JP2001145496A - 組換えヒトプロテインｃ - Google Patents

組換えヒトプロテインｃ

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JP2001145496A JP2000309380A JP2000309380A JP2001145496A JP 2001145496 A JP2001145496 A JP 2001145496A JP 2000309380 A JP2000309380 A JP 2000309380A JP 2000309380 A JP2000309380 A JP 2000309380A JP 2001145496 A JP2001145496 A JP 2001145496A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 真核宿主細胞において、γカルボキシル化さ
れ、正しく折りたたまれ、そしてプロセッシングされて
いる機能的なプロテインＣを産生する。 【解決手段】 (ａ)プロテインＣをコードしているＤＮ
Ａ配列を組換えベクターに導入し、(ｂ)該ベクターを、
アデノウイルスで形質転換したヒト胎児腎細胞に導入
し、そして(ｃ)工程(ｂ)の宿主細胞を、カルボキシル化
のためのビタミンＫを十分に含有する培地において、増
殖条件下で培養する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、大きいＤＮＡウイ
ルスの即時型遺伝子産物の存在下にＢＫエンハンサーを
用いて、真核宿主細胞における組換え遺伝子の転写を増
加させる方法、ならびに本方法に用いるのに適したＤＮ
Ａ化合物、組換えＤＮＡベクターおよび該ベクターで形
質転換した宿主細胞に関する[ここでいうＢＫエンハン
サーとは、３個の繰り返し配列からなる、本明細書に定
義したＤＮＡセグメントである(後記実施例１７中に記
載)]。
【０００２】本明細書中に例示したＢＫエンハンサー配
列は、ＢＫウイルス、すなわち免疫抑制患者の尿から初
めて単離されたヒト・パポバウイルスから得られる。Ｂ
Ｋウイルスは、外見からはわからない幼年期感染を引き
起こすものと推測され、全人類中に存在している。ＢＫ
ウイルスはヒト細胞中で最もよく増殖するが、このウイ
ルスは非霊長動物細胞においては不稔サイクル下に入
り、インビトロで齧歯類動物細胞を形質転換し、そして
ハムスターにおいては腫瘍を引き起こす。ＢＫウイルス
はＳＶ４０に極めて似ているが、この２種類のパポバウ
イルス(すなわち、ＳＶ４０およびＢＫ)のエンハンサー
配列は実質的にヌクレオチド配列が異なっている。ＢＫ
ウイルスの完全なヌクレオチド配列(〜５.２kb)は、セ
イフ等[Ｓeif et al.,Ｃell,１８:９６３(１９７９)]、
ならびにヤングおよびウー[Ｙangand Ｗu,Ｓcience,２
０６:４５６(１９７９)]が開示しており、このウイルス
はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Ａ
ＴＣＣ)(Ａmerican ＴypeＣulture Ｃollection,１２３
０１ Ｐarklawn Ｄr.,Ｒockville,ＭＤ２０８５２−１
７７６)から、取得番号ＡＴＣＣ ＶＲ−８３７のもとで
入手することができる。このＢＫウイルスの制限部位お
よび機能地図を添付の図１に示す。
【０００３】エンハンサー成分はcis−作用であり、こ
のエンハンサー成分の位置および配向に比較的依存せず
に、近接する遺伝子の、そのプロモーターからの転写レ
ベルを増加させる。事実、コーリーおよびグルス[Ｋhou
ry and Ｇruss,cell,３３:３１３(１９８３)]は、「真核
生物遺伝子の上流、内部または下流で機能するエンハン
サー配列の注目すべき能力は、これらを古典的なプロモ
ーター成分と区別するものである・・・」と述べ、ある
種の実験結果が「エンハンサーはかなりの距離(おそらく
１０kb以上)を越えて作用することができる」ことを示し
ている、と示唆している。
【０００４】本発明は、真核生物性プロモーター(有用
な物質をコードしているＤＮＡ配列を転写させるため
に、ＢＫエンハンサーと直列して用いる)の「ＣＡＡＴ」
領域のすぐ上流(該領域の５'側)にＢＫエンハンサーを
配置することによって、予想外の転写の増加が得られる
ことを教示するものである。このＣＡＡＴ領域または
「すぐ上流の領域」または「−８０相同配列」は、転写活性
のための配列が詳細に調べられているプロモーター中に
見い出されるヌクレオチドの保存領域である。このＣＡ
ＡＴ配列は転写の効率に関係し、ごくわずかな例外を除
いて、これを削除するとプロモーターの強さが減少す
る。
【０００５】エンハンサー成分は、多数のウイルス[Ｂ
Ｋおよびサルウイルス４０(ＳＶ４０)などのパポバウイ
ルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎
ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、乳頭腫ウ
イルス、ポリオーマウイルスを含む]および非ウイルス
性遺伝子(たとえば、マウスの免疫グロブリン遺伝子イ
ントロン中など)において確認されている。エンハンサ
ー成分は多種多様のその他の生物中にも存在している可
能性がある。宿主細胞は、エンハンサー成分が異なる
と、異なった反応を示すことが多い。この細胞特異性
は、宿主遺伝子産物が遺伝子の発現中にエンハンサー成
分と相互作用していることを示すものである。
【０００６】また、エンハンサー成分は、宿主細胞中に
存在しているウイルス性遺伝子産物と相互作用すること
もある。ベルシッチおよびジッフ[Ｖelcich and Ｚiff,
Ｃell,４０:７０５(１９８３)]、ボレリ等[Ｂorrelli e
t al．,Ｎature,３１２:６０８(１９８４)]およびヘン
等[Ｈen et al．,Ｓcience,２３０:１３９１(１９８
５)]は、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、マウス免疫グ
ロブリン遺伝子およびアデノウイルス−２ Ｅ１Ａのエ
ンハンサーが誘起する転写の活性化を、アデノウイルス
−２初期領域１Ａ(Ｅ１Ａ)遺伝子産物が抑制すると記載
している。従って、Ｅ１Ａを含有する宿主細胞において
は、組換え遺伝子の転写を増加させるためにエンハンサ
ーを用いた真核生物性発現ベクターが、エンハンサーを
有さないベクターより有効に作動すると期待することは
できない。エンハンサー類を用いる先行技術の方法とは
著しく異なり、本発明のＢＫウイルスエンハンサー成分
を用いる方法は、Ｅ１Ａ遺伝子産物または大きいＤＮＡ
ウイルスの同様の即時型遺伝子産物を用いて遺伝子発現
を最大にすることに関するものである。すなわち本発明
は、いずれかのアデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子産物の存
在下に、ＢＫエンハンサーのＤＮＡ転写促進能力を向上
させることを教示するものである。
【０００７】Ｅ１Ａ遺伝子産物(正確に言うと、Ｅ１Ａ
遺伝子は２種類の産物を産生するが、本明細書中ではこ
れらをひとまとめにして「Ｅ１Ａ遺伝子産物」と称する)
は、アデノウイルス(大きいＤＮＡウイルス)の即時型遺
伝子産物である。本発明は、Ｅ１Ａ遺伝子産物と同様に
機能してＢＫエンハンサーの活性を増加させる、大きい
ＤＮＡウイルスのあらゆる即時型遺伝子産物の使用を包
含する。単純性疱疹ウイルスＩＣＰ４タンパク質[デル
カ等(Ｄe Ｌuca et al．,Ｍol.Ｃell.Ｂiol.,５:１９９
７−２００８(１９８５))が開示]、シュードラビエスウ
イルスＩＥタンパク質[フェルドマン等(Ｆeldman et a
l.,Ｐ.Ｎ.Ａ.Ｓ.,７９:４９５２−４９５６(１９８２))
が開示]およびアデノウイルスのＥ１Ｂタンパク質は、
すべてＥ１Ａタンパク質と同様の機能を有する、大きい
ＤＮＡウイルスの即時型遺伝子産物である。従って本発
明方法は、Ｅ１Ａタンパク質の存在または非存在下にＩ
ＣＰ４、ＩＥ、またはＥ１Ｂタンパク質を用いて、ＢＫ
エンハンサーの活性を増加させることをも包含する。
【０００８】アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子産物のよう
な、大きいＤＮＡウイルスの即時型遺伝子産物の存在下
にＢＫウイルスエンハンサーを用いると、真核宿主細胞
において組換え遺伝子の転写および発現が増加する。本
発明の別の重要な態様は、真核生物性プロモーター(た
とえば、アデノウイルス後期プロモーター)に直列して
ＢＫエンハンサー配列を用い、真核宿主細胞において有
用な産物を発現させる種々の発現ベクターに関する。こ
れらの発現ベクターの多くは、ＢＫエンハンサー−アデ
ノウイルス後期プロモーターカセットを含有し、このカ
セットは、本発明方法に用いる他のベクターに容易に移
し換えることができる。この発現ベクターの多様性は、
これらのベクターが誘導する種々のタンパク質(たとえ
ば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ、タンパク質Ｃ、組織プラスミノーゲン活性化因子、
および修飾化組織プラスミノーゲン活性化因子など)の
高レベル発現によって示される。
【０００９】本発明のさらに別の重要な態様は、近接す
る真核生物性プロモーターと関連しているＢＫエンハン
サーの活性を増加させる方法に関し、これをＢＫエンハ
ンサー−アデノウイルス−２後期プロモーターカセット
を用いて説明する。これらの誘導体を、アデノウイルス
−２後期プロモーターのＣＡＡＴ領域の極めて近くにＢ
Ｋエンハンサーを配置する酵素的な処理によって構築し
た。これらの修飾化ＢＫエンハンサー−アデノウイルス
後期プロモーター配列を発現ベクターに導入し、次いで
これらを用いて真核宿主細胞中で有用な遺伝子産物を発
現させたとき、このような位置決めを欠く構築物と比較
すると、劇的な発現レベルの増加が認められた。すなわ
ち本発明は、近接する真核生物性プロモーターと関連し
ているＢＫエンハンサーの活性を増加させるための方法
であって、真核生物性プロモーターのＣＡＡＴ領域の
５'末端のすぐ上流、０−約３００ヌクレオチド以内に
該エンハンサーを配置することからなる方法を提供する
ものである。
【００１０】本明細書中で用いる語句を以下のように定
義する。 抗生物質:微生物が産生する物質であって、天然のまま
で、またはわずかに化学修飾することにより、他の微生
物または真核生物細胞を殺すか、またはその増殖を抑制
する物質。 抗生物質耐性付与遺伝子:抗生物質に対する耐性を付与
する活性をコードしているＤＮＡセグメント。 ＡpＲ:アンピシリン耐性の表現型またはそれを付与する
遺伝子。 クローニング:組換えＤＮＡクローニングベクターにＤ
ＮＡセグメントを導入する過程。 ＣmＲ:クロラムフェニコール耐性の表現型またはそれを
付与する遺伝子。 ep:Ｔ−抗原遺伝子のＳＶ４０初期プロモーター、Ｔ−
抗原結合部位、およびＳＶ４０の複製起源を含有するＤ
ＮＡセグメント。 真核生物性プロモーター:真核生物細胞中でプロモータ
ーとして機能するすべてのＤＮＡセグメント。 ＨmＲ:ハイグロマイシン耐性の表現型またはそれを付与
する遺伝子。 ＩＶＳ:介在配列とも呼ばれる、イントロンをコードし
ているＤＮＡ。
【００１１】大きいＤＮＡウイルス:真核生物細胞に感
染し、〜１０kb以上の大きさのゲノムを有するウイル
ス、すなわちポックスウイルス類、アデノウイルス類、
およびヘルペスウイルス類のいずれか。 ＮeoＲ:ネオマイシン耐性付与遺伝子であり、これを用
いて真核宿主細胞にＧ４１８耐性を付与することもでき
る。 ori:プラスミドの複製起源。 pＡ:ポリアデニル化シグナルをコードしているＤＮＡ配
列。 プロモーター:ＤＮＡのＲＮＡへの転写を誘導するＤＮ
Ａ配列。 組換えＤＮＡクローニングベクター:自律的に複製する
かまたは組み込まれる媒介物であって、１またはそれ以
上の付加的なＤＮＡセグメントを付加することができる
かまたは付加したＤＮＡ分子からなる媒介物。 組換えＤＮＡ発現ベクター:プロモーターおよびこれに
関連する挿入部位を含有する組換えＤＮＡクローニング
ベクターであって、該部位に有用な産物をコードしてい
るＤＮＡ分子を挿入し、そして発現させることができる
ベクター。
【００１２】組換えＤＮＡベクター:組換えＤＮＡクロ
ーニングまたは組換えＤＮＡ発現ベクター。 レプリコン:組換えＤＮＡベクターの複製を制御してい
るＤＮＡ配列。 制限フラグメント:１またはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成した直線状のＤＮＡ。 rＲＮＡ:リボソーム性リボ核酸。 感受性宿主細胞:ある抗生物質またはその他の毒性化合
物に対する耐性を付与するＤＮＡセグメントなしでは、
それらが存在するところで増殖することができない宿主
細胞。 構造遺伝子:開始および停止コドンをコードしているＤ
ＮＡを含む、ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配
列。 ＴcＲ:テトラサイクリン耐性の表現型またはそれを付与
する遺伝子。 形質転換体:形質転換を受けた受容宿主細胞。 形質転換:受容宿主細胞へのＤＮＡの導入。 tＲＮＡ:転移リボ核酸。
【００１３】図面の説明 図１は、ＢＫウイルス(５.２kb)の制限部位および機能
地図であり、図２は、プラスミドpＢＫＥ１(７.９kb)の
制限部位および機能地図であり、図３は、プラスミドp
ＢＫneo１(１１.５kb)の制限部位および機能地図であ
り、図４は、プラスミドpＳＶ２cat(５.０１５kb)の制
限部位および機能地図であり、図５は、プラスミドpＬ
Ｐcat(４.８３kb)の制限部位および機能地図であり、図
６は、プラスミドpＢＬcat(６.０９kb)の制限部位およ
び機能地図であり、図７は、プラスミドpＢＫcat(５.７
９kb)の制限部位および機能地図であり、図８は、プラ
スミドpＳＢＬcat(５.８８kb)の制限部位および機能地
図であり、
【００１４】図９は、プラスミドpＬ１３３の構築なら
びにその制限部位および機能地図を表し、図１０は、プ
ラスミドpＬＰＣ(６.５kb)の制限部位および機能地図で
あり、図１１は、プラスミドpＬＰＣ４(１１.７kb)の制
限部位および機能地図であり、図１２は、プラスミドp
ＳＶ２hyg(５.２４kb)の制限部位および機能地図であ
り、図１３は、プラスミドpＬＰＣhyg１(８.３kb)の制
限部位および機能地図であり、図１４、図１５、図１６
および図１７は、プラスミドpＢＷ３２の構築ならびに
その制限部位および機能地図を表し、図１８は、プラス
ミドpＬＰＣhd１(１０.２３kb)の制限部位および機能地
図であり、図１９は、プラスミドphd(８.５５kb)の制限
部位および機能地図であり、
【００１５】図２０は、プラスミドpＬＰＣＥ１Ａ(７.
６kb)の制限部位および機能地図であり、図２１は、プ
ラスミドpＢＬＴ(６.４４kb)の制限部位および機能地図
であり、図２２は、プラスミドpＢＬＴhyg１(８.９５k
b)の制限部位および機能地図であり、図２３は、プラス
ミドpＢＬＴdhfr１(８.３４kb)の制限部位および機能地
図であり、図２４は、プラスミドpＴＰＡ６０２(４.９k
b)の制限部位および機能地図であり、図２５は、プラス
ミドpＴＰＡ６０３(６.３kb)k制限部位および機能地図
であり、図２６は、プラスミドphdＴＰＡ(１０.６７kb)
の制限部位および機能地図であり、図２７は、プラスミ
ドphdＭＴＰＡ(１０.６７kb)の制限部位および機能地図
である。
【００１６】本発明は、真核宿主細胞において機能的な
ポリペプチドを産生させるための方法であって、大きい
ＤＮＡウイルスまたはそのＤＮＡで形質転換され、そし
て少なくとも a)真核生物性プロモーター、 b)該プロモーターを刺激するように配置したＢＫウイル
スエンハンサー、 c)該プロモーターから発現するように配置した、機能的
なポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列、を含有す
る組換えＤＮＡベクターで形質転換された真核生物細
胞、または上記a)、b)、c)および d)大きいＤＮＡウイルスの即時型遺伝子産物をコードし
ているＤＮＡ配列、を含有する組換えＤＮＡベクターで
形質転換された真核生物細胞を、c)およびd)の発現に適
した条件下で培養することからなる方法を提供するもの
である。
【００１７】また、本発明は真核生物性プロモーターと
関連しているＢＫエンハンサーの活性を増加させるため
の方法であって、プロモーターがＳＶ４０初期プロモー
ターではないという限定のもと、真核生物性プロモータ
ーのＣＡＡＴ領域の５'末端の上流側０−３００ヌクレ
オチド以内に該エンハンサーを配置することからなる方
法を提供するものである。
【００１８】さらに本発明は、本発明方法において使用
するに適した組換えＤＮＡベクター、ならびに該組換え
ＤＮＡベクターで形質転換したヒト胎児腎細胞およびサ
ル腎細胞等の真核生物細胞を提供するものである。加え
て本発明は、ＢＫエンハンサー−アデノウイルス後期プ
ロモーターを含有するＤＮＡ化合物をも提供するもので
ある。
【００１９】当業者なら、本発明方法の両態様におけ
る、大きいＤＮＡウイルスの即時型遺伝子産物の重要な
役割について理解することであろう。さらに、多数の確
立された細胞セルラインが大きいＤＮＡウイルスの即時
型遺伝子産物を発現すること、およびそのようなセルラ
インが本発明方法において特に有用であることについて
も理解することであろう。本方法の１態様では、真核生
物性プロモーター、該プロモーターを刺激するように配
置したＢＫエンハンサー、および所望の機能的なポリペ
プチドをコードしているＤＮＡ配列(該プロモーターか
ら発現するようにこの配列を配置する)を含有する組換
えＤＮＡベクターで、大きいＤＮＡウイルスの即時型遺
伝子産物を発現する細胞を形質転換し、そして発現に適
した条件下で該ベクターを含有する細胞を培養する。ま
た、本発明方法の他の態様は、大きいＤＮＡウイルスの
即時型遺伝子産物は発現しないが、即時型遺伝子産物を
コードしているＤＮＡ配列、ならびに上記のプロモータ
ー、エンハンサーおよび機能的なポリペプチドをコード
しているＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ発現ベクタ
ーで形質転換した細胞を培養することからなる。
【００２０】本発明において重要なものは、ＢＫエンハ
ンサー配列をアデノウイルス−２後期プロモーターと直
列して含有する１群の新規発現ベクターである。該ベク
ター中、発現のための正しい位置に、有用な産物をコー
ドしているＤＮＡ分子を容易に挿入するか、または挿入
できるように、本発明の発現ベクターを構築した。さら
に、比較的小さい制限フラグメントとして発現ベクター
から単離しうる「カセット」を形成するように、ＢＫエン
ハンサー配列および真核生物性プロモーターを組み立て
た。このカセットは、種々の発現ベクター間を容易に往
復することができる。本明細書中に特定して例示した発
現ベクターは、本発明方法において転写を誘導するＢＫ
エンハンサー−真核生物性プロモーターカセットに、ア
デノウイルス−２またはＢＫ後期プロモーターを用いて
いる。
【００２１】ＢＫウイルス(ＡＴＣＣ ＶＲ−８３７)は
購入可能であるか、または実施例１の記載のようにして
容易かつ大量に単離することができるが、このウイルス
は、ＢＫウイルス性ＤＮＡをプラスミドクローニングベ
クターにクローンし、この組換えベクターをＢＫウイル
ス性ＤＮＡ配列の供給源として使用するのにも都合がよ
い。従って、ＢＫウイルスＤＮＡを制限酵素ＥcoＲＩで
消化して直線状のＢＫＤＮＡ(ＢＫゲノム上にはＥcoＲ
Ｉ部位が１つしか存在しないので)を得、同様にプラス
ミドpＵＣ８[ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Ｂ
ＲＬ)(ＢethesdaＲesearch Ｌaboratories,Ｐ.Ｏ.Ｂox
６００９,Ｇaithersburg,ＭＤ ２０８７７)から入手可
能]を制限酵素ＥcoＲＩで消化して直線化し、そしてこ
のＥcoＲＩ切断したプラスミドpＵＣ８ ＤＮＡをＥcoＲ
Ｉ切断したＢＫウイルスＤＮＡにライゲートして、ＢＫ
ウイルスＤＮＡの配向だけが異なるプラスミドpＢＫＥ
１およびpＢＫＥ２を得た。プラスミドpＢＫＥ１の制限
部位および機能地図を添付の図２に示す。プラスミドp
ＢＫＥ１およびpＢＫＥ２の構築については、実施例２
に記載する。
【００２２】また、ＢＫウイルスゲノムをプラスミドpd
ＢＰＶ−ＭＭＴneoの一部と結合させてプラスミドpＢＫ
neo１およびpＢＫneo２を構築した。プラスミドpdＢＰ
Ｖ−ＭＭＴneo(約１５kbの大きさであり、ＡＴＣＣから
取得番号ＡＴＣＣ ３７２２４のもとで入手可能である)
は、プラスミドpＢＲ３２２由来のβ−ラクタマーゼ遺
伝子およびレプリコン、ネオマイシン耐性付与酵素をコ
ードしている構造遺伝子を発現させるように配置したマ
ウス・メタロチオネイン・プロモーター、および約８kb
のウシ乳頭腫ウイルス(ＢＰＶ)ＤＮＡを含有している。
プラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴneoを制限酵素ＢamＨＩで
消化して２種類のフラグメント、すなわちＢＰＶ ＤＮ
Ａを含有する〜８kbフラグメントおよびそれ以外の上記
配列を含有する〜７kbフラグメントを得ることができ
る。ＢＫウイルスはＢamＨＩ制限部位を１つだけ有して
おり、プラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴneoの〜７kb ＢamＨ
Ｉ制限フラグメントをＢamＨＩで直線化したＢＫウイル
スＤＮＡにライゲートすることによってプラスミドpＢ
Ｋneo１およびpＢＫneo２を構築した。ＢＫウイルスＤ
ＮＡの配向だけが異なっているこのプラスミドpＢＫneo
１およびpＢＫneo２の構築を実施例３に記載し、プラス
ミドpＢＫneo１の制限部位および機能地図を添付の図３
に示す。
【００２３】プラスミドpＢＫＥ１、pＢＫＥ２、pＢＫn
eo１およびpＢＫneo２それぞれは、エンハンサー配列を
含むＢＫウイルスの完全なゲノムを含有しており、従っ
て本発明の発現ベクター用の有用な出発原料となる。説
明のためにそのような発現ベクターを１つ挙げると、プ
ラスミドpＢＬcatは、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ酵素(ＣＡＴ)を発現させるように配置
した、ヒトアデノウイルス−タイプ−２・後期プロモー
ターと直列してＢＫエンハンサー配列を含有している。
プラスミドpＳＶ２catはＣＡＴ遺伝子の都合のよい供給
源として有用であり、取得番号ＡＴＣＣ ３７１５５の
もとでＡＴＣＣから入手できる。プラスミドpＳＶ２cat
の制限部位および機能地図を添付の図４に示す。ヒトア
デノウイルス−タイプ−２ ＤＮＡは市販品から入手す
ることができ、またＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ Ｖ
Ｒ−２のもとで入手することもできる。
【００２４】説明のために挙げたこのプラスミドpＢＬc
atは、ヒトアデノウイルス−タイプ−２・ＤＮＡの〜
０.３２kb後期プロモーター含有ＡccＩ−ＰvuＩＩ制限
フラグメントを、ＡccＩ−ＰvuＩＩ制限フラグメントの
ＰvuＩＩ末端だけに結合する平滑末端化ＢcｌＩリンカ
ーにライゲートすることによって構築した。次いで得ら
れたフラグメントをプラスミドpＳＶ２catの〜４.５１k
b ＡccＩ−ＳtuＩ制限フラグメントにライゲートして中
間体プラスミドpＬＰcatを得た(このプラスミドの制限
部位および機能地図を添付の図５に示す)。所望のプラ
スミドpＢＬcatは、複製起源およびエンハンサーを含有
する、ＢＫウイルスＤＮＡの〜１.２８kbＡccＩ−Ｐvu
ＩＩ制限フラグメントを、プラスミドpＬＰcatの〜４.
８１kb ＡccＩ−ＳtuＩ制限フラグメントにライゲート
することによって、プラスミドpＬＰcatから構築した。
得られたプラスミドpＢＬcatの制限部位および機能地図
を添付の図６に示す。プラスミドpＢＬcatの構築につい
ては実施例４にさらに詳しく記載する。
【００２５】プラスミドpＢＫcatは本発明をさらに例示
する発現ベクターであり、ＢＫエンハンサーおよびＢＫ
後期プロモーターを用いてクロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼを発現させるものである。プラス
ミドpＢＫcatを、プラスミドpＬＰcatについて記載した
と類似の方法で構築した。すなわち、プラスミドpＳＶ
２catの〜４.５１kb ＡccＩ−ＳtuＩ制限フラグメント
をＢＫウイルスの〜１.２８kb ＡccＩ−ＰvuＩＩ制限フ
ラグメントにライゲートして、ＢＫ後期プロモーターが
正しい配向となるようにし、ＣＡＴ遺伝子を発現させる
ようにした。プラスミドpＢＫcatの制限部位および機能
地図を添付の図７に示す。
【００２６】プラスミドpＢＬcatは、本発明のＢＫエン
ハンサー−アデノウイルス後期プロモーター「カセット」
の都合のよい供給源である。このカセットは〜８７０bp
のＨindＩＩＩ制限フラグメントであり、都合よく真核
生物性発現ベクターに挿入して該ベクターがコードして
いる産物の発現を増加させることができる。これは、プ
ラスミドpＳＶ２catを制限酵素ＨindＩＩＩで消化し、
ＢＫエンハンサー−アデノウイルス後期プロモーターカ
セットを挿入することによって行なわれる。得られたプ
ラスミド(プラスミドpＳＢＬcatと命名した)は、ＳＶ４
０複製起源、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０
エンハンサーを含有し、従ってこれらの配列が削除され
ているプラスミドpＢＬcatとは異なる。
【００２７】プラスミドpＳＢＬcatは、Ｅ１Ａ遺伝子産
物が存在しなければ、プラスミドpＢＬcatより高レベル
でＣＡＴを発現させる。Ｅ１Ａ遺伝子産物が存在しない
場合におけるこの発現の増加は、２種類のエンハンサー
(一方はＳＶ４０由来、他方はＢＫ由来)が、隣接するプ
ロモーターからの転写において付加的な促進効果を有し
ていることを示すものである。しかし、Ｅ１Ａ遺伝子産
物の存在下では、プラスミドpＳＢＬcatよりプラスミド
pＢＬcatの方が高レベルでＣＡＴを発現させる(これは
おそらくＳＶ４０エンハンサーがＥ１Ａ遺伝子産物によ
って抑制されるためであろう)。プラスミドpＳＢＬcat
の制限部位および機能地図を添付の図８に示し、プラス
ミドpＳＢＬcatの構築を実施例５に記載する。
【００２８】また、ＢＫエンハンサー−アデノウイルス
後期プロモーターカセットを用いて、ヒトタンパク質Ｃ
の発現を改良した。これは、カセットをプラスミドpＬ
１３３中にライゲートすることによって行った。プラス
ミドpＬ１３３の制限部位および機能地図を添付の図９
に示し、その構築を実施例６に記載する。プラスミドp
Ｌ１３３を制限酵素ＨindＩＩＩで消化し、次いでプラ
スミドpＢＬcatの〜０.８７kb ＨindＩＩＩ制限フラグ
メントにライゲートしてプラスミドpＬＰＣを得た。プ
ラスミドpＬＰＣの制限部位および機能地図を添付の図
１０に示し、プラスミドpＬＰＣの構築を実施例７に記
載する。
【００２９】プラスミドpＬ１３３と同様、プラスミドp
ＬＰＣはＳＶ４０の複製起源、Ｔ−抗原結合部位、初期
および後期プロモーター、およびエンハンサーを含有す
る。これらの成分はともにＳＶ４０ ＤＮＡ上に近接し
て位置しており、これを正確に表すことは困難である。
Ｔ−抗原のＴ−抗原結合部位への結合(ＳＶ４０の複製
に必要である)が、ＳＶ４０後期プロモーターからの転
写を促進することが知られているが、驚くべきことにＢ
Ｋ後期プロモーターに対しても同様の効果を有してい
る。ＳＶ４０複製起源を含有するプラスミドの高レベル
Ｔ−抗原誘導複製は通常宿主細胞にとって致死的である
ので、ＳＶ４０ Ｔ−抗原の存在下ではプラスミドpＬＰ
ＣおよびプラスミドpＬ１３３のどちらもエピソーム(染
色体外)成分として安定に保持されず、むしろこの２種
類のプラスミドを宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込ん
で安定に保持されるようにしなければならない。
【００３０】ＢＫエンハンサー領域の全体の構造はＳＶ
４０のそれと極めて類似しており、ＢＫエンハンサー、
複製起源、初期および後期プロモーター、およびＴ−抗
原結合部位のＢＫ同等物はすべて近接して位置してお
り、ＢＫウイルスＤＮＡ上において、正確に表すことは
困難である。しかし、ＢＫ Ｔ−抗原の存在下で増殖さ
せたとき、ＢＫ複製起源およびＴ−抗原結合部位を含有
するプラスミドは致死となるまでは複製せず、エピソー
ム成分として宿主細胞中に安定に保持される。多分、Ｂ
ＫおよびＳＶ４０ Ｔ−抗原とそれらの抗原のそれぞれ
の結合部位との間の、類似した構造−機能の関係によ
り、ＢＫの複製はＳＶ４０ Ｔ−抗原によっても刺激さ
れる。形質転換した真核生物細胞中で、安定に保持され
る成分として存在しうるプラスミドpＬＰＣの誘導体を
構築するため、完全なＢＫゲノム(ＥcoＲＩで直線化し
た制限フラグメントとして)を、プラスミドpＬＰＣの唯
一のＥcoＲＩ制限部位に挿入した。この挿入により２種
類のプラスミドが得られた。これらは、ＢＫ ＥcoＲＩ
フラグメントの配向においてのみ異なっており、それぞ
れpＬＰＣ４およびpＬＰＣ５と命名した。プラスミドp
ＬＰＣ４の制限部位および機能地図を添付の図１１に示
し、プラスミドpＬＰＣ４およびpＬＰＣ５の構築を実施
例８に記載する。
【００３１】組換えＤＮＡ発現ベクターのエピソーム保
持は、宿主細胞染色体への組み込みの際に、常に好まし
いというわけではない。しかし、真核生物細胞中で機能
する選択マーカーが存在しないため、プラスミドpＬＰ
Ｃを別の選択マーカー含有プラスミドと共形質転換しな
ければ、プラスミドpＬＰＣの安定な真核生物性形質転
換体を同定するのは困難である。従って、プラスミドp
ＬＰＣを修飾して、真核宿主細胞中で選択しうるプラス
ミド誘導体を作成した。
【００３２】プラスミドpＳＶ２hyg、すなわちハイグロ
マイシン耐性付与遺伝子を含有するプラスミドの一部に
プラスミドpＬＰＣをライゲートすることによってこれ
を行った。プラスミドpＳＶ２hyg[このプラスミドは、
ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー(Ｎ
ＲＲＬ)(Ｎorthern Ｒegional Ｒesearch Ｌaboratory,
Ｐeoria,ＩＬ ６１６４０)から取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−
１８０３９のもとで入手することができる]の制限部位
および機能地図を添付の図１２に示す。プラスミドpＳ
Ｖ２hygを制限酵素ＢamＨＩで消化し、完全なハイグロ
マイシン耐性付与遺伝子を含有する〜２.５kb ＢamＨＩ
制限フラグメントを単離し、クレノウ酵素[Ｅ.コリ(Ｅ.
coli)ＤＮＡポリメラーゼＩのスブチリシン切断によっ
て得られる大きいフラグメント]で処理し、次いでクレ
ノウ処理した、プラスミドpＬＰＣの〜５.８２kb Ｎde
Ｉ−ＳtuＩ制限フラグメントにライゲートしてプラスミ
ドpＬＰＣhyg１およびpＬＰＣhyg２を得た。プラスミド
pＬＰＣhyg１およびpＬＰＣhyg２はハイグロマイシン耐
性付与フラグメントの配向だけが異なっている。プラス
ミドpＬＰＣhyg１の制限部位および機能地図を添付の図
１３に示し、プラスミドpＬＰＣhyg１およびpＬＰＣhyg
２構築のプロトコールを実施例９に記載する。
【００３３】ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を含有
する、クレノウ処理した、プラスミドpＢＷ３２の〜１.
９kb ＢamＨＩ制限フラグメントを、プラスミドpＬＰＣ
の〜５.８２kb ＮdeＩ−ＳtuＩ制限フラグメントに挿入
することによって、dhfr遺伝子を含有する上記と同様の
ヒトタンパク質Ｃ発現プラスミドを構築した。得られた
プラスミド、すなわちpＬＰＣdhfr１およびpＬＰＣdhfr
２はdhfr遺伝子の配向だけが異なっており、これらのプ
ラスミドの構築を実施例１１Ｂに記載する。
【００３４】プラスミドpＬＰＣhyg１をさらに修飾して
ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を導入した。dhfr遺
伝子はdhfr−陰性の細胞における選択マーカーであり、
これを用い、宿主細胞をメトトレキセイトにさらす(濃
度を順次増加する)ことによって、ＤＮＡセグメントの
コピー数を増加させることができる。このdhfr遺伝子は
プラスミドpＢＷ３２から得ることができる。プラスミ
ドpＢＷ３２の制限部位および機能地図を添付の図１
４、図１５、図１６および図１７に示し、プラスミドp
ＢＷ３２構築のプロトコールを実施例１０に記載する。
【００３５】dhfr遺伝子を含有する、プラスミドpＢＷ
３２の〜１.９kb ＢamＨＩ制限フラグメントを単離し、
クレノウ酵素で処理し、部分的にＥcoＲＩ消化したプラ
スミドpＬＰＣhyg１に挿入してプラスミドpＬＰＣhd１
およびpＬＰＣhd２を得た。プラスミドpＬＰＣhyg１は
２つのＥcoＲＩ制限酵素認識部位を含有し、１つはハイ
グロマイシン耐性付与遺伝子中に、もう１つはプラスミ
ドpＢＲ３２２由来の配列中に存在している。dhfr遺伝
子を含有するフラグメントを、プラスミドpＬＰＣhyg１
のpＢＲ３２２由来配列中に位置するＥcoＲＩ部位に挿
入してプラスミドpＬＰＣhd１およびpＬＰＣhd２を得
た。プラスミドpＬＰＣhd１の制限部位および機能地図
を添付の図１８に示し、dhfr遺伝子を含有するＤＮＡセ
グメントの配向だけが異なっているプラスミドpＬＰＣh
d１およびpＬＰＣhd２の構築を実施例１１に記載する。
【００３６】プラスミドpＬＰＣhd１を修飾してプラス
ミドphd、すなわち本発明に係るＢＫエンハンサー−ア
デノウイルス後期プロモーターカセットならびにハイグ
ロマイシン耐性付与およびdhfr遺伝子の両者を含有する
プラスミドを得た。プラスミドphdを構築するため、プ
ラスミドpＬＰＣhd１をdamＥ.コリ宿主細胞から調製
し、制限酵素ＢclＩで消化し、そして再び環化してヒト
タンパク質ＣをコードしているＤＮＡを削除した。プラ
スミドphdはＢclＩ制限酵素認識部位を１つだけ含有し
ており、この部位は、本発明のＢＫエンハンサー−アデ
ノウイルス後期プロモーターから発現させようとするす
べての配列を挿入するのに都合よく配置されている。プ
ラスミドphdの制限部位および機能地図を添付の図１９
に示し、プラスミドphd構築のプロトコールを実施例１
２に記載する。
【００３７】本発明をさらに例示する別の発現ベクター
であって、ヒトタンパク質Ｃを発現させるベクターはプ
ラスミドpＬＰＣＥ１Ａである。プラスミドpＬＰＣＥ１
Ａはヒトアデノウイルス タイプ２のＥ１Ａ遺伝子を含
有し、この遺伝子の産物は、上述のように、ＢＫエンハ
ンサーの活性を増加させる。すなわち、ＢＫエンハンサ
ーに直列するプロモーターからの転写は、Ｅ１Ａ遺伝子
産物の存在下に増加する。Ｅ１Ａ遺伝子を含有する、ヒ
トアデノウイルス−タイプ−２ ＤＮＡの〜１.８kb Ｂa
lＩ制限フラグメントを、プラスミドpＬＰＣの〜５.８
２kb ＮdeＩ−ＳtuＩ制限フラグメントとライゲートす
ることにより、プラスミドpＬＰＣＥ１Ａを構築した。
プラスミドpＬＰＣＥ１Ａの制限部位および機能地図を
添付の図２０に示し、プラスミドpＬＰＣＥ１Ａ構築の
プロトコールを実施例１３に記載する。
【００３８】本発明の発現ベクターのうちの多数は、組
織プラスミノーゲン活性化因子(ＴＰＡ)または修飾化Ｔ
ＰＡ(ＭＴＰＡ)を発現させるために、ＢＫエンハンサー
−アデノウイルス後期プロモーターカセットを利用して
いる。このようなベクターを構築するため、プラスミド
pＢＷ３２(図１４、図１５、図１６および図１７)を制
限酵素ＢamＨＩで消化し、得られた〜５.６kbフラグメ
ントを再環化してプラスミドpＢＷ３２delを得た。修飾
化ＴＰＡをコードし、ＨindＩＩＩ制限部位を１つだけ
含有するこのプラスミドpＢＷ３２delをＨindＩＩＩで
消化し、次いでプラスミドpＢal８catの〜０.６５kb Ｈ
indＩＩＩ制限フラグメントとライゲートしてプラスミ
ドpＢＬＴを得た。プラスミドpＢal８catについては実
施例１７に記載するが、このプラスミドは改良型ＢＫエ
ンハンサー−アデノウイルス後期プロモーターカセット
を含有している。プラスミドpＢＬＴの制限部位および
機能地図を添付の図２１に示し、プラスミドpＢＬＴ構
築のプロトコールを実施例１４に記載する。
【００３９】ＢamＨＩ消化したプラスミドpＢＬＴに選
択マーカーを導入した。ある構築においては、ハイグロ
マイシン耐性遺伝子を含有する、プラスミドpＳＶ２hyg
の〜２.５kb ＢamＨＩ制限フラグメントを挿入してプラ
スミドpＢＬＴhyg１およびpＢＬＴhyg２を得、別の構築
においては、dhfr遺伝子を含有する、プラスミドpＢＷ
３２の〜１.９kb ＢamＨＩ制限フラグメントを挿入し
てプラスミドpＢＬＴdhfr１およびpＢＬＴdhfr２を得
た。これら４種のプラスミド、pＢＬＴhyg１、pＢＬＴh
yg２、pＢＬＴdhfr１、およびpＢＬＴdhfr２は、選択マ
ーカーの種類および／または配向だけが異なっている。
プラスミドpＢＬＴhyg１およびpＢＬＴdhfr１それぞれ
の制限部位および機能地図を添付の図２２および図２３
に示し、プラスミドpＢＬＴhyg１、pＢＬＴhyg２、pＢ
ＬＴdhfr１、およびpＢＬＴdhfr２構築のプロトコール
を実施例１５に記載する。
【００４０】ＴＰＡまたは修飾化ＴＰＡを発現させる本
発明の他の発現ベクターは、プラスミドpＢＷ３２の構
築に用いる中間体であるプラスミドpＴＰＡ１０３から
得られる。プラスミドpＴＰＡ１０３構築のプロトコー
ルを実施例１０に記載し、プラスミドpＴＰＡ１０３の
制限部位および機能地図を添付の図１４、図１５、図１
６および図１７に示す。これらの誘導体を構築するた
め、プラスミドpＴＰＡ１０３のＴＰＡコード化領域の
５'末端の直前にＢamＨＩ制限部位を導入した。プラス
ミドpＴＰＡ１０３を制限酵素ＨgaＩで消化して、ＴＰ
Ａコード化領域の５'末端を含有する〜０.５２kb Ｈga
Ｉ制限フラグメントを単離した。クレノウ処理した後、
このＨgaＩフラグメントをＢamＨＩリンカーにライゲー
トし、制限酵素ＢamＨＩで消化し、そしてＢamＨＩ消化
したプラスミドpＢＲ３２２に挿入してプラスミドpＴＰ
Ａ６０１およびpＴＰＡ６０２を得た。プラスミドpＴＰ
Ａ６０２(このプラスミドは、挿入したＢamＨＩ制限フ
ラグメントの配向だけがプラスミドpＴＰＡ６０１と異
なる)の制限部位および機能地図を添付の図２４に示
す。
【００４１】次いで、プラスミドpＴＰＡ６０２を制限
酵素ＢglＩＩおよびＳalＩで消化し、得られた〜４.２k
b ＢglＩＩ−ＳalＩ制限フラグメントをプラスミドpＴ
ＰＡ１０３の〜２.０５kb ＳalＩ−ＢglＩＩ制限フラグ
メントにライゲートしてプラスミドpＴＰＡ６０３を得
た。従って、プラスミドpＴＰＡ６０３は、両末端がＢa
mＨＩ制限部位で区切られているＴＰＡの完全なコード
化配列を含有している。プラスミドpＴＰＡ６０３の制
限部位および機能地図を添付の図２５に示す。プラスミ
ドpＴＰＡ６０３に類似しているが、しかし改良型ＴＰ
Ａをコードしているプラスミドを構築するため、プラス
ミドpＴＰＡ６０３を制限酵素ＢglＩＩおよびＳstＩで
消化し、得られた〜５.０２kb ＢglＩＩ−ＳstＩフラグ
メントをプラスミドpＢＬＴの〜０.６９kb ＢglＩＩ−
ＳstＩ制限フラグメントにライゲートした。次いで、得
られたプラスミド(pＭＴＰＡ６０３と命名した)を制限
酵素ＢamＨＩで消化し、得られた〜１.３５kbフラグメ
ントを単離した。このフラグメントおよびプラスミドp
ＴＰＡ６０３の〜１.９０kb ＢamＨＩ制限フラグメント
を、別々にＢclＩ消化したプラスミドphd(図１９)にラ
イゲートして、それぞれプラスミドphdＭＴＰＡおよびp
hdＴＰＡを得た。プラスミドphdＴＰＡおよびphdＭＴＰ
Ａの制限部位および機能地図をそれぞれ添付の図２６お
よび図２７に示す。プラスミドphdＴＰＡおよびphdＭＴ
ＰＡの構築(プラスミドpＴＰＡ６０２構築のプロトコー
ルから始める)を実施例１６に記載する。
【００４２】本発明は、真核生物性プロモーターと直列
してＢＫエンハンサーを用いて、大きいＤＮＡウイルス
の即時型遺伝子を発現する真核宿主細胞において、ＤＮ
Ａ配列を転写および発現させるための方法を包含する。
本方法において、実質的にすべての真核生物性プロモー
ターをＢＫエンハンサーと直列して用いることができる
ということについては当業者の理解するところであろ
う。たとえば、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、
ＢＫ初期および後期プロモーター、すべてのポリオーマ
ウイルス群またはパポバウイルス群の初期および後期プ
ロモーター、単純性疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロ
モーター、インターフェロンα１プロモーター、マウス
メタロチオネインプロモーター、レトロウイルス群のプ
ロモーター、β−グロビンプロモーター、アデノウイル
ス群のプロモーター、ウニＨ２Ａプロモーター、コンア
ルブミンプロモーター、卵アルブミンプロモーター、マ
ウスβ−グロビンプロモーター、ヒトβグロビンプロモ
ーター、およびラウス肉腫ウイルスの長い末端繰り返し
(ＬＴＲ)プロモーターは、本発明方法において、すべて
真核生物性プロモーターとして役立ちうる。さらに、上
流の「ＣＡＡＴ」配列を有するか、または有しない「ＴＡ
ＴＡ」様の配列からなる転写開始部位を含有するすべて
の配列が、本発明におけるプロモーターとして役立ちう
る。このようなプロモーターをＢＫエンハンサー含有の
発現ベクター中に都合よく挿入することによって、該プ
ロモーターを本方法に用いることができる(本方法に用
いるに好ましい真核生物性プロモーターであるアデノウ
イルス−２後期プロモーターを用いて本明細書中に例示
したようにして)。
【００４３】本発明を例示するものである本明細書中の
ベクターに用いられるＢＫエンハンサーは、ＢＫウイル
スの原型菌株から単離されたものである。しかし、多数
のＢＫウイルス変異株が単離され、開示されている。ガ
ードナー等[Ｇardner et al.,Ｔhe Ｌancet,１:１２５
３(１９７１);Ｇardner,Ｂrit.Ｍed.Ｊ.,１:７７−７８
(１９７３)をも参照]は最初のＢＫウイルスの単離につ
いて記載しており、従ってこのガードナー株は原型また
は野生型ＢＫウイルスと称されている。ＢＫウイルスの
ガードナー株(図１)は、ＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ
ＶＲ−８３７のもとで入手可能である。大きいＤＮＡ
ウイルスの即時型遺伝子産物の存在下に、ＢＫエンハン
サーを真核生物性プロモーターと直列して用いて有用な
物質(たとえば、核酸およびタンパク質)を発現させる方
法、およびそれ以外のすべての本発明方法は、原型株の
エンハンサーが好ましいものではあるが、いずれもガー
ドナー株または特定のＢＫ変異株に限定されるものでは
ない。本発明方法に用いることができる多数の代表的な
ＢＫ変異株を以下の第１表に挙げる。
【００４４】
【表１】
【表２】
【００４５】宿主細胞が大きいＤＮＡウイルスの即時型
遺伝子産物を発現するものである限り、本方法において
種々の真核宿主細胞を用いることができるということに
ついては当業者の理解するところであろう。多数の方法
(たとえば、プラスミドまたは他のベクターを用いる形
質転換)によって即時型遺伝子産物を宿主細胞に導入す
ることができるので、実質的にすべての真核細胞を本方
法に用いることができる。ヒト細胞はＢＫウイルスの天
然の宿主であり、かつＢＫエンハンサーの刺激に役立つ
細胞因子を含有していると考えられるので、本発明方法
における好ましい宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞
としてはヒト腎細胞が特に好ましいが、Ｅ１Ａ遺伝子産
物を発現するアデノウイルス ５−形質転換したヒト胎
児腎細胞セルライン２９３が最も好ましく、このセルラ
インはＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７５
３のもとで入手可能である。
【００４６】２９３細胞がＥ１Ａ遺伝子産物を発現する
という理由だけではなく、２９３細胞がタンパク質Ｃの
ような複雑な遺伝子産物をγ−カルボキシル化すること
ができ、かつそれ以外に該産物を正確にプロセッシング
することができるという理由から２９３セルラインが好
ましい。腎細胞は通常ある種のタンパク質をγ−カルボ
キシル化し、かつそれ以外にそれをプロセッシングする
が、２９３細胞をアデノウイルスで形質転換すると、通
常特殊な機能が失われてしまう。従って本発明は、天然
にγカルボキシル化され、正しく折りたたまれ、そして
プロセッシングされたタンパク質を産生させるための方
法(該タンパク質を組換えＤＮＡベクター中にコード化
して、該ベクターを含有する真核宿主細胞を適当な発現
条件下で培養したときに該タンパク質が発現されるよう
にする方法)の改良法であって、改良点が、(a)アデノウ
イルスで形質転換したヒト胎児腎細胞に該ベクターを挿
入すること、および(b)カルボキシル化のための十分量
のビタミンＫを含有する培地中、増殖条件下で工程(a)
の宿主細胞を培養すること、からなる方法をも包含する
ものである。
【００４７】真核生物性プロモーターと関連しているＢ
Ｋエンハンサーの活性を改良するための方法を用いて、
実施例１７に記載した新規ＢＫエンハンサー−真核生物
性プロモーター構築物を構築した。この方法は、ＢＫエ
ンハンサーと直列して用いる真核生物性プロモーターの
ＣＡＡＴ流域の５'末端の上流側０−３００ヌクレオチ
ド以内にＢＫエンハンサーを配置することからなる。こ
の方法によって調製した改良型カセットは本発明の重要
な態様を構成する。改良型カセットの好ましい使用法
は、大きいＤＮＡウイルスの即時型遺伝子産物による改
良型カセットの刺激を包含するものであるが、Ｅ１Ａま
たは類似の遺伝子産物を発現する宿主細胞に限定はされ
ない。
【００４８】アデノウイルスのＶＡ遺伝子産物などの他
のウイルス性遺伝子産物を用いて、本方法(ＢＫエンハ
ンサーを用いて真核宿主細胞における組換え遺伝子の転
写および発現を促進させる)の全体の効率を増加させる
ことができる。このＶＡ遺伝子産物は、アデノウイルス
の３分節リーダーを含有するmＲＮＡ分子の翻訳効率を
増加させる[カウフマン(Ｋaufman,ＰＮＡＳ,８２:６８
９−６９３(１９８５));スベンソンおよびアクジャルル
(Ｓvensson and Ａkusjarul.ＥＭＢＯ.４:９５７−９６
４(１９８５))]。本発明のベクターを修飾してアデノウ
イルスの完全な３分節リーダーをコードさせることもで
きるが、実施例１８に示すように、本発明はＶＡ遺伝子
産物を用いて、アデノウイルスの３分節リーダーの最初
の部分だけを含有するmＲＮＡの翻訳を増加させること
を含むものである。
【００４９】アデノウイルスの３分節リーダーは以下の
配列で示される（配列番号１）:
【化１】 [配列中、Ａはリボアデニル、Ｇはリボグアニル、Ｃは
リボシチジル、およびＵはウリジルである]。本明細書
中において、アデノウイルスの３分節リーダーの「最初
の部分」とは、少なくとも以下の配列を含有するもので
ある（配列番号２）:
【化２】
【００５０】すなわち本発明は、有用な物質をコードし
ているＤＮＡ配列および真核生物性プロモーターの両者
を含有している組換えＤＮＡベクターで形質転換した真
核宿主細胞において、該有用な物質を産生させるための
方法(該プロモーターから発現するように該配列を配置
し、該有用な物質の発現に適した条件下で該ベクターを
含有する該細胞を培養する)の改良法であって、mＲＮＡ
がアデノウイルスの完全な３分節リーダーを含有しない
という限定のもと、改良点が、(a)アデノウイルスの３
分節リーダーの最初の部分をコードしているＤＮＡを該
ベクター中に導入して、転写に際して、生成したmＲＮ
Ａが該有用な産物をコードし、そしてその５'末端にお
いて該３分節リーダーの最初の部分を含有しているよう
にすること、(b)工程a)のベクターを含有している該細
胞に、該アデノウイルスのＶＡ遺伝子産物の発現をコー
ドしているＤＮＡ配列を付与すること、および(c)該Ｖ
Ａ遺伝子産物の発現および該mＲＮＡの翻訳の刺激に適
した条件下で工程b)の細胞を培養すること、からなる方
法を含有するものである。
【００５１】ＶＡをコードしているプラスミドは、アデ
ノウイルスＤＮＡから構築した。アデノウイルス−２
ＤＮＡから、ヌクレオチド９８３３のＳalＩ部位および
ヌクレオチド１１５５６のＨindＩＩＩ部位を境界とす
る〜１７２３bpの制限フラグメントを単離し、ＨindＩ
ＩＩ−ＳalＩ消化したプラスミドpＢＲ３２２中にクロ
ーンし、こうしてpＢＲ３２２の〜６２２bp ＳalＩ−Ｈ
indＩＩＩフラグメントを置換してプラスミドpＶＡを構
築した。プラスミドpＶＡから〜１８２６bp ＮruＩフラ
グメントを単離し、このフラグメントをクレノウ処理し
たＢamＨＩ消化プラスミドpＳＶＮeo(ＢＲＬから入手可
能)中に挿入することによって、ネオマイシン耐性およ
びＶＡをコードしているプラスミドを構築した。得られ
たプラスミド(pＶＡ−Ｎeoと命名した)を用い、形質転
換後のネオマイシン(Ｇ４１８)耐性選択によって、すべ
てのセルラインにＶＡ遺伝子を挿入することができる。
【００５２】ＳＶ４０、ＢＫウイルス、またはその他の
すべてのポリオーマウイルスのＴ−抗原を本発明のベク
ターとともに用いて、複製を刺激することによりプラス
ミドのコピー数を増加させ、そして／またはプロモータ
ー活性を増加させることができる。ＳＶ４０ Ｔ−抗原
はアデノウイルスおよびＢＫ後期プロモーターの両者か
らの転写を刺激する。本発明の発現ベクターにＴ−抗原
コード化配列を含有させること、またはこのベクターを
Ｔ−抗原コード化配列を有するプラスミドと同時トラン
スフェクションすることにより、実施例１９に概説した
ように選択圧の応用に先だって、コピー数の増幅を得る
ことができる。これは、発現ベクターの高コピー数組み
込みを可能にする。
【００５３】従って、本発明の好ましい態様において
は、組換えＤＮＡ発現ベクターは、アデノウイルス後期
プロモーター(それ自身は、少なくとも３分節リーダー
の最初の部分および有用な物質をコードしている遺伝子
を発現させるように配置されている)の上流側３００ヌ
クレオチド以内に配置した原型菌株のＢＫエンハンサー
を含有する。この好ましいベクターを用い、修飾を加え
て(発現ベクターで形質転換する前または後に)アデノウ
イルスのＶＡ遺伝子産物を発現させるようにしたヒト胎
児腎２９３細胞を形質転換する。
【００５４】以下に実施例を挙げて、本発明の方法、化
合物および組換え微生物をさらに詳しく説明するが、実
施例中に記載した特定の試薬、装置および方法は単に説
明のために挙げたものであって、本発明を限定するもの
ではない。
【００５５】実施例１ ＢＫウイルスＤＮＡの調製 ＢＫウイルスを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(ＡＴＣＣ)から取得番号ＡＴＣＣ ＶＲ−８
３７のもとで入手する。このウイルスは凍結乾燥品とし
て得られ、これをハンク(Ｈank)のバランス塩[ギブコ
(Ｇibco,３１７５Ｓtaley Ｒoad,Ｇrand Ｉsland,ＮＹ
１４０７２)]に再懸濁して約１０5プラーク生成単位(pf
u)／mlの力価にする。ＢＫウイルスＤＮＡ調製用に選択
した宿主は１次(プライマリー)ヒト胎児腎(ＰＨＥＫ)細
胞であり、この細胞はフロウ・ラボラトリーズ社(Ｆlow
Ｌaboratories,Ｉnc.,７６５５ Ｏld Ｓpringhouse Ｒ
oad,ＭcＬean,ＶＡ ２２１０１)からカタログ番号０−
１００のもとで、またはＭ.Ａ.バイオプロダクツ(Ｍ.
Ａ.Ｂioproducts)からカタログ番号７０−１５１のもと
で入手することができる。
【００５６】全面単層の約１０6ＰＨＥＫ細胞を含有す
る７５mm2ポリスチレンフラスコ約５個を用いてウイル
スを調製する。力価１０5pfu／mlのＢＫウイルス約１ml
を各フラスコに加え、これを３７℃で１時間インキュベ
ートし、次いで新鮮な培養培地[１０％ウシ胎児血清を
追加したデルベッコの改良イーグル培地(Ｄelbecco's
Ｍodified Ｅagle's Ｍedium,Ｇibco)]を加え、感染細
胞を３７℃で１０−１４日間またはウイルスの完全な細
胞病原性効果が認められるまでインキュベートする。こ
の細胞病原性効果はセルラインの種類およびウイルスの
種類によって変わるが、通常、丸くなり、凝集し、そし
て培養盤から剥がれる細胞からなる。
【００５７】凍結−解凍を３回繰り返すことによってこ
の細胞からウイルスを放出させ、５０００Ｘgで遠心し
て細胞破片を除去する。ＰＥＧ−６０００(１００g)を
加え、この溶液を４℃で２４時間インキュベートし、そ
して５０００Ｘgで２０分間遠心することによって、上
清液１l中のウイルスを沈澱させ、集める。このペレッ
トを、最初の容積の１／１００となるように０.１Ｘ Ｓ
ＳＣ緩衝液[１Ｘ ＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮaＣlおよび０.
０１５Ｍクエン酸Ｎa(pＨ＝７)]に溶解する。このウイ
ルス懸濁液を、試験管中の飽和ＫＢr溶液１５mlに層状
に加え、これを７５,０００Ｘgで３時間遠心する。遠心
後、このＫＢr溶液中に２つのバンドが現れる。完全な
ビリオンを含有する低い方のバンドを集め、ＴＥ[１０m
Ｍトリス−ＨＣl(pＨ＝７.８)および１mＭ ＥＤＴＡ]を
溶離緩衝液として用いてセファデックス(Ｓephadex)Ｇ
−５０カラムで脱塩する。
【００５８】このカラムから得た精製ビリオン溶液に、
ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を１％濃度となるよう
に加え、プロナーゼを１００μg／ml濃度となるように
加え、そしてこの溶液を３７℃で２時間インキュベート
する。次いで、この溶液に塩化セシウムを１.５６g／ml
濃度となるように加え、臭化エチジウムを最終濃度１０
０μg／mlとなるように加える。この溶液を、ソーバル
(Ｓorval)８６５ローターまたは同様の垂直ローター
中、２６０,０００Ｘgで２４時間遠心する。遠心後、ウ
イルスＤＮＡのバンドを単離し、１００mＭトリス−Ｈ
Ｃl(pＨ＝７.８)で飽和したイソアミルアルコールで５
回抽出する。次いでこのＢＫウイルスＤＮＡの溶液を、
ＤＮＡの２６０nm／２８０nm吸収比が１.７５と１.９０
の間に入るまで、ＴＥ緩衝液に対して透析する。ＮaＣl
濃度を０.１５Ｍに調整し、２倍量のエタノールを加
え、この溶液を−７０℃で少なくとも２時間インキュベ
ートし、そして１２,０００Ｘgで１０分間遠心すること
によってＤＮＡを沈澱させる。得られたＢＫウイルスＤ
ＮＡのペレットを、１mg／mlの濃度でＴＥ緩衝液に懸濁
させる。
【００５９】実施例２ プラスミドpＢＫＥ１およびpＢ
ＫＥ２の構築 ＴＥ緩衝液１μl中のＢＫウイルスＤＮＡ(実施例１で調
製した)約１μgを、１０×ＥcoＲＩ緩衝液[１.０Ｍトリ
ス−ＨＣl(pＨ＝７.５)、０.５Ｍ ＮaＣl、５０mＭ Ｍ
gＣl2および１mg／ml ＢＳＡ]２μlおよび水１５μlに
溶解した。このＤＮＡ溶液に、制限酵素ＥcoＲＩ約２μ
l[〜１０単位:酵素の実際の供給源は異なることもある
が、本明細書中で用いるすべての酵素単位は、他に記載
がなければ、ニュー・イングランド・バイオラブズ(Ｎe
w Ｅngland Ｂiolabs,３２ Ｔozer Ｒoad,Ｂeverly,Ｍ
Ａ ０１９１５−９９９０)定義の単位を意味する]を加
え、得られた反応溶液を３７℃で２時間インキュベート
した。
【００６０】実質的に、ＥcoＲＩ消化したＢＫウイルス
ＤＮＡを調製するための方法に従って、ＴＥ緩衝液１μ
l中のプラスミドpＵＣ８[ファーマシア Ｐ−Ｌ バイオ
ケミカルズ(Ｐharmacia Ｐ−Ｌ Ｂiochemicals,８００
Ｃentennial Ａve.,Ｐiscataway,Ｎ.Ｊ.０８８５４)か
ら入手可能]約１μgをＥcoＲＩで消化した。このＥcoＲ
Ｉ消化したプラスミドpＵＣ８ ＤＮＡをＴＥ緩衝液で１
００μlに希釈し、この溶液にウシ腸アルカリホスファ
ターゼ〜０.０６単位を加え、得られた反応溶液を３７
℃で３０分間インキュベートした。１×ＳＥＴ[５mＭト
リス−ＨＣl(pＨ＝７.８)、５mＭ ＥＤＴＡおよび１５
０mＭ ＮaＣl]、０.３Ｍ ＮaＯＡc、および０.５％ＳＤ
Ｓを含有するようにこの溶液を調整し、次いで６５℃で
４５分間インキュベートした。このホスファターゼ処理
はpＵＣ８ ＤＮＡが自己ライゲートするのを防止する。
【００６１】このＥcoＲＩ消化したＢＫウイルスおよび
プラスミドpＵＣ８ ＤＮＡを、始め緩衝フェノールで、
次いでクロロホルムで抽出した。各ＤＮＡ溶液のＮaＣl
濃度を０.２５Ｍに調整し、２倍量のエタノールを加
え、得られた混合物をドライアイス−エタノール浴で５
分間インキュベートし、そして遠心してＤＮＡをペレッ
ト化することによってＤＮＡを集めた。上清を除去し、
ＤＮＡペレットを７０％エタノールですすぎ、乾燥し、
そしてＢＫおよびプラスミドpＵＣ８試料用のＴＥ緩衝
液それぞれ１０μlおよび３０μlに再懸濁した。
【００６２】水約３μlおよび１０×リガーゼ緩衝液
[０.５Ｍトリス−ＨＣl(pＨ＝７.８)、１００mＭ ＭgＣ
l2、２００mＭ ＤＴＴ、１０mＭ ＡＴＰ、および０.５m
g／mlＢＳＡ]１μlを、ＥcoＲＩ消化したＢＫウイルス
２μlおよびＥcoＲＩ消化したプラスミドpＵＣ８ ＤＮ
Ａ１μlの混合物に加えた。このＤＮＡ溶液にＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼ１μl(〜１０００単位)を加え、得られた反
応液を１６℃で一晩インキュベートした。このライゲー
ト化ＤＮＡは所望のプラスミドpＢＫＥ１およびpＢＫＥ
２からなり、これらは挿入したＢＫウイルスＤＮＡの配
向だけが異なっている。プラスミドpＢＫＥ１の制限部
位および機能地図を添付の図２に示す。
【００６３】Ｌ−ブロス中のＥ.コリ(Ｅ.coli)Ｋ１２
ＪＭ１０３(ファーマシア Ｐ−Ｌ バイオケミカルズか
ら入手可能)培養物５０mlを、６５０ナノメーターにお
ける光学密度(Ｏ.Ｄ.650)が約０.４吸収単位になるまで
増殖させた。この培養物を氷上で１０分間冷却し、遠心
して細胞を集めた。この細胞ペレットを１００mＭの冷
ＭgＣl2２５mlに再懸濁し、氷上で２５分間インキュベ
ートした。この細胞を遠心してもう一度ペレット化し、
ペレットを１００mＭの冷ＣaＣl2２.５mlに再懸濁し、
氷上で３０分間インキュベートした。インキュベート
後、この細胞は形質転換するＤＮＡの取り込みに対して
コンピテントである。
【００６４】この細胞懸濁液２００μlを、上記のよう
にして調製したライゲート化ＤＮＡと混合し、氷上で３
０分間インキュベートした。この時間が経過した後、細
胞を４２℃の水浴に２分間入れ、次いで氷上に戻してさ
らに１０分間インキュベートした。遠心して細胞を集
め、Ｌ−ブロス１mlに再懸濁し、３７℃で１時間インキ
ュベートした。
【００６５】この細胞混合物の一部を、１００μgアン
ピシリン／ml、４０μg Ｘ−gal／mlおよび４０μgＩＰ
ＴＧ／ml含有のＬ−寒天(１lあたり寒天１５g含有する
Ｌ−ブロス)プレート上にプレートした。このプレート
を３７℃で一晩インキュベートした。挿入体を含まない
プラスミドを含有するコロニー(Ｅ.コリＫ１２ ＪＭ１
０３／pＵＣ８など)はプレート上で青色を呈し、挿入体
を含むプラスミドを含有するコロニー(Ｅ.コリＫ１２
ＪＭ１０３／pＢＫＥ１)は白色を呈する。白色コロニー
数個を選び、それらのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析
によって、ＢＫウイルスの〜５.２kb ＥcoＲＩ制限フラ
グメントの存在についてスクリーニングした。実質的
に、後記実施例記載のプラスミドＤＮＡの単離方法に従
って(制限酵素分析のためだけにプラスミドＤＮＡを単
離するときには、ＣsＣl勾配の工程を省略し、比較的小
さいスケールで行う)、Ｅ.コリＫ１２ ＪＭ１０３／pＢ
ＫＥ１およびＥ.コリＫ１２ ＪＭ１０３／pＢＫＥ２細
胞からプラスミドＤＮＡを得た。
【００６６】実施例３ プラスミドpＢＫneo１およびp
ＢＫneo２の構築 Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pdＢＰＶ−ＭＭＴneo細胞
を、ＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ ３７２２４のも
と、凍結乾燥品として入手する。この凍結乾燥細胞を、
１００μg／mlのアンピシリンを含有するＬ−寒天プレ
ート上にプレートし、３７℃でインキュベートして単一
のコロニー単離体を得る。
【００６７】５０μg／mlのアンピシリンを含有するＬ
−ブロス(１lあたりトリプトン１０g、ＮaＣl １０g、
および酵母抽出物５g)１lにＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１
／pdＢＰＶ−ＭＭＴneoのコロニーを接種し、空気振盪
器中、３７℃で、Ｏ.Ｄ.590が〜１吸収単位になるまで
インキュベートし、この時点でクロラムフェニコール１
５０mgを培養物に加えた。インキュベートを約１６時間
継続した。クロラムフェニコールの添加によりタンパク
質の合成が阻害され、従って細胞分裂が阻害されるが、
プラスミドの複製は継続して起こり得る。
【００６８】この培養物を、ソーバル(Ｓorvall)ＧＳＡ
ローター(ＤuＰont Ｃo.,Ｉnstrument Ｐroducts,Ｂiom
edical Ｄivision,Ｎewtown,ＣＮ ０６４７０)中、６０
００rpm、４℃で５分間遠心した。得られた上清を除去
し、細胞ペレットをＴＥＳ緩衝液[１０mＭトリス−ＨＣ
l(pＨ＝７.５)、１０mＭ ＮaＣl、および１mＭ ＥＤＴ
Ａ]４０mlで洗浄し、次いで再ペレット化した。上清を
除去し、細胞ペレットをドライアイス−エタノール浴で
凍結させ、次いで解凍した。解凍した細胞ペレットを、
２５％ショ糖および５０mＭ ＥＤＴＡの溶液１０mlに再
懸濁した。この溶液に５mg／mlリソチーム溶液約１ml、
０.２５ＭのＥＤＴＡ(pＨ＝８.０)３ml、および１０mg
／mlのＲＮアーゼＡ １００μlを加え、次いで氷上で１
５分間インキュベートした。このリソチーム処理した細
胞に、溶解溶液[１０％トリトン−Ｘ１００(３ml)、０.
２５Ｍ ＥＤＴＡ(pＨ＝８.０)７５ml、１Ｍトリス−Ｈ
Ｃl(pＨ＝８.０)１５ml、および水７mlを混合して調製
する]３mlを加え、混合し、得られた溶液を氷上でさら
に１５分間インキュベートした。溶解した細胞をドライ
アイス−エタノール浴で凍結させ、ついで解凍した。
【００６９】ＳＷ２７ローター(Ｂeckman,７３６０Ｎ.
Ｌincoln Ａve.,Ｌincolnwood,ＩＬ６０６４６)中、２
５,０００rpmで４０分間遠心し、緩衝フェノールで抽出
することによって、溶液から細胞の残骸を除去した。こ
の細胞抽出物に、ＣsＣl約３０.４４gおよび５mg／ml臭
化エチジウム溶液〜１mlを加え、次いでこの溶液の容量
をＴＥＳ緩衝液で４０mlに調整した。この溶液をＶＴi
５０超遠心管(Ｂeckman)中にデカンテーションし、次い
で封をし、ＶＴi５０ローター中、４２,０００rpmで〜
１６時間遠心した。紫外線で目に見えるようにしたプラ
スミドのバンドを単離し、Ｔi７５遠心管およびロータ
ー(Ｂeckman)に入れ、５０,０００rpmで１６時間遠心し
た。必要な容量調整はすべて０.７６１g／mlのＣsＣlを
含有するＴＥＳを用いて行った。このプラスミドバンド
をもう一度単離し、塩で飽和させたイソプロパノールで
抽出して臭化エチジウムを除去し、そしてＴＥＳ緩衝液
で１:３に希釈した。次いでこの溶液に２倍量のエタノ
ールを加え、−２０℃で一晩インキュベートした。この
溶液を、ＳＳ３４ローター(Ｓorvall)中、１０,０００r
pmで１５分間遠心することによって、プラスミドＤＮＡ
をペレット化した。
【００７０】この方法によって得たプラスミドpdＢＰＶ
−ＭＭＴneoＤＮＡ〜１mgをＴＥ緩衝液１mlに懸濁さ
せ、−２０℃で保存した。通常、前記のプラスミド単離
法は、大量の極めて純粋なプラスミドＤＮＡが必要なと
きに用いられる。この方法を若干変え、培養細胞を約５
mlだけ用い、適宜減少させた溶解緩衝液中で細胞を溶解
し、そして遠心工程をフェノールおよびクロロホルム抽
出に置き換えることによって、比較的少量の、やや純度
の劣るＤＮＡ(あるプラスミドの存在について形質転換
体をスクリーニングする場合に必要となるようなＤＮ
Ａ)を早く得ることができる。
【００７１】１０×ＢamＨＩ緩衝液[１.５Ｍ ＮaＣl、
６０mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝７.９)、６０mＭ ＭgＣ
l2、および１mg／mlＢＳＡ]２μl、制限酵素ＢamＨＩ
１μlおよび水７μlを含有する溶液中、３７℃で２時
間、上記で調製したプラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴneoＤ
ＮＡ約５μg(５μl)および実施例１で調製したＢＫウイ
ルスＤＮＡ５μg(５μl)それぞれを消化した。等容量の
フェノールで抽出し、次いでクロロホルムで２回抽出す
ることによって反応を呈しさせた。ＢamＨＩ消化したＤ
ＮＡそれぞれを沈澱させ、遠心して集め、水５μlに再
懸濁した。
【００７２】ＢamＨＩ消化したプラスミドpdＢＰＶ−Ｍ
ＭＴneo(１μl)およびＢamＨＩ消化したＢＫウイルスＤ
ＮＡ(１μl)の混合物に、１０×リガーゼ緩衝液約１μl
を加えた。このＤＮＡ混合物に、Ｔ−４ ＤＮＡリガー
ゼ１μl(〜１０００単位)および水６μlを加え、得られ
た反応溶液を１６℃で一晩インキュベートした。このラ
イゲート化ＤＮＡは所望のプラスミドpＢＫneo１および
pＢＫneo２からなり、これらはＢＫウイルスＤＮＡの配
向だけが異なっている。プラスミドpＢＫneo１の制限部
位および機能地図を添付の図３に示す。
【００７３】Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１細胞は、ノーザ
ン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー(ＮＲＲＬ)
から取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２６のもと、凍結乾
燥品として入手可能である。実質的に、実施例２の方法
に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１細胞を培養し、形
質転換用にコンピテントにし、上記で調製したライゲー
ト化ＤＮＡで形質転換した。この形質転換細胞を、１０
０μg／mlアンピシリンを含有するＬ−寒天プレート上
にプレートした。Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＢＫneo
１およびＥ.コリＫ１２／pＢＫneo２形質転換体を、そ
のアンピシリン耐性の表現型およびそのプラスミドＤＮ
Ａの制限酵素分析によって同定した。
【００７４】実施例４ プラスミドpＢＬcatの構築 Ａ.中間体プラスミドpＬＰcatの構築 アデノウイルス２(Ａd２)のビリオンＤＮＡは、約３５.
９４kbの大きさの、２本鎖の直線状分子である。このＡ
d２の後期プロモーターは、Ａd２ゲノムの〜０.３１６k
b ＡccＩ−ＰvuＩＩ制限フラグメントとして単離するこ
とができ、この〜０.３２kb制限フラグメントは、Ａd２
ゲノムのヌクレオチド位置５７５５と６０７１の間の配
列に対応している。所望の〜０.３２kb ＡccＩ−ＰvuＩ
Ｉ制限フラグメントを単離するため、始めにＡd２ ＤＮ
Ａを制限酵素ＢalＩで消化し、〜０.３２kb ＡccＩ−Ｐ
vuＩＩ制限フラグメントの完全な配列を含有する〜２.
４kb ＢalＩ制限フラグメントを単離する。次いで、こ
の〜２.４kb ＢalＩ制限フラグメントをＡccＩおよびＰ
vuＩＩで消化して所望のフラグメントを得る。
【００７５】Ａd２ ＤＮＡ(ＢＲＬから入手可能)約５０
μgを、水８０μlおよび１０×ＢalＩ緩衝液[１００mＭ
トリス−ＨＣl(pＨ＝７.６)、１２０mＭ ＭgＣl2、１０
０mＭ ＤＴＴ、および１mg／mlＢＳＡ]１０μlに溶解す
る。このＡd２ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＢalＩ約１０
μl(〜２０単位)を加え、得られた反応液を３７℃で４
時間インキュベートする。
【００７６】制限フラグメントが十分に分離するまで、
ＢalＩ消化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけ
る。電気泳動したＤＮＡの可視化は、臭化エチジウムの
希釈溶液(０.５μg／ml)中でゲルを染色し、染色したゲ
ルに長波長紫外光(ＵＶ)をあてることによって行う。ア
ガロースからＤＮＡを単離する方法の１つは以下のよう
である。所望のフラグメントの前方のゲルに小さい切れ
目を入れ、各切れ目にＮＡ−４５ ＤＥＡＥメンブラン
[シュライヒャー・アンド・シュエル(Ｓchleicher and
Ｓchuell,Ｋeene,ＮＨ ０３４３１)]の小片を差し込
む。さらに電気泳動を続けると、ＤＮＡがＤＥＡＥメン
ブランに非共有結合的に結合する。所望のフラグメント
がＤＥＡＥメンブランに結合した後、メンブランを取り
上げ、低塩の緩衝液[１００mＭ ＫＣl、０.１mＭ ＥＤ
ＴＡ、および２０mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝８)]ですす
ぐ。次いで、メンブランを小さい試験管に入れ、高塩の
緩衝液[１Ｍ ＮaＣl、０.１mＭ ＥＤＴＡ、および２０m
Ｍ トリス−ＨＣl(pＨ＝８)]中に浸漬し、そして６５℃
で１時間インキュベートしてＤＥＡＥ紙からＤＮＡを取
り出す。６５℃のインキュベーションの後、インキュベ
ート緩衝液を集め、メンブランを高塩緩衝液ですすぐ。
この高塩緩衝液ですすいだ溶液を、高塩インキュベート
緩衝液といっしょにプールする。
【００７７】ＮaＣl濃度が０.２５Ｍとなるように、高
塩−ＤＮＡ溶液の容積を調整し、次いでこの溶液に３倍
量の無水の冷エタノールを加える。得られた溶液を混合
し、１０−２０分間、−７０℃に保つ。次いでこの溶液
を１５,０００rpmで１５分間遠心する。残留する塩を除
去するため、もう一度この沈澱操作を行った後、ＤＮＡ
ペレットをエタノールですすぎ、乾燥し、ＴＥ緩衝液２
０μl中に再懸濁する。このペレットはＡd２の所望の制
限フラグメント約３μgからなる。得られた精製フラグ
メントをＴＥ緩衝液１０μlに溶解する。
【００７８】水約６μlおよび１０×ＡccＩ緩衝液[６０
mＭ ＮaＣl、６０mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝７.５)、６０
mＭ ＭgＣl2、６０mＭ ＤＴＴ、および１mg／ml ＢＳ
Ａ]２μlを、Ａd２の〜２.４kb ＢalＩ制限フラグメン
トの溶液に加える。このＤＮＡ溶液に制限酵素ＡccＩ約
２μl(〜１０単位)を加えた後、反応液を３７℃で２時
間インキュベートする。このＡccＩ消化の後、ＤＮＡを
エタノール沈澱で集め、水１６μlおよび１０×ＰvuＩ
Ｉ緩衝液[６００mＭ ＮaＣl、６０mＭトリス−ＨＣl(p
Ｈ＝７.５)、６０mＭ ＭgＣl2、６０mＭ ＤＴＴ、およ
び１mg／ml ＢＳＡ]２μl中に再懸濁する。このＤＮＡ
溶液に制限酵素ＰvuＩＩ約２μl(約１０単位)を加えた
後、反応液を３７℃で２時間インキュベートする。
【００７９】Ａd２の後期プロモーターを含有する〜０.
３２kb ＡccＩ−ＰvuＩＩ制限フラグメントが他の消化
産物から分離するまで、ＡccＩ−ＰvuＩＩ消化した、Ａ
d２の〜２.４kb ＢalＩ制限フラグメントを〜６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかける。このゲルを臭化
エチジウムで染色し、ＵＶ光を用いて観察し、〜０.３
２kb ＡccＩ−ＰvuＩＩ制限フラグメントを含有するゲ
ルセグメントをゲルから切り出し、つぶし、抽出緩衝液
[５００mＭ ＮＨ4ＯＡc、１０mＭ ＭgＯＡc、１mＭ Ｅ
ＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳ]〜２５０μl中に、室温
で一晩浸漬する。翌朝、この混合物を遠心し、ペレット
を除去する。上清中のＤＮＡをエタノールで沈澱させ、
tＲＮＡ約２μgを加えて所望のフラグメントの沈澱を完
全なものにする。〜０.３２kb ＡccＩ−ＰvuＩＩ制限フ
ラグメント約０.２μgが得られ、これを水７μlに懸濁
させる。
【００８０】実質的に、後記実施例１０Ａに記載した方
法に従って、キナーゼ処理しておいたＢclＩリンカー
[５'−ＣＴＧＡＴＣＡＧ−３';ニュー・イングランド・
バイオラブズ(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs)から入手可能]
約０.２５μg(０.５μl中)を、〜０.３２kb ＡccＩ−Ｐ
vuＩＩ制限フラグメントの溶液に加え、次いでこのＤＮ
Ａ溶液にＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μl(〜１０００単位)お
よび１０×リガーゼ緩衝液１μlを加え、得られた反応
液を１６℃で一晩インキュベートした。このＢclＩリン
カーは、ＡccＩ−ＰvuＩＩ制限フラグメントのＰvuＩＩ
末端にだけライゲートすることもある。後に行ったＤＮ
Ａ配列決定により、ＡccＩ−ＰvuＩＩ制限フラグメント
のＰvuＩＩ末端には４個のＢclＩリンカーが結合してい
ることがわかった。これら余分のＢclＩリンカーをＢcl
Ｉ消化および再ライゲートによって除去することができ
るが、これらのリンカーは余分のリンカーを含有するベ
クターの正しい機能を妨害しないので、これら余分のＢ
clＩリンカーを除去しなかった。
【００８１】Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＳＶ２cat細
胞をＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ３７１５５のもと、
凍結乾燥品として入手し、実質的に実施例３の方法に従
ってこの細胞からプラスミドpＳＶ２cat ＤＮＡを単離
した。プラスミドpＳＶ２catの制限部位および機能地図
を添付の図４に示す。プラスミドpＳＶ２cat ＤＮＡ約
１mgが得られ、これをＴＥ緩衝液１mlに溶解する。プラ
スミドpＳＶ２cat ＤＮＡ約３μg(３μl)を１０×Ａcc
Ｉ緩衝液２μlおよび水１６μlに加え、次いで制限酵素
ＡccＩ３μl(約９単位)をこのpＳＶ２cat ＤＮＡ溶液に
加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベート
した。次いで、１０×ＳtuＩ緩衝液[１.０Ｍ ＮaＣl、
１００mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝８.０)、１００mＭ Ｍg
Ｃl2、６０mＭ ＤＴＴ、および１mg／ml ＢＳＡ]３μ
l、水５μl、および制限酵素ＳtuＩ約２μl(約１０単
位)を加えることにより、このＡccＩ消化したプラスミ
ドpＳＶ２cat ＤＮＡを制限酵素ＳtuＩで消化した。得
られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。こ
の反応混合物をフェノールで１回、次いでクロロホルム
で２回抽出することによって反応を停止させた。所望の
フラグメント約０.５μgが得られ、これをＴＥ緩衝液２
０μlに溶解した。
【００８２】ＡccＩ−ＳtuＩ消化したプラスミドpＳＶ
２cat ＤＮＡ約４μlを、Ａd２の〜０.３２kb ＡccＩ−
ＰvuＩＩ(ＢclＩリンカーが結合している)制限フラグメ
ント約７μlと混合し、１０×リガーゼ緩衝液３μl、水
１５μl、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ２μl(約１０００
単位)を加えた後、このライゲーション混合物を１６℃
で一晩インキュベートした。このライゲートしたＤＮＡ
は所望のプラスミドpＬＰcat、すなわち、Ａd２後期プ
ロモーター(クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を転写し、これを発現させるように配置
されている)を含有するプラスミドからなっていた。プ
ラスミドpＬＰcatの制限部位および機能地図を添付の図
５に示す。
【００８３】実質的に実施例３の方法に従い、このライ
ゲート化ＤＮＡを用いてＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１細胞
を形質転換した。形質転換細胞を、５０μg／mlアンピ
シリンを含有するＬ−寒天で平板培養した。プラスミド
ＤＮＡの制限酵素分析を用いてＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０
１／pＬＰcat形質転換体を同定した。実施例３に記載し
たプラスミド単離法に実質的に従って、後の構築に用い
るためにプラスミドpＬＰcat ＤＮＡを形質転換体から
単離した。
【００８４】Ｂ.プラスミドpＢＬcatの最終的な構築 １０×ＡccＩ緩衝液７.５μl、水３０μl、および制限
酵素ＡccＩ１５μl(約７５単位)に、ＴＥ緩衝液５０μl
中のプラスミドpＢＫneo１ＤＮＡ約８８μgを加え、得
られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。Ａ
ccＩ消化したＢＫウイルスＤＮＡをアガロースゲルにか
け、ＢＫエンハンサーを含有する〜１.４kbフラグメン
トを他の消化産物から分離した。次いで、実施例４Ａ記
載の方法に実質的に従って、〜１.４kb ＡccＩ制限フラ
グメントを単離した。このフラグメント約５μgを、１
０×ＰvuＩＩ緩衝液５μl、水４５μl、および制限酵素
ＰvuＩＩ ５μl(約２５単位)中に再懸濁し、得られた反
応液を３７℃で２時間インキュベートした。次いで、実
質的に実施例４Ａの方法に従って、ＰvuＩＩ消化したＤ
ＮＡをライゲーション用に単離し、調製した。所望の〜
１.２８kb ＡccＩ−ＰvuＩＩフラグメントが約２μg得
られ、これをＴＥ緩衝液５μlに溶解した。
【００８５】プラスミドpＬＰcat ＤＮＡ約１μgを、１
０×ＡccＩ緩衝液５μlおよび水４０μlに溶解した。制
限酵素ＡccＩ約５μl(〜２５単位)をプラスミドpＬＰca
tＤＮＡの溶液に加え、得られた反応液を３７℃でイン
キュベートした。ＡccＩ消化したプラスミドpＬＰcat
ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１０×ＳtuＩ緩衝液５
μl、水４０μl、および制限酵素ＳtuＩ ５μl(約２５
単位)中に再懸濁し、得られた反応液を３７℃で２時間
インキュベートした。ＡccＩ−ＳtuＩ消化したプラスミ
ドpＬＰcat ＤＮＡをエタノールで数回沈澱させて、他
の消化産物(大きさが１６bpの制限フラグメント)を含ま
ない、Ｅ.コリの複製期限およびＡd２後期プロモーター
を含有する〜４.８１kb ＡccＩ−ＳtuＩ制限フラグメン
トを精製した。所望の〜４.８１kb制限フラグメントが
約１μg得られ、これをＴＥ緩衝液２０μlに溶解した。
【００８６】プラスミドpＬＰcatの〜４.８１kb ＡccＩ
−ＳtuＩ制限フラグメント５μlを、ＢＫウイルスの
１．２８kb ＡccＩ−ＰvuＩＩ制限フラグメント５μlに
加えた。このＤＮＡ混合物に、１０×リガーゼ緩衝液３
μl、水１５μl、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ２μl(約１
０００単位)を加えた後、このライゲーション反応液を
１６℃で一晩インキュベートした。このライゲート化Ｄ
ＮＡは所望のプラスミドpＢＬcatからなっていた。プラ
スミドpＢＬcatの制限部位および機能地図を添付の図６
に示す。
【００８７】実施例３記載の方法に実質的に従い、この
ライゲート化ＤＮＡを用いてＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１
細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡの制限酵素分析
によって、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＢＬcat形質転
換体を同定した。実質的に実施例３の方法に従って、後
の構築に用いるためにプラスミドpＢＬcat ＤＮＡを調
製した。
【００８８】実施例５ プラスミドpＳＢＬcatの構築 プラスミドpＢＬcat ＤＮＡ約１００μgを、１０×Ｈin
dＩＩＩ緩衝液[０.５Ｍ ＮaＣl、０.１Ｍトリス−ＨＣl
(pＨ＝８.０)、０.１Ｍ ＭgＣl2、および１mg／ml ＢＳ
Ａ]１０μlおよび水８０μlに溶解した。このプラスミ
ドpＢＬcatＤＮＡの溶液に、制限酵素ＨindＩＩＩ約１
０μl(約１００単位)を加え、得られた反応液を３７℃
で２時間インキュベートした。ＢＫエンハンサーおよび
Ａd２後期プロモーターを含有する〜０.８７kb ＨindＩ
ＩＩ制限フラグメントが他の消化産物から十分に分離す
るまで、ＨindＩＩＩ消化したプラスミドpＢＬcat ＤＮ
Ａをアガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的
に実施例４Ａの方法に従って、この〜０.８７kbフラグ
メントをライゲーション用に単離し、調製した。目的の
フラグメントが約１０μg得られ、これをＴＥ緩衝液５
０μlに溶解した。
【００８９】ＴＥ緩衝液１μl中のプラスミドpＳＶ２ca
t ＤＮＡ約１μgを、１０×ＨindＩＩＩ緩衝液２μlお
よび水１６μlに溶解した。このＤＮＡ溶液に制限酵素
ＨindＩＩＩ約１μl(約１０単位)を加え、得られた反応
液を３７℃で２時間インキュベートした。この反応混合
物を始めにフェノールで、次いでクロロホルムで２回抽
出することによって、反応を停止させた。ＨindＩＩＩ
消化したプラスミドpＳＶ２cat ＤＮＡをエタノールで
沈澱させ、ＴＥ緩衝液１００μlに再懸濁した。このＨi
ndＩＩＩ消化したプラスミドpＳＶ２cat ＤＮＡを、実
質的に実施例２の方法に従って、ウシ腸アルカリホスフ
ァターゼで処理し、次いでＴＥ緩衝液１０μlに再懸濁
した。
【００９０】プラスミドpＢＬcatの〜０.８７kb Ｈind
ＩＩＩ制限フラグメント約５μlを、ＨindＩＩＩ消化し
たプラスミドpＳＶ２cat １０μlに加え、次いでこのＤ
ＮＡ溶液に、１０×リガーゼ緩衝液３μl、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ２μl(約１０００単位)、および水１３μlを加
え、この反応液を１６℃で２時間インキュベートした。
このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドpＳＢＬcat
からなっていた。このライゲート化ＤＮＡを用い、実質
的に実施例３の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ＨＢ１０
１を形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有の
Ｌ−寒天で平板培養し、制限酵素分析によってアンピシ
リン耐性形質転換体のプラスミドＤＮＡを試験して、
Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＳＢＬcat形質転換体を同
定した。ＢＫエンハンサーおよびＡd２後期プロモータ
ーをコードしている〜０.８７kb ＨindＩＩＩ制限フラ
グメントは、ＨindＩＩＩ消化したプラスミドpＳＢＬca
t中に、２つの配向のうちのいずれかで挿入される(その
うちの１つだけがプラスミドpＳＢＬcatを与える)。プ
ラスミドpＳＢＬcatの制限部位および機能地図を添付の
図８に示す。
【００９１】実施例６ プラスミドpＬ１３３の構築 Ａ.中間体プラスミドpＳＶ２−ＨＰＣ８の構築 プラスミドpＨＣ７はヒトタンパク質Ｃをコードしてい
るＤＮＡ配列を含有している。１５μg／mlのテトラサ
イクリンを含有するＬ−ブロス１lにＥ.コリＫ１２ Ｒ
Ｒ１／pＨＣ７(ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２６)の培養物を接
種し、実質的に実施例３の方法に従ってプラスミドpＨ
Ｃ７ ＤＮＡを単離し、精製した。この操作により約１m
gのプラスミドpＨＣ７ ＤＮＡが得られ、これをＴＥ緩
衝液１mlに懸濁し、−２０℃で保存した。プラスミドp
ＨＣ７の制限部位および機能地図を添付の図９に示す。
【００９２】プラスミドpＨＣ７ ＤＮＡ５０μlを、制
限酵素ＢanＩ ５μl(〜５０単位)、１０×ＢanＩ反応緩
衝液[１.５Ｍ ＮaＣl、６０mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝７.
９)、６０mＭ ＭgＣl2、および１mg／ml ＢＳＡ]１０μ
lおよび水３５μlと混合し、消化が完結するまでインキ
ュベートした。次いで、〜１.２５kb ＢanＩ制限フラグ
メントが他の消化産物から分離するまで、このＢanＩ消
化したプラスミドpＨＣ７ ＤＮＡを３.５％ポリアクリ
ルアミドゲル(アクリルアミド:ビスアクリルアミド＝２
９:１)電気泳動にかけた。
【００９３】この〜１.２５kb ＢanＩ制限フラグメント
を含有するゲル部分をゲルから切り出し、試験管に入
れ、細かくつぶした。このフラグメントを含有する試験
管に抽出緩衝液(５００mＭ ＮＨ4ＯＡc、１０mＭ ＭgＯ
Ａc、１mＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、および１０mg／ml
tＲＮＡ)１mlを加え、一晩試験管を３７℃に保った。遠
心して残骸をペレット化し、上清を新しい試験管に移し
た。残骸を抽出緩衝液２００μlで１回洗浄し、洗浄液
の上清を、最初の、一晩抽出物からの上清といっしょに
した。この上清を、ガラスウールを詰めたところに通し
た後、２倍量のエタノールを加え、混合した。得られた
溶液を〜１０分間ドライアイス−エタノール浴に入れ、
次いで遠心してＤＮＡをペレット化した。
【００９４】この操作により約８μgの〜１.２５kb Ｂa
nＩ制限フラグメントが得られた。この精製フラグメン
トをＴＥ緩衝液１０μlに懸濁し、−２０℃で保存し
た。プラスミドpＳＶ２−ＨＰＣ８を構築するために
は、リンカーを付加することによってＢanＩ制限フラグ
メントを修飾しなければならない。このリンカーの構築
に用いるＤＮＡフラグメントを、システック １４５０
Ａ ＤＮＡ合成機(Ｓystec１４５０Ａ ＤＮＡ Ｓynthesi
zer;Ｓystec Ｉnc.,３８１６ Ｃhandler Ｄrive,Ｍinne
apolis,ＭＮ)またはＡＢＳ ３８０Ａ ＤＮＡ合成機(Ａp
plied Ｂiosystems,Ｉnc.,８５０ Ｌincoln Ｃentre Ｄ
rive,Ｆoster Ｃity,ＣＡ ９４４０４)のどちらかを用
いることによって合成した。当分野においては多数のＤ
ＮＡ合成装置が知られており、これらを用いてフラグメ
ントを調製することができる。さらに、実質的にイタク
ラ等[Ｉtakura et al.,Ｓcience,１９８:１０５６(１９
７７)]およびクレア等[Ｃrea et al.,Ｐroc.Ｎat.Ａca
d.Ｓci.ＵＳＡ,７５:５７６５(１９７８)]の方法に従っ
て、常法によりフラグメントを調製することもできる。
【００９５】Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１５単位
(〜０.５μl)、１０×リガーゼ緩衝液２μl、５００μ
Ｍ ＡＴＰ１０μl、および水７.５μlを含有する反応緩
衝液２０μl中で、１本鎖リンカーそれぞれ５００ピコ
モルをキナーゼ処理した。このキナーゼ反応液を３７℃
で３０分間インキュベートし、次いで１００℃で１０分
間インキュベートすることによって反応を止めた。キナ
ーゼ化を完全にするため、反応液を氷で冷却し、反応混
合物に０.２Ｍジチオトレイトール２μl、５mＭＡＴＰ
２.５μl、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１５単
位を加えて混合し、この反応混合物を３７℃でさらに３
０分間インキュベートした。１００℃でさらに１０分間
インキュベートすることによって反応を止め、次いで氷
で冷却した。
【００９６】キナーゼ処理は別々に行ったが、キナーゼ
反応後、２種類の１本鎖ＤＮＡリンカーをいっしょにし
て混合した。これらの鎖をアニールするため、キナーゼ
反応混合物を、〜１５０mlの水を入れた水浴中、１００
℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、
水浴の栓を止め、室温まで冷却した。この過程に約３時
間かかった。次いで、キナーゼ処理したＤＮＡの試験管
がまだ入っている水浴を４℃で一晩インキュベートし
た。この操作により１本鎖がアニールされた。作成した
リンカーは以下の構造を有していた（配列番号３）:
【化３】 このリンカーを使用時まで−２０℃で保存した。〜１.
２５kb ＢanＩフラグメント〜８μgを、リンカー〜５０
μl(〜５００ピコモル)、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μl(約
５００単位)、１０×リガーゼ緩衝液１０μl、および水
２９μlに加えて混合し、このライゲーション反応液を
４℃で一晩インキュベートした。６５℃で１０分間イン
キュベートすることによってライゲーション反応を止め
た。最終濃度０.３ＭとなるようにＮaＯＡcを加え、２
倍量のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール浴
で冷却し、そしてこの溶液を遠心することによってＤＮ
Ａをペレット化した。
【００９７】このＤＮＡペレットを、１０×ＡpaＩ反応
緩衝液[６０mＭ ＮaＣl、６０mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝
７.４)、６０mＭ ＭgＣl2、および６０mＭ ２−メルカ
プトエタノール]１０μl、制限酵素ＡpaＩ ５μl(〜５
０単位)および水８５μlに溶解し、反応液を２時間３７
℃に保った。次いで上記のようにして反応を止め、ＤＮ
Ａをペレット化した。このＤＮＡペレットを、１０×Ｈ
indＩＩＩ反応緩衝液１０μl、制限酵素ＨindＩＩＩ ５
μl(〜５０単位)および水８５μlに溶解し、反応液を２
時間３７℃に保った。ＨindＩＩＩ消化の後、実質的に
実施例４Ａ記載の方法に従って、反応混合物を３.５％
ポリアクリルアミドゲルにかけ、目的の〜１.２３kb Ｈ
indＩＩＩ−ＡpaＩ制限フラグメントを単離した。目的
のフラグメントが約５μg得られ、これをＴＥ緩衝液１
０μlに懸濁し、−２０℃で保存した。
【００９８】プラスミドpＨＣ７ ＤＮＡ５０μlを、制
限酵素ＰstＩ ５μl(〜５０単位)、１０×ＰstＩ反応緩
衝液[１.０Ｍ ＮaＣl、１００mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝
７.５)、１００mＭ ＭgＣl2、および１mg／ml ＢＳＡ]
１０μlおよび水３５μlと混合し、３７℃で２時間イン
キュベートした。次いで、実質的に上記記載の方法に従
って、ＰstＩ消化したプラスミドpＨＣ７ ＤＮＡを、
３.５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、目的
の〜０.８８kbフラグメントを精製した。目的のフラグ
メント約５μgが得られ、これをＴＥ緩衝液１０μlに懸
濁し、−２０℃で保存した。
【００９９】この〜０.８８kb ＰstＩフラグメント〜５
μgを、自動ＤＮＡ合成機で作成した以下のリンカー〜
５０μlに加えて混合した（配列番号４）:
【化４】 このＤＮＡ混合物に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ約１μl(〜
１０単位)、１０×リガーゼ緩衝液１０μl、および水２
９μlを加え、得られたライゲーション反応液を４℃で
一晩インキュベートした。
【０１００】このライゲーション反応を、６５℃で１０
分間インキュベートすることによって止めた。ライゲー
ト化ＤＮＡを沈澱させた後、ＤＮＡペレットを１０×Ａ
paＩ反応緩衝液１０μl、制限酵素ＡpaＩ ５μl(〜５０
単位)および水８５μlに溶解し、反応液を２時間３７℃
に保った。次いでもう一度反応を止め、ＤＮＡをペレッ
ト化した。このＤＮＡペレットを、１０×ＢglＩＩ反応
緩衝液[１Ｍ ＮaＣl、１００mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝
７.４)、１００mＭ ＭgＣl2、１００mＭ ２−メルカプ
トエタノール、および１mg／ml ＢＳＡ]１０μl、制限
酵素ＢglＩＩ ５μl(〜５０単位)および水８５μlに溶
解し、反応液を２時間３７℃に保った。ＢglＩＩ消化の
後、実質的に上記記載の方法に従って、反応混合物を
３.５％ポリアクリルアミドゲルにかけ、目的の〜０.１
９kb ＡpaＩ−ＢglＩＩ制限フラグメントを単離した。
目的のフラグメントが約１μg得られ、これをＴＥ緩衝
液１０μlに懸濁し、−２０℃で保存した。
【０１０１】プラスミドpＳＶ２gpt ＤＮＡ(ＡＴＣＣ
３７１４５)約１０μgを、１０×ＨindＩＩＩ反応緩衝
液１０μl、制限酵素ＨindＩＩＩ ５μl(〜５０単位)お
よび水８５μlに溶解し、反応液を２時間３７℃に保っ
た。次いでこの反応混合物を、ＮaＯＡcが０.２５Ｍと
なるようにし、２倍量のエタノールを加えてドライアイ
ス−エタノール浴でインキュベートした後、遠心してＤ
ＮＡをペレット化した。このＤＮＡペレットを、１０×
ＢglＩＩ緩衝液１０μl、制限酵素ＢglＩＩ ５μl(〜５
０単位)および水８５μlと混合し、反応液を２時間３７
℃に保った。ＢglＩＩ消化の後、反応混合物を１％アガ
ロースゲルにかけ、電気泳動してフラグメントを分離し
た。ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で見
えるようにし、目的の〜５.１kb ＨindＩＩＩ−ＢglＩ
Ｉフラグメントを含有するバンドをゲルから切り出し、
これを透析管に入れ、ＤＮＡがアガロースから溶出して
しまうまで電気泳動を続けた。透析管からのＤＮＡ含有
緩衝液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、次い
でＤＮＡを沈澱させた。このペレットは目的のプラスミ
ドpＳＶ２gptの〜５.１kb ＨindＩＩＩ−ＢglＩＩ制限
フラグメント〜５μgからなり、これをＴＥ緩衝液１０
μlに再懸濁した。
【０１０２】〜１.２３kb ＨindＩＩＩ−ＡpaＩ制限フ
ラグメント２μl、〜０.１９kb ＡpaＩ−ＢglＩＩフラ
グメント３μl、および〜５.１kb ＨindＩＩＩ−ＢglＩ
Ｉフラグメント２μlをいっしょにして混合し、次い
で、１０×リガーゼ緩衝液１０μl、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼ１μl(〜５００単位)、および水８２μlとともに１６
℃で一晩インキュベートした。このライゲートしたＤＮ
Ａは目的のプラスミドpＳＶ２−ＨＰＣ８からなってい
た。このプラスミドの制限部位および機能地図を添付の
図９に示す。
【０１０３】Ｅ.コリＫ１２ ＲＲ１(ＮＲＲＬ Ｂ−１５
２１０)を、実質的に実施例２記載の方法に従って、形
質転換用にコンピテントにした。上記で調製したライゲ
ート化ＤＮＡを用いてこの細胞を形質転換した。形質転
換混合物の一部を、１００μg／mlアンピシリン含有の
Ｌ−寒天プレートにプレートし、このプレートを３７℃
でインキュベートした。プラスミドＤＮＡの制限酵素分
析によってＥ.コリＫ１２ ＲＲ１／pＳＶ２−ＨＰＣ８
形質転換体を確認した。
【０１０４】Ｂ.プラスミドpＬ１３３の最終的な構築 ５０μgのプラスミドpＳＶ２−ＨＰＣ８を、１０×Ｈin
dＩＩＩ反応緩衝液１０μl、制限酵素ＨindＩＩＩ ５μ
l(〜５０単位)および水８５μlに溶解し、反応液を３７
℃で２時間インキュベートした。ＨindＩＩＩ消化の
後、ＤＮＡを沈澱させ、そのＤＮＡペレットを１０×Ｓ
alＩ反応緩衝液[１.５Ｍ ＮaＣl、６０mＭトリス−ＨＣ
l(pＨ＝７.９)、６０mＭ ＭgＣl2、６０mＭ ２−メルカ
プトエタノール、および１mg／ml ＢＳＡ]１０μl、制
限酵素ＳalＩ ５μl(〜５０単位)および水８５μlに溶
解した。得られたＳalＩ反応混合物を３７℃で２時間イ
ンキュベートした。次いで、目的の〜０.２９kb Ｈind
ＩＩＩ−ＳalＩ制限フラグメントが他の反応生成物から
分離するまで、このＨindＩＩＩ−ＳalＩ消化したプラ
スミドpＳＶ２−ＨＰＣ８を３.５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけた。目的のフラグメントをゲルから
単離して約２μgのフラグメントを得、これをＴＥ緩衝
液１０μlに懸濁させた。
【０１０５】５０μgのプラスミドpＳＶ２−ＨＰＣ８
を、１０×ＢglＩＩ反応緩衝液１０μl、制限酵素Ｂgl
ＩＩ ５μl(〜５０単位)および水８５μlに溶解し、反
応液を３７℃で２時間インキュベートした。ＢglＩＩ消
化の後、ＤＮＡを沈澱させ、そのＤＮＡペレットを１０
×ＳalＩ反応緩衝液１０μl、制限酵素ＳalＩ ５μl(〜
５０単位)および水８５μlに溶解した。得られたＳalＩ
反応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。次い
で、目的の〜１.１５kb ＳalＩ−ＢglＩＩ制限フラグメ
ントが他の反応生成物から分離するまで、このＳalＩ−
ＢglＩＩ消化したプラスミドpＳＶ２−ＨＰＣ８を３.５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。この〜
１.１５kb ＳalＩ−ＢglＩＩ制限フラグメントをゲルか
ら単離して約８μgのフラグメントを得、これをＴＥ緩
衝液１０μlに懸濁させた。
【０１０６】約１０μgのプラスミドpＳＶ２−β−グロ
ビンＤＮＡ(ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２８)を、１０×Ｈind
ＩＩＩ反応緩衝液１０μl、制限酵素ＨindＩＩＩ ５μl
(〜５０単位)および水８５μlに溶解し、反応液を２時
間３７℃に保った。次いでこの反応混合物を、ＮaＯＡc
が０.２５Ｍとなるようにし、２倍量のエタノールを加
えてドライアイス−エタノール浴でインキュベートした
後、遠心してＤＮＡをペレット化した。このＨindＩＩ
Ｉ消化したプラスミドpＳＶ２−β−グロビンを、１０
×ＢglＩＩ緩衝液１０μl、制限酵素ＢglＩＩ ５μl(〜
５０単位)および水８５μlと混合し、反応液を２時間３
７℃に保った。ＢglＩＩ消化の後、反応混合物を１％ア
ガロースゲル電気泳動にかけてフラグメントを分離し
た。目的の〜４.２kb ＨindＩＩＩ−ＢglＩＩ制限フラ
グメントをゲルから単離して約５μgのフラグメントを
得、これをＴＥ緩衝液１０μlに懸濁させた。
【０１０７】プラスミドpＳＶ２−ＨＰＣ８の〜０.２９
kb ＨindＩＩＩ−ＳalＩフラグメント２μl、プラスミ
ドpＳＶ２−ＨＰＣ８の〜１.１５kb ＳalＩ−ＢglＩＩ
フラグメント２μl、およびプラスミドpＳＶ２−β−グ
ロビンの〜４.２kb ＨindＩＩＩ−ＢglＩＩフラグメン
ト２μlをいっしょにして混合し、実質的に実施例６Ａ
の方法に従ってライゲートした。このライゲートしたＤ
ＮＡは目的のプラスミドpＬ１３３からなっていた。こ
のプラスミドpＬ１３３の制限部位および機能地図を添
付の図９に示す。形質転換するＤＮＡとして、プラスミ
ドpＳＶ２−ＨＰＣ８のかわりにプラスミドpＬ１３３を
用いること以外は、実質的に実施例６Ａの教示に従っ
て、目的のＥ.コリＫ１２ ＲＲ１／pＬ１３３形質転換
体を作成した。
【０１０８】実施例７ プラスミドpＬＰＣの構築 プラスミドpＢＬcatＤＮＡ約２０μgを、１０×ＨindＩ
ＩＩ緩衝液１０μlおよび水８０μlに溶解した。得られ
たプラスミドpＢＬcatＤＮＡの溶液に制限酵素ＨindＩ
ＩＩ約１０μl(〜１００単位)を加え、この反応液を３
７℃で２時間インキュベートした。次いで、ＢＫエンハ
ンサーおよびＡd２後期プロモーターを含有する〜０.８
７kb ＨindＩＩＩ制限フラグメントが他の消化生成物か
ら分離するまで、このＨindＩＩＩ消化したプラスミドp
ＢＬcatＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけた。次
いで、実質的に実施例４Ａの方法に従って、〜０.８７k
bフラグメントを単離し、ライゲーション用に調製し
た。目的のフラグメントが約２μg得られ、これをＴＥ
緩衝液５μlに溶解した。
【０１０９】プラスミドpＬ１３３ ＤＮＡ約１.５μg
を、１０×ＨindＩＩＩ緩衝液２μlおよび水１６μlに
溶解した。このＤＮＡ溶液に制限酵素ＨindＩＩＩ約１
μl(〜１０単位)を加え、得られた反応液を３７℃で２
時間インキュベートした。次いで、このＤＮＡをＴＥ緩
衝液で１００μlまで希釈し、実質的に実施例２の方法
に従って、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。
このＨindＩＩＩ消化したプラスミドpＬ１３３ ＤＮＡ
をフェノールで２回、クロロホルムで１回抽出し、エタ
ノールで沈澱させ、そしてＴＥ緩衝液１０μlに再懸濁
した。
【０１１０】プラスミドpＢＬcatの〜０.８７kb Ｈind
ＩＩＩ制限フラグメント約５μlを、ＨindＩＩＩ消化し
たプラスミドpＬ１３３ １.５μlに加え、次いでこの
ＤＮＡ溶液に、１０×リガーゼ緩衝液１μl、Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼ１μl(〜１０００単位)、および水１.５μl
を加え、得られた反応液を１６℃で一晩インキュベート
した。このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドpＬ
ＰＣからなっていた。プラスミドpＬＰＣの制限部位お
よび機能地図を添付の図１０に示す。
【０１１１】このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に
実施例３の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ−
寒天で平板培養し、制限酵素分析によってアンピシリン
耐性形質転換体のプラスミドＤＮＡを試験して、Ｅ.コ
リＫ１２ ＨＢ１０１／pＬＰＣ形質転換体を同定した。
ＢＫエンハンサーおよびＡd２後期プロモーターをコー
ドしている〜０.８７kb ＨindＩＩＩ制限フラグメント
は、ＨindＩＩＩ消化したプラスミドpＳＢＬcat中に、
２つの配向のうちのどちらかで挿入されている(そのう
ちの１つだけがプラスミドpＬＰＣを生じる)。
【０１１２】実施例８ プラスミドpＬＰＣ４およびpＬ
ＰＣ５の構築 実施例１で調製したＢＫウイルスＤＮＡ約１μg(１μl)
およびプラスミドpＬＰＣ１μg(１μl)を、１０×Ｅco
ＲＩ緩衝液２μlおよび水１４μlに溶解した。このＤＮ
Ａ溶液に制限酵素ＥcoＲＩ約２μl(〜１０単位)を加
え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートし
た。このＥcoＲＩ消化したＢＫウイルスおよびプラスミ
ドpＬＰＣ ＤＮＡの混合物を緩衝フェノールで１回、ク
ロロホルムで１回抽出した。次いで、ＮaＣl濃度を０.
２５Ｍに調整し、２倍量のエタノールを加え、この溶液
をドライアイス−エタノール浴で２分間インキュベート
し、そして溶液を遠心してＤＮＡをペレット化すること
によってＤＮＡを集めた。上清を除去し、ＤＮＡペレッ
トを７０％エタノールですすぎ、乾燥し、ＴＥ緩衝液１
２μlに再懸濁した。
【０１１３】ＥcoＲＩ消化したＢＫウイルスおよびプラ
スミドpＬＰＣ ＤＮＡの混合物に、水約１３μlおよび
１０×リガーゼ緩衝液３μlを加えた。このＤＮＡ溶液
にＴ４ＤＮＡリガーゼ２μl(〜１０００単位)を加え、
得られた反応液を１６℃で２時間インキュベートした。
このライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミドpＬＰＣ
４およびpＬＰＣ５からなり、両者は挿入したＢＫウイ
ルスＤＮＡの配向だけが異なっていた。プラスミドpＬ
ＰＣ４の制限部位および機能地図を添付の図１１に示
す。
【０１１４】このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に
実施例３の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１コ
ンピテント細胞を形質転換した。形質転換細胞を１００
μg／mlアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養した。
アンピシリン耐性の表現型およびプラスミドＤＮＡの制
限酵素分析によって、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＬ
ＰＣ４およびＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＬＰＣ５形
質転換体を同定した。
【０１１５】実施例９ プラスミドpＬＰＣhyg１および
pＬＰＣhyg２の構築 Ｅ.コリＫ１２ ＲＲ１／pＳＶ２hyg細胞を、ＮＲＲＬか
ら取得番号ＮＲＲＬＢ−１８０３９のもとで入手する。
実質的に実施例３の方法に従って、この細胞からプラス
ミドpＳＶ２hyg ＤＮＡを得る。プラスミドpＳＶ２hyg
の制限部位および機能地図を添付の図１２に示す。
【０１１６】プラスミドpＳＶ２hyg約１０μg(ＴＥ緩衝
液１０μl中)を、１０×ＢamＨＩ緩衝液２μlおよび水
６μlに加えた。このＤＮＡ溶液に、制限酵素ＢamＨＩ
約２μl(約２０単位)を加え、得られた反応液を３７℃
で２時間インキュベートした。この反応液を始めフェノ
ールで抽出し、次いでクロロホルムで２回抽出した。実
質的に実施例４Ａ記載の方法に従って、このＢamＨＩ消
化したプラスミドpＳＶ２hyg ＤＮＡをアガロースゲル
にかけ、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する〜２.
５kbの制限フラグメントを単離した。
【０１１７】１０×クレノウ緩衝液[４種類のdＮＴＰそ
れぞれが０.２mＭ、０.５Ｍトリス−ＨＣl(pＨ＝７.
８)、５０mＭ ＭgＣl2、０.１Ｍ ２−メルカプトエタ
ノール、および１００μg／ml ＢＳＡ]約５μlおよび水
３５μlを、ＢamＨＩ消化したプラスミドpＳＶ２hyg Ｄ
ＮＡの溶液に加え、次いでこのＤＮＡ混合物にクレノウ
酵素(ＢＲＬから市販されている)約２５単位(約５μl)
を加え、得られた反応液を１６℃で３０分間インキュベ
ートした。このクレノウ処理し、ＢamＨＩ消化したプラ
スミドpＳＶ２hyg ＤＮＡをフェノールで１回、クロロ
ホルムで１回抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。
目的のフラグメントが約２μg得られ、これをＴＥ緩衝
液５μlに懸濁させた。
【０１１８】プラスミドpＬＰＣ ＤＮＡ約１０μg(１０
μl)を、１０×ＳtuＩ緩衝液２μlおよび水６μlに加え
た。このＤＮＡ溶液に、制限酵素ＳtuＩ約２μl(〜１０
単位)を加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキ
ュベートした。このＳtuＩ消化したプラスミドpＬＰＣ
ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、１０×
ＮdeＩ緩衝液[１.５Ｍ ＮaＣl、０.１Ｍトリス−ＨＣl
(pＨ＝７.８)、７０mＭ ＭgＣl2、６０mＭ ２−メルカ
プトエタノール、および１mg／ml ＢＳＡ]２μlおよび
水１６μlに再懸濁した。このＳtuＩ消化したＤＮＡの
溶液に、制限酵素ＮdeＩ約２μl(〜１０単位)を加え、
得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
【０１１９】ＮdeＩ−ＳtuＩ消化したプラスミドpＬＰ
Ｃ ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、１
０×クレノウ緩衝液５μlおよび水４０μlに再懸濁し
た。このＤＮＡ溶液に、クレノウ酵素約５μl(〜２５単
位)を加え、得られた反応液を１６℃で３０分間インキ
ュベートした。クレノウ反応の後、反応混合物をアガロ
ースゲルにかけ、〜５.８２kb ＮdeＩ−ＳtuＩ制限フラ
グメントをゲルから単離した。目的のフラグメントが約
５μg得られ、これをＴＥ緩衝液５μlに懸濁させた。
【０１２０】プラスミドpＳＶ２hygの〜２.５kbのクレ
ノウ処理したＢamＨＩ制限フラグメント約２μlを、プ
ラスミドpＬＰＣの〜５.８２kbのクレノウ処理したＮde
Ｉ−ＳtuＩ制限フラグメント約１μlと混合し、このＤ
ＮＡ溶液に、１０×リガーゼ緩衝液約３μl、Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼ２μl(〜１０００単位)、Ｔ４ ＲＮＡリガー
ゼ１μl(〜１単位)、および水１４μlを加えた。得られ
た反応液を１６℃で一晩インキュベートした。このライ
ゲートしたＤＮＡは目的のプラスミドpＬＰＣhyg１およ
びpＬＰＣhyg２からなり、それらはプラスミドpＳＶ２h
ygの〜２.５kbのクレノウ処理したＢamＨＩ制限フラグ
メントの配向だけが異なっていた。プラスミドpＬＰＣh
yg１の制限部位および機能地図を添付の図１３に示す。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例３の方
法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１を形質転換し
た。目的のＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＬＰＣhyg１お
よびＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＬＰＣhyg２形質転換
体を、アンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、プラ
スミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。
【０１２１】実施例１０ プラスミドpＢＷ３２の構築 Ａ.中間体プラスミドpＴＰＡ１０３の構築 プラスミドpＴＰＡ１０２はヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子(ＴＰＡ)のコード化配列を含有している。プ
ラスミドpＴＰＡ１０２はＥ.コリＫ１２ ＭＭ２９４／p
ＴＰＡ１０２(この菌株はＮＲＲＬから取得番号ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１５８３４のもとで入手可能である)から単離す
ることができる。プラスミドpＴＰＡ１０２の制限部位
および機能地図を添付の図１４、図１５、図１６および
図１７に示す。プラスミドpＴＰＡ１０２ ＤＮＡを、実
質的に実施例２の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＭＭ２
９４／pＴＰＡ１０２から単離する。
【０１２２】プラスミドpＴＰＡ１０２約５０μg(ＴＥ
緩衝液約５０μl中)を、１０×Ｔth111Ｉ緩衝液[０.５
Ｍ ＮaＣl、８０mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝７.４)、８０m
Ｍ ＭgＣl2、８０mＭ ２−メルカプトエタノール、およ
び１mg／ml ＢＳＡ]１０μlおよび水８０μlに加えた。
このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｔth111Ｉ約１０μl(〜５０
単位)を加え、得られた反応液を６５℃で２時間インキ
ュベートした。この反応混合物をアガロースゲルにか
け、ＴＰＡコード化配列を含有する〜４.４kb Ｔth111
Ｉ制限フラグメントをゲルから単離した。その他の消化
産物、すなわち３.１kbおよび０.５kb制限フラグメント
は廃棄した。目的の〜４.４kb Ｔth111Ｉ制限フラグメ
ントが約１０μg得られ、これをＴＥ緩衝液１０μlに懸
濁させた。
【０１２３】１０×クレノウ緩衝液約５μlおよび水３
０μlに〜４.４kb Ｔth111Ｉ制限フラグメントを含有す
る溶液を加え、さらにクレノウ酵素約５μl(〜５単位)
を加えた後、この反応混合物を１６℃で３０分間インキ
ュベートした。クレノウ反応の後、ＤＮＡをエタノール
で沈澱させ、１０×リガーゼ緩衝液３μlおよび水１４
μlに再懸濁させた。
【０１２４】配列:
【化５】 で示されるＢamＨＩリンカー(ニュー・イングランド・
バイオラブズ)を以下の方法によってキナーゼ処理し、
ライゲーション用に調製した。リンカー４μl(〜２μg)
を水２０.１５μlおよび１０×キナーゼ緩衝液[５００m
Ｍ トリス−ＨＣl(pＨ＝７.６)および１００mＭ ＭgＣl
2]５μlに溶解し、９０℃で２分間インキュベートし、
次いで室温まで冷却した。この混合物に、γ−32Ｐ−Ａ
ＴＰ ５μl(〜２０μＣi)、１Ｍ ＤＴＴ ２.５μlおよ
びポリヌクレオチドキナーゼ５μl(〜１０単位)を加
え、得られた反応液を３７℃で３０分間インキュベート
した。次いで、０.０１Ｍ ＡＴＰ３.３５μlおよびキナ
ーゼ５μlを加え、反応液をさらに３０分間３７℃に保
った。この放射活性ＡＴＰは、リンカーが標的ＤＮＡに
ライゲートしたかどうかを決定するのに役立つ。
【０１２５】キナーゼ処理したＢamＨＩリンカー約１０
μlを〜４.４kb Ｔth111Ｉ制限フラグメントの溶液に加
え、さらにＴ４ ＤＮＡリガーゼ２μl(〜１０００単位)
およびＴ４ ＲＮＡリガーゼ１μl(〜２単位)を加えた
後、このライゲーション反応液を４℃で一晩インキュベ
ートした。このライゲートしたＤＮＡをエタノールで沈
澱させ、１０×ＨindＩＩＩ緩衝液５μlおよび水４０μ
lに再懸濁させた。このＤＮＡ溶液に制限酵素ＨindＩＩ
Ｉ約５μl(〜５０単位)を加え、得られた反応液を３７
℃で２時間インキュベートした。
【０１２６】このＨindＩＩＩ消化したＤＮＡをエタノ
ールで沈澱させ、１０×ＢamＨＩ緩衝液１０μlおよび
水９０μlに再懸濁させた。このＤＮＡ溶液に制限酵素
ＢamＨＩ約１０μl(〜１００単位)を加え、得られた反
応液を３７℃で２時間インキュベートした。ＢamＨＩ消
化の後、反応混合物をアガロースゲルにかけ、〜２.０k
b ＢamＨＩ−ＨindＩＩＩ制限フラグメントをゲルから
単離した。目的のフラグメントが約４μg得られ、これ
をＴＥ緩衝液約５μlに懸濁させた。
【０１２７】プラスミドpＴＰＡ１０３を構築するた
め、プラスミドpＴＰＡ１０２由来の〜２.０kb ＢamＨ
Ｉ−ＨindＩＩＩ制限フラグメントを、ＢamＨＩ−Ｈind
ＩＩＩ消化したプラスミドpＲＣに挿入した。プラスミ
ドpＲＣは、Ｅ.コリtrpオペロンのプロモーターおよび
オペレーター(trpＰＯ)配列を含有する〜２８８bp Ｅco
ＲＩ−ＣlaＩ制限フラグメントを、ＥcoＲＩ−ＣlaＩ消
化したプラスミドpＫＣ７に挿入することによって構築
した。プラスミドpＫＣ７は、Ｅ.コリ Ｋ１２ Ｎ１００
／pＫＣ７として、ＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ３７
０８４のもとで入手することができる。trpＰＯを含有
する〜２８８bp ＥcoＲＩ−ＣlaＩ制限フラグメントは
プラスミドpＴＰＡ１０２[このプラスミドはＥ.コリ Ｋ
１２ ＭＭ２９４／pＴＰＡ１０２(ＮＲＲＬ Ｂ−１５８
３４)から単離することができる]から単離することがで
きる。プラスミドpＫＣ７およびプラスミドpＴＰＡ１０
２ＤＮＡは、実質的に実施例３の方法に従って、上記セ
ルラインから得ることができる。このプラスミドpＴＰ
Ａ１０２の〜０.２９kb ＥcoＲＩ−ＣlaＩ制限フラグメ
ントは、Ｅ.コリ trp遺伝子の翻訳活性化配列の大部分
および転写活性化配列を含有し、以下の配列を有してい
る（配列番号５）:
【０１２８】
【化６】
【化７】
【０１２９】すなわち、プラスミドpＲＣを構築するた
めに、ＴＥ緩衝液１０μl中のプラスミドpＫＣ７約２μ
gを、１０×ＣlaＩ緩衝液[０.５Ｍ ＮaＣl、６０mＭト
リス−ＨＣl(pＨ＝７.９)、６０mＭ ＭgＣl2、および
１mg／ml ＢＳＡ]２μlおよび水６μlに加えた。このプ
ラスミドpＫＣ７ ＤＮＡの溶液に制限酵素ＣlaＩ約２μ
l(〜１０単位)を加え、得られた反応液を３７℃で２時
間インキュベートした。このＣlaＩ消化したプラスミド
pＫＣ７ ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１０×ＥcoＲ
Ｉ緩衝液２μlおよび水１６μlに再懸濁させた。このＣ
laＩ消化したプラスミドpＫＣ７ ＤＮＡの溶液に制限酵
素ＥcoＲＩ約２μl(〜１０単位)を加え、得られた反応
液を３７℃で２時間インキュベートした。
【０１３０】このＥcoＲＩ−ＣlaＩ消化したプラスミド
pＫＣ７ ＤＮＡを、フェノールで１回、次いでクロロホ
ルムで２回抽出した。次いで、ＤＮＡをエタノールで沈
澱させ、１０×リガーゼ緩衝液３μlおよび水２０μlに
再懸濁した。プラスミドpＫＣ７の制限部位および機能
地図は、マニアティス等[Ｍaniatis et al.]のＭolecul
ar Ｃloning,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory,８頁
(１９８２)から入手することができる。
【０１３１】ＴＥ緩衝液約２０μl中のプラスミドpＴＰ
Ａ１０２約２０μgを、１０×ＣlaＩ緩衝液１０μlおよ
び水６０μlに加えた。このプラスミドpＴＰＡ１０２
ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＣlaＩ約１０μl(〜５０単
位)を加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュ
ベートした。このＣlaＩ消化したプラスミドpＴＰＡ１
０２ ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１０×ＥcoＲＩ
緩衝液１０μlおよび水８０μlに再懸濁した。このＣla
Ｉ消化したプラスミドpＴＰＡ１０２ ＤＮＡの溶液に制
限酵素ＥcoＲＩ約１０μl(〜５０単位)を加え、得られ
た反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
【０１３２】このＥcoＲＩ−ＣlaＩ消化したプラスミド
pＴＰＡ１０２ ＤＮＡをフェノールで１回抽出し、trp
ＰＯを含有する〜２８８bp ＥcoＲＩ−ＣlaＩ制限フラ
グメントが他の消化産物から分離するまで、７％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけ、次いでこの〜２８８
bp ＥcoＲＩ−ＣlaＩ制限フラグメントをゲルから単離
した。目的のフラグメントが約１μg得られ、これをＴ
Ｅ緩衝液５μlに懸濁し、上記のようにして調製したＥc
oＲＩ−ＣlaＩ消化のプラスミドpＫＣ７ ＤＮＡの溶液
に加えた。次いでこのＤＮＡ混合物に、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ約２μl(〜１０００単位)を加え、得られたライ
ゲーション反応液を１６℃で２時間インキュベートし
た。このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドpＲＣ
ＤＮＡからなっていた。
【０１３３】このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に
実施例２の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１コ
ンピテント細胞を形質転換した。形質転換細胞を１００
μg／mlアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、プ
ラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピシリン耐
性形質転換体をスクリーニングして目的のＥ.コリＫ１
２ ＨＢ１０１／pＲＣコロニーを同定した。実質的に実
施例３の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／p
ＲＣ形質転換体からプラスミドpＲＣ ＤＮＡを得た。
【０１３４】ＴＥ緩衝液約２μl中のプラスミドpＲＣ
ＤＮＡ約２μgを、１０×ＨindＩＩＩ緩衝液２μlおよ
び水１６μlに加えた。このプラスミドpＲＣ ＤＮＡの
溶液に、制限酵素ＨindＩＩＩ約２μl(〜１０単位)を加
え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートし
た。このＨindＩＩＩ消化したプラスミドpＲＣ ＤＮＡ
をエタノールで沈澱させ、１０×ＢamＨＩ緩衝液２μl
および水１６μlに再懸濁した。このＨindＩＩＩ消化し
たプラスミドpＲＣ ＤＮＡの溶液に制限酵素ＢamＨＩ約
２μl(〜１０単位)を加え、得られた反応液を３７℃で
２時間インキュベートした。
【０１３５】このＢamＨＩ−ＨindＩＩＩ消化したプラ
スミドpＲＣ ＤＮＡをフェノールで１回、次いでクロロ
ホルムで２回抽出した。このＤＮＡをエタノールで沈澱
させ、１０×リガーゼ緩衝液３μlおよび水２０μlに再
懸濁した。このＢamＨＩ−ＨindＩＩＩ消化したプラス
ミドpＲＣ ＤＮＡの溶液に、プラスミドpＴＰＡ１０２
の〜２.０kb ＨindＩＩＩ−ＢamＨＩ制限フラグメント
〜４μg(ＴＥ緩衝液〜５μl中)を加えた。このＤＮＡ混
合物に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ約２μl(〜１０００単位)
を加え、得られた反応液を１６℃で２時間インキュベー
トした。このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドp
ＴＰＡ１０３ ＤＮＡからなっていた。
【０１３６】目的ではない形質転換体を減少させるた
め、このライゲート化ＤＮＡを制限酵素ＮcoＩ(この酵
素はプラスミドpＲＣを切断するがプラスミドpＴＰＡ１
０３を切断しない)で消化した。すなわち、直線化した
ＤＮＡは閉環した環状ＤＮＡに比べてＥ.コリを形質転
換することが少ないので、ＮcoＩによってライゲート化
ＤＮＡを消化すると目的ではない形質転換体が減少す
る。ライゲート化ＤＮＡを消化するため、始めにＤＮＡ
をエタノールで沈澱させ、次いで１０×ＮcoＩ緩衝液
[１.５Ｍ ＮaＣl、６０mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝７.
８)、６０mＭ ＭgＣl2、および１mg／ml ＢＳＡ]２μl
および水１６μlに再懸濁した。このＤＮＡ溶液に制限
酵素ＮcoＩ約２μl(〜１０単位)を加え、得られた反応
液を３７℃で２時間インキュベートした。
【０１３７】ライゲートし、次いでＮcoＩ消化したこの
ＤＮＡを用いてＥ.コリＫ１２ ＲＶ３０８(ＮＲＲＬ Ｂ
−１５６２４)を形質転換した。実質的に実施例３の方
法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＲＶ３０８細胞をコンピテ
ントにし、そして形質転換した。形質転換混合物を１０
０μg／mlアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し
た。アンピシリン耐性形質転換体をカナマイシン感受性
について試験した(プラスミドpＲＣはカナマイシン耐性
を与えるがプラスミドpＴＰＡ１０３は与えない)。次い
でアンピシリン耐性かつカナマイシン感受性の形質転換
体からプラスミドＤＮＡを調製し、このプラスミドＤＮ
Ａを制限酵素分析することによってＥ.コリＫ１２ ＲＶ
３０８／pＴＰＡ１０３形質転換体を同定した。プラス
ミドpＴＰＡ１０３の制限部位および機能地図を添付の
図１４、図１５、図１６および図１７に示す。実質的に
実施例３の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＲＶ３０８
／pＴＰＡ１０３細胞からプラスミドpＴＰＡ１０３ Ｄ
ＮＡを単離した。
【０１３８】Ｂ.中間体プラスミドpＢＷ２５の構築 ＴＥ緩衝液１μl中のプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡ
約１μgを、１０×ＢglＩＩ緩衝液２μlおよび水１６μ
lに加えた。このプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡの溶
液に、制限酵素ＢglＩＩ約１μl(〜５単位)を加え、得
られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。こ
のＢglＩＩ消化したプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡを
エタノールで沈澱させ、１０×クレノウ緩衝液５μlお
よび水４４μlに再懸濁した。このＢglＩＩ消化したプ
ラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡの溶液に、クレノウ酵素
約１μl(〜１単位)を加え、得られた反応液を１６℃で
２時間インキュベートした。このクレノウ処理し、Ｂgl
ＩＩ消化したプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡをエタノ
ールで沈澱させ、１０×リガーゼ緩衝液３μlおよび水
２２μlに再懸濁した。
【０１３９】このクレノウ処理し、ＢglＩＩ消化したプ
ラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡの溶液に、配列:
【化８】 で示されるキナーゼ処理していないＮdeＩリンカー(ニ
ュー・イングランド・バイオラブズ)約２μl(０.２μg)
を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２μl(〜１０００単位)および
Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１μl(〜２単位)とともに加え、得
られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。こ
のライゲート化ＤＮＡはプラスミドpＴＰＡ１０３derＮ
deＩからなっていた(このプラスミドは、プラスミドpＴ
ＰＡ１０３が有するＢglＩＩ認識配列のところにＮdeＩ
認識配列を有していること以外は、実質的にプラスミド
pＴＰＡ１０３と同じである)。
【０１４０】このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に
実施例２記載の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＲＶ３０
８コンピテント細胞を形質転換した。この形質転換細胞
をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、プラスミ
ドＤＮＡの制限酵素分析によって、Ｅ.コリＫ１２ ＲＶ
３０８／pＴＰＡ１０３derＮdeＩ形質転換体を同定し
た。後の構築にもちいるため、プラスミドpＴＰＡ１０
３derＮdeＩ ＤＮＡを、実質的に実施例３の方法に従っ
て、形質転換体から単離した。
【０１４１】ＴＥ緩衝液１０μl中のプラスミドpＴＰＡ
１０３derＮdeＩ ＤＮＡ約１０μgを、１０ＡvaＩＩ緩
衝液[０.６Ｍ ＮaＣl、６０mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝８.
０)、０.１Ｍ ＭgＣl2、６０mＭ ２−メルカプトエタノ
ール、および１mg／ml ＢＳＡ]２μlおよび水６μlに加
えた。このＤＮＡ溶液に、制限酵素ＡvaＩＩ約２μl(〜
１０単位)を加え、得られた反応液を３７℃で２時間イ
ンキュベートした。〜１.４kb制限フラグメントが他の
消化産物から分離するまで、このＡvaＩＩ消化したＤＮ
Ａをアガロースゲル電気泳動にかけた。次いでこのプラ
スミドpＴＰＡ１０３derＮdeＩの〜１.４kb ＡvaＩＩ制
限フラグメントをゲルから単離し、目的のフラグメント
約２μgを得、これをＴＥ緩衝液５μlに懸濁した。
【０１４２】この〜１.４kb ＡvaＩＩ制限フラグメント
の溶液に、１０×クレノウ緩衝液約５μl、水３５μl、
およびクレノウ酵素５μl(〜５単位)を加え、得られた
反応液を１６℃で３０分間インキュベートした。このク
レノウ処理したＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１０×
リガーゼ緩衝液３μlおよび水１４μlに再懸濁した。
【０１４３】実質的に実施例１０Ａの方法に従って、配
列:
【化９】 で示されるＨpaＩリンカー約２μgをキナーゼ処理し
た。クレノウ処理した、プラスミドpＴＰＡ１０３derＮ
deＩの〜１.４kb ＡvaＩＩ制限フラグメントの溶液に、
このキナーゼ処理したリンカー約１０μlを、Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼ２μl(〜１０００単位)およびＴ４ ＲＮＡリ
ガーゼ１μl(〜１単位)とともに加え、得られた反応液
を１６℃で一晩インキュベートした。
【０１４４】このライゲート化ＤＮＡをフェノールで１
回、クロロホルムで２回抽出し、エタノールで沈澱さ
せ、１０×ＥcoＲＩ緩衝液２μlおよび水１６μlに再懸
濁した。このＤＮＡ溶液に、制限酵素ＥcoＲＩ約２μl
(〜１０単位)を加え、得られた反応液を３７℃で２時間
インキュベートした。このＥcoＲＩ消化したＤＮＡをフ
ェノールで１回、クロロホルムで２回抽出し、エタノー
ルで沈澱させ、１０×リガーゼ緩衝液３μlおよび水２
０μlに再懸濁した。このようにして調製した、約７７
０bpの大きさの、trpＰＯおよびＴＰＡのアミノ末端を
コードしているフラグメントは、ＥcoＲＩ適合末端を１
つおよび平滑末端を１つ有しており、これをＥcoＲＩ−
ＳmaＩ消化したプラスミドpＵＣ１９にライゲートして
プラスミドpＵＣ１９ＴＰＡＦＥを得た。
【０１４５】プラスミドpＵＣ１９[ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ(ＢＲＬ)から入手可能]約２μlを、１
０×ＳmaＩ緩衝液[０.２Ｍ ＫＣl、６０mＭトリス−Ｈ
Ｃl(pＨ＝８.０)、６０mＭ ＭgＣl2、６０mＭ ２−メル
カプトエタノール、および１mg／ml ＢＳＡ]２μlおよ
び水１６μlに溶解した。このＤＮＡ溶液に、制限酵素
ＳmaＩ約２μl(〜１０単位)を加え、得られた反応液を
２５℃で２時間インキュベートした。このＳmaＩ消化し
たプラスミドpＵＣ１９ ＤＮＡをエタノールで沈澱さ
せ、遠心して集め、１０×ＥcoＲＩ緩衝液２μlおよび
水１６μlに再懸濁した。このＳmaＩ消化したプラスミ
ドpＵＣ１９ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＥcoＲＩ約２μ
l(〜１０単位)を加え、得られた反応液を３７℃で２時
間インキュベートした。このＥcoＲＩ−ＳmaＩ消化した
プラスミドpＵＣ１９ ＤＮＡをフェノールで１回、クロ
ロホルムで２回抽出し、ＴＥ緩衝液５μlに再懸濁し
た。
【０１４６】ＥcoＲＩ−ＳmaＩ消化したプラスミドpＵ
Ｃ１９ ＤＮＡを、プラスミドpＴＰＡ１０３derＮdeＩ
由来の〜７７０bp ＥcoＲＩ−平滑末端制限フラグメン
トを含有する容器に加えた。このＤＮＡ混合物に、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ約２μl(〜１０００単位)を加え、得ら
れた反応液を１６℃で一晩インキュベートした。このラ
イゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドpＵＣ１９ＴＰＡ
ＦＥからなっていた。プラスミドpＵＣ１９ＴＰＡＦＥ
の制限部位および機能地図を添付の図１４、図１５、図
１６および図１７に示す。
【０１４７】プラスミドpＵＣ１９ＴＰＡＦＥの構築に
用いるＥcoＲＩおよびＳmaＩ認識配列を含有する、プラ
スミドpＵＣ１９の多重クローニング部位は、lacＺ α
フラグメントのコード化配列内に位置している。lacＺ
ΔＭ１５突然変異(βガラクトシダーゼをコードしてい
るlacＺ遺伝子における突然変異)を含有する細胞におい
てこのlacＺ αフラグメントを発現させると、これらの
細胞は機能的なβガラクトシダーゼ分子を発現し、従っ
てこれらの細胞はＸ−ガル(５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド;無色の
化合物)をそのインジゴ色の加水分解産物に加水分解す
る。プラスミドpＵＣ１９の多重クローニング部位にＤ
ＮＡを挿入すると、lacＺ αフラグメントのコード化配
列が乱され、lacＺ ΔＭ１５突然変異を有する(そのよ
うなプラスミドを有する)細胞はＸ−ガルを加水分解す
ることができない(プラスミドpＵＣ８にクローニングす
るときに同じ原理を用いる;実施例２参照)。プラスミド
pＵＣ１９ＴＰＡＦＥからなるこのライゲート化ＤＮＡ
を用い、実質的に実施例２の方法に従って、形質転換用
にコンピテントにしたＥ.コリＫ１２ ＲＲ１ΔＭ１５
(ＮＲＲＬ Ｂ−１５４４０)細胞を形質転換した。
【０１４８】形質転換細胞を、１００μg／mlアンピシ
リン、４０μg／ml Ｘ−ガル、および１mＭ ＩＰＴＧを
含有するＬ−寒天で平板培養した。インジゴ色を呈しな
いコロニーを継代培養し、これを用いてプラスミドＤＮ
Ａを調製し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって
Ｅ.コリＫ１２ ＲＲ１ΔＭ１５／pＵＣ１９ＴＰＡＦＥ
形質転換体を同定した。後の構築にもちいるため、プラ
スミドpＵＣ１９ＴＰＡＦＥ ＤＮＡを、実質的に実施例
３の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＲＲ１ΔＭ１５／p
ＵＣ１９ＴＰＡＦＥ細胞から単離した。
【０１４９】ＴＥ鑑賞液２０μl中のプラスミドpＵＣ１
９ＴＰＡＦＥ約７μgを、１０×ＨpaＩ緩衝液[０.２Ｍ
ＫＣl、０.１Ｍトリス−ＨＣl(pＨ＝７.４)、および
０.１Ｍ ＭgＣl2]１０μlおよび水７０μlに加えた。こ
のプラスミドpＵＣ１９ＴＰＡＦＥ ＤＮＡの溶液に、制
限酵素ＨpaＩ約３μl(〜６単位)を加え、得られた反応
液を３７℃で２０分間インキュベートした(この短い反
応時間は部分的にＨpaＩ消化するために設定した)。こ
の反応液を、１×ＢamＨＩ緩衝液[１５０mＭ ＮaＣl、
１０mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝８.０)、および１０mＭ Ｍ
gＣl2;塩濃度を高くするとＨpaＩを不活性化する]１５
０μlに調整した。この部分的にＨpaＩ消化したＤＮＡ
の溶液に、制限酵素ＢamＨＩ約１μl(〜１６単位)を加
え、得られた反応液を３７℃で９０分間インキュベート
した。
【０１５０】このＢamＨＩ−ＨpaＩ部分消化プラスミド
pＵＣ１９ＴＰＡＦＥ ＤＮＡをエタノール沈澱で濃縮
し、１.５％アガロースゲルにかけた。次いで、目的の
フラグメントを含有するゲルセグメントを切り出し、セ
グメントを凍結させ、次いでセグメントから液体を圧搾
することによって、プラスミドpＵＣＡＴＰＡＦＥのレ
プリコン、βラクタマーゼ遺伝子、およびＴＰＡコード
化ＤＮＡのすべてを含有する〜３.４２kb ＨpaＩ−Ｂam
ＨＩ制限フラグメントをゲルから単離した。エタノール
沈澱によって液体からＤＮＡを沈澱させた。目的のフラ
グメントが約１μg得られ、これをＴＥ緩衝液２０μlに
懸濁した。
【０１５１】ＴＥ緩衝液１０μl中のプラスミドpＴＰＡ
１０３約１０μgを、１０×ＳcaＩ緩衝液[１.０Ｍ Ｎa
Ｃl、６０mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝７.４)、６０mＭ Ｍg
Ｃl2、１０mＭ ＤＴＴ、および１mg／ml ＢＳＡ]１０μ
lおよび水８０μlに加えた。このプラスミドpＴＰＡ１
０３ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＳcaＩ約３μl(〜１８
単位)を加え、得られた反応液を３７℃で９０分間イン
キュベートした。この反応液の容積を、１×ＢamＨＩ緩
衝液で１５０μlに調整し、この混合物に制限酵素Ｂam
ＨＩ約１μl(〜１６単位)を加え、得られた反応液を３
７℃で９０分間インキュベートした。このＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ、遠心して集め、電気泳動用の調製物
に再懸濁した。このＳcaＩ−ＢamＨＩ消化したプラスミ
ドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡを、〜１.０１５kb ＳcaＩ−Ｂ
amＨＩ制限フラグメントが他の消化産物から分離するま
で、１.５％アガロースゲル電気泳動にかけた。プラス
ミドpＴＰＡ１０３のＴＰＡカルボキシ末端コード化Ｄ
ＮＡを含有する〜１.０１５kb ＳcaＩ−ＢamＨＩ制限フ
ラグメントをゲルから単離し、目的のフラグメント約
０.５μgを得、これをガラス蒸留した水２０μlに溶解
した。
【０１５２】プラスミドpＴＰＡ１０３の〜１.０１５kb
ＳcaＩ−ＢamＨＩ制限フラグメント２μlに、プラスミ
ドpＵＣ１９ＴＰＡＦＥの〜３.４２kb ＢamＨＩ−Ｈpa
Ｉ制限フラグメント約２μlを、１０×リガーゼ緩衝液
２μlおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μl[〜１バイス(Ｗe
iss)単位;このリガーゼはプロメガ・バイオテック(Ｐro
mege Ｂiotec,２８００ Ｓ.Ｆish Ｈatchery Ｒoad,Ｍa
dison,ＷＩ ５３７１１)から入手した]とともに加え、
得られた反応液を１６℃で一晩インキュベートした。こ
のライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドpＢＷ２５か
らなっていた。このプラスミドpＢＷ２５の制限部位お
よび機能地図を添付の図１４、図１５、図１６および図
１７に示す。
【０１５３】５０mＭ ＣaＣl2を用いること以外は実質
的に実施例２の方法に従い、このライゲート化ＤＮＡを
用いて形質転換用にコンピテントにしておいたＥ.コリ
Ｋ１２ ＪＭ１０５(ＢＲＬから入手できる)を形質転換
した。形質転換細胞を１０００μg／mlアンピシリン含
有のＢＨＩ[ディフコ・ラボラトリーズ(Ｄifco Ｌabora
tories,Ｄetroit,ＭＩ)]で平板培養し、プラスミドＤＮ
Ａの制限酵素分析によってＥ.コリＫ１２ ＪＭ１０５／
pＢＷ２５形質転換体を同定した。プラスミドpＢＷ２５
を制限酵素ＥcoＲＩで消化すると、〜３.３８kbおよび
〜１.０８kb制限フラグメントが得られる。後の構築に
もちいるため、実質的に実施例３の方法に従って、プラ
スミドpＢＷ２５を調製した。
【０１５４】Ｃ.ＴＰＡコード化領域の部位特異的な突
然変異誘発およびプラスミドpＢＷ２８の構築 ガラス蒸留した水１０μl中のプラスミドpＢＷ２５約５
μgを、１０×ＨindＩＩＩ反応緩衝液約１０μlおよび
水８０μlに加えた。このプラスミドpＢＷ２５ＤＮＡの
溶液に、制限酵素ＨindＩＩＩ約１μl(〜２０単位)を加
え、得られた反応液を３７℃で９０分間インキュベート
した。このＨindＩＩＩ消化したプラスミドpＢＷ２５
ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＥcoＲＩ約３μl(〜２４単
位)および１Ｍ トリス−ＨＣl(pＨ＝７.６)１０μlを加
え、得られた反応液を３７℃で９０分間インキュベート
した。このＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ消化したプラスミドp
ＢＷ２５ ＤＮＡをエタノール沈澱で濃縮し、〜８１０b
p ＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ制限フラグメントが他の消化
産物から分離するまで、１.５％アガロースゲル電気泳
動にかけた。〜８１０bp ＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ制限フ
ラグメント約０.５μgをゲルから単離し、ライゲーショ
ン用に調製し、これをガラス蒸留した水２０μlに再懸
濁した。
【０１５５】ガラス蒸留した水３５μl中の複製型(Ｒ
Ｆ)のＭ１３mp８ ＤＮＡ(ニュー・イングランド・バイ
オラブズから入手できる)約４.５μgを、１０×ＨindＩ
ＩＩ緩衝液１０μlおよび水５５μlに加えた。このＭ１
３mp８ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＨindＩＩＩ約１μl
(〜２０単位)を加え、得られた反応液を３７℃で１時間
インキュベートした。このＨindＩＩＩ消化したＭ１３m
p８ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＥcoＲＩ約３μl(〜２４
単位)および１Ｍ トリス−ＨＣl(pＨ＝７.６)約１０μl
を加え、得られた反応液を３７℃で１時間インキュベー
トした。このＨindＩＩＩ−ＥcoＲＩ消化したＭ１３mp
８ ＤＮＡをエタノール沈澱で集め、アガロースゲル電
気泳動用の調製物に再懸濁し、ゲル電気泳動によって大
きい制限フラグメントをゲルから単離した。Ｍ１３mp８
の大きいＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ制限フラグメント約１
μgが得られ、これをガラス蒸留した水２０μlに懸濁し
た。Ｍ１３mp８の大きいＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ制限フ
ラグメント約２μl、１０×リガーゼ緩衝液２μl、水１
２μl、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ〜１μl(〜１バイス
単位)を、プラスミドpＢＷ２５の〜８１０bp ＥcoＲＩ
−ＨindＩＩＩ制限フラグメント３μlに加え、得られた
ライゲーション反応液を１６℃で一晩インキュベートし
た。
【０１５６】トランスフェクションに用いるＤＮＡの量
を変えること以外は、実質的にＢＲＬ Ｍ１３ クローニ
ング／'ジデオキシ'シークエンシング・インストラクシ
ョン・マニュアル(ＢＲＬ Ｍ１３ Ｃloning／'Ｄideox
y'Ｓequencing ＩnstructionＭanual)記載の方法に従っ
て、Ｅ.コリＪＭ１０３細胞(ＢＲＬから入手可能)をコ
ンピテントにし、ライゲーション混合物でトランスフェ
クションした。挿入によるβガラクトシダーゼ αフラ
グメントをコードしている遺伝子の不活性化(これによ
り、Ｘ−ガルをそのインジゴ色の切断産物に切断する能
力が失われる)によって組換え体プラークを同定した。
スクリーニングするため、白いプラーク６個をＬブロス
２.５mlに入れ、これに、最小培地ストックで培養してp
roＡＢを有するＦエピソームの保持を確実なものにし
た、Ｅ.コリＫ１２ ＪＭ１０３(０.４ml)を、対数増殖
期において加えた。このプラークを含有する溶液を、エ
アー振盪器中、３７℃で８時間インキュベートした。こ
の溶液１.５mlから得た細胞をペレット化し、実質的に
バーンボイムおよびドーリィ[Ｂirnboim and Ｄoly,Ｎu
c.Ａcids Ｒes.,７:１５１３(１９７９)]のアルカリ・
ミニスクリーン法に従って、ＲＦ ＤＮＡを単離した。
各培養物の残りは４℃で保存した。目的のファージ(pＭ
８ＢＷ２６と命名した)は、Ｍ１３mp８の〜７.２kb Ｅc
oＲＩ−ＨindＩＩＩ制限フラグメントにライゲートした
プラスミドpＢＷ２５の〜８１０bp ＥcoＲＩ−ＨindＩ
ＩＩ制限フラグメントを含有していた。
【０１５７】対数期のＥ.コリ ＪＭ１０３約５０mlをp
Ｍ８ＢＷ２６で感染させ、エアー振盪器中、３７℃で１
８時間インキュベートした。低速遠心することによって
感染細胞をペレット化し、上記インストラクション・マ
ニュアルの方法をスケールアップすることによって培養
物上清から１本鎖pＭ８ＢＷ２６ ＤＮＡを調製した。ク
レノウ反応を、室温で３０分間、次いで３７℃で６０分
間、次いで１０℃で１８時間行うこと以外は、実質的に
アデルマン等[Ａdelman et al.,ＤＮＡ ２(３):１８３
−１９３(１９８３)]の教示に従って、１本鎖pＭ８ＢＷ
２６を突然変異誘発にかけた。さらに、Ｓ１処理を２０
℃で行ない、緩衝液の塩濃度を製造元推奨の半分にし、
そしてＭ１３配列決定(シークエンシング)プライマー
(ＢＲＬ)を用いた。天然ＴＰＡのアミノ酸残基８７から
２６１に対応するコード化配列を削除するために用いた
合成オリゴデオキシリボヌクレオチド・プライマーは以
下の配列で示される（配列番号６）: ５'−GGGAAGTGCTGTGAAATATCCACCTGCGGCCTGAGA−３'
【０１５８】得られた突然変異誘発混合物を用い、実質
的に上記の感染方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＪＭ１０
３をトランスフェクションした。ＲＦ ＤＮＡの制限酵
素分析、およびマクサムおよびギルバート(Ｍaxam and
Ｇilbert)のＤＮＡ配列決定によって目的の突然変異体
を同定した。天然ＴＰＡのアミノ酸残基８７から２６１
に対応するコード化配列が削除された目的の突然変異体
をpＭ８ＢＷ２７と命名した。
【０１５９】プラスミドpＢＷ２８を構築するために
は、多種のＤＮＡフラグメントが必要である。それらフ
ラグメントの最初のものを以下のようにして得た。ガラ
ス蒸留した水２０μl中のＲＦ pＭ８ＢＷ２７ ＤＮＡ〜
２０μgを、１０×ＮdeＩ緩衝液１０μlおよび水６０μ
lに加えた。このプラスミドpＭ８ＢＷ２７ ＤＮＡの混
合物に、制限酵素ＮdeＩ約１０μl(〜５０単位)を加
え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートし
た。このＮdeＩ消化したプラスミドpＭ８ＢＷ２７ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、遠心した集め、１０×Ｅco
ＲＩ緩衝液１０μlおよび水９０μlに再懸濁した。この
ＮdeＩ消化したプラスミドpＭ８ＢＷ２７ＤＮＡの溶液
に、制限酵素ＥcoＲＩ約１０μl(〜５０単位)を加え、
得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
欠失部位を含むＴＰＡコード化配列の一部を含有する〜
５６０bp ＮdeＩ−ＥcoＲＩ制限フラグメントが他の消
化産物から分離するまで、このＥcoＲＩ−ＮdeＩ消化し
たプラスミドpＭ８ＢＷ２７ＤＮＡをアガロースゲル電
気泳動にかけた。この〜５６０bp ＮdeＩ−ＥcoＲＩ制
限フラグメントをゲルから単離し、目的のフラグメント
約０.５μgを得、これをガラス蒸留した水２０μlに再
懸濁した。
【０１６０】プラスミドpＢＷ２８の構築に必要な第２
のフラグメントは、鎖１本ずつ自動ＤＮＡ合成機で合成
する。実質的に実施例６Ａの方法に従って、２本の相補
的な鎖(これらは、ハイブリダイズしてＸbaＩおよびＮd
eＩの重なり部分を有する２本鎖ＤＮＡセグメントを形
成する)をキナーゼ処理し、アニーリングする。このリ
ンカーは以下の構造を有している（配列番号７）:
【化１０】
【０１６１】プラスミドpＢＷ２８の構築に必要な第３
のフラグメントは以下のようにして調製した。ＴＥ緩衝
液２０μl中のプラスミドpＴＰＡ１０３(〜２０μg)
を、１０×ＢamＨＩ緩衝液１０μlおよび水６０μlに加
えた。このプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡの溶液に、
制限酵素ＢamＨＩ約１０μl(〜５０単位)を加え、得ら
れた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。この
ＢamＨＩ消化したプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡをエ
タノールで沈澱させ、遠心して集め、１０×ＥcoＲＩ緩
衝液１０μlおよび水８０μlに再懸濁した。このＢamＨ
Ｉ消化したプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡの溶液に、
制限酵素ＥcoＲＩ約１０μl(〜５０単位)を加え、得ら
れた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。ＴＰ
Ａのカルボキシ末端のコード化配列を含有する〜６８９
bp ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ制限フラグメントが他の消化産
物から分離するまで、このＢamＨＩ−ＥcoＲＩ消化した
プラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡをアガロースゲル電気
泳動にかけた。この〜６８９bpフラグメント約０.５μg
をゲルから単離し、次いでガラス蒸留した水１０μlに
再懸濁した。
【０１６２】プラスミドpＢＷ２８の構築に必要な最後
のフラグメントはプラスミドpＬ１１０から単離した。
プラスミドpＬ１１０の制限部位および機能地図を添付
の図１４、図１５、図１６および図１７に示し、プラス
ミドpＬ１１０の構築を実施例１０Ｄ(本実施例の次節)
に記載する。
【０１６３】ＴＥ緩衝液２５μl中のプラスミドpＬ１１
０約２５μgを、１０×ＸbaＩ緩衝液[０.５Ｍ ＮaＣl、
６０mＭ トリス−ＨＣl(pＨ＝７.９)、６０mＭ ＭgＣ
l2、および１mg／ml ＢＳＡ]１０μlおよび水５５μlに
加えた。このプラスミドpＬ１１０ ＤＮＡの溶液に、制
限酵素ＸbaＩ約１０μl(〜５０単位)を加え、得られた
反応液を３７℃で２時間インキュベートした。このＸba
Ｉ消化したプラスミドpＬ１１０ ＤＮＡをエタノールで
沈澱させ、遠心して集め、１０×ＢamＨＩ緩衝液１０μ
lおよび水８９μlに再懸濁した。このＸbaＩ消化したプ
ラスミドpＬ１１０ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＢamＨＩ
約１μl(〜５単位)を加え、得られた反応液を３７℃で
３０分間インキュベートして、ＢamＨＩ部分消化物を得
た。〜６.０kb ＸbaＩ−ＢamＨＩフラグメントが他の消
化産物から明確に分離するまで、このＸbaＩ消化−Ｂam
ＨＩ部分消化したプラスミドpＬ１１０ ＤＮＡをアガロ
ースゲル電気泳動にかけた。この〜６.０kb制限フラグ
メントをゲルから単離し、約０.５μgの〜６.０kb Ｘba
Ｉ−ＢamＨＩ制限フラグメントを得、これをガラス蒸留
した水約４０μlに懸濁した。この〜６.０kb ＸbaＩ−
ＢamＨＩ制限フラグメントは、ＥＫ−ＢＧＨをコードし
ているＤＮＡを除き、プラスミドpＬ１１０のすべてを
含有している。
【０１６４】プラスミドpＢＷ２８を構築するため、次
のフラグメント、すなわち、プラスミドpＬ１１０の〜
６.０kb ＢamＨＩ−ＸbaＩ制限フラグメント約０.１μg
(〜８μl)、プラスミドpＭ８ＢＷ２７の〜５６０bp Ｎd
eＩ−ＥcoＲＩ制限フラグメント約０.０５μg(〜２μ
l)、プラスミドpＴＰＡ１０３の〜６８９bp ＥcoＲＩ−
ＢamＨＩ制限フラグメント約０.１μg(〜２μl)、およ
び〜４５bp ＸbaＩ−ＮdeＩ合成リンカー約０.０２μg
(〜１μl)をいっしょにして混合した。このＤＮＡ混合
物に、１０×リガーゼ緩衝液約２μlおよびＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ１μl(〜１バイス単位)を加え、得られたライ
ゲーション反応液を４℃で一晩２時間インキュベートし
た。ライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドpＢＷ２８
からなっていた。このプラスミドpＢＷ２８の制限部位
および機能地図を添付の図１４、図１５、図１６および
図１７に示す。
【０１６５】このライゲート化ＤＮＡを用い、５０mＭ
ＣaＣl2を用いること以外は実質的に実施例２の方法に
従って、コンピテントにしておいたＥ.コリＫ１２ ＭＭ
２９４(ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２５)を形質転換した。プ
ラスミドpＢＷ２８上にラムダpＬプロモーターおよび感
温性ラムダpＬリプレッサーをコードしている遺伝子が
存在しているため、形質転換方法および形質転換体の培
養方法を若干変えた。形質転換および次いで行う培養に
おいて、細胞を３２℃以上の温度にしなかった。本実施
例の次節は、ラムダpＬプロモーターおよびその感温性
リプレッサーをコードしているプロモーターの取り扱い
方法をより詳細に説明している。目的のＥ.コリＫ１２
ＭＭ２９４／pＢＷ２８形質転換体を、そのテトラサイ
クリン耐性かつアンピシリン感受性の表現型およびその
プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。
【０１６６】Ｄ.プラスミドpＬ１１０の構築 プラスミドpＫＣ２８３を出発原料として用いてプラス
ミドpＬ１１０を構築した。Ｅ.コリＫ１２ ＢＥ１２０
１／pＫＣ２８３の凍結乾燥品を、ＮＲＲＬから取得番
号ＮＲＲＬ Ｂ−１５８３０のもとで入手する。この凍
結乾燥品をＬブロス１０ml含有の試験管に移し、３２℃
で２時間インキュベートし、この時点で培養物を５０μ
g／mlアンピシリンの濃度にし、次いで３２℃で一晩イ
ンキュベートする。プラスミドpＫＣ２８３がpＬプロモ
ーターを含有し、Ｅ.コリＫ１２ ＢＥ１２０１細胞が細
胞ＤＮＡ内に組み込まれた感温性cＩリプレッサー遺伝
子を含有するので、このＥ.コリＫ１２ ＢＥ１２０１／
pＫＣ２８３細胞を３２℃で培養した。野性型ラムダpＬ
リプレッサー遺伝子を含有する細胞、またはラムダpＬ
プロモーターを含有しない細胞を、このプラスミド単離
方法に用いるときには、本明細書中の後の実施例に記載
したように、インキュベーション温度は３７℃である。
【０１６７】一晩培養物の少量を、Ｅ.コリＫ１２ ＢＥ
１２０１／pＫＣ２８３の単一コロニー単離体が得られ
るような方法で、５０μg／mlアンピシリン含有のＬ寒
天プレートで平板培養する。得られた単一コロニーを、
５０μg／mlアンピシリン含有のＬブロス１０mlに接種
し、激しく振盪しながら３２℃で一晩インキュベートし
た。この一晩培養物１０mlをＬブロス５００mlに接種
し、培養物が定常期に到達するまで、激しく振盪しなが
ら３２℃でインキュベートした。次いで、実質的に実施
例３の方法に従って、細胞からプラスミドpＫＣ２８３
ＤＮＡを調製した。プラスミドpＫＣ２８３が約１mg得
られ、これをＴＥ緩衝液中、約１μg／μlの濃度で、４
℃で保存した。プラスミドpＫＣ２８３の制限部位およ
び機能地図を添付の図１４、図１５、図１６および図１
７に示す。
【０１６８】プラスミドpＫＣ２８３ ＤＮＡ約１０μl
(〜１０μg)を、１０×中濃度塩制限緩衝液[５００mＭ
ＮaＣl、１００mＭ トリス−ＨＣl(pＨ＝７.５)、１０
０mＭＭgＣl2、および１０mＭ ＤＴＴ]２０μl、１mg／
ml ＢＳＡ２０μl、制限酵素ＰvuＩＩ ５μl(〜２５単
位)、および水１４５μlと混合し、得られた反応液を３
７℃で２時間インキュベートした。ここに記載する制限
酵素反応は、常法により、フェノール抽出、次いでクロ
ロホルム抽出によって停止させ、ＤＮＡを沈澱させ、エ
タノールで洗浄し、そしてＤＮＡをＴＥ緩衝液に再懸濁
した。上記のようにしてＰvuＩＩ消化を停止させた後、
ＰvuＩＩ消化したプラスミドpＫＣ２８３ ＤＮＡを沈澱
させ、これをＴＥ緩衝液５μlに再懸濁した。
【０１６９】ＸhoＩリンカー(５'−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−
３')約６００ピコモル(pＭ)を、５×キナーゼ緩衝液[３
００mＭ トリス−ＨＣl(pＨ＝７.８)、５０mＭ ＭgＣ
l2、および２５mＭ ＤＴＴ]１０μl、５mＭ ＡＴＰ５μ
l、水２４μl、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ０.５μ
l[Ｐ−Ｌ バイオケミカルズ(Ｐ−Ｌ Ｂiochemicals)定
義の約２.５単位]、１mg／mlＢＳＡ５μl、および１０m
Ｍスペルミジン５μlを含有する混合物中、混合物を３
７℃で３０分間インキュベートすることによってキナー
ゼ処理した。このキナーゼ処理したＸbaＩリンカー約１
２.５μlを、ＰvuＩＩ消化したプラスミドpＫＣ２８３
ＤＮＡ ５μlに加え、次いでこのＤＮＡ溶液に、１０×
リガーゼ緩衝液２.５μl、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２.５μ
l(Ｐ−Ｌバイオケミカルズ定義の約２.５単位)、１０m
Ｍスペルミジン２.５μl、および水１２.５μlを加え、
得られたライゲーション反応液を４℃で一晩インキュベ
ートした。ライゲーション反応の後、反応混合物を高塩
緩衝液[０.１Ｍ ＮaＣl、０.０５Ｍ トリス−ＨＣl(pＨ
＝７.５)、１０.０mＭ ＭgＣl2、および１mＭ ＤＴＴ]
の組成に調整した。この混合物に制限酵素ＸhoＩ約１０
μl(１００単位)を加え、得られた反応液を３７℃で２
時間インキュベートした。
【０１７０】反応を止め、ＸhoＩ消化したＤＮＡを沈澱
させ、再懸濁し、ライゲーション混合物にＸhoＩリンカ
ーを加えないこと以外は上記と同様にして、ライゲート
した。このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドpＫ
Ｃ２８３ＰＸからなっていた。このプラスミドpＫＣ２
８３ＰＸの制限部位および機能地図を添付の図１４、図
１５、図１６および図１７に示す。
【０１７１】Ｅ.コリＫ１２ ＭＯ(λ+)[ＮＲＲＬから取
得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５９９３のもとで入手可能]は野
性型ラムダpＬ cＩリプレッサー遺伝子を含有している
ので、Ｅ.コリＫ１２ ＭＯ(λ+)細胞においてはラムダp
Ｌプロモーターからの転写は起こらない。Ｅ.コリＫ１
２ ＭＯ(λ+)の単一コロニーを単離し、細胞の一晩培養
物１０mlを調製する(増殖培地にアンピシリンを用いな
い)。この一晩培養物５０μlを、１０mＭ ＭgＳＯ4およ
び１０mＭ ＭgＣl2含有のＬブロス５mlに接種した。こ
の培養物を、激しく振盪しながら３７℃で一晩インキュ
ベートした。翌朝、この培養物を１０mＭ ＭgＳＯ4およ
び１０mＭ ＭgＣl2含有のＬブロスで２００mlに希釈し
た。この希釈培養物を、Ｏ.Ｄ.590が約０.５(これは、
約１×１０8細胞／mlの細胞密度を示す)になるまで、激
しく振盪しながら３７℃でインキュベートした。氷水浴
で培養物を１０分間冷却し、次いで４℃、４０００Ｘg
で１０分間遠心して細胞を集めた。この細胞ペレットを
冷１０mＭ ＮaＣl １００mlに再懸濁し、そして直ちに
遠心して再ペレット化した。この細胞ペレットを３０m
Ｍ ＣaＣl2 １００mlに再懸濁し、氷上で２０分間イン
キュベートした。
【０１７２】もう一度遠心して細胞を集め、これを３０
mＭ ＣaＣl2 １０mlに再懸濁した。この細胞のうち０.
５mlを上記のようにして調製したライゲート化ＤＮＡ
(このＤＮＡは３０mＭ ＣaＣl2にしておいた)に加え
た。この細胞−ＤＮＡ混合物を氷上で１時間インキュベ
ートし、４２℃で９０秒間熱ショックを加え、次いで氷
上で約２分間冷却した。この細胞−ＤＮＡ混合物を、１
２５mlフラスコ中、ＬＢ培地で１０mlに希釈し、３７℃
で１時間インキュベートした。この１００μlをアンピ
シリン含有のＬ寒天プレートにプレートし、コロニーが
現れるまで３７℃でインキュベートした。
【０１７３】このコロニーを別々に培養し、個々のコロ
ニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素分析およびゲル電気
泳動で試験した。プラスミドＤＮＡの単離は、実施例３
の方法に従って、比較的小さいスケールで行なったが、
目的のＥ.コリＫ１２ ＭＯ(λ+)／pＫＣ２８３ＰＸ形質
転換体が同定されるまでＣsＣl勾配工程は割愛した。プ
ラスミドpＫＣ２８３ＰＸの制限部位および機能地図を
添付の図１４、図１５、図１６および図１７に示す。
【０１７４】プラスミドpＫＣ２８３ＰＸ ＤＮＡ１０μ
gを、１０×高塩緩衝液２０μl、１mg／ml ＢＳＡ２０
μl、制限酵素ＢglＩＩ ５μl(〜５０単位)、制限酵素
ＸhoＩ５μl(〜５０単位)、および水１５０μlに溶解
し、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートし
た。反応を止め、ＢglＩＩ−ＸhoＩ消化したＤＮＡを沈
澱させ、このＤＮＡをＴＥ緩衝液５μlに再懸濁した。
【０１７５】ＢglＩＩおよびＸhoＩ制限酵素切断の特徴
を示す１本鎖ＤＮＡ末端を有するＤＮＡリンカーを、自
動ＤＮＡ合成機を用いて合成し、実施例６Ａの記載と同
様にしてキナーゼ処理した。このＤＮＡリンカーは次の
構造を有していた（配列番号８）:
【化１１】 このリンカーおよびＢglＩＩ−ＸhoＩ消化したプラスミ
ドpＫＣ２８３ＰＸを、実質的に上記ライゲーション法
に従ってライゲートした。このライゲート化ＤＮＡは目
的のプラスミドpＫＣ２８３−Ｌからなっていた。この
プラスミドpＫＣ２８３−Ｌの制限部位および機能地図
を添付の図１４、図１５、図１６および図１７に示す。
このプラスミドpＫＣ２８３−Ｌ ＤＮＡを用いてＥ.コ
リＫ１２ ＭＯ(λ+)を形質転換し、得られたＥ.コリＫ
１２ ＭＯ(λ+)／pＫＣ２８３−Ｌ形質転換体を、その
アンピシリン耐性の表現型およびプラスミドＤＮＡの制
限酵素分析によって同定した。
【０１７６】プラスミドpＫＣ２８３−Ｌ ＤＮＡ約１０
μgを、１０×高塩緩衝液２０μl、１mg／ml ＢＳＡ２
０μl、制限酵素ＸhoＩ ５μl(〜５０単位)、および水
１５５μlに溶解し、得られた反応液を３７℃で２時間
インキュベートした。次いで、ＸhoＩ消化したプラスミ
ドpＫＣ２８３−Ｌ ＤＮＡを沈澱させ、これを１０×ニ
ックトランスレーション緩衝液[０.５Ｍ トリス−ＨＣl
(pＨ＝７.２)、０.１ＭＭgＳＯ4、および１mＭ ＤＴＴ]
２μl、デオキシヌクレオチド三リン酸それぞれが２mＭ
である溶液１μl、水１５μl、クレノウ１μl(Ｐ−Ｌ
バイオケミカルズ定義の〜６単位)、および１mg／mlＢ
ＳＡ１μlに再懸濁した。得られた反応液を２５℃で３
０分間インキュベートし、この溶液を７０℃で５分間イ
ンキュベートすることによって反応を止めた。
【０１７７】実質的に、上記のリンカーライゲーション
法に従って、ＢamＨＩリンカー(５'−ＣＧＧＧＡＴＣＣ
ＣＧ−３')をキナーゼ処理し、これを、ＸhoＩ消化し、
クレノウ処理したプラスミドpＫＣ２８３−Ｌ ＤＮＡに
ライゲートした。ライゲーション反応の後、このＤＮＡ
を高塩緩衝液中、３７℃で約２時間、ＢamＨＩ約１００
単位で消化した。ＢamＨＩ消化の後、実質的に上記の方
法に従って、ＤＮＡをライゲーション用に調製し、〜
５.９kb ＢamＨＩ制限フラグメントをライゲートして環
化し、Ｅ.コリＫ１２ ＭＯ(λ+)に導入して形質転換し
た。実質的に実施例３の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２
ＭＯ(λ+）／pＫＣ２８３−ＬＢ形質転換体を同定し、
次いでプラスミドpＫＣ２８３−ＬＢ ＤＮＡを形質転換
体から調製した。このプラスミドpＫＣ２８３−ＬＢの
制限部位および機能地図を添付の図１４、図１５、図１
６および図１７に示す。
【０１７８】実質的に上記方法に従って、プラスミドp
ＫＣ２８３ＰＸ約１０μgを、高塩緩衝液中、制限酵素
ＳalＩで消化し、クレノウで処理し、ＥcoＲＩリンカー
(５'−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣ−３')にライゲートし
た。制限酵素ＥcoＲＩによる消化(これにより〜２.１kb
ＤＮＡが削除される)の後、〜４.０kb ＥcoＲＩ制限フ
ラグメントをライゲーションにより環化してプラスミド
pＫＣ２８３ＰＲＳを得た。実質的に実施例３の方法に
従って、このライゲート化ＤＮＡを用いてＥ.コリＫ１
２ ＭＯ(λ+)を形質転換し、Ｅ.コリＫ１２ ＭＯ(λ+)
／pＫＣ２８３ＰＲＳ形質転換体を同定した後、形質転
換体からプラスミドpＫＣ２８３ＰＲＳ ＤＮＡを調製し
た。このプラスミドpＫＣ２８３ＰＲＳの制限部位およ
び機能地図を添付の図１４、図１５、図１６および図１
７に示す。
【０１７９】プラスミドpＫＣ２８３ＰＲＳ約１０μg
を、高塩緩衝液２００μl中、制限酵素ＰstＩおよびＳp
hＩそれぞれ約５０単位で消化した。この反応液を３７
℃で約２時間インキュベートした後、反応混合物を、ト
リス−アセテート緩衝液中、０.６％低ゲル化温度アガ
ロース[ＦＭＣ社(ＦＭＣ Ｃorporation,Ｍarine Ｃollo
ids Ｄivision,Ｒockland,Ｍaine ０４８４１)ゲルで、
２〜３時間、〜１３０Ｖおよび〜７５mＡで電気泳動し
た。
【０１８０】ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液で染色
し、〜０.８５kb ＰstＩ−ＳphＩ制限フラグメントを含
有するＤＮＡバンド(長波長ＵＶ光で目に見えるように
した)をゲルから小さいセグメントとして切り出した。
セグメントの重量および密度からセグメントの体積を測
定し、等容量の１０mＭ トリス−ＨＣl(pＨ＝７.６)を
セグメントを含む試験管に加えた。次いで７２℃でイン
キュベートしてセグメントを溶融した。約１００μl容
量中に、プラスミドpＫＣ２８３ＰＲＳの〜０.８５kb
ＰstＩ−ＳphＩ制限フラグメントが約１μg得られた。
同様の方法により、プラスミドpＫＣ２８３−ＬＢを制
限酵素ＰstＩおよびＳphＩで消化し、得られた〜３.０k
b 制限フラグメントをアガロースゲル電気泳動によって
単離し、ライゲーション用に調製した。
【０１８１】プラスミドpＫＣ２８３ＰＲＳの〜０.８５
kb ＰstＩ−ＳphＩ制限フラグメントをプラスミドpＫＣ
２８３−ＬＢの〜３.０kb ＰstＩ−ＳphＩ制限フラグメ
ントにライゲートした。このライゲート化ＤＮＡは目的
のプラスミドpＬ３２からなっていた。プラスミドpＬ３
２の制限部位および機能地図を添付の図１４、図１５、
図１６および図１７に示す。プラスミドpＬ３２をＥ.コ
リＫ１２ ＭＯ(λ +)細胞に導入して形質転換し、実質的
に実施例３の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＭＯ(λ+)
／pＬ３２形質転換体からプラスミドpＬ３２ ＤＮＡを
調製した。プラスミドpＬ３２ ＤＮＡの分析により、プ
ラスミドpＫＣ２８３ＰＸのクレノウ処理したＳalＩ末
端に１以上のＥcoＲＩリンカーが結合していることがわ
かった。１以上のＥcoＲＩリンカーの存在は、プラスミ
ドpＬ３２またはプラスミドpＬ３２誘導体の有用性に影
響せず、これをＸhoＩ制限部位(この部位は２個のＥco
ＲＩリンカーがライゲートしたときに生成する)の存在
によって検出することができる。
【０１８２】プラスミドpＣＣ１０１はショーナー等[Ｓ
choner et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,８１,
５４０３−５４０７(１９８４)]が開示している。ショ
ーナー等はプラスミドpＣＣ１０１をプラスミドpＣＺ１
０１と称している。プラスミドpＣＣ１０１の制限部位
および機能地図を添付の図１４、図１５、図１６および
図１７に示す。ＥＫ−ＢＧＨをコードしているＤＮＡを
単離するため、プラスミドpＣＣ１０１約１０μgを、制
限酵素ＸbaＩおよびＢamＨＩそれぞれを約５０単位含有
する高塩緩衝液２００μl中で消化した。この消化産物
をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ＥＫ−ＢＧ
Ｈをコードしている〜０.６kb ＸbaＩ−ＢamＨＩ制限フ
ラグメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製
した。
【０１８３】また、プラスミドpＬ３２も制限酵素Ｘba
ＩおよびＢamＨＩで消化し、〜３.９kb制限フラグメン
トを単離し、ライゲーション用に調製した。このプラス
ミドpＬ３２の〜３.９kb ＸbaＩ−ＢamＨＩ制限フラグ
メントを、プラスミドpＣＣ１０１の〜０.６kb ＸbaＩ
−ＢamＨＩ制限フラグメントにライゲートしてプラスミ
ドpＬ４７を得た。プラスミドpＬ４７の制限部位および
機能地図を添付の図１４、図１５、図１６および図１７
に示す。プラスミドpＬ４７をＥ.コリＫ１２ ＭＯ(λ+)
に導入して形質転換し、Ｅ.コリＫ１２ ＭＯ(λ+)／pＬ
４７形質転換体を同定した。実質的に実施例３の方法に
従って、形質転換体からプラスミドpＬ４７ ＤＮＡを調
製した。
【０１８４】プラスミドpＰＲ１２は、感温性pＬリプレ
ッサー遺伝子cＩ８５７およびプラスミドpＢＲ３２２の
テトラサイクリン耐性付与遺伝子を含有している。プラ
スミドpＰＲ１２は、１９８４年３月１３日発行の米国
特許Ｎo.４,４３６,８１５に記載され、特許請求されて
いる。プラスミドpＰＲ１２の制限部位および機能地図
を添付の図１４、図１５、図１６および図１７に示す。
【０１８５】プラスミドpＰＲ１２約１０μgを、高塩緩
衝液２００μl中、３７℃で２時間、制限酵素ＥcoＲＩ
約５０単位で消化した。実質的に上記方法に従って、こ
のＥcoＲＩ消化したプラスミドpＰＲ１２ＤＮＡを沈澱
させ、次いでクレノウで処理した。クレノウ反応の後、
このＥcoＲＩ消化し、クレノウ処理したプラスミドpＰ
Ｒ１２ ＤＮＡをライゲートして再環化し、目的のプラ
スミドpＰＲ１２ΔＲ１からなるこのライゲート化ＤＮ
Ａを用いてＥ.コリＫ１２ ＲＶ３０８(ＮＲＲＬＢ−１
５６２４)を形質転換した。形質転換体はテトラサイク
リン(１０μg／ml)耐性に基いて選択した。実質的に実
施例３の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ＲＶ３０８／pＰ
Ｒ１２ΔＲ１形質転換体を同定した後、プラスミドpＰ
Ｒ１２ΔＲ１ＤＮＡを形質転換体から調製した。
【０１８６】プラスミドpＰＲ１２ΔＲ１約１０μgを、
中塩緩衝液２００μl中、３７℃で２時間、制限酵素Ａv
aＩ約５０単位で消化した。このＡvaＩ消化したプラス
ミドpＰＲ１２ΔＲ１ ＤＮＡを沈澱させ、次いでクレノ
ウで処理した。クレノウ反応の後、このＡvaＩ消化し、
クレノウ処理したプラスミドpＰＲ１２ΔＲ１ ＤＮＡを
ＥcoＲＩリンカー(５'−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣ−
３')にライゲートし、沈澱させ、制限酵素ＥcoＲＩを約
５０単位含有する高塩緩衝液約２００μlに再懸濁し、
３７℃で約２時間インキュベートした。このＥcoＲＩ消
化の後、反応混合物を低溶融アガロースゲルにかけ、〜
５.１kb ＥcoＲＩ制限フラグメントをゲルから精製し、
ライゲーションによって再環化して目的のプラスミドp
ＰＲ１２ＡＲ１を得た。このプラスミドpＰＲ１２ＡＲ
１ ＤＮＡをＥ.コリＫ１２ ＲＶ３０８に導入して形質
転換した。形質転換体の選択はテトラサイクリン耐性に
基いて行った。実質的に実施例３の方法に従って、プラ
スミドpＰＲ１２ＡＲ１ ＤＮＡを形質転換体から調製し
た。プラスミドpＰＲ１２ＡＲ１の制限部位および機能
地図を添付の図１４、図１５、図１６および図１７に示
す。
【０１８７】プラスミドpＰＲ１２ＡＲ１ ＤＮＡ約１０
μgを、制限酵素ＰstＩおよびＥcoＲＩそれぞれを約５
０単位含有する高塩緩衝液約２００mlに懸濁し、この消
化反応液を３７℃で約２時間インキュベートした。次い
で、反応混合物をアガロースゲルにかけ、プラスミドp
ＰＲ１２ＡＲ１の〜２.９kb ＰstＩ−ＥcoＲＩ制限フラ
グメントを単離し、ライゲーション用に調製した。
【０１８８】プラスミドpＬ４７約１０μgを、高塩緩衝
液２００μl中、３７℃で２時間、制限酵素ＰstＩおよ
びＢamＨＩで消化した。このＰstＩ−ＢamＨＩ消化した
ＤＮＡをアガロースゲルにかけ、複製起源およびアンピ
シリン耐性付与遺伝子の一部を含有する〜２.７kb Ｐst
Ｉ−ＢamＨＩ制限フラグメントを単離し、ライゲーショ
ン用に調製した。別の反応液において、プラスミドpＬ
４７ ＤＮＡ約１０μgを、高塩緩衝液２００μl中、３
７℃で２時間、制限酵素ＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化
し、ラムダpＬ転写活性化配列、Ｅ.コリ lpp翻訳活性化
配列、およびＥＫ−ＢＧＨをコードしているＤＮＡを含
有する〜１.０３kb ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ制限フラグメン
トを単離し、ライゲーション用に調製した。
【０１８９】プラスミドpＬ４７の〜２.７kb ＰstＩ−
ＢamＨＩおよび〜１.０３kb ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ制限フ
ラグメントを、プラスミドpＰＲ１２ＡＲ１の〜２.９kb
ＰstＩ−ＥcoＲＩ制限フラグメントにライゲートして
プラスミドpＬ１１０を構築し、このライゲート化ＤＮ
Ａを用いてＥ.コリＫ１２ＲＶ３０８を形質転換した。
テトラサイクリン耐性に基いて形質転換体を選択した。
【０１９０】２つのＰstＩ制限酵素認識部位が、ＥＫ−
ＢＧＨコード化領域に存在する(添付図の制限部位およ
び機能地図には記載されていない)。プラスミドpＬ１１
０の制限部位および機能地図を添付の図１４、図１５、
図１６および図１７に示す。
【０１９１】Ｅ.最終的なプラスミドpＢＷ３２の構築 プラスミドpＳＶ２−β−グロビンＤＮＡ(ＮＲＲＬ Ｂ
−１５９２８)約１０μgを１０×ＨindＩＩＩ反応緩衝
液１０μl、制限酵素ＨindＩＩＩ ５μl(〜５０単位)、
および水８５μlに溶解し、この反応液を２時間３７℃
に保った。次いでこの反応混合物を０.１５Ｍ ＬiＣlと
し、２.５倍量のエタノール加え、ドライアイス−エタ
ノール浴でインキュベートした後、遠心してＤＮＡをペ
レット化した。
【０１９２】このＤＮＡペレットを、１０×ＢglＩＩ緩
衝液１０μl、制限酵素ＢglＩＩ５μl(〜５０単位)、お
よび水８５μlに溶解し、この反応液を２時間３７℃に
保った。このＢglＩＩ消化の後、反応混合物を０.８５
％アガロースゲル電気泳動にかけ、フラグメントを分離
した。前記と同様にして、臭化エチジウムおよび紫外光
を用いてゲルを可視化し、目的の〜４.２kb ＨindＩＩ
Ｉ−ＢglＩＩフラグメントを含有するバンドをゲルから
切り出した。ペレットを水１０μlに再懸濁した。この
ペレットは目的のプラスミドpＳＶ２−β−グロビンの
〜４.２kb ＨindＩＩＩ−ＢglＩＩ制限フラグメント〜
５μgからなっていた。実質的に上記教示に従って、Ｔ
ＰＡをコードしているプラスミドpＴＰＡ１０３の〜２.
０kb ＨindＩＩＩ−ＢamＨＩ制限フラグメントをプラス
ミドpＴＰＡ１０３から単離した。プラスミドpＴＰＡ１
０３の〜２.０kb ＨindＩＩＩ−ＢamＨＩ制限フラグメ
ント約５μgが得られ、水１０μlに懸濁し、−２０℃で
保存した。
【０１９３】プラスミドpＳＶ２−β−グロビンの〜４.
２kb ＢglＩＩ−ＨindＩＩＩ制限フラグメント２μlお
よびプラスミドpＴＰＡ１０３の〜２.０kb ＨindＩＩＩ
−ＢamＨＩフラグメント４μlをいっしょにして混合
し、次いで１０×リガーゼ緩衝液２μl、水１１μl、お
よびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μl(〜５００単位)とともに
４℃で一晩インキュベートした。このライゲート化ＤＮ
Ａは目的のプラスミドpＴＰＡ３０１からなっていた。
このプラスミドの制限部位および機能地図を添付の図１
４、図１５、図１６および図１７に示す。実質的に実施
例３の教示に従い、このライゲート化ＤＮＡを用いて、
形質転換用にコンピテントにしたＥ.コリＫ１２ ＲＲ１
細胞(ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１０)を形質転換した。実質
的に実施例３の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＲＲ１／
pＴＰＡ３０１形質転換体からプラスミドＤＮＡを得
た。
【０１９４】プラスミドpＳＶ２−dhfrは、ジヒドロ葉
酸還元酵素(dhfr)遺伝子に共有結合したＤＮＡの増幅お
よび形質転換した真核生物細胞の選択に有用であるdhfr
遺伝子を含有している。プラスミドpＳＶ−dhfr[Ｅ.コ
リＫ１２ ＨＢ１０１／pＳＶ２−dhfr(ＡＴＣＣ ３７１
４６)から単離した]１０μgを、１０×ＰvuＩＩ緩衝液
１０μl、ＰvuＩＩ制限酵素２μl(〜２０単位)、および
水８８μlと混合し、得られた反応液を３７℃で２時間
インキュベートした。フェノールおよびクロロホルム抽
出によって反応を止め、次いでこのＰvuＩＩ消化したプ
ラスミドpＳＶ２−dhfr ＤＮＡを沈澱させ、遠心して集
めた。
【０１９５】以下の方法により、ＢamＨＩリンカー(５'
−ＣＧＧＡＴＣＣＣＧ−３')をキナーゼ処理しライゲー
ション用に調製した。水５μl中のリンカー１μgに、５
×キナーゼ塩[３００mＭ トリス−ＨＣl(pＨ＝７.８)、
５０mＭ ＭgＣl2、および２５mＭ ＤＴＴ]１０μl、５m
Ｍ ＡＴＰ ５μl、１mg／ml ＢＳＡ ５μl、１０mＭス
ペルミジン５μl、水１９μl、および１０単位／μlポ
リヌクレオチドキナーゼ１μlを加えた。次いでこの反
応液を３７℃で６０分間インキュベートし、−２０℃で
保存した。ＰvuＩＩ消化したプラスミドpＳＶ２−dhfr
５μl(〜５μg)およびキナーゼ処理したＢamＨＩリンカ
ー１２μl(〜.２５μl)を混合し、水１１μl、１０×リ
ガーゼ緩衝液２μlおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μl(〜
１０００単位)とともに１６℃で一晩インキュベートし
た。
【０１９６】このライゲーション反応混合物に、１０×
ＢamＨＩ反応緩衝液１０μl、ＢamＨＩ制限酵素１０μl
(〜５０単位)、および水４８μlを加え、次いでこの溶
液を３７℃で３時間インキュベートした。この反応液を
１％アガロースゲルにかけ、dhfr遺伝子を含有する目的
の〜１.９kbフラグメントをゲルから単離した。これら
の実施例で行なったリンカー付加のすべては、常法によ
りアガロースゲルで精製して最終ベクターにおける多重
リンカー配列の可能性を減少させた。得られたフラグメ
ント〜３μgをＴＥ緩衝液１０μlに懸濁した。
【０１９７】次に、プラスミドpＴＰＡ３０１約１５μl
(〜１μg)を、上記のようにしてＢamＨＩ制限酵素で消
化した。プラスミドpＴＰＡ３０１にはＢamＨＩ部位が
１つしか存在しないので、このＢamＨＩ消化により直線
状のプラスミドpＴＰＡ３０１ＤＮＡが生成する。この
ＢamＨＩ消化したプラスミドpＴＰＡ３０１をエタノー
ルで沈澱させ、水９４μlに再懸濁し、ウシ腸アルカリ
ホスファターゼ[コラボレーティブ・リサーチ社(Ｃolla
borative Ｒesearch,Ｉnc.,１２８ Ｓpring Ｓtreet,Ｌ
exington,ＭＡ ０２１７３)]１μlおよび１Ｍトリス−
ＨＣl(pＨ＝９.０)５μlを用いて６５℃で４５分間ホス
ファターゼ処理した。このＤＮＡをフェノール:クロロ
ホルムで抽出し、次いでクロロホルム:イソアミルアル
コールで抽出し、エタノール沈澱し、水２０μlに再懸
濁した。ホスファターゼ処理したプラスミドpＴＰＡ３
０１(１０μl:〜０.２５μg)を、ＢamＨＩ ５μl、dhfr
遺伝子を含有する制限フラグメント(〜１.５μg)、１０
×リガーゼ緩衝液３μl、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ３μl(〜
１５００単位)、および水９μlに加えた。このライゲー
ション反応液を１５℃で一晩インキュベートした。この
ライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドpＴＰＡ３０３
ＤＮＡからなっていた。
【０１９８】プラスミドpＴＰＡ３０３を用いてＥ.コリ
Ｋ１２ ＲＲ１(ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１０)を形質転換
し、得られたＥ.コリＫ１２ ＲＲ１／pＴＰＡ３０３形
質転換体を、そのアンピシリン耐性の表現型およびその
プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。実
質的に実施例３の方法に従って、プラスミドpＴＰＡ３
０３を形質転換体から単離した。
【０１９９】pＢＲ３２２レプリコンおよびプラスミドp
ＴＰＡ３０１由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子をコードし
ている〜２.７kb ＥcoＲＩ−ＢglＩＩ制限フラグメント
を単離するため、プラスミドpＴＰＡ３０１約１０μg
を、全反応液容量４００μl中、３７℃で、１×ＢglＩ
Ｉ緩衝液中のＢglＩＩ制限酵素２０単位で完全に消化し
た。このＢglＩＩ消化の後、トリス−ＨＣl濃度を１１
０mＭに調整し、ＢglＩＩ消化したＤＮＡにＥcoＲＩ制
限酵素２０単位を加えた。〜２.７kb ＥcoＲＩ−ＢglＩ
Ｉ制限フラグメントが他の消化産物から分離するまで、
このＥcoＲＩ−ＢglＩＩ消化したＤＮＡをアガロースゲ
ル電気泳動にかけ、次いで〜２.７kbフラグメントを単
離し、ライゲーション用に調製した。
【０２００】dhfr遺伝子を含有する制限フラグメントを
単離するため、プラスミドpＴＰＡ３０３をＨindＩＩＩ
およびＥcoＲＩ制限酵素で２重に消化し、dhfr遺伝子を
含有する〜２３４０bp ＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ制限フラ
グメントを単離し、回収した。
【０２０１】ＴＰＡのカルボキシ末端コード化領域およ
びＳＶ４０プロモーターを含有するプラスミドpＴＰＡ
３０３の〜２kb ＨindＩＩＩ−ＳstＩ制限フラグメント
を単離するため、プラスミドpＴＰＡ３０３を、１×Ｈi
ndＩＩＩ緩衝液中、ＨindＩＩＩおよびＳstＩ制限酵素
で２重に消化した。〜１.７kbフラグメントをゲルから
単離し、ライゲーション用に調製した。
【０２０２】改良型ＴＰＡのアミノ末端コード化領域を
含有するプラスミドpＢＷ２８の〜６８０bp ＸhoＩＩ
(ライゲーションに対してはＢglＩＩ重なり部分と適合
しうる)−ＳstＩ制限フラグメントを単離するため、プ
ラスミドpＢＷ２８約１０μgを、１×ＸhoＩＩ緩衝液
[０.１Ｍ トリス−ＨＣl(pＨ＝８.０)、０.１Ｍ ＭgＣl
2、０.１％トリトンＸ−１００、および１mg／ml ＢＳ
Ａ]中、ＸhoＩＩ酵素で完全に消化した。このＸhoＩＩ
消化したＤＮＡをエタノール沈澱で回収し、次いでＳst
Ｉ酵素で完全に消化した。このＸhoＩＩ−ＳstＩ消化し
たＤＮＡをアクリルアミドゲルにかけ、目的のフラグメ
ントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した。
【０２０３】上記のフラグメント、すなわちプラスミド
pＴＰＡ３０１の〜２.７kb ＥcoＲＩ−ＢglＩＩ制限フ
ラグメント、プラスミドpＴＰＡ３０３の〜２.３４kb
ＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ制限フラグメント、プラスミドp
ＴＰＡ３０３の〜１.７kb ＳstＩ−ＨindＩＩＩ制限フ
ラグメント、およびプラスミドpＢＷ２８の〜０.６８kb
ＳstＩ−ＸhoＩＩ制限フラグメントそれぞれ約０.１μ
gをいっしょにしてライゲートし、プラスミドpＢＷ３２
を得た。このライゲーション混合物を用い、５０mＭ Ｃ
aＣl2を用いること以外は実施例２の教示のようにし
て、Ｅ.コリＫ１２ＭＭ２９４を形質転換した。形質転
換体をそのアンピシリン耐性の表現型およびそのプラス
ミドＤＮＡの制限分析によって同定した。実質的に実施
例３の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＭＭ２９４／pＢ
Ｗ３２形質転換体からプラスミドpＢＷ３２ ＤＮＡを得
た。このプラスミドpＢＷ３２の制限部位および機能地
図を添付の図１４、図１５、図１６および図１７に示
す。
【０２０４】実施例１１ プラスミドpＬＰＣhd１、pＬ
ＰＣhd２、pＬＰＣdhfr１およびpＬＰＣdhfr２の構築 Ａ.プラスミドpＬＰＣhd１およびpＬＰＣhd２の構築 ＴＥ緩衝液２０μl中のプラスミドpＢＷ３２約２０μg
を、１０×ＢamＨＩ緩衝液１０μlおよび水６０μlに加
えた。このプラスミドpＢＷ３２ ＤＮＡの溶液に、制限
酵素ＢamＨＩ約１０μl(〜５０単位)を加え、得られた
反応液を３７℃で２時間インキュベートした。このＢam
ＨＩ消化したプラスミドpＢＷ３２ ＤＮＡをエタノール
で沈澱させ、遠心して集め、１０×クレノウ緩衝液５μ
l、水４５μlおよびクレノウ酵素２μl(〜１００単位)
に再懸濁した。この反応液を１６℃で３０分間インキュ
ベートし、次いで消化産物が明確に分離するまでこの反
応混合物をアガロースゲル電気泳動にかけた。実質的に
実施例４Ａの方法に従って、dhfr遺伝子を含有する、プ
ラスミドpＢＷ３２の〜１.９kb クレノウ処理化ＢamＨ
Ｉ制限フラグメントをゲルから単離し、ライゲーション
用に調製した。目的のフラグメントが約４μg得られ、
これをＴＥ緩衝液５μlに懸濁した。
【０２０５】ＴＥ緩衝液１００μl中のプラスミドpＬＰ
Ｃhyg１約２００μgを、１０×ＥcoＲＩ緩衝液１５μl
および水３０μlに加えた。このプラスミドpＬＰＣhyg
１ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＥcoＲＩ約５μl(〜５０
単位)を加え、得られた反応液を３７℃で１０分間イン
キュベートした。この短い反応時間は、部分的なＥcoＲ
Ｉ消化物が得られるように算出したものである。プラス
ミドpＬＰＣhyg１はＥcoＲＩ制限部位を２箇所有してお
り、そのうちの１箇所は、ハイグロマイシン耐性付与
(ＨmＲ)遺伝子のコード化配列内に存在している。この
ＨmＲ遺伝子内ではないプラスミドpＬＰＣhyg１のＥco
ＲＩ部位に、dhfr遺伝子を含有している制限フラグメン
トを挿入することが望ましい。１箇所だけ切断したプラ
スミドpＬＰＣhyg１ ＤＮＡが未切断プラスミドＤＮＡ
およびその他の消化産物から分離するまで、この部分に
ＥcoＲＩ消化したプラスミドpＬＰＣhyg１ ＤＮＡをア
ガロースゲル電気泳動にかけた。実質的に実施例４Ａの
方法に従って、この１箇所だけ切断したＤＮＡをゲルか
ら単離し、ライゲーション用に調製した。１箇所だけＥ
coＲＩ切断したプラスミドpＬＰＣhyg１が約２μg得ら
れ、これをＴＥ緩衝液２５μlに懸濁した。この試料
に、クレノウ酵素約５μl(〜２５単位)、１０×クレノ
ウ緩衝液５μl、および水４０μlを加え、得られた反応
液を１６℃で６０分間インキュベートした。このクレノ
ウ処理し、部分的にＥcoＲＩ消化したＤＮＡを、フェノ
ールで２回、次いでクロロホルムで１回抽出し、エタノ
ールで沈澱させ、ＴＥ緩衝液２５μlに再懸濁した。
【０２０６】プラスミドpＢＷ３２の〜１.９kbのクレノ
ウ処理したＢamＨＩ制限フラグメント約５μl、および
１箇所だけＥcoＲＩ切断したプラスミドpＬＰＣhyg１
ＤＮＡ約５μlをいっしょにして混合し、このＤＮＡ混
合物に、１０×リガーゼ緩衝液１μl、水５μl、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ１μl(〜５００単位)、およびＴ４ ＲＮ
Ａリガーゼ１μl(〜２単位)を加え、得られた反応液を
１６℃で一晩インキュベートした。このライゲート化Ｄ
ＮＡは目的のプラスミドpＬＰＣhd１およびpＬＰＣhd２
(これらは、dhfr遺伝子を含有している〜１.９kbフラグ
メントの配向だけが異なっている)からなっていた。
【０２０７】このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に
実施例２の方法に従って、形質転換用にコンピテントに
しておいたＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を１００μg／mlアンピシリン含有の
Ｌ−寒天で平板培養し、アンピシリン耐性の形質転換体
をプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって分析して、
Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＬＰＣhd１およびＥ.コリ
Ｋ１２ ＨＢ１０１／pＬＰＣhd２形質転換体を同定し
た。プラスミドpＬＰＣhd１の制限部位および機能地図
を添付の図１８に示す。プラスミドpＬＰＣhd１および
プラスミドpＬＰＣhd２ ＤＮＡを、実質的に実施例３の
方法に従って、適切な形質転換体から単離した。
【０２０８】プラスミドpＬＰＣhd３およびpＬＰＣhd４
は、その構造がプラスミドpＬＰＣhd１およびpＬＰＣhd
２に類似している。プラスミドpＬＰＣhyg１のかわりに
プラスミドpＬＰＣhyg２を出発原料として用いること以
外は、実質的にプラスミドpＬＰＣhd１およびpＬＰＣhd
２の構築に用いた方法に従って、プラスミドpＬＰＣhd
３およびpＬＰＣhd４を構築する。
【０２０９】Ｂ.プラスミドpＬＰＣdhfr１およびpＬＰ
Ｃdhfr２の構築 ＴＥ緩衝液１００μl中のプラスミドpＢＷ３２約１００
μgを、１０×ＢamＨＩ緩衝液１５μlおよび水２５μl
に加えた。このプラスミドpＢＷ３２ ＤＮＡの溶液に、
制限酵素ＢamＨＩ約１０μl(〜２５単位)を加え、得ら
れた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。この
ＢamＨＩ消化したプラスミドpＢＷ３２ＤＮＡを、実質
的に実施例１１Ａの方法に従って、クレノウで処理し
た。この平滑末端にしたフラグメントをエタノールで沈
澱させ、ＴＥ緩衝液１０μlに再懸濁し、次いでジヒド
ロ葉酸還元酵素遺伝子を含有する〜１.９kb ＢamＨＩ制
限フラグメントがその他の消化産物から分離するまで、
アガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的に実
施例４Ａの方法に従って、この〜１.９kb制限フラグメ
ントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した。
目的のフラグメントが約１０μg得られ、これをＴＥ緩
衝液５０μlに懸濁した。
【０２１０】ＮdeＩ−ＳtuＩ消化したプラスミドpＬＰ
Ｃ ＤＮＡ(実施例９で調製した)約５μlを、クレノウ処
理した、プラスミドpＢＷ３２の〜１.９kb ＢamＨＩ制
限フラグメント５μl、１０×リガーゼ緩衝液１.５μ
l、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μl(〜１０００単位)、Ｔ４
ＲＮＡリガーゼ１μl(〜２単位)、および水１.５μlに
加えた。得られたライゲーション反応液を１６℃で一晩
インキュベートした。このライゲート化ＤＮＡは目的の
プラスミドpＬＰＣdhfr１およびpＬＰＣdhfr２(これら
は、dhfr遺伝子を含有している〜１.９kbフラグメント
の配向だけが異なっている)からなっていた。このライ
ゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２の方法に従っ
て、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１を形質転換した。形質転
換細胞をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、プ
ラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピシリン耐
性のＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＬＰＣdhfr１および
Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＬＰＣdhfr２形質転換体
を同定した。
【０２１１】実施例１２ プラスミドphdの構築 プラスミドphdを構築するためには、アデニンメチラー
ゼ(たとえばこれをdam遺伝子がコードしており、その遺
伝子産物は配列:５'−ＧＡＴＣ−３'中のアデニン残基
をメチル化する)を欠くＥ.コリ宿主細胞から、プラスミ
ドpＬＰＣhd１ＤＮＡ(これをプラスミドphd構築の出発
原料として用いる)を調製することが必要であった。Ｅ.
コリＫ１２ ＧＭ４８(ＮＲＲＬ Ｂ−１５７２５)は機能
的なdamメチラーゼを欠いており、従って、プラスミドp
hd構築の出発原料として用いるプラスミドpＬＰＣhd１
ＤＮＡを調製する目的で使用するのに適した宿主であ
る。
【０２１２】実質的に実施例２の方法に従って、Ｅ.コ
リＫ１２ ＧＭ４８細胞を培養し、形質転換用にコンピ
テントにし、プラスミドpＬＰＣhyg１を用いてこのＥ.
コリＫ１２ ＧＭ４８細胞を形質転換した。実質的に実
施例３の方法に従って、この形質転換細胞をアンピシリ
ン含有のＬ寒天にプレートし、アンピシリン耐性のＥ.
コリＫ１２ ＧＭ４８／pＬＰＣhd１形質転換体がコロニ
ーを形成したら、そのコロニーの１つを用いてプラスミ
ドpＬＰＣhd１ ＤＮＡを調製した。約１mgのプラスミド
pＬＰＣhd１ ＤＮＡが得られ、これをＴＥ緩衝液約１ml
に懸濁した。
【０２１３】ＴＥ緩衝液２μl中のプラスミドpＬＰＣhd
１ ＤＮＡ約２μgを、１０×ＢclＩ緩衝液[７５０mＭ
ＫＣl、６０mＭ トリス−ＨＣl(pＨ＝７.４)、１００m
Ｍ ＭgＣl2、１０mＭ ＤＴＴ、および１mg／ml ＢＳＡ]
２μlおよび水１４μlに加えた。このプラスミドpＬＰ
Ｃhd１ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＢclＩ約２μl(〜１
０単位)を加え、得られた反応液を５０℃で２時間イン
キュベートした。この混合物をフェノールで１回、クロ
ロホルムで２回抽出することによって反応を止めた。
【０２１４】ＢclＩ消化したプラスミドpＬＰＣhd１ Ｄ
ＮＡ約１μlを、１０×リガーゼ緩衝液１μl、水８μ
l、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μl(〜５００単位)に
加えた。このライゲーション反応液を１６℃で一晩イン
キュベートした。このライゲート化ＤＮＡは目的のプラ
スミドphdからなっていた。プラスミドphdは、プラスミ
ドpＬＰＣhd１から全大きさが約１.４５kbの２個の近接
ＢclＩ制限フラグメントおよびプラスミドpＬＰcat構築
の際に結合した余分のＢclＩリンカー削除することによ
って得られる。プラスミドphdの制限部位および機能地
図を添付の図１９に示す。発現させようとするＤＮＡ
を、プラスミドphdの唯一のＢclＩ部位に、発現のため
の正しい位置で、容易に挿入することができるので、プ
ラスミドphdは、本発明のＢＫウイルスエンハンサー−
アデノウイルス後期プロモーターからのすべてのＤＮＡ
配列の発現を容易にする。
【０２１５】このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に
実施例２の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＧＭ４８を形
質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ−寒
天で平板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によ
ってアンピシリン耐性のＥ.コリＫ１２ ＧＭ４８／phd
形質転換体を同定した。
【０２１６】プラスミドpＬＰＣhd１の代わりにプラス
ミドpＬＰＣhd２、pＬＰＣhd３またはpＬＰＣhd４のい
ずれかを出発原料として用い、実質的に上記のプラスミ
ドphd構築法に従って、プラスミドphdに類似するプラス
ミドを構築することができる。これらの類似プラスミド
は、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子および／またはdh
fr遺伝子の配向だけがプラスミドphdと異なっている。
【０２１７】実施例１３ プラスミドpＬＰＣＥ１Ａの
構築 アデノウイルス２ ＤＮＡのＥ１Ａ遺伝子を単離するた
め、アデノウイルス２ＤＮＡ(ＢＲＬから入手)約２０μ
gを、１０×ＢalＩ緩衝液[１００mＭ トリス−ＨＣl(p
Ｈ＝７.６)、１２０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ ２−メル
カプトエタノール、および１mg／ml ＢＳＡ]１０μlお
よび水８０μlに溶解した。このアデノウイルス２ ＤＮ
Ａの溶液に、制限酵素ＢalＩ約１０μl(約２０単位)を
加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベート
した。Ｅ１Ａ遺伝子を含有する〜１.８kb制限フラグメ
ントがその他の消化産物から分離するまで、このＢalＩ
消化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけた。実
質的に実施例４Ａの方法に従って、この〜１.８kbフラ
グメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製し
た。目的のフラグメントが約３μg得られ、これをＴＥ
緩衝液２０μlに懸濁した。
【０２１８】ＴＥ緩衝液５μl中のプラスミドpＬＰＣ約
５μgを、１０×ＳtuＩ緩衝液２μlおよび水１１μlに
加えた。このプラスミドpＬＰＣの溶液に、制限酵素Ｓt
uＩ約２μl(〜１０単位)を加え、得られた反応液を３７
℃で２時間インキュベートした。このＳtuＩ消化したプ
ラスミドpＬＰＣ ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１０
×ＮdeＩ緩衝液２μlおよび水１６μlに再懸濁した。こ
のＳtuＩ消化したプラスミドpＬＰＣ ＤＮＡの溶液に制
限酵素ＮdeＩ約２μl(〜１０単位)を加え、得られた反
応液を３７℃で２時間インキュベートした。
【０２１９】このＮdeＩ−ＳtuＩ消化したプラスミドp
ＬＰＣ ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１０×クレノ
ウ緩衝液５μlおよび水４２μlに再懸濁した。このＤＮ
Ａ溶液にクレノウ酵素約３μl(〜６単位)を加え、得ら
れた反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。〜
５.８２kbの、クレノウ処理したＮdeＩ−ＳtuＩ制限フ
ラグメントがその他の反応生成物から明確に分離するま
で、この反応混合物をアガロースゲル電気泳動にかけ
た。実質的に実施例４Ａの方法に従って、このフラグメ
ントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した。
プラスミドpＬＰＣの〜５.８２kbの、クレノウ処理した
ＮdeＩ−ＳtuＩ制限フラグメントが約２μg得られ、Ｔ
Ｅ緩衝液２５μlに懸濁した。
【０２２０】Ｅ１Ａ遺伝子をコードしているアデノウイ
ルス２の〜１.８kb ＢamＨＩ制限フラグメント約９μ
l、およびプラスミドpＬＰＣの〜５.８２kb クレノウ処
理化ＮdeＩ−ＳtuＩ制限フラグメント３μlを、１０×
リガーゼ緩衝液２μlおよび水４μlに加えた。このＤＮ
Ａ溶液に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ約１μl(〜５００単位)
およびＴ４ ＲＮＡリガーゼ１μl(〜２単位)を加え、得
られた反応液を１６℃で一晩インキュベートした。
【０２２１】このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミ
ドpＬＰＣＥ１ＡおよびpＬＰＣＥ１Ａ１からなっていた
(これらは、Ｅ１Ａ遺伝子の配向が異なり、またおそら
くは、ＢＫエンハンサーがプラスミド上のＥ１Ａ遺伝子
に対して有している発現促進効果が異なる)。プラスミ
ドpＬＰＣＥ１Ａ１よりプラスミドpＬＰＣＥ１Ａのほう
が、ＢＫエンハンサーにより近接してＥ１Ａプロモータ
ーが位置しているので、プラスミドpＬＰＣＥ１Ａ１を
用いるよりプラスミドpＬＰＣＥ１Ａを用いるときのほ
うがＥ１Ａ発現が高くなるであろう。プラスミドpＬＰ
ＣＥ１Ａの制限部位および機能地図を添付の図２０に示
す。
【０２２２】このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に
実施例２の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ−
寒天で平板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
よってアンピシリン耐性形質転換体をスクリーニングし
て、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＬＰＣＥ１Ａおよび
Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＬＰＣＥ１Ａ１形質転換
体を同定した。後の実験にもちいるため、実質的に実施
例３の方法に従って、形質転換体からプラスミドＤＮＡ
を得た。
【０２２３】実施例１４ プラスミドpＢＬＴの構築 ＴＥ緩衝液１μl中のプラスミドpＢＷ３２ ＤＮＡ(図１
４、図１５、図１６および図１７、実施例１０)約１μg
を、１０×ＢamＨＩ緩衝液２μlおよび水１５μlに加え
た。このプラスミドpＢＷ３２ ＤＮＡの溶液に、制限酵
素ＢamＨＩ約２μl(〜１０単位)を加え、得られた反応
液を３７℃で２時間インキュベートした。この反応混合
物を始めにフェノールで、次いでクロロホルムで２回抽
出することによって反応を止めた。このＢamＨＩ消化し
たプラスミドpＢＷ３２ ＤＮＡ約１μlを、１０×リガ
ーゼ緩衝液１μlおよび水８μlに加え、このＤＮＡ溶液
にＴ４ ＤＮＡリガーゼ約１μl(〜５００単位)を加えた
後、得られた反応液を１６℃で一晩インキュベートし
た。
【０２２４】このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミ
ドpＢＷ３２delからなっていた(このプラスミドは大き
さが約５.６kbであり、ＨindＩＩＩ制限部位を１つだけ
含有している)。このライゲート化ＤＮＡを用い、実質
的に実施例２の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０
１を形質転換した。目的のＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／
pＢＷ３２del形質転換体を、そのアンピシリン耐性の表
現型およびそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によっ
て同定した。後の構築にもちいるため、実質的に実施例
３の方法に従って、形質転換体からプラスミドpＢＷ３
２del ＤＮＡを得た。
【０２２５】ＴＥ緩衝液１μl中のプラスミドpＢＷ３２
del約１μgを、１０×ＨindＩＩＩ緩衝液２μlおよび水
１５μlに加えた。このプラスミドpＢＷ３２del ＤＮＡ
の溶液に、制限酵素ＨindＩＩＩ約２μl(〜１０単位)を
加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベート
した。実質的に実施例２記載の方法に従って、この試料
をＴＥ緩衝液で１００μlに希釈し、ウシ腸アルカリホ
スファターゼで処理した。この反応液をフェノールで２
回、次いでクロロホルムで１回抽出した。次いで、この
ＨindＩＩＩ消化したプラスミドpＢＷ３２del ＤＮＡを
エタノールで沈澱させ、水１０μlに再懸濁した。
【０２２６】実質的に実施例５の方法に従って、プラス
ミドpＢal８cat(実施例１７)を制限酵素ＨindＩＩＩで
消化し、改良型ＢＫエンハンサー−アデノウイルス２後
期プロモーターカセットを含有する〜０.６５kb Ｈind
ＩＩＩ制限フラグメントを単離し、これをライゲーショ
ン用に調製した。ＴＥ緩衝液５μl中のプラスミドpＢal
８catの〜０.６５kb ＨindＩＩＩ制限フラグメント約
０.１μgを、ＨindＩＩＩ消化したプラスミドpＢＷ３２
delの溶液３μlに加えた。このＤＮＡ混合物に、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ約１μl(〜５００単位)および１０×リ
ガーゼ緩衝液１μlを加え、得られた反応液を１６℃で
一晩インキュベートした。
【０２２７】このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミ
ドpＢＬＴからなっていた。プラスミドpＢＬＴの制限部
位および機能地図を添付の図２１に示す。このライゲー
ト化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２の方法に従って、
Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１を形質転換した。形質転換細
胞をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、プラス
ミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピシリン耐性の
Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＢＬＴ形質転換体を同定
した。〜０.６５kb ＨindＩＩＩ制限フラグメントは、
２つの配向(そのうちの１つだけがプラスミドpＢＬＴを
与える)のうちのどちらででもＨindＩＩＩ消化したプラ
スミドpＢＷ３２delに挿入することができるので、この
〜０.６５kb ＨindＩＩＩ制限フラグメントの配向を決
定してＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＢＬＴ形質転換体
を同定した。後の構築にもちいるため、実質的に実施例
３の方法に従って、形質転換体からプラスミドpＢＬＴ
ＤＮＡを調製した。
【０２２８】実施例１５ プラスミドpＢＬＴhyg１、p
ＢＬＴhyg２、pＢＬＴdhfr１、およびpＢＬＴdhfr２の
構築 Ａ.プラスミドpＢＬＴhyg１およびpＢＬＴhyg２の構築 ＴＥ緩衝液４μl中のプラスミドpＢＬＴ ＤＮＡ約４μg
を、１０×ＢamＨＩ緩衝液２μlおよび水１２μlに加え
た。このプラスミドpＢＬＴ ＤＮＡの溶液に、制限酵素
ＢamＨＩ約２μl(〜１０単位)を加え、得られた反応液
を３７℃で２時間インキュベートした。この反応混合物
を始めにフェノールで、次いでクロロホルムで抽出する
ことによって反応を止めた。次いで、このＢamＨＩ消化
したプラスミドpＢＬＴ ＤＮＡをエタノールで沈澱さ
せ、ＴＥ緩衝液２μlに再懸濁した。
【０２２９】ＴＥ緩衝液１０μl中のプラスミドpＳＶ２
hyg約１０μgを、１０×ＢamＨＩ緩衝液１０μlおよび
水７５μlに加えた。このプラスミドpＳＶ２hyg ＤＮＡ
の溶液に、制限酵素ＢamＨＩ約５μl(〜２５単位)を加
え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートし
た。このＢamＨＩ消化したプラスミドpＳＶ２hyg ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝液１０μlに再懸
濁し、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有する〜
２.５kb ＢamＨＩ制限フラグメントがその他の消化産物
から分離するまで、アガロースゲル電気泳動にかけた。
次いで、実質的に実施例４Ａの方法に従って、この〜
２.５kb制限フラグメントをゲルから単離し、ライゲー
ション用に調製した。目的のフラグメント約２μgが得
られ、これをＴＥ緩衝液１０μlに懸濁した。
【０２３０】ＢamＨＩ消化したプラスミドpＢＬＴ ＤＮ
Ａ約２μlおよびプラスミドpＳＶ２hygの〜２.５kb Ｂa
mＨＩ制限フラグメント１μlを、１０×リガーゼ緩衝液
１μl、水５μl、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μl(〜
５００単位)に加え、得られた反応液を１６℃で一晩イ
ンキュベートした。このライゲート化ＤＮＡは目的のプ
ラスミドpＢＬＴＴhyg１およびpＢＬＴhyg２からなって
いた。プラスミドpＢＬＴhyg１の制限部位および機能地
図を添付の図２２に示す。プラスミドpＢＬＴhyg１とp
ＢＬＴhyg２は、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子をコ
ードしている〜２.５kb ＢamＨＩ制限フラグメントの配
向だけが異なっている。
【０２３１】このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に
実施例２の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ−
寒天で平板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
よってアンピシリン耐性のＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／
pＢＬＴhyg１およびＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＢＬ
Ｔhyg２形質転換体を同定した。
【０２３２】Ｂ.プラスミドpＢＬＴdhfr１およびpＢＬ
Ｔdhfr２の構築 ＴＥ緩衝液１００μl中のプラスミドpＢＷ３２約１００
μgを、１０×ＢamＨＩ緩衝液１５μlおよび水２５μl
に加えた。このプラスミドpＢＷ３２ ＤＮＡの溶液に、
制限酵素ＢamＨＩ約１０μl(〜５０単位)を加え、得ら
れた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。この
ＢamＨＩ消化したプラスミドpＢＷ３２ＤＮＡをエタノ
ールで沈澱させ、ＴＥ緩衝液１０μlに再懸濁し、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子を含有する〜１.９kb ＢamＨＩ
制限フラグメントがその他の消化産物から分離するま
で、アガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的
に実施例４Ａの方法に従って、この〜１.９kb制限フラ
グメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製し
た。目的のフラグメント約１０μgが得られ、これをＴ
Ｅ緩衝液５０μlに懸濁した。
【０２３３】実施例１５Ａで調製したＢamＨＩ消化のプ
ラスミドpＢＬＴ ＤＮＡ約２μlおよびプラスミドpＢＷ
３２の〜１.９kb ＢamＨＩ制限フラグメント１μlを、
１０×リガーゼ緩衝液１μl、水５μl、およびＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ１μl(〜５００単位)に加え、得られた反
応液を１６℃で一晩インキュベートした。このライゲー
ト化ＤＮＡは目的のプラスミドpＢＬＴdhfr１およびpＢ
ＬＴdhfr２からなっていた。プラスミドpＢＬＴdhfr１
の制限部位および機能地図を添付の図２３に示す。プラ
スミドpＢＬＴdhfr１とpＢＬＴdhfr２は、dhfr遺伝子を
コードしている〜１.９kb ＢamＨＩ制限フラグメントの
配向だけが異なっている。
【０２３４】このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に
実施例２の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ−
寒天で平板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
よってアンピシリン耐性のＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／
pＢＬＴdhfr１およびＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０１／pＢＬ
Ｔdhfr２形質転換体を同定した。
【０２３５】実施例１６ プラスミドphdＴＰＡおよびp
hdＭＴＰＡの構築 Ａ.中間体プラスミドpＴＰＡ６０２の構築 ガラス蒸留水４５μl中のプラスミドpＴＰＡ１０３(実
施例１０、図１４、図１５、図１６および図１７)約５
０μgを、１０×ＥcoＲＩ緩衝液３０μlおよび水２２５
μlに加えた。このプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡの
溶液に、制限酵素ＥcoＲＩ約１０μl(〜８０単位)を加
え、得られた反応液を３７℃で９０分間インキュベート
した。このＥcoＲＩ消化したプラスミドpＴＰＡ１０３
ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１×ローディング緩衝
液(１０％グリセリンおよび０.０２％ブロモフェノール
ブルー)５０μlに再懸濁し、〜１.１kb ＥcoＲＩ制限フ
ラグメントがその他の反応生成物から分離するまで、ア
ガロースゲル電気泳動にかけた。フラグメントを透析袋
に電気泳動させることによって、ＴＰＡのアミノ末端を
コードしているＤＮＡを含有する〜１.１kb ＥcoＲＩ制
限フラグメントをゲルから単離した。次いで、このフラ
グメントをエタノールで沈澱させ、水１６０μlに再懸
濁した。
【０２３６】１０×ＨgaＩ緩衝液[０.５Ｍ ＮaＣl、６
０mＭ トリス−ＨＣl(pＨ＝７.４)、および０.１Ｍ
ＭgＣl2]約４０μl、ガラス蒸留水２００μl、および制
限酵素ＨgaＩ ２０μl(約１０単位)を、〜１.１kb Ｅco
ＲＩ制限フラグメントの溶液に加え、得られた反応液を
３７℃で４時間インキュベートした。このＨgaＩ消化し
たＤＮＡをエタノールで沈澱させ、次いで５％アクリル
アミドゲルで電気泳動し、ＴＰＡのアミノ末端をコード
している〜５２０bp制限フラグメントをＤＥ８１紙に単
離し、回収した。〜５２０bp ＨgaＩフラグメント約５
μgが得られ、これを水５０μlに懸濁した。
【０２３７】１０×クレノウ緩衝液[０.５Ｍ トリス−
ＨＣl(pＨ＝７.４)、および０.１ＭＭgＣl2]約１２.５
μl、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸それぞれ
が６.２５mＭである溶液２μl、０.２Ｍ ＤＴＴ ２μ
l、７μg／ml ＢＳＡ １μl、ガラス蒸留水５７.５μ
l、およびクレノウ酵素[ベーリンガー・マンハイム・バ
イオケミカルズ(Ｂoehringer−Ｍannheim Ｂiochemical
s,７９４１ ＣastlewayＤr.,Ｐ.Ｏ.Ｂox ５０８１６,Ｉ
ndianapolis,ＩＮ ４６２５０)]２μl(〜１０単位)を、
〜５２０bp ＨgaＩ制限フラグメントの溶液に加え、得
られた反応液を２０℃で３０分間インキュベートした。
このクレノウ処理したＤＮＡを７０℃で１５分間インキ
ュベートし、エタノールで沈澱させた。
【０２３８】ＢamＨＩリンカー(５'−ＣＧＧＧＡＴＣＣ
ＣＧ−３';２本鎖であり、ニュー・イングランド・バイ
オラブズから入手した)約５００ピコモルを、合計反応
容量２５μl中、ポリヌクレオチドキナーゼを用いてホ
スホリル化した。この反応は、実質的に実施例６Ａ記載
の方法に従って行った。クレノウ処理した〜５２０bpＨ
gaＩ制限フラグメントの溶液に、このキナーゼ処理した
ＢamＨＩリンカーを、１０×リガーゼ緩衝液１５μl、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ７μl(〜７バイス単位)、および反
応液容量を１５０μlとするに十分なガラス蒸留水とと
もに加えた。得られた反応液を１６℃で一晩インキュベ
ートした。
【０２３９】このライゲーション反応液を加熱して不活
性化し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１０×ＢamＨ
Ｉ緩衝液５μlおよび水４５μlに再懸濁した。このＤＮ
Ａ溶液に制限酵素ＢamＨＩ約１μl(〜１６単位)を加
え、得られた反応液を３７℃で９０分間インキュベート
した。次いで、この反応混合物にＢamＨＩ酵素１６単位
をさらに加え、反応液を３７℃でさらに９０分間インキ
ュベートした。次いで、実質的に実施例６Ａの方法に従
って、反応混合物を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、ＢamＨＩ末端を有する〜５３０bp ＨgaＩ制
限フラグメントをゲルから精製した。目的のフラグメン
トが約２μg得られ、これを水２０μlに懸濁した。
【０２４０】ＢamＨＩ消化し、脱ホスホリル化したプラ
スミドpＢＲ３２２ ＤＮＡは、ニュー・イングランド・
バイオラブズから入手することができる。水２μl中
の、ＢamＨＩ消化し、脱ホスホリル化したプラスミドp
ＢＲ３２２約０.１μgを、プラスミドpＴＰＡ１０３
の、ＢamＨＩ末端を有する〜５３０bp ＨgaＩ制限フラ
グメント１μl、水１４μl、およびＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ１μl(〜１バイス単位)に加え、得られた反応液を１
６℃で一晩インキュベートした。このライゲート化ＤＮ
Ａは、目的のプラスミドpＴＰＡ６０２およびプラスミ
ドpＴＰＡ６０１と命名したその等価物(このプラスミド
は、挿入した〜５３０bp制限フラグメントの配向だけが
プラスミドpＴＰＡ６０２と異なる)からなっていた。こ
のプラスミドpＴＰＡ６０２の制限部位および機能地図
を添付の図２４に示す。
【０２４１】このライゲート化ＤＮＡを用い、５０mＭ
ＣaＣl2を用いること以外は実質的に実施例２の方法に
従って、Ｅ.コリＫ１２ ＭＭ２９４を形質転換した。形
質転換細胞をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養
し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピシ
リン耐性のＥ.コリＫ１２ ＭＭ２９４／pＴＰＡ６０２
およびＥ.コリＫ１２ ＭＭ２９４／pＴＰＡ６０１細胞
を同定した。〜５３０bpＢamＨＩ制限フラグメントの存
在は、プラスミドがpＴＰＡ６０２またはpＴＰＡ６０１
のどちらかであることを示す。
【０２４２】Ｂ.中間体プラスミドpＴＰＡ６０３の構築 プラスミドpＴＰＡ６０２約５μgを、１０×ＢglＩＩ緩
衝液２０μlおよび水１８０μlに加えた。このプラスミ
ドpＴＰＡ６０２ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＢglＩＩ約
３μl(〜２４単位)を加え、得られた反応液を３７℃で
９０分間インキュベートした。次いで、この反応混合物
に１０×ＢamＨＩ緩衝液〜１３μlを加えて、反応混合
物の塩濃度をＳalＩ消化に推奨される濃度にし、この反
応液に制限酵素ＳalＩ ２μl(〜２０単位)を加えた。こ
の反応液を３７℃でさらに２時間インキュベートし、次
いでＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ローディング緩衝
液７５μlに再懸濁し、〜４.２kb ＢglＩＩ−ＳalＩ制
限フラグメントがその他の消化産物から分離するまで、
アガロースゲル電気泳動にかけた。この〜４.２kb Ｂgl
ＩＩ−ＳalＩ制限フラグメントを含有するゲル領域をゲ
ルから切り出し、凍結させ、この凍結セグメントをプラ
スチックで包み、そして圧搾して〜４.２kbフラグメン
トを取り出した。このＤＮＡを沈澱させ、水２０μlに
再懸濁した(目的のフラグメントが約２００ナノグラム
得られた)。
【０２４３】プラスミドpＴＰＡ１０３約１２μgを、１
０×ＢglＩＩ緩衝液１５μlおよび水１３５μlに加え
た。このプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡの溶液に、制
限酵素ＢglＩＩ約２μl(〜１６単位)を加え、得られた
反応液を３７℃で９０分間インキュベートした。このＢ
glＩＩ消化したプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡの溶液
に１０×ＢamＨＩ緩衝液約１０μlを加えて、反応混合
物の塩濃度をＳalＩ消化に必要とされる濃度にした。次
いで、このＢglＩＩ消化したプラスミドpＴＰＡ１０３
ＤＮＡの溶液に制限酵素ＳalＩ約２μl(〜２０単位)を
加え、この反応液を３７℃でさらに９０分間インキュベ
ートした。このＢglＩＩ−ＳalＩ消化したプラスミドp
ＴＰＡ１０３ ＤＮＡをエタノール沈澱によって濃縮
し、次いでアガロースゲルにかけ、ＴＰＡのアミノ末端
以外のすべてをコードしている〜２.０５kb ＢglＩＩ−
ＳalＩ制限フラグメントをゲルから単離し、エタノール
で沈澱させ、水２０μlに再懸濁した。目的のフラグメ
ントが約２μg得られた。
【０２４４】プラスミドpＴＰＡ６０２の〜４.２kb Ｂg
lＩＩ−ＳalＩ制限フラグメント約５μlおよびプラスミ
ドpＴＰＡ１０３の〜２.０５kb ＢglＩＩ−ＳalＩ制限
フラグメント２μlを、１０×リガーゼ緩衝液２μl、水
１０μl、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μl(〜１バイス
単位)に加え、得られたライゲーション反応液を１６℃
で一晩インキュベートした。このライゲート化ＤＮＡは
目的のプラスミドpＴＰＡ６０３からなっていた。プラ
スミドpＴＰＡ６０３の制限部位および機能地図を添付
の図２５に示す。
【０２４５】このライゲート化ＤＮＡを用い、５０mＭ
ＣaＣl2を用いること以外は実質的に実施例２の方法に
従って、Ｅ.コリＫ１２ ＭＭ２９４を形質転換した。こ
の形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培
養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピ
シリン耐性のＥ.コリＫ１２ ＭＭ２９４／pＴＰＡ６０
３形質転換体を同定した。
【０２４６】Ｃ.プラスミドpＭＴＰＡ６０３の構築 ＴＥ緩衝液１００μl中のプラスミドpＢＬＴ(実施例１
４、図２１)約１００μgを、１０×ＳstＩ(ＳstＩは制
限酵素ＳacＩと等価である)緩衝液[６０mＭ トリス−Ｈ
Ｃl(pＨ＝７.４)、６０mＭ ＭgＣl2、６０mＭ ２−メル
カプトエタノール、および１mg／ml ＢＳＡ]１０μlお
よび水２５μlに加えた。このプラスミドpＢＬＴ ＤＮ
Ａの溶液に、制限酵素ＳstＩ約１０μl(〜５０単位)を
加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベート
した。このＳstＩ消化したプラスミドpＢＬＴ ＤＮＡを
エタノールで沈澱させ、１０×ＢglＩＩ緩衝液１０μl
および水８５μlに再懸濁した。このＳstＩ消化したプ
ラスミドpＢＬＴ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＢglＩＩ約
５μl(〜５０単位)を加え、得られた反応液を３７℃で
２時間インキュベートした。
【０２４７】実質的に実施例４Ａの方法に従って、この
ＢglＩＩ−ＳstＩ消化したプラスミドpＢＬＴ ＤＮＡを
エタノールで沈澱させ、水１０μlに再懸濁し、アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、改良型ＴＰＡのコード化配列
部分(改良型ＴＰＡをコードしている配列が得られるよ
うな欠失が生じている)を含有するプラスミドpＢＬＴの
〜６９０bp ＢglＩＩ−ＳstＩ制限フラグメントをゲル
から単離した。目的の、プラスミドpＢＬＴの〜６９０b
p ＢglＩＩ−ＳstＩ制限フラグメントが約５μg得ら
れ、これを水１００μlに懸濁した。
【０２４８】ＴＥ緩衝液５μl中のプラスミドpＴＰＡ６
０３(実施例１６Ｂ、図２５)約５μgを、１０×ＳstＩ
緩衝液１０μlおよび水９５μlに加えた。このプラスミ
ドpＴＰＡ６０３ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＳstＩ約５
μl(〜５０単位)を加え、得られた反応液を３７℃で２
時間インキュベートした。このＳstＩ消化したプラスミ
ドpＴＰＡ６０３ ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１０
×ＢglＩＩ緩衝液１０μlおよび水８５μlに再懸濁し
た。このＳstＩ消化したプラスミドpＴＰＡ６０３ＤＮ
Ａの溶液に、制限酵素ＢglＩＩ約５μl(〜５０単位)を
加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベート
した。実質的に実施例２の方法に従って、このＢglＩＩ
−ＳstＩ消化したプラスミドpＴＰＡ６０３ ＤＮＡをＴ
Ｅ緩衝液１００μlに希釈し、ウシ腸アルカリホスファ
ターゼで処理した。次いで、このＤＮＡをエタノールで
沈澱させ、水１０μlに再懸濁した。
【０２４９】ＢglＩＩ−ＳstＩ消化したプラスミドpＴ
ＰＡ６０３約５μlおよびプラスミドpＢＬＴの〜６９０
bp ＢglＩＩ−ＳstＩ制限フラグメント２μlを、１０×
リガーゼ緩衝液２μl、水１０μl、およびＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ１μl(〜１０００単位)に加え、得られたライ
ゲーション反応液を１６℃で一晩インキュベートした。
このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドpＭＴＰＡ
６０３からなっていた。従って、プラスミドpＭＴＰＡ
６０３が改良型ＴＰＡをコードし、プラスミドpＴＰＡ
６０３がＴＰＡをコードしていること以外は、プラスミ
ドpＭＴＰＡ６０３はその構造がプラスミドpＴＰＡ６０
３(図２５)と類似している。
【０２５０】このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に
実施例２の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１を
形質転換した。この形質転換細胞をアンピシリン含有の
Ｌ−寒天で平板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分
析によってアンピシリン耐性のＥ.コリＫ１２ ＨＢ１０
１／pＭＴＰＡ６０３形質転換体を同定した。
【０２５１】Ｄ.プラスミドphdＴＰＡの構築 ＴＥ緩衝液１０μl中のプラスミドpＴＰＡ６０３(実施
例１６Ｂ、図２５)約１０μgを、１０×ＢamＨＩ緩衝液
１０μlおよび水８５μlに加えた。このプラスミドpＴ
ＰＡ６０３ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＢamＨＩ約５μl
(〜５０単位)を加え、得られた反応液を３７℃で２時間
インキュベートした。このＢamＨＩ消化したプラスミド
pＴＰＡ６０３ ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、水１０
μlに再懸濁し、ＴＰＡをコードしている〜１.９０kb
ＢamＨＩ制限フラグメントがその他の消化産物から分離
するまでアガロースゲル電気泳動にかけた。この〜１.
９０kb ＢamＨＩ制限フラグメントをゲルから単離し、
ＴＥ緩衝液５０μlに再懸濁した。目的のフラグメント
が約４μg得られた。
【０２５２】ＴＥ緩衝液２μl中のプラスミドphd(実施
例１２、図１９)約２μgを、１０×ＢclＩ緩衝液２μl
および水１４μlに加えた。このプラスミドphd ＤＮＡ
の溶液に、制限酵素ＢclＩ約２μl(〜１０単位)を加
え、得られた反応液を５０℃で２時間インキュベートし
た。この反応混合物を始めにフェノールで、次いでクロ
ロホルムで２回抽出することによって、反応を停止させ
た。次いで、このＢclＩ消化したプラスミドphd ＤＮＡ
をエタノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝液２０μlに再懸濁
した。
【０２５３】ＢclＩ消化したプラスミドphd約１μlおよ
びプラスミドpＴＰＡ６０３の〜１.９０kb ＢamＨＩ制
限フラグメント２μlを、１０×リガーゼ緩衝液１μl、
水５μl、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μl(〜５００単
位)に加え、得られたライゲーション反応液を１６℃で
一晩インキュベートした。このライゲート化ＤＮＡは目
的のプラスミドphdＴＰＡからなっていた。このプラス
ミドphdＴＰＡの制限部位および機能地図を添付の図２
６に示す。
【０２５４】このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に
実施例２の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１
(ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２６)を形質転換した。この形質
転換混合物をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養
し、制限酵素分析によってアンピシリン耐性のＥ.コリ
Ｋ１２ ＨＢ１０１／phdＴＰＡ細胞を同定した。〜１.
９０kb ＢamＨＩ制限フラグメントは、ＢclＩ消化した
プラスミドphdに２種類の配向のうちどちらかで挿入す
ることができるが、そのうちの１つだけが、ＢＫエンハ
ンサー−アデノウイルス後期プロモーターカセットの制
御下に発現させるのに適した位置に、ＴＰＡコード化配
列を配置している。すなわち、これが目的のプラスミド
phdＴＰＡである。
【０２５５】Ｅ.プラスミドphdＭＴＰＡの構築 ＴＥ緩衝液１０μl中のプラスミドpＭＴＰＡ６０３(実
施例１６Ｃ)約１０μgを、１０×ＢamＨＩ緩衝液１０μ
lおよび水８５μlに加えた。このプラスミドpＭＴＰＡ
６０３ ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＢamＨＩ約５μl(〜
５０単位)を加え、得られた反応液を３７℃で２時間イ
ンキュベートした。このＢamＨＩ消化したプラスミドp
ＭＴＰＡ６０３ ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、水１
０μlに再懸濁し、改良型ＴＰＡをコードしている〜１.
３５kb ＢamＨＩ制限フラグメントがその他の消化産物
から分離するまでアガロースゲル電気泳動にかけた。こ
の〜１.３５kb ＢamＨＩ制限フラグメントをゲルから単
離し、ＴＥ緩衝液２０μlに再懸濁した。目的のフラグ
メントが約４μg得られた。
【０２５６】実施例１６Ｄで調製したＢclＩ消化のプラ
スミドphd約１μlおよびプラスミドpＭＴＰＡ６０３の
〜１.３５kb ＢamＨＩ制限フラグメント２μlを、１０
×リガーゼ緩衝液１μl、水５μl、およびＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ１μl(〜５００単位)に加え、得られたライゲ
ーション反応液を１６℃で一晩インキュベートした。こ
のライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドphdＭＴＰＡ
からなっていた。プラスミドphdＭＴＰＡの制限部位お
よび機能地図を添付の図２７に示す。
【０２５７】このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に
実施例２の方法に従って、Ｅ.コリＫ１２ ＨＢ１０１を
形質転換した。この形質転換混合物をアンピシリン含有
のＬ−寒天で平板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素
分析によってアンピシリン耐性のＥ.コリＫ１２ ＨＢ１
０１／phdＭＴＰＡ細胞を同定した。〜１.３５kbＢamＨ
Ｉ制限フラグメントは、ＢclＩ消化したプラスミドphd
に２種類の配向のうちのどちらかで挿入することができ
るが、そのうちの１つだけが、ＢＫエンハンサー−アデ
ノウイルス後期プロモーターの制御下に発現させるのに
適した位置に、ＴＰＡコード化配列を配置している。す
なわち、これが目的のプラスミドphdＭＴＰＡである。
【０２５８】実施例１７ 改良型ＢＫエンハンサー−ア
デノウイルス後期プロモーターカセットの構築 近接する真核生物性プロモーターのＣＡＡＴ領域の５'
末端の上流側０〜３００ヌクレオチドにＢＫエンハンサ
ーを配置することによって、該エンハンサーの転写促進
効果を著しく増加させることができる。修飾を加えてよ
り大きい促進活性を達成する前の、本発明のＢＫエンハ
ンサー−アデノウイルス２後期プロモーターカセットの
配列および機能成分を以下に示す（配列番号９）:
【０２５９】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】 [配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、およびＴはチミジルであ
る]。
【０２６０】ＢＫエンハンサーは、上記配列中に示した
３つの繰り返し配列で定義され、近接する配列に対し
て、どちらの配向であっても同様に機能する。このエン
ハンサー、すなわちＢＫエンハンサーの３番目の繰り返
しの３'末端(これは配向に依存する)を、アデノウイル
ス−２ 後期プロモーターのＣＡＡＴ領域の５'末端のよ
り近くに持ってくるため、ＴＥ緩衝液１７０μl中のＳs
tＩ消化したプラスミドpＢＬcat ＤＮＡ約８２μgを、
５×Ｂal３１ヌクレアーゼ緩衝液[０.１Ｍ トリス−Ｈ
Ｃl(pＨ＝８.１)、０.５Ｍ ＮaＣl、０.０６Ｍ ＣaＣ
l2、および５mＭ Ｎa2ＥＤＴＡ]２０μlおよびＢal３１
ヌクレアーゼ[これは、「早い」Ｂal３１酵素６μl(〜６
単位)および「遅い」Ｂal３１酵素３μl(〜３単位)からな
り、これらはインターナショナル・バイオテクノロジー
ズ社(Ｉnternational Ｂiotechnologies,Ｉnc.,Ｐ.Ｏ.
Ｂox １５６５,Ｎew Ｈaven,ＣＴ ０６５０６)から市販
されている]９μlに加えた。この反応液を３０℃で約３
分間インキュベートし、次いで０.１Ｍ ＥＧＴＡ約１０
μlを加えて反応を止めた後、このＢal３１消化したＤ
ＮＡをエタノール沈澱および遠心することによって集め
た。実質的に上記記載の方法に従って、このＤＮＡペレ
ットを１×クレノウ緩衝液に再懸濁し、クレノウ酵素で
処理した。
【０２６１】このクレノウ処理したＤＮＡをＴＥ緩衝液
１０μlに再懸濁し、次いで前記のようにして、このＤ
ＮＡ約１μlを、１×リガーゼ緩衝液１０μl中、Ｔ４
ＤＮＡおよびＲＮＡリガーゼを用いて自己ライゲートさ
せた。このライゲート化ＤＮＡを用いてＥ.コリＫ１２
ＨＢ１０１を形質転換し、次いでこの形質転換体をアン
ピシリン含有のＬ寒天にプレートした。制限酵素分析を
用いて、どの形質転換体が適当な大きさのＢＫエンハン
サー−アデノウイルス２後期プロモーターカセット含有
のプラスミドを含んでいるかを測定し、ＤＮＡ配列決定
を用いてこのカセットのヌクレオチド配列を確認した。
上記の方法は、アデノウイルス後期プロモーターのＣＡ
ＡＴ領域の上流側０〜３００ヌクレオチド以内にＢＫエ
ンハンサーが配置された多数のプラスミドを生じる。上
記方法から得られたプラスミドの１つをプラスミドpＢa
l８catと命名した。このプラスミドpＢal８catのＢＫエ
ンハンサー−アデノウイルス２後期プロモーターの配列
を以下に示す（配列番号１０）:
【０２６２】
【化１６】
【化１７】
【化１８】 [配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、およびＴはチミジルであ
る]。
【０２６３】プラスミドpＢal８catについて説明した
が、上記方法によって多数の別種プラスミドが得られる
ことは当業者の理解するところであろう。一群のこれら
プラスミドは、Ａd２後期プロモーターのＣＡＡＴ領域
から３００ヌクレオチド以内の様々な距離のところにＢ
Ｋエンハンサーを配置したものであり、従って本発明の
重要な態様である。上述の方法または当分野で既知のそ
の他の方法を用いておこなうことができるこのＢＫエン
ハンサー活性を改良する方法は、すべてのＢＫエンハン
サーおよびすべての真核生物性プロモーターを用いて行
うことができる。
【０２６４】実施例１８ 本発明の発現ベクターの真核
宿主細胞形質転換体の作成およびこれら形質転換体にお
ける組換え遺伝子発現レベルの測定 本発明の態様のうち重要なものは、ＢＫエンハンサーを
用いて、Ｅ１Ａ遺伝子産物の存在下に遺伝子の発現を刺
激することに関する。２９３細胞は構成的にＥ１Ａ遺伝
子産物を発現するので、２９３細胞が本発明の真核生物
性発現ベクターの宿主として好ましい。２９３細胞はア
デノウイルスタイプ５(本発明方法においては、アデノ
ウイルスの特定タイプのいずれかを用いてＥ１Ａ遺伝子
産物を供給することができることに注意)で形質転換し
たヒト胎児腎細胞であり、ＡＴＣＣから取得番号ＣＲＬ
１５７３のもとで入手できる。しかし本発明の発現ベ
クターは、たとえＥ１Ａ遺伝子産物が存在しない場合で
あっても、多種多様の宿主細胞において機能する。さら
に、Ｅ１Ａ遺伝子を含有する本発明のベクター(たとえ
ば、プラスミドpＬＰＣＥ１ＡおよびpＬＰＣＥ１Ａ１)
あるいは完全なアデノウイルスＤＮＡで形質転換する
か、またはアデノウイルスに感染させることによって、
Ｅ１Ａ−非産生セルラインにＥ１Ａ遺伝子産物を導入す
ることができる。
【０２６５】以下に記載する形質転換法は、宿主細胞セ
ルラインとして２９３細胞を挙げて言及するが、この方
法は、ほとんどの真核生物セルラインに一般的に応用す
ることができる。本発明のベクターで多数のセルライン
を形質転換し、実際に作成した形質転換体のいくつか、
およびその関連情報を本実施例中、後記の表に示す。本
発明の発現ベクターは極めて多数にのぼるので、形質転
換法は一般的に記載し、実際に作成した形質転換体を表
中に示す。
【０２６６】２９３細胞を、ＡＴＣＣから取得番号ＣＲ
Ｌ１５７３のもと、１０％の加熱不活性化したウマ血清
を含有するイーグル(Ｅagle)の最小必須培地中の、約
５.５×１０6の全面単層細胞を含有する２５mm2フラス
コとして入手する。このフラスコを３７℃でインキュベ
ートし、培地を週２回交換する。培地を除去し、ハンク
(Ｈank)のバランス塩溶液(Ｇibco)ですすぎ、０.２５％
トリプシンを１〜２分間加え、新鮮な培地ですすぎ、そ
して１:５または１:１０の継代培養比で新しいフラスコ
に吸引、分取することによって細胞を継代培養する。
【０２６７】形質転換の１日前に０.７×１０6細胞／皿
で細胞を植え付ける。形質転換の４時間前に培地を交換
する。滅菌し、エタノール沈澱させたプラスミドＤＮＡ
(ＴＥ緩衝液に溶解した)を用いて、４０μg／ml ＤＮＡ
および２５０mＭ ＣaＣl2を含有する２×ＤＮＡ−ＣaＣ
l2溶液を調製する。２８０mＭ ＮaＣl、５０mＭヘペス
および１.５mＭリン酸ナトリウムを含有し、pＨを７.０
５〜７.１５に調整した２×ＨＢＳを調製する。２×Ｄ
ＮＡ−ＣaＣl2溶液を等容量の滅菌２×ＨＢＳに滴下す
る。綿栓をつけた１mlの滅菌プラスチックピペットを、
２×ＨＢＳを含有する混合管に挿入し、ＤＮＡを添加す
る間、吹き込むことによって気泡を導入する。室温で３
０〜４５分間、撹拌することなくカルシウム−リン酸塩
−ＤＮＡ沈澱物を析出させる。
【０２６８】次いで、プラスチックピペットで穏やかに
ピペット操作を行って沈澱物を混合し、受容細胞を覆う
増殖培地１０mlに沈澱物１ml(プレートあたり)を直接加
える。３７℃で４時間インキュベートした後、培地を１
０％ウシ胎児血清含有のＤＭＥＭに置き換え、選択圧を
与える前にこの細胞をさらに７２時間インキュベートす
る。組換えヒトタンパク質Ｃを発現する形質転換体に対
しては、このタンパク質のγカルボキシル化に必要な補
助因子であるビタミンＫ(１〜１０μg／ml)を増殖培地
に含有させた。真核生物細胞中で機能する選択マーカー
を含有していないプラスミドに対しては、プラスミド混
合物、すなわち選択マーカーを欠く本発明の発現ベクタ
ー、および真核生物細胞中で機能する選択マーカーを含
有している発現ベクターを用いて形質転換を行った。こ
の共形質転換法は、形質転換させるプラスミドの両者を
含有している細胞の同定を可能にする。
【０２６９】ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有す
るプラスミドでトランスフェクションした細胞に対して
は、増殖培地に最終濃度約２００〜４００μg／mlにな
るまでハイグロマイシンを加える。次いで、培地を３〜
４日間隔で交換しながら３７℃で２〜４週間細胞をイン
キュベートする。得られたハイグロマイシン耐性のコロ
ニーを、その特徴を調べるために別々の培養フラスコに
移す。ネオマイシン(ネオマイシンの代わりにＧ４１８
を用いることもできる)耐性コロニーの選択は、ハイグ
ロマイシンの代わりにネオマイシンを最終濃度４００μ
g／mlになるまで加えること以外は、実質的にハイグロ
マイシン耐性細胞の選択方法に従って行う。２９３細胞
はdhfr陽性であるので、dhfr遺伝子を有するプラスミド
含有の２９３形質転換体はdhfr陽性の表現型(ヒポキサ
ンチンおよびチミンを欠く培地で増殖する能力)に基づ
いてのみでは選択されない。機能的なdhfr遺伝子を欠
き、そしてdhfrを含有するプラスミドで形質転換された
セルラインは、dhfr＋表現型に基づいて選択することが
できる。
【０２７０】dhfr欠失セルラインに遺伝子またはプラス
ミドを導入するための選択マーカーとしてジヒドロ葉酸
還元酵素(dhfr)遺伝子を用いること、および後にメトト
レキセイトを用いてプラスミドのコピー数を増幅するこ
とは文献上よく認められている。dhfr産生細胞において
選択および増幅マーカーとしてdhfrを用いることについ
ては十分に研究が為されていないが、文献に挙げられて
いる証拠は、遺伝子増幅のためおよびdhfr産生細胞にお
ける選択マーカーとしてdhfrを用いることができること
を示唆している。本発明は用いる選択マーカーによって
は限定されない。さらに、メタロチオネイン遺伝子、ア
デノシンデアミナーゼ遺伝子、またはＰ−糖タンパク質
で例示される多重遺伝子耐性族の一員などの増幅しうる
マーカーを用いることができる。
【０２７１】
【表３】
【表４】
【０２７２】
【表５】 ＊ それぞれのセルラインにおいて産生したＣＡＴの相
対レベル値は、プラスミドpＳＶ２catからのＣＡＴレベ
ルを基礎とした(それぞれのセルラインにおいて１であ
るとして)。結果は別個に測定した２〜６測定値の平均
である。ＮＤ＝検出されず。ＮＴ＝試験せず。プラスミ
ドpＳＬcatはプラスミドpＢＬcatに類似しているが、Ｂ
Ｋエンハンサーの代わりにＳＶ４０エンハンサーを有し
ている。２９３セルラインだけがＥ１Ａを産生する。Ｃ
ＯＳおよびk８１６−４セルラインはＴ抗原を産生す
る。 ＊＊ k８１６−４細胞は、複製起源に欠失を有するＳ
Ｖ４０ゲノムを含有している。pＭＫ１６,８−１６と命
名されたプラスミド[グルズマン(Ｙ.Ｇluzman,Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor)から入手]で１次ヒト腎細胞を形質転換
することによって調製した。このセルラインはＳＶ４０
のＴ抗原を構成的に産生する。このk８１６−４セルラ
インは本質的にセルラインＳＶ１[ＳＶ４０で形質転換
したヒト腎細胞セルラインであり、メジャー(Ｅ.Ｏ.Ｍa
jor,Ｐolyomaviruses and ＨumanＮeurological Ｄisea
se,Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.,Ｎ.Ｙ.１９８３,eds Ｄ.Ｍa
dden,and Ｊ.Ｓever)が開示している]と同じである。
【０２７３】
【表６】 ＊ それぞれのセルラインにおいて産生したＣＡＴの相
対レベル値は、細胞溶解物中のＣＡＴレベルを、ハイブ
リダイゼーション分析で測定した同細胞溶解物中のプラ
スミドＤＮＡ量で割ることによって補正した。２９３細
胞におけるプラスミドpＳＶ２catの補正値を１とした。
【０２７４】
【配列表】 Sequence Listing <110> Eli Lilly and Company <120> Human protein C prepared by recombinant method <130> 165381 <150> US 849999 <151> 1986-4-9 <160> 10 <210> 1 <211> 200 <212> RNA <400> 1 acucucuucc gcaucgcugu cugcgagggc cagcuguugg gcucgcgguu gaggacaaac 60 ucuucgcggu cuuuccagua cucuuggauc ggaaacccgu cggccuccga acguacuccg 120 ccaccgaggg accugagcga guccgcaucg accggaucgg aaaaccucuc gagaaaggcg 180 ucuaaccagu cacagucgca 200 <210> 2 <211> 33 <212> RNA <400> 2 acucucuucc gcaucgcugu cugcgagggc cag 33 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <400> 3 agctttgatc ag 12 aactag tccacg <210> 4 <211> 8 <212> DNA <400> 4 gtgatcaa 8 acgt cactagttct ag <210> 5 <211> 287 <212> DNA <400> 5 aattcacgct gtggtgttat ggtcggtggt cgctagggtg ccgacgcgca tctcgactgc 60 gtgcga caccacaata ccagccacca gcgatcccac ggctgcgcgt agagctgacg acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca gccaatcgga agctgtggta tggctgtgca 120 tgccacgtgg ttacgaagac cgcagtccgt cggttagcct tcgacaccat accgacacgt ggtcgtataa tcaccgcata attcgagtcg ctcaaggcgc actcccgttc cggataatgt 180 ccagcatatt agtggcgtat taagctcagc gagttccgcg tgagggcaag gcctattaca tttttgctcc gacatcataa cggttccggc aaatattctg aaatgagctg ttgacaatta 240 aaaaacgagg ctgtagtatt gccaaggccg tttataagac tttactcgac aactgttaat atcatcgaac tagttaacta gtacgcaagt tctcgtaaaa agggtat 287 tagtagcttg atcaattgat catgcgttca agagcatttt tcccatagc <210> 6 <211> 36 <212> DNA <400> 6 gggaagtgct gtgaaatatc cacctgcggc ctgaga 36 <210> 7 <211> 46 <212> DNA <400> 7 ctagagggta ttaataatgt atcgatttaa ataaggagga ataaca 46 tcccat aattattaca tagctaaatt tattcctcct tattgtat <210> 8 <211> 22 <212> DNA <400> 8 gatctattaa ctcaatctag ac 22 ataatt gagttagatc tgagct <210> 9 <211> 874 <212> DNA <400> 9 aagcttttct cattaaggga agatttcccc aggcagctct ttcaaggcct aaaaggtcca 60 tgagctccat ggattcttcc ctgttaagaa ctttatccat ttttgcaaaa attgcaaaag 120 aatagggatt tccccaaata gttttgctag gcctcagaaa aagcctccac acccttacta 180 cttgagagaa agggtggagg cagaggcggc ctcggcctct tatatattat aaaaaaaaag 240 gccacaggga ggagctgctt acccatggaa tgcagccaaa ccatgacctc aggaaggaaa 300 gtgcatgact cacaggggaa tgcagccaaa ccatgacctc aggaaggaaa gtgcatgact 360 cacagggagg agctgcttac ccatggaatg cagccaaacc atgacctcag gaaggaaagt 420 gcatgactgg gcagccagcc agtggcagtt aatagtgaaa ccccgccgac agacatgttt 480 tgcgagccta ggaatcttgg ccttgtcccc agttaaactg gacaaaggcc atggttctgc 540 gccaggctgt cctcgagcgg tgttccgcgg tcctcctcgt atagaaactc ggaccactct 600 gagacgaagg ctcgcgtcca ggccagcacg aaggaggcta agtgggaggg gtagcggtcg 660 ttgtccacta gggggtccac tcgctccagg gtgtgaagac acatgtcgcc ctcttcggca 720 tcaaggaagg tgattggttt ataggtgtag gccacgtgac cgggtgttcc tgaagggggg 780 ctataaaagg gggtgggggc gcgttcgtcc tcactctctt ccgcatcgct gtctgcgagg 840 gccagctgat cagcctaggc tttgcaaaaa gctt 874 <210> 10 <211> 642 <212> DNA <400> 10 aagcttttct cattaaggga agatttcccc aggcagctct ttcaaggcct aaaaggtcca 60 tgagctccat ggattcttcc ctgttaagaa ctttatccat ttttgcaaaa attgcaaaag 120 aatagggatt tccccaaata gttttgctag gcctcagaaa aagcctccac acccttacta 180 cttgagagaa agggtggagg cagaggcggc ctcggcctct tatatattat aaaaaaaaag 240 gccacaggga ggagctgctt acccatggaa tgcagccaaa ccatgacctc aggaaggaaa 300 gtgcatgact cacaggggaa tgcagccaaa ccatgacctc aggaaggaaa gtgcatgact 360 cacagggagg agctgcttac ccatggaatg cagccaaacc atgacctcag gaaggaaagt 420 gcatgactgg gcagccagcc agtggcagtt aatacagggt gtgaagacac atgtcgccct 480 cttcggcatc aaggaaggtg attggtttat aggtgtaggc cacgtgaccg ggtgttcctg 540 aaggggggct ataaaagggg gtgggggcgc gttcgtcctc actctcttcc gcatcgctgt 600 ctgcgagggc cagctgatca gcctaggctt tgcaaaaagc tt 642
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＢＫウイルスの制限部位および機能地図を表
す模式図である。
【図２】 プラスミドpＢＫＥ１の制限部位および機能
地図を表す模式図である。
【図３】 プラスミドpＢＫneo１の制限部位および機能
地図を表す模式図である。
【図４】 プラスミドpＳＶ２catの制限部位および機能
地図を表す模式図である。
【図５】 プラスミドpＬＰcatの制限部位および機能地
図を表す模式図である。
【図６】 プラスミドpＢＬcatの制限部位および機能地
図を表す模式図である。
【図７】 プラスミドpＢＫcatの制限部位および機能地
図を表す模式図である。
【図８】 プラスミドpＳＢＬcatの制限部位および機能
地図を表す模式図である。
【図９】 プラスミドpＬ１３３の構築を示す工程図(プ
ラスミドpＬ１３３の制限部位および機能地図も合わせ
て記す)である。
【図１０】 プラスミドpＬＰＣの制限部位および機能
地図を表す模式図である。
【図１１】 プラスミドpＬＰＣ４の制限部位および機
能地図を表す模式図である。
【図１２】 プラスミドpＳＶ２hygの制限部位および機
能地図を表す模式図である。
【図１３】 プラスミドpＬＰＣhyg１の制限部位および
機能地図を表す模式図である。
【図１４】 プラスミドpＢＷ３２の構築を示す工程図
(プラスミドpＢＷ３２の制限部位および機能地図も合わ
せて記す)である。
【図１５】 プラスミドpＢＷ３２の構築を示す工程図
(プラスミドpＢＷ３２の制限部位および機能地図も合わ
せて記す)である。
【図１６】 プラスミドpＢＷ３２の構築を示す工程図
(プラスミドpＢＷ３２の制限部位および機能地図も合わ
せて記す)である。
【図１７】 プラスミドpＢＷ３２の構築を示す工程図
(プラスミドpＢＷ３２の制限部位および機能地図も合わ
せて記す)である。
【図１８】 プラスミドpＬＰＣhd１の制限部位および
機能地図を表す模式図である。
【図１９】 プラスミドphd制限部位および機能地図を
表す模式図である。
【図２０】 プラスミドpＬＰＣＥ１Ａの制限部位およ
び機能地図を表す模式図である。
【図２１】 プラスミドpＢＬＴの制限部位および機能
地図を表す模式図である。
【図２２】 プラスミドpＢＬＴhyg１の制限部位および
機能地図を表す模式図である。
【図２３】 プラスミドpＢＬＴdhfr１の制限部位およ
び機能地図を表す模式図である。
【図２４】 プラスミドpＴＰＡ６０２の制限部位およ
び機能地図を表す模式図である。
【図２５】 プラスミドpＴＰＡ６０３の制限部位およ
び機能地図を表す模式図である。
【図２６】 プラスミドphdＴＰＡの制限部位および機
能地図を表す模式図である。
【図２７】 プラスミドphdＭＴＰＡの制限部位および
機能地図を表す模式図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｎ-アセチルガラクトサミン(ＧａｌＮＡ
    ｃ)を含むグリコシル化パターンを有するヒトプロテイ
    ンＣ。
  2. 【請求項２】 プロテインＣがヒトプロテインＣ前駆体
    である、請求項１に記載のヒトプロテインＣ。
  3. 【請求項３】 プロテインＣが活性化されたヒトプロテ
    インＣである、請求項１に記載のヒトプロテインＣ。
  4. 【請求項４】 該ヒトプロテインＣが、プロテインＣ 1
    モル当り少なくとも2.6モルのＮ-アセチルガラクトサミ
    ンを有する、請求項１に記載のヒトプロテインＣ。
  5. 【請求項５】 プロテインＣをコードするＤＮＡを細胞
    に導入し、該細胞中で該プロテインＣを発現させること
    により製造されるヒトプロテインＣであって、Ｎ-アセ
    チルガラクトサミンを含むグリコシル化パターンを有す
    るプロテインＣ。
  6. 【請求項６】 該プロテインＣがヒトプロテインＣ前駆
    体である、請求項５に記載のプロテインＣ。
  7. 【請求項７】 ヒトプロテインＣが、プロテインＣをコ
    ードするＤＮＡを細胞に導入し、該細胞中で該プロテイ
    ンＣを発現させ、そしてプロテインＣを活性化すること
    により製造された活性化プロテインＣである、請求項５
    に記載のヒトプロテインＣ。
  8. 【請求項８】 該細胞がアデノウイルスにより形質転換
    された宿主細胞である、請求項５に記載のプロテイン
    Ｃ。
  9. 【請求項９】 アデノウイルスにより形質転換された宿
    主細胞が、ＡＶ１２細胞及びヒト胎児腎２９３細胞から
    なる群から選択される、請求項８に記載のヒトプロテイ
    ンＣ。
  10. 【請求項１０】 プロテインＣの該グリコシル化パター
    ンが、ヒトプロテインＣ １モル当り少なくとも約4.0モ
    ルのフコースを含む、請求項１に記載のプロインＣ。
  11. 【請求項１１】 血漿ヒトプロテインＣと比べて、より
    高い抗凝血活性を有するヒトプロテインＣ。
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