ES2237755T3 - Procedimiento de uso de vectores de expresion eucariotas que comprenden el potenciador del virus bk. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UNA PROTEINA C HUMANA, RECOMBINANTEMENTE PRODUCIDA, PRODUCIDA MEDIANTE UN METODO QUE SE DESCRIBE EN LAS ESPECIFICACIONES.

Description

Procedimiento de uso de vectores de expresión eucariotas que comprenden el potenciador del virus BK.

La presente invención se refiere a una molécula de proteína C humana producida de manera recombinante que se puede obtener de la línea celular 293 por el procedimiento descrito en el Ejemplo 18, dado más adelante. Este procedimiento usa el potenciador de BK en presencia de un producto génico temprano inmediato de un virus de ADN grande para aumentar la transcripción de un gen recombinante en células huésped eucariotas. El potenciador de BK es un segmento definido de ADN que consta de tres secuencias repetidas (descritas en el Ejemplo 17, dado más adelante).

La secuencia potenciadora de BK ejemplificada en este documento se obtiene del virus BK, un papovavirus humano que fue aislado por primera vez de la orina de un paciente inmunosuprimido. Se sospecha que el virus BK es el causante de una infección infantil no evidente y es ubicuo en la población humana. Aunque el virus BK crece de manera óptima en células humanas, el virus experimenta un ciclo abortivo en células que no son de primate, transforma células de roedor in vitro, e induce tumores en hámster. El virus BK es muy similar a SV40, pero las secuencias potenciadoras de los dos papovavirus, SV40 y BK, difieren sustancialmente en la secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos completa del virus BK (\sim5,2 kb) se ha descrito por Seif y col., 1979, Cell 18:963, y Yang y Wu, 1979, Science 206:456. El virus BK está disponible por la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852-1776, con el número de acceso ATCC VR-837. Se muestra un mapa sitios de restricción y función del virus BK en la Figura 1 de los dibujos adjuntos.

Los elementos potenciadores funcionan en cis y aumentan el nivel de transcripción de un gen adyacente a partir de su promotor de un modo que es relativamente independiente de la posición y orientación del elemento potenciador. De hecho, Khoury y Gruss, 1983, Cell 13:313, exponen que "la exclusiva capacidad de las secuencias potenciadoras para funcionar cadena arriba de, en, o cadena abajo de genes eucariotas las distingue de elementos promotores clásicos..." y sugieren que ciertos resultados experimentales indican que "los potenciadores pueden funcionar sobre distancias considerables (quizá >10 kb)".

La presente invención muestra que el posicionando del potenciador de BK inmediatamente cadena arriba de la región "CAAT" (en el lado 5') de un promotor eucariota usado en tándem con el potenciador de BK para transcribir la secuencia de ADN que codifica una sustancia útil, da como resultado incrementos inesperados en la trascripción. La región CAAT o "región cadena arriba inmediata" o "secuencia de homología -80" es una región conservada de nucleótidos observada en promotores cuyas secuencias para la actividad transcripcional se han analizado minuciosamente. La secuencia CAAT media la eficacia de transcripción y, con pocas excepciones, no puede eliminarse sin disminuir la fuerza del promotor.

Se han identificado los elementos potenciadores en varios virus, incluyendo poliomavirus, papiloma virus, adenovirus, retrovirus, virus de la hepatitis, citomegalovirus, herpes virus, papovavirus, tales como el virus 40 de simio (SV40) y BK, y genes no virales, tales como en los intrones génicos de la inmunoglobulina de ratón. Los elementos potenciadores también pueden estar presentes en una amplia diversidad de otros organismos. Las células huésped a menudo reaccionan de manera diferente a diferentes elementos potenciadores. Esta especificidad celular indica que los productos génicos del huésped interaccionan con el elemento potenciador durante la expresión génica.

Los elementos potenciadores también pueden interaccionar con productos génicos virales en la célula huésped. Velcich y Ziff, 1983, Cell 40: 705; Borrelli y col., 1984, Nature 312:608; y Hen y col., 1985, Science 230:1391, describen que los productos génicos de la región temprana 1A de adenovirus 2 (E1A) reprimen la activación de la transcripción inducida por los potenciadores de SV40, poliomavirus, gen de la inmunoglobulina de ratón y E1A de adenovirus 2. Por consiguiente, los vectores de expresión eucariotas que utilizan potenciadores para aumentar la transcripción de genes recombinantes no se espera que trabajen mejor que los vectores sin potenciadores en células huésped que contienen E1A. En notable contraste con los procedimientos de uso de potenciadores de la técnica anterior, el procedimiento de la presente invención para usar el elemento potenciador del virus BK implica usar el producto génico de E1A o un producto génico temprano inmediato similar de un virus de ADN grande para maximizar la expresión génica. De este modo, la presente invención muestra que la capacidad del potenciador de BK para promover la trascripción de ADN se aumenta en presencia del producto génico de E1A de cualquier adenovirus.

El producto génico de E1A (en realidad, el gen E1A produce dos productos, que se denominan colectivamente en este documento como "producto génico de E1A") es un producto génico temprano inmediato de adenovirus, un virus de ADN grande. La presente invención abarca el uso de cualquier producto génico temprano inmediato de un virus de ADN grande que funcione de manera similar al producto génico de E1A para aumentar la actividad del potenciador de BK. La proteína ICP4 del virus del herpes simple, descrita por DeLuca y col., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1997-2008, la proteína IE del virus de la pseudarrabia, descrita por Feldman y col., 1982 P.N.A.S. 79:4952-4956, y la proteína E1B de adenovirus son todas productos génicos tempranos inmediatos de virus de ADN grande que tienen funciones similares a la proteína E1A. Por lo tanto, el procedimiento de la presente invención incluye el uso de las proteínas ICP4, IE, o E1B, en presencia o ausencia de la proteína E1A, para aumentar la actividad del potenciador de BK.

El uso del potenciador del virus BK en presencia de un producto génico temprano inmediato de un virus de ADN grande, tal como el producto génico E1A de adenovirus, aumenta la transcripción y expresión de genes recombinantes células huésped eucariotas. Otro aspecto significativo de la presente invención se refiere a una diversidad de vectores de expresión que utilizan la secuencia potenciadota de BK en tándem con un promotor eucariota, tal como el promotor tardío de adenovirus, para dirigir la expresión de productos útiles en células huésped eucariotas. Muchos de estos vectores de expresión comprenden un casete potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus, que puede transferirse fácilmente a otros vectores para usar en el presente procedimiento. La versatilidad de los presentes vectores de expresión se demuestra por el alto nivel de expresión dirigido por estos vectores de diversas proteínas tales como cloranfenicol acetiltransferasa, proteína C, activador de plasminógenos tisular, y activador de plasminógenos tisular modificado.

Otro aspecto importante más de la presente invención se refiere a un procedimiento de aumentar la actividad del potenciador de BK en relación con un promotor adyacente eucariota y se ilustra usando el casete potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus 2. Estos derivados se construyeron por tratamiento enzimático que posicionó el potenciador de BK muy cerca de la región CAAT del promotor tardío de adenovirus 2. Se observaron aumentos drásticos en los niveles de expresión, en comparación con construcciones que carecen de este posicionamiento, cuando estas secuencias potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus modificadas se incorporaban en vectores de expresión y después se usaban para dirigir la expresión de productos génicos útiles en células huésped eucariotas. De este modo, la presente invención proporciona un procedimiento para aumentar la actividad del potenciador de BK en relación con un promotor eucariota adyacente que comprende posicionar el potenciador inmediatamente cadena arriba, en 0 a aproximadamente 300 nucleótidos, del extremo 5' de la región CAAT del promotor eucariota.

Para propósitos de la presente invención, los siguientes términos son como se definen a continuación.

Antibiótico - una sustancia producida por un microorganismo que, de manera natural o con una modificación química limitada, inhibirá el crecimiento de o destruirá otro microorganismo o célula eucariota.

Gen que Confiere Resistencia a Antibiótico - un segmento de ADN que codifica una actividad que confiere resistencia a un antibiótico.

ApR - el fenotipo resistente a ampicilina o el gen que confiere el mismo.

Clonación - el procedimiento de incorporar un segmento de ADN en un vector de clonación de ADN recombinante.

CmR - el fenotipo resistente a cloranfenicol o el gen que confiere el mismo.

ep - un segmento de ADN que comprende el promotor temprano de SV40 del gen del antígeno T, los sitios de unión al antígeno T, y el origen de replicación de SV40.

Promotor eucariota - cualquier secuencia de ADN que funciona como un promotor en células eucariotas.

HmR - el fenotipo resistente a higromicina o el gen que confiere el mismo.

IVS - ADN que codifica un intrón, también llamado secuencia intermedia.

Virus de ADN grande - un virus que infecta células eucariotas y tiene un genoma más grande de \sim10 kb de tamaño, es decir, cualquier pox virus, adenovirus, y herpes virus.

NeoR - el gen que confiere resistencia a neomicina, que también puede usarse para conferir resistencia a G418 en células huésped eucariotas.

ori - un origen de replicación plasmídico.

pA - una secuencia de ADN que codifica una señal de poliadenilación.

Promotor - una secuencia de ADN que dirige la transcripción de ADN en ARN.

Vector de Clonación de ADN Recombinante - cualquier agente de replicación o integración autónoma que comprende una molécula de ADN a la que se puede o se ha añadido uno o más segmentos adicionales de ADN.

Vector de Expresión de ADN Recombinante - cualquier vector de clonación de ADN recombinante que comprende un promotor y un sitio de inserción asociado, en el que puede insertarse y expresarse una molécula de ADN que codifica un producto útil.

Vector de ADN Recombinante - cualquier vector de clonación o expresión de ADN recombinante.

Replicón - cualquier secuencia de ADN que controla la replicación de un vector de ADN recombinante.

Fragmento de Restricción - cualquier ADN lineal generado por la acción de una o más enzimas de restricción.

ARNr - ácido ribonucleico ribosómico.

Célula Huésped Sensible - una célula huésped que no puede crecer en presencia de un antibiótico dado u otro compuesto tóxico sin un segmento de ADN que confiera resistencia al mismo.

Gen Estructural - cualquier secuencia de ADN que codifica un polipéptido, incluidas las de ADN que codifican los codones de inicio y parada.

TcR - el fenotipo resistente a tetraciclina o el gen que confiere el mismo.

Transformante - una célula huésped receptora que ha experimentado una transformación.

Transformación - la introducción de ADN en un célula huésped receptora.

ARNt - ácido ribonucleico transferente.

Breve Descripción de los Dibujos

La Figura 1 es un mapa de sitios de restricción y función del virus BK.

La Figura 2 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBKE1.

La Figura 3 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBKneo1.

La Figura 4 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pSV2cat.

La Figura 5 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPcat.

La Figura 6 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBLcat.

La Figura 7 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBKcat.

La Figura 8 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pSBLcat.

La Figura 9 representa la construcción y muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pL133.

La Figura 10 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPC.

La Figura 11 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPC4.

La Figura 12 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pSV2hyg.

La Figura 13 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPChyg1.

La Figura 14 representa la construcción y muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBW32.

La Figura 15 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPChd1.

La Figura 16 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido phd.

La Figura 17 es un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPCE1A.

La presente invención proporciona una molécula de proteína C humana producida de manera recombinante que se puede obtener de la línea celular 293 por el procedimiento descrito en el Ejemplo 18.

Los especialistas en la técnica reconocerán el papel clave del producto génico temprano inmediato de un virus de ADN grande en el procedimiento de la presente invención. Los especialistas en la técnica también reconocerán que muchas líneas celulares establecidas expresan un producto génico temprano inmediato de un virus de ADN grande y que esas dichas líneas celulares son especialmente útiles en el presente procedimiento. En una realización del procedimiento se transforma una célula que expresa un producto génico temprano inmediato de un virus de ADN grande con un vector de ADN recombinante que comprende un promotor eucariota, un potenciador de BK posicionado para estimular dicho promotor, y una secuencia de ADN que codifica el polipéptido funcional deseado, estando la secuencia posicionada para la expresión a partir del promotor, y la célula que contiene el vector se cultiva en condiciones apropiadas para la expresión. Otra realización del procedimiento de la presente invención comprende cultivar una célula que no expresa un producto génico temprano inmediato de un virus de ADN grande pero que se transforma con un vector de expresión de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica el producto génico temprano inmediato así como el promotor mencionado, el potenciador, y la secuencia de ADN que codifica el polipéptido funcional. Un aspecto importante de la presente invención es el nuevo grupo de vectores de expresión que comprende la secuencia potenciadota de BK en tándem con el promotor tardío de adenovirus 2. Los vectores de expresión de la presente invención se construyeron de modo que las moléculas de ADN que codifican productos útiles pueden o se han insertado fácilmente en los vectores en la posición correcta para la expresión. Además, la secuencia potenciadota de BK y el promotor eucariota se han construido para formar un "casete", que puede aislarse de los vectores de expresión en un fragmento de restricción relativamente pequeño. El casete puede transportarse entre un diversidad de vectores de expresión. Los vectores de expresión ejemplificados específicamente en este documento utilizan el promotor tardío de adenovirus 2 o BK en el casete potenciador de BK-promotor eucariota que dirige la transcripción en el procedimiento de la presente invención.

Aunque el virus BK (ATCC VR-837) puede comprarse o aislarse fácilmente en grandes cantidades como se describe en el Ejemplo 1, también es conveniente clonar el ADN viral de BK en un vector de clonación plasmídico y usar el vector recombinante como una fuente de secuencias de ADN virales de BK. Por consiguiente, se digirió el ADN viral de BK con la enzima de restricción EcoRI, que, debido a la presencia sólo de un sitio EcoRI en el genoma de BK, produjo un ADN lineal de BK. El plásmido pUC8 (disponible por Bethesda Research Laboratories (BRL), P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20877) se digirió del mismo modo y se linealizó con la enzima de restricción EcoRI, y el ADN del plásmido pUC8 cortado con EcoRI se ligó al ADN viral de BK cortado con EcoRI para formar los plásmidos pBKE1 y pBKE2, que difieren sólo con respecto a la orientación del ADN viral de BK. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBKE1 en la Figura 2 de los dibujos adjuntos. La construcción de los plásmidos pBKE1 y pBKE2 se describe en el Ejemplo 2.

El genoma viral de BK también se ha combinado con una porción del plásmido pdBPV-MMTneo para construir los plásmidos pBKneo1 y pBKneo2. El plásmido pdBPV-MMTneo, de aproximadamente 15 kb de tamaño y disponible por la ATCC con el número de acceso ATCC 37224, comprende el replicón y el gen de \beta-lactamasa del plásmido pBR322, el promotor de la metalotioneína de ratón posicionado para dirigir la expresión de un gen estructural que codifica una enzima que confiere resistencia a neomicina, y aproximadamente 8 kb de ADN de un papiloma virus bovino (BPV). El plásmido pdBPV-MMTneo puede digerirse con la enzima de restricción BamHI para generar dos fragmentos: el fragmento de \sim8 kb que comprende el ADN de BPV y un fragmento de \sim7 kb que comprende las otras secuencias descritas anteriormente. El virus BK tiene sólo un sitio de restricción BamHI, y los plásmidos pBKneo1 y pBKneo2 se construyeron ligando el fragmento de restricción BamHI de \sim7 kb del plásmido pdBPV-MMTneo al ADN del virus BK linealizado con BamHI. La construcción de los plásmidos pBKneo1 y pBKneo2, que difieren sólo con respecto a la orientación del ADN del virus BK, se describe en el Ejemplo 3, y se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBKneo 1 en la Figura 3 de los dibujos adjuntos.

Los plásmidos pBKE1, pBKE2, pBKneo1, y pBKneo2 comprenden cada uno el genoma completo del virus BK, incluyendo la secuencia potenciadota, y de este modo sirven como materiales de partida útiles para los vectores de expresión de la presente invención. Uno de dicho vectores de expresión ilustrativos, el plásmido pBLcat, comprende la secuencia potenciadota de BK en tándem con el promotor tardío de adenovirus tipo-2 humano posicionado para dirigir la expresión de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). El plásmido pSV2cat sirve como una fuente adecuada del gen CAT y puede obtenerse de la ACTT con el número de acceso ATCC 37155. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pSV2cat en la Figura 4 de los dibujos adjuntos. El ADN del adenovirus tipo-2 humano está disponible en el mercado y también puede obtenerse de la ATCC con el número de acceso ATCC VR-2.

El plásmido ilustrativo pBLcat se construyó ligando el fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb que contiene promotor tardío del ADN de adenovirus tipo-2 humano a engarces BclI de extremos romos que se unen sólo al extremo PvuII del fragmento de restricción AccI-PvuII. Después se ligó el fragmento resultante al fragmento de restricción AccI-StuI de \sim4,51 kb del plásmido pSV2cat para producir el plásmido pLPcat intermedio, para el que se muestra un mapa de sitios de restricción y función en la Figura 5 de los dibujos adjuntos. El plásmido pBLcat deseado se construyó a partir del plásmido pLPcat ligando el fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim1,28 kb que contiene el origen de replicación y el potenciador del ADN del virus BK al fragmento de restricción AccI-StuI de \sim4,81 kb del plásmido pLPcat. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBLcat resultante en la Figura 6 de los dibujos adjuntos. La construcción del plásmido pBLcat se describe adicionalmente en el Ejemplo 4.

El plásmido pBKcat es un vector de expresión que también ejemplifica la presente invención y utiliza el potenciador de BK y el promotor tardío de BK para dirigir la expresión de la cloranfenicol acetiltransferasa. El plásmido pBKcat se construyó de un modo análogo al descrito para el plásmido pLPcat. De este modo, el fragmento de restricción AccI-StuI de \sim4,51 kb del plásmido pSV2cat se ligó al fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim1,28 kb del virus BK de modo que el promotor tardío de BK está en la orientación correcta para dirigir la expresión del gen CAT. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBKcat en la Figura 7 de los dibujos adjuntos.

El plásmido pBLcat es una fuente adecuada del "casete" potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus de la presente invención. Este casete es un fragmento de restricción HindIII de \sim870 pb que puede insertarse de manera práctica en un vector de expresión eucariota para aumentar la expresión de un producto codificado por ese vector. Esto se hizo digiriendo el plásmido pSV2cat con la enzima de restricción HindIII e insertando el casete potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus. El plásmido resultante, denominado como plásmido pSBLcat, contiene el origen de replicación de SV40, el promotor temprano de SV40, y el potenciador de SV40 y por lo tanto difiere del plásmido pBLcat en que esas secuencias se han eliminado.

El plásmido pSBLcat dirige la expresión de CAT a niveles más altos que como lo hace el plásmido pBLcat, mientras no está presente el producto génico de E1A. Esta expresión aumentada en ausencia del producto génico de E1A indica que los dos potenciadores, uno de SV40 y el otro de BK, tienen un efecto aditivo, potenciador en la transcripción a partir de promotores cercanos. Sin embargo, en presencia del producto génico de E1A, el plásmido pBLcat dirige la expresión de CAT a niveles más altos que como lo hace el plásmido pSBLcat, supuestamente porque el potenciador de SV40 se inhibe por el producto génico de E1A. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pSBLcat en la Figura 8 de los dibujos adjuntos, y la construcción del plásmido pSBLcat se describe en el Ejemplo 5.

El casete potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus también se ha usado para mejorar la expresión de la proteína C humana. Esto se hizo ligando el casete en el plásmido pL133. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pL133 en la Figura 9 de los dibujos adjuntos. El plásmido pL133, la construcción del cual se da en el Ejemplo 6, se digirió con la enzima de restricción HindIII y después se ligó al fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb del plásmido pBLcat para producir el plásmido pLPC. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPC en la Figura 10 de los dibujos adjuntos, y la construcción del plásmido se describe adicionalmente en el Ejemplo 7.

El plásmido pLPC, como el plásmido pL133, comprende el potenciador, los promotores temprano y tardío, los sitios de unión al antígeno T, y el origen de replicación de SV40. Estos elementos están situados muy cerca entre sí en el ADN de SV40 y son difíciles de delimitar. La unión del antígeno T a los sitios de unión al antígeno T, que es necesaria para la replicación de SV40, se sabe que potencia la transcripción a partir del promotor tardío de SV40 y sorprendentemente tiene un efecto similar en el promotor tardío de BK. A causa del alto nivel de replicación dirigida por antígeno T de un plásmido que comprende el origen de replicación de SV40 que generalmente es letal para la célula huésped, ni el plásmido pLPC ni el plásmido pL133 se mantienen de manera estable como elementos episomales (extracromosómicos) en presencia del antígeno T de SV40, sino que, los dos plásmidos deben integrarse en el ADN cromosómico de la célula huésped para mantenerse de manera estable.

La estructura global de la región potenciadota de BK es bastante similar a la de SV40, para el potenciador de BK, el origen de replicación, los promotores temprano y tardío, y los análogos de BK a los sitios de unión al antígeno T están todos situados muy cerca y son difíciles de delimitar en el ADN viral de BK. Sin embargo, cuando crece en presencia de antígeno T de BK, un plásmido que comprende el origen de replicación de BK y los sitios de unión al antígeno T no se replica a un grado que resulte letal y se mantiene de manera estable como un elemento episomal en la célula huésped. Aparentemente, debido a las relaciones similares estructura-función entre los antígenos T de BK y SV40 y sus respectivos sitios de unión, la replicación de BK también se estimula por el antígeno T de SV40. Para construir un derivado del plásmido pLPC que puede existir como elemento mantenido de manera estable en una célula eucariota transformada, el genoma de BK completo, en forma de un fragmento de restricción linealizado con EcoRI, se insertó en el único sitio de restricción EcoRI del plásmido pLPC. Esta inserción produjo dos plásmidos, denominados pLPC4 y pLPC5, que difieren sólo con respecto a la orientación del fragmento EcoRI de BK. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPC4 en la Figura 11 de los dibujos adjuntos, y la construcción de los plásmidos pLPC4 y pLPC5 se describe adicionalmente en el Ejemplo 8.

El mantenimiento episomal de un vector de expresión de ADN recombinante no siempre se prefiere sobre la integración en el cromosoma de la célula huésped. Sin embargo, debido a la ausencia de un marcador de selección que funcione en células eucariotas, la identificación de transformantes eucariotas estables del plásmido pLPC es difícil, salvo si el plásmido pLPC se cotransforma con otro plásmido que comprenda un marcador de selección. Por consiguiente, se ha modificado el plásmido pLPC para producir plásmidos derivados que se pueden seleccionar en células huésped eucariotas.

Esto se hizo ligando el plásmido pLPC a una porción del plásmido pSV2hyg, un plásmido que comprende un gen que confiere resistencia a higromicina. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pSV2hyg, que puede obtenerse del Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria, IL 61640, con el número de acceso NRRL B-18039, en la Figura 12 de los dibujos adjuntos. El plásmido pSV2hyg se digirió con la enzima de restricción BamHI, y el fragmento de restricción BamHI de \sim2,5 kb, que comprende el gen que confiere resistencia a higromicina completo, se aisló, se trató con la enzima Klenow (el fragmento grande producido por la escisión con subtilisina de la ADN polimerasa I de E. coli), y después se ligó al fragmento de restricción NdeI-StuI de \sim5,82 kb tratado con Klenow del plásmido pLPC para producir los plásmidos pLPChyg1 y pLPChyg2. Los plásmidos pLPChyg1 y pLPChyg2 difieren sólo con respecto a la orientación del fragmento que confiere resistencia a higromicina. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPChyg1 en la Figura 13 de los dibujos adjuntos, y el protocolo de construcción de los plásmidos pLPChyg1 y pLPChyg2 se describe en el Ejemplo 9.

Los plásmidos de expresión de la proteína C humana similares que contienen el gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) se construyeron insertando el fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb tratado con Klenow del plásmido pBW32 que contiene el gen dhfr en el fragmento de restricción NdeI-StuI de \sim5,82 kb del plásmido pLPC. Los plásmidos resultantes, denominados como pLPCdhfr1 y pLPCdhfr2, difieren sólo con respecto a la orientación del gen dhfr. La construcción de estos plásmidos se describe en el Ejemplo 11B.

El plásmido pLPChyg1 se modificó adicionalmente para introducir un gen de dihidrofolato reductasa (dhfr). El gen dhfr se un marcador de selección en células negativas para dhfr y puede usarse para aumentar el número de copias de un segmento de ADN exponiendo la célula huésped a niveles en aumento de metotrexato. El gen dhfr puede obtenerse del plásmido pBW32. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBW32 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. El protocolo de construcción del plásmido pBW32 se describe en el Ejemplo 10.

Se aisló el fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb del plásmido pBW32 que contiene el gen dhfr, se trató con la enzima Klenow, y se insertó en el plásmido pLPChyg1 parcialmente digerido con EcoRI para producir los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2. El plásmido pLPChyg1 contiene dos sitios de reconocimiento de la enzima de restricción EcoRI, uno en el gen que confiere resistencia a higromicina y uno en las secuencias derivadas del plásmido pBR322. El fragmento que comprende el gen dhfr se insertó en el sitio EcoRI localizado en las secuencias derivadas de pBR322 del plásmido pLPChyg1 para producir los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPChd1 en la Figura 15 de los dibujos adjuntos. La construcción de los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2, que difieren sólo con respecto a la orientación del segmento de ADN que contiene el gen dhfr, se describe en el Ejemplo 11.

Se modificó el plásmido pLPChd1 para formar el plásmido phd, un plásmido que contiene tanto el casete potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus de la presente invención como también los genes que confiere resistencia a higromicina y dhfr. Para construir el plásmido phd, se preparó el plásmido pLPChd1 a partir de células huésped dam^{-} de E. coli, digeridas con la enzima de restricción BclI, y se recircularizaron, delecionando de este modo el ADN que codifica la proteína C humana. El plásmido phd contiene un único sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BclI, que está posicionado de manera práctica para la inserción de cualquier secuencia deseada a expresar a partir del potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus de la presente invención. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido phd en la Figura 16 de los dibujos adjuntos, y el protocolo de construcción del plásmido phd se describe en el Ejemplo 12.

Otro vector de expresión que ejemplifica adicionalmente la presente invención y dirige la expresión de la proteína C humana es el plásmido pLPCE1A. El plásmido pLPCE1A contiene el gen E1A de adenovirus humano tipo 2, el producto génico del cual, como se ha descrito anteriormente, aumenta la actividad del potenciador de BK. De este modo, la transcripción a partir de un promotor en tándem con el potenciador de BK aumenta en presencia del producto génico de E1A. El plásmido pLPCE1A se construyó ligando el fragmento de restricción BalI de \sim1,8 kb del ADN de adenovirus humano tipo 2 que contiene el gen E1A con el fragmento de restricción NdeI-StuI de \sim5,82 kb del plásmido pLPC. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPCE1A en la Figura 17 de los dibujos adjuntos, y el protocolo de construcción para el plásmido pLPCE1A se describe en el Ejemplo 13.

La presente invención comprende un procedimiento para usar el potenciador de BK en tándem con un promotor eucariota para dirigir la transcripción y expresión de secuencias de ADN en células huésped eucariotas que expresan un gen temprano inmediato de un virus de ADN grande. Los especialistas en la técnica reconocerán que prácticamente cualquier promotor eucariota puede usarse en tándem con el potenciador de BK en el presente procedimiento. Por ejemplo, los promotores temprano y tardío de SV40, los promotores temprano y tardío de BK, los promotores temprano y tardío de cualquier poliomavirus o papovavirus, el promotor de la timidita quinasa del virus del herpes simple, el promotor del interferón \alpha1, el promotor de la metalotioneína de ratón, los promotores de los retrovirus, el promotor de la \beta-globina, los promotores de los adenovirus, el promotor de H2A del erizo de mar, el promotor de la conalbúmina, el promotor de la ovoalbúmina, el promotor de la \beta-globina de ratón, el promotor de la \beta-globina humana, y el promotor de la repetición larga terminal del virus del sarcoma de Rous, pueden todos servir como promotor eucariota en el procedimiento de la presente invención. Además, cualquier secuencia que contenga un sitio de inicio de la transcripción, compuesto de una secuencia tipo "TATA" con o sin una secuencia "CAAT" cadena arriba, puede servir como promotor en la presente invención. Dichos promotores pueden utilizarse en el presente procedimiento insertando de manera práctica los promotores en vectores de expresión que comprenden el potenciador de BK como se ejemplifica en este documento usando el promotor tardío de adenovirus 2, que es el promotor eucariota preferido para usar en el presente procedimiento.

El potenciador de BK usado en los vectores de este documento que ejemplifican la presente invención se aisló de la cepa prototipo del virus BK. Sin embargo, se han aislado y descrito varias variantes del virus BK. Gardner y col., 1971, The Lancet 1:1253, (véase también Gardner, 1973, Brit. Med. J. 1:77-78) describió el primer aislamiento de un virus BK, y la cepa de Gardner, por lo tanto, se denomina como el virus BK prototipo o de tipo silvestre. La cepa de Gardner del virus BK (Figura 1) está disponible por la ATCC con el número de acceso ATCC VR-837. Ni el procedimiento para usar el potenciador de BK en tándem con un promotor eucariota para dirigir la expresión de sustancias útiles, tales como un ácido nucleico o proteína, en presencia de un producto génico temprano inmediato de un virus de ADN grande, ni cualquier otro procedimiento de la presente invención está limitado a la cepa de Gardner o una variante particular de BK, aunque se prefiere el potenciador de la cepa prototipo. La siguiente Tabla enumera una cantidad representativa de variantes de BK que pueden usarse en los procedimientos de la presente invención.

1

Los especialistas en la técnica entenderán que pueden usarse una diversidad de células huésped eucariotas en el presente procedimiento, mientras que la célula huésped exprese un producto génico temprano inmediato de un virus de ADN grande. Prácticamente puede usarse cualquier célula eucariota en el presente procedimiento, porque el producto génico temprano inmediato puede introducirse en células huésped por cualquier medio, tal como transformación con un plásmido u otro vector. Las células humanas son las células huésped preferidas en el procedimiento de la presente invención, porque las células humanas son el huésped natural del virus BK y pueden contener factores celulares que sirven para estimular el potenciador de BK. Aunque se prefieren especialmente células de riñón humanas como células huésped, la línea celular 293 de riñón humano transformada con adenovirus-5, que expresa el producto génico E1A, es más preferida y está disponible por la ATCC con el número de acceso ATCC CRL 15753.

La línea celular 293 se prefiere no sólo porque las células 293 expresan el producto génico de E1A sino también por la capacidad de las células 293 para \gamma-carboxilar y procesar de otro modo apropiado los productos génicos complejos tales como la proteína C. Las células de riñón normalmente \gamma-carboxilan y procesan de otro modo ciertas proteínas, pero las células 293 se transforman con adenovirus, lo que generalmente da como resultado una pérdida de de las funciones especializadas. Por consiguiente, la presente invención también comprende una mejora en el procedimiento para producir una proteína que se gamma carboxila de manera natural, se pliega de manera apropiada, y se procesa, donde dicha proteína se codifica en un vector de ADN recombinante de modo que dicha proteína se expresa cuando se cultiva una célula eucariota que contiene dicho vector en condiciones de expresión apropiadas, donde la mejora comprende: (a) insertar dicho vector en una célula de riñón humana transformada con adenovirus; y (b) cultivar dicha célula huésped de la etapa a) en condiciones de crecimiento y en medios que contienen suficiente vitamina K para la carboxilación.

Las nuevas construcciones potenciador de BK-promotor eucariota descritas en el Ejemplo 17, se construyeron usando un procedimiento para mejorar la actividad del potenciador de BK con respecto a un promotor eucariota. Dicho procedimiento comprende colocar el potenciador de BK en 0 a 300 nucleótidos cadena arriba del extremo 5' de la región CAAT del promotor eucariota usado en tándem con el potenciador de BK. Los casetes mejorados producidos por este procedimiento comprenden una importante realización de la presente invención. El uso de casetes mejorados no está limitado a células huésped que expresan E1A o un producto génico similar, aunque el uso preferido implica la estimulación del casete mejorado por el producto génico temprano inmediato de un virus de ADN grande.

Otros productos génicos virales, tales como el producto génico VA de adenovirus, pueden usarse para aumentar la eficacia global del presente procedimiento para usar el potenciador de BK para promover la transcripción y expresión de genes recombinantes en células huésped eucariotas. El producto génico VA aumenta la eficacia de transcripción de moléculas de ARNm que contienen el líder tripartito de adenovirus (Kaufman, 1985, PNAS, 82:689-693, y Svensson y Akusjarul, 1985, EMBO, 4:957-964). Los vectores de la presente invención pueden modificarse fácilmente para que codifiquen el líder tripartito completo de adenovirus; sin embargo, como se demuestra en el Ejemplo 18, la presente invención abarca el uso del producto génico VA para aumentar la traducción de un ARNm dado que sólo contiene la primera parte del líder tripartito de adenovirus.

La secuencia del líder tripartito de adenovirus se representa a continuación:

2

donde A es riboadenilo, G es riboguanilo, C es ribocitidilo, y U es uridilo. Como se usa en este documento, la "primera parte" del líder tripartito de adenovirus comprende al menos la secuencia:

5'-ACUCUCUCUUCCGCAUCGCUGUCUGCGAGGGCCAG-3'

De este modo, la presente invención comprende una mejora en el procedimiento para producir una sustancia útil en una célula huésped eucariota que está transformada con un vector de ADN recombinante que contiene tanto el promotor eucariota como una secuencia de ADN que codifica dicha sustancia útil, estando dicha secuencia posicionada para la expresión a partir de dicho promotor, y donde dicha célula que contiene dicho vector se cultiva en condiciones apropiadas para la expresión de dicha sustancia útil, donde la mejora comprende:

(a) incorporar el ADN que codifica la primera parte del líder tripartito de un adenovirus en dicho vector de modo que, sobre la transcripción, el ARNm producido codifica dicho producto útil y, en el extremo 5', contiene dicha primera parte del líder tripartito;

(b) proporcionar a dicha célula que contiene el vector de la etapa a) con una secuencia de ADN que codifica para la expresión de un producto génico VA de dicho adenovirus; y

(c) cultivar dicha célula de la etapa b) en condiciones apropiadas para la expresión de dicho producto génico VA para estimular la traducción de dicho ARNm,

sujeta a la limitación de que dicho ARNm no contiene el líder tripartito completo de dicho adenovirus.

Los plásmidos que codifican VA se han construido a partir de ADN de adenovirus. Se aisló un fragmento de restricción de \sim1723 pb, definido por un sitio SalI (en el nucleótido 9833) y un sitio HindIII (en el nucleótido 11556), a partir del ADN de adenovirus 2 y se clonó en el plásmido pBR322 digerido con HindIII-SalI, reemplazando de este modo el fragmento SalI-HindIII de \sim622 pb de pBR322, para construir el plásmido pVA. Se ha construido un plásmido que codifica resistencia a neomicina y VA aislando el fragmento NruI de \sim1826 pb del plásmido pVA e insertando ese fragmento en el plásmido pSVNeo digerido con BamHI tratado con Klenow (disponible por BRL). El plásmido resultante, denominado pVA-Neo, puede usarse para insertar el gen VA en cualquier línea celular por selección de resistencia a neomicina (G418) después de la transformación.

El antígeno T de SV40, del virus BK, o cualquier otro poliomavirus también puede usarse con los vectores de la presente invención para aumentar la actividad del promotor y/o aumentar el número de copias del plásmido estimulando la replicación. El antígeno T de SV40 estimula la transcripción tanto del promotor tardío de adenovirus como el de BK. Incluyendo secuencias que codifican el antígeno T en los vectores de expresión de la presente invención o por cotransfección de los vectores con un plásmido o plásmidos que llevan las secuencias que codifican el antígeno T, puede obtenerse la amplificación del número de copias antes de la aplicación de presión selectiva como se describe en el Ejemplo 19. Esto permitirá una integración de alto número de copias del vector de expresión.

De este modo, en la realización preferida de la presente invención, el vector de expresión de ADN recombinante comprende el potenciador de BK de la cepa prototipo posicionada a menos de 300 nucleótidos cadena arriba del promotor tardío de adenovirus, que se posiciona por sí mismo para dirigir la expresión de un gen que codifica al menos la primera parte del líder tripartito y una sustancia útil. Este vector preferido se usa para transformar células 293 de riñón embrionarias humanas que se han modificado antes o después de la transformación con el vector de expresión, para expresar el producto génico VA de un adenovirus.

Los siguientes Ejemplos describen más a fondo los procedimientos, compuestos, y organismos recombinantes de la presente invención. Los especialistas en la técnica reconocerán que los reactivos particulares, equipos, y procedimientos descritos en los Ejemplos son simplemente ilustrativos y no limitan la presente invención.

Ejemplo 1 Preparación de ADN del virus BK

El virus BK se obtiene de la American Type Culture Collection con el número de acceso ATCC VR-837. El virus se suministra en forma seca congelada y se resuspende en sales balanceadas de Hank (Gibco, 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072) para un título de aproximadamente 10^{5} unidades formadoras de placa (pfu)/ml. El huésped de la elección para la preparación de ADN del virus BK es células de riñón humanas primarias (PHEK), que pueden obtenerse de Flow Laboratories, Inc, 7655 Old Springhouse Road, McLean, VA 22101, con el número de catálogo 0-100 o de M.A. Bioproducts con el número de catálogo 70-151.

Se usan aproximadamente 5 matraces de 75 mm^{2} de poliestireno que comprenden monocapas confluyentes de aproximadamente 10^{6} células PHEK para preparar el virus. Se añade aproximadamente 1 mm de virus BK a un título de 10^{5} pfu/ml a cada matraz, que después se incuba a 37ºC durante una hora, y después, se añade medio de cultivo fresco (medio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco, suplementado con suero bovino fetal al 10%), y las células infectadas se incuban a 37ºC durante 10-14 días o hasta que se observe el efecto citopatogénico completo del virus. Este efecto citopatogénico varía de una línea celular a otra y de un virus a otro pero usualmente consta de células que se redondean, se agrupan, y se desprenden del disco de cultivo.

El virus se libera de las células por tres ciclos de congelación-descongelación, y los restos celulares se retiran por centrifugación a 5000 Xg. Se precipita el virus en 1 litro de fluido sobrenadante y se recoge por la adición de 100 g de PEG-6000, incubación de la solución durante 24 horas a 4ºC, y centrifugación a 5000 Xg durante 20 minutos. El sedimento se disuelve en tampón SSC 0,1X (SSC 1X = NaCl 0,15 M y NaCitrato 0,015 M, pH = 7) a 1/100 del volumen original. La suspensión del virus se pone en capas en una solución de 15 ml de KBr saturado en un tubo, que se centrifuga a 7500 Xg durante 3 horas. Son evidentes dos bandas en la solución de KBr después de la centrifugación. La banda inferior, que contiene el virión completo, se recoge y se desala en una columna Sephadex G-50 usando TE (Tris-HCl 15 mM, pH = 7,8, y EDTA 1 mM) como tampón de elución.

Se añade dodecilsulfato sódico (SDS) a la solución de viriones purificados obtenida de la columna a una concentración del 1%; se añade pronasa a una concentración de 100 \mug/ml, y la solución se incuba a 37ºC durante 2 horas. Después se añade cloruro de cesio a la solución a una densidad de 1,56 g/ml, y se añade bromuro de etidio a la solución a una concentración final de 100 \mug/ml. Se centrifuga la solución en un rotor Sorval 865 o rotor vertical similar a 260.000 Xg durante 24 horas. Después de la centrifugación, la banda de ADN de virus se aísla y se extrae cinco veces con alcohol de isoamilo saturado con Tris-HCl 100 mM, pH =7,8. La solución de AND de virus BK después se dializa frente a tampón TE hasta que la proporción de absorbancia en 260 nm/280 nm del ADN esté entre 1,75 y 1,90. El ADN se precipita ajustando la concentración de NaCl a 0,15 M, añadiendo dos volúmenes de etanol, incubando la solución a -70ºC durante al menos 2 horas, y centrifugando la solución a 12.000 Xg durante 10 minutos. El sedimento resultante del ADN del virus BK se suspende en tampón TE a una concentración de 1 mg/ml.

Ejemplo 2 Construcción de los Plásmidos pBKE1 y pBKE2

Se disolvió aproximadamente un \mug del ADN del virus BK preparado en el Ejemplo 1 en un \mul de tampón TE, en 2 \mul de tampón EcoRI 10X (Tris-HCl 1,0 M, pH = 7,5; NaCl 0,5 M; MgCl_{2} 50 mM; y 1 mg/ml de BSA) y 15 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul de la enzima de restricción EcoRI (\sim10 unidades; todas las unidades de encimas mencionadas en este documento, salvo que se indique lo contrario, se refieren a las definiciones de unidad de New England Biolabs, 32 Trozer Road, Beverly, MA 01915-9990, aunque la fuente actual de enzimas pueda ser diferente) a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante dos horas.

Se digirió aproximadamente 1 \mug del plásmido pUC8 (disponible por Pharmacia P-L Biochemicals, 800 Centennial Ave., Piscataway, N.J. 08854) en 1 \mul de tampón TE con EcoRI sustancialmente de acuerdo con el procedimiento usado para preparar el ADN del virus BK digerido con EcoRI. El ADN del plásmido pUC8 digerido con EcoRI se diluyó a 100 \mul en tampón TE; se añadieron \sim0,06 unidades de fosfatasa alcalina intestinal de ternera a la solución, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Se ajustó la solución para que contuviera SET 1X (Tris-HCl 5 mM, pH = 7,8; EDTA 5 mM; y NaCl 150 mM), NaOAc 0,3 M, y SDS al 0,5% y después se incubó al 65ºC durante 45 minutos. El tratamiento con fosfatasa previene que el ADN de pUC8 se autoligue.

El ADN del virus BK y del plásmido pUC8 digerido con EcoRI se extrajo primero con fenol tamponado y después con cloroformo. El ADN se recogió ajustando la concentración de NaCl para cada solución de ADN a 0,25 M, añadiendo 2 volúmenes de etanol, incubando las mezclas resultantes en un baño de etanol en hielo seco durante 5 minutos, y centrifugando para sedimentar el ADN. Los sobrenadantes se desecharon, y los sedimentos de ADN se lavaron con etanol al 70%, se secaron, y se resuspendieron en 10 \mul y 30 \mul de tampón TE para las muestras de BK y plásmido pUC8, respectivamente.

Se añadieron aproximadamente 3 \mul de H_{2}O y 1 \mul de tampón ligasa 10X (Tris-HCl 0,5 M, pH = 7,8; MgCl_{2} 100 mM; DTT 200 mM; ATP 10 mM; y 0,5 mg/ml de BSA) a una mezcla de 2 \mul del ADN del virus BK digerido con EcoRI y 1 \mul del ADN de plásmido pUC8 digerido con EcoRI. Se añadió un \mul (\sim 1000 unidades) de ADN ligasa T4 a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó los plásmidos deseados pBKE1 y pBKE2, que difieren sólo con respecto a la orientación del ADN del virus BK insertado. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBKE1 en la Figura 2 de los dibujos adjuntos.

Se hizo crecer un cultivo de 50 ml de E. coli K12 JM103, disponible por Pharmacia P-L Biochemicals, en caldo-L a una densidad óptica de 650 nanómetros (D.O._{650}) de aproximadamente 0,4 unidades de absorbancia. Se enfrió el cultivo en hielo durante 10 minutos, y las células se recogieron por centrifugación. El sedimento celular se resuspendió en 25 ml de MgCl_{2} 100 mM frío y se incubó en hielo durante 25 minutos. Las células se sedimentaron una vez más por centrifugación, y se resuspendió el sedimento en 2,5 ml de CaCl_{2} 100 mM frío y se incubó durante 10 minutos en hielo. Después de la incubación, las células son competentes para la captación del ADN transformante.

Se mezclaron doscientos \mul de esta suspensión celular con el ADN ligado preparado anteriormente y se incubó en hielo durante 30 minutos. Al final de este periodo, las células se colocaron en un baño de agua a 42ºC durante 2 minutos y después se volvieron a poner en hielo durante 10 minutos adicionales. Se recogieron las células por centrifugación y se resuspendieron en un ml de caldo-L y se incubaron a 37ºC durante 1 hora.

Se sembraron alícuotas de la mezcla celular en placas de agar-L (caldo-L con 15 gramos de agar por litro) que contenía 100 \mug de ampicilina/ml, 40 \mug de X-gal/ml y 40 \mug de IPTG/ml. Se incubaron las placas a 37ºC durante una noche. Las colonias que contienen un plásmido sin un inserto, tales como E. coli K12 JM103/pUC8, aparecen azules en estas placas. Las colonias que contiene un plásmido con un inserto, tales como E. coli K12 JM103/pBKE1, son blancas. Varias colonias blancas se seleccionaron y se exploraron para el análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico para la presencia del fragmento de restricción EcoRI de \sim5,2 kb del virus BK. Se obtuvo ADN plasmídico de las células de E. coli K12 JM103/pBKE1 y E. coli K12 JM103/pBKE2 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento para asilar ADN plasmídico que se describe en el siguiente Ejemplo, aunque el procedimiento se hace en menor escala, y las etapas de gradiente de CsCl se omiten, cuando el ADN plasmídico se aísla sólo para el análisis con enzimas de restricción.

Ejemplo 3 Construcción de los Plásmidos pBKneo1 y pBKneo2

Las células de E. coli K12 HB101/pdBPV-MMTneo se obtienen en forma liofilizada de la American Type Culture Collection con el número de acceso ATCC 37224. Las células liofilizadas se siembran en placas de agar-L que contienen 100 \mug/ml de ampicilina y se incuban a 37ºC para obtener aislados de colonias únicas.

Se inocula 1 litro de caldo-L (10 g de triptona, 10 g de NaCl, y 5 g de extracto de levadura por litro) que contiene 50 \mug/ml de ampicilina con una colonia de E. coli K12 HB101/pdBPV-MMTneo y se incubó en un agitador de aire a 37ºC hasta que la D.O._{590} fue de \sim1 unidad de absorbancia, al tiempo que se añadían 150 mg de cloramfenicol al cultivo. Se continuó la incubación durante aproximadamente 16 horas; la adición de cloranfenicol inhibe la síntesis de proteínas, y de este modo inhibe también la división celular, pero permite que continúe la replicación plasmídica.

Se centrifugó el cultivo en un rotor Sorvall GSA (DuPont Co., Instrument Products, Biomedical Division, Newton, CN 06470) a 6000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Se desechó el sobrenadante resultante, y el sedimento celular se lavó en 40 ml de tampón TES (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5; NaCl 10 mM; y EDTA 1 mM) y después se resedimentó. Se desechó el sobrenadante, y el sedimento celular se congeló en un baño de etanol en hielo seco y después se descongeló. El sedimento celular descongelado se resuspendió en 10 ml de una solución de sacarosa al 25% y EDTA 50 mM. Se añadieron aproximadamente 1 ml de una solución de 5 mg/ml de lisozima; 3 ml de EDTA 0,25 M, pH = 8,0; y 100 \mul de 10 mg/\mul de ARNasa A a la solución, que después se incubó en hielo durante 15 minutos. Se añadieron tres ml de solución de lisis (preparada mezclando 3 ml de Triton-X 100 al 10%; 75 ml de EDTA 0,25 M, pH = 8,0; 15 ml de Tris-HCl 1 M, pH = 8,0; y 7 ml de agua) a las células tratadas con lisozima, se mezclaron, y la solución resultante se incubó en hielo durante otros 15 minutos. Las células lisadas se congelaron en un baño de etanol en hielo seco y después se descongelaron.

Los restos celulares se retiraron de la solución por centrifugación a 25.000 rpm durante 45 minutos en un rotor SW27 (Beckman, 7369 N. Lincoln Ave., Lincoln-wood, IL 60646) y por extracción con fenol tamponado. Se añadieron aproximadamente 30,44 g de CsCl y \sim1 ml de una solución de 50 mg/ml de bromuro de etidio al extracto celular, y después, se ajustó el volumen de la solución a 40 ml con tampón TES. Se decantó la solución en un tubo de ultracentrífuga VTi50 (Beckman), que después se selló y se centrifugó en un rotor VTi50 a 42.000 rpm durante \sim16 horas. La banda del plásmido resultante, visualizada con luz ultravioleta, se aisló y después se colocó en un tubo Ti75 y en un rotor (Beckman) y se centrifugó a 50.000 rpm durante 16 horas. Cualquier ajuste de volumen necesario se hizo usando TES que contenía 0,761 g/ml de CsCl. La banda de plásmido se asiló otra vez, se extrajo con isopropanol saturado con sal para retirar el bromuro de etidio, y se diluyó con tampón TES 1:3. Después se añadieron dos volúmenes de etanol a la solución, que después se incubó durante una noche a -20ºC. Se sedimentó el ADN plasmídico centrifugando la solución en un rotor SS34 (Sorvall) durante 15 minutos a 10.000 rpm.

El \sim1 mg del ADN del plásmido pdBPV-MMTneo obtenido por este procedimiento se suspendió en 1 ml de tampón TE y se guardó a -20ºC. El procedimiento de asilamiento de plásmido anterior generalmente se usa cuando se desean grandes cantidades de ADN plasmídico muy puro. El procedimiento puede modificarse para obtener rápidamente una cantidad más pequeña y menos pura de ADN, tal como se necesita cuando se exploran transformantes para la presencia de un plásmido dado, usando sólo aproximadamente 5 ml de células cultivadas, lisando las células en una cantidad de tampón de lisis apropiadamente reducida a escala, y reemplazando las etapas de centrifugación con extracciones con fenol y cloroformo.

Aproximadamente 5 \mug (5 \mul) del ADN del plásmido pdBPV-MMTneo preparado anteriormente y 5 \mug (5\mul) del ADN del virus BK preparado en el Ejemplo 1 se digirieron cada uno a 37ºC durante 2 horas en una solución que contenía 2 \mul de tampón BamHI 10X (NaCl 1,5 M; Tris-HCl 60 mM, pH = 7,9; MgCl_{2} 60 mM; y 1 mg/ml de BSA), 1 \mul de enzima de restricción BamHI, y 7 \mul de H_{2}O. La reacción se paró por una extracción con un volumen igual de fenol, seguido por dos extracciones con cloroformo. Después se precipitó cada ADN digerido con BamHI, se recogió por centrifugación, y se resuspendió en 5 \mul de H_{2}O.

Se añadió aproximadamente 1 \mul de tampón ligasa 10X a una mezcla de ADN del plásmido pdBPV-MMTneo digerido con BamHI (1 \mul) y ADN del virus BK digerido con BamHI (1 \mul). Después de añadir un 1\mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 y 6 \mul de H_{2}O a la mezcla de ADN, la reacción resultante se incubó a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó los plásmidos deseados pBKneo1 y pBKneo2, que difieren sólo con respecto a la orientación del AND del virus BK. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBKneo1 en la Figura 3 de los dibujos adjuntos.

Las células de E. coli K12 HB101 están disponibles en forma liofilizada por el Nothern Regional Research Laboratory con el número de acceso NRRL B-15626. Las células de E. coli K12 HB101 se cultivaron, haciéndolas competentes para la transformación, y se transformaron con el ADN ligado preparado anteriormente sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2. Las células transformadas se sembraron en placas de agar-L que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Los transformantes E. coli K12 HB101/pBKneo1 y E. coli K12/pBKneo2 se identificaron por su fenotipo resistente a ampicilina y por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico.

Ejemplo 4 Constricción del Plásmido pBLcat A. Construcción del Plásmido pLPcat intermedio

El AND del virión de adenovirus 2 (Ad2) es una molécula lineal de doble cadena de aproximadamente 35,94 kb de tamaño. El promotor tardío de Ad2 puede asilarse en un fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,316 kb del genoma de Ad2; este fragmento de restricción de \sim0,32 kb se corresponde con la secuencia entre las posiciones de los nucleótidos 5755 y 6071 del genoma de Ad2. Para asilar el fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb deseado, primero se digiere el ADN de Ad2 con la enzima de restricción BalI, y se aísla el fragmento de restricción BalI de \sim2,4 kb que comprende la secuencia completa del fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb. Después, se digiere el fragmento de restricción BalI de \sim 2,4 kb con AccI y PvuII para obtener el fragmento deseado.

Se disuelven aproximadamente 50 \mug del ADN de Ad2 (disponible por BRL) en 80 \mul de H_{2}O y 10 \mul de tampón BalI 10X (Tris-HCl 100 mM, pH = 7,6; MgCl_{2} 120 mM; DTT 100 mM; y 1 mg/ml de BSA). Se añaden aproximadamente 10 \mul (\sim20 unidades) de la enzima de restricción BalI a la solución de ADN de Ad2, y la reacción resultante se incuba a 37ºC durante 4 horas.

El ADN digerido con BalI se carga en un gel de agarosa y se somete a electroforesis hasta que los fragmentos de restricción están bien separados. La visualización del ADN sometido a electroforesis se consigue tiñendo el gel en una solución diluida de bromuro de etidio (0,5 \mug/ml) y exponiendo el gel teñido a luz de longitud de onda ultravioleta (UV). Un procedimiento para asilar ADN de agarosa es el siguiente. Se hace un pequeño corte en el gel delante del fragmento deseado, y se coloca una pequeña pieza de membrana NA-45 DEAE (Shleicher y Schuell, Keene, NH 03431) en cada corte. Sobre electroforesis adicional, el ADN se une de manera no covalente a la membrana DEAE. Después de que el fragmento deseado se une a la membrana DEAE, se retira la membrana y se aclara con tampón de bajo contenido salino (KCl 10 mM; EDTA 0,1 mM; y Tris-HCl 20 mM, pH = 8). A continuación, se coloca la membrana en un pequeño tubo y se sumerge en tampón de alto contenido salino (NaCl 1 M; EDTA 0,1 mM; y Tris-HCl 20 mM, pH = 8) y después se incuba a 65ºC durante una hora para retirar el ADN del papel DEAE. Después de la incubación a 65ºC, se recoge el tampón de incubación y la membrana se aclara con tampón de alto contenido salino. La solución de aclarado de alto contenido salino se junta con el tampón de incubación de alto contenido
salino.

Se ajusta el volumen de la solución de ADN de alto contenido salino de modo que la concentración de NaCl es 0,25 M, y después se añaden tres volúmenes de etanol absoluto frío a la solución. La solución resultante se mezcla y se coloca a -70ºC durante 10-20 minutos. Después se centrifuga la solución a 15.000 rpm durante 15 minutos. Después de otra precipitación para retirar la sal residual, el sedimento de ADN se aclara con etanol, se seca, se resuspende en 20 \mul de tampón TE, y constituye aproximadamente 3 \mug del fragmento de restricción deseado de Ad2. El fragmento purificado obtenido se disuelve en 10 \mul de tampón TE.

Se añaden aproximadamente 6 \mul de H_{2}O y 2\mul de tampón AccI 10X (NaCl 60 mM; Tris-HCl 60 mM, pH = 7,5; MgCl_{2} 60 mM; DTT 60 mM; y 1 mg/ml de BSA) a la solución del fragmento de restricción BalI de \sim2,4 kb de Ad2. Después de la adición de aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción AccI a la solución de ADN, se incuba la reacción a 37ºC durante 2 horas. Después de la digestión con AccI, se recoge el ADN por precipitación con etanol y se resuspende en 16 \mul de H_{2}O y 2 \mul de tampón PvuII 10X (NaCl 600 mM; Tris-HCl 60 mM, pH = 7,5; MgCl_{2} 60 mM; DTT 60 mM; y 1 mg/ml de BSA). Después de la adición de aproximadamente 2 \mul (aproximadamente 10 unidades) de la enzima de restricción PvuII a la solución de ADN, se incuba la reacción a 37ºC durante 2 horas.

El fragmento de restricción BalI de \sim2,4 kb digerido con AccI- PvuII de Ad2 se carga en un gel de poliacrilamida al \sim6% y se somete a electroforesis hasta que el fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb que comprende el promotor tardío de Ad2 se separa de los otros productos de digestión. El gel se tiñe con bromuro de etidio y se ve usando luz ultravioleta, y el segmento de gel que contiene el fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb se corta del gel, se prensa, y se pone en remojo durante una noche a temperatura ambiente en \sim250 ml de tampón de extracción (NH_{4}OAc 500 mM; MgOAc 10 mM; EDTA 1 mM; y SDS al 0,1%). La siguiente mañana, se centrifuga la mezcla, y se desecha el sedimento. El ADN en el sobrenadante se precipita con etanol; se añaden aproximadamente 2 \mug de ARNt para asegurar la precipitación completa del fragmento deseado. Se obtienen aproximadamente 0,2 \mug del fragmento de restricción AccI- PvuII de \sim0,32 kb y se suspenden en 7 \mul de H_{2}O.

Se añaden aproximadamente 0,25 \mug (en 0,5 \mul) de engarces BclI (5'-CTGATCAG-3', disponible por New England Biolabs), que se han tratado con quinasas sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 10A, a continuación, a la solución del fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb, y después, se añadieron 1 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 y 1 \mul de tampón ligasa 10X a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante una noche. Los engarces BclI sólo podían ligarse al extremo PvuII del fragmento de restricción AccI-PvuII. Más tarde, la secuenciación de ADN reveló que cuatro engarces BclI se unieron al extremo PvuII del fragmento de restricción AccI-PvuII. Estos engarces BclI adicionales pueden retirarse por digestión con BclI y religamiento; si embargo, los engarces BclI adicionales no se pueden quitar como los engarces que no afectan al funcionamiento apropiado de los vectores que comprenden los engarces adicionales.

Las células de E. coli K12 HB101/pSV2cat se obtienen en forma liofilizada de la ATCC con el número de acceso ATCC 37155, y se aisló el ADN del plásmido pSV2cat de las células sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Se muestra un mapa de los sitios de restricción y función del plásmido pSV2cat en la Figura 4 de los dibujos adjuntos. Se obtiene aproximadamente 1 mg del ADN del plásmido pSV2cat y se disuelve en 1 ml de tampón TE. Se añadieron aproximadamente 3 \mug (3 \mul) del ADN del plásmido pSV2cat a 2 \mul de tampón AccI 10X y 16 \mul de H_{2}O, y después, se añadieron 3 \mul (aproximadamente 9 unidades) de la enzima de restricción AccI a la solución de ADN de pSV2cat, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pSV2cat digerido con AccI después se digirió con la enzima de restricción StuI añadiendo 3 \mul de tampón StuI 10X (NaCl 1,0 M; Tris-HCl 100 mM, pH = 8,0; MgCl_{2} 100 mM; DTT 60 mM; y 1 mg/ml BSA), 5 \mul de H_{2}O, y aproximadamente 2 \mul (aproximadamente 10 unidades) de la enzima de restricción StuI. La reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. La reacción se interrumpió extrayendo la mezcla de reacción una vez con fenol, después dos veces con cloroformo. Se obtuvieron aproximadamente 0,5 \mug del fragmento deseado y se disolvieron en 20 \mul de tampón TE.

Se mezclaron aproximadamente 4 \mul del ADN del plásmido pSV2cat digerido con AccI-StuI con aproximadamente 7 \mul del fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb (con engarces BclI unidos) de Ad2, y después de la adición de 3 \mul de tampón ligasa 10X, 15 \mul de H_{2}O, y 2 \mul (aproximadamente 1000 unidades) de ADN ligasa T4, se incubó la reacción de ligamiento a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pLPcat deseado, un plásmido que comprende el promotor tardío de Ad2 posicionado de modo que dirige la trascripción, y de este modo la expresión, del gen de la cloramfenicol acetiltransferasa. Se muestra un mapa de los sitios de restricción y función del plásmido pLPcat en la Figura 5 de los dibujos adjuntos.

Se usó el ADN ligado para transformar células de E. coli K12 HB101 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Las células transformadas se sembraron en placas de agar-L que contenían 50 \mug/ml de ampicilina; se usó el análisis con enzimas de restricción del ADN plasmídico para identificar los transformantes E. coli K12 HB101/pLPcat. El ADN del plásmido pLPcat se aisló de los transformantes para usarlo en construcciones posteriores sustancialmente de acuerdo con el procedimiento de asilamiento plasmídico descrito en el Ejemplo 3.

B. Construcción final del Plásmido pBLcat

Se añadieron aproximadamente 88 \mug del ADN del plásmido pBKneo1 en 50 \mul de tampón TE a 7,5 \mul de tampón AccI 10X, 30 \mul de H_{2}O, y 15 \mul (aproximadamente 75 unidades) de la enzima de restricción AccI, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del virus BK digerido con AccI se cargó en un gel de agarosa, y el fragmento de \sim1,4 kb que contiene el potenciador de BK se separó de los otros productos de digestión. Después se asiló el fragmento de restricción AccI de \sim1,4 kb sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4A. Se resuspendieron aproximadamente 5 \mug del fragmento en 5 \mul de tampón PvuII 10X, 45 \mul de H_{2}O, y 5 \mul (aproximadamente 25 unidades) de la enzima de restricción PvuII, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. Después se aisló el ADN digerido con PvuII y se preparó para el ligamiento sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento AccI-PvuII de \sim1,28 kb deseado y se disolvieron en 5 \mul de tampón TE.

Se disolvió aproximadamente 1 \mug del ADN del plásmido pLPcat en 5 \mul de tampón AccI 10X y 40 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim25 unidades) de la enzima de restricción AccI a la solución de ADN del plásmido pLPcat, y la reacción resultante se incubó a 37ºC. El ADN del plásmido pLPcat digerido con AccI se precipitó con etanol y se resuspendió en 5 \mul de tampón StuI 10X, 40 \mul de H_{2}O, y 5 \mul (aproximadamente 25 unidades) de la enzima de restricción StuI, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pLPcat digerido con AccI-StuI se precipitó con etanol varias veces para purificar el fragmento de restricción AccI-StuI de \sim4,81 kb que comprende el origen de replicación de E. coli y el promotor tardío de Ad2 lejos del otro producto de digestión, un fragmento de restricción de aproximadamente 16 pb de tamaño. Se obtuvo aproximadamente 1 \mug del fragmento de restricción de \sim4,81 kb deseado y se disolvió en 20 \mul de tampón TE.

Se añadieron los 5 \mul del fragmento de restricción AccI-StuI de \sim4,81 kb del plásmido pLPcat a 5 \mul del fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim1,28 kb del virus BK. Después de la adición de 3 \mul de tampón ligasa 10X, 15 \mul de H_{2}O, y 2 \mul (aproximadamente 1000 unidades) de ADN ligasa T4 a la mezcla de ADN, la reacción de ligamiento resultante se incubó a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pBLcat deseado. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBLcat en la Figura 6 de los dibujos adjuntos.

El ADN ligado se usó para transformar células de E. coli K12 HB101 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 3. Los transformantes E. coli K12 HB101/pBLcat se identificaron por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico. El ADN del plásmido pBLcat se preparó para usarlo en las construcciones posteriores sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3.

Ejemplo 5 Construcción del Plásmido pSBLcat

Se disolvieron aproximadamente 100 g del ADN del plásmido pBLcat en 10 \mul de tampón HindIII 10X (NaCl 0,5 M; Tris-HCl 0,1 M, pH = 8,0; MgCl_{2} 0,1 M; y 1 mg/ml de BSA) y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (aproximadamente 100 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN del plásmido pBLcat, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pBLcat digerido con HindIII se cargó en un gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que el fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb que comprende el potenciador de BK y el promotor tardío de Ad2 se separó bien de los otros productos de digestión; después, se aisló el fragmento de \sim0,87 kb y se preparó para el ligamiento sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 10 \mug del fragmento deseado y se disolvieron en 50 \mul de tampón TE.

Se disolvió aproximadamente 1 \mug del ADN del plásmido pSV2cat en 1 \mul de tampón TE, en 2 \mul de tampón HindIII 10X y 16 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (aproximadamente 10 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. Se paró la reacción extrayendo la mezcla de reacción primero con fenol, después dos veces con cloroformo. El ADN del plásmido pSV2cat digerido con HindIII se precipitó con etanol y se resuspendió en 100 \mul de tampón TE. El ADN del plásmido pSV2cat digerido con HindIII se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternera sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2 y después se resuspendió en 10 \mul de tampón TE.

Se añadieron aproximadamente 5 \mul del fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb del plásmido pBLcat a los 10 \mul del plásmido pSV2cat digerido con HindIII, y después, se añadieron 3 \mul de tampón ligasa 10X, 2 \mul (aproximadamente 1000 unidades) de ADN ligasa T4, y 13 \mul de H_{2}O a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante 2 horas. El ADN ligado constituyó el plásmido pSBLcat deseado. El ADN ligado se usó para trasformar E. coli K12 HB101 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Las células trasformadas se sembraron en placas de agar-L que contenían ampicilina, y se examinó el ADN plasmídico de los transformantes resistentes a ampicilina por análisis con enzimas de restricción para identificar los transformantes E. coli K12 HB101/pSBLcat. El fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb que codifica el potenciador de BK y el promotor tardío de Ad2 podía insertarse en el plásmido pSBLcat digerido con HindIII en una de dos orientaciones, sólo una de las cuales produce el plásmido pSBLcat. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pSBLcat en la Figura 8 de los dibujos adjuntos.

Ejemplo 6 Construcción del Plásmido pL133 A. Construcción del Plásmido pSV2-HPC8 Intermedio

El plásmido pHC7 comprende una secuencia de AND que codifica la proteína C humana. Se inoculó un litro de caldo-L que contenía 15 \mul/ml de tetraciclina con un cultivo de E. coli K12 RR1/pHC7 (NRRL B-15926), y se aisló y se purificó el ADN del plásmido pHC7 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Se obtuvo aproximadamente 1 mg del ADN del plásmido pHC7 por este procedimiento, se suspendió en 1 ml de tampón TE, y se guardó a -20ºC. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pHC7 en la Figura 9 de los dibujos adjuntos.

Se mezclaron cincuenta \mul del ADN del plásmido pHC7 con 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BanI, 10 \mul de tampón de reacción BanI 10X (NaCl 1,5 M; Tris-HCl 60 mM, pH = 7,9; MgCl_{2} 60 mM; y 1 mg/ml de BSA), y 35 \mul de H_{2}O y se incubaron hasta que se completó la digestión. Después el ADN del plásmido pHC7 digerido con BanI se sometió a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 3,5% (29:1, acrilamida:bisacrilamida), hasta que el fragmento de restricción BanI de \sim1,25 kb se separó de los otros productos de digestión.

La región del gel que contenía el fragmento de restricción BanI de \sim1,25 kb se cortó del gel, se colocó en un tubo de ensayo, y se rompió en pequeños fragmentos. Se añadió un ml de tampón de extracción (NH_{4}OAc 500 mM, MgOAc 10 mM, EDTA 1 mM, SDS al 1%, y 10 mg/ml de ARNt) al tubo que contenía los fragmentos, y se colocó el tubo a 37ºC durante una noche. Se usó centrifugación para sedimentar los restos, y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo. Los restos se lavaron una vez con 200 \mul de tampón de extracción; el sobrenadante lavado se combinó con el primer sobrenadante de la extracción de una noche. Después de pasar el sobrenadante a través de un tapón de lana de vidrio, se añadieron dos volúmenes de etanol y se mezclaron con el sobrenadante. La solución resultante se colocó en un baño de etanol en hielo seco durante \sim10 minutos, y después, se sedimentó el ADN por centrifugación.

Se obtuvieron aproximadamente 8 \mug del fragmento de restricción BanI de \sim1,25 kb por este procedimiento. El fragmento purificado se suspendió en 10 \mul de tampón TE y se guardó a -20ºC, El fragmento de restricción BanI tenía que modificarse por la adición de un engarce para construir el plásmido pSV2-HPC8. Los fragmentos de ADN usados en la construcción del engarce se sintetizaron usando un sintetizador de ADN Systec 1450A (Systec Inc., 3816 Chandler Drive, Minneapolis, MN) o un sintetizador de ADN ABS 380A (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404). Muchos instrumentos de síntesis de ADN son conocidos en la técnica y pueden usarse para hacer los fragmentos. Además, los fragmentos también pueden preparase de manera práctica sustancialmente de acuerdo con los procedimientos de Itakura y col., 1977, Science, 198:1056 y Crea y col., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75:5765.

Se trataron con quinasa quinientos picomoles de cada cadena simple del engarce en 20 \mul de tampón de reacción, que contenía 15 unidades (\sim0,5 \mul) de polinucleótido quinasa T4, 2 \mul de tampón ligasa 10X, 10\mul de ATP 500 \muM y 7,5 \mul de H_{2}O. La reacción con quinasa se incubó a 37ºC durante 30 minutos, y se interrumpió la reacción por incubación a 100ºC durante 10 minutos. Para asegurar la quinación completa, se enfrió la reacción en hielo, se añadieron 2 \mul de ditiotreitol 0,2 M, 2,5 \mul de ATP 5 mM, y 15 unidades de polinucleótido quinasa T4 a la mezcla de reacción y se mezclaron, y la mezcla de reacción se incubó otros 30 minutos a 37ºC. Se paró la reacción por otra incubación de 10 minutos a 10ºC y después se enfrió en hielo.

Aunque se trataron con quinasa por separado, las dos cadenas simples del engarce de ADN se mezclaron entre sí después de la reacción con quinasa. Para hibridar las cadenas, la mezcla de reacción con quinasa se incubó a 100ºC durante 10 minutos en un baño de agua que contenía \sim150 ml de agua. Después de esta incubación, se retiró el baño de agua y se dejó enfriar a temperatura ambiente, un procedimiento que tarda aproximadamente 3 horas. El baño de agua, que aún contenía el tubo de ADN tratado con quinasa, después se incubó a 4ºC durante una noche. Este procedimiento hibridó las cadenas simples. El engarce construido tenía la siguiente estructura:

3

El engarce se guardó a -20ºC hasta su uso.

Se añadieron los \sim8 \mug del fragmento BanI de \sim1,25 kb y se mezclaron con los \sim50 \mul del engarce (\sim500 picomoles), y 1 \mul de ADN ligasa T4 (\sim500 unidades), 10 \mul de tampón ligasa 10X, y 29 \mul de H_{2}O, y la reacción de ligamiento resultante se incubó a 4ºC durante una noche. La reacción de ligamiento se paró por una incubación de 10 minutos a 65ºC. El ADN se sedimentó añadiendo NaOAc a una concentración final de 0,3 M, añadiendo 2 volúmenes de etanol, enfriando en un baño de etanol con hielo seco, y después centrifugando la solución.

Se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón de reacción ApaI 10X (NaCl 60 mM; Tris-HCl 60 mM, pH = 7,4; MgCl_{2} 60 mM; y 2-mercaptoetanol 60 mM), 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción ApaI, y 85 \mul de H_{2}O, y la reacción se colocó a 37ºC durante 2 horas. Después se paró la reacción y se sedimentó el ADN del modo anterior. Se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón de reacción HindIII 10X, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción HindIII, y 85 \mul de H_{2}O, y se colocó la reacción a 37ºC durante 2 horas. Después de la digestión con HindIII, la mezcla de reacción se cargó en un gel de poliacrilamida al 3,5%, y se aisló el fragmento de restricción HindIII-ApaI de \sim1,23 kb deseado sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 5 \mug del fragmento deseado, se suspendieron en 10 \mul de tampón TE, y se guardaron a -20ºC.

Se mezclaron cincuenta \mul de ADN del plásmido pHC7 con 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción PstI, 10 \mul de tampón de reacción PstI 10X (NaCl 1,0 M; Tris-HCl 100 mM, pH = 7,5; MgCl_{2} 100 mM; y 1 mg/ml de BSA), y 35 \mul de H_{2}O y se incubaron a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pHC7 digerido con PstI después se sometió a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 3,5%, y se purificó el fragmento de \sim0,88 kb deseado sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Se obtuvieron aproximadamente 5 \mug del fragmento deseado, se suspendieron en 10 \mul de tampón TE, y se guardaron a -20ºC.

Los \sim5 \mug del fragmento PstI de \sim0,88 kb se añadieron y se mezclaron con \sim50 \mul del siguiente engarce, que se construyó en un sintetizador de ADN automatizado:

4

Se añadieron aproximadamente 1 \mul de ADN ligasa T4 (\sim10 unidades), 10 \mul de tampón ligasa 10X, y 29 \mul de H_{2}O a la mezcla de ADN, y la reacción de ligamiento resultante se incubó a 4ºC durante una noche.

La reacción de ligamiento se paró por una incubación de 10 minutos a 65ºC. Después de la precipitación del ADN ligado, se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón de reacción ApaI 10X, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción ApaI, y 85 \mul de H_{2}O, y la reacción se colocó a 37ºC durante dos horas. Después se paró la reacción y se sedimentó el ADN una vez más. Se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón de reacción BglII 10X (NaCl 1 M; Tris-HCl 100 mM, pH = 7,4; MgCl_{2} 100 mM; 2-mercaptoetanol 100 mM; y 1 mg/ml de BSA), 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BglII, y 85 \mul de H_{2}O, y la reacción se colocó a 37ºC durante dos horas. Después de la digestión con BglII, la mezcla de reacción se cargó en un gel de poliacrilamida al 3,5%, y el fragmento de restricción ApaI-BglII de \sim0,19 kb deseado se aisló sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Se obtuvo aproximadamente 1 \mug del fragmento deseado, se suspendió en 100 \mul de tampón TE, y se guardó a -20ºC.

Se disolvieron aproximadamente 10 \mug del ADN del plásmido pSV2gpt (ATCC 37145) en 10 \mul de tampón HindIII 10X, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción HindIII, y 85 \mul de H_{2}O, y la reacción se colocó a 37ºC durante 2 horas. Después se hizo la mezcla de reacción a 0,25 M en NaOAc, y después de la adición de dos volúmenes de etanol e incubación en un baño de etanol en hielo seco, se sedimentó el ADN por centrifugación. Se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón BglII 10X, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BglII, y 85 \mul de H_{2}O, y la reacción se colocó a 37ºC durante dos horas. Después de la digestión con BglII, la mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa al 1%, y los fragmentos se separaron por electroforesis. Se tiñó el gel con bromuro de etidio y se vio con luz ultravioleta, y la banda que contenía el fragmento HindIII-BglII de \sim5,1 kb deseado se cortó del gel y se colocó en un tubo de diálisis, y se continuó la electroforesis hasta que el ADN salió de la agarosa. El tampón que contenía el ADN del tubo de diálisis se extrajo con fenol y CHCl_{3}, y después, se precipitó el ADN. El sedimento se resuspendió en 10 \mul de tampón TE y constituyó \sim5 \mug del fragmento de restricción HindIII-BglII de \sim5,1 kb deseado del plásmido pSV2gpt.

Se mezclaron entre sí dos \mul del fragmento de restricción HindIII-ApaI de \sim1,23 kb, 3 \mul del fragmento ApaI- BglII de \sim0,19 kb, y 2\mul del fragmento HindIII-BglII de \sim5,1 kb y después se incubaron con 10 \mul de tampón ligasa 10X, 1 \mul de ADN ligasa T4 (\sim500 unidades), y 82 \mul de H_{2}O a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pSV2-HPC8 deseado; se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido en la Figura 9 de los dibujos adjuntos.

Las células de E. coli K12 RR1 (NRRL B-15210) se hicieron competentes para la transformación sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. El ADN ligado preparado anteriormente se usó para transformar las células, y se sembraron alícuotas de la mezcla de transformación en placas de agar-L que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Después se incubaron las placas a 37ºC. Los transformantes E. coli K12 RR1/pSV2-HPC8 se verificaron por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico.

B. Construcción Final del Plásmido pL133

Se disolvieron cincuenta \mug del plásmido pSV2-HPC8 en 10 \mul de tampón de reacción HindIII 10X, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción HindIII, y 85 \mul de H_{2}O, y la reacción se incubó a 37ºC durante dos horas. Después de la digestión con HindIII, se precipitó el ADN, y el sedimento de ADN se disolvió en 10 \mul de tampón de reacción SalI 10X (NaCl 1,5 M; Tris-HCl 60 mM, pH = 7,9; MgCl_{2} 60 mM; 2-mercaptoetanol 60 mM; y 1 mg/ml de BSA), 50 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción SalI, y 85 \mul de H_{2}O. La mezcla de reacción SalI resultante se incubó durante 2 horas a 37ºC. El plásmido pSV2-HPC8 digerido con HindIII-SalI se cargó en un gel de poliacrilamida al 3,5% y se sometió a electroforesis hasta que el fragmento de restricción HindIII-SalI de \sim0,29 kb deseado se separó de los otros productos de reacción. El fragmento deseado se aisló del gel; se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento y se suspendieron en 10 \mul de tampón TE.

Se disolvieron cincuenta \mug del plásmido pSV2-HPC8 en 10 \mul de tampón de reacción BglII 10X, 5 \mul (50 unidades) de la enzima de restricción BglII, y 85 \mul de H_{2}O, y la reacción se incubó a 37ºC durante dos horas. Después de la digestión con BglII, se precipitó el ADN, y el sedimento de ADN se disolvió en 10 \mul de tampón de reacción SalI 10X, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción SalI, y 85 \mul de H_{2}O. La mezcla de reacción SalI resultante se incubó durante 2 horas a 37ºC. El plásmido pSV2-HPC8 digerido con SalI-BglII se cargó en un gel de poliacrilamida al 3,5% y se sometió a electroforesis hasta que el fragmento de restricción SalI- BglII de \sim1,15 kb deseado se separó de los otros productos de reacción. El fragmento de restricción SalI-BglII de \sim1,15 kb se asiló del gel; se obtuvieron aproximadamente 8 \mug del fragmento y se suspendieron en 10 \mul de tampón TE.

Se disolvieron aproximadamente 10 \mul del ADN del plásmido pSV2-\beta-globina (NRRL B-15928) en 10 \mul de tampón de reacción HindIII 10X, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción HindIII, y 85 \mul de H_{2}O, y la reacción se colocó a 37ºC durante 2 horas. Después la mezcla de reacción se hizo a 0,25 M en NaOAc, y después de la adición de dos volúmenes de etanol e incubación en un baño de etanol en hielo seco, se sedimentó el ADN por centrifugación. Se disolvió el plásmido pSV2-\beta-globina digerido con HindIII en 10 \mul de tampón BglII 10X, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BglII, y 85 \mul de H_{2}O, y la reacción se colocó a 37ºC durante dos horas. Después de la digestión con BglII, la mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa al 1%, y se separaron los fragmentos por electroforesis. El fragmento de restricción HindIII-BglII de \sim4,2 kb deseado se asiló del gel; se obtuvieron aproximadamente 5 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 10 \mul de tampón TE.

Se mezclaron entre sí dos \mul del fragmento HindIII-SalI de \sim0,29 kb del plásmido pSV2-HPC8, 2 \mul del fragmento SalI-BglII de \sim1,15 kb del plásmido pSV2-HPC8, y 2 \mul del fragmento HindIII-BglII de \sim4,2 kb del plásmido pSV2-\beta-globina y se ligaron sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 6A. El ADN ligado constituyó el plásmido pL133 deseado; se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pL133 en la Figura 9 de los dibujos adjuntos. Los transformantes E. coli K12 RR1/pL103 deseados se construyeron sustancialmente de acuerdo con el contenido del Ejemplo 6A, con la excepción de que se usó el plásmido pL133, en lugar del plásmido pSV2-HPC8, como ADN transformante.

Ejemplo 7 Construcción del Plásmido pLPC

Se disolvieron aproximadamente 20 \mug del ADN del plásmido pBLcat en 10 \mul de tampón HindIII 10X y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim100 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN del plásmido pBLcat, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pBLcat digerido con HindIII se cargó en un gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que el fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb que comprende el potenciador de BK y el promotor tardío de Ad2 se separó de los otros productos de digestión; después, se asiló el fragmento de \sim0,87 kb y se preparó para el ligamiento sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento deseado y se disolvieron en 5 \mul de tampón TE.

Se disolvieron aproximadamente 1,5 \mug del ADN del plásmido pL133 en 2 \mul de tampón HindIII 10X y 16 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. Después se diluyó el ADN a 100 \mul con tampón TE y se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternera sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2. El ADN del plásmido pL133 digerido con HindIII se extrajo dos veces con fenol y una vez con cloroformo, se precipitó con etanol, y se resuspendió en 10 \mul de tampón TE.

Se añadieron aproximadamente 5 \mul del fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb del plásmido pBLcat a los 1,5 \mul del plásmido pL133 digerido con HindIII, y después, se añadieron 1 \mul de tampón ligasa 10X, 1 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4, y 1,5 \mul de H_{2}O a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pLPC deseado. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPC en la Figura 10 de los dibujos adjuntos.

El ADN ligado se usó para transformar E. coli K12 HB101 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Las células trasformadas se sembraron en placas de agar-L que contenían ampicilina, y se examinó el ADN plasmídico de los transformantes resistentes a ampicilina por análisis con enzimas de restricción para identificar los transformantes E. coli K12 HB101/pLPC. El fragmento de restricción HindIII de \sim 0,87 kb que codifica el potenciador de BK y el promotor tardío de Ad2 podía insertarse en el plásmido pSBLcat digerido con HindIII en una de dos orientaciones, sólo una de las cuales produce el plásmido pLPC.

Ejemplo 8 Construcción de los Plásmidos pLPC4 y pLPC5

Se disolvió aproximadamente 1 \mug (1 \mul) del ADN del virus BK preparado en el Ejemplo 1 y 1 \mug del plásmido pLPC (1 \mul) en 2 \mul de tampón EcoRI 10X y 14 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. Se extrajo la mezcla de ADN del virus BK y el plásmido pLPC digerida con EcoRI una vez con fenol tamponado y una vez con cloroformo. Después, se recogió el ADN ajustando la concentración de NaCl a 0,25 M, añadiendo dos volúmenes de etanol, incubando la solución en un baño de etanol en hielo seco durante 2 minutos, y centrifugando la solución para sedimentar el ADN. Se desechó el sobrenadante, y el sedimento de ADN se aclaró con etanol al 70%, se secó, y se resuspendió en 12 \mul de tampón TE.

Se añadieron aproximadamente 13 \mul de H_{2}O Y 3 \mul de tampón ligasa 10X a la mezcla de ADN del virus BK y el plásmido pLPC digerida con EcoRI. Se añadieron dos \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante 2 horas. El ADN ligado constituyó los plásmidos deseados pLPC4 y pLPC5, que difieren sólo con respecto a la orientación del ADN del virus BK insertado. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPC4 en la Figura 11 de los dibujos adjuntos.

El ADN ligado constituyó los plásmidos pLPC4 y pLPC5 deseados y se usó para transformar células competentes de E. coli K12 HB101 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Las células transformadas se sembraron en placas de agar-L que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Los transformantes E. coli K12 HB101/pLPC4 y E. coli K12 HB101/pLPC5 se identificaron por su fenotipo resistente a ampicilina y por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico.

Ejemplo 9 Construcción de los Plásmidos pLPChyg1 y pLPChyg2

Las células de E. coli K12 RR1/pSV2hyg se obtienen del Northern Regional Research Laboratory con el número de acceso NRRL B-18039. El ADN del plásmido pSV2hyg se obtiene de las células sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pSV2hyg en la Figura 12 de los dibujos adjuntos.

Se añadieron aproximadamente 10 \mug (en 10 \mul de tampón TE) del plásmido pSV2hyg a 2 \mul de tampón BamHI 10X y 6 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (aproximadamente 20 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. La reacción se extrajo primero con fenol y después se extrajo dos veces con cloroformo. El ADN del plásmido pSV2hyg digerido con BamHI se cargó en un gel de agarosa, y se aisló el fragmento de restricción de \sim2,5 kb que contiene el gen de resistencia a higromicina sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4A.

Se añadieron aproximadamente 5 \mul de tampón Klenow 10X (0,2 mM en cada uno de los cuatro dNTP; Tris-HCl 0,5 M, pH = 7,8; MgCl_{2} 50 mM; 2-mercaptoetanol 0,1 M; y 100 \mug/ml de BSA) y 35 \mul de H_{2}O a la solución de ADN del plásmido pSV2hyg digerido con BamHI, y después, se añadieron aproximadamente 25 unidades de la enzima Klenow (aproximadamente 5 \mul, comercializado por BRL) a la mezcla de ADN, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante 30 minutos. El ADN del plásmido pSV2hyg digerido con BamHI, tratado con Klenow se extrajo una vez con fenol y una vez con cloroformo y después se precipitó con etanol. Se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 5 \mul de tampón TE.

Se añadieron aproximadamente 10 \mug (10 \mul) del ADN del plásmido pLPC a 2 \mul de tampón StuI 10X y 6 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción StuI a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pLPC digerido con StuI se precipitó con etanol, se recogió por centrifugación, y se resuspendió en 2 \mul de tampón NdeI 10X (NaCl 1,5 M; Tris-HCl 0,1 M, pH = 7,8; MgCl_{2} 70 mM; 2-mercaptoetanol 60 mM; y 1 mg/ml de BSA) y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la encima de restricción NdeI a la solución de ADN digerido con StuI, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas.

El ADN del plásmido pLPC digerido con NdeI-StuI se precipitó con etanol, se recogió por centrifugación, y se resuspendió en 5 \mul de tampón Klenow 10X y 40 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim25 unidades) de la enzima Klenow a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante 30 minutos. Después de la reacción con Klenow, la mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa, y el fragmento de restricción NdeI-StuI de \sim5,82 kb se aisló del gel. Se obtuvieron aproximadamente 5 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 5 \mul de tampón TE.

Se mezclaron aproximadamente 2 \mul de fragmento de restricción BamHI tratado con Klenow de \sim2,5 kb del plásmido pSV2hyg con aproximadamente 1 \mul del fragmento de restricción NdeI-StuI tratado con Klenow de \sim5,82 kb del plásmido pLPC, y se añadieron aproximadamente 3 \mul de tampón ligasa 10X, 2 \mul de ADN ligasa T4 (\sim1000 unidades), 1 \mul de ARN ligasa T4 (\sim1 unidad), y 14 \mul de H_{2}O a la solución de ADN. La reacción resultante se incubó a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó los plásmidos pLPChyg1 y pLPChyg2 deseados, que difieren sólo con respecto a la orientación del fragmento de restricción BamHI tratado con Klenow de \sim2,5 kb del plásmido pSV2hyg.Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPChyg1 en la Figura 13 de los dibujos adjuntos. El ADN ligado se usó para transformar E. coli K12 HB101 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Los transformantes E. coli K12 HB101/ pLPChyg1 y E. coli K12 HB101/ pLPChyg2 deseados se sembraron en placas de agar-L que contenían ampicilina y se identificaron por análisis con enzimas restricción de su ADN plasmídico.

Ejemplo 10 Construcción del Plásmido pBW32 A. Construcción del plásmido pTPA103 Intermedio

El plásmido pTPA102 comprende la secuencia codificante del activador de plasminógenos tisular humano (TPA). El plásmido pTPA102 puede asilarse de E. coli K12 MM294/pTPA102, una cepa disponible por el Northern Regional Research Laboratory con el número de acceso NRRL B-15834. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pTPA102 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. El ADN del plásmido pTPA102 se aísla de E. coli K12 MM294/pTPA102 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2.

Se añadieron aproximadamente 50 \mug del plásmido pTPA102 (en aproximadamente 50 \mul de tampón TE) a 10 \mul de tampón Tth111I 10X (NaCl 0,5 M; Tris-HCl 80 mM, pH = 7,4; MgCl_{2} 80 mM; 2-mercaptoetanol 80 mM; y 1 mg/ml de BSA) y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción Tth111I a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 65ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa, y se aisló del gel el fragmento de restricción Tth111I de \sim4,4 kb que comprende la secuencia codificante de TPA. Los otros productos de digestión, los fragmentos de restricción de 3,1 kb y 0,5 kb, se desecharon. Se obtuvieron aproximadamente 10 \mug del fragmento de restricción Tth111I de \sim4,4 kb deseado y se suspendieron en 10 \mul de tampón TE.

Se añadieron aproximadamente 5 \mul de tampón Klenow 10X y 30 \mul de H_{2}O a la solución que comprende el fragmento de restricción Tth111I de \sim4,4 kb, y después de la adición adicional de aproximadamente 5 \mul de la enzima Klenow (\sim5 unidades), la mezcla de reacción se incubó a 16ºC durante 30 minutos. Después de la reacción con Klenow, el ADN se precipitó con etanol y se resuspendió en 3 \mul de tampón ligasa 10X y 14 \mul de H_{2}O.

Los engarces BamHI (New England Biolabs), que tenían la siguiente secuencia:

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se trataron con quinasa y se prepararon para el ligamiento por el siguiente procedimiento. Se disolvieron cuatro \mul de engarces (\sim2 \mug) en 20,15 \mul de H_{2}O y 5 \mul de tampón quinasa 10X (Tris-HCl 500 mM, pH = 7,6 y MgCl_{2} 100 mM), se incubaron a 90ºC durante dos minutos, y después se enfriaron a temperatura ambiente. Se añadieron cinco \mul de \gamma-^{31}P-ATP (\sim20 \muCi), 2,5 \mul de DTT 1 M, y 5 \mul de polinucleótido quinasa (\sim10 unidades) a la mezcla, que después se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Después, se añadieron 3,35 \mul de ATP 0,01 M y 5 \mul de quinasa, y la reacción se continuó durante otros 30 minutos a 37ºC. El ATP radioactivo ayuda a determinar si los engarces se han ligado al ADN diana.

Se añadieron aproximadamente 10 \mul de los engarces BamHI tratados con quinasa a la solución del fragmento de restricción Tth111I de \sim4,4 kb, y después de la adicción de 2 \mul de ADN ligasa T4 (\sim1000 unidades) y 1 \mul de ARN ligasa T4 (\sim2 unidades), se incubó la reacción de ligamiento durante una noche a 4ºC. El ADN ligado se precipitó con etanol y se resuspendió en 5 \mul de tampón HindIII 10X y 40 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas.

El ADN digerido con HindIII se precipitó con etanol y se resuspendió en 3 \mul de tampón BamHI 10X y 90 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim100 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. Después de la digestión con BamHI, la mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa, y el fragmento de restricción BamHI-HindIII de \sim2,0 kb se aisló del gel. Se obtuvieron aproximadamente 4 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en aproximadamente 5 \mul de tampón TE.

Para construir el plásmido pTPA103, se insertó el fragmento de restricción BamHI-HindIII de \sim2,0 kb obtenido del plásmido pTPA102 en el plásmido pRC digerido con BamHI-HindIII. El plásmido pRC se construyó insertando un fragmento de restricción EcoRI-ClaI de \sim288 pb que comprende las secuencias promotora y operadora (trpPO) del operón trp de E. coli en el plásmido pKC7 digerido con EcoRI-ClaI. El plásmido pKC7 puede obtenerse de la American Type Culture Collection en E. coli K12 N100/pKC7 con el número de acceso ATCC 37084. El fragmento de restricción EcoRI-ClaI de \sim288 pb que comprende el trpPO puede aislarse del plásmido pTPA102, que puede aislarse de E. coli K12 MM294/pTPA102 (NRRL B-15834). El ADN del plásmido pKC7 y el plásmido pTPA102 puede obtenerse de las líneas celulares mencionadas anteriormente sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Este fragmento de restricción EcoRI-ClaI de \sim0,29 kb del plásmido pTPA102 comprende la secuencia de activación de la trascripción y la mayoría de la secuencia de activación de la traducción del gen trp de E. coli y tiene la secuencia representada a continuación:

\vskip1.000000\baselineskip

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De este modo, para construir el plásmido pRC, se añadieron aproximadamente 2 \mug del plásmido pKC7 en 10 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón ClaI (NaCl 0,5 M; Tris-HCl 60 mM; pH = 7,9, MgCl_{2} 60 mM; y 1 mg/ml de BSA) y 6 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción ClaI a la solución de ADN del plásmido pKC7, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pKC7 digerido con ClaI se precipitó con etanol y se resuspendió en 2 \mul de tampón EcoRI 10X y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN del plásmido pKC7 digerido con ClaI, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas.

El ADN del plásmido pKC7 digerido con EcoRI-ClaI se extrajo una vez con fenol y después dos veces con cloroformo. Después se precipitó el ADN con etanol y se resuspendió en 3 \mul de tampón ligasa 10X y 20 \mul de H_{2}O. Puede obtenerse un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pKC7 por Maniatis y col., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), página 8.

Se añadieron aproximadamente 20 \mug del plásmido pTPA102 en aproximadamente 20 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón ClaI 10X y 60 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción ClaI a la solución de ADN del plásmido pTPA102, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pTPA102 digerido con ClaI se precipitó con etanol y se resuspendió en 10 \mul de tampón EcoRI 10X y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN del plásmido pTPA102 digerido con ClaI, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas.

Se extrajo el ADN del plásmido pTPA102 digerido con EcoRI-ClaI una vez con fenol, se cargó en un gel de poliacrilamida al 7%, y se sometió a electrofóresis hasta que el fragmento de restricción EcoRI-ClaI de \sim288 pb que comprende el prpPO se separó de los otros productos de digestión. El fragmento de restricción EcoRI-ClaI de \sim288 pb se aisló del gel; se obtuvo aproximadamente 1 \mug del fragmento deseado, se suspendió en 5 \mul de tampón TE, y se añadió a la solución de ADN del plásmido pKC7 digerido con EcoRI-ClaI preparado como se ha descrito anteriormente. Después se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 a la mezcla de ADN, y la reacción de ligamiento resultante se incubó a 16ºC durante 2 horas. El AND ligado constituyó el ADN del plásmido pRC deseado.

El ADN ligado se usó para transformar células competentes de E. coli K12 HB101 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2. Las células transformadas se sembraron en placas de agar-L que contenían 100 \mug/ml de ampicilina, y los transformantes resistentes a ampicilina se exploraron por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico para identificar las colonias de E. coli K12 HB101/pRC deseadas. El ADN del plásmido pRC se obtuvo de los transformantes E. coli K12 HB101/pRC sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3.

Se añadieron aproximadamente 2 \mug del ADN del plásmido pRC en 2 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón HindIII 10X y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN del plásmido pRC, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante dos horas. El ADN del plásmido pRC digerido con HindIII se precipitó con etanol y se resuspendió en 2 \mul de tampón BamHI 10X y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pRC digerido con HindIII, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas.

El ADN del plásmido pRC digerido con BamHI-HindIII se extrajo una vez con fenol, y después dos veces con cloroformo. El ADN se precipitó con etanol y se resuspendió en 3 \mul de tampón ligasa 10X y 20 \mul de H_{2}O. Los \sim4 \mug (en \sim5 ml de tampón TE) del fragmento de restricción HindIII-BamHI de \sim2,0 kb del plásmido pTPA102 se añadieron después a la solución de ADN del plásmido pRC digerido con BamHI-HindIII. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 a la mezcla de ADN, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante 2 horas. El ADN ligado constituyó el ADN del plásmido pTPA103 deseado.

Para reducir los transformantes no deseados, el ADN ligado se digirió con la enzima de restricción NcoI, que corta el plásmido pRC pero no el plásmido pTPA103. De este modo, la digestión del ADN ligado con NcoI reduce los transformantes no deseados, porque el ADN linealizado transforma E. coli a una frecuencia menor que el ADN cerrado circular. Para digerir el ADN ligado, primero se precipitó el ADN con etanol y después se resuspendió en 2 \mul de tampón NcoI 10X (NaCl 1,5 M; Tris-HCl 60 mM, pH = 7,8; MgCl_{2} 60 mM; y 1 mg/ml de BSA) y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción NcoI a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas.

El ADN ligado y después digerido con NcoI se usó para transformar E. coli K12 RV308 (NRRL B-15624). Las células de E. coli K12 RV308 se hicieron competentes y se transformaron sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. La mezcla de transformación se sembró en placas de agar-L que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Los transformantes resistentes a ampicilina se ensayaron para sensibilidad a kanamicina, pues aunque el plásmido pRC confiere resistencia a kanamicina, el plásmido pTPA103 no lo hace. Los transformantes sensibles a kanamicina resistentes a ampicilina después se usaron para preparar el ADN plasmídico, y el ADN plasmídico se examinó por análisis con enzimas de restricción para identificar los transformantes E. coli K12 RV308/pTPA103. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pTPA103 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. El ADN del plásmido pTPA103 se aisló de células de E. coli K12 RV308/pTPA103 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3.

B. Construcción del Plásmido pBW25 Intermedio

Se añadió aproximadamente 1 \mug de ADN del plásmido pTPA103 en 1 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón BglII 10X y 16 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim5 unidades) de la enzima de restricción BglII a la solución de ADN del plásmido pTPA103, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pTPA103 digerido con BglII se precipitó con etanol y se resuspendió en 5 \mul de tampón Klenow 10X y 44 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul de la enzima Klenow (\sim1 unidad) a la solución de ADN del plásmido pTPA103 digerido con BglII, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pTPA103 digerido con BglII tratado con Klenow se precipitó con etanol y se resuspendió en 3 \mul de tampón ligasa 10X y 22 \mul de H_{2}O.

Se añadieron aproximadamente 2 \mul (0,2 \mug) de engarces NdeI no tratados con quinasa (New England Biolabs) de secuencia:

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a la solución de ADN del plásmido con pTPA103 digerido con BglII tratado con Klenow, junto con 2 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 y 1 \mul (\sim2 unidades) de ARN ligasa T4, y la reacción de ligamiento resultante se incubó a 4ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pTPA103derNdeI, que es sustancialmente similar al plásmido pTPA103, excepto en que el plásmido pTPA103derNdeI tiene una secuencia de reconocimiento NdeI donde el plásmido pTPA103 tiene una secuencia de reconocimiento BglII.

El ADN ligado se usó para transformar células competentes de E. coli K12 RV308 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Las células transformadas se sembraron en placas de agar-L que contenían ampicilina, y los transformantes E. coli K12 RV308/pTPA103derNdeI se identificaron por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico. El ADN del plásmido pTPA103derNdeI se aisló de los transformantes para usar en construcciones posteriores sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3.

Se añadieron aproximadamente 10 \mug del ADN del plásmido pTPA103derNdeI en 10 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón AvaII 10X (NaCl 0,6 M; Tris-HCl 60 mM, pH = 8,0; MgCl_{2} 0,1 M; 2-mercaptoetanol 60 mM; y 1 mg/ml de BSA) y 6 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción AvaII al ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN digerido con AvaII se cargó en un gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que el fragmento de restricción de \sim1,4 kb se separó de los otros productos de digestión. El fragmento de restricción de AvaII de \sim1,4 kb del plásmido pTPA103derNdeI se aisló del gel; se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 5 \mul de tampón TE.

Se añadieron aproximadamente 5 \mul de tampón Klenow 10X, 35 \mul de H_{2}O, y 5 \mul (\sim5 unidades) de la enzima Klenow a la solución del fragmento de restricción AvaII de \sim1,4 kb, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante treinta minutos. El ADN tratado con Klenow se precipitó con etanol y se resuspendió en 3 \mul de tampón ligasa 10X y 14 \mul de H_{2}O.

Aproximadamente 2 \mug de engarces HpaI de secuencia:

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se trataron con quinasa sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 10A. Se añadieron aproximadamente 10 \mul de engarces tratados con quinasa a la solución del fragmento de restricción AvaII de \sim1,4 kb tratado con Klenow del plásmido pTPA103derNdeI junto con 2 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 y 1 \mul (\sim1 unidad) de ARN ligasa T4, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante una noche.

El ADN ligado se extrajo una vez con fenol, se extrajo dos veces con cloroformo, se precipitó con etanol, y se resuspendió en 2 \mul de tampón EcoRI 10X y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN digerido con EcoRI se extrajo una vez con fenol, se extrajo dos veces con cloroformo, se precipitó con etanol, y se resuspendió en 3 \mul de tampón ligasa 10X y 20 \mul de H_{2}O. El fragmento, que es de aproximadamente de 770 pb de tamaño y codifica el trpPO y el amino-terminal de TPA, preparado de este modo, tenía un extremo compatible con EcoRI y un extremo romo y se ligó en el plásmido pUC19 digerido con EcoRI-SmaI para formar el plásmido pUC19TPAFE.

Se disolvieron aproximadamente 2 \mul del plásmido pUC19 (disponible por Bethesda Research Laboratories) en 2 \mul de tampón SmaI 10X (KCl 0,2 M; Tris-HCl 60 mM, pH = 8,0; MgCl_{2} 60 mM; 2-mercaptoetanol 60 mM; y 1 mg/ml de BSA) y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción SmaI a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 25ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pUC19 digerido con SmaI se precipitó con etanol, se recogió por centrifugación, y se resuspendió en 2 \mul de tampón EcoRI 10X y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN del plásmido pUC19 digerido con SmaI, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pUC19 digerido con EcoRI-SmaI se extrajo una vez con fenol, se extrajo dos veces con cloroformo, y se resuspendió en 2 \mul de tampón TE.

El ADN del plásmido pUC19 digerido con EcoRI-SmaI se añadió a la solución que contenía el fragmento de restricción de extremo romo EcoRI de \sim770 pb obtenido del plásmido pTPA103derNdeI. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 a la mezcla de ADN, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pUC19TPAFE deseado. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pUC19TPAFE en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.

El sitio de clonación múltiple del plásmido pUC19, que comprende las secuencias de reconocimiento EcoRI y SmaI utilizadas en la construcción del plásmido pUC19TPAFE, se localiza en la secuencia codificante del fragmento lacZ \alpha. La expresión del fragmento lacZ \alpha en células que contienen la mutación lacZ \DeltaM15, una mutación en el gen lacZ que codifica \beta-galactosidasa, permite a esas células expresar una molécula de \beta-galactosidasa funcional y de este modo permite a esas células hidrolizar X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido), un compuesto incoloro, a su producto de hidrólisis de color índigo. La inserción de ADN en el sitio de clonación múltiple del plásmido pUC19 interrumpe la secuencia codificante del fragmento lacZ \alpha, y las células con la mutación lacZ \DeltaM15 que presentan dicho plásmido son incapaces de hidrolizar X-Gal (se utiliza el mismo principio cuando se clona en el plásmido pUC8; véase Ejemplo 2). El ADN ligado que constituyó el plásmido pUC19TPAFE se usó para transformar células de E. coli K12 RR1\DeltaM15 (NRRL B-15440) hechas competentes para la transformación sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2.

Las células transformadas se sembraron en placas de agar-L que contenían 100 \mug/ml de ampicilina; 40 \mug/ml de X-Gal; e IPTG 1 mM. Las colonias que fallaron en mostrar el color índigo se subcultivaron y se usaron para preparar ADN plasmídico; los transformantes de E. coli K12 RR1\DeltaM15/pUC19TPAFE se identificaron por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico. El ADN del plásmido pUC19TPAFE se aisló de células de E. coli K12 RR1\DeltaM15/pUC19TPAFE para usar en construcciones posteriores sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3.

Se añadieron aproximadamente 7 \mug del plásmido pUC19TPAFE en 20 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón HpaI 10X (KCl 0,2 M; Tris-HCl 0,1 M, pH = 7,4; y MgCl_{2} 0,1 M) y 70 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 3 \mul (\sim6 unidades) de la enzima de restricción HpaI a la solución de ADN del plásmido pUC19TPAFE, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 20 minutos; se diseñó el corto periodo de reacción produciendo una digestión parcial con HpaI. La reacción se ajustó a 150 \mul de tampón BamHI 1X (NaCl 150 mM; Tris-HCl 10 mM, pH = 8,0; y MgCl_{2} 10 mM; aumentando la concentración salina se inactiva HpaI). Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim16 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN digerido parcialmente con HpaI, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 90 minutos.

El ADN del plásmido pUC19TPAFE digerido con BamHI y parcialmente con HpaI y se concentró por precipitación con etanol, se cargó en un gel de agarosa al 1,5%, y el fragmento de restricción HpaI-BamHI de \sim3,42 kb que comprende el replicón, el gen de \beta-lactamasa, y todo el ADN codificante de TPA del plásmido pUC19TPAFE se aisló del gel cortando el segmento del gel que contenía el fragmento deseado, congelando el segmento, y después extrayendo el líquido del segmento. El ADN se precipitó a partir del líquido por una precipitación con etanol. Se obtuvo aproximadamente 1 \mug del fragmento deseado y se suspendió en 20 \mul de tampón TE.

Se disolvieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pTPA103 en 10 \mul de tampón TE, en 10 \mul de tampón ScaI 10X (NaCl 1,0 M; Tris-HCl 60 mM, pH = 7,4; y MgCl_{2} 60 mM, DTT 10 mM; y 1 mg/ml de BSA) y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 3 \mul (\sim18 unidades) de la enzima de restricción ScaI a la solución de ADN del plásmido pTPA103, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 90 minutos. El volumen de reacción se ajustó a 150 \mul de tampón BamHI 1X, y se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim16 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la mezcla, que después se incubó a 37ºC durante 90 minutos. El ADN se precipitó con etanol, se recogió por centrifugación y se resuspendió en preparación para electroforesis. El ADN del plásmido pTPA103 digerido con ScaI-BamHI se cargó en un gel de agarosa al 1,5% y se sometió a electroforesis hasta que el fragmento de restricción ScaI-BamHI de \sim1,015 kb se separó de los otros productos de digestión. El fragmento de restricción ScaI-BamHI de \sim1,015 kb que comprende el ADN que codifica el carboxi-terminal de TPA del plásmido pTPA103 se aisló del gel; se obtuvieron aproximadamente 0,5 \mug del fragmento deseado y se disolvieron en 20 \mul de H_{2}O destilada en alambique de vidrio.

Se añadieron aproximadamente 2 \mul del fragmento de restricción BamHI-HpaI de \sim3,42 kb del plásmido
pUC19TPAFE a 2 \mul del fragmento de restricción ScaI-BamHI de \sim1,015 kb del plásmido pTPA103 junto con 2 \mul de tampón ligasa 10X y 1 \mul (\sim1 unidad Weiss; la ligasa se obtuvo de Promega Biotec, 2800 S. Fish Hatchery Road, Madison, WI 53711) de ADN ligasa T4, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido deseado pBW25. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBW25 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.

El ADN ligado se usó para transformar E. coli K12 JM105 (disponible por BRL) que se hicieron competentes para la transformación sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2, excepto en que se usó CaCl_{2} 50 mM en el procedimiento. Las células transformadas se sembraron en placas BHI (Difco Laboratories, Detroit, MI) que contenían 100 \mug/ml de ampicilina, y los transformantes E. coli K12 JM105/pBW25 se identificaron por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico. La digestión del plásmido pBW25 con la enzima de restricción EcoRI produce los fragmentos de restricción de \sim3,38 kb y \sim1,08 kb. El plásmido pBW25 se prepara para usar en construcciones posteriores sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3.

C. Mutagénesis Específica de Sitio de la Región Codificante de TPA y Construcción del Plásmido pBW28

Se añadieron aproximadamente 5 \mug del plásmido pBW25 en 10 \mul de H_{2}O destilada en alambique de vidrio a aproximadamente 10 \mul de tampón de reacción HindIII 10X y 80 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim20 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN del plásmido pBW25, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 90 minutos. Se añadieron aproximadamente 3 \mul (\sim24 unidades) de la enzima de restricción EcoRI y 10 \mul de Tris\cdotHCl 1 M, pH = 7,6, a la solución de ADN del plásmido pBW25 digerido con HindIII, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 90 minutos. El ADN del plásmido pBW25 digerido con EcoRI-HindIII se concentró por precipitación con etanol, se cargó en un gel de agarosa al 1,5%, y se sometió a electroforesis hasta que el fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim810 pb se separó de los otros productos de digestión. El fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim810 pb se aisló del gel, se preparó para el ligamiento, y se resuspendió en 2 \mul de H_{2}O destilada en alambique de vidrio.

Se añadieron aproximadamente 4,5 \mug de la forma replicativa (RF) de ADN de M13mp8 (disponible por New England Biolabs) en 35 \mul de H_{2}O destilada en alambique de vidrio a 10 \mul de tampón HindIII 10X y 55 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim20 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN de M13mp8, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 1 hora. Se añadieron aproximadamente 3 \mul (\sim24 unidades) de la enzima de restricción EcoRI y aproximadamente 10 \mul de Tris\cdotHCl 1 M, pH = 7,6, a la solución de ADN de M13mp8 digerido con HindIII, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 1 hora. El ADN de M13mp8 digerido con HindIII-EcoRI se recogió por precipitación con etanol, se resuspendió en preparación para electroforesis en gel de agarosa, y el fragmento de restricción grande se aisló por electroforesis en gel. Se obtuvo aproximadamente 1 \mug del fragmento de restricción EcoRI-HindIII grande de M13mp8 y se suspendió en 20 \mul de H_{2}O destilada en alambique de vidrio. Se añadieron aproximadamente 2 \mul del fragmento de restricción EcoRI-HindIII grande de M13mp8, 2 \mul de tampón ligasa 10X, 12 \mul de H_{2}O y \sim1 \mul (\sim1 unidad Weiss) de ADN ligasa T4 a 3 \mul del fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim810 pb del plásmido pBW25, y la reacción de ligamiento resultante se incubó a 16ºC durante una noche.

Las células de E. coli JM103, disponibles por BRL, se hicieron competentes y se transfectaron con la mezcla de ligamiento sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el BRL M13 Cloning/'Dideoxi' Sequencing Instruction Manual, excepto en que se varió la cantidad de ADN usada por transfección. Se identificaron placas recombinantes por inactivación de inserción del gen que codifica el fragmento \alpha de \beta-galactosidasa, que da como resultado una pérdida de la capacidad para escindir X-gal a su producto escindido de color índigo. Para propósitos de exploración, se cogieron seis placas blancas en 2,5 ml de caldo-L, al que se le añadió 0,4 ml de E. coli K12 JM103, cultivado en solución madre de medio mínimo para asegurar la retención del episoma F que lleva proAB, en la fase de crecimiento logarítmica. Las soluciones que contienen placas se incubaron en un agitador de aire a 37ºC durante 8 horas. Se sedimentaron las células de alícuotas de 1,5 ml y se aisló el ADN RF sustancialmente de acuerdo con el procedimiento de miniexploración alcalina de Birnboim y Doly, 1979, Nuc. Acids Res. 7:1513. Los restos de cada cultivo se guardaron a 4ºC para almacenarlos. El fago deseado, denominado pM8BW26, contenía el fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim810 pb del plásmido pBW25 ligamiento al fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim7,2 kb de M13mp8.

Se infectaron aproximadamente cincuenta ml de E. coli K12 JM103 en fase logarítmica con pM8BW26 y se incubaron en un agitador de aire a 37ºC durante 18 horas. Las células infectadas se sedimentaron por centrifugación a baja velocidad, y se preparó el ADN de pM8BW26 de cadena simple a partir del sobrenadante del cultivo aumentando a escala el procedimiento dado en el manual de instrucciones. Se mutagenizó pM8BW26 de cadena simple sustancialmente de acuerdo con el contenido de Adelman y col., 1983, DNA 2(3): 183-193, excepto en que la reacción con Klenow se hizo a temperatura ambiente durante 30 minutos, después a 37ºC durante 60 minutos, después a 10ºC durante 18 horas. Además, el tratamiento con S1 se hizo a 20ºC, la concentración salina del tampón fue la mitad que la recomendada por el fabricante, y se usó el cebador de secuenciación M13 (BRL). El cebador de oligodesoxirribonucleótidos sintético usado para delecionar la secuencia codificante de los restos de aminoácidos 87 a 261 de TPA nativo fue

5'-GGGAAGTGCTGTGAAATATCCACCTGCGGCCTGAGA-3'

Se usó la mezcla de mutagénesis resultante para transfectar E. coli K12 JM103 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento de infección descrito anteriormente. Los mutantes deseados se identificaron por análisis con enzimas de restricción del ADN RF y por secuenciación de ADN de Maxam y Gilbert. El mutante deseado, que tenía la secuencia codificante de los restos de aminoácidos 87 a 261 de TPA nativa delecionada, se denominó pM8BW27.

Para construir el plásmido pBW28, se necesitan una diversidad de fragmentos de ADN. El primero de estos fragmentos se obtuvo añadiendo \sim20 \mug de ADN RF de pM8BW27 en 20 \mul de H_{2}O destilada en alambique de vidrio a 10 \mul de tampón NdeI 10X y 60 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción NdeI a la mezcla de ADN del plásmido pM8BW27, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante dos horas. El ADN del plásmido pM8BW27 digerido con NdeI se precipitó con etanol, se recogió por centrifugación, y se resuspendió en 10 \mul de tampón EcoRI 10X y 90 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN del plásmido pM8BW27 digerido con NdeI, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pM8BW27 digerido con EcoRI-NdeI se sometió a electroforesis en un gel de agarosa hasta que el fragmento de restricción NdeI-EcoRI de \sim560 pb, que contiene la porción de secuencia codificante de TPA que abarca el sitio de deleción, se separó de los otros productos de digestión. El fragmento de restricción NdeI-EcoRI de \sim560 pb se aisló del gel; se obtuvieron aproximadamente 0,5 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 20 \mul de H_{2}O destilada en alambique de vidrio.

El segundo fragmento necesario para construir el plásmido pBW28 sintetizando una cadena cada vez en un sintetizador de ADN automatizado. Las dos cadenas complementarias, que hibridarán para formar un segmento de ADN de cadena doble con solapamientos XbaI y NdeI, se tratan con quinasa y se hibridan sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 6A. El engarce tiene la siguiente estructura:

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El tercer fragmento necesario para construir el plásmido pBW28 se preparó añadiendo \sim20 \mug del plásmido pTPA103 en 20 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón BamHI 10X y 60 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pTPA103, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pTPA103 digerido con BamHI se precipitó con etanol, se recogió por centrifugación, y se resuspendió en 10 \mul de tampón EcoRI 10X y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción de EcoRI a la solución de ADN del plásmido pTPA103 digerido con BamHI, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pTPA103 digerido con BamHI-EcoRI se cargó en un gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que el fragmento de restricción EcoRI-BamHI de \sim689 pb que comprende la secuencia codificante del carboxi-terminal de TPA, se separó de los otros productos de digestión. Se aislaron del gel aproximadamente 0,5 \mug del fragmento de \sim689 pb y después se resuspendieron en 10 \mul de H_{2}O destilada en alambique de vidrio.

El fragmento final necesario para construir el plásmido pBW28 se aisló del plásmido pL110. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pL110 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos, y la construcción del plásmido pL110 se describe en el Ejemplo 10d, la siguiente sección del presente Ejemplo.

Se añadieron aproximadamente 25 \mug del plásmido pL110 en 25 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón XbaI 10X (NaCl 0,5 M; Tris-HCL 60 mM, pH = 7,9; MgCl_{2} 60 mM; y 1 mg/ml de BSA) y 55 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción XbaI a la solución de ADN del plásmido pL110, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pL110 digerido con XbaI se precipitó con etanol, se recogió por centrifugación, y se resuspendió en 10 \mul de tampón BamHI 10X y 89 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim5 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pL110 digerido con XbaI, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 30 minutos para obtener una digestión parcial con BamHI. El ADN del plásmido pL110 digerido con XbaI y parcialmente con BamHI se cargó en un gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que el fragmento XbaI-BamHI de \sim6,0 kb se separó claramente de los otros productos de digestión. El fragmento de restricción de \sim 6,0 kb se aisló del gel; se obtuvieron aproximadamente 0,5 \mug del fragmento de restricción XbaI-BamHI de \sim6,0 kb y se suspendieron en aproximadamente 40 \mul de H_{2}O destilada en alambique de vidrio. Este fragmento de restricción XbaI-BamHI de \sim6,0 kb comprende todo el plásmido pL110 excepto el ADN que codifica EK-BGH.

Para construir el plásmido pBW28, los siguientes fragmentos se mezclan entre si: aproximadamente 0,1 \mug (\sim8 \mul) del fragmento de restricción BamHI-XbaI de \sim6,0 kb del plásmido pL110; aproximadamente 0,05 \mug (\sim2 \mul) del fragmento de restricción NdeI-EcoRI de \sim560 pb del plásmido pM8W27; aproximadamente 0,1 \mug (\sim2 \mul) del fragmento de restricción EcoRI-BamHI de \sim689 pb del plásmido pTPA103; y aproximadamente 0,02 \mug (\sim1 \mul) del engarce sintético XbaI-NdeI de \sim45 pb. Se añaden aproximadamente 2 \mug de tampón ligasa 10X y 1\mul (\sim1 unidad Weiss) de ADN ligasa T4 a la mezcla de ADN, y la mezcla de ligamiento resultante se incuba a 4ºC por la noche durante 2 horas. El ADN ligado constituyó el plásmido pBW28 deseado. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBW28 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.

El ADN ligado se usó para transformar E. coli K12 MM94 (NRRL B-15625) hechas competentes sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2, excepto en que se usó CaCl_{2} 50 mM en el procedimiento. Debido a la presencia del promotor pL lambda y el gen que codifica el represor pL lambda sensible a temperatura en el plásmido pBW28, el procedimiento de transformación y cultivo de los transformantes se variaron algo. Las células no se expusieron a temperaturas mayores de 32ºC durante la transformación y el cultivo posterior. La siguiente sección de este Ejemplo se refiere con más detalle a los procedimientos para manipular los plásmidos que codifican el promotor pL lambda y su represor sensible a temperatura. Los transformantes E. coli K12 MM294/pBW28 deseados se identificaron por su fenotipo resistente a tetraciclina, sensible a ampicilina y por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico.

D. Construcción del Plásmido pL110

El plásmido pL110 se construyó usando el plásmido pKC283 como material de partida. Los liofilizados de E. coli K12 BE1201/pKC283 se obtienen del NRRL con el número de acceso NRRL B-15830. Los liofilizados se decantan en tubos que contienen 10 ml de caldo-L y se incuban dos horas a 32ºC, al tiempo que se hacen los cultivos a 50 \mug/ml en ampicilina y después se incuban a 32ºC durante una noche. Las células de E. coli K12 BE1201/pKC283 se cultivaron a 32ºC, porque el plásmido pKC283 comprende el promotor pL y porque las células de E. coli K12 BE1201 comprende un gen represor cI sensible a temperatura integrado en el ADN celular. Cuando se utilizan en este procedimiento de aislamiento de plásmido células que comprenden un gen represor pL lambda de tipo silvestre o células que no comprenden un promotor pL lambda, como se describe en Ejemplos posteriores en este documento, la temperatura de incubación es 37ºC.

Una pequeña porción del cultivo de una noche se coloca en placas de agar-L que contienen 50 \mug/ml de ampicilina de un modo que se obtenga una colonia única aislada de E. coli K12 BE1201/pKC283. La colonia única obtenida se inoculó en 10 ml de caldo-L que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se incubó durante una noche a 32ºC con agitación vigorosa. Los 10 ml de cultivo de una noche se inocularon en 500 ml de caldo-L y se incubaron a 32ºC con agitación vigorosa hasta que el cultivo alcanzó la fase estacionaria. Después se preparó el ADN del plásmido pKC283 a partir de las células sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Se obtuvo aproximadamente 1 mg del plásmido pKC283 y se guardó a 4ºC en tampón TE a una concentración de aproximadamente 1 \mug/\mul. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pKC283 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.

Se mezclaron aproximadamente 10 \mul (\sim10 \mug) del ADN del plásmido pKC283 con 20 \mul de tampón de restricción de contenido salino medio 10X (NaCl 500 mM; Tris-HCl 100 mM, pH = 7,5; MgCl_{2} 100 mM; y DTT 10 mM), 20 \mul de BSA a 1 mg/ml, 5 \mul de la enzima de restricción PvuII (\sim25 unidades), y 145 \mul de agua, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. Las reacciones con enzimas de restricción descritas en este documento se interrumpieron de forma rutinaria por extracciones con fenol y después con cloroformo, que se siguieron por precipitación del ADN, lavado con etanol, y resuspensión del ADN en tampón TE. Después de interrumpir la digestión con PvuII como se ha descrito anteriormente, el ADN del plásmido pKC283 digerido con PvuII se precipitó y después se suspendió en 5 \mul de tampón TE.

Se trataron con quinasa aproximadamente 600 picomoles (pM) de engarces XhoI (5'-CCTCGAGG-3') en una mezcla que contenía 10 \mul de tampón quinasa 5X (Tris-HCl 300 mM, pH = 7,8; MgCl_{2} 50 mM; y DTT 25 mM), 5 \mul de ATP 5 mM, 24 \mul de H_{2}O, 0,5 \mul de polinucleótido quinasa T4 (aproximadamente 2,5 unidades como se define por P-L Biochemicals), 5 \mul de BSA a 1 mg/ml, y 5 \mul de espermidina 10 mM incubando la mezcla a 37ºC durante 30 minutos. Se añadieron aproximadamente 12,5 \mul de los engarces XhoI tratados con quinasa a los 5 \mul de ADN del plásmido pKC283 digerido con PvuII, y después, se añadieron 2,5 \mul de tampón ligasa 10X, 2,5 \mul (aproximadamente 2,5 unidades como se define por P-L Biochemicals) de ADN ligasa T4, 2,5 \mul de espermidina 10 mM, y 12,5 \mul de agua al ADN. La reacción de ligamiento resultante se incubó a 4ºC durante una noche. Después de la reacción de ligamiento, la mezcla de reacción se ajustó para tener la composición de tampón de alto contenido salino (NaCl 0,1 M; Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5; MgCl_{2} 10,0 mM; y DTT 1 mM). Se añadieron aproximadamente 10 \mul (100 unidades) de la enzima de restricción XhoI a la mezcla, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2
horas.

Se interrumpió la reacción, y se precipitó el ADN digerido con XhoI, se resuspendió, y se ligó como se ha descrito anteriormente, excepto en que no se añadieron engarces XhoI a la mezcla de ligamiento. El ADN ligado constituyó el plásmido pKC283PX deseado. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pKC283PX en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.

E. coli K12 MO(\lambda^{+}), disponible por el NRRL con el número de acceso NRRL B-15993, comprende el gen represor pL lambda de tipo silvestre, de modo que no sucede la transcripción a partir del promotor pL lambda en células de E. coli K12 MO(\lambda^{+}). Se aíslan colonias únicas de E. coli K12 MO(\lambda^{+}), y se prepara un cultivo de una noche de 10 ml de células; no se usa ampicilina en el medio de cultivo. Se usaron cincuenta \mul del cultivo de una noche para inocular 5 ml de caldo-L, que también contenía MgSO_{4} 10 mM y MgCl_{2} 10 mM. El cultivo se incubó a 37ºC durante una noche con agitación vigorosa. La siguiente mañana, se diluyó el cultivo a 200 ml con caldo-L que contenía MgSO_{4} 10 mM y MgCl_{2} 10 mM. El cultivo diluido se incubó a 37ºC con agitación vigorosa hasta que la D.O._{590} fue de aproximadamente 0,5, que indicaba una densidad celular de aproximadamente 1 x 10^{8} células/ml. Se enfrió el cultivo durante diez minutos en un baño de agua enfriada con hielo, y después se recogieron las células por centrifugación a 4000 Xg durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento celular se resuspendió en 100 ml de NaCl 10 mM frío y después se re-sedimentó inmediatamente por centrifugación. El sedimento celular se resuspendió en 100 ml de CaCl_{2} 30 mM y se incubó en hielo durante 20 minutos.

Las células se recogieron de nuevo por centrifugación y se resuspendieron en 10 ml de CaCl_{2} 30 mM. Se añadió una alícuota de medio ml de las células al ADN ligado preparado anteriormente; el ADN se había hecho 30 mM en CaCl_{2}. La mezcla célula-ADN se incubó en hielo durante una hora, se sometió a choque térmico a 42ºC durante 90 segundos, y después se enfrió en hielo durante aproximadamente dos minutos. La mezcla célula-ADN se diluyó en 10 ml de medio LB en matraces de 125 ml y se incubó a 37ºC durante una hora. Se sembraron alícuotas de cien \mul en placas de agar-L que contenían ampicilina y se incubaron a 37ºC hasta que aparecieron las colonias.

Las colonias se cultivaron individualmente, y el ADN plasmídico de las colonias individuales se examinó por análisis con enzimas de restricción y electroforesis en gel. El aislamiento de ADN plasmídico se realizó en una escala menor de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3, pero la etapa de gradiente de CsCl se omitió hasta que se identificaron los transformantes E. coli K12 MO(\lambda^{+})/pKC283PX deseados. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pKC283PX en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.

Se disolvieron diez \mug del ADN del plásmido pKC283PX en 20 \mul de tampón de alto contenido salino 10X, 20 \mul de BSA a 1 mg/ml, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BglII, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción XhoI, y 150 \mul de agua, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante dos horas. Se paró la reacción; se precipitó el ADN digerido con BglII-XhoI, y el ADN se resuspendió en 5 \mul de tampón TE.

Se sintetizó un engarce de ADN con extremos de ADN de cadena simple característicos de escisión con las enzimas de restricción BglII y XhoI usando un sintetizador de ADN automatizado y se trató con quinasa como se ha descrito en el Ejemplo 6A. El engarce de ADN tenía la siguiente estructura:

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El engarce y el plásmido pKC283PX digerido con BglII-XhoI se ligaron sustancialmente de acuerdo con el procedimiento de ligamiento descrito anteriormente. El ADN ligado constituyó el plásmido pKC283-L deseado. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pKC283-L en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. El ADN del plásmido pKC283-L se usó para transformar E. coli K12 MO(\lambda^{+}), y los transformantes de E. coli K12 MO(\lambda^{+})/pKC283-L resultantes se identificaron por su fenotipo resistente a ampicilina y por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico.

Se disolvieron aproximadamente 10 \mug del ADN del plásmido pKC283-L en 20 \mul de tampón de alto contenido salino 10X, 20 \mul de BSA a 1 mg/ml, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción XhoI, y 155 \mul de H_{2}O, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante dos horas. El ADN del plásmido pKC283-L digerido con XhoI se precipitó después y se resuspendió en 2 \mul de tampón de traslado de mella 10X (Tris-HCl 0,5 M, pH = 7,2; MgSO_{4} 0,1 M; y DTT 1 mM), 1 \mul de una solución 2 mM de cada uno de los desoxinucleótidos trifosfato, 15 \mul de H_{2}O, 1 \mul (\sim6 unidades como se define por P-L Biochemicals) de Klenow, y 1 \mul de BSA a 1 mg/ml. La reacción resultante se incubó a 25ºC durante 30 minutos; la reacción se paró incubando la solución a 70ºC durante cinco minutos.

Los engarces BamHI (5'-CGGGATCCCG-3') se trataron con quinasa y se ligaron al ADN del plásmido pKC283-L tratado con Klenow, digerido con XhoI sustancialmente de acuerdo con los procedimientos de ligamiento de engarces descritos anteriormente. Después de la reacción de ligamiento, se digirió el ADN con aproximadamente 100 unidades de BamHI durante aproximadamente 2 horas a 37ºC en tampón de alto contenido salino. Después de la digestión con BamHI, se preparó el ADN para el ligamiento, y se circularizó el fragmento de restricción BamHI de \sim5,9 kb por ligamiento y se transformó en E. coli K12 MO(\lambda^{+}) sustancialmente de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. Se identificaron los transformantes E. coli K12 MO(\lambda^{+})/pKC283-LB, y después, se preparó el ADN del plásmido pKC283-LB de los transformantes sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pKC283-LB en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.

Se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pKC283PX con la enzima de restricción SalI en tampón de alto contenido salino, se trató con Klenow, y se ligó a engarces EcoRI (5'-GAGGAATTCCTC-3') sustancialmente de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. Después de la digestión con la enzima de restricción EcoRI, que dio como resultado la escisión de \sim2,1 kb de ADN, se circularizó el fragmento de restricción EcoRI de \sim 4,0 kb por ligamiento produciendo el plásmido pKC283PRS. El ADN ligado se usó para transformar E. coli K12 MO(\lambda^{+}), y después de identificar los transformantes E. coli K12 MO(\lambda^{+})/pKC283PRS, se preparó el ADN del plásmido pKC283PRS de los transformantes sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pKC283PRS en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.

Se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pKC283PRS en 200 \mul de tampón de alto contenido salino con aproximadamente 50 unidades de cada una de las enzimas de restricción PstI y SphI. Después de incubar la reacción a 37ºC durante aproximadamente 2 horas, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en un gel de agarosa de baja temperatura de gelificación al 0,6% (FMC Corporation, Marine Colloids Division, Rockland, Maine 04841) durante 2-3 horas a \sim130 V y \sim75 mA en tampón Tris-Acetato.

Se tiñó el gel en una solución diluida de bromuro de etidio, y la banda de ADN que constituía el fragmento de restricción PstI-SphI de \sim0,85 kb, que se visualizó con luz de longitud de onda UV, se cortó del gel en un pequeño segmento. El volumen del segmento se determinó por el peso y la densidad del segmento, y se añadió un volumen igual de Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, al tubo que contenía el segmento. Después se fundió el segmento por incubación a 72ºC. Se obtuvo aproximadamente 1 \mug del fragmento de restricción PstI-SphI de \sim0,85 kb del plásmido pKC283PRS en un volumen de aproximadamente 100 \mul. De manera análoga, se digirió el plásmido pKC283-LB con las enzimas de restricción PstI y SphI, y el fragmento de restricción de \sim3,0 kb resultante se aisló por electroforesis en gel de agarosa y se preparó para el ligamiento.

El fragmento de restricción PstI-SphI de \sim0,85 kb del plásmido pKC283PRS se ligó al fragmento de restricción PstI-SphI de \sim3,0 kb del plásmido pKC283-LB. El ADN ligado constituyó el plásmido pL32 deseado. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pL32 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. El plásmido pL32 se trasformó en células de E. coli K12 MO(\lambda^{+}); el ADN del plásmido pL32 se preparó de los transformantes E. coli K12 MO(\lambda^{+})/pL32 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. El análisis del ADN del plásmido pL32 demostró que más de un engarce EcoRI se unió los extremos SalI tratados con Klenow del plásmido pKC283PX. La presencia de más de un engarce EcoRI no afecta a la utilidad del plásmido pL32 o derivados del plásmido pL32 y puede detectarse por la presencia de un sitio de restricción XhoI, que se genera cuando dos o más engarces EcoRI se ligan entre sí.

El plásmido pCC101 se describe en Schoner y col., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 5403-54047. Schoner y col., se refieren al plásmido pCC101 como plásmido pCZ101. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pCC101 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. Para aislar el ADN que codifica EK-BGH, se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pCC101 en 200 \mul de tampón de alto contenido salino que contenía aproximadamente 50 unidades de cada una de las enzimas de restricción XbaI y BamHI. Los productos de digestión se separaron por electroforesis en gel de agarosa, y se aisló del gel el fragmento de restricción XbaI-BamHI de \sim0,6 kb que codifica EK-BGH y se preparó para el ligamiento.

El plásmido pL32 también se digirió con las enzimas de restricción XbaI y BamHI, y se asiló el fragmento de restricción de \sim3,9 kb y se preparó para el ligamiento. El fragmento de restricción XbaI-BamHI de \sim3,9 kb del plásmido pL32 se ligó al fragmento de restricción XbaI-BamHI de \sim0,6 kb del plásmido pCC101 produciendo el plásmido pL47. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pL47 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. El plásmido pL47 se transformó en E. coli K12 MO(\lambda^{+}), y se identificaron los transformantes E. coli K12 MO(\lambda^{+})/pL47. El ADN del plásmido pL47 se preparó de los transformantes sustancialmente de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 3.

El plásmido pPR12 comprende el gen represor pL sensible a temperatura cI857 y el plásmido pBR322 el gen que confiere resistencia a tetraciclina. El plásmido pPR12 se describe y reivindica en la Patente de EEUU Nº 4.436.815, expedida el 13 de marzo de 1984. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pPR12 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.

Se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pPR12 con aproximadamente 50 unidades de la enzima de restricción EcoRI en 200 \mul de tampón de alto contenido salino a 37ºC durante dos horas. El ADN del plásmido pPR12 digerido con EcoRI se precipitó y después se trató con Klenow sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Después de la reacción con Klenow, el ADN del plásmido pPR12 tratado con Klenow, digerido con EcoRI se recircularizó por ligamiento, y el ADN ligado, que constituyó el plásmido pPR12\DeltaR1 deseado, se usó para
transformar E. coli K12 RV308 (NRRL B-15624); los transformantes se seleccionaron en base a resistencia a tetraciclina (10 \mug/ml). Después de identificar los transformantes E. coli K12 RV308/ pPR12\DeltaR1, el ADN del plásmido pPR12\DeltaR1 se preparó de los transformantes sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3.

Se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pPR12\DeltaR1 con aproximadamente 50 unidades de la enzima de restricción AvaI en 200 \mul de tampón de contenido salino medio a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pPR12\DeltaR1 digerido con AvaI se precipitó y después se trató con Klenow. Después de la reacción con Klenow, el ADN del plásmido pPR12\DeltaR1 tratado con Klenow, digerido con AvaI se ligó a engarces EcoRI (5'-GAGGAATTCCTC-3'), se precipitó, se resuspendió en aproximadamente 200 \mul de tampón de alto contenido salino que contenía aproximadamente 50 unidades de la enzima de restricción EcoRI, y se incubó a 37ºC durante aproximadamente 2 horas. Después de la digestión con EcoRI, la mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa de bajo punto de fusión, y se purificó del gel el fragmento de restricción EcoRI de \sim5,1 kb y se recircularizó por ligamiento produciendo el plásmido pPR12AR1 deseado. El ADN del plásmido pPR12AR1 se transformó en E. coli K12 RV308; la selección de los transformantes se basó en la resistencia a tetraciclina. El ADN del plásmido pPR12AR1 se preparó de los transformantes sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pPR12AR1 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.

Se suspendieron aproximadamente 10 \mug del ADN del plásmido pPR12AR1 en aproximadamente 200 ml de tampón de alto contenido salino que contenía aproximadamente 50 unidades de cada una de las enzimas de restricción PstI y EcoRI, y la reacción de digestión se incubó a 37ºC durante aproximadamente 2 horas. Esta mezcla de reacción después se cargó en un gel de agarosa, y se aisló el fragmento de restricción PstI-EcoRI de \sim2,9 kb del plásmido pPR12AR1 y se preparó para el ligamiento.

Se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pL47 con las enzimas de restricción PstI y BamHI en 200 \mul de tampón de alto contenido salino a 37ºC durante dos horas. El ADN digerido con PstI-BamHI se cargó en un gel de agarosa, y se aisló el fragmento de restricción PstI-BamHI de \sim2,7 kb que comprendía el origen de replicación y una porción del gen que confiere resistencia a ampicilina y se preparó para el ligamiento. En una reacción por separado, se digirieron aproximadamente 10 \mug del ADN del plásmido pL47 con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI en 200 \mul de tampón de alto contenido salino a 37ºC durante dos horas, y se aisló el fragmento de restricción EcoRI-BamHI de \sim1,03 kb que comprendía la secuencia de activación de la transcripción pL lambda, la secuencia de activación de la traducción lpp de E. coli, y el ADN que codifica EK-BGH y se prepararon para el ligamiento.

Los fragmentos de restricción PstI-BamHI de \sim2,7 kb y EcoRI-BamHI de \sim1,03 kb del plásmido pL47 se ligaron al fragmento de restricción PstI-EcoRI de \sim2,9 kb del plásmido pPR12AR1 para construir el plásmido pL110, y el ADN ligado se usó para transformar E. coli K12 RV308. Se uso la resistencia a tetraciclina como base para seleccionar los transformantes.

Hay dos sitios de reconocimiento de la enzima de restricción PstI en la región que codifica EK-BGH que no se representa en los mapas de sitios de restricción y función mostrados en los dibujos adjuntos. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pL110 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.

E. Construcción Final del Plásmido pBW32

Se disolvieron aproximadamente 10 \mug del ADN del plásmido pSV2-\beta-globina (NRRL B-15928) en 10 \mul de tampón de reacción HindIII 10X, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción HindIII, y 85 \mul de H_{2}O, y la reacción se colocó a 37ºC durante 2 horas. Después la mezcla de reacción se hizo 0,15 M en LiCl, y después de la adición de 2,5 volúmenes de etanol e incubación en un baño de etanol en hielo seco, se sedimentó el ADN por centrifugación.

El sedimento de ADN se disolvió en 10 \mul de tampón BglII 10X, 5\mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BglII, y 85 \mul de H_{2}O, y la reacción se colocó a 37ºC durante dos horas. Después de la digestión con BglII, la mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa al 0,85%, y los fragmentos se separaron por electroforesis. El gel se visualizó usando bromuro de etidio y luz ultravioleta, y la banda que contenía el fragmento HindIII-BglII de \sim4,2 kb
se escindió del gel como se ha descrito previamente. El sedimento se resuspendió en 10 \mul de H_{2}O y constituyó \sim5 \mug del fragmento de restricción HindIII-BglII de \sim4,2 kb deseado del plásmido pSV2-\beta-globina. Se aisló el fragmento de restricción HindIII-BamHI de \sim2,0 kb del plásmido pTPA103 que codifica TPA del plásmido pTPA103 sustancialmente de acuerdo con el contenido anterior. Se obtuvieron aproximadamente 5 \mug del fragmento de restricción HindIII-BamHI de \sim2,0 kb del plásmido pTPA103, se suspendieron en 10 \mul de H_{2}O, y se guardaron a -20ºC.

Se mezclaron entre sí dos \mul del fragmento de restricción BglII-HindIII de \sim4,2 kb del plásmido pSV2-\beta-globina y 4 \mul del fragmento de HindIII-BamHI de \sim2,0 kb del plásmido pTPA103 y después se incubaron con 2 \mul de tampón ligasa 10X, 11 \mul de H_{2}O, y 1 \mul de ADN ligasa T4 (\sim500 unidades) a 4ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pTPA301 deseado; se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. El ADN ligado se usó para transformar células de E. coli K12 RR1 (NRRL B-15210) hechas competentes para transformación sustancialmente de acuerdo con el contenido del Ejemplo 3. El ADN plasmídico se obtuvo
de los transformantes E. coli K12 RR1/pTPA301 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3.

El plásmido pSV2-dhfr comprende un gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) para selección de células eucariotas transformadas y amplificación de ADN unido de manera covalente al gen dhfr. Se mezclaron diez \mug del plásmido pSV2-dhfr (aislado de E. coli K12 HB101/pSV2-dhfr, ATCC 37146) con 10 \mul de tampón PvuII 10X, 2 \mul (\sim20 unidades) de la enzima de restricción PvuII, y 88 \mul de H_{2}O, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante dos horas. Se interrumpió la reacción por extracciones con fenol y cloroformo, y después, el ADN del plásmido pSV2-dhfr digerido con PvuII se precipitó y se recogió por centrifugación.

Los engarces BamHI (5'-CGGATCCCG-3') se trataron con quinasa y se prepararon para el ligamiento por el siguiente procedimiento. Se añadieron a 1 \mug de engarce en 5 \mul de H_{2}O: 10 \mul de sales de quinasa 5X (Tris-HCl 300 mM, pH = 7,8; MgCl_{2} 50 mM; y DTT 25 mM), 5 \mul de ATP 5 mM, 5 \mul de BSA (1 mg/ml), 5 \mul de espermidina 10 mM, 19 \mul de H_{2}O, y 1 \mul de polinucleótido quinasa (10 unidades/\mul). Esta reacción después se incubó a 37ºC durante 60 minutos y se guardó a -20ºC. Se mezclaron cinco \mul (\sim5 \mug) del plásmido pSV2-dhfr digerido con PvuII y 12 \mul (\sim0,25 \mug) de los engarces BamHI tratados con quinasa y se incubaron con 11 \mul de H_{2}O, 2 \mul de tampón ligasa 10X, y 1 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 a 16ºC durante una noche.

Se añadieron diez \mul de tampón de reacción BamHI 10X, 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BamHI, y 48 \mul de H_{2}O a la mezcla de reacción de ligamiento, que después se incubó a 37ºC durante 3 horas. La reacción se cargó en un gel de agarosa al 1%, y se aisló del gel el fragmento de \sim1,9 kb deseado, que comprende el gen dhfr. Todas las adiciones de engarce realizadas en estos Ejemplos se purificaron de manera rutinaria en un gel de agarosa para reducir la probabilidad de secuencias de engarces múltiples en el vector final. Los \sim3 \mug del fragmento obtenido se suspendieron en 10 \mul de tampón TE.

A continuación, se digirieron aproximadamente 15 \mul (\sim1 \mug) del plásmido pTPA301 con la enzima de restricción BamHI como se ha mostrado anteriormente. Esta digestión con BamHI genera un ADN lineal del plásmido pTPA301 porque hay un único sitio BamHI en el plásmido pTPA301. El plásmido pTPA301 digerido con BamHI se precipitó con etanol y se resuspendió en 94 \mul de H_{2}O y se trató con fosfatasa usando 1 \mul de fosfatasa alcalina intestinal de ternera (Collaborative Research, Inc., 128 Spring Street, Lexington, MA 02173), y 5 \mul de Tris-HCl 1 M, pH = 9,0, a 65ºC durante 45 minutos. El ADN se extrajo con fenol:cloroformo, después se extrajo con cloroformo:alcohol de isoamilo, se precipitó con etanol, y se resuspendió en 20 \mul de H_{2}O. Se añadieron diez \mul (\sim0,25 \mug) del plásmido pTPA301 tratado con fosfatasa a 5 \mul del fragmento de restricción BamHI que contenía el gen dhfr (\sim1,5 \mug), 3 \mul de tampón ligasa 10X, 3 \mul (\sim1500 unidades) de ADN ligasa T4, y 9 \mul de H_{2}O. Esta reacción de ligamiento se incubó a 15ºC durante una noche; el ADN ligado constituyó el ADN del plásmido pTPA303 deseado.

El plásmido pTPA303 se usó para transformar E. coli K12 RR1 (NRRL B-15210), y los transformantes E. coli K12 RR1/pTPA303 resultantes se identificaron por su fenotipo resistente a ampicilina y por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico. El plásmido pTPA303 se aisló de los transformantes sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3.

Para aislar el fragmento de restricción EcoRI-BglII de \sim2,7 kb que codifica el replicón pBR322 y el gen de \beta-lactamasa del plásmido pTPA301, se digieren aproximadamente 10 \mug del plásmido pTPA301 para completar un volumen de reacción total de 400 \mul con 20 unidades de la enzima de restricción BglII en tampón BglII 1X a 37ºC. Después de la digestión con BglII, se ajusta la concentración de Tris-HCl a 110 mM, y se añaden 20 unidades de la enzima de restricción EcoRI al ADN digerido con BglII. El ADN digerido con EcoRI-BglII se carga en un gel de agarosa y se somete a electroforesis hasta que el fragmento de restricción EcoRI-BglII de \sim2,7 kb se separa de los otros productos de digestión, y después, se aísla el fragmento de \sim2,7 kb y se prepara para el ligamiento.

Para aislar un fragmento de restricción que comprende el gen dhfr, se digirió doblemente el plásmido pTPA303 con las enzimas de restricción HindIII y EcoRI, y se aisló y recuperó el fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim2340 pb que comprende el gen dhfr.

Para aislar el fragmento de restricción HindIII-SstI de \sim2 kb del plásmido pTPA303 que comprende la región codificante del carboxi-terminal de TPA y el promotor de SV40, se digirió doblemente el plásmido pTPS303 con las enzimas de restricción HindIII y SstI en tampón HindIII 1X. Se aisló del gel el fragmento de \sim1,7 kb y se preparó para el ligamiento.

Para aislar el fragmento de restricción XhoII (compatible para ligamiento con el solapamiento BglII)-SstI de \sim680 pb del plásmido pBW28 que comprende la región codificante del amino-terminal de TPA modificado, se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pBW28 con la enzima XhoII hasta que se completó la reacción en tampón XhoII 1X (Tris-HCl 0,1 M, pH = 8,0; MgCl_{2} 0,1 M; Triton X-100 al 0,1%, y 1 mg/ml de BSA). El ADN digerido con XhoII se recuperó por precipitación con etanol y posteriormente se digirió hasta completar la reacción con la enzima SstI. El ADN digerido con XhoII-SstI se cargó en un gel de acrilamida, y el fragmento deseado se aisló del gel y se preparó para el ligamiento.

Se ligaron entre sí aproximadamente 0,1 \mug de cada uno de los fragmentos anteriores: el fragmento de restricción EcoRI-BglII de \sim2,7 kb del plásmido pTPA301; el fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim2,34 kb del plásmido pTPA303; el fragmento de restricción SstI-HindIII de \sim1,7 kb del plásmido pTPA303; y el fragmento de restricción SstI-XhoII de \sim0,68 kb del plásmido pBW28 para formar el plásmido pBW32. La mezcla de ligamiento se usó para transformar E. coli K12 MM294 como se ha mostrado en el Ejemplo 2, excepto en que se usó CaCl_{2} 50 mM en el procedimiento. Se identificaron los transformantes por su fenotipo resistente a ampicilina y por análisis de restricción de su ADN plasmídico. El ADN del plásmido pBW32 se obtuvo de los transformantes E. coli K12 MM294/pBW32 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pBW32 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.

Ejemplo 11 Construcción de los Plásmidos pLPChd1, pLPChd2, pLPCdhfr1, y pLPCdhfr2 A. Construcción de los Plásmidos pLPChd1 y pLPChd2

Se añadieron aproximadamente 20 \mug del plásmido pBW32 en 20 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón BamHI 10X y 60 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pBW32, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante dos horas. El ADN del plásmido pBW32 digerido con BamHI se precipitó con etanol, se recogió por centrifugación, y se resuspendió en 5 \mul de tampón Klenow 10X, 45 \mul de H_{2}O, y 2 \mul (\sim100 unidades) de la enzima Klenow. Se incubó la reacción a 16ºC durante 30 minutos; después, se cargó la mezcla de reacción en un gel de agarosa y se sometió a electrofóresis hasta que los productos de digestión estuvieron claramente separados. Se aisló del gel el fragmento de restricción BamHI tratado con Klenow de \sim1,9 kb del plásmido pBW32 que comprende el gen dhfr y se preparó para el ligamiento sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 4 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 5 \mul de tampón TE.

Se añadieron aproximadamente 200 \mug del plásmido pLPChyg1 en 100 \mul de tampón TE a 15 \mul de tampón EcoRI 10X y 30 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim50 unidades) de la de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN del plásmido pLPChyg1, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante aproximadamente 10 minutos. El corto tiempo de reacción se calculó para que produjera una digestión parcial con EcoRI. El plásmido pLPChyg1 tiene dos sitios de restricción EcoRI, uno de los cuales está en la secuencia codificante del gen que confiere resistencia a higromicina (HmR), y se deseaba insertar el fragmento de restricción que contiene el gen dhfr en el sitio EcoRI del plásmido pLPChyg1 que no está en el gen HmR. El ADN del plásmido pLPChyg1 digerido parcialmente con EcoRI se cargó en un gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que el ADN del plásmido pLPChyg1 cortado en un único sitio se separó del ADN plasmídico no cortado y los otros productos de digestión. Se aisló del gel el ADN cortado en un único sitio y se preparó para el ligamiento sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del plásmido pLPChyg1 cortado con EcoRI en un único sitio y se suspendieron en 25 \mul de tampón TE. A esta muestra, se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim25 unidades) de la enzima Klenow, 5 \mul de tampón Klenow 10X, y 40 \mul de H_{2}O, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante 60 minutos. El ADN digerido parcialmente con EcoRI, tratado con Klenow después se extrajo dos veces con fenol y después una vez con cloroformo, se precipitó con etanol, y se resuspendió en 25 \mul de tampón TE.

Se mezclaron entre sí aproximadamente 5 \mul del fragmento de restricción BamHI tratado con Klenow de \sim1,9 kb del plásmido pBW32 y aproximadamente 5 \mul del ADN del plásmido pLPChyg1 cortado con EcoRI en un único sitio, y se añadieron 1 \mul de tampón ligasa 10X, 5 \mul de H_{2}O, 1 \mul (\sim500 unidades) de ADN ligasa T4, y 1 \mul (\sim2 unidades) de ARN ligasa T4 a la mezcla de ADN, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2 deseados, que difieren sólo con respecto a la orientación del fragmento de \sim1,9 kb que comprende el gen dhfr.

El ADN ligado se usó para transformar células de E. coli K12 HB101 hechas competentes para la transformación sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2. Las células transformadas se sembraron en placas de agar-L que contenían 100 \mug/ml de ampicilina, y los transformantes resistentes a ampicilina se analizaron por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico para identificar los transformantes E. coli K12 HB101/pLPChd1 y E. coli K12 HB101/pLPChd2. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPChd1 en la Figura 15 de los dibujos adjuntos. El ADN del plásmido pLPChd1 y el plásmido pLPChd2 se aisló de los transformantes apropiados sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3.

Los plásmidos pLPChd3 y pLPChd4 son similares en estructura a los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2. Los plásmidos pLPChd3 y pLPChd4 se construyen sustancialmente de acuerdo con el procedimiento usado para construir los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2, excepto en que se usa el plásmido pLPChyg2 como material de partida en el procedimiento en lugar del plásmido pLPChyg1.

B. Construcción de los Plásmidos pLPChdfr1 y pLPChdfr2

Se añadieron aproximadamente 100 \mug del plásmido pBW32 en 100 \mul de tampón TE a 15 \mul de tampón BamHI 10X y 25 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim25 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pBW32, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pBW32 digerido con BamHI se trató con Klenow sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 11A. El fragmento de extremos romos se precipitó con etanol, se resuspendió en 10 \mul de tampón TE, se cargó en un gel de agarosa, y se sometió a electroforesis hasta que el fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb que comprende el gen de dihidrofolato reductasa se separó de los otros productos de digestión. Después se aisló del gel el fragmento de restricción de \sim1,9 kb y se preparó para el ligamiento sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 4A; se obtuvieron aproximadamente 10 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 50 \mul de tampón TE.

Se añadieron aproximadamente 5 \mul del ADN del plásmido pLPC digerido con NdeI-StuI, preparado en el Ejemplo 9, a 5 \mul del fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb tratado con Klenow del plásmido pBW32, 1,5 \mul de tampón ligasa 10X, 1 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4, 1 \mul (\sim2 unidades) de ARN ligasa T4, y 1,5 \mul de H_{2}O. La reacción de ligamiento resultante se incubó a 16ºC durante una noche; el ADN ligado constituyó los plásmidos pLPCdhfr1 y pLPCdhfr2 deseados, que difieren sólo con respecto a la orientación del fragmento de \sim1,9 kb que contiene el gen dhfr. El ADN ligado se usó para transformar E. coli K12 HB101 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2. Las células transformadas se sembraron en placas de agar-L que contenían ampicilina, y los transformantes E. coli K12 HB101/ pLPCdhfr1 y E. coli K12 HB101/ pLPCdhfr2 resistentes a ampicilina se identificaron por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico.

Ejemplo 12 Construcción del Plásmido phd

Para construir el plásmido phd, era necesario preparar el ADN del plásmido pLPChd1, usado como material de partida en la construcción del plásmido phd, de células huésped de E. coli que carecen de adenina metilasa, tal como la codificada por el gen dam, el producto del cual metila el resto de adenina en la secuencia 5'-GATC-3'. E. coli K12 GM48 (NRRL B-15725) carece de metilasa dam funcional y por tanto es un huésped apropiado para usar para el propósito de preparar el ADN del plásmido pLPChd1 para usar como material de partida en la construcción del plásmido phd.

Las células de E. coli K12 GM48 se cultivaron y se hicieron competentes para la transformación, y se usó el plásmido pLPChyg1 para transformar las células de E. coli K12 GM48 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2. Las células transformadas se sembraron el placas de agar-L que contenían ampicilina, y una vez que los transformantes E. coli K12 GM48/ pLPChd1 resistentes a ampicilina hubieron formado colonias, se usó una de dichas colonias para preparar el ADN del plásmido pLPChd1 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. Se obtuvo aproximadamente 1 mg del ADN del plásmido pLPChd1 y se suspendió en aproximadamente 1 ml de tampón TE.

Se añadieron aproximadamente 2 \mug del ADN del plásmido pLPChd1 en 2 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón BclI 10X (KCl 750 mM; Tris-HCl 60 mM, pH = 7,4; MgCl_{2} 100 mM; DTT 10 mM y 1 mg/ml de BSA) y 14 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción BclI a la solución de ADN del plásmido pLPChd1, y la reacción resultante se incubó a 50ºC durante dos horas. Se paró la reacción extrayendo la mezcla una vez con fenol y dos veces con cloroformo.

Se añadió aproximadamente 1 \mul del ADN del plásmido pLPChd1 digerido con BclI a 1 \mul de tampón ligasa 10X, 8 \mul de H_{2}O y 1 \mul (\sim500 unidades) de ADN ligasa T4. La reacción del ligamiento se incubó a 16ºC durante una noche, y el ADN ligado constituyó el plásmido phd deseado. El plásmido phd se obtiene de la deleción de los engarces BclI adicionales que se unen durante la construcción del plásmido pLPcat y los dos fragmentos de restricción BclI adyacentes de un tamaño total de aproximadamente 1,45 kb del plásmido pLPChd1. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido phd en la Figura 16 de los dibujos adjuntos. El plásmido phd facilita la expresión de cualquier secuencia de ADN del potenciador del virus BK-promotor tardío de adenovirus de la presente invención, porque el ADN a expresar puede insertarse fácilmente en la posición correcta para la expresión en el sitio BclI único en el plásmido phd.

El ADN ligado se usó para transformar E. coli K12 GM48 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2. Las células transformadas se sembraron en placas de agar-L que contenían ampicilina, y los transformantes E. coli K12 GM48/phd resistentes a ampicilina se identificaron por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico.

Pueden construirse plásmidos análogos al plásmido phd sustancialmente de acuerdo con el procedimiento anterior para construir el plásmido phd usando cualquiera de los plásmidos pLPChd2, pLPChd3, o pLPChd4 como material de partida en lugar del plásmido pLPChd1. Estos plásmidos análogos difieren del plásmido phd sólo con respecto a la orientación del gen que confiere resistencia a higromicina y/o el gen dhfr.

Ejemplo 13 Construcción del Plásmido pLPCE1A

Para aislar el gen E1A del ADN de adenovirus 2, se disolvieron aproximadamente 20 \mug de ADN de adenovirus 2 (de BRL) en 10 \mul de tampón BalI 10X (Tris-HCl 100 mM, pH = 7,6; MgCl_{2} 120 mM; 2-mercaptoetanol 100 mM; y 1 mg/ml de BSA) y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (aproximadamente 20 unidades) de la enzima de restricción BalI a la solución de ADN de adenovirus 2, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante dos horas. El ADN digerido con BalI se cargó en un gel de agarosa y se sometió a electrofóresis hasta que el fragmento de restricción de \sim1,8 kb que comprende el gen E1A se separó de los otros productos de digestión. El fragmento de \sim1,8 kb se aisló del gel y se preparó para el ligamiento sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 3 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 20 \mul de tampón TE.

Se añadieron aproximadamente 5 \mug del plásmido pLPC en 5 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón StuI 10X y 11 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción StuI a la solución del plásmido pLPC, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN del plásmido pLPC digerido con StuI se precipitó con etanol y se resuspendió en 2 \mul de tampón NdeI 10X y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción NdeI a la solución de ADN del plásmido pLPC digerido con StuI, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas.

El ADN del plásmido pLPC digerido con NdeI-StuI se precipitó con etanol y se resuspendió en 5 \mul de tampón Klenow 10X y 42 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 3 \mul (\sim6 unidades) de la enzima Klenow a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Después, la mezcla de reacción se cargó en un gen de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que el fragmento de restricción NdeI-StuI tratado con Klenow de \sim5,8 kb se separó claramente de los otros productos de reacción. Se aisló del gel el fragmento y se preparó para el ligamiento sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento de restricción NdeI-StuI tratado con Klenow de \sim5,82 kb del plásmido pLPC y se suspendieron en 25 \mul de tampón TE.

Se añadieron aproximadamente 9 \mul del fragmento de restricción BalI de \sim1,8 kb de adenovirus 2 que codifica el gen E1A y 3 \mul del fragmento de restricción NdeI-StuI tratado con Klenow de \sim5,82 kb del plásmido pLPC a 2 \mul de tampón ligasa 10X y 4 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 1 \mul (\sim500 unidades) de ADN ligasa T4 y 1 \mul (\sim2 unidades) de ARN ligasa T4 a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante una noche.

El ADN ligado constituyó los plásmido pLPCE1A y pLPCE1A1 deseados, que difieren con respecto a la orientación del gen E1A y posiblemente difieren con respecto al efecto potenciador de la expresión que el potenciador de BK tiene en el gen E1A en el plásmido. La expresión de E1A puede ser mayor cuando el plásmido pLPCE1A se usa en oposición al plásmido pLPCE1A1 porque el promotor E1A se localiza más cerca del potenciador de BK en el plásmido pLPCE1A que en el plásmido pLPCE1A1. Se muestra un mapa de sitios de restricción y función del plásmido pLPCE1A en la Figura 17 de los dibujos adjuntos.

El ADN ligado se usó para transformar E. coli K12 HB101 sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2. Las células transformadas se sembraron en placas de agar-L que contenían ampicilina, y los transformantes resistentes a ampicilina se exploraron por análisis con enzimas de restricción de su ADN plasmídico para identificar los transformantes E. coli K12 HB101/pLPCE1A y E. coli K12 HB101/pLPCE1A1. El ADN plasmídico se obtuvo de los transformantes para usar en experimentos posteriores sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3.

Ejemplo 17 Construcción de un Casete Potenciador de BK-Promotor Tardío de Adenovirus Mejorado

El efecto potenciador de la transcripción del potenciador de BK puede aumentarse de manera significativa colocando el potenciador de 0 a 300 nucleótidos cadena arriba del extremo 5' de la región CAAT de un promotor eucariota adyacente. A continuación se representa la secuencia y los elementos funcionales del presente casete potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus 2, antes de la modificación para mejorar en gran medida la actividad potenciadora.

11

donde A es desoxiadenilo; G es desoxiguanilo; C es desoxicitidilo; y T es timidilo.

El potenciador de BK se define por las tres secuencias repetidas indicadas en la secuencia anterior y funciona de manera similar, con respecto a una secuencia adyacente, en cualquier orientación. Para llevar el potenciador, más específicamente, la tercera repetición del extremo 3' (que depende de la orientación) del potenciador de BK, cercano al extremo 5' de la región CAAT del promotor tardío de adenovirus 2, se añadieron aproximadamente 82 \mug del ADN del plásmido pBLcat digerido con SstI en 170 \mul de tampón TE a 20 \mul de tampón nucleasa Bal31 5X (Tris-HCl 0,1 M, pH = 8,1; NaCl 0,5 M; CaCl_{2} 0,06 M; y Na_{2}EDTA 5 mM) y 9 \mul de nucleasa Bal31, que está compuesta de 6 \mul (\sim6 unidades) de la enzima Bal31 "rápida" y 3 \mul (\sim3 unidades) de la enzima Bal31 "lenta" y (comercializada por International Biotechnologies, Inc., P.O. Box 1565, New Haven, CT 06506). La reacción se incubó a 30ºC durante aproximadamente 30 minutos; después, tras añadir aproximadamente 10 \mul EGTA 0,1 M para parar la reacción, se recogió el ADN digerido con Bal31 por precipitación con etanol y centrifugación. El sedimento de ADN se resuspendió en tampón Klenow 1X y se trató con la enzima Klenow sustancialmente de acuerdo con los procedimientos descritos previamente en este documento.

El ADN tratado con Klenow se resuspendió en 10 \mul de tampón TE; después se autoligó 1 \mul del ADN en 10 \mul de tampón ligasa 1X usando ADN y ARN ligasa T4 como se ha descrito previamente. El ADN ligado se usó para transformar E. coli K12 HB101, y después, se sembraron los transformantes en placas de agar-L que contenían ampicilina. Se usó análisis con enzimas de restricción para determinar qué transformantes contenían plásmidos con un casete potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus 2 de tamaño apropiado, y se usó secuenciación de ADN para confirmar la secuencia de nucleótidos del casete. El procedimiento anterior genera una cantidad de plásmidos en la que el potenciador de BK se coloca en 0 a 300 nucleótidos cadena arriba de la región CAAT del promotor tardío de adenovirus. Un plásmido que resultó del procedimiento anterior se denominó plásmido pBa18cat. La secuencia del potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus 2 del plásmido pBa18cat se representa a continuación.

12

donde A es desoxiadenilo; G es desoxiguanilo; C es desoxicitidilo; y T es timidilo.

Los especialistas en la técnica reconocerán que el procedimiento anterior produjo varios plásmidos distintos, de los cuales el plásmido pBa18cat es ilustrativo. Estos plásmidos, como grupo, muestran la colocación del potenciador de BK a una diversidad de distancias menores de 300 nucleótidos a partir de la región CAAT del promotor tardío de Ad2 y de este modo comprende un aspecto importante de la presente invención. Este procedimiento para mejorar la actividad de un potenciador de BK, que puede conseguirse usando el procedimiento anterior u otros conocidos por los especialistas en la técnica, puede usarse con cualquier potenciador de BK y cualquier promotor eucariota.

Ejemplo 18 Construcción de Transformantes de Células Huésped Eucariotas de los Vectores de Expresión de la Presente Invención y Determinación de Niveles de Expresión de Genes Recombinantes en Esos Transformantes

Un importante aspecto de la presente invención se refiere al uso del potenciador de BK para estimular la expresión génica en presencia del producto génico de E1A. Las células 293 son el huésped preferido para los vectores de expresión eucariota de la presente invención porque las células 293 expresan de manera constitutiva el producto génico de E1A. Las células 293 son células de riñón humanas transformadas con adenovirus tipo 5 (obsérvese que cualquier tipo particular de adenovirus puede usarse para suministrar el producto génico de E1A en el procedimiento de la presente invención) y está disponible por la ATCC con el número de acceso CRL 1573. Sin embargo, los vectores de expresión de la presente invención funcionan en una amplia diversidad de células huésped, incluso si el producto génico de E1A no está presente. Además, el producto génico de E1A puede introducirse en una línea celular que no produce E1A por transformación con un vector de la presente invención que comprende el gen E1A, tal como los plásmidos pLPCE1A y pLPCE1A1, o con ADN de adenovirus puro, o por infección con adenovirus.

El procedimiento de transformación descrito a continuación se refiere a células 293 como línea celular huésped; sin embargo, el procedimiento generalmente es aplicable a la mayoría de líneas celulares eucariotas. Se han transformado una diversidad de líneas celulares con los vectores de la presente invención; algunos de los transformantes reales construidos e información relacionada se muestra en las Tablas adjuntas de este Ejemplo. A causa del gran número de vectores de expresión de la presente invención, el procedimiento de transformación se describe genéricamente, y los transformantes reales construidos se muestran en las Tablas.

Las células 293 se obtienen de la ATCC con el número de acceso CRL 1573 en un matraz de 25 mm^{2} que contiene una monocapa confluyente de aproximadamente 5,5 x 10^{6} células en medio esencial mínimo de Eagle con suero de caballo inactivado por calor al 10%. El matraz se incuba a 37ºC; el medio se cambia dos veces a la semana. Las células se subcultivan retirando el medio, aclarando con solución de sales balanceadas de Hank (Gibco), añadiendo tripsina al 0,25% durante 1-2 minutos, aclarando con medio fresco, aspirando, y dispersándolas en nuevos matraces a una proporción de subcultivo de 1:5 ó 1:10.

Un día antes de la transformación, las células se siembran a 0,7 x 10^{6} células por plato. El medio se cambia 4 horas antes de la transformación. Se usa ADN plasmídico precipitado en etanol, estéril disuelto en tampón TE para preparar una solución de ADN-CaCl_{2} 2X que contiene 40 \mug/ml de ADN y CaCl_{2} 250 mM. Se prepara HBS 2X que contiene NaCl 280 mM, Hepes 50 mM, y fosfato sódico 1,5 mM, con el pH ajustado a 7,05-7,15. Se añade la solución ADN-CaCl_{2} 2X gota a gota a un volumen igual de HBS 2X estéril. Se inserta una pipeta de plástico estéril de 1 ml con un tapón de algodón en el tubo de mezcla que contiene el HBS 2X, y se introducen burbujas inyectando aire mientras se añade el ADN. Se deja que se forme el precipitado fosfato de calcio-ADN sin agitación durante 30-45 minutos a temperatura ambiente.

Después el precipitado se mezcla pipeteando suavemente con una pipeta de plástico, y se añade un ml (por placa) de precipitado directamente a los 10 ml de medio de crecimiento que cubre las células receptoras. Después de 4 horas de incubación a 37ºC, se reemplaza el medio con DMEM con suero bovino fetal al 10% y se dejan las células incubando durante 72 horas adicionales antes de proporcionarles presión selectiva. Para los transformantes que expresan la proteína C humana recombinante, el medio de crecimiento contenía de 1 a 10 \mug/ml de vitamina K, un cofactor necesario para la \gamma-carboxilación de la proteína. Para plásmidos que no comprenden un marcador de selección que funcione en células eucariotas, el procedimiento de transformación utiliza una mezcla de plásmidos: el vector de expresión de la presente invención que carece de un marcador de selección; y un vector de expresión que comprende un marcador de selección que funciona en células eucariotas. Esta técnica de cotransformación permite la identificación de células que comprenden ambos plásmidos transformantes.

Para células transfectadas con plásmidos que contienen el gen que confiere resistencia a higromicina, se añade higromicina al medio de crecimiento a una concentración final de aproximadamente 200 a 400 \mug/ml. Después se incuban las células a 37ºC durante 2-4 semanas con cambios del medio a intervalos de 3 a 4 días. Las colonias resistentes a higromicina resultantes se transfieren a matraces de cultivo individuales para la caracterización. La selección de colonias resistentes a neomicina (también se usa G418 en lugar de neomicina) se realiza sustancialmente de acuerdo con el procedimiento de selección para células resistentes a higromicina, excepto en que se añade neomicina a una concentración final de 400 \mug/ml en lugar de higromicina. Las células 293 son positivas a dhfr, de modo que los transformantes 293 que contienen plásmidos que comprenden el gen dhfr no sólo se seleccionan en base al fenotipo positivo a dhfr, que es la capacidad para crecer en medio que carece de hipoxantina y timina. Las líneas celulares que carecen de un gen dhfr funcional y se transforman con plásmidos que contienen dhfr pueden seleccionarse en base al fenotipo dhfr+.

Se ha establecido bien en la bibliografía el uso del gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) como marcador de selección para introducir un gen o plásmido en una línea celular deficiente en dhfr y el posterior uso de metotrexato para amplificar el número de copias del plásmido. Aunque el uso de dhfr como marcador de selección y amplificable en células que producen dhfr no se ha estudiado bien, las evidencias en la bibliografía sugerirían de dhfr puede usarse como marcador de selección en células que producen dhfr y para amplificación génica. El uso de la presente invención no está limitado por los marcadores de selección usados. Además, pueden utilizarse marcadores amplificables tales como genes de metalotioneina, genes de adenosina desaminasa o miembros de la familia de resistencia multigénica, ejemplificados por la glicoproteína P.

TABLA 2 Niveles de Expresión en Transformaciones de Células 293

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13

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TABLA 3 Niveles de Expresión en Células Transformantes MK2 (ATCC CCL7)

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14

TABLA 4 Niveles Relativos de Cloranfenicol Acetiltransferasa (CAT) Producidos por Plásmidos Recombinantes en Diversas Líneas Celulares de Riñón de Humano y Mono

15

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}{150mm} * Los valores para los niveles
relativos de CAT producidos en cada línea celular se basaron en el
nivel de CAT del plásmido pSV2cat como unidad en esa línea celular.
Los resultados son la media de 2 a 6 determinaciones individuales de
cada dato puntual. ND = no detectado. NT = no ensayado. El plásmido
pSLcat es análogo al plásmido pBLcat pero tiene el potenciador de
SV40 en lugar del potenciador de BK. Sólo la línea celular 293
produce E1A. Las líneas celulares COS y k816-4
producen antígeno T.\end{minipage} \cr 
 \begin{minipage}{150mm} ** Las células k816-4
se prepararon por transformación de células de riñón humanas
primarias con un plásmido, denominado pMK16,8-16
(obtenido de Y. Gluzman, Cold Spring Harbor), que contiene un genoma
de SV40 con un defecto en el origen de replicación. Esta línea
celular produce de manera constitutiva el antígeno T de SV40. La
línea celular k816-4 es esencialmente igual que la
línea celular SV1, una línea de riñón humano transformada con SV40,
descrita por E.O. Major,  Polyomaviruses and Human Neurological
Disease  (Alan R. Liss, Inc., N.Y. 1983, eds D. Madden, y J.
Server).\end{minipage} \cr}

TABLA 5 Niveles Relativos de Cloranfenicol Acetiltransferasa (CAT) Producidos por Diversas Líneas Celulares de Riñón de Humano y Mono Corregidos para las Diferencias Relativas en el Número de Copias de Plásmido

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}{150mm} * Los valores para los niveles
relativos de CAT producidos en cada línea celular se corrigieron
dividiendo el nivel de CAT en el lisado celular entre la cantidad de
ADN plasmídico, como se determina por análisis de hibridación, en el
mismo lisado celular. El valor corregido para el plásmido pSV2cat en
células 293 se tomó como
unidad.\end{minipage} \cr}

Claims (1)

1. Una molécula de proteína C humana producida de manera recombinante que se puede obtener de la línea celular 293 por el procedimiento descrito en el Ejemplo 18.