JPS6312296A - Ｂｋウイルスエンハンサ−を含有する真核生物性発現ベクタ−を用いる方法 - Google Patents

Ｂｋウイルスエンハンサ−を含有する真核生物性発現ベクタ−を用いる方法

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JPS6312296A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物の
存在下にＢＫエンハンサ−を用いて、真核宿主細胞にお
ける組換え遺伝子の転写を増加させる方法、ならびに本
方法に用いるのに適したＤＮ　／’１化合物、組換えＤ
ＮＡベクターおよび該ベクターで形質転換した宿主細胞
に関する［ここでいうＩ３にエンハンサ−とは、３個の
繰り返し配列からなる、本明細書に定義したＤＮＡセグ
メントである（後記実施例１７中に記載）］。
本本明細書に例示したＢＫエンハンサ−配列は、ＢＫウ
ィルス、すなわち免疫抑制患者の尿から初めて単離され
たヒト・パボバウィルスから得られる。Ｉ３にウィルス
は、外見からはわからない幼年期感染を引き起こすもの
と推測され、全人類中に存在している。ＢＫウィルスは
ヒト細胞中で最もよく増殖するが、このウィルスは非霊
長動物細胞においては不稔サイクル下に入り、インビト
ロで協歯類動物細胞を形質転換し、そしてハムスターに
おいては腫瘍を引き起こす。ＢＫウィルスはＳＶ４０に
極めて似ているか、この２種類のパボバウィルス（すな
わち、ＳＶ４０およびＢＫ）のエンハンサ−配列は実質
的にヌクレオチド配列が異なっている。ＢＫウィルスの
完全なヌクレオチド配列（〜５．２ｋｂ）は、セイフ等
［５ｅｉｆ　ｅｔ　ａ１、、Ｃｅ１１、１８：９６３（
１９７９）］、ならびにヤングおよびウー［Ｙａｎｇ　
ａｎｄ　Ｗｕ、５ｃｉｅｎｃｅ、２０６＋４５６（１９
７９）］が開示しており、このウィルスはアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ　Ｔ　ＣＣＸＡ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ、、
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ２０８５２−１７７６）から
、取得番号ＡＴＣＣＶＲ−８３７のもとで入手すること
ができる。このＢＫウィルスの制限部位および機能地図
を添付の第１図に示す。
エンハンサ−成分はり１−作用であり、このエンハンサ
−成分の位置および配向に比較的依存せずに、近接する
遺伝子の、そのプロモーターからの転写レベルを増加さ
せる。事実、コーリーおよびグルメ［Ｋｈｏｕｒｙ　ａ
ｎｄ　Ｇｒｕｓｓ、ｃｅｌ１、３３：３１３（１９８３
）］は、「真核生物遺伝子の上流、内部または下流で機
能するエンハンサ−配列の注目すべき能力は、これらを
古典的なプロモーター成分と区別するものである・・・
」と述べ、ある種の実験結果が「エンハンサ−はかなり
の距離（おそら＜１０ｋｂ以上）を越えて作用すること
ができる」ことを示している、と示唆している。
本発明は、真核生物性プロモーター（有用な物質をコー
ドしているＤＮＡ配列を転写させるために、ＢＫエンハ
ンサ−と直列して用いる）のｒＣＡＡＴＪ領域のすぐ上
流（該領域の５゛側）にＢＫエンハンサ−を配置するこ
とによって、予想外の転写の増加が得られることを教示
するものである。このＣＡＡＴ領域または「すぐ上流の
領域」または「−８０相同配列」は、転写活性のための
配列が詳細に調べられているプロモーター中に見い出さ
れるヌクレオチドの保存領域である。このＣＡＡＴ配列
は転写の効率に関係し、ごくわずかな例外を除いて、こ
れを削除するとプロモーターの強さが減少する。
エンハンサ−成分は、多数のウィルス［ＢＫおよびサル
ウィルス４０（ＳＶ４０）などのパボバウィルス、ヘル
ペスウィルス、サイトメガロウィルス、肝炎ウィルス、
レトロウィルス、アデノウィルス、乳頭腫ウィルス、ポ
リオーマウィルスを含む］および非ウィルス性遺伝子（
たとえば、マウスの免疫グロブリン遺伝子イントロン中
など）において確認されている。エンハンサ−成分は多
種多様のその他の生物中にも存在している可能性がある
。
宿主細胞は、エンハンサ−成分が異なると、異なった反
応を示すことが多い。この細胞特異性は、宿主遺伝子産
物が遺伝子の発現中にエンハンサ−成分と相互作用して
いることを示すものである。
また、エンハンサ−成分は、宿主細胞中に存在している
ウィルス性遺伝子産物と相互作用することもある。ベル
シッヂおよびシッフ［Ｖｅｌｃｉｃｈ　ａｎｄＺｉｆｆ
、Ｃｅ１１，４０ニア０５（１９８３）コ、ボレリ等［
Ｂｏｒｒｅｌｌｉ　ｅｔ　ａ１、、Ｎａｔｕｒｅ、３１
２＋６０８（１９８４）コおよびヘン等［Ｈｅｎｅｔ　
ａ１、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３９１（１９８５
）］は、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、マウス免疫グ
ロブリン遺伝子およびアデノウィルス−２Ｅ１Ａのエン
ハンサ−が誘起する転写の活性化を、アデノウィルス−
２初期領域Ｉ　Ａ（Ｅ　Ｉ　Ａ）遺伝子産物が抑制する
と記載している。従って、Ｅ１Ａを含有する宿主細胞に
おいては、組換え遺伝子の転写を増加させるためにエン
ハンサ−を用いた真核生物性発現べフターが、エンハン
サ−を有さないベクターより打効に作動すると期待する
ことはできない。エンハンザ−類を用いる先行技術の方
法とは著しく異なり、本発明のＢＫウィルスエンハンサ
−成分を用いる方法は、Ｅ１Ａ遺伝子産物または大きい
ＤＮＡウィルスの同様の即時型遺伝子産物を用いて遺伝
子発現を最大にすることに関するものである。
すなわち本発明は、いずれかのアデノウィルスのＥ１Ａ
遺伝子産物の存在下に、ＢＫエンハンサ−のＤＮＡ転写
促進能力を向上させることを教示するものである。
Ｅ１Ａ遺伝子産物（正確に言うと、Ｅ１Ａ遺伝子は２種
類の産物を産生ずるが、本明細書中ではこれらをひとま
とめにしてＩＥ１Ａ遺伝子産物」と称する）は、アデノ
ウィルス（大きいＤＮＡウィルス）の即時型遺伝子産物
である。本発明は、Ｅ１Ａ遺伝子産物と同様に機能して
ＢＫエンハンサ−の活性を増加させる、大きいＤＮＡウ
ィルスのあらゆる即時型遺伝子産物の使用を包含する。
単純性庖疹ウィルスＩＣＰ４タンパク質［デル力等（Ｄ
ｅＬｕｃａ　ｅｔ　ａ１、、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ
１、、５：１９９７−２００８（１９８５））が開示］
、シュードラビエスウィルスＩＥタンパク質［フェルト
マン等（Ｆｅｌｄｍａｎ　ｅｔ　ａ１、、Ｐ、Ｎ、Ａ、
ｓ、、７９：４９５２−４９５６（１９８２））が開示
コおよびアデノウィルスのＥ１Ｂタンパク質は、すべて
Ｅ１Ａタンパク質と同様の機能を有する、大きいＤＮＡ
ウィルスの即時型遺伝子産物である。従って本発明方法
は、Ｅ１Ａタンパク質の存在または非存在下にＩＣＰ４
、ＩＥ、またはＥ１Ｂタンパク質を用いて、ＢＫエンハ
ンサ−の活性を増加させることをも包含する。
アデノウィルスのＥ１Ａ遺伝子産物のような、大きいＤ
ＮＡウィルスの即時型遺伝子産物の存在下にＢＫウィル
スエンハンサ−を用いると、真核宿主細胞において組換
え遺伝子の転写および発現が増加する。本発明の別の重
要な態様は、真核生物性プロモーター（たとえば、アデ
ノウィルス後期プロモーター）に直列してＢＫエンハン
サ−配列を用い、真核宿主細胞において有用な産物を発
現させる種々の発現ベクターに関する。これらの発現ベ
クターの多くは、ＢＫエンハンサー−アデノウィルス後
期プロモーターカセットを含有し、このカセットは、本
発明方法に用いる他のベクターに容易に移し換えること
ができる。この発現ベクターの多様性は、これらのベク
ターが誘導する種々のタンパク質（たとえば、クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ、タンパク質
Ｃ１組織プラスミノーゲン活性化因子、および修飾化組
織プラスミノーゲン活性化因子など）の高レベル発現に
よって示される。
本発明のさらに別の重要な態様は、近接する真核生物性
プロモーターと関連しているＢＫエンハンサ−の活性を
増加させる方法に関し、これをＢＫエンハンサー−アデ
ノウィルス−２後期プロモーターカセットを用いて説明
する。これらの誘導体を、アデノウィルス−２後期プロ
モーターのＣＡＡＴ領域の極めて近くにＢＫエンハンサ
−を配置する酵素的な処理によって構築した。これらの
修飾化ＢＫエンハンサーーアデノウィルス後期プロモー
ター配列を発現ベクターに導入し、次いでこれらを用い
て真核宿主細胞中で有用な遺伝子産物を発現させたとき
、このような位置決めを欠く構築物と比較すると、劇的
な発現レベルの増加が認められた。すなわち本発明は、
近接する真核生物性プロモーターと関連しているＢＫエ
ンハンサ−の活性を増加させるための方法であって、真
核生物性プロモーターのＣＡＡＴ領域の５°末端のすぐ
上流、〇−約３００ヌクレオヂド以内に該エンハンサ−
を配置することからなる方法を提供するものである。
本明細書中で用いる語句を以下のように定義する。
抗生物質：微生物が産生ずる物質であって、天然のまま
で、またはわずかに化学修飾することにより、他の微生
物または真核生物細胞を殺すか、またはその増殖を抑制
する物質。
抗生物質耐性付与遺伝子：抗生物質に対する耐性を付与
する活性をコードしているＤＮＡセグメント。
ＡｐＲ：アンピシリン耐性の表現型またはそれを付与す
る遺伝子。
クローニング：組換えＤＮＡクローニングベクターにＤ
ＮＡセグメントを導入する過程。
ＣｍＲ：クロラムフェニコール耐性の表現型またはそれ
を付与する遺伝子。
ｅｐ：Ｔ−抗原遺伝子のＳＶ４０初期プロモーター、Ｔ
−抗原結合部位、およびＳＶ４０の複製起源を含有する
ＤＮＡセグメント。。
真核生物性プロモーター：真核生物細胞中でプロモータ
ーとして機能するすべてのＤＮＡセグメント。
ＩｒｍＲ：ハイグロマイシン耐性の表現型またはそれを
付与する遺伝子。
ｒＶＳ：介在配列とも呼ばれる、イントロンをコードし
ているＤＮＡ０ 大きいＤＮＡウィルス：真核生物細胞に感染し、〜ｌ０
ｋｂ以上の大きさのゲノムを有するウィルス、すなわち
ポックスウィルス類、アデノウィルス類、およびヘルペ
スウィルス類のいずれか。
ＮｅｏＲ：ネオマイシン耐性付与遺伝子であり、これを
用いて真核宿主細胞に０４１８耐性を付与することらで
きる。
ｏｒｉニブラスミドの複製起源。
ｐＡ：ポリアデニル化シグナルをコードしているＤＮＡ
配列。
プロモーター：ＤＮＡのＲＮＡへの転写を誘導するＤＮ
Ａ配列。
組換えＤＮＡクローニングベクター：自律的に複製する
かまたは組み込まれる媒介物であって、１またはそれ以
上の付加的なりＮＡ上セグメント付加することができる
かまたは付加したＤＮＡ分子からなる媒介物。
組換えＤＮＡ発現ベクター：プロモーターおよびこれに
関連する挿入部位を含有する組換えＤＮＡクローニング
ベクターであって、該部位に有用な産物をコードしてい
るＤＮＡ分子を挿入し、そして発現させることができる
ベクター。
組換えＤＮＡベクター二組換えＤＮＡクローニングまた
は組換えＤＮＡ発現ベクター。
レプリコン：組換えＤＮＡベクターの復製を制御してい
るＤＮＡ配列。
制限フラグメント：ｌまたはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成した直線状のＤＮＡ。
ｒＲＮＡ：リポソーム性リボ核酸。
感受性宿主細胞：ある抗生物質またはその他の毒性化合
物に対する耐性を付与するＤＮＡセグメントなしでは、
それらが存在するところで増殖することができない宿主
細胞。
構造遺伝子：開始および停止コドンをコードしているＤ
ＮＡを含む、ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列
。
ＴｃＲ：テトラサイクリン耐性の表現型またはそれを付
与する遺伝子。
形質転換体；形質転換を受けた受容宿主細胞。
形質転換：受容宿主細胞へのＤＮＡの導入。
ｔＲＮＡ：転移リボ核酸 図面の説明 第１図は、Ｉ３にウィルス（５，２ｋｂ）の制限部位お
よび機能地図であり、 第２図は、プラスミドｐＢＫＥ１（７，９ｋｂ）の制限
部位および機能地図であり、 第３図は、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌ（１１，５ｋｂ）
の制限部位および機能地図であり、 第４図は、プラスミドｐＳＶ　２ｃａｔ（５，０１５ｋ
ｂ）の制限部位および機能地図であり、 第５図は、プラスミドｐＬ　Ｐ　ｃａｔ（４、８３ｋｂ
）の制限部位および機能地図であり、 第６図は、プラスミドｐＢ　Ｌｃａｔ（６、０９ｋｂ）
の制限部位および機能地図であり、 第７図は、プラスミドｐＢＫｃａｔ（５，７９ｋｂ）の
制限部位および機能地図であり、 第８図は、プラスミドｐＳ　Ｂ　Ｌｃａｔ（５、８８ｋ
ｂ）の制限部位および機能地図であり、 第９図は、プラスミドｐｔ、　１３３の構築ならびにそ
の制限部位および機能地図を表し、第１θ図は、プラス
ミドｐＬＰＣ（６，５ｋｂ）の制限部位および機能地図
であり、 第１１図は、プラスミドｐＬＰＣ４（１１，７ｋｂ）の
制限部位および機能地図であり、 第１２図は、プラスミドｐＳ　Ｖ　２ｈｙｇ（５、２１
１ｋｂ）の制限部位および機能地図であり。
第１３図は、プラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ鳳（８，３
ｋｂ）の制限部位および機能地図であり、 第１４図は、プラスミドｐＢＷ３２の構築ならびにその
制限部位および機能地図を表し、第１５図は、プラスミ
ドＰＬＰＣｈｄｌ（１０，２３ｋｂ）の制限部位および
機能地図であり、第１６図は、プラスミドｐｈｄ（８、
５５ｋｂ）の制限部位および機能地図であり、 第１７図は、プラスミドｐＬＰＣＥ　１Ａ（７，６ｋｂ
）の制限部位および機能地図であり、第＋８図は、プラ
スミドｐＢＬＴ（６，４４ｋｂ）の制限部位および機能
地図であり、 第１９図は、プラスミドｐＢＬＴｈｙｇ＋（８，９５ｋ
ｂ）の制限部位および機能地図であり、第２０図は、プ
ラスミドｐＢＬＴｄｈｆｒｌ　（８，３４ｋｂ）の制限
部位および機能地図であり、第２１図は、プラスミドｐ
ＴＰＡ６０２（４，９ｋｂ）の制限部位および機能地図
であり、第２２図は、プラスミドｐＴＰＡ６０３（６，
３ｋｂ）の制限部位および機能地図であり、第２３図は
、プラスミドｐｈｄＴＰＡ（１０，６７ｋｂ）の制限部
位および機能地図であり、第２４図は、プラスミドｐｈ
ｄＭＴ　Ｐ　Ａ（１０、６７ｋｂ）の制限部位および機
能地図である。
本発明は、真核宿主細胞において機能的なポリペプチド
を産生させるための方法であって、大きいＤＮＡウィル
スまたはそのＤＮＡで形質転換され、そして少なくとら ａ）真核生物性プロモーター、 ｂ）該プロモーターを刺激するように配置したＢＫウィ
ルスエンハンサー、 Ｃ）該プロモーターから発現するように配置した、機能
的なポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列、 を含有する組換えＤＮＡベクターで形質転換された真核
生物細胞、または上記ａ）、ｂ）、Ｃ）およびｄ）大き
いＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物をコードしている
ＤＮＡ配列、 を含有する組換えＤＮＡベクターで形質転換された真核
生物細胞を、Ｃ）およびｄ）の発現に適した条件下で培
養することからなる方法を提供するものである。
また、本発明は真核生物性プロモーターと関連してい、
るＢＫエンハンサ−の活性を増加させるための方法であ
って、プロモーターがＳＶ４０初期プロモーターではな
いという限定のもと、真核生物性プロモーターのＣＡＡ
Ｔ領域の５゛末端の上流側０−３００ヌクレオチド以内
に該エンハンサ−を配置することからなる方法を提供す
るものである。
さらに本発明は、本発明方法において使用するに−した
組換えＤＮＡベクター、ならびに該組換えＤＮＡベクタ
ーで形質転換したヒト胎児腎細胞およびサル腎細胞等の
真核生物細胞を提供するものである。
加えて本発明は、ＢＫエンハンサーーアデノウィルス後
期プロモーターを含有するＤＮＡ化合物をも提供するも
のである。
当業者なら、本発明方法の両態様における、大きいＤＮ
Ａウィルスの即時型遺伝子産物の重要な役割について理
解することであろう。さらに、多数の確立された細胞セ
ルラインが大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物を
発現すること、およびそのようなセルラインが本発明方
法において特に有用であることについても理解すること
であろう。
本方法の１態様では、真核生物性プロモーター、該プロ
モーターを刺激するように配置したＢＫエンハンサ−１
および所望の機能的なポリペプチドをコードしているＤ
ＮＡ配列（該プロモーターから発現するようにこの配列
を配置する）を含有する組換えＤＮＡベクターで、大き
いＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物を発現する細胞を
形質転換し、そして発現に適した条件下で該ベクターを
含有する細胞を培養する。また、本発明方法の他の態様
は、大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物は発現し
ないが、即時型遺伝子産物をコードしているＤＮＡ配列
、ならびに上記のブロモ−クー、エンハンサ−および機
能的なポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を含有
する組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細胞を培
養することからなる。
本発明において重要なものは、ＢＫエンハンサ−配列を
アデノウィルス−２後期プロモーターと直列して含有す
る１群の新規発現ベクターである。
該ベクター中、発現のための正しい位置に、有用な産物
をコードしているＤＮＡ分子を容易に挿入するか、また
は挿入できるように、本発明の発現ベクターを構築した
。さらに、比較的小さい制限フラグメントとして発現ベ
クターから単離しうる「カセット」を形成するように、
ＢＫエンハンサ−配列および真核生物性プロモーターを
組み立てた。
このカセットは、種々の発現ベクター間を容易に往復す
ることができる。本明細書中に特定して例示した発現ベ
クターは、本発明方法において転写を誘導するＢＫエン
ハンサーー真核生物性プロモーターカセットに、アデノ
ウィルス−２またはＢＫ後期プロモーターを用いている
。
ＢＫウィルス（ＡＴＣＣＶＲ−８３７）は購入可能であ
るか、または実施例１の記載のようにして容易かつ大量
に単離することができるが、このウィルスは、ＢＫウィ
ルス性Ｄ　Ｎ　Ａをプラスミドクローニングベクターに
クローンし、この組換えベクターをＢＫウィルス性ＤＮ
Ａ配列の供給源として使用するのにも都合がよい。従っ
て、ＢＫウィルスＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し
て直線状のＢＫ　ＤＮＡ（ＢＫゲノム上にはＥｃｏＲＩ
部位が１つしか存在しないので）を得、同様にプラスミ
ドｐＵＣ８’ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂ
　ＲＬ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐ、０゜Ｂｏｘ　６００９．Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ　２０８７７）から入手
可能］を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して直線化し、そし
てこのＥｃｏＲＩ切断したプラスミドｐＵＣ８ＤＮＡを
ＥｃｏＲＩ切断した１３にウィルスＤＮＡにライゲート
して、ＢＫウィルスＤＮＡの配向だけが異なるプラスミ
ドｐＢＫＥ１およびｐＢＫＥ２を得た。
プラスミドｐＢＫＥ１の制限部位および機能地図を添付
の第２図に示す。プラスミドｐＢＫＥＩおよびｐＢＫＥ
２の構築については、実施例２に記載する。
また、ＢＫウィルスゲノムをプラスミドｐｄＢＰＶ−Ｍ
ＭＴｎｅｏの一部と結合させてプラスミドｐＢＫ　ｎｅ
ｏ　ｌおよびｐＢＫｎｅｏ２を構築した。プラスミドｐ
ｄ１３　Ｐ　Ｖ　−ＭＭ　Ｔ　ｎｅｏ（約１５ｋｂの大
きさであり、ＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ３７２２４
のもとで入手可能である）は、プラスミドルＢｒ１３２
２由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子およびレプリコン、ネ
オマイシン耐性付与酵素をコードしている構造遺伝子を
発現させるように配置したマウス・メタロチオネイン・
プロモーター、および約８ｋｂのウシ乳頭腫ウィルス（
ＢＰＶ）ＤＮＡを含有している。
プラスミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ−ＭＭＴｎｅｏを制限酵素Ｂ
ａＬＩＩＨ，！で消化して２種類のフラグメント、すな
わちＢＰＶ　ＤＮＡを含有する〜８ｋｂフラグメントお
よびそれ以外の上記配列を含有する〜７ｋｂフラグメン
トを得ることができる。ＢＫウィルスはＢａａＨＴ制限
部位を１つだけ有しており、プラスミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ
　−ＭＭ　Ｔ　ｎｅｏの〜７　ｋｂ　Ｂ　ａｔｎＨＩ制
限フラグメントをＢａｍＨＩで直線化したＢＫウィルス
ＤＮＡにライゲートすることによってプラスミドｐＢ　
Ｋ　ｎｅｏ　ｌおよびｐＢＫｎｅｏ２を構築した。ＢＫ
ウィルスＤＮＡの配向だけが異なっているこのプラスミ
ドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２の構築を実施例
３に記載し、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの制限部位およ
び機能地図を添付の第３図に示す。
プラスミドｐＢＫＥ　Ｉ　５ｐＢＫＥ２、ｐＢＫｎｅｏ
ｌおよびｐＢＫｎｅｏ２それぞれは、エンハンサ−配列
を含むＢＫウィルスの完全なゲノムを含有しており、従
って本発明の発現ベクター用の有用な出発原料となる。
説明のためにそのような発現ベクターを１つ挙げると、
プラスミドｐＢＬｃａｔは、クロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ酵素（ＣＡＴ）を発現させるよ
うに配置した、ヒトアデノウィルス−タイプ−２・後期
プロモーターと直列してＢＫエンハンサ−配列を含有し
ている。
プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔはＣＡＴ遺伝子の都合
のよい供給源として有用であり、取得番号ＡＴＣＣ３７
１５５のもとてＡＴＣＣから入手できる。プラスミドｐ
ｓＶ２ｃａｔの制限部位および機能地図を近は小笛ＪＩ
ｉ７１−壬十　←に７ギｌ内ノ１「１フ−ｈノブー２　
　ＤＮＡは市販品から入手することができ、またＡＴＣ
Ｃから取得番号ＡＴＣＣＶ、Ｒ−２のらとで入手するこ
ともできる。
説明のために挙げたこのプラスミドｐＢＬｃａｔは、ヒ
トアデノウィルス−タイプ−２・ＤＮＡの〜０゜３２ｋ
ｂ後期プロモーター含有Ａｃｅ　Ｉ　−Ｐｖｕｌｌ制限
フラグメントを、Ａｃｅ　Ｔ　−Ｐ　ｖｕｌｌ制限フラ
グメントのＰｖｕｌｌ末端だけに結合する平滑末端化Ｂ
ｃｌｌリンカ−にライゲートすることによって構築した
。次いで得られたフラグメントをプラスミドｐＳ　Ｖ　
２　ｃａｔの＝４．５１ｋｂ　Ａｃｃｌ−９ｔｕｌ制限
フラグメントにライゲートして中間体プラスミドｐＬＰ
ｃａｔを得た（このプラスミドの制限部位および機能地
図を添付の第５図に示す）。所望のプラスミドｐＢＬｃ
ａｔは、複製起源およびエンハンサ−を含有する、ＢＫ
ウィルスＤＮＡの〜１．２８ｋｂＡｃｃｒ−Ｐｖｕｌｌ
制限フラグメントを、プラスミドｐＬＰｃａｔの〜４．
８１ｋｂ　Ａｃｃｌ−９ｔｕｌ制限フラグメントにライ
ゲートすることによって、プラスミドｐＬＰｃａｔから
構築した。得られたプラスミドｐＢ　Ｌ　ｃａｔの制限
部位および機能地図を添付の第６図に示す。プラスミド
ｐＢ　Ｌ　ｃａｔの構築については実施例４にさらに詳
しく記載する。
プラスミドｐＢＫｃａｔは本発明をさらに例示する発現
ベクターであり、ＢＫエンハンサ−およびＢＫ後期プロ
モーターを用いてクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼを発現さ仕るものである。プラスミドｐＢ
Ｋｃａｔを、プラスミドｐｌ。
Ｐ　ｃａｔについて記載したと類似の方法で構築した。
すなわち、プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔの〜４．５
１ｋｂＡｃｃｒ−９ｔｕＩ制限フラグメントを１３にウ
ィルスの〜１．２８ｋｂ　ＡｃｃＩ−Ｐｖｕｌｌ制限フ
ラグメントにライゲートして、ＢＫ後期プロモーターが
正しい配向となるようにし、ＣＡＴ遺伝子を発現させる
ようにした。プラスミドｐＢＫｃａｔの制限部位および
機能地図を添付の第７図に示す。
プラスミドｐＢＬｃａｔは、本発明のＢＫエンハンサー
−アデノウィルス後期プロモーター「カセット」の都合
のよい供給源である。このカセットは〜ｓ’ｙｏｂｐの
Ｈｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントであり、都合よく真核
生物性発現ベクターに挿入して該ベクターがコードして
いる産物の発現を増加させることができる。これは、プ
ラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔを制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ
ｌで消化し、ＢＫエンハンサー−アデノウィルス後期プ
ロモーターカセットを挿入することによって行なわれる
。得られたプラスミド（プラスミドｐＳ　Ｂ　Ｌｃａｔ
と命名した）は、ＳＶ４０複製起源、ＳＶ４０初期プロ
モーターおよびＳＶ４０エンハンサ−を含有し、従って
これらの配列が削除されているプラスミドｐＢ　Ｌ　ｃ
ａｔとは異なる。
プラスミドｐＳＢＬｃａｔは、Ｅ１Ａ遺伝子産物が存在
しなければ、プラスミドｐＢＬｃａｔより高レベルでＣ
ＡＴを発現させる。Ｅ１Ａ遺伝子産物が存在しない場合
におけるこの発現の増加は、２種類のエンハンサ−（一
方はＳＶ４０由来、他方はＢＫ由来）が、隣接するプロ
モーターからの転写において付加的な促進効果を有して
いることを示すものである。しかし、Ｅ１Ａ遺伝子産物
の存在下では、プラスミドｐＳＢＬｃａｔよりプラスミ
ドｐ１３Ｌ　ｃａｔの方が高レベルでＣＡＴを発現させ
る（これはおそら＜ＳＶ４０エンハンサ−がＥ１Ａ遺伝
子産物によって抑制されるためであろう）。プラスミド
ｐＳＢＬｃａｔの制限部位および機能地図を添付の第８
図に示し、プラスミド１）ＳＢＬｃａｔの構築を実施例
５に記載する。
また、ＢＫエンハンサー−アデノウィルス後期プロモー
ターカセットを用いて、ヒトタンパク質Ｃの発現を改良
した。これは、カセットをプラスミドｐ１、　１３３中
にライゲートすることによって行った。プラスミドｐｔ
、　１３３の制限部位および機能地図を添付の第９図に
示し、その構築を実施例６に記載する。プラスミドｐＬ
　１３３を制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌで消化し、次いでプ
ラスミドｐＢＬｃａｔの〜０　、８７　ｋｂＨ１ｎｄｌ
ｌｌ制限フラグメントにライゲートしてプラスミドｐＬ
　Ｐ　Ｃを得た。プラスミドＩ）ＬＰＧの制限部位およ
び機能地図を添付の第１０図に示し、プラスミドｐｔ、
ｐｃの構築を実施例７に記載する。
プラスミドｐｔ、　１３３と同様、プラスミドＩ）ＬＰ
ＣはＳＶ４０の複製起源、Ｔ〜抗原結合部位、初期およ
び後期プロモーター、およびエンハンサ−を含有する。
これらの成分はともに５Ｖ４０ＤＮＡ上に近接して位置
しており、これを正確に表すことは困難である。Ｔ−抗
原のＴ−抗原結合部位への結合（ＳＶ４０の複製に必要
である）が、ＳＶ４０後期プロモーターからの転写を促
進することが知られているが、驚くべきことにＢＫ後期
プロモーターに対しても同様の効果を有している。
ＳＶ４０複製起源を含有するプラスミドの高レベルＴ−
抗原誘導複製は通常宿主細胞にとって致死的であるので
、ＳＶ４０　　Ｔ−抗原の存在下ではプラスミドｐｔ、
ｐｃおよびプラスミドｐＬ　１３３のどちらもエピソー
ム（染色体外）成分として安定に保持されず、むしろこ
の２種類のプラスミドを宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組
み込んで安定に保持されるようにしなければならない。
ＢＫエンハンサ−領域の全体の構造はＳＶ４０のそれと
極めて類似しており、ＢＫエンハンサ−１複製起源、初
期および後期プロモーター、およびＴ−抗原結合部位の
ＢＫ同等物はすべて近接して位置しており、ＢＫウィル
スＤＮＡ上において、正確に表すことは困難である。し
かし、ＢＫＴ−抗原の存在下で増殖させたとき、ＢＫ複
製起源およびＴ−抗原結合部位を含有するプラスミドは
致死となるまでは複製仕ず、エピソーム成分として宿主
細胞中に安定に保持される。多分、ＢＫおよびＳＶ４０
　Ｔ−抗原とそれらの抗原のそれぞれの結合部位との間
の、類似した構造−機能の関係により、ＢＫの複製はＳ
Ｖ４０　　Ｔ−抗原によっても刺激される。形質転換し
た真核生物細胞中で、安定に保持される成分として存在
しうるプラスミドｐｔ、　Ｐ　Ｃの誘導体を構築するた
め、完全なＩ３にゲノム（ＥｃｏＲｒで直線化した制限
フラグメントとして）を、プラスミドｐＬＰＣの唯一の
ＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した。この挿入により２種類
のプラスミドが得られた。これらは、ＢＫ　ＥｃｏＲＩ
フラグメントの配向においてのみ異なっており、それぞ
れｐｔ、　Ｐ　Ｃ４およびｐＬ　Ｐ　Ｃ５と命名した。
プラスミドｐｔ、　Ｐ　Ｃ４の制限部位および機能地図
を添付の第１１図に示し、プラスミドＩ）Ｌ　Ｐ　Ｃ４
およびｐｒ、　Ｐ　Ｃ５の構築を実施例８に記載する。
組換えＤＮＡ発現ベクターのエピソーム保持は、宿主細
胞染色体への組み込みの際に、常に好ましいというわけ
ではない。しかし、真核生物細胞中で機能する選択マー
カーが存在しないため、プラスミドｐｔ、ｐｃを別の選
択マーカー含有プラスミドと共形質転換しなければ、プ
ラスミドｐｔ、ｐｃの安定な真核生物性形質転換体を同
定するのは困難である。従って、プラスミドｐＬＰＣを
修飾して、真核宿主細胞中で選択しうるプラスミド誘導
体を作成した。
プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｈｙｇｓすなわちハイグロマ
イシン耐性付与遺伝子を含有するプラスミドの一部にプ
ラスミドｐｔ、　Ｐ　Ｃをライゲートすることによって
これを行った。プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｈｙｇ［この
プラスミドは、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラ
ボラトリ−（Ｎ　ＲＲＬ　）（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅ
ｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ　６１６４０）から取得番号Ｎ
ＲＲＬ　ｌ３−１８０３９のもとで入手することができ
るコの制限部位および機能地図を添付の第１２図に示す
。プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｈｙｇを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで消化し、完全なハイグロマイシン耐性付与遺伝子を
含有する〜２．５ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントを
単離し、フレノウ酵素ＥＥ、コリ（Ｅ　、ｃｏｌ　ｉ）
Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■のスブチリシン切断によって
得られる大きいフラグメント］で処理し、次いでフレノ
ウ処理した、プラスミドｐｌ。
ＰＣの〜５，８２ｋｂ　ＮｄｅＩ−９ｔｕＩ制限フラグ
メントにライゲートしてプラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ
　ＩおよびｐＬＰＣｈｙｇ２を得た。プラスミドｐＬＰ
ＣｈｙｇｌおよびｐＬＰＣｂｙｇ２はハイグロマイシン
耐性付与フラグメントの配向だけが異なっている。プラ
スミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ　Ｉの制限部位および機能地
図を添付の第１３図に示し、プラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈ
ｙｇ　＋およびｐＬＰＣｈｙｇ２構築のプロトコールを
実施例９に記載する。
ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を含有する、
フレノウ処理した、プラスミドｐＢＷ３２の〜■。
９　ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントを、プラスミド
ｐＬＰＣの〜５．８２ｋｂ　Ｎｄｅｌ　−３ｔｕｌ制限
フラグメントに挿入することによって、ｄｈｆｒ遺伝子
を含有する上記と同様のヒトタンパク質Ｃ発現プラスミ
ドを構築した。得られたプラスミド、すなわちｐＬ　Ｐ
　Ｃｄｈｆｒ　１およびｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ２はｄｈ
ｆｒ遺伝子の配向だけが異なっており、これらのプラス
ミドの構築を実施例１１Ｂに記載する。
プラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ　１をさらに修飾してジ
ヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を導入した。ｄ
ｈｆｒ遺伝子はｄｈｆｒ−陰性の細胞における選択マー
カーであり、これを用い、宿主細胞をメトトレキセイト
にさらす（濃度を順次増加する）ことによって、ＤＮＡ
セグメントのコピー数を増加させることができる。この
ｄｈｒｒ遺伝子はプラスミドｐ１３Ｗ３２から得ること
ができる。プラスミドｐＢＷ３２の制限部位および機能
地図を添付の第１４図に示し、プラスミドＩ）ＢＷ３２
ｈ％築のプロトコールを実施例１０に記載する。
ｄｈｆｒ遺伝子を含有する、プラスミドｐＢＷ３２の〜
１．９ｋｂ　ＢａｍＨＴ制限フラグメントを単離し、フ
レノウ酵素で処理し、部分的にＥｃｏＲＩ消化したプラ
スミドｐＬＰｃｈｙｇｌに挿入してプラスミドｐＬＰｃ
ｈｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２を得た。プラスミドｐＬ　
Ｐ　Ｃｈｙｇ　１は２つのＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位
を含有し、１つはハイグロマイシン耐性付与遺伝子中に
、もう１つはプラスミドｐＢＲ３２２由来の配列中に存
在している。ｄｈｆｒ遺伝子を含有するフラグメントを
、プラスミドｐＬＰＣｈｙｇｌのｐＢＲ３２２由来配列
中に位置するＥｃｏＲＩ部位に挿入してプラスミドｐｔ
、、ｐｃｈｄｔおよびｐＬＰＣｈｄ２を得た。プラスミ
ドｐｔ、ｐｃｈｄｔの制限部位および機能地図を添付の
第１５図に示し、ｄｈｆｒ遺伝子を含有するＤＮＡセグ
メントの配向だけが異なっているプラスミドｐＬＰｃｈ
ｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２の構築を実施例１１に記載す
る。
プラスミドｐＬＰｃｈｄｌを修飾してプラスミドｐｈｄ
、すなわち本発明に係るＢＫエンハンサー−アデノウィ
ルス後期プロモーターカセットならびにハイグロマイシ
ン耐性付与およびｄｈｆｒ遺伝子の両者を含有するプラ
スミドを得た。プラスミドｐｈｄを構築するため、プラ
スミドｐＬＰｃｈｄｌをｄａｍ−Ｅコリ宿主細胞から調
製し、制限酵素Ｂｃｌｌで消化し、そして再び環化して
ヒトタンパク質ＣをコードしているＤＮＡを削除した。
プラスミドｐｈｄはＢｃｌ［制限酵素認識部位を１つだ
け含有しており、この部位は、本発明のＢＫエンハンサ
ーーアデノウィルス後期プロモーターから発現させよう
とするすべての配列を挿入するのに都合よく配置されて
いる。プラスミドｐｈｄの制限部位および機能地図を添
付の第１６図に示し、プラスミドｐｈｄ構築のプロトコ
ールを実施例１２に記載する。
本発明をさらに例示する別の発現ベクターであって、ヒ
トタンパク質Ｃを発現させるベクターはプラスミドｐＬ
ＰＣＥ１Ａである。プラスミドｐＬＰＣＥ１Ａはヒトア
デノウィルスタイプ２のＥ１Ａ遺伝子を含有し、この遺
伝子の産物は、上述のように、ＢＫエンハンサ−の活性
を増加さける。
すなわち、ＢＫエンハンサ−に直列するプロモーターか
らの転写は、Ｅ１Ａ遺伝子産物の存在下に増加する。Ｅ
１Ａ遺伝子を含有する、ヒトアデノウィルス−タイプ−
２ＤＮＡの〜１．８ｋｂＢａｌ■制限フラグメントを、
プラスミドｐｔ、ｐｃの〜５．８２ｋｂ　Ｎｄｅｌ−°
Ｓｔｕ！制限フラグメントとライゲートすることにより
、プラスミドｐＬＰＣＥ１Ａを構築した。プラスミドｐ
ＬＰＣＥ１Ａの制限部位および機能地図を添付の第１７
図に示し、プラスミドｐＬＰＣＥ１Ａ構築のプロトコー
ルを実施例１３に記載する。
本発明の発現ベクターのうちの多数は、組織プラスミノ
ーゲン活性化因子（ＴＰＡ）または修飾化ＴＰＡ（ＭＴ
ＰＡ）を発現させるために、ＢＫエンハンサー−アデノ
ウィルス後期プロモーターカセットを利用している。こ
のようなベクターを構築するため、プラスミドｐＢＷ３
２（第１４図）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、得られ
た〜５　、６　ｋｂフラグメントを再環化してプラスミ
ドｐＢ　Ｗ　３２　ｄｅｌを得た。修飾化ＴＰＡをコー
ドし、Ｈｉｎｄｌｌｌ制限部位を１つだけ含有するこの
プラスミドｐＢ〜Ｖ３２ｄｅ１をＨｉｎｄｌｌｌで消化
し、次いでプラスミドｐＢ　ａ１８　ｃａｔの〜０　、
６５　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグメントとライゲ
ートしてプラスミドｐＩ３ＬＴを得た。プラスミドｐＢ
ａｌ　８　ｃａｔについては実施例Ｉ７に記載するが、
このプラスミドは改良型ＢＫエンハンサーーアデノウィ
ルス後期プロモーターカセットを含有している。プラス
ミドｐＢＬＴの制限部位および機能地図を添付の第１８
図に示し、プラスミドｐＩ３ＬＴ構築のプロトコールを
実施例１４に記載する。
ＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＢＬＴに選択マーカー
を導入した。ある構築においては、ハイグロマイシン耐
性遺伝子を含有する、プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｈｙｇ
の〜２，５ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントを挿入し
てプラスミドｐＢＬＴｈｙｇｌおよびｐＢＬ　Ｔ　ｈｙ
ｇ　２を得、別の構築においては、ｄｈｆｒ遺伝子を含
有する、プラスミドｐＢＷ３２の〜Ｉ　、　９　ｋｂＢ
ａｉｌ−（Ｉ制限フラグメントを挿入してプラスミドｐ
Ｂ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ　ｌおよびｐＢＬＴｄｈｆｒ２を得
た。これら４種のプラスミド、ｐＢＬＴ５、ｐＬＰＣｈ
ｙｇ１、ｐＢＬＴｈｙｇ２、ｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ　１
、およびｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ２は、選択マーカーの種
類および／または配向だけが異なっている。プラスミド
ｐＢ　Ｌ　Ｔｈｙｇ　１およびｐＩ３Ｌ　Ｔｄｈｆｒ　
ｌそれぞれの制限部位および機能地図を添付の第１９図
および第２０図に示し、プラスミドｐＢ　Ｌ　Ｔｈｙｇ
　１　、　　ｐＢ　Ｌ　Ｔｈｙｇ２、ｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈ
ｒｒ　１　。
およびｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ２構築のプロトコールを実
施例１５に記載する。
ＴＰＡまたは修飾化ＴＰＡを発現させる本発明の他の発
現ベクターは、プラスミドｐＢＷ３２の構築に用いる中
間体であるプラスミドｐＴＰＡＩ０３から得られる。プ
ラスミドｐＴＰＡＩ０３構築のプロトコールを実施例１
Ｏに記載し、プラスミドｐＴＰＡ１０３の制限部位およ
び機能地図を添付の第１４図に示す。これらの誘導体を
構築するため、プラスミドｐＴＰＡＩ０３のＴＰＡコー
ド化領域の５°末端の商館にＢａｍＨＩ制限部位を導入
した。プラスミドｐＴＰＡ１０３を制限酵素Ｈｇａｌで
消化して、ＴＰＡコード化領域の５゛末端を含有する〜
０．５２ｋｂ　Ｈｇａｒ制限フラグメントを単離した。
フレノウ処理した後、このＨｇａＩフラグメントをＢａ
ｍＨＩリンカ−にライゲートし、制限酵素ＢａｍＨＩで
消化し、そしてＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＢＲ３
２２に挿入してプラスミドｐＴＰＡ６０１およびｐＴＰ
Ａ６０２を得た。プラスミドｐＴＰＡ６０２（このプラ
スミドは、挿入したＢａｍＨＩ制限フラグメントの配向
だけがプラスミドｐＴＰＡ６０１と異なる）の制限部位
および機能地図を添付の第２１図に示す。
次いで、プラスミドｐＴＰＡ６０２を制限酵素Ｂｇｌｌ
ｌおよび５ａｌｌで消化し、得られた〜４．２ｋｂＢｇ
ｌｌｌ−５ａｌ■制限フラグメントをプラスミドｐＴＰ
Ａ１０３の〜２．０５ｋｂ　５ａｌｌ　−ＢｇｌＩ［制
限フラグメントにライゲートしてプラスミドｐＴＰＡ６
０３を得た。従って、プラスミドｐＴ　Ｐ　Ａ６０３は
、両末端がＢａｍＨＩ制限部位で区切られているＴＰＡ
の完全なコード化配列を含有している。プラスミドｐＴ
ＰＡ６０３の制限部位および機能地図を添付の第２２図
に示す。プラスミドｐＴＰＡ６０３に類似しているが、
しかし改良型ＴＰＡをコードしているプラスミドを構築
するため、プラスミドｐＴＰＡ６０３を制限酵素Ｂｇｌ
ｌｌおよび５ｓｔｌで消化し、得られた〜５．０２ｋｂ
　ＢｇｌｌＩ−ＳｓｔＩフラグメントをプラスミドｐＢ
　Ｌ　Ｔの〜０．６９ｋｂ　ＢｇｌＩＩ−ＳｓｔＩ制限
フラグメントにライゲートした。次いで、得られたプラ
スミド（ｐＭＴＰＡ６０３と命名した）を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで消化し、得られた〜１，３５ｋｂフラグメント
を単離した。このフラグメントおよびプラスミドｐＴＰ
Ａ６０３の〜１．９０ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメン
トを、別々にＢｃｌＩ消化したプラスミドｐｈｄ（第１
６図）にライゲートして、それぞれプラスミドｐｈｄＭ
ＴＰＡおよびｐｈｄＴ　Ｐ　Ａを得た。プラスミドｐｈ
ｄＴＰＡおよびｐｈｄＭＴＰＡの制限部位および機能地
図をそれぞれ添付の第２３図および第２４図に示す。プ
ラスミドｐｈｄ’ｒ　Ｐ　ＡおよびｐｈｄＭ　Ｔ　Ｐ　
Ａの構築（プラスミドｐＴＰＡ６０２構築のプロトコー
ルから始める）を実施例１６に記載する。
本発明は、真核生物性プロモーターと直列してＢＫエン
ハンサ−を用いて、大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝
子を発現する真核宿主細胞において、Ｄ　Ｎ　Ａ配列を
転写および発現させるための方法を包含する。本方法に
おいて、実質的にすべての真核生物性プロモーターをＢ
Ｋエンハンサ−と直列して用いることができるというこ
とについては当業者の理解するところであろう。たとえ
ば、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ＢＫ初期お
よび後期プロモーター、すべてのポリオーマウィルス群
またはパボバウィルス群の初期および後期プロモーター
、単純性庖疹ウィルスチミジンキナーゼプロモーター、
インターフェロンα１プロモーター、マウスメタロチオ
ネインプロモーター、レトロウィルス群のプロモーター
、β−グロビンプロモーター、アデノウィルス群のプロ
モーター、ウニＨ２Ａプロモーター、コンアルブミンプ
ロモーター、卵アルブミンプロモーター、マウスβ−グ
ロビンプロモーター、ヒトβグロビンプロモーター、お
よびラウス肉腫ウィルスの長い末端繰り返しくＬ　Ｔ　
Ｒ）プロモーターは、本発明方法において、すべて真核
生物性プロモーターとして役立ちうる。さらに、上流の
ｒｃＡＡＴＪ配列を有するか、または有しないｒＴＡＴ
Ａｊ様の配列からなる転写開始部位を含有するすべての
配列が、本発明におけるプロモーターとして役立ちうろ
。このようなプロモーターをＢＫエンハンサ−含有の発
現ベクター中に都合よく挿入することによって、該プロ
モーターを本方法に用いることかできる（本方法に用い
るに好ましい真核生物性プロモーターであるアデノウィ
ルス−２後期プロモーターを用いて本明細書中に例示し
たようにして）。
本発明を例示するものである本明細書中のベクターに用
いられるＢＫエンハンサ−は、ＢＫウィルスの原型菌株
から単離されたものである。しかし、多数のＢＫウィル
ス変異株が単離され、開示されている。ガードナー等［
Ｇａｒｄｎｅｒ　ｅｔ　ａ１、、ＴｈｅＬａｎｃｅｔ　
、　１　：　１２５３（１９７１）　；Ｇａｒｄｎｅｒ
、　Ｂｒ１ｔ、Ｍｅｄ、　Ｊ　、　、　ｌ　ニア７−７
３（１９７３）をも参照］は最初のＢＫウィルスの単離
について記載しており、従ってこのガードナー株は原型
または野生型ＢＫウィルスと称されている。
ＢＫウィルスのガードナー株（第１図）は、ＡＴＣＣか
ら取得番号ＡＴＣＣＶＲ−８３７のもとて入手可能であ
る。大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物の存在下
に、ＢＫエンハンサ−を真核生物性プロモーターと直列
して用いて有用な物質（たとえば、核酸およびタンパク
質）を発現させる方法、およびそれ以外のすべての本発
明方法は、原型味のエンハンサ−が好ましいものではあ
るが、いずれもガードナー株または特定のＢＫ変異株に
限定されるものではない。本発明方法に用いることがで
きる多数の代表的なりＫ変異株を以下の第１表に挙げる
。
宿主細胞が大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物を
発現するものである限り、本方法において種々の真核宿
主細胞を用いることができるということについては当業
者の理解するところであろう。多数の方法（たとえば、
プラスミドまたは他のベクターを用いる形質転換）によ
って即時型遺伝子産物を宿主細胞に導入することができ
るので、実質的にすべての真核細胞を本方法に用いるこ
とができる。ヒト細胞はＢＫウィルスの天然の宿主であ
り、かつＢＫエンハンサ−の刺激に役立つ細胞因子を含
有していると考えられるので、本発明方法における好ま
しい宿主細胞はヒト細胞である。
宿主細胞としてはヒト腎細胞が特に好ましいが、Ｅ１Ａ
遺伝子産物を発現するアデノウィルス　５−形質転換し
たヒト胎児腎細胞セルライン２９３が最も好ましく、こ
のセルラインはＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣＣＲＬ　
　１５７５３のもとて入手可能である。
２９３細胞がＥ１Ａｉ１４＝子産物を発現するという理
由だけではなく、２９３細胞がタンパク質Ｃのような複
雑な遺伝子産物をγ−カルボキシル化することができ、
かつそれ以外に該産物を正確にプロセッシングすること
ができるという理由から２９３セルラインが好ましい。
腎細胞は通常ある種のタンパク質をγ−カルボキシル化
し、かつそれ以外にそれをプロセッシングするが、２９
３細胞をアデノウィルスで形質転換すると、通常特殊な
機能が失われてしまう。従って本発明は、天然にγカル
ボキシル化され、正しく折りたたまれ、そしてプロセッ
シングされたタンパク質を産生させるための方法（該タ
ンパク質を組換えＤＮＡベクター中にコード化して、該
ベクターを含有する真核宿主細胞を適当な発現条件下で
培養したときに該タンパク質が発現されるようにする方
法）の改良法であって、改良点が、（ａ）アデノウィル
スで形質転、換したヒト胎児腎細胞に該ベクターを挿入
すること、および（ｂ）カルボキシル化のための十分量
のビタミンにを含有する培地中、増殖条件下で工程（ａ
）の宿主細胞を培養すること、からなろ方法をも包含す
るものである。
真核生物性プロモーターと関連しているＢＫエンハンサ
−の活性を改良するための方法を用いて、実施例！７に
記載した新規ＢＫエンハンサーー真核生物性プロモータ
ー構築物を構築した。この方法は、ＢＫエンハンサ−と
直列して用いる真核生物性プロモーターのＣＡＡＴ領域
の５°末端の上流側０−３００ヌクレオチド以内にＢＫ
エンハンサ−を配置することからなる。この方法によっ
て調製した改良型カセットは本発明の重要な態様を構成
する。改良型カセットの好ましい使用法は、大きいＤＮ
Ａウィルスの即時型遺伝子産物による改良型カセットの
刺激を包含するものであるが、Ｅ１Ａまたは類似の遺伝
子産物を発現する宿主細胞に限定はされない。
アデノウィルスのＶＡ遺伝子産物などの他のウィルス性
遺伝子産物を用いて、本方法（ＢＫエンハンサ−を用い
て真核宿主細胞における組換え遺伝子の転写および発現
を促進させる）の全体の効率を増加させることができる
。このＶＡ遺伝子産物は、アデノウィルスの３分節リー
ダーを含有するｌｌｌＲＮＡ分子の翻訳効率を増加させ
る［カウフマン（Ｋａｕｒｍａｎ、ＰＮＡＳ、８２：６
８９−６９３（１９８５））：スベンソンおよびアクジ
ャルル（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ　ａｎｄ　Ａｋｕｓｊａｒｕ
１、ＥＭＢｏ。
４：９５７−９６４（１９１１１５））］。本発明のベ
クターを修飾してアデノウィルスの完全な３分節リーダ
ーをコードさせることもできるが、実施例１８に示すよ
うに、本発明はＶＡ遺伝子産物を用いて、アデノウィル
スの３分節リーダーの最初の部分だけを含有するｍＲＮ
Ａの翻訳を増加させることを含むものである。
アデノウィルスの３分節リーダーは以下の配列で示され
る： ＊−−−−−−−−−−−−−−−−−５°−ＡＣＵＣ
ＵＣＵＵＣＣＧＣＡＵＣＧＣＵ−−−一一−−−最初の
部分−一一−−−−−ＧＵＣＵＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＧ
ＣＬＩＧＵＵＧ−＊：＊−−−−−−−−−−−−−一
−−−ＧＧＣＵＣＧＣＧＧｔＪｔＪＧＡＣＧＡＣＡＡＡ
Ｃ−−−−−−−−２番目の部分−−−一−−−ＵＣＵ
ＵＣＧＣＧＧＵＣＵＵＵＣＣＡＧＵＡＣＵ　ＣＵ　Ｕ　
Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｕ　ＣＧ　Ｇ　ＡＡ　Ａ　ＣＣＣＧ　Ｕ　
ＣＧ−−−−−−−−−＊＊−−−−−−−−−ＧＣＣ
ＵＣＣＧＡＡＣＧＵＡＣＵＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＧ
ＡＣＣＵＧＡＧＣＧＡＧＵＣＣ−−−−−−一−３番目
の部分−一一一一〜−ＧＣＡＵＣＧＡＣＣＧＧＡｔＪＣ
ＧＧＡＡＡＡＣＣＵＣＵＣＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＵＣＵ
ＡＡＣ−−−一−−−−−−−−−＊ ＣＡＧＵＣＡＣＡＧＵＣＧＣＡ−３゜ ［配列中、Ａはリボアデニル、Ｇはリボグアニル、Ｃは
リボシチジル、およびＵはウリジルである］。
本明細書中において、アデノウィルスの３分節リーダー
の「最初の部分」とは、少なくとも以下の配列を含有す
るものである： ５°−ＡＣＵＣＵＣＵＵＣＣＧＣＡＵＣＧＣＵＧＵＣＵ
ＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＧ−３’すなわち本発男は、有用
な物質をコードしているＤＮＡ配列および真核生物性プ
ロモーターの両者を含有している組換えＤＮＡベクター
で形質転換した真核宿主細胞において、該有用な物質を
産生させるための方法（該プロモーターから発現するよ
うに該配列を配置し、該有用な物質の発現に適した条件
下で該ベクターを含有する該細胞を培養する）の改良法
であって、ｍＲＮＡがアデノウィルスの完全な３分節リ
ーダーを含有しないという限定のもと、改良点が、 （ａ）アデノウィルスの３分節リーダーの最初の部分を
コードしているＤＮＡを該ベクター中に導入して、転写
に際して、生成したｍＲＮＡが該有用な産物をコードし
、そしてその５°末端において該３分節リーダーの最初
の部分を含有しているようにすること、 （ｂ）工程ａ）のベクターを含有している該細胞に、該
アデノウィルスのＶＡ遺伝子産物の発現をコードしてい
るＤＮＡ配列を付与すること、および（ｃ）該ＶＡ遺伝
子産物の発現および該ｍＲＮＡの翻訳の刺激に適した条
件下で工程ｂ）の細胞を培養すること、 からなる方法を含有するしのである。
ＶＡをコードしているプラスミドは、アデノウィルスＤ
ＮＡから構築した。アデノウィルス−２ＤＮＡから、ヌ
クレオチド９８３３の５ａｌＩ部位およびヌクレオチド
１１５５６のＨｉｎｄｌ１１部位を境界とする〜１７２
３ｂｐの制限フラグメントを単離し、Ｈ１ｎｄｌｌｌ　
−Ｓ　ａ日清化したプラスミドｐ［３Ｒ３２２中にクロ
ーンし、こうしてｐＢＩ’（３２２の〜６２２ｂｐ　Ｓ
ａｔ　ｌ−Ｈ１ｎｄｌｌ！フラグメントを置換してプラ
スミドｐＶＡを構築した。プラスミド１）ＶＡから〜Ｉ
　８２６ｂｐ　ＮｒｕＩフラグメントを単離し、このフ
ラグメントをフレノウ処理したＢａｍ１−１１消化プラ
スミドｐＳ　Ｖ　Ｎｅｏ（Ｂ　ＲＬから入手可能）中に
挿入することによって、ネオマイシン耐性およびＶＡを
コードしているプラスミドを構築した。得られたプラス
ミド（ｐＶＡ　　Ｎｅｏと命名した）を用い、形質転換
後のネオマイシン（Ｇ４１８）耐性選択によって、すべ
てのセルラインにＶＡ遺伝子を挿入することができる。
ＳＶ４０、ＢＫウィルス、またはその他のすべてのポリ
オーマウィルスのＴ−抗原を本発明のベクターとともに
用いて、複製を刺激することによりプラスミドのコピー
数を増加させ、モして／またはプロモーター活性を増加
させることができろ。
５Ｖ４０Ｔ−抗原はアデノウィルスおよびＢＫ後期プロ
モーターの両者からの転写を刺激する。
本発明の発現ベクターにＴ−抗原コード化配列を含有さ
せること、またはこのベクターをＴ−抗原コード化配列
を有するプラスミドと同時トランスフェクションするこ
とにより、実施例１９に概説したような選択圧の応用に
先だって、コピー数の増幅を得ることができる。これは
、発現ベクターの高コピー数組み込みを可能にする。
従って、本発明の好ましい態様においては、組換えＤＮ
Ａ発現ベクターは、アデノウィルス後期プロモーター（
それ自身は、少なくとも３分節リーダーの最初の部分お
よび有用な物質をコードしている遺伝子を発現させるよ
うに配置されている）の上流側３００ヌクレオチド以内
に配置した原型菌株のＢＫエンハンザ−を含有する。こ
の好ましいベクターを用い、修飾を加えて（発現ｌ＼ク
ターで形質転換する前または後に）アデノウィルスのＶ
Ａ遺伝子産物を発現させるようにしたヒト胎児腎２９３
細胞を形質転換する。
以下に実施例を挙げて、本発明の方法、化合物および組
換え微生物をさらに詳しく説明するが、実施例中に記載
した特定の試薬、装置および方法は単に説明のために挙
げたものであって、本発明を限定するものではない。
実施例Ｉ　　ＢＫウィルスＤＮＡの調製ＢＫウィルスを
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ
ＴＣＣ）から取得番号Ａ　’Ｉ”　ＣＣＶＲ−８３７の
もとで人手する。このウィルスは凍結乾燥品として得ら
れ、これをハング（Ｉｌａｎｋ）のバランス塩［ギブコ
（Ｇｉｂｃｏ、３１７５５ｔａｌｅｙ　Ｒｏａｄ。
Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ　１４０７２）］に再
懸濁して約１０’プラーク生成単位Ｃｐｆｕ）／ｍ（ｌ
の力価にする。１３にウィルスＤＮ／４Ｊ１製用に選択
した宿主は１次（プライマリ−）ヒト胎児腎（ＰＨＥＫ
）細胞であり、この細胞はフロラ・ラボラトリーズ社（
Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔ。
ｒｉｅｓ、ｌｎｃ、、７６５５０１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｈ
ｏｕｓｅ　Ｒｏａｄ、ＭｃＬｅａｎ、ＶＡ　２２１０１
）からカタログ番号０−１００のもとで、またはＭ、Ａ
、バイオプロダクツ（Ｍ、Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ
）からカタログ番号７０−１５１のもとで入手すること
ができる。
全面単層の約１０８ＰＨＥＫ細胞を含有する７５ｉｉ’
ポリスチレンフラスコ約５個を用いてウィルスを調製す
る。力価１０５ｐｆｕ／ｍσのＢＫウィルス約ＩＲＱを
各フラスコに加え、これを３７℃で１時間インキュベー
トし、次いて新鮮な培養培地臼０％ウシ胎児血清を追加
したデルベッコの改良イーグル培地（Ｄｅｌｂｅｃｃｏ
’ｓ　Ｍｏｄｉｌ’ｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉ
ｕｍ、Ｇｉｂｃｏ）］を加え、感染細胞を３７℃で１０
−１４日間またはウィルスの完全な細胞病原性効果が認
められるまでインキュベートする。この細胞病原性効果
はセルラインの種類およびウィルスの種類によって変わ
るが、通常、丸くなり、凝集し、そして培養盤から剥が
れる細胞からなる。
凍結−解凍を３回繰り返すことによってこの細胞からウ
ィルスを放出させ、５０００Ｘｇで遠心して細胞破片を
除去する。ＰＥＧ−６０００（１００ｇ）を加え、この
溶液を４℃で２４時間インキュベートし、モして５００
０Ｘｇで２０分間遠心することによって、上清液ＩＱ中
のウィルスを沈澱させ、集める。このペレットを、最初
の容積の１／１００となるように０．ＩＸ　　ＳＳＣ緩
衝液［ＩＸ　　５ＳＣ＝Ｏ，Ｉ　５Ｍ　ＮａＣＱおよび
０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ（ｐＨ＝　７　）］に溶解す
る。このウィルス懸濁液を、試験管中の飽和ＫＢｒ溶液
ｌ５１１ＩＱに層状に加え、これを７５，０００Ｘｇで
３時間遠心する。遠心後、このＫＢｒ溶液中に２つのバ
ンドが現れる。完全なピリオンを含有する低い方のバン
ドを集め、ＴＥ［１０ｍＭトリスートｔｃｃ（ｐ１４−
７．８）および１ｍＭＥＤＴＡ］を溶離緩衝液として用
いてセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ　−５０
カラムで脱塩する。
このカラムから得た精製ピリオン溶液に、ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）をｉ％濃度となるように加え、プ
ロナーゼを１００μ９ＩＲＱ’ａ度となるように加え、
そしてこの溶液を３７℃で２時間インキュベートする。
次いで、この溶液に塩化セシウムを１．５６９／πＱ濃
度となるように加え、臭化エチジウムを最終濃度１００
μ９／ＭＱとなるように加える。この溶液を、ソーパル
（Ｓｏｒｖａｌ）８６５０−ターまたは同様の垂直ロー
ター中、２６０．０００Ｘｇで２４時間遠心する。遠心
後、ウィルスＤ　Ｎ　Ａのバンドを単離し、ｌ００ｍＭ
トリス−ＨＣＱ（ｐＨ＝７．８）で飽和したイソアミル
アルコールで５回抽出する。次いでこのＢＫウィルスＤ
　Ｎ　Ａの溶液を、ＤＮＡの２６０ｎｍ／２８０ｎｍ吸
収比が１．７５と１．９０の間に入るまで、ＴＥＩ衝液
に対して透析する。ＮａＣＱａ度を０．１５Ｍに調整し
、２倍量のエタノールを加え、この溶液を一７０℃で少
なくとも２時間インキュベートし、そして１２，０００
Ｘｇで１０分間遠心することによってＤＮＡを沈澱させ
る。得られたＢＫウィルスＤＮＡのベレットを、１ＩＮ
９７峠の濃度でＴＥＩＩ衝液に懸濁させる。
実施例２　プラスミドｐＢＫＥＩおよびｐＢＫＥ２の構
築 ＴＥ緩衝液ｌμｇ中のＢＫウィルスＤＮＡ（実施例１で
調製した）約１μ９を、１０ＸＥｃｏＲｔｇ衝液［１，
０Ｍトリス−１−ＩＣ＆（ｐＨ＝７．５）、０．５Ｍ　
ＮａＣＬ　５０ｍＭ　ＭｇＣＱｔおよびｌｚｇ／ＪＢＳ
Ａ］２μＱおよび水１５μＱに溶解した。このＤＮＡ溶
液に、制限酵素ＥｃｏＲＩ約２μＱ［〜１０単位；酵素
の実際の供給源は異なることもあるが、本明細書中て用
いろすべての酵素単位は、他に記載がなければ、二ニー
・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、３２　Ｔｏｚｅｒ　Ｒｏａｄ、Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ　０１９１５−９９９０）定義の単
位を意味する］を加え、得られた反応溶液を３７℃で２
時間インキュベートした。
実質的に、ＥｃｏＲＩ消化したＩＮＫウィルスＤＮＡを
調製するための方法に従って、ＴＥ緩衝液１μρ中のプ
ラスミドｐＵＣ８［ファーマシア　Ｐ−Ｌバイオケミカ
ルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ。
８００　Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ　Ａｖｅ、、Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、０８８５４）から入手可能］約１
μ９をＥｃｏＲＩで消化した。このＥｃｏＲＩ消化した
プラスミドｐＵＣ８ＤＮＡをＴＥ１１衝液で１００μａ
に希釈し、この溶液にウシ腸アルカリホスファターゼ〜
０．０６単位を加え、得られた反応溶液を３７°Ｃで３
０分間インキュベートした。ｌｘ　　ＳＥＴ［５ｍＭ）
リス−１−ＩＣ（ｌｃｐｌ−１＝７．８）、５ｍＭＥＤ
ＴＡおよび１５０ｍＭＮａＣ＆］、０．３Ｍ　Ｎａ０Ａ
ｃ、および０．５％ＳＤＳを含有するようにこの溶液を
調整し、次いで６５℃で４５分間インキュベートした。
このホスファターゼ処理はｐＵＣ８ＤＮＡが自己ライゲ
ートするのを防止する。
このＥｃｏＲＩ消化したＢＫウィルスおよびプラスミド
ｐＵＣ８ＤＮＡを、始め緩衝フェノールで、次いでクロ
ロホルムで抽出した。各ＤＮＡ溶液のＮａＣＱａ度度を
０．２５Ｍに調整し、２倍量のエタノールを加え、得ら
れた混合物をドライアイス−エタノール浴で５分間イン
キュベートし、そして遠心してＤＮＡをベレット化する
ことによってＤＮＡを集めた。上清を除去し、ＤＮＡペ
レットを７０％エタノールですすぎ、乾燥し、そしてＢ
Ｋおよびプラスミドｐｕｃａ試料用のＴＥ緩衝液それぞ
れ１０μＱおよび３０μＱに再懸濁した。
水約３μｇおよび１０Ｘ　　リガーゼ緩衝液［０，５Ｍ
ト！、１スーＨＣｆｆ（ｐＨ＝７．８）、１００　ｍＭ
　ＭｇＣｅ３．２００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ
、および０．５ｍｇ／ｍＱＢｓＡ］Ｉμ１２を、Ｅｃｏ
ＲＩ消化したＢＫウィルス２μｅおよびＥｃｏＲＩ消化
したプラスミドｐＵｃ８　　ＤＮＡＩμＱの混合物に加
えた。
このＤ　Ｎ　Ａ溶液にＴ４　　ＤＮＡリガーゼ１μｅ（
〜１０００単位）を加え、得られた反応液を１６℃で一
晩インキユベートした。このライゲート化ＤＮＡは所望
のプラスミドｐＢＫＥ１およびｐＢＫＥ２からなり、こ
れらは挿入したＢＫウィルスＤＮＡの配向だけが異なっ
ている。プラスミドｐＢＫＥｌの制限部位および機能地
図を添付の第２図に示す。
Ｌ−ブロス中のＥ２コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ　１２　　
Ｊ　ＭＩ０３（ファーマシアＰ−Ｌバイオケミカルズか
ら入手可能）培養物５０ｚＱを、６５０ナノメーｈ−１
，−ＧＩ＋Ｘ＄’ｆｆ案庁／ｎＴ”ｌ　−’−）Ｍ’ｌ
ｈｎ　　ＡｆＦｂ’ｌＶ単位になるまで増殖さけた。こ
の培養物を水上で１０分間冷却し、遠心して細胞を集め
た。この細胞ペレットを１００ｍＭの冷ＭｇＣＱ、２５
　ｔｈＱに再懸濁し、氷上で２５分間インキュベートし
た。この細胞を遠心してもう一部ベレット化し、ペレッ
トを１００ｍＭの冷ＣａＣｌ２ｔ２，５好に再懸濁し、
水上で３０分間インキュベートした。インキュベート後
、この細胞は形質転換するＤＮＡの取り込みに対してコ
ンピテントである。
この細胞懸ｍａ２ｏｏμＣを、上記のようにして調製し
たライゲート化ＤＮＡと混合し、氷上で３０分間インキ
ュベートした。この時間が経過した後、細胞を４２℃の
水浴に２分間入れ、次いで氷上に戻してさらに１０分間
インキュベートした。
遠心して細胞を集め、Ｌ−ブロス１ｘｆ２に再懸濁し、
３７°Ｃで１時間インキュベートした。
この細胞混合物の一部を、１００μ９アンピシリン／酎
、４０　ｕ９　Ｘ−ｇａｌ／ｘＱおよび４０μ９ＩＰＴ
Ｇ／ｘｃ含有のＬ−寒天（１ρあたり寒天Ｉ５９含有す
るし一ブロス）プレート上にプレートした。
このプレートを３７℃で一部インキユベートした。
挿入体を含まないプラスミドを含有するコロニー（Ｅ、
コリに１２　　ＪＭＩ０３／ｐＵＣ８など）はプレート
上で青色を呈し、挿入体を含むプラスミドを含有するコ
ロニー（Ｅ、コリに１２　　ＪＭ１０３／ｐＢＫＥ１）
は白色を呈する。白色コロニー数個を選び、それらのプ
ラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって、ＢＫウィルス
の〜５．２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ制限フラグメントの存在に
ついてスクリーニングした。実質的に、後記実施例記載
のプラスミドＤＮＡの単離方法に従って（制限酵素分析
のためだけにプラスミドＤＮＡを単離するときには、Ｃ
ｓＣＩ２勾配の工程を省略し、比較的小さいスケールで
行う）、Ｅ、コリＫＩ２　　ＪＭＩ０３／ｐＢＫＥ１お
よびＥ、コリＫＩ２　　ＪＭ１０３／ｐＢＫＥ２細胞か
らプラスミドＤＮＡを得た。
実施例３　プラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅ
ｏ２の構築 Ｅ、：１ＩＩＪＫ　１２　　ＨＢ　Ｉ　Ｏｌ／ｐｄＢＰ
Ｖ−ＭＭＴｎｅｏ細胞を、ＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣ
Ｃ３７２２４のもと、凍結乾燥品として入手する。この
凍結乾燥細胞を、１００μ９７Ｈのアンピシリンを含有
するし一寒天プレート上にプレートし、３７°Ｃでイン
キュベートして単一のコロニー単離体を得る。
５０μ９７Ｍ（ｌのアンピシリンを含有するし一ブロス
（ＩＣあたりトリプトン１０ｇ、ＮａＣ（！１０９、お
よび酵母抽出物５ｇ）１１２にＥ、コリＫＩ２ＨＢ１０
１／ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏのコロニーを接種し、空
気振盪器中、３７℃で、Ｏ，Ｄ、５＋＋ｏが〜ｌ吸収単
位になるまでインキュベートし、この時点でクロラムフ
ェニコール１５０ｚｇを培養物に加えた。インキュベー
トを約１６時間継続した。クロラムフェニコールの添加
によりタンパク質の合成が阻害され、従って細胞分裂が
阻害されるが、プラスミドの複製は継続して起こり得る
。
この培養物を、ソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ）Ｇ　Ｓ　Ａ
ローター（ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｏ、、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＤｉｖｉ
ｓｉｏｎ、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＣＮ　０６４７０）中、６
０００　ｒｐｍ。
４℃で５分間遠心した。得られた上滑を除去し、細胞ペ
レットをＴＥＳ緩衝液［１０ｍＭ）リス−ＨＣＱ（ｐＨ
＝　７　、５　）、ｌ　Ｏａ＋Ｍ　ＮａＣＣ１およびＩ
ｍＭＥＤＴＡ］４０ｉ（２で洗浄し、次いで再ペレット
化した。上清を除去し、細胞ペレットをドライアイス−
エタノール浴で凍結させ、次いで解凍した。
解凍した細胞ペレットを、２５％ショ糖および５０ｍＭ
ＥＤＴＡの溶液１０ａ＋ｃに再懸濁した。この溶液に５
Ｒ９／７ＩＱリソチ一ム溶液約１ｍＱ、０．２５ＭのＥ
ＤＴＡ（ｐｌ−１＝８．０）３ＩＩＩＱ、およびＩａｎ
９／肩ＱのＲＮアーゼＡ　　１００μｇを加え、次いで
水上で１５分間インキュベートした。このリソデーム処
理した細胞に、溶解溶液［１０％トリトン−Ｘ１００（
３Ｒ＆）、０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０）７５
ｉ１２．ＩＭ）リス−ＨＣ＋２（ｐＨ＝８．０）１５ｚ
（２゜および水７Ｊ１１２を混合して調製するコ３ｍＱ
を加え、混合し、得られた溶液を氷上でさらに１５分間
インキュベートした。溶解した細胞をドライアイス−エ
タノール浴で凍結させ、ついで解凍した。
５Ｗ２７０−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ、７３６ＯＮ、Ｌｉ
ｎｃｏｌｎ　Ａｖｅ。
、Ｌｉｎｃｏｌｎｗｏｏｄ、ＩＬ　６０６４６）中、２
５．ＯＯＯｒｐｍで４０分間遠心し、緩衝フェノールで
抽出することによって、溶液から細胞の残骸を除去した
。この細胞抽出物に、Ｃ３ＣＱ約３０．４４９および５
　ｍ？／ｍｃ臭化エチジウム溶液〜ＩｚＣを加え、次い
でこの溶液の容量をＴＥＳ緩衝液で４０ｙ（ｌに調整し
ｒ：ｏ　この溶液をＶＴｉ５０超遠心管（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）中にデカンテーションし、次いで封をし、ＶＴｉ５
０ローター中、４２．００Ｏｒｐｍて〜１６時間遠心し
た。紫外線で目に見えるようにしたプラスミドのバンド
を単離し、Ｔｉ７５遠心管およびローター（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ）に入れ、５０．ＯＯＯｒｐｍで１６時間遠心した
。
必要な容量調整はすべてｏ、７６１９／７１ｃのＣ５Ｃ
Ｑを含有するＴＥＳを用いて行った。このプラスミドバ
ンドをもう一度単離し、塩で飽和させたイソプロパツー
ルで抽出して臭化エチジウムを除去し、そしてＴＥＳｇ
衝液でｌ：３に希釈した。次いでこの溶液に２倍量のエ
タノールを加え、−２０°Ｃて一部インキユベートした
。この溶液を、５９３４０−ター（Ｓｏｒｖａｌｌ）中
、１０．ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心することによって
、プラスミドＤＮＡをベレット化した。
この方法によって得たプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎ
ｅｏ　ＤＮＡ　＝　１７１ｇをＴＥＡ衝液ｌｕｌ！（！
に懸濁させ、−２０℃で保存した。通常、前記のプラス
ミド単離法は、大量の極めて純粋なプラスミドＤＮＡが
必要なときに用いられる。この方法を若干変え、培養細
胞を約５ｇ（たけ用い、適宜減少させた溶解緩衝液中で
細胞を溶解し、そして遠心工程をフェノールおよびクロ
ロホルム抽出に置き換えることによって、比較的少量の
、やや純度の劣るＤＮＡ（あるプラスミドの存在につい
て形質転換体をスクリーニングする場合に必要となるよ
うなりＮＡ）を早く得ることができる。
１０　Ｘ　ＢａｍＨＩ緩衝液［１，５ＭＮａＣ！２．６
０ｍＭ）リス−Ｈ（ｊ！（ｐＨ＝７．９）、６０ｍＭ　
ＭｇＣｌ２７、およびＩ　ｍ９／ｒｎＱＢ　Ｓ　Ａｌ１
　ｔｔ（１、制限酵素Ｂａｍ１−１１１μＱおよび水７
μｇを含有する溶液中、３７℃で２時間、上記で調製し
たプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　ＤＮＡ約５１
１９（５μａ）および実施例Ｉで調製したＢＫウィルス
Ｄ　Ｎ　Ａ　５μ９（５μＣ）それぞれを消化した。等
容量のフェノールで抽出し、次いでクロロホルムで２回
抽出することによって反応を停止させた。ＢａｍＨＩ消
化したＤＮＡそれぞれを沈澱させ、遠心して集め、水５
μｇに再懸濁した。
ＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ−ＭＭＴ
ｎｅｏ（１ｕ　Ｑ）およびＢａｍＨＩ消化したＢＫウィ
ルスＤＮＡ（１μυの混合物に、１０ｘリガ一ゼ緩衝液
約１μｇを加えた。このＤＮＡ混合物に、Ｔ−４ＤＮＡ
リガーゼｌμＱ（〜１０００単位）および水６μＱを加
え、得られた反応溶液を１６℃で一部インキユベートし
た。このライゲート化Ｄ　Ｎ　Ａは所望のプラスミドｐ
ＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２からなり、これらは
ＢＫウィルスＤＮＡの配向だけが異なっている。プラス
ミドｐＢＫｎｅｏ＋の制限部位および機能地図を添付の
第３図に示す。
Ｅ、コリＫＩ２ＨＢＩ０１細胞は、ノーザン・リージョ
ナル・リサーチ・ラボラトリ−（ＮＲＩＩＬ）から取得
番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５６２６のらと、凍結乾燥品とし
て人手可能である。実質的に、実施例２の方法に従って
、Ｅ、コリＫ１２ＨＢ、１０１細胞を培養し、形質転換
用にコンピテントにし、上記で調製したライゲート化Ｄ
ＮＡで形質転換した。この形質転換細胞を、１００μｇ
／１ｘ（ｌアンピシリンを含有するし一寒天プレート上
にプレートした。Ｅ、コリＫ　１２　　ＨＢ　Ｉ　Ｏ１
／ｐＢＫｎｅｏｌおよびＥ、コリＫＩ　２／ｐＢＫｎｅ
ｏ２形質転換体を、そのアンピシリン耐性の表現型およ
びそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定し
た。
実施例４　プラスミドｐＢＬｃａＬの構築Ａ、東刑伴プ
ラスミドｐＬＰｃａｔの構築アデノウィルス２（Ａｄ２
）のピリオンＤＮＡは、約３５．９４ｋｂの大きさの、
２本鎖の直線状分子である。このＡｄ２の後期プロモー
ターは、Ａｄ２ゲノムの〜０．３１６ｋｂ　ＡｃｃＩ　
−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントとして単離することがで
き、この〜０゜３２ｋｂ制限フラグメントは、Δｄ２ゲ
ノムのヌクレオチド位置５７５５と６０７１の間の配列
に対応している。所望の〜０．３２ｋｂ　Ａｃｃ［−Ｐ
ｖｕｌｌ制限フラグメントを単離するため、始めにＡｄ
２ＤＮＡを制限酵素Ｂａ１Ｉで消化し、〜０．３２ｋｂ
Ａｃｃ　Ｉ　−Ｐ　ｖｕｌｌ制限フラグメントの完全な
配列を含有する〜２．４ｋｂＢａｌｌ制限フラグメント
を単離する。次いで、この〜２．４ｋｂ　ｌ３ａｌｌ制
限フラグメントをＡｃｃｌおよびＰｖｕｌｌで消化して
所望のフラグメントを得る。
Ａｄ２　　ＤＮＡ（ＢＲＬから入手可能）約５０μ９を
、水８０μρおよび１０ＸＢａｌｌｌ衝液［１００ｍＭ
）リス−ＨＣｆｆ（ｐＨ＝７．６）、１２０ｍＭＭｇｃ
Ｑｖ、Ｉ　００ｍＭ　ＤＴＴ、およびｌ　ｍｇ／ｍＱ　
Ｂ　ＳＡ］１０μＱに溶解する。このＡｄ２　　ＤＮＡ
の溶液に、制限酵素Ｂａ１Ｉ約１０μＱ（〜２０単位）
を加え、得られた反応液を３７℃で４時間インキュベー
トする。
制限フラグメントが十分に分離するまで、ＢａｔＩ消化
したＤ　Ｎ　Ａをアガロースゲル電気泳動にかける。電
気泳動したＤ　Ｎ　Ａの可視化は、臭化エチジウムの希
釈溶液（０，５μ９／村）中でゲルを染色し、染色した
ゲルに長波長紫外光（ＵＶ）をあてることによって行う
。アガロースからＤＮＡを単離する方法の１つは以下の
ようである。所望のフラグメントの前方のゲルに小さい
切れ目を入れ、各切れ目にＮＡ−４５ＤＥＡＥメンブラ
ン［シュライヒャー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌ１、Ｋｅｅｎｅ、Ｎ！
＋　０３４３１）］の小片を差し込む。さらに電気泳動
を続けると、ＤＮＡがＤＥＡＥメンプランに非共有結合
的に結合する。所望のフラグメントがＤＥＡＥメンプラ
ンに結合した後、メンプランを取り上げ、低塩の緩衝液
［＋　００ｍＭ　ＫＣＬＯ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、および
２０ｍＭトリス−ＨＣＣ（ｐｉ−１＝　８　）］ですす
ぐ。次いで、メンプランを小さい試験管に入れ、高温の
緩衝液［ＩＭＮａＣρ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、および
２０ｍＭ　　トリス−ＨＣ（！（ｐＬ（＝　８　）］中
に浸漬し、そして６５°Ｃで１時間インキュベートして
ＤＥＡＥ紙からＤＮＡを取り出す。６５℃のインキュベ
ーションの後、インキュベート緩衝液を集め、メンプラ
ンを高温緩衝液ですすぐ。この高温緩衝液ですすいだ溶
液を、高温インキュベート緩衝液といっしょにプールす
る。
ＮａＣＣ濃度が０．２５Ｍとなるように、高温−ＤＮＡ
溶液の容積を調整し、次いでこの溶液に３倍量の無水の
冷エタノールを加える。得られた溶液を混合し、１０−
２０分間、−７０°Ｃに保つ。
次いでこの溶液を１５．００Ｏｒｐｍで１５分間遠心す
る。残留する塩を除去するため、もう一度この沈澱操作
を行った後、ＤＮＡペレットをエタノールですすぎ、乾
燥し、ＴＥ緩衝液２０μσ中に再！！！蜀する。このペ
レットはＡｄ２の所望の制限フラグメント約３μ９から
なる。得られた精製フラグメントをＴＥｆｌ衝液１０μ
σに溶解する。
水約６μｆ２および１０ＸＡｃｃｌ緩衝液［６０ｍＭＮ
ａＣＱ、６０ｍＭ　トリス−ＨＣＣ（ｐｌ−１−７，５
）、６０　ｍＭ　ＭｇＣ（Ｌ、６０ｍＭＤＴＴ、および
ｉｔｇ／ｎＱ　Ｂ　Ｓ　Ａｌ１　ｔｔＱを、Ａｄ２の〜
２．４　ｋｂ　Ｂａｌ　Ｉ制限フラグメントの溶液に加
える。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ａｃｃｌ約２μＱ（〜
１０学位）を加えた後、反応液を３７℃で２時間インキ
ュベートする。このＡｃｃｌ消化の後、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱で集め、水１６μρおよび１０ＸＰｖｕｌｌ緩
衝液［６００ｍＭ　ＮａＣＱ、６０ｍＭ　トリス−ＨＣ
（（ｐＨ−７，５）、６０ｍＭ　　ＭｇＣ（ｂ、６０ｍ
ＭＤＴＴ。
および１　ｍ９／ｌｐＱ、　Ｂ　Ｓ　Ａ］　２μＱ中に
再懸濁する。
このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｐｖｕｌｌ約２ｕＱＣ約１０
単位）を加えた後、反応液を３７℃で２時間インキュベ
ートする。
Ａｄ２の後期プロモーターを含有する〜０．３２ｋｂ　
Ａｃｃ　Ｉ　−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントか他の消化
産物から分離するまで、Ａｃｃ　Ｉ　−Ｐ　ｖｕｌｌ消
化した、Ａｄ２の〜２．４ｋｂＢａｌＩ制限フラグメン
トを〜６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。
このゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光を用いて観
察し、〜０，３２ｋｂ　ＡＣＣＩ　−Ｐｖｕｌｌ制限フ
ラグメントを含有するゲルセグメントをゲルから切り出
し、つぶし、抽出緩衝液［５００ｍＭＮＨ−ＯＡｃ、　
Ｉ　ＯｍＭ　ＭｇＯＡｃ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、および
０．１％ＳＤＳ］〜２５０μρ中に、室温で一晩浸漬す
る。翌朝、この混合物を遠心し、ペレットを除去する。
上清中のＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ｔＲＮＡ約２
μ９を加えて所望のフラグメントの沈澱を完全なものに
する。〜０．３２ｋｂＡｃｃ　Ｉ　−Ｐ　ｖｕｌｌ制限
フラグメント約０．２μ９が得られ、これを水７μＱに
懸濁させる。
実質的に、後記実施例１０Ａに記載した方法に従って、
キナーゼ処理しておいたＢｃｌｌリンカ−［５’−ＣＴ
ＧＡＴＣＡＧ−３’；ニュー・イングランド・バイオラ
ブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から
入手可能〕約０．２５μ９（０，５μｇ中）を、〜０．
３２　ｋｂ　Ａｃｅ　Ｔ　−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメン
トの溶液に加え、次いでこのＤＮＡ溶液にＩ４　　ＤＮ
ＡリガーゼｌμＱ（〜１０００単位）およびＩＱｘリガ
ーゼ緩衝液ｌμＱを加え、得られた反応液を１６℃で一
部インキユベートした。このＢｃｌｌリンカ−は、Ａｃ
ｃ　ｒ　−Ｐ　ｖｕ［Ｉ制限フラグメントのＰｖｕ［Ｉ
末端にだけライゲートすることもある。後に行ったＤ　
Ｎ　Ａ配列決定により、Ａｃｅ　Ｉ　−Ｐ　ｖｕｌｌ制
限フラグメントのＰｖｕｌｌ末端には４個のＢｃｌ　ｒ
リンカ−が結合していることがわかった。これら余分の
Ｂｃｌｌリンカ−をＢａ１ｌ消化および再ライゲートに
よって除去することができるが、これらのリンカ−は余
分のリンカ−を含有するベクターの正しい機能を妨害し
ないので、これら余分の［３ｃｌｌリンカ−を除去しな
かった。
Ｅ、コリＫ　１２　　ＨＢ　Ｉ　Ｏｌ／ｐＳ　Ｖ　２ｃ
ａｔ細胞をＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ３７１５５の
もと、凍結乾燥品として入手し、実質的に実施例３の方
法に従ってこの細胞からプラスミドｐＳＶ２ｃａｔＤＮ
Ａを単離した。プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔの制限
部位および機能地図を添付の第４図に示す。
プラスミドｐｓＶ２ｃａｔ　ＤＮＡ約Ｌ１が得られ、こ
れをＴＥＩ衝液１ｘ（ｉに溶解する。プラスミドｐＳＶ
２ｃａＬＤＮＡ約３μｇ（３μのを１ＯＸＡｃｃＩ緩衝
液２μＣおよび水１６μρに加え、次いで制限酵素Ａｃ
ｃ１３μ（（約９単位）をこのｐｓＶ２ｃａｔＤＮＡ溶
液に加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベ
ートした。次いで、１０ＸＳｔｕＩ緩衝液［１，０Ｍ　
ＮａＣＱＳ　１００ｍＭ　トリス−Ｉ４Ｃｆ２（ｐＨ＝
＝８．０）、１００　ｍＭ　ＭｇＣＣｔ、６０ｍＭＤＴ
Ｔ、および１Ｍ９／祿ＢＳＡ］３μσ、水５μＱ１およ
び制限酵素Ｓ　ｔｕ　Ｉ約２μｅ（約１０単位）を加え
ることにより、このＡｃｃｌ消化したプラスミドｐＳＶ
２ｃａｔ　ＤＮＡを制限酵素５ｔｕＩで消化した。
得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
この反応混合物をフェノールで１回、次いでクロロホル
ムで２回抽出することによって反応を停止させた。所望
のフラグメント約０．５μ９が得られ、これをＴＥ＠衝
液２０μσに溶解した。
Ａｃｃｌ−Ｓｔｕ＋消化したプラスミドｐＳ　Ｖ　２　
ｃａｔＤＮＡ約４ｕＱを、Ａｄ２の〜０．３２ｋｂ　Ａ
ｃｃＩ−Ｐｖｕｌｌ（Ｂｃｌ　Ｉリンカ−が結合してい
る）制限フラグメント約７μＱと混合し、１０Ｘリガー
ゼ緩衝液３μＱ１水１５μｇ１およびＩ４　　ＤＮＡリ
ガーゼ２μＱ（約１０００単位）を加えた後、このライ
ゲーション混合物を１６°Ｃで一部インキユベートした
。このライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＬ　
Ｐ　ｃａｔ、すなわち、Ａｄ２後期プロモーター（クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を
転写し、これを発現させろように配置されている）を含
有するプラスミドからなっていた。プラスミドｐＬＰｃ
ａｔの制限部位および機能地図を添付の第５図に示す。
実質的に実施例３の方法に従い、このライゲート化ＤＮ
Ａを用いてＥ、コリに１２ＨＢ１０１細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を、５０μ９／ｘＱアンピシリンを含
有するし一寒天で平板培養した。プラスミドＤＮＡの制
限酵素分析を用いてＥ。
コリＫ　１２　　ＨＢ　Ｉ　Ｏ１／ｐＬＰｃａｔ形質転
換体を同定した。実施例３に記載したプラスミド単離法
に実質的に従って、後の構築に用いるためにプラスミド
ｐＬＰｃａｔ　ＤＮＡを形質転換体から単離した。
Ｂ、プラスミドｐＢＬｃａｔの最終的な構築１０　Ｘ　
Ａｃｃ’ｌ　Ｈ新液７．５μ１２．水３０ｔｔＱ、およ
び制限酵素ＡＣＣＩ　１５μ（２（約７５単位）に、Ｔ
Ｅ緩衝液５０μａ中のプラスミドｐＢＫｎｅｏｌＤＮＡ
約８８μ９を加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間
インキュベートした。Ａｃｃｌ消化したＢＫウィルスＤ
ＮＡをアガロースゲルにかけ、ＢＫエンハンサ−を含有
する〜１．４ｋｂフラグメントを他の消化産物から分離
した。次いで、実施例４Ａ記載の方法に実質的に従って
、〜１．４ｋｂＡｃｃｌ制限フラグメントを単離した。
このフラグメント約５μ９を、１０　ｘ　Ｐｖｕｌｌ援
衝液５μ新液、水４５μＱ、および制限酵素Ｐｖｕｌｌ
　５ｕＱＣ約２５単位）中に再懸濁し、得られた反応液
を３７℃で２時間インキュベートした。次いで、実質的
に実施例４Ａの方法に従って、Ｐｖｕｌｌ消化したＤＮ
Ａをライゲーション用に単離し、調製した。所望の〜ｌ
。
２８ｋｂ　Ａｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌフラグメントが約２μ
９得られ、これをＴＥ緩衝液５μＱに溶解した。
プラスミドｐＬＰｃａｔ　ＤＮＡ約１ｕ９を、１ＯＸＡ
ｃｃＴｌ衝液５μＱおよび水４０μＱに溶解した。
制限酵素ＡｃｃＩ約５μＱ（〜２５単位）をプラスミド
ｐＬＰｃａｔ　ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応液を
３７℃でインキュベートした。Ａｃｃｌ消化したプラス
ミドｐＬＰｃａｔ　ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１
０ＸＳｔｕｌ緩衝液５μσ、水４０μｆ７゜および制限
酵素５ｔｕｌ　　５μＱ（約２５単位）中に再懸濁し、
得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
Ａｃｃｌ−’Ｓｔｕ！消化したプラスミドＰＬＰｃａｔ
　ＤＮＡをエタノールで数回沈澱さ什て、他の消化産物
（大きさが１６ｂｐの制限フラグメント）を含まない、
Ｅ、コリの複製起源およびＡｄ２後期プロモーターを含
有する〜４．８１ｋｂ　ＡｃｃＩ−Ｓ　ｔｕ　Ｉ制限フ
ラグメントを精製した。所望の〜４．８１ｋｂ制限フラ
グメントが約１μ９得られ、これをＴＥ’［新液２０μ
σに溶解した。
プラスミドｐＬＰｃａｔの〜４．８１ｋｂ　Ａｃｃｌ　
−９ｔｕｌ制限フラグメント５μｇを、ＢＫウィルスの
〜１．２８ｋｂ　Ａｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメン
ト５μＱに加えた。このＤＮＡ混合物に、１０Ｘリガー
ゼ緩衝液３μσ、水１５μｅ１およびＴ４　　ＤＮＡリ
ガーゼ２μＱ（約１０００単位）を加えた後、このライ
ゲーション反応液を１６℃で一部インキユベートした。
このライゲート化ＤＮＡは所望のプラスミドｐＢ　Ｌ　
ｃａｔからなっていた。プラスミドｐＢＬｃａｔの制限
部位および機能地図を添付の第６図に示す。
実施例３記載の方法に実質的に従い、このライゲート化
ＤＮＡを用いてＥ、コリに１２ＨＢ１０１細胞を形質転
換した。プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって、Ｅ
、コリに１２　　）１Ｂ１０Ｉ／ｐＢ　Ｌ　ｃａｔ形質
転換体を同定した。実質的に実施例３の方法に従って、
後の構築に用いるためにプラスミドｐＢＬｃａｔ　ＤＮ
Ａを調製した。
実施例５　プラスミドｐＳＢＬｃａｔの構築プラスミド
ｐＢＬｃａｔ　ＤＮＡ約１００．Ｂを、１０ｘ　Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ緩衝液Ｃ０，５Ｍ　ＮａＣＱ、０．１Ｍトリス
−）（Ｃ１２（ＰＨ＝８．０）、０　、　Ｉ　Ｍ　Ｍｇ
Ｃ１２ｔ。
および１　ｍ９／ｘＱ　Ｂ　Ｓ　Ａ］　Ｉ　ＯμＱおよ
び水８０μＱに溶解した。このプラスミドｐＢＬｃａｔ
　ＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ＋約１０μｆ
ｆ（約１００単位）を加え、得られた反応液を３７℃で
２時間インキュベートした。ＢＫエンハンサ−およびＡ
ｄ２後期プロモーターを含有する〜０．８７ｋｂＨｉｎ
ｄｌ１１制限フラグメントが他の消化産物から十分に分
離するまで、Ｈｉｎｄｌｌ！消化したプラスミドｐＢＬ
ｃａｔＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけた。
次いで、実質的に実施例４Ａの方法に従って、この〜０
．８７ｋｂフラグメントをライゲーション用に単離し、
調製した。目的のフラグメントが約１０μ９得られ、こ
れをＴＥ緩衝液５０μＱに溶解した。
ＴＥ緩衝液１μＱ中のプラスミドｐｓＶ２ｃａｔＤＮＡ
約１ｕ９を、１０　Ｘ　Ｈｉｎｄｌｌｌ緩衝液２μＱお
よび水１６μＱに溶解した。このＤＮＡ溶液に制限酵素
Ｈｉｎｄｌｌｌ約１ｕＱＣ約１０単位）を加え、得られ
た反応液を３７℃で２時間インキュベートした。この反
応混合物を始めにフェノールで、次いでクロロホルムで
２回抽出することによって、反応を停止させた。Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ消化したプラスミドｐＳＶ２ｃａｔＤＮＡをエ
タノールで沈澱さ仕、ＴＥ緩衝液１００μｇに再懸濁し
た。このＨｉｎｄｌｌ！消化したプラスミドｐＳ　Ｖ　
２ｃａｔ　Ｉ）ＮＡを、実質的に実施例２の方法に従っ
て、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、次いでＴ
Ｅ暖衝新液ＯμＱに再懸濁した。
プラスミドｐＢ　Ｌ　ｃａｔの〜０　、８７　ｋｂ　Ｈ
１ｎｄｌｌ！制限フラグメント約５μＱを、Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ消化したプラスミドｐｓＶ２ｃａｔ　　１０ｕＱに
加え、次いでこのＤＮＡ溶液に、１０×リガーゼ緩圭液
３μρ、ＴｌｌＤＮＡリガーゼ２μＱ（約１０００単位
）、および水１３μＱを加え、この反応液を１６℃で２
時間インキュベートした。このライゲート化ＤＮＡは目
的のプラスミドｐｓ　Ｂ　Ｌｃａｔからなっていた。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例３の方
法に従って、Ｅ、コリＫＩ２ＨＢ１０１を形質転換した
。形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培
養し、制限酵素分析によってアンピシリン耐性形質転換
体のプラスミドＤＮＡを試験して、Ｅ、コリＫ　１２　
　ＨＢ　ｌ　０１／ＰＳＢＬ　ｃａｔ形質転換体を同定
した。ＢＫエンハンサ−およびＡｄ２後期プロモーター
をコードしている〜０　、８７　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ
制限フラグメントは、ｌ１ｉｎｄｌｌ＋消化したプラス
ミドｐＳＢＬｃａｔ中に、２つの配向のうちのいずれか
で挿入される（そのうちの１つだけがプラスミドｐＳ　
Ｂ　Ｌ　ｃａｔを与える）。プラスミド１）ＳＢＬｃａ
ｔの制限部位および機能地図を添付の第８図に示す。
実施例６　プラスミドｐｔ、　１３３の横築Ａ、中間体
プラスミドｐＳＶ２−ＨＦＯ２の構築プラスミドｐＨＣ
７はヒトタンパク質ＣをコードしているＤＮＡ配列を含
有している。■５μり／ｘＱのテトラサイクリンを含有
するＬ−ブロスＩＱにＥ、コリＫＩ２　　ＲＲＩ／ｐＨ
Ｃ７（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５９２６）の培養物を接種し
、実質的に実施例３の方法に従ってプラスミドｐＨ０７
ＤＮＡを単離し、精製した。この操作により約Ｌｍｇの
プラスミドｐＨＣ７ＤＮＡが得られ、これをＴＥＩ衝液
新液Ｑに懸濁し、−２０℃で保存した。プラスミドｐＨ
０７の制限部位および機能地図を添付の第９図に示す。
プラスミドｐＨ０７ＤＮＡ５０μＱを、制限酵素Ｂａｎ
１　５μρ（〜５０単位）、１０ＸＢａｎ１反応緩衝液
Ｃ１，５Ｍ　ＮａＣｌ２．６０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ２
（ｐｉ−１＝７．９）、６０ｍＭ〜１ｇＣＱｔ、および
Ｉ　ｍ９／ｉ＆ＢｓＡ］１０μＱおよび水３５μσと混
合し、消化が完結するまでインキュベートした。次いで
、〜Ｉ　、２５ｋｂ　Ｂａｎ１制限フラグメントが他の
消化産物から分離するまで、このＢａｎ１消化したプラ
スミドｐＨＣ７ＤＮＡを３．５％ポリアクリルアミドゲ
ル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド−２９・ｌ）
？［気泳動にかけた。
この〜１．２５ｋｂ　Ｂａｎ１制限フラグメントを含有
するゲル部分をゲルから切り出し、試験管に入れ、細か
くつぶした。このフラグメントを含有する試験管に抽出
緩衝液（５００ｍＭ　ＮＩ−Ｔ、ＯＡｃ。
１０ｍＭ　ＭＥＯＡＣ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、、１％ＳＤ
Ｓ。
および１０　ｍｇ／ｍＱ　ｔＲＮ　Ａ）　１１１（ｌを
加え、−晩試験管を３７°Ｃに保った。遠心して残骸を
ベレット化し、上清を新しい試験管に移した。残骸を抽
出緩衝液２００μＱで１回洗浄し、洗浄液の上清を、最
初の、−晩抽出物からの上清といっしょにした。
この上清を、ガラスウールを詰めたところに通した後、
２倍量のエタノールを加え、混合した。得られた溶液を
〜１０分間ドライアイスーエタノール浴に入れ、次いで
遠心してＤＮＡをベレット化した。
この操作により約８μ９の〜Ｉ　、　２５　ｋｂ　Ｂａ
ｎ’１制限フラグメントが得られた。この精製フラグメ
ントをＴＥ緩衝新液Ｏμｅに懸濁し、−２０°Ｃで保存
した。プラスミドｐＳ　Ｖ　２−ＨＰ　Ｃ，８を構築す
るためには、リンカ−を付加することによってＢａｎ１
制限フラグメントを修飾しなければならない。このリン
カ−の構築に用いるＤＮＡフラグメントを、シスチック
　＋４５０ＡＤＮＡ合成＃！（Ｓｙｓｔｅｃ　１４５０
Ａ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ；５ｙｓｔｅｃ　
Ｉｎｃ、、３８１６Ｃｈａｎｄｌｅｒ　Ｄｒｉｖｅ、Ｍ
ｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、１ＡＮ）またはＡＢＳ３８０Ａ
ＤＮＡ合成機（Ａｐｌ）ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ、Ｉｎｃ。
、８５０　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｃｅｎｔｒｅ　Ｄｒｉｖｅ
、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ　９４４０４）のどち
らかを用いることによって合成した。
当分野においては多数のＤＮＡ合成装置が知られており
、これらを用いてフラグメントを調製することができろ
。さらに、実質的にイタクラ等［１ｔａｋｕｒａ　ｅｔ
　ａ１、、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８：１０５６（１９７
７月およびフレア等［Ｃｒｅａ　ｅｔ　ａ１、、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５：５７６
５（１９７８）１の方法に従って、常法によりフラグメ
ントを調製することもできる。
Ｔ４ボリヌクレオヂドキナーゼ１５単位（〜０゜５μＩ
２）、１０×　リガーゼ緩衝液２μｍ２．５００μＭ　
ＡＴＰ　１　ｏμｃ、おヨヒ水７．５μ（ｌを含有スル
反応緩衝液２０μρ中で、１本鎖リンカ−それぞれ５０
０ピコモルをキナーゼ処理しＲｏこのキナーゼ反応液を
３７℃で３０分間インキュベートし、次いで１００°Ｃ
で１０分間インキュベートすることによって反応を止め
た。キナーゼ化を完全にするため、反応液を水で冷却し
、反応混合物に０゜２Ｍジチオトレイトール２μＱ、５
ｍＭ　ＡＴＰ２゜５μＣ１およびＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ１５単位を加えて混合し、この反応混合物を３
７°Ｃでさらに３０分間インキュベートした。１００°
Ｃでさらに１０分間インキュベートすることによって反
応を止め、次いで水で冷却した。
キナーゼ処理は別々に行ったが、キナーゼ反応後、２種
類の１本鎖ＤＮＡリンカ−をいっしょにして混合した。
これらの鎖をアニールするため、キナーゼ反応混合物を
、〜１５０＋（！の水を入れた水浴中、１００℃で１０
分間インキュベートした。
インキュベート後、水浴の栓を止め、室温まで冷却した
。この過程に約３時間かかった。次いで、キナーゼ処理
したＤＮＡの試験管がまだ入っている水浴を４°Ｃて一
部インキユベートした。この操作により１本鎖がアニー
ルされた。作成したリンカ−は以下の措造を有していた
。
５°−ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧ−３’３°−ＡＡＣＴ
ＡＧＴＣＣＡＣＧ−５゜このリンカ−を使用時まで一２
０°Ｃで保存した。
〜１．２５ｋｂ　ＢａｎＩフラグメント〜８μりを、リ
ンカ−〜５０μＱ（〜５００ピコモル）、Ｔ４　　ＤＮ
ＡリガーゼｌμＱ（約５００単位）、１０×リガーゼ緩
衝液１０μＱ、および水２９μｅに加えて混合し、この
ライゲーション反応液を４℃で一部インキユベートした
。６５°Ｃで１０分間インキユヘートすることによって
ライゲーション反応を止めた。最終濃度０．３Ｍとなる
ようにＮ　ａ　ＯＡ　ｃを加え、２倍量のエタノールを
加え、ドライアイス−エタノール浴で冷却し、そしてこ
の溶液を遠心することによってＤＮＡをペレット化した
。
このＤＮＡペレットを、１０ＸＡｐａ１反応緩衝液［６
０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ！、６０ｍＭ）リス−ＨＣＣ（ｐＨ＝
　７　、４　）、６０　ｍＭ　ＭｇＣＱ２、および６０
ｍＭ２−メルカプトエタノール］１０μＱ１制限酵素Ａ
ｐａＩ５μρ（〜５０単位）および水８５μａに溶解し
、反応液を２時間３７°Ｃに保った。次いで上記のよう
にして反応を止め、ＤＮＡをペレット化した。このＤＮ
Ａベレットを、１０　Ｘ　Ｈｉｎｄｌｌ１反応緩衝液１
０ｕＱ、制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌｌ　５　μＱ（〜５０単
位）および水８５μＱに溶解し、反応液を２時間３７℃
に保った。Ｈｉｎｄｌｌｌ消化の後、実質的に実施例４
Ａ記載の方法に従って、反応混合物を３５％ポリアクリ
ルアミドゲル ２　３　ｋｂ　Ｈ　ｉｎｄｌｌｌ　−　Ａｐａ　Ｉ制限
フラグメントを単離した。目的のフラグメントが約５μ
？得られ、これをＴＥ緩衝新液ＯμＱに懸濁し、−２０
℃で保存した。
プラスミドｐＨＣ７　　ＤＮＡ混合物ｇを、制限酵素Ｐ
ｓｔＩ　　５μ（！（〜５０単位）、１０ＸＰｓ目反応
緩衝液［１　、Ｏ　Ｍ　ＮａＣＱ，　　Ｉ　Ｏ　ＯｍＭ
　トリス−ＩＣ＋２（ｐＨ　＝　７　、　５　）、１　
０　０　ｍＭ　ＭｇＣ（ｂ、およびｌｖｉ／ｍＱ　Ｂ　
Ｓ　Ａ］　ｌ　Ｏ　ｔｔρおよび水３５μ１２と混合し
、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、実質的
に上記記載の方法に従って、ＰｓｔＩ消化したプラスミ
ドｐＨ０７ＤＮＡを、３．５％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、目的の〜０．８８ｋｂフラグメントを
精製した。目的のフラグメント約５μ９が得られ、これ
をＴＥＡ衝液新液μＱに懇副し、−２０℃で保存した。
この〜０．８　８ｋｂ　Ｐｓｔ！フラグメント〜５μ２
を、自動Ｄ　Ｎ　Ａ合成機で作成した以下のリンカ−〜
５０μＱに加えて混合した。
５°−ＧＴＧＡＴＣＡＡ−３’ ３’−ＡＣＧＴＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧ−５。
このＤＮＡ混合物に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ約１μρ（〜
１０単位）、１０Ｘリガーゼ緩衝液１０μＱ、および水
２９μＱを加え、得られたライゲーション反応液を４°
Ｃで一部インキユベートした。
このライゲーション反応を、６５°Ｃで１０分間インキ
ュベートすることによって止めた。ライゲート化Ｄ　Ｎ
　Ａを沈澱させた後、ＤＮＡペレットを１０ＸＡｐａＩ
反応緩衝液１０ｕＱ、制限酵素Ａｐａ■　５μｌ！（〜
５０単位）および水８５μρに溶解し、反応液を２時間
３７℃に保った。次いでらう一度反応を止め、ＤＮＡを
ベレット化した。このＤＮＡペレットを、１ｏｘＢａｌ
ｌ１反応緩衝液［ＩＭＮａＣＱ、＋　００ｍＭ　トリス
−ＨＣ１２（＋）Ｈ＝７．４）、＋　００ｍＭ　ＭｇＣ
ｆ２ｔ、１００ｍＭ　２−メルカプトエタノール、およ
び１ｍ９／肩１２ＢＳＡ］１０μＱ１制限酵素Ｂｇｌｌ
ｌ　５μＱ（〜５０単位）および水８５μＱに溶解し、
反応液を２時間３７℃に保った。ＢｇＩＩ＋消化の後、
実質的に上記記載の方法に従って、反応混合物を３．５
％ポリアクリルアミドゲルにかけ、目的の〜０．１９ｋ
ｂ　ＡｐａＩ　−ＢｇＨＩ制限フラグメントを単離した
。目的のフラグメントが約１μ？得られ、これをＴＥ緩
衝新液Ｏμａに＠濁し、−２０°Ｃで保存した。
プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ　ＤＮＡ（ＡＴＣＣ３７１４
５）約１０μ９を、Ｉ　ＯＸ　Ｈｉｎｄｌｌ１反応緩衝
液１０ａＱ、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ　５μσ（〜５０
単位）および水８５μＱに溶解し、反応液を２時間３７
℃に保った。次いでこの反応混合物を、Ｎａ０Ａｃが０
．２５Ｍとなるようにし、２倍量のエタノールを加えて
ドライアイス−エタノール浴でインキュベートした後、
遠心してＤＮＡをベレット化した。
このＤＮＡペレットを、ｌ　Ｑ　ｘ　ＢｇＬＩＩ緩衝液
１０μｇ、制限酵素Ｂｇｌｌｌ　５μＣ（〜５０単位）
および水８５μｇと混合し、反応液を２時間３７℃に保
った。Ｂｇｌｌ＋消化の後、反応混合物を１％アガロー
スゲルにかけ、電気泳動してフラグメントを分離した。
ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で見える
ようにし、目的の〜５，１ｋｂＨｉｎｄｌｌｌ　−８ｇ
ｌｌｌフラグメントを含有するバンドをゲルから切り出
し、これを透析管に入れ、ＤＮＡがアガロースから溶出
してしまうまで電気泳動を続けた。透析管からのＤＮＡ
含有緩衝液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、
次いでＤＮＡを沈澱させた。このベレットは目的のプラ
スミドｐｓＶ２ｇｐｔの〜５　、　ｌ　ｋｂ　Ｈｉｎｄ
［ＩＩ　−Ｂｇｌｌｌ制限フラグメント〜５μ９からな
り、これをＴＥＩ街液１０μＱに再懸濁した。
〜１　、２３　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ　−ＡＰａ　Ｉ制
限フラグメント２ｔｔＱ、　〜０．１９ｋｂ　Ａｐａｌ
　−８ｇｌｌｌフラグメント３ｕＱ、および〜５　、１
　ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ　−８ｇｌｌｌフラグメント２
μＣをいっしょにして混合し、次いで、ｔＯＸリガーゼ
緩衝液新液μＱ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼＩμｍ２（〜５０
０単位）、および水８２μＱとともに１６℃で一部イン
キユベートした。
このライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミドｐＳＶ２
−）ＴＰＣ８からなっていた。このプラスミドの制限部
位および機能地図を添付の第９図に示す。
Ｅ、コリＫＩ２　　ＲＲＩ（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５２１
０）を、実質的に実施例２記載の方法に従って、形質転
換用にコンピテントにした。上記で調製したライゲート
化ＤＮＡを用いてこの細胞を形質転換した。形質転換混
合物の一部を、１００μ９／ｙＱアンピシリン含有のし
一寒天プレートにプレートし、このプレートを３７℃で
インキュベートした。プラスミドＤＮＡの制限酵素分析
によってＥ。
コリＫＩ２　ＲＲＩ／ｐＳＶ２−ＨＰＣ８形質転換体を
確認した。
Ｂ、プラスミドｐＬ　１３３の最終的な構築５０μ９の
プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８を、１０ｘ　Ｈｉｎｄｌ
１１反応緩衝液１０μσ、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ＋　５
μｅ（〜５０単位）および水８５μσに溶解し、反応液
を３７℃で２時間インキュベートした。
Ｈｉｎｄｌｌｌ消化の後、ＤＮＡを沈澱させ、そのＤＮ
Ａペレットをｌ０ＸＳａｌ［反応緩衝液［１，５ＭＮａ
Ｃｌ２．６０ｍＭ）リス−ＨＣＣ（ｐＨ＝７．９）、６
０ｍＭ　ＭｇＣＣｔ、６０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル、およびＩ　Ｒ２Ｚｎ（ｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ］　ｔ　Ｏμ
Ｑ１制限酵素５ａ１１　５μ１２（〜５０単位）および
水８５μＣに溶解した。得られた５μσ１反応混合物を
３７℃で２時間インキュベートした。次いで、目的の〜
０゜２９　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ　−Ｓ　ａｌ　Ｉ制限
フラグメントが他の反応生成物から分離するまで、この
Ｈｉｎｄｌ［ｌ−５ａｌｌ消化したプラスミドｐＳＶ２
−ＨＰＣＢを３．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけた。目的のフラグメントをゲルから単離して約２
μ９のフラグメントを得、これをＴＥ緩衝新液ＯμＱに
懸濁させた。
５０μ９のプラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８を、１０ｘ　
Ｂｇｌｌ１反応緩衝液１０μｆ２、制限酵素Ｂｇｌｌ１
５μｆ２（〜５０単位）および水８５μＱに溶解し、反
応液を３７℃で２時間インキュベートした。Ｂｇｌｌｌ
消化の後、ＤＮＡを沈澱させ、そのＤＮＡペレットを１
０ＸＳａｌＩ反応緩衝液１０μＣ１制限酵素Ｓａ１■　
５μＱ（〜５０単位）および水８５．ｃｌに溶解した。
得られたＳａｌ１反応混合物を３７℃で２時間インキュ
ベートした。次いで、目的の〜１．１５ｋｂ　Ｓａｉｌ
−８ｇｌｌｌ制限フラグメントが他の反応生成物から分
離するまで、この５ａｌｌ　−Ｂｇｉｌ＋消化したプラ
スミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８を３゜５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけた。
この〜１．１５ｋｂ　Ｓａｌ（−８ｇｌｌｌ制限フラグ
メントをゲルから単離して約８μこのフラグメントを得
、これをＴＥ緩衝新液Ｏμσに懸濁させた。
約１０μ９のプラスミドｐＳＶ２−β−グロビンＤＮＡ
（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９２８）を、１０×　Ｈｉｎｄｌ
ｌ１反応緩衝液１０μＣ１制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ　５
μｍ２（〜５０単位）および水８５μｅに溶解し、反応
液を２時間３７℃に保った。次いでこの反応混合物を、
Ｎａ０Ａｃが０．２５Ｍとなるようにし、２倍量のエタ
ノールを加えてドライアイス−エタノール浴でインキュ
ベートした後、遠心してＤ　Ｎ　Ａをペレット化した。
このＨｉｎｄｌ１１消化したプラスミドｐＳＶ２−β−
グロビンを、Ｉ　Ｏｘ　　Ｂｇｌｌｌｌ衝液１０ｕ新液
制限酵素Ｂｇｌｌｌ　５　Ｈ１２（〜５０単位）および
水８５μＱと混合し、反応液を２時間３７℃に保った。
Ｂｇｌｌｌ消化の後、反応混合物を１％アガロースゲル
電気泳動にかけてフラグメントを分離した。目的の〜４
．２ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｉｌ−８ｇｌｌｌ制限フラグメン
トをゲルから単離して約５μ９のフラグメントを得、こ
れをＴＥ緩衝新液０μｇに懸濁させた。
プラスミド１）ＳＶ２−ＨＰＣＢ（７）　〜０．２９ｋ
ｂＨ１ｎｄｌｌｌ　−Ｓ　ａｌ　１フラグメント２ｕＱ
、プラスミドｐＳＶ２−１−ＩＰＣ８の〜１．１５ｋｂ
　　５ａｉｌ　−ＢｇＩＩＩフラグメント２μＱ１およ
びプラスミドｐＳＶ２−β−グロビンの〜４　、２　ｋ
ｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ　−Ｂｇｌｌｌフラグメント２μｇ
をいっしょにして混合し、実質的に実施例６Ａの方法に
従ってライゲートした。
このライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミドｐＬ１３
３からなっていた。このプラスミドｐＬ１３３の制限部
位および機能地図を添付の第９図に示す。形質転換する
ＤＮＡとして、プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８のかわり
にプラスミドｐＬ　ｌ　３３を用いること以外は、実質
的に実施例６Ａの教示に従って、目的のＥ、コリに１２
ＲＲ１／ｐＬ１３３形質転換体を作成した。
実施例７　プラスミドｐｔ、ｐｃの構築プラスミドｐＢ
Ｌｃａｔ　ＤＮＡ約２０μ９を、１０Ｘ　Ｈ４ｎｄｌｌ
ｌｌｉ衝液１０μＱおよび水８０μ１２に溶解した。得
られたプラスミドｐＢＬｃａｔ　ＤＮＡの溶液に制限酵
素ｌ−１ｉｎｄｌｌｌ約１０μＱ（〜１００単位）を加
え、この反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
次いで、ＢＫエンハンサ−およびＡｄ２後期プロモータ
ーを含有する〜０．８７ｋｂＨｉｎｄｌｌ＋制限フラグ
メントが他の消化生成物から分離するまで、このＨｉｎ
ｄｌｌｌ消化したプラスミドｐ１３ＬｃａｔＤＮＡをア
ガロースゲル電気泳動にかけた。
次いで、実質的に実施例４Ａの方法に従って、〜０．８
７ｋｂフラグメントを単離し、ライゲーション用に調製
した。目的のフラグメントが約２μ９得られ、これをＴ
Ｅ緩衝液５μＱに溶解した。
プラスミドｐＬ１３３ＤＮＡ約１．５μ９を、１ＯＸＨ
ｉｎｄｌｌｌ緩衝液２ｕＱおよび水１６ｔｔＱに溶解し
た。このＤ　Ｎ　Ａ溶液に制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ約Ｉ
μＱ（〜１０単位）を加え、得られた反応液を３７℃で
２時間インキュベートした。次いで、このＤＮＡをＴＥ
緩衝液で１００μＱまで希釈し、実質的に実施例２の方
法に従って、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した
。このＨｉｎｄｌｌｌ消化したプラスミドｐＬ１３３Ｄ
ＮＡをフェノールで２回、クロロホルムで１回抽出し、
エタノールで沈澱させ、そしてＴＥＩＩ衝液！新液ｇに
再懸濁した。
プラスミドｐＢ　Ｌ　ｃａｔの〜０　、８　？　ｋｂ　
Ｈ１ｎｄｌｌ＋制限フラグメント約５μｇを、Ｈｉｎｄ
ｌｌｌ消化したプラスミドｐＬＩ３３　１．５μｅに加
え、次いでこのＤＮＡ溶液に、１０×リガーゼ緩衝液１
μｍ２．　Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ１ｕＱＣ〜１０００
単位）、！３ヨび水１．５μＱを加え、得られた反応液
を１６°Ｃで一部インキユベートした。このライゲート
化ＤＮＡは目的のプラスミドＩ）ＬＰＧからなっていた
。
プラスミドｐ［、Ｐ　Ｃの制限部位および機能地図を添
付の第１Ｏ図に示す。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例３の方
法に従って、Ｅ、コリに１２　　ＨＢ１０Ｉを形質転換
した。形質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平
板培養し、制限酵素分析によってアンピシリン耐性形質
転換体のプラスミドＤＮＡを試験して、Ｅ、コリＫＩ２
ＨＢＩ０１／ｐＬＰＣ形質転換体を同定した。ＢＫエン
ハンサ−およびＡｄ２後期プロモーターをコードしてい
る〜０　、８７　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグメン
トは、Ｈｉｎｄ１１１？Ａ化したプラスミドｐＳＢＬｃ
ａｔ中に、２つの配向のうちのどちらかで挿入されてい
る（そのうちの１つだけがプラスミドｐＬＰＣを生じる
）。
実施例８　プラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃ４およびｐＬＰＣ５
の構築 実施例１で調製したＢＫウィルスＤＮＡ約Ｉμ９（ｌμ
Ｑ）おヨヒプラスミドｐＬＰｃ１１（ＨＩ０を、Ｉ　Ｏ
Ｘ　ＥｃｏＲＴ緩衝液２μＱおよび水１４μａに溶解し
た。このＤＮＡ溶液に制限酵素ＥｃｏＲ１約２μＱ（〜
１０里位）を加え、得られた反応液を３７℃で２時間イ
ンキュベートした。このＥｃ。
Ｒ■消化したＢＫウノルスおよびプラスミドｐＬＰＣＤ
ＮＡの混合物を緩衝フェノールで１回、クロロホルムで
１回抽出した。次いで、ＮａＣｊ濃度を０．２５Ｍに調
整し、２倍量のエタノールを加え、この溶液をドライア
イス−エタノール浴で２分間インキュベートし、そして
溶液を遠心してＤＮＡをベレット化することによってＤ
ＮＡを集めた。上清を除去し、ＤＮＡベレットを７０％
エタノールですすぎ、乾燥し、ＴＥＡ衝液新液μＱに再
懸局した。
ＥｃｏＲＩ消化したＢＫウィルスおよびプラスミドｐＬ
ＰＣＤＮＡの混合物に、水約１３μＱおよび１０Ｘリガ
ーゼ緩衝液３μＱを加えた。このＤＮＡ溶液にＴ４　　
ＤＮＡリガーゼ２μ１２（〜１０００単位）を加え、得
られた反応液を１６℃で２時間インキュベートした。こ
のライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミドｐＬ　Ｐ　
Ｃ４およびｐＬＰＣ５からなり、両者は挿入したＢＫウ
ィルスＤＮＡの配向だけが異なっていた。プラスミドｐ
ＬＰＣ４の制限部位および機能地図を添付の第１１図に
示す。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例３の方
法に従って、Ｅ、コリに１２　　ＨＢ１０Ｉコンピテン
ト細胞を形質転換した。形質転換細胞を１００μ９／ｒ
ｌＱアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養した。アン
ピンリン耐性の表現型およびプラスミドＤＮＡの制限酵
素分析によって、Ｅ。
コリＫ　Ｉ　２　　ＨＩ３１０１／ｐＬＰＣ４およびＥ
、コリＫＩ２　　ＨＢ１０Ｉ／ｐＬＰｃ５形質転換体を
同定した。
実施例９　プラスミドｐＬＰＣｈｙｇｌおよびｐｔ、ｐ
Ｃｈｙｇ　２の構築 Ｅ、：］１ＪＫ１２　　ＲＲＩ／ｐＳＶ２ｈｙｇ細胞を
、ＮＲＲＬから取得番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０３９のら
とで入手する。実質的に実施例３の方法に従って、この
細胞からプラスミドｐＳ　Ｖ　２ｈｙｇ　ＤＮＡを得る
。プラスミドｐＳＶ２ｈｙｇの制限部位および機能地図
を添付の第１２図に示す。
プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｈｙｇ約１０μｇ（Ｔ　Ｅ緩
衝液１０μ（中）を、１０　Ｘ　ＢａｍＨＩ緩衝液２ｕ
（ｌおよび水６μａに加えた。このＤＮＡ溶液に、制限
酵素３ａｍＨＩ約２μＱ（約２０単位）を加え、得られ
た反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
この反応液を始めフェノールで抽出し、次いでクロロホ
ルムで２回抽出した。実質的に実施例４Ａ記載の方法に
従って、このＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＳＶ２ｈ
ｙｇＤＮＡをアガロースゲルにかけ、ハイグロマインン
耐性遺伝子を含有する〜２゜５ｋｂの制限フラグメント
を単離した。
１０Ｘ　フレノウ緩衝液［４種類のｄＮＴＰそれぞれが
０．２ｍＭ、０．５Ｍトリス−ＨＣＱ（ｐＨ＝７゜８）
、５０ｍＭ　ＭｇＣ（ｈ、０．１Ｍ２−メルカプトエタ
ノール、および１００μｇ／村ＢＳＡ］約５μσおよび
水３５μＣを、ＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＳＶ２
ｈｙｇＤＮＡの溶液に加え、次いでこのＤＮＡ混合物に
フレノウ酵素（ＢＲＬから市販されている）約２５単位
（約５μＱ）を加え、得られた反応液を１６°Ｃで３０
分間インキュベートした。
このフレノウ処理し、１３ａｍＨＴ消化したプラスミド
ｐＳ　Ｖ　２ｈｙｇ　ＤＮＡをフェノールで１回、クロ
ロホルムで１回抽出し、次いでエタノールで沈澱させた
。目的のフラグメントが約２μ９得られ、これをＴＥ緩
衝液５μ夕に懸蜀させた。
プラスミドｐＬＰＣＤＮＡ約１０８ｇ（１０μＱ）を、
１ＯＸｓｔｕＩ緩衝液２μＱおよび水６μＱに加えた。
このＤＮＡ溶液に、制限酵素５ｔｕｌ約２μＱ（〜１０
単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間イン
キュベートした。この５ｔｕＩ消化したプラスミドｐＬ
ＰＣＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、１
ＯＸＮｄｅｌ緩衝液［＋。
５Ｍ　ＮａＣＱ、０．１Ｍ　トリス−ＨＣｌ２（ｐＨ＝
　７　、８　）、７０ｍＭＭｇＣｌ２２．６０ｍＭ２−
メルカプトエタノール、およびｌ　ｍ９／ｘ（ｌ　Ｂ　
Ｓ　Ａｌ１　ｕ（ｌおよび水１６μρに再懸濁した。こ
の５ｔｕｌ消化したＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｎｄｅｌ
約２μρ（〜１０単位）を加え、得られた反応液を３７
°Ｃで２時間インキュベートした。
Ｎｄｅｌ　　５ｔｕｌ消化したプラスミドｐＬＰｃＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、１０×　フ
レノウ緩衝液５μｇおよび水４０μｇに再懸濁した。こ
のＤＮＡ溶液に、フレノウ酵素的５μｍ２（〜２５単位
）を加え、得られた反応液を１６℃で３０分間インキュ
ベートした。フレノウ反応の後、反応混合物をアガロー
スゲルにかけ、〜５゜８２ｋｂ　Ｎｄｅ［−５ｔｕｌ制
限フラグメントをゲルから単離した。目的のフラグメン
トが約５μ９得られ、これをＴＥ緩衝液５μＱに懸詞さ
せた。
プラスミドｐＳＶ２ｈｙｇの〜２　、５　ｋｂのフレノ
ウ処理したＢａｍＨＩ制限フラグメント約２μＱを、プ
ラスミドｐＬＰＣの〜５．８２ｋｂのフレノウ処理した
Ｎｄｅｌ−９ｔｕｌ制限フラグメント約ｌμＱと混合し
、このＤＮＡ溶液に、１０ｘリガ一ゼ緩衝液約３μｍ２
ＳＴ４　　ＤＮＡリガーゼ２μｇ（〜１０００単位）、
Ｔ４　　ＲＮＡリガーゼｌμσ（〜１１単）、および水
１４μＱを加えた。得られた反応液を１６６Ｃで一部イ
ンキユベートした。このライゲートしたＤＮＡは目的の
プラスミドＩ）Ｌ　Ｐ　ｃｈｙｇ　＋およびｐＬ　Ｐ　
Ｃｈｙｇ２からなり、それらはプラスミドｐＳ　Ｖ　２
　ｈｙｇの〜２５ｋｂのフレノウ処理したＢａｍＨＩ制
限フラグメントの配向だけが異なっていた。
プラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ　Ｉの制限部位および機
能地図を添付の第１３図に示す。このライゲート化ＤＮ
Ａを用い、実質的に実施例３の方法に従って、Ｅ、コリ
ＫＩ２ＨＢ１０１を形質転換した。目的のＥ、コリＫ　
ｌ　２　　ＨＢ　Ｉ　ＯＩ／ｐＬＰｃｈｙｇ＋およびＥ
、コリに１２　　ＨＢ１０Ｉ／ｐＬＰＣｈｙｇ２形質転
換体を、アンビンリン含有のＬ−寒天で平板培養し、プ
ラスミドＤ　Ｎ　Ａの制限酵素分析によって同定した。
実施例１０　プラスミドＩ）ＢＷ３２の構築Ａ、中間体
プラスミドｐＴＰＡ１０３の構築プラスミドｐＴＰＡ１
０２はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）
のコード化配列を含有している。プラスミド１）ＴＰＡ
１０２はＥ　コリＫ　ｌ　２　ＭＭ２９４／ｐＴＰＡ　
１０２（この菌株はＮＲ１”ＬＬから取得番号ＮＲＲＬ
　Ｂ−１５８３４のらとで入手可能である）から単離す
ることができる。プラスミドｐＴＰＡ１０２の制限部位
および機能地図を添付の第１４図に示す。プラスミドｐ
ＴＰＡ１０２　　ＤＮＡを、実質的に実施例２の方法に
従って、Ｅ、コリＫ　１２　　ＭＭ　２９４　／　ｐＴ
　ＰＡ１０２から単離する。
プラスミドｐＴＰＡ１０２約５０７１ｇ（ＴＥ緩衝液約
５０μＱ中）を、１０　ｘ　Ｔｔｈｌｌｌｌ緩衝液［０
゜５　Ｍ　Ｎ’ａＣＱ、　　８０　ｍＭ　トリス−ＨＣ
Ｑ（ｐＨ＝　７　、４　）、８０ｍＭ　ＭｇＣＱｔ、８
０ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、および１ｒｔｔ
９／ｌＱ　ＢＳＡ］１０ｔｔＱおよび水８０μｇに加え
た。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｔｔｈ１１１１約１０μ
Ｑ（〜５０単位）を加え、得られた反応液を６５℃で２
時間インキュベートした。
この反応混合物をアガロースゲルにかけ、ＴＰＡコード
化配列配列有する〜４．４　ｋｂ　Ｔｔｈｌｌｌ＋制限
フラグメントをゲルから単離した。その他の消化産物、
すなわち３　、１　ｋｂおよび０　、５　ｋｂ制限フラ
グメントは廃棄しｒこ。目的の〜４　、４　ｋｂ　Ｔ　
ｔｈｌｌｌｌ制限フラグメントが約１０μり得られ、こ
れをＴＥ緩衝新液Ｏμｇに懸濁させた。
１０Ｘクレノウ緩衝液約５μｇおよび水３０μρに〜４
　、４　ｋｂ　Ｔ　ｔｈｌｌｌ＋制限フラグメントを含
有する溶液を加え、さらにフレノウ酵素約５μｍ２（〜
５単位）を加えた後、この反応混合物を１６℃で３０分
間インキュベートした。フレノウ反応の後、ＤＮＡをエ
タノールで沈澱させ、１０ｘリガーゼ緩衝液３μＱおよ
び水１４μＱに再懸濁させた。
配列： ５’−ＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’ ３’−ＧＣＣＴＡＧＧＣ−５゜ で示されるＢａｍＨＩリンカ−にュー・イングランド・
バイオラブズ）を以下の方法によってキナーゼ処理し、
ライゲーション用に調製した。リンカ−４μＱ（〜２μ
ｇ）を水２０．１５μｇおよび１０×キナーゼ緩衝液［
５００ｍＭトリス−Ｈｃ＆（ｐＨ＝７．６）およびＩ　
ＯＯｍＭ　ＭｇＣＬ］５１１Ｑに溶解し、９０°Ｃで２
分間インキュベートし、次いで室温まで冷却した。この
混合物に、γ−”Ｐ−ＡＴＰ　　５．［ｚ１２（〜２０
μＣｉ）、ＩＭ　ＤＴＴ　　２．５μ（およびポリヌク
レオヂドキナーゼ５μＱ（〜１０単位）を加え、得られ
た反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。次い
で、０．０１Ｍ　ＡＴＰ３．３５μＱおよびキナーゼ５
μＱを加え、反応液をさらに３０分間３７℃に保った。
この放射活性ＡＴＰは、リンカ−が標的ＤＮＡにライゲ
ートしたかどうかを決定するのに役立つ。
キナーゼ処理したＢａｍＨＩリンカ−約１０μｇを〜４
．４　ｋｂ　Ｔｔｈｌｌｌｌ制限フラグメントの溶液に
加え、さらにＴ４　　ＤＮＡリガーゼ２μａ（〜１００
０単位）およびＴ４　　ＲＮＡリガーゼ１μＱ（〜２単
位）を加えた後、このライゲーション反応液を４℃で一
部インキユベートした。このライゲートしたＤＮＡをエ
タノールで沈澱させ、ｌ０Ｘ）ｔｉｎｄｌｌ！緩衝液５
μＱおよび水４０μｇに再＠蜀させた。
このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ約５μｆ２（
〜５０単位）を加え、得られた反応液を３７℃で２時間
インキュベートした。
このＨｉｎｄｌｌ＋消化したＤＮＡをエタノールで沈澱
させ、１０Ｘ１０ＸＢａ緩衝液１０μＱおよび水９０μ
Ｑに再懸濁させた。このＤＮＡ溶液に制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ約１０μＱ（〜Ｉ０θ単位）を加え、得られた反応液
を３７°Ｃで２時間インキュベートした。ＢａｍＨＩ消
化の後、反応混合物をアガロースゲルにかけ、〜２．Ｏ
ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグメント
をゲルから単離した。目的のフラグメントが約４μり得
られ、これをＴＥ緩衝液約５μｅに懸濁させた。
プラスミドｐＴＰＡ１０３を構築するため、プラスミド
ｐＴＰＡ１０２由来の〜２　、　Ｏｋｂ　ＢａｍＨＩ　
−Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグメントを、Ｂ　ａｍＨＩ　
−Ｈｉｎｄｌｌｌ消化したプラスミドＩ）ＲＣに挿入し
た。プラスミドｐＲＣは、Ｅ、コリ　ｔｒｐオペロンの
プロモーターおよびオペレーター（ｔｒｐＰｏ）配列を
含有する〜２８８ｂｐ　ＥｃｏＲｌ−Ｃ１ａＩ制限フラ
グメントを、ＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａＩ消化したプラスミド
ｐＫｃ７に挿入することによって構築した。プラスミド
ｐＫＣ７は、Ｅ、コリ　Ｋ１２ＮＩ００／ｐＫＣ７とし
て、ＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ３７０８４のもとで
入手することができる。ｔｒｐＰＯを含有する〜２８８
ｂｐ　ＥｃｏＲｌ−Ｃ１ａＩ制限フラグメントはプラス
ミドｐＴＰＡ１０２［このプラスミドはＥ、コリ　Ｋ　
１２　　ＭＭ　２９４　／ｐＴ　ＰＡ１０２（ＮＲＲＬ
　Ｂ−１５８３４）から単離することができる］から単
離することができる。プラスミドｐＫＣ７およびプラス
ミドｐＴＰＡ１０２ＤＮＡは、実質的に実施例３の方法
に従って、上記セルラインから得ることができる。この
プラスミドｐＴＰＡ１０２の〜０．２９ｋｂ　ＥｃｏＲ
Ｉ　−Ｃ１ａｌ制限フラグメントは、Ｅ、コリ　Ｌｒｐ
遺伝子の翻訳活性化配列の大部分および転写活性化配列
を含有し、以下の配列を有している： ５’−ＡＡＴＴＣＡＣＯＣＴ １１１Ｎ ３°−ＧＴＧＣＧＡ ＴＣＴＣＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＣＡＣＣｌｌｌｌｌ
ｌｌｌｌｌ　　　１１１１１１１１１１ＡＧＡＧＣＴＧ
ＡＣＧ　　　ＴＧＣＣＡＣＣ；ＴＧＧＡＡＴＧＣＴＴＣ
ＴＧ　　　ＧＣＧＴＣＡＧＧＣＡｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ
　　　１１１１１＋１＋１１ＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＣＧ
ＣＡＧＴＣＣＧＴｔｏｏ　　　　　　　　　　　　　　
ｔｔ。
ＧＣＣＡＡＴＣＧＧＡ　　　ＡＧＣＴＧＴＧＧＴＡｌｌ
ｌｌｌｌｌｌｌｌ　　　１１１１１１１１１１ＣＧＧＴ
ＴＡＧＣＣＴ　　　ＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧ
ＣＡＴＡ　　　ＡＴＴＣＧＡＧＴＣＧ１１１＋１１１１
１１　　１１１１１１１１１１ＡＧＴＧＧＣＣ；ＴＡＴ
　　　ＴＡＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣ
ＴＣＣＣＧＴＴＣｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ　　　１１１１
１＋１１１１ＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧ　　　ＴＧＡＧＧＧ
ＣＡＡＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴ　　ＧＣＣＡＡＧＧＣＣ
ＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＧＡＣＴＴＧＡ
ＣＡＡＴＴＡ　　　ＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣｌｌｌｌｌｌ
ｌｉｌｌ　　　１ｌｌｌｌｌｌｌｌｌＡＡＣＴＧＴＴＡ
ＡＴ　　　ＴＡＧＴＡＧＣＴＴＣ；ＡＴＣＡＡＴＴＧＡ
Ｔ　　　ＣＡＴＧＣＧＴＴＣＡすなわち、プラスミドｐ
ＲＣを構築するために、ＴＥ緩衝新液Ｏμσ中のプラス
ミドｐＫＣ７約２μ９を、ｌｏｘ　Ｃｌａｉｍ街液［０
，５Ｍ　ＮａＣＬ　６０ｍＭトリス−ＨＣｌ２（ｐＩ−
１＝７．９）、６０　ｍＭ　ＭｇＣＱｔ、および１ｘ９
／＊Ｑ　ＢＳＡ］２μ１２および水６μＱに加えた。こ
のプラスミドｐＫＣ７ＤＮＡの溶液に制限酵素Ｃ１ａｌ
約２μＱ（〜１０単位）を加え、得られた反応液を３７
℃で２時間インキュベートした。このＣ１ａｌ消化した
プラスミドｐＫＣ７ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１
０ＸＥｃ。
Ｒ１緩衝液２μＱおよび水１６μＱに再懸濁させた。
このＣ１ａｌ消化したプラスミドｐＫＣ７ＤＮＡの溶液
に制限酵素ＥｃｏＲＩ約２μＱ（〜１０単位）を加え、
得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
このＥｃｏＲｌ−Ｃ１ａｌ消化したプラスミドＩ）ＫＣ
ｌ　　ＤＮＡを、フェノールで１回、次いでクロロホル
ムで２回抽出した。次いで、ＤＮＡをエタノールで沈澱
させ、１０×リガーゼ暖衝液３μＱおよび水２０μＱに
再懸濁した。プラスミドＩ）ＫＣｌの制限部位および機
能地図は、マニアティス等［Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　
ａ１、］のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、８頁（１９８２）から人手することができる。
ＴＥ緩衝液約２０μＱ中のプラスミドｐＴＰＡ１０２約
２０μ９を、１０ＸＣ１ａＩ緩衝液１０μσおよび水６
０ｔｔＱに加えた。このプラスミドｐＴＰＡ１０２ＤＮ
Ａの溶液に、制限酵素Ｃ１ａＩ約１０μＱ（〜５０単位
）を加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベ
ートした。このＣ１ａｌ消化したプラスミドｐＴＰＡ１
０２　　ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１ＯＸＥｃｏ
Ｒｒ緩衝液ｔｏμｃおよび水８０μＱに再＠濁した。こ
のＣ１ａＩ消化したプラスミドｐＴＰＡ１０２　　ＤＮ
Ａの溶液に制限酵素ＥｃｏＲＩ！／］　１０　μｆｆ（
〜５０単位）を加え、得られた反応液を３７℃で２時間
インキュベートした。
このＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａＩ消化したプラスミドｐ’ｒＰ
Ａ１０２　　ＤＮＡをフェノールで１回抽出し、Ｌｒｐ
ＰＯを含有する〜２８８ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｃ１ａｌ
制限フラグメントが他の消化産物から分離するまで、７
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、次いでこの
〜２８８ｂｐ　ＥｃｏＲｌ−Ｃ１ａｌ制限フラグメント
をゲルから単離した。目的のフラグメントが約１μ９得
られ、これをＴＥ緩衝液５μＱに懸蜀し、上記のように
して調製したＥｃｏＲＩ　−Ｃ１ａｌ消化のプラスミド
ｐＫＣ７ＤＮＡの溶液に加えた。次いでこのＤＮＡ混合
物に、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ約２μＱ（〜１０００単
位）を加え、得られたライゲーンヨン反応液を１６℃で
２時間インキュベートした。このライゲート化Ｄ　Ｎ　
Ａは目的のプラスミドｐＲＣＤＮＡからなっていた。
このライゲート化Ｄ　Ｎ　Ａを用い、実質的に実施例２
の方法に従って、Ｅ、コリＫＩ２ＨＢＩ０１コンピテン
ト細胞を形質転換した。形質転換細胞を１００μ９７Ｔ
ＩＱアンピンリン含有のし一寒天で平板培養し、プラス
ミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピシリン耐性形
質転換体をスクリーニングして目的のＥ、コリＫ　Ｉ　
２　　ＨＢ　１０１／ｐＲＣコロニーを同定した。実質
的に実施例３の方法に従って、Ｅ、コリＫ　ｌ　２　　
ＨＢ　１０１／ｐＲＣ形質転換体からプラスミドｐＲｃ
　ＤＮＡを得た。
ＴＥＩ衝液新液μｅ中のプラスミドｐＲＣＤＮＡ約２μ
９を、ｌ　ＯＸ　　Ｈｉｎｄｌｌｌｌｌ衝液２ｕＱおよ
び水液２ｕＱに加えた。このプラスミドｐＲｃＤＮＡの
溶液に、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ約２μ！２（〜１０単
位）を加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュ
ベートした。このＨｉｎｄｌｌｌ消化したプラスミドｐ
ＲＣＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１０Ｘ１０ＸＢａ
緩衝液２μＱおよび水１６μＣに再懸濁した。このｌ１
ｉｎｄｌｌｌ消化したプラスミドｐＲＣＤＮＡの溶液に
制限酵素ＢａｍＨＩ約２μｒ：ｌ（〜１０単位）を加え
、得られた反応液を３７°Ｃて２時間インキュベートし
た。
このＢａｍＨｒ　−ＩＩ　１ｎｄｌｌｌ消化したプラス
ミドｐＲＣＤＮＡをフェノールで１回、次いてクロロホ
ルムで２回抽出した。このＤＮＡをエタノールで沈澱さ
せ、１０ｘ　　リガーゼ緩衝液３μＱおよび水２０ｕ（
ｌに再懸濁した。このＢａｍＨＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌＩ消
化したプラスミドｐＲＣＤＮＡの溶液に、プラスミドｐ
ＴＰＡ１０２の〜２　、　Ｏｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ　−
ＢａｍＨＩ制限フラグメント〜４μ９（ＴＥＩ衝液新液
μＱ中）を加えた。このＤＮＡ混合物に、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ約２μＱ（〜１０００単位）を加え、得られた反
応液を１６°Ｃで２時間インキュベートした。このライ
ゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐＴＰＡ１０３　　
ＤＮＡからなっていた。
目的ではない形質転換体を減少させるため、このライゲ
ート化ＤＮＡを制限酵素Ｎｃｏｒ（この酵素はプラスミ
ドｐＲＣを切断するがプラスミドｐＴＰＡ１０３を切断
しない）で消化した。すなわち、直線化したＤＮＡは閉
環した環状ＤＮＡに比べてＥ、コリを形質転換すること
が少ないので、Ｎｃ。
■によってライゲート化ＤＮＡを消化すると目的ではな
い形質転換体が減少する。ライゲート化ＤＮＡを消化す
るため、始めにＤＮＡをエタノールで沈澱させ、次いで
１０ＸＮｃｏｌ緩衝液［１，５Ｍ　ＮａＣＱ、６０ｍＭ
　トリス−ＨＣＣ（ｐＩ−（＝　７　、８　）、６０ｍ
Ｍ　ＭｇＣｆ２ｔ１およびＩ　ｍ９／ｌ（ｌ　Ｂ　Ｓ　
Ａコ２μρおよび水１６μＱに再！！！澗した。このＤ
ＮＡ溶液に制限酵素Ｎｃｏｌ約２μＱ（〜１０単位）を
加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュベー
トした。
ライゲートし、次いでＮｃｏＩ消化したこのＤＮＡを用
いてＥ、コリＫ　Ｉ　２　　ＲＶ　３０　Ｂ（ＮＲＲＬ
Ｂ−１５６２４）を形質転換した。実質的に実施例３の
方法に従って、Ｅ、コリＫ１２　　ＲＶ３０８細胞をコ
ンピテントにし、そして形質転換した。
形質転換混合物を１００μ９／ｍσアンビンリン含有の
し一寒天で平板培養した。アンピシリン耐性形質転換体
をカナマイシン感受性について試験した（プラスミドＩ
）ＲＣはカナマイシン耐性を与えるがプラスミドｐＴＰ
Ａ１０３は与えない）。次いでアンピシリン耐性かつカ
ナマイシン感受性の形質転換体からプラスミドＤＮＡを
調製し、このプラスミドＤＮＡを制限酵素分析すること
によってＥ。
コリに１２　ＲＶ３０８／ｐＴＰＡ１０３形質転換体を
同定した。プラスミドｐＴＰＡ１０３の制限部位および
機能地図を添付の第１４図に示す。実質的に実施例３の
方法に従って、Ｅ、コリに１２ＲＶ３０８／ｐＴＰＡ　
１０３細胞からプラスミドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡを
単離した。
Ｂ、中間体プラスミドｐＢ’１Ｖ２５の構築ＴＥ緩衝液
１μρ中のプラスミドｐＴＰＡ１０３ＤＮＡ約１μｇを
、１０ｘＢｇｌｌｌ緩衝液２μｇおよび水１６μＱに加
えた。このプラスミドｐＴＰＡ１０３ＤＮＡの溶液に、
制限酵素Ｂｇｌｌｌ約ｌμＱ（〜５単位）を加え、得ら
れた反応液を３７℃で２時間インキュベートしｆ二。こ
のＢｇｌｌ＋消化したプラスミドｐＴＰＡ　ｌ　０３　
　ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ｔＯＸクレノウ緩衝
液５μｅおよび水４４μＱに再懸濁した。このＢｇｌｌ
＋消化したプラスミドｐＴＰＡ　１０３　　ＤＮＡの溶
液に、フレノウ酵素的ｌμａ（〜１単位）を加え、得ら
れた反応液を１６℃で２時間インキュベートした。この
フレノウ処理し、Ｂｇｌｌ＋消化したプラスミドｐＴＰ
Ａ１０３　　ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１０×リ
ガーゼ緩衝液３μＱおよび水２２μＱに再！！！濁した
。
このフレノウ処理し、Ｂｇｌｌｌ消化したプラスミドｐ
ＴＰＡ、１０３　　ＤＮＡの溶液に、配列；５°−ＣＣ
ＡＴＡＴＧＧ−３゜ ３°−ＧＧ′ｒＡＴＡＣＣ−５’ て示されるキナーゼ処理していないＮｄｅｌリンカ−に
ュー・イングランド・バイオラブズ）約２μＱ、（０、
２μｇ）を、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ２μｅ（〜１００
０単位）およびＴ４ＲＮＡリガーゼ１μＱ（〜２単位）
とともに加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキ
ュベートした。このライゲート化ＤＮＡはプラスミドｐ
ＴＰＡ　Ｉ　Ｏ３ｄｅｒＮｄｅＩからなっていた（この
プラスミドは、プラスミドｐＴＰＡＩＱ３が有するＢｇ
ｌｌｌ認識配列のところにＮｄｅ■認識配列を有してい
ること以外は、実質的にプラスミドｐＴＰＡＩ０３と同
じである）。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２記載
の方法に従って、Ｅ、コリに１２　　ＲＶ３０８コンピ
テント細胞を形質転換した。この形質転換細胞をアンピ
シリン含有のし一寒天で平板培養し、プラスミドＤＮＡ
の制限酵素分析によって、Ｅ、コリＫ　１２　　ＲＶ３
０８／ｐＴＰＡ　１０３ｄｅｒＮｄｅ［形質転換体を同
定しｔこ。後の構築にもちいるため、プラスミドｐＴＰ
Ａ　Ｉ　Ｏ３ｄｅｒＮｄｅｌ　　ＤＮＡを、実質的に実
施例３の方法に従って、形質転換体から単離した。
ＴＥ緩衝液１０μσ中のプラスミドＩ）Ｔ、ＰＡ１０３
ｄｅｒＮｄｅＩ　　ＤＮＡ約１０ｕ９を、ＩＱＸ、Ａｖ
ａｉｌ緩衝液［０，６Ｍ　ＮａＣＱ、６０ｍＭ）リス−
ＨＣ（ｌｃｐＨ＝　８　、０　）、０　、１　Ｍ　Ｍｇ
ＣＱｔ、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、および１
ＪＩ９／肩１２ＢｓＡ］２μＱおよび水６μＱに加えた
。このＤＮＡ溶液に、制限酵素Ａｖａｌｌ約２μＱ（〜
１０単位）を加え、得られた反応液を３７℃で２時間イ
ンキュベートした。〜１．４ｋｂ制限フラグメントが他
の消化産物から分離するまで、このＡｖａｌｌ消化した
ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけた。次いでこの
プラスミドｐＴＰＡ　１０３ｄｅｒＮｄｅｌの〜１．４
ｋｂＡｖａｌｌ制限フラグメントをゲルから単離し、目
的のフラグメント約２μ９を得、これをＴＥ緩衝液５μ
Ｑに懇請した。
この〜Ｉ　、　４　ｋｂ　Ａｖａｌｌ制限フラグメント
の溶液に、１０×　フレノウ緩衝液約５μＱ、水３５μ
Ｑ、およびフレノウ酵素５μσ（〜５単位）を加え、得
られた反応液を１６℃で３０分間インキュベートした。
このフレノウ処理したＤＮＡをエタノールで沈澱させ、
ｔＯＸリガーゼ緩衝′ｔＬ３μＱおよび水１４μａに再
懸局した。
実質的に実施例１０Ａの方法に従って、配列：５°−Ｃ
ＧＴＴＡＡＣＧ−３゜ ３°−ＧＣＡＡＴＴＧ（、−５゜ で示されるＨｐａＩリンカ−約２μ９をキナーゼ処理し
た。フレノウ処理した、プラスミドｐＴＰＡ１０３　ｄ
ｅｒＮｄｅ　Ｉの〜Ｉ　、４　ｋｂ　Ａｖａｌ＋制限フ
ラグメントの溶液に、このキナーゼ処理したリンカ−約
１０ｕＱを、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ２μσ（〜１０００
単位）およびＴ４　　ＲＮＡリガーゼ１μσ（〜ｌ単位
）とともに加え、得られた反応液を１６℃で一部インキ
ユベートした。
このライゲート化ＤＮＡをフェノールで１回、クロロホ
ルムで２回抽出し、エタノールで沈澱させ、ｌ０ＸＥｃ
ｏＲＩ緩衝液２）ｔＱおよび水１６μＱに再＠濁した。
このＤＮＡ溶液に、制限酵素ＥｃｏＲＩ約２μＱ（〜１
０単位）を加え、得られた反応液を３７℃で２時間イン
キュベートした。このＥｃｏＲＬ消化したＤＮＡをフェ
ノールで１回、クロロホルムで２回抽出し、エタノール
で沈澱させ、１０Ｘ　　リガーゼ緩衝液３μｇおよび水
２０μσに再１８濁した。このようにして調製した、約
７７０ｂｐの大きさの、ｔｒｐＰｏおよびＴＰＡのアミ
ノ末端をコードしているフラグメントは、ＥｃｏＲＩ適
合末端を１つおよび平滑末端を１つ有しており、これを
ＥｃｏＲＩ−５ｍａｌｌ肖化したプラスミドｐｕＣ１９
にライゲートしてプラスミドｐＵｃ１９ＴＰＡＦＥを得
た。
プラスミドｐＵｃ１９［ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ（ＢＲＬ）から人手可能］約２μＱを、１０ＸＳ
ｍ１０Ｘ５衝液［０，２Ｍ　ＫＣＣ，６０ｍＭトリス−
ＨＣｌ２（ｐＨ＝８．０）、６０ｍＭ　ＭｇＣ（ｂ、６
０ｍＭ２−メルカプトエタノール、およびＩ肩９／ｘｆ
２ＢｓＡ］２μＱおよび水１６μＱに溶解した。
このＤＮＡ溶液に、制限酵素ＳｍａＩ約２μｅ（〜１０
単位）を加え、得られた反応液を２５℃で２時間インキ
ュベートした。このＳ　ｍａ　ｒ　？’ｆ４化したプラ
スミドｐＵｃ１９　　ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、
遠心して集め、１０ＸＥｃｏＲＩ緩衝液２μＱおよび水
１６μＱに再懸濁した。このＳｍａｌ消化したプラスミ
ドｐＵｃ１９ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＥｃｏＲＩ約２
μ１２（〜１０単位）を加え、得られた反応液を３７℃
で２時間インキュベートした。このＥｃｏＲＩ　−Ｓｖ
ａ　Ｉ消化したプラスミドｐＵｃ１９　　ＤＮＡをフェ
ノールで１回、クロロホルムで２回抽出し、ＴＥ緩衝液
５μＣに再懸濁した。
ＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ消化したプラスミドｐＵｃ１９　
　ＤＮＡを、プラスミドｐＴ　Ｐ　Ａ　Ｉ　Ｏ３ｄｅｒ
Ｎｄｅ■由来の〜７７　ｏｂｐ　ＥｃｏＲＩ−平滑末端
制限フラグメントを含有する溶液に加えた。このＤＮＡ
混合物に、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ約２μρ（〜１００
０単位）を加え、得られた反応液を１６℃で一部インキ
ユベートした。このライゲート化ＤＮＡは目的のプラス
ミドｐＵｃ　１９ＴＰＡＦＥからなっていた。プラスミ
ドｐＵＣ１９ＴＰＡＦＥの制限部位および機能地図を添
付の第１４図に示す。
プラスミドｐＵＣ１９ＴＰＡＦＥの構築に用いるＥｃｏ
ＲＩおよびＳｍａＩ認識配列を含有する、プラスミドｐ
Ｕｃ１９の多重クローニング部位は、ＩａｃＺ　αフラ
グメントのコード化配列内に位置している。ｌａｃ　Ｚ
　ΔＭ１５突然変異（βガラクトシダーゼをコードして
いるｌａｃ　Ｚ遺伝子における突然変異）を含有する細
胞においてこのＩａｃ　Ｚ　αフラグメントを発現させ
ると、これらの細胞は機能的なβガラクトシダーゼ分子
を発現し、従ってこれらの細胞はＸ−ガル（５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド；無色の化合物）をそのインジゴ色の加水分解産
物に加水分解する。プラスミドｐＬｌｃ１９の多重クロ
ーニング部位にＤＮＡを挿入すると、１ａｃＺ　αフラ
グメントのコード化配列が乱され、ｌａｃ　Ｚ　６Ｍ＋
５突然変異を有する（そのようなプラスミドを有する）
細胞はＸ−ガルを加水分解することができない（プラス
ミドｐｕｃｓにクローニングするときに同じ原理を用い
る；実施例２参照）。プラスミドｐＵＣ１９ＴＰＡＦＥ
からなるこのライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施
例２の方法に従って、形質転換用にコンピテントにした
Ｅ、コリに１２Ｒｒ（１６Ｍ１５（ＮＲＲＬ　１３−１
５４４０）細胞を形質転換した。
形質転換細胞を、１００μ９／’ｊｒＱアンピシリン、
４０μｇ／ｆｆ１２　　Ｘ−ガル、および１ｍＭＩＰＴ
Ｇを含有するし一寒天で平板培養した。インジゴ色を呈
しないコロニーを継代培養し、これを用いてプラスミド
ＤＮＡを調製し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によ
ってＥ、コリＫ１２ＲＲ１ΔＭ１５／ｐＵＣ１９ＴＰＡ
ＦＥ形質転換体を同定した。後の構築にもちいるため、
プラスミドｐＵＣ１９ＴＰＡＦＥ　ＤＮＡを、実質的に
実施例３の方法に従って、Ｅ、コリＫ１２ＲＲ１ΔＭ１
５／ｐＵＣ１９ＴＰＡＦＥ細胞から単離した。
ＴＥ緩衝液２０μａ中のプラスミドｐＵｃ１９ＴＰＡＦ
Ｅ約７μ９を、１ＯＸＨｐａ［緩衝液［０，２Ｍ　ＫＣ
＆、０．１Ｍト’ＪスーＨＣｅ（ＰＨ＝７．４）、お、
及び０．ＩＭ　ＭｇＣｊ＊］ｌ　Ｏμ（ｌおよび水７０
ａ（１に加えた。このプラスミドｐＵＣ１９ＴＰＡＰＥ
ＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｈｐａｌ約３μＱ（〜６単位
）を加え、得られた反応液を３７℃で２０分間インキュ
ベートした（この短い反応時間は部分的にＨｐａｌ消化
するために設定した）。この反応液を、Ｉ　Ｘ　Ｂａｍ
ＨＩ緩衝液［１５０ｍＭ　ＮａＣ１２，１０ｍＭトリス
−ＨＣＱ（ｐＨ＝８．０）、および１０ｍＭ　Ｍ　ｇ　
ＣＱ　＊　：塩濃度を高くするとＨｐａｌを不活性化す
る］１５０μＣに調整した。この部分的にＨｐａｌ消化
したＤＮＡの溶液に、制限酵素ＢａｍＨＩ約Ｉμσ（〜
１６単位）を加え、得られた反応液を３７℃で９０分間
インキュベートした。
このＢａｍＨＩ−Ｈｐａ１部分消化プラスミドｐＵＣ１
９ＴＰＡＰＥ　ＤＮＡをエタノール沈澱で濃縮し、１．
５％アガロースゲルにかけた。次いで、目的のフラグメ
ントを含有するゲルセグメントを切り出し、セグメント
を凍結させ、次いでセグメントから液体を圧搾すること
によって、プラスミドｐＵＣＡＴＰＡＦＥのレプリコン
、βラクタマーゼ遺伝子、およびＴＰＡコード化ＤＮＡ
のすべてを含有する〜３．４２ｋｂ　Ｈｐａｌ　−Ｉ３
ａｍＨｒ制限フラグメントをゲルから単離した。エタノ
ール沈澱によって液体からＤ　Ｎ　Ａを沈澱させた。目
的のフラグメントが約１μ９得られ、これをＴＥ緩衝液
２０μＱに懸濁した。
ＴＥ緩衝新液Ｏμρ中のプラスミドｐＴＰＡ１０３約１
０μ９を、１ＯＸｓｃａｌ緩衝液［１，０ＭＮａＣＱ、
６０ｍＭ）リス−ＨＣＱ（ＰＨ＝７．４）、６０　ｍＭ
　ＭｇＣｌ２１、Ｉ　Ｏ＋＋＋Ｍ　ＤＴＴ、および１ｘ
ｇ／１ｘｆ２ＢｓＡ］１０μＣおよび水８０μＱに加え
た。このプラスミドｐＴＰＡＩ０３　　ＤＮＡの溶液に
、制限酵素５ｃａＩ約３μＱ（〜１８単位）を加え、得
られた反応液を３７°Ｃで９０分間インキュベートした
。この反応液の容積を、ＩＸＢａｍＨＩｌ衝液で１５０
μ新液調整し、この混合物に制限酵素１３ａｍＨＩ約１
μｍ２（〜１６単位）を加え、得られた反応液を３７℃
で９０分間インキュベートした。このＤＮＡをエタノー
ルで沈澱させ、遠心して集め、電気泳動用の調製物に再
懸局した。この５ｅａｌ　−ＢａｍＨＩ消化したプラス
ミドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡを、〜１．０１５ｋｂ　
Ｓｅａｌ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントが他の消化産物
から分離するまで、１゜５％アガロースゲル電気泳動に
かけた。プラスミドｐＴＰＡ１０３のＴＰＡカルボキシ
末端コード化ＤＮＡを含有する〜１．０１５ｋｂ　５ｃ
ａｒ　−ＢａｌＩＩＨＩ制限フラグメントをゲルから単
離し、目的のフラグメント約０．５μ９を得、これをガ
ラス蒸留した水２０μＱに溶解した。
プラスミドｐＴＰＡ１０３の〜１．０１５ｋｂ　Ｓｃａ
ｌ−ＢａｍＨＩ制限フラグメント２μｇに、プラスミ　
ドｐＵｃ　１９ＴＰＡＦＥの〜３．４２ｋｂ　ＢａｍＨ
Ｉ−ＨｐａＩ制限フラグメント約２μＱを、１０ｘリガ
ーゼ緩衝液２μｅおよびＴ４　　ＤＮＡリガーゼｌμＱ
［〜ｌバイス（Ｊｅｉｓｓ）単位；このリガーゼはプロ
メガ・バイオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、
２８０ＯＳ。
Ｆｉｓｈ　Ｈａｔｃｈｅｒｙ　Ｒｏａｄ、Ｍａｄｉｓｏ
ｎ、１１５３７１１）から入手したコとともに加え、得
られた反応液を１６℃で一部インキユベートした。この
ライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐＢＷ２５から
なっていた。
このプラスミドｐＢＷ２５の制限部位および機能地図を
添付の第１４図に示す。
５０ｍＭ　ＣａＣＱｔを用いること以外は実質的に実施
例２の方法に従い、このライゲート化ＤＮＡを用いて形
質転換用にコンピテントにしておいたＥ、コリＫＩ２　
　ＪＭ１０５（ＢＲＬから人手できる）を形質転換した
。形質転換細胞を１００μ９／ｘＱアンピシリン含有の
Ｂ　ＨＩ　［ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｌ）］
で平板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によっ
てＥ、コリに１２　　ＪＭ１０５／ｐＢＷ２５形質転換
体を同定した。プラスミドｐＢＷ２５を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化すると、〜３．３８ｋｂおよび〜１．０８ｋ
ｂ制限フラグメントが得られる。後の構築にもちいろた
め、実質的に実施例３の方法に従って、プラスミドｐＢ
Ｗ２５を調製した。
ガラス蒸留した水１０μＣ中のプラスミドｐＢＷ２５約
５μ９を、１０　Ｘ　Ｈｉｎｄｌｌ１反応緩衝液約１０
μ新液よび水８０μＱに加えた。このプラスミドｐＢＷ
２５　　ＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ約ｌ
μＱ（〜２０単位）を加え、得られた反応液を３７℃で
９０分間インキュベートした。このＨｉｎｄ１１１消化
したプラスミドｐＢＷ２５　　ＤＮＡの溶液に、制限酵
素ＥｃｏＲＩ約３μＱ（〜２４単位）および１Ｍ　トリ
ス−Ｈｃ１２（ｐＨ−７，ｅ）ｌｏμＱを加え、得られ
た反応液を３７℃で９０分間インキュベートした。この
ＥｃｏＲＥ　−Ｈ１ｎｄｌｌ＋消化したプラスミドｐＢ
Ｗ２５　　ＤＮＡをエタノール沈澱で濃縮し、〜８１０
　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌ＋制限フラグメン
トが他の消化産物から分離するまで、１．５％アガロー
スゲル電気泳動にかけた。〜８１０ｂｐＥｃｏＲｒ　−
Ｈ１ｎｄｌｌ！制限フラグメント約０．５μ９をゲルか
ら単離し、ライゲーション用に調製し、これをガラス蒸
留した水２０μａに再懸濁した。
ガラス蒸留した水３５μρ中の複製型（ＲＦ）のＭＩ３
ｍｐ８　　ＤＮＡにュー・イングランド・バイオラブズ
から入手できる）約４．５μ９を、１０ｘＨｉｎｄｌｌ
ｌｌ衝液１０μＱおよび水５５μＱに加えた。
このＭ１３ｍｐ８　　ＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ約ｌμＱ（〜２０単位）を加え、得られた反応
液を３７℃で１時間インキュベートした。この［（ｉｎ
ｄ１１１消化したＭ　１３　ｍｐ８　　Ｄ　Ｎ　Ａの溶
液に、制限酵素ＥｃｏＲＩ約３μＩ２（〜２４単位）お
よび１Ｍ　トリス−ＨＣｌ２（ｐＨ−７，６）約１０μ
ｇを加え、得られた反応液を３７℃で１時間インキュベ
ートした。
このＨ１ｎｄｌｌｌ　−ＥｃｏＲＩ消化したＭ１３ｍｐ
８ＤＮＡをエタノール沈澱で集め、アガロースゲル電気
泳動用の調製物に再懸濁し、ゲル電気泳動によって大き
い制限フラグメントをゲルから単離した。
ＭＩ３ｍｐ８の大きいＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ
制限フラグメント約１μ９が得られ、これをガラス蒸留
した水２０μρに悲劇した。Ｍ１３ｍｐ８の大きいＥｃ
ｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグメント約２μＣ，
ｔ。
×リガーゼ緩衝液２μＱ１水１２μσ、およびＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ〜ｌμσ（〜ｌバイス単位）を、プラスミド
ｐＢＷ２５の〜８１０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌ
ｌ！制限フラグメント３μｇに加え、得られたライゲー
ション反応液を１６℃で一部インキユベートした。
トランスフェクションに用いるＤＮＡの量を変えること
以外は、実質的にＢＲＬＭ１３　　クローニング／°ジ
デオキシ′シークエンシング・インストラクション・マ
ニュアル（ＢＲＬ　Ｍ１３　Ｃｌｏｎｉｎｇ／’Ｄｉｄ
ｅｏｘｙ’ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉ
ｏｎ　Ｍａｎｕａｌ）記載の方法に従って、Ｅ、コリＪ
Ｍ１０３細胞（ＢＲＬから人手可能）をコンピテントに
し、ライゲーション混合物でトランスフェクションした
。挿入によるβガラクトシダーゼαフラグメントをコー
ドしている遺伝子の不活性化（これにより、Ｘ−ガレを
そのインジゴ色の切断産物に切断する能力が失われる）
によって組換え体プラークを同定した。
スクリーニングするため、白いプラーク６個をＬブロス
２　、５　ｘＱに入れ、これに、最小培地ストックで培
養してｐｒｏＡ　Ｂを有するＦエピソームの保持を確実
なものにした、Ｅ、コリＫ１２　　ＪＭ１０３（０，４
ｍ＋りを、対数増殖期において加えた。このプラークを
含有する溶液を、エアー振盪基中、３７℃で８時間イン
キュベートした。この溶液１゜５１から得た細胞をペレ
ット化し、実質的にバーンボイムおよびドーリイ［Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、Ｎｕｃ。
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、７：１５１３（１９７９）］の
アルカリ・ミニスクリーン法に従って、ＲＦ　　ＤＮＡ
を単離した。各培養物の残りは４℃で保存した。目的の
ファージ（９Ｍ８ＢＷ２６と命名した）は、Ｍ１３ｍｐ
８の〜７．２ｋｂ　ＥｃｏＲｒ−Ｈｉｎｄｌｌｌ制限フ
ラグメントにライゲートしたプラスミドｐＢＷ２５の〜
８１０ｂｐＥｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄｌｌ！制限フラグメン
トを含有していた。
対数期のＥ、コリ　ＪＭ１０３約５０雇を９Ｍ８ＢＷ２
６で感染さ仕、エアー振盪基中、３７℃で１８時間イン
キュベートした。低速遠心することによって感染細胞を
ペレット化し、上記インストラクション・マニュアルの
方法をスケールアップすることによって培養物上清から
１末鎖ｐＭ８ＢＷ２６　　ＤＮＡを調製した。フレノウ
反応を、室温で３０分間、次いで３７℃で６０分間、次
いで１０℃で１８時間行うこと以外は、実質的にアデル
マン等［Ａｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａ１、、ＤＮＡ　２（
３）：１８３−１９３（１９８３）］の教示に従って、
１末鎖ｐＭ８ＢＷ２６を突然変異誘発にかけた。さらに
、Ｓｔ処理を２０℃で行ない、緩衝液の塩濃度を製造元
推奨の半分にし、そしてＭ＋３配列決定（シーフェンシ
ング）ブライマー（ＢＲＬ）を用いた。天然ＴＰＡのア
ミノ酸残基８７から２６１に対応するコード化配列を削
除するために用いた合成オリゴデオキシリボヌクレオヂ
ド・ブライマーは以下の配列で示される＝５°−ＧＧＧ
ＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＴＡＴＣＣＡＣＣＴＧＣＧ
ＧＣＣＴＧＡＧＡ−３゜得られｆコ突然変異誘発混合物
を用い、実質的に上記の感染方法に従って、Ｅ、コリＫ
Ｉ２　　ＪＭＩ０３をトランスフェクションした。ＲＦ
　　ＤＮＡの制限酵素分析、およびマクサムおよびギル
バート（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）のＤＮ
Ａ配列決定によって目的の突然変異体を同定した。天然
ＴＰＡのアミノ酸残基８７から２６１に対応するコード
化配列が削除された目的の突然変異体をｐＭ８ＢＷ２７
と命名した。
プラスミドｐＢＷ２８を構築するためには、多種のＤＮ
Ａフラグメントが必要である。それらフラグメントの最
初のものを以下のようにして得た。
ガラス蒸留した水２０μｇ中のＲＰ　ｐＭ８ＢＷ２７　
　ＤＮＡ　〜２０ｕ９を、ｌ０ＸＮｄｅｌｌ衝液１０μ
ｇおよび水６０μａに加えた。このプラスミドｐＭ８Ｂ
Ｗ２７　ＤＮＡの混合物に、制限酵素Ｎｄｅｌ約！０μ
ｍ２（〜５０単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃ
で２時間インキュベートした。このＮｄｅｌ消化したプ
ラスミドｐＭ８ＢＷ２７　ＤＮＡをエタノールで沈澱さ
せ、遠心して集め、１０ｘＥｃｏＲＩ緩衝液１０μＱお
よび水９０μＱに再懸濁した。このＮｄｅＩ消化したプ
ラスミドｐＭ８ＢＷ２７ＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ約１０μａ（〜５０単位）を加え、得られた反応
液を３７℃で２時間インキュベートした。欠失部位を含
むＴＰＡコード化配列配列部を含有する〜５６０ｂｐＮ
ｄｅ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントが他の消化産
物から分離するまで、このＥｃｏＲＩ　−Ｎｄｅ　Ｉ　
消化したプラスミドｐＭ８ＢＷ２７　　ＤＮＡをアガロ
ースゲル電気泳動にかけた。この〜５６０ｂｐＮｄｅＴ
−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントをゲルから単離し、目的
のフラグメント約０．５μ９を得、これをガラス蒸留し
た水２０μＱに再懸濁した。
プラスミドｐＢＷ２８の構築に必要な第２のフラグメン
トは、鎖１本ずつ自動ＤＮＡ合成機で合成する。実質的
に実施例６Ａの方法に従って、２本の相補的な鎖（これ
らは、ハイブリダイズしてＸｂａｌおよびＮｄｅｌの重
なり部分を有する２本鎖ＤＮＡセグメントを形成する）
をキナーゼ処理し、アニーリングする。このリンカ−は
以下の構造を有している： Ｘｂａｌ ＡＡＴＡＡＣＡ−３゜ １１１１Ｎ ＴＴＡＴＴＧＴＡＴ Ｎｄｅｌ プラスミドｐＢＷ２８の構築に必要な第３のフラグメン
トは以下のようにして調製した。ＴＥ緩衝液２０μρ中
のプラスミドｐＴＰＡＩ０３（〜２０μｇ）を、１０Ｘ
１０ＸＢａ緩衝液１０μ（！および水６０μρに加えた
。このプラスミドｐＴＰＡＩ０３　　ＤＮＡの溶液に、
制限酵素ＢａｍＨＩ約ＩＪｔＱ（〜５０単位）を加え、
得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
このＢａｍＨ［消化したプラスミドｐＴＰＡ　ｌ　０３
　　ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、１
ＯＸＥｃｏＲＩ緩衝液１０μＱおよび水８０μＱに再懸
濁した。このＢａｍＨｒ消化したプラスミドｐＴＰＡＩ
０３　ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＥｃｏｎＩ約１０μＱ
、（〜５０単位）を加え、得られた反応液を３７℃で２
時間インキュベートした。ＴＰＡのカルボキシ末端のコ
ード化配列を含有する〜６８９ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｉ
３ａｍｌ−１１制限フラグメントが他の消化産物から分
離するまで、このｎａｍｌ−Ｉ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ消化
しｆコブラスミドｐＴＰＡ　Ｉ　０３　　ＤＮＡをアガ
ロースゲル電気泳動にかけた。この〜６８９ｂｐフラグ
メント約０．５μ９をゲルから単離し、次いでガラス蒸
留した水１０μｇに再懸濁した。
プラスミドｐＢＷ２８の構築に必要な最後のフラグメン
トはプラスミドｐＬ　Ｉ　Ｉ　Ｏから単離した。
プラスミドｐｔ、　１１０の制限部位および機能地図を
添付の第１４図に示し、プラスミドｐＬ　Ｉ　Ｉ　Ｏの
構築を実施例１０Ｄ（本実施例の次面）に記載する。
ＴＥ緩衝液２５μＱ中のプラスミドｐＬＩＩｏ約２５μ
９を、ｌ０ｘＸｂａｒ援衝液［０，５ＭＮａＣＱ、６０
ｍＭ　　トリス−ＨＣＣ（ｐＨ＝７．９）、６０ｍＭ　
ＭｇＣＬ、およびＩｚ９／ｚＱＢＳＡ］ｌ　０ｔｔＱお
よび水５５μジに加えた。このプラスミドｐＬ１１０　
ＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｘｂａｌ約１０．ｃｉ（〜５
０単位）を加え、得られた反応液を３７℃で２時間イン
キュベートした。このＸｂａＩ消化したプラスミドｐＬ
１１０ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、
１０ＸＢａｍＨＩ緩衝液１０μＱお新液水８９μＱに再
懸濁した。このＸ　ｂａ　Ｉ消化したプラスミドｐＬｌ
１０ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＢａｍＨＩ約１μσ（〜
５単位）を加え、得られた反応液を３７℃で３０分間イ
ンキュベートして、ＢａｍＨ１部分消化物を得た。〜６
．ＯｋｂＸｂａ１−ＢａｍＨＩフラグメントが他の消化
産物から明確に分離するまで、このＸ　ｂａ　Ｉ消化−
ＢａｍＨ１部分消化したプラスミドｐＬ　１１０　　Ｄ
ＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけた。この〜６　、
　Ｏｋｂ制限フラグメントをゲルから単離し、約０．５
μ９の〜６、Ｏｋｂ　Ｘｂａｌ　−ＢａｍＨ！制限フラ
グメントを得、これをガラス蒸留した水約４０μＱに悲
劇した。
この〜６．Ｏｋｂ　Ｘｂａｌ−ＢａｍＨＩ制限フラグメ
ントは、ＥＫ−ＢＣ；ＨをコードしているＤＮＡを除き
９．プラスミドｐｔ、　ｌ　Ｉ　Ｏのすべてを含有して
いる。
プラスミドｐＢＷ２８を構築するため、次のフラグメン
ト、ずなわち、プラスミドｐ１、　１１０の〜６．Ｏｋ
ｂ　ＢａｍＨＩ−Ｘｂａｌ制限フラグメント約０．１μ
ｇ（〜８μＮ）、プラスミドｐＭ８ＢＷ２７の〜５６０
ｂｐ　Ｎｄｅｌ　−ＥｃｏＲＩ制限フラグメント約０．
０ｂｐｇ（〜２μＱ）、プラスミドｐＴＰＡ１０３の〜
６８９ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ制限フラグメン
ト約０　、１７１（〜２　ｕ（２）、および〜４５ｂｐ
Ｘｂａｌ−Ｎｄｅ１合成リンカ−約０．０２μｇ（〜１
μＩ２）をいっしょにして混合した。このＤＮＡ混合物
に、１０Ｘリガーゼ緩衝液約２μｇおよびＴ４　　ＤＮ
Ａリガーゼｌμｇ（〜ｌバイス単位）を加え、得られた
ライゲーション反応液を４℃で一晩２時間インキュベー
トした。ライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐＢＷ
２８からなっていた。このプラスミドｐＢＷ２８の制限
部位および機能地図を添付の第１４図に示す。
このライゲート化ＤＮＡを用い、５０ｍＭＣａＣＱｘを
用いること以外は実質的に実施例２の方法に従って、コ
ンピテントにしておいたＥ、コリに１２　ＭＭ２９４（
ＮＲＲＬ　Ｂ　　１５６２５）を形質転換した。プラス
ミドｐＢＷ２８上にラムダｐＬプロモーターおよび感温
性ラムダｐＬリプレッサーをコードしている遺伝子が存
在しているため、形質転換方法および形質転換体の培養
方法を若干変えた。形質転換および次いで行う培養にお
いて、細胞を３２℃以上の温度にしなかった。本実施例
の次面は、ラムダｐＬプロモーターおよびその感温性リ
プレッサーをコードしているプロモーターの取り扱い方
法をより詳細に説明している。目的のＥ、コリに１２　
　ＭＭ２９４／ｐＢＷ２Ｂ形質転換体を、そのテトラサ
イクリン耐性かつアンピシリン感受性の表現型およびそ
のプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。
Ｄ、プラスミドｐｔ、　ｔ　＋　ｏの構築プラスミドｐ
ＫＣ２８３を出発原料として用いてプラスミドｐｔ、ｚ
ｏを構築した。Ｅ、コリに１２　ｌ３Ｅ１２０１／ＰＫ
Ｃ２８３の凍結乾燥品を、ＮＲＲＬから取得番号ＮＲＲ
Ｌ　Ｂ−１５８３０のもとで入手する。この凍結乾燥品
をＬブロス１０Ｎ含有の試験管に移し、３２℃で２時間
インキュベートし、この時点で培養物を５０μ９／Ｒ（
ｌアンピシリンの濃度にし、次いで３２℃で一晩インキ
ユベートする。プラスミドｐＫ０２８３がｐＬプロモー
ターを含有し、Ｅ、コリに１２　　ＢＥ１２０１細胞が
細胞ＤＮＡ内に組み込まれた感温性ｃ■リプレッサー遺
伝子を含有するので、このＥ、コリに１２　　ＢＥ１２
０１／ｐＫＣ２８３細胞を３２℃で培養した。野性型ラ
ムダｐＬリプレッサー遺伝子を含有する細胞、またはラ
ムダｐ１、プロモーターを含有しない細胞を、このプラ
スミド単離方法に用いるときには、本明細書中の後の実
施例に記載したように、インキュベーション温度は３７
℃である。
一晩培養物の少量を、Ｅ、コリに１２　　ｌ３Ｅ１２０
１／ｐＫＣ２８３の単一コロニー単離体が得られるよう
な方法で、５０μ９／１１（ｌアンピシリン含有のし寒
天プレートで平板培養する。得られた単−コロニーを、
５０μ９７Ｒ（ｌアンピシリン含有のＬプロス１０ｍ１
２に接種し、激しく振盪しながら３２℃で一晩インキユ
ベートした。この−晩培養物１０ｍＱをＬブロス５００
１１Ｉ２に接種し、培養物が定常期に到達するまで、激
しく振盪しながら３２℃でインキュベートした。次いで
、実質的に実施例３の方法に従って、細胞からプラスミ
ドＩ）ＫＣ２８３ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＫＣ
２８３が約Ｌ１得られ、これをＴＥ緩衝液中、約１μ９
／μｇの濃度で、４℃で保存した。プラスミドｐＫＣ２
８３の制限部位および機能地図を添付の第１４図に示す
。
プラスミドｐＫ０２８３　　ＤＮＡ約１０μＱ（〜１０
μｇ）を、ｔＯＸ中濃度塩制限緩衝液［５００ｎ＋Ｍ　
ＮａＣＱ、１００ｍＭ　　）リス−ＨＣＱ（ｐＨ＝７゜
５）、１００ｍＭ　ＭｇＣＬｌおよび１０ｍＭＤＴＴ］
２０ｕＱ、　　１ｉｆｔ／Ｌ（ｌ　Ｂ５Ａ２０ｕＱ、制
限酵素Ｐｖｕｌｌ　５　Ｈ２（〜２５単位）、および水
１４５μｆ２と混合し、得られた反応液を３７℃で２時
間インキュベートした。ここに記載する制限酵素反応は
、常法により、フェノール抽出、次いでクロロホルム抽
出によって停止さ仕、ＤＮＡを沈澱させ、エタノールで
洗浄し、そしてＤＮＡをＴＥ緩衝液に再ｐＢした。上記
のようにしてＰｖｕｌｌ消化を停止させた後、Ｐｖｕｌ
ｌ消化したプラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡを沈澱させ、
これをＴＥ緩衝新液μｇに再懸濁した。
Ｘｈｏｌリンカ−（５’−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３°）約
６００ピコモル（ｐＭ）を、５×キナーゼ緩衝液［３０
０ｍＭ）リス−〇０ｆｆ（ｐＨ＝７．８）、５０ｍＭＭ
　ｇ　ＣＱ　ｔ、および２５ｍＭＤＴＴコ１０μ（，５
ｍＭＡＴＰ５μ（、水２４μｍ２．Ｔ４　ポリヌクレオ
チドキナーゼ０．５μｆｆ［Ｐ　−Ｌバイオケミカルズ
（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）定義の約２．５
単位］、Ｉｚｙ／１（２ＢＳＡ５μｆ２．および１０ｎ
Ｍスペルミジン５μａを含有する混合物中、混合物を３
７℃で３０分間インキュベートすることによってキナー
ゼ処理した。このキナーゼ処理したＸ　ｈｏ　Ｉリンカ
−約１２゜５μ１２を、Ｐｖｕｌｌ消化したプラスミド
ｐＫＣ２８３ＤＮＡ　　５μｇに加え、次いでこのＤＮ
Ａ溶液に、ｔ　ＯＸ　＋、＋ガーゼ緩衝液２．５μ（２
，Ｔ４　　ＤＮＡＩＪガーゼ２．５μＱ（Ｐ　−Ｌバイ
オケミカルズ定義の約２．５単位）、１０ｍＭスペルミ
ジン２．５μ１２゜および水１２．５μＱを加え、得ら
れたライゲーション反応液を４℃で一晩インキユベート
した。ライゲーション反応の後、反応混合物を高温緩衝
液［０，１Ｍ　ＮａＣＱ、０．０５Ｍ　　トリス−Ｈｃ
Ｒ（ｐＨ＝７．５）、１０　、０　ｍＭ　ＭｇＣ（ｂ、
および１ｍＭＤＴＴ］の組成に調整した。この混合物に
制限酵素ｘｈＯＩ約１０μＱ（１００単位）を加え、得
られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
反応を止め、Ｘｈｏｌ消化したＤＮＡを沈澱させ、再懸
濁し、ライゲーション混合物にＸｈｏＩリンカ−を加え
ないこと以外は上記と同様にして、ライゲートした。こ
のライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐＫＣ２８３
ＰＸからなっていた。このプラスミドｐＫＣ２８３ＰＸ
の制限部位および機能地図を添付の第１４図に示す。
Ｅ、コリに１２Ｍ０（λ“）［Ｎ　ＲＲＬから取得番号
ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９９３のもとて入手可能コは野性型
ラムダｐＬｃｌリプレッサー遺伝子を含有しているので
、Ｅ、コリに１２Ｍ０（λ′″）細胞においてはラムダ
ｐＬプロモーターからの転写は起こらない。Ｅ、コリに
１２Ｍ０（λ“）の単一コロニーを単離し、細胞の一部
培養物１０ｍＱを調製する（増殖培地にアンピシリンを
用いない）。この−晩培養物５０ｕＱを、１０ｍＭ　Ｍ
ｇ５Ｏ，および１０ｍＭ　ＭｇＣＱｘ含有のしブロス５
肩Ｑに接種した。
この培養物を、激しく振盪しながら３７℃で一晩インキ
ユベートした。翌朝、この培養物を１０＋ｎＭＭｇＳＯ
ａおよび１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含有のＬブロスで２０
０ｊＩＱに希釈した。この希釈培養物を、０゜Ｄ、５＠
０が約０．５（これは、約ｌＸｌ０’細胞／酎の細胞密
度を示す）になるまで、激しく振盪しながら３７℃でイ
ンキュベートした。氷水浴で培養物を１０分間冷却し、
次いで４℃、４０００Ｘｇで１０分間遠心して細胞を集
めた。この細胞ベレットを冷１０ｍＭ　ＮａＣｌ２１０
０ｘＱに再懸濁し、そして直ちに遠心して再ペレット化
した。この細胞ペレットを３０ｍＭ　ＣａＣＱｔ　１０
０ｕＱに再懸濁し、水上で２０分間インキュベートした
。
もう一度遠心して細胞を集め、これを３０ｍＭＣａＣＱ
２１０ｙｒＱに再懸濁した。この細胞のうち０゜５１１
Ｑを上記のようにして調製したライゲート化ＤＮＡ（こ
のＤＮＡは３０ｍＭ　ＣａＣ（！−にしておいた）に加
えた。この細胞−ＤＮＡ混合物を水上で１時間インキュ
ベートし、４２℃で９０秒間熱シヨツクを加え、次いで
氷上で約２分間冷却した。この細胞−ＤＮＡ混合物を、
１２５ｉ（７フラスコ中、ＬＢ培地でＬＯｍ（ｌに希釈
し、３７℃で１時間インキュベートした。この１０Ｏμ
ｇをアンピシリン含有のし寒天プレートにプレートし、
コロニーが現れるまで３７℃でインキュベートした。
このコロニーを別々に培養し、個々のコロニーのプラス
ミドＤＮＡを制限酵素分析およびゲル電気泳動で試験し
た。プラスミドＤＮＡの単離は、実施例３の方法に従っ
て、比較的小さいスケールで行ったが、目的のＥ、コリ
に１２Ｍ０（λ″″）／１）ＫＣ２８３ＰＸ形質転換体
が同定されるまでＣ５ＣＱ勾配工程は割愛した。プラス
ミドｐＫＣ２８３ＰＸの制限部位および機能地図を添付
の第１４図に示す。
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸ　　ＤＮＡｌ０μ９を、１
０Ｘ　高面緩衝液２０ｕ（１，ｌ＋ｇ／Ｊ　Ｂ５Ａ２０
ｕＱ、制限酵素Ｂｇｌｌｌ　５μｅ（〜５０単位）、制
限酵素Ｘｈｏｌ　　５　Ｂ１２（〜’５０単位）、およ
び水１５０μＱに溶解し、得られた反応液を３７℃で２
時間インキュベートした。反応を止め、Ｂｇｌｌｌ−Ｘ
ｈｏｌ消化したＤＮＡを沈澱させ、このＤＮＡをＴＥｆ
ｌ衝液５新液に再懸濁した。
ＢｇｌｌｌおよびＸｈｏｌ制限酵素切断の特徴を示す１
本鎖ＤＮＡ末端を有するＤＮＡリンカ−を、自動ＤＮＡ
合成機を用いて合成し、実施例６Ａの記載と同様にして
キナーゼ処理した。このＤＮＡリンカ−は次の構造を有
していた： ＡＣＡＣ−３’ ＴＣＴＧＡＧＣＴ−５” このリンカ−およびＢｇｌｌｌ−ＸｈｏＩ消化し、たプ
ラスミドｐＫＣ２８３ＰＸを、実質的に上記ライゲーシ
ョン法に従ってライゲートした。このライゲート化ＤＮ
Ａは目的のプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌからなっていた
。このプラスミドｐＫ０２８３−Ｌの制限部位および機
能地図を添付の第１４図に示す。このプラスミドｐＫＣ
２８３−Ｌ　　ＤＮＡを用いてＥ、コリに１２Ｍ０（λ
０）を形質転換し、得られたＥ、コリに１２Ｍ０（λ＋
）／ｐＫ　Ｃ２８ＩＬ形質転換体を、そのアンピシリン
耐性の表現型およびプラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
よって同定した。
プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　　ＤＮＡ約１０μりを、
１０Ｘ高塩高面緩衝液２０μＱ　Ｉ　ｍ９／ＩＩＩＱ　
Ｂ　５Ａ２０μ（、制限酵素Ｘｈｏｌ　　５　μｃ（〜
５０単位）、および水１５５μＱに溶解し、得られた反
応液を３７℃で２時間インキュベートした。次いで、Ｘ
ｈｏｌ消化したプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　ＤＮＡを
沈澱させ、これを１０Ｘ　ニックトランスレーンヨン緩
衝液［０５Ｍ　トリス−ＨＣＣ（ｐＨ＝　７２）、０．
１ＭＭｇ５Ｏ，、および１ｍＭＤＴＴ］２μＱ１デオキ
シヌクレオチド三リン酸それぞれが２１１１Ｍである溶
液ｌμＱ１水１５μＱ１　フレノウｌμＣ（Ｐ　−Ｌバ
イオケミカルズ定義の〜６単位）、およびＩ　Ｍ９／１
ｔｒ（ｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ　１μＱに再懸濁した。得られた
反応液を２５℃で３０分間インキュベートし、この溶液
を７０℃で５分間インキュベートすることによって反応
を止めた。
実質的に、上記のリンカ−ライゲーション法に従って、
Ｂａｍ１−ＩＩリンカ−（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧ
−３’）をキナーゼ処理し、これを、Ｘｈｏｌ消化し、
フレノウ処理したプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　　ＤＮ
Ａにライゲートした。ライゲーション反応の後、このＤ
ＮＡを高温緩衝液中、３７℃で約２時間、Ｉ３ａｍＨＩ
約１００単位で消化した。
ＢａｍＨＩ消化の後、実質的に上記の方法に従って、Ｄ
ＮＡをライゲーション用に調製し、〜５　、９　ｋｂＢ
ａｍｌｌＩ制限フラグメントをライゲートして環化し、
Ｅ、コリＫＩ２ＭＯ（λ“）に導入して形質転換した。
実質的に実施例３の方法に従って、Ｅ。
コリに１２Ｍ０（λ＋）／ＰＫＣ２８３−ＬＩ３形質転
換体を同定し、次いでプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢ　
ＤＮＡを形質転換体から調製した。このプラスミドｐＫ
０２８３−ＬＢの制限部位および機能地図を添付の第１
４図に示す。
実質的に上記方法に従って、プラスミドｐＫＣｐ８３Ｐ
Ｘ約１０μ９を、高温緩衝液中、制限酵素５ａｉｌで消
化し、フレノウで処理し、ＥｃｏＲＩリンカ−（５’−
ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣ−３°）にライゲートした。
制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化（これにより〜２．１ｋ
ｂＤＮＡが削除される）の後、〜４．０ｋｂＥｃｏＲＩ
制限フラグメントをライゲーションにより環化してプラ
スミドｐＫＣ２８３ＰＲＳを得た。実質的に実施例３の
方法に従って、このライゲート化Ｄ　Ｎ　Ａを用いてＥ
、コリに１２Ｍ　Ｏ（λ＋）を形質転換し、Ｅ、コリＫ
］２Ｍ０（λ＋）／ｐＫＣ２８３ＰＲ９形質転換体を同
定した後、形質転換体からプラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ
Ｓ　ＤＮＡを調製した。このプラスミドｐＫＣ２８３Ｐ
ＲＳの制限部位および機能地図を添付の第１４図に示す
。
プラスミドｐＫｃ２８３ＰＲｓ約１０μ９を、高温緩衝
液２００μｅ中、制限酵素Ｐｓｔｒおよび５ｐｈｒそれ
ぞれ約５０単位で消化した。この反応液を３７℃で約２
時間インキュベートした後、反応混合物を、トリス−ア
セテート緩衝液中、０．６％低ゲル化温度アガロース［
ＦＭＣ社（ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｒｉｎ
ｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｒｏｃｋ［
ａｎｄ、Ｍａｉｎｅ　０４８４１）］ゲルで、２〜３時
間、〜１３０■および〜７５ｍＡで電気泳動した。
ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液で染色し、〜０．８５
ｋｂ　Ｐｓｔ（−Ｓｐｈｌ制限フラグメントを含有する
ＤＮＡバンド（長波長ＵＶ光で目に見えるようにした）
をゲルから小さいセグメントとして切り出した。セグメ
ントの重虫および密度からセグメントの体積を測定し、
等容量の１０ｍＭ　　トリス−Ｈｃｃ（ｐｔｔ　＝　７
　、６　）をセグメントを含む試験管に加えた。次いで
７２℃でインキュベートしてセグメントを溶融した。約
１００μＣ容量中に、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ９の
〜０．８５ｋｂＰｓＬＩ−９ｐｈｌ制限フラグメントが
約１μ９得られた。
同様の方法により、プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢを制
限酵素Ｐｓｔｌおよび５ｐｈｌで消化し、得られた〜３
　、　Ｏｋｂ制限フラグメントをアガロースゲル電気泳
動によって単離し、ライゲーション用に調製した。
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳの〜０．８５ｋｂＰｓｔ
ｌ−３ｐｈｌ制限フラグメントを、プラスミドｐＫＣ２
８３−ＬＢの〜３．Ｏｋｂ　Ｐｓｔｌ　−９ｐｈｌ制限
フラグメントにライゲートした。このライゲート化ＤＮ
Ａは目的のプラスミドｐＬ３２からなっていた。プラス
ミドｐＬ３２の制限部位および機能地図を添付の第１４
図に示す。プラスミドｐＬ３２をＥ、コリに１２Ｍ０（
λ”）細胞に導入して形質転換し、実質的に実施例３の
方法に従って、Ｅ、コリに１２Ｍ０（λ”　）／ｐＬ　
３２形質転換体からプラスミドｐＬ３２ＤＮＡを調製し
た。プラスミドｐＬ３２ＤＮＡの分析により、プラスミ
ドｐＫＣ２８３ＰＸのフレノウ処理した５ａｌＩ末端に
１以上のＥｃｏＲＩリンカ−が結合していることがわか
った。１以上のＥｃｏＲＩリンカ−の存在は、プラスミ
ドｐＬ３２またはプラスミドｐ　［、３２誘導体の有用
性に影響せず、これをＸｈｏｌ制限部位（この部位は２
個のＥｃｏＲＩリンカ−がライゲートしたときに生成す
る）の存在によって検出することができる。
プラスミドｐｃｃ１０１はショーナー等［５ｃｈｏｎｅ
ｒ　ｅｔ　ａ１、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ、ＰＬ１、５４０３−５４０７（１９８４
）］が開示している。ショーナー等はプラスミドｐｃｃ
ｔｏｔをプラスミドｐｃＺＩｏ＋と称している。プラス
ミドｐｃｃ１０１の制限部位および機能地図を添付の第
１４図に示す。ＥＫ−Ｉ３ＧＨをコードしているＤＮＡ
を単離するため、プラスミドｐｃｃｔｏｔ約１０μ９を
、制限酵素ＸｂａｌおよびＢａｍ１−１１それぞれを約
５０単位含有する高面緩衝液２００μρ中で消化した。
この消化産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し
、ＥＫ−Ｂ　Ｇ　Ｈをコードしている〜０，６ｋｂ　Ｘ
ｂａＩ　−ＢａｍＨ［制限フラグメントをゲルから単離
し、ライゲーション用に調製した。
＊ト−−ｆ−’ｙママ：ＶｎＴ　Ｑすｆ−６１ＩＥ　６
１　専ｖ　ｋ−ｖ　＋−よびＢａｍＨＩで消化し、〜３
　、９　ｋｂ制限フラグメントを単離し、ライゲーショ
ン用に調製した。このプラスミドｐＬ３２の〜３．９ｋ
ｂ　Ｘｂａｌ　−ＢａｎＨ１制限フラグメントを、プラ
スミドｐｃｃ１０１の〜０．６ｋｂ　ＸｂａＩ−Ｂａｍ
ＨＩ制限フラグメントにライゲートしてプラスミドｐＬ
４７を得た。
プラスミドｐＬ４７の制限部位および機能地図を添付の
第１４図に示す。プラスミドｐＬ４７をＥ。
コリに１２Ｍ０（λ′″）に導入して形質転換し、Ｅ、
コリに１２Ｍ０（λ”　）／ｐＬ　４７形質転換体を同
定した。実質的に実施例３の方法に従って、形質転換体
からプラスミドｐＬ４７ＤＮＡを調製した。
プラスミドｐＰＲ１２は、感温性ｐｔ、リプレッサー遺
伝子ｃ１８５７およびプラスミドｐＦ３Ｒ３２２のテト
ラサイクリン耐性付与遺伝子を含有している。プラスミ
ドｐＰＲ１２は、１９８４年３月！り日発行の米国特許
Ｎｏ、４，４３６，８１５に記載され、特許請求されて
いる。プラスミドｐＰＲ１２の制限部位および機能地図
を添付の第１４図に示す。
プラスミドｐＰＲ１２約１０μ９を、高温緩衝液２００
Ｈ２中、３７℃で２時間、制限酵素ＥｃｏＲＩ約５０単
位で消化した。実質的に上記方法に従って、このＥｃｏ
ＲＩ消化したプラスミドｐＰＲ１２ＤＮＡを沈澱させ、
次いでフレノウで処理した。
フレノウ反応の後、このＥｃｏＲＩ消化し、フレノウ処
理したプラスミドｐＰＲ１２ＤＮＡをライゲートして再
環化し、目的のプラスミド１）ＰＲ１２ΔＲ１からなる
このライゲート化ＤＮＡを用いてＥ、コリに１２　　Ｒ
Ｖ３０８（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５６２４）を形質転換し
た。形質転換体はテトラサイクリン（１０μｇ／、ｗｉ
２）耐性に基いて選択した。実質的に実施例３の方法に
従って、Ｅ、コリに１２ＲＶ３０８／ｐＰＲ１２ΔＲ１
形質転換体を同定した後、プラスミドｐＰＲ１２ΔＲＩ
　　ＤＮＡを形質転換体から調製した。
プラスミドＩ）ＰＲ１２ΔＲ１約１０μ９を、中堀緩衝
液２００μσ中、３７℃で２時間、制限酵素Ａｖａｌ約
５０単位で消化した。このＡｖａ！消化したプラスミド
ｐＰＲ１２ΔＲＩ　　ＤＮＡを沈澱させ、次いでフレノ
ウで処理した。フレノウ反応の後、このＡｖａｌ消化し
、フレノウ処理したプラスミドｐＰＲＩ２ΔＲＩ　　Ｄ
ＮＡをＥｃｏＲＩリンカ−（５゜−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣ
ＣＴＣ−３’）にライゲートし、沈澱させ、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩを約５０単位含有する高塩緩衝液約２００μＣ
に再懸濁し、３７℃で約２時間インキュベートした。こ
のＥＣ０Ｒ１消化の後、反応混合物を低溶融アガロース
ゲルにかけ、〜５．ＩｋｂＥｃｏＲＩ制限フラグメント
をゲルから精製し、ライゲーションによって再環化して
目的のプラスミドｐＰＲＩ２Ａｌｌを得た。このプラス
ミドｐＰＲｌ　２ＡＲＩ　　ＤＮＡをＥ、コリＫ１２　
　ＲＶ３０８に導入して形質転換した。形質転換体の選
択はテトラサイクリン耐性に基いで行った。実質的に実
施例３の方法に従って、プラスミドｐＰＲ１２ＡＲＩ　
　ＤＮＡを形質転換体から調製した。プラスミドｐＰＲ
１２ＡＲ１の制限部位および機能地図を添付の第１４図
に示す。
プラスミドｐｐＲｌ　２Ａｎ　Ｉ　　ＤＮＡ約１０μ９
を、制限酵素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩそれぞれを約５
０単位含有する高塩緩衝液約２００Ｈに懸濁し、この消
化反応液を３７℃で約２時間インキュベートした。次い
で、反応混合物をアガロースゲルにかけ、プラスミドｐ
ＰＲ１２ＡＲ１の〜２　、９　ｋｂＰｓ目−ＥｃｏＲＩ
制限フラグメントを単離し、ライゲーション用に調製し
た。
プラスミドｐＬ４７約１０μ９を、高温緩衝液２００μ
６中、３７℃で２時間、制限酵素ＰｓｔｒおよびＢａｍ
ＨＩで消化した。このＰｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨ１消化し
たＤＮＡをアガロースゲルにかけ、複製起源およびアン
ピシリン耐性付与遺伝子の一部を含有する〜２．７ｋｂ
　ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＥ制限フラグメントを単離し、ラ
イゲーション用に調製した。別の反応液において、プラ
スミドｐＬ４７ＤＮＡ約１０μ９を、高温緩衝液２００
μｇ中、３７℃で２時間、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩで消化し、ラムダルＬ転写活性化配列、Ｅ、コ
リ　ｌｐｐ翻訳活性化配列、およびＥ　Ｋ　−Ｂ　Ｇ　
Ｉ−１をコードしているＤＮＡを含有する〜１．０３ｋ
ｂ　ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨ！制限フラグメントを単離
し、ライゲーション用に調製した。
プラスミドｐＬ４７の〜２．７ｋｂ　Ｐｓｔｌ　−Ｂａ
ｍＨｌおよび〜１．０３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
制限フラグメントを、プラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１の〜
２．９ｋｂ　ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントに
ライゲートしてプラスミドｐＬ　１１０を構築し、この
ライゲート化ＤＮＡを用いてＥ、コリＫ１２ＲＶ３０８
を形質転換した。テトラサイクリン耐性に基いて形質転
換体を選択した。
２つのＰｓｔｌ制限酵素認識部位が、ＥＫ−ＢＧＨコー
ド化領域に存在する（添付図の制限部位および機能地図
には記載されていない）。プラスミドｐｔ、ｚｏの制限
部位および機能地図を添付の第１４図に示す。
Ｅ、最終的なプラスミドｐＢＷ３２の構築プラスミドｐ
ＳＶ２−β−グロビンＤＮＡ（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５９
２８）約１０ｕ９を、１０ＸＨｉｎｄｌｌ＋反応緩衝液
１０μｆｆ１制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ　５μＱ（〜５０
単位）、および水８５μＱに溶解し、この反応液を２時
間３７℃に保った。次いでこの反応混合物を０，１５Ｍ
ＬｉｃＱとし、２．５倍量のエタノール加え、ドライア
イス−エタノール浴でインキュベートした後、遠心して
ＤＮＡをペレット化した。
このＤＮＡベレットを、１０ｘＢｇｌｌｌ緩衝液１０μ
Ｑ、制限酵素Ｂｇｌｌｌ　５μＱ（〜５０単位）、およ
び水８５μＱに溶解し、この反応液を２時間３７°Ｃに
保った。このｌ３ｇ１１１消化の後、反応混合物を０．
８５％アガロースゲル電気泳動にかけ、フラグメントを
分離した。前記と同様にして、臭化エヂジウムおよび紫
外光を用いてゲルを可視化し、目的の〜４．２ｋｂ　Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ−８ｇｌｌｌフラグメントを含有するバン
ドをゲルから切り出した。ベレットを水１０μＱに再懸
濁した。このペレットは目的のプラスミドｐＳＶ２−β
−グロビンの〜４　、２　ｋｂ　ＩＩ　１ｎｄｌｌｌ　
−Ｂｇｌｌｌ制限フラグメント〜５μ９からなっていた
。実質的に上記教示に従って、ＴＰＡをコードしている
プラスミドｐＴＰＡＩ０３の〜２．Ｏｋｂ　Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントをプラスミドｐＴＰ
Ａ１０３から単離した。
プラスミドｐＴＰＡ１０３の〜２．Ｏｋｂ　Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ−ＢａｍＨＩ制限フラグメント約５μ９か得られ、
水１０μｇに懸濁し、−２０℃で保存した。
プラスミドｐＳＶ２−β−グロビンの〜４　、２　ｋｂ
Ｂｇｌｌｌ−Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグメント２ｕＱお
よびプラスミドｐＴＰＡ１０３の〜２　、　Ｏｋｂ　Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメント４μｇをいっし
ょにして混合し、次いでｔＯＸ　　リガーゼ緩衝液２μ
Ｑ、水ＩＩμＱ１およびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ１μｍ
２（〜５００単位）とともに４℃で一部インキユベート
した。このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐＴ
ＰＡ３Ｑ１からなっていた。このプラスミドの制限部位
および機能地図を添付の第１４図に示す。実質的に実施
例３の教示に従い、このライゲート化ＤＮＡを用いて、
形質転換用にコンピテントにしたＥ、コリに１２ＲＲ１
細胞（ＮＲＲＬＢ−１５２１０）を形質転換した。実質
的に実施例３の方法に従って、Ｅ、コリに１２ＲＲ１／
ＰＴＰＡ３０１形質転換体からプラスミドＤＮＡを得プ
ラスミドｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆｒは、ジヒドロ葉酸還元
酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子に共有結合したＤＮＡの増幅お
よび形質転換した真核生物細胞の選択に有用であるｄｈ
ｆｒ遺伝子を含有している。プラスミドｐＳＶ　２−ｄ
ｈｆｒ［Ｅ　、コリＫｌ　２　　ＨＢ　１０１／ｐＳＶ
２−ｄｈｒｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）から単離した］１
０ｕ９を、１ＱＸＰｖｕｌｌ緩衝液１０　ｕ（１，Ｐｖ
ｕｌｌ制限酵素２μＱ（〜２０単位）、および水８８μ
Ｑと混合し、得られた反応液を３７℃で２時間インキュ
ベートした。フェノールおよびクロロホルム抽出によっ
て反応を止め、次いでこのＰｖｕｌｌ消化したプラスミ
ドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ　ＤＮＡを沈澱させ、遠心して集
めた。
以下の方法により、ＢａｍＨＩリンカ−（５°−ＣＧＧ
ＡＴＣＣＣＧ−３’）をキナーゼ処理しライゲーション
用に調製した。水５μσ中のリンカ−１μ９に、５×キ
ナーゼ塩［３００ｍＭ）リス−ＨＣｌ２（ｐＨ＝７．８
）、５０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２ｔ、および２５＋＋＋Ｍ　
　Ｄ　Ｔ　ＴコＩ　　ＯｕＱ、　　５ｍＭ　　ＡＴＰ　
　５　μｅ、　　ｌｘｇ／１Ｑ、ＢＳＡ　　５μ（、ｌ
　０ｍＭスペルミジン５μρ、水１９μＱ１および１０
単位／μＱポリヌクレオチドキナーゼｌμＱを加えた。
次いでこの反応液を３７℃で６０分間インキュベートし
、−２０℃で保存した。ｐｖｕｌｌ消化したプラスミド
ｐＳＶ２−ｄｈｒｒ５μＱ（〜５μｇ）およびキナーゼ
処理したＢａｍ１−［リンカ−！　２　ｉ（〜、　２５
　ｔｔＱ）を混合し、水ｌｌμ＆、１０Ｘ　　リガーゼ
緩衝液２μＱおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ１μｍ２（〜１
０００単位）とともに１６℃で一部インキユベートした
。
このライゲーション反応混合物に、１０Ｘ１０ＸＢａ反
応緩衝液１０　μ（１，ＢａｍＨＩ制限酵素１０μＱ（
〜５０単位）、および水４８μａを加え、次いでこの溶
液を３７℃で３時間インキュベートした。
この反応液を１％アガロースゲルにかけ、ｄｈｆｒ遺伝
子を含有する目的の〜ｌ　、　９　ｋｂフラグメントを
ゲルから単離した。これらの実施例で行なったリンカ−
付加のすべては、常法によりアガロースゲルで精製して
最終ベクターにおける多重リンカ−配列の可能性を減少
させた。得られたフラグメント〜３μ９をＴＥ緩衝新液
０μｇに悲劇した。
次に、プラスミドｐＴＰＡ３０１約１５μ（！（〜ｌμ
９）を、上記のようにしてＢａｍＨＩ制限酵素で消化し
た。プラスミドｐＴＰＡ３０１にはＢａｍＨ１部位かＩ
っしか存在しないので、このＢａｍＨＩ消化により直線
状のプラスミドｐＴＰＡ３０１　　ＤＮＡが生成する。
このＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＴＰＡ３０１をエ
タノールで沈澱させ、水９４μｇに再懸濁し、ウシ腸ア
ルカリホスファターゼ［コラボレーティブ・リサーチ社
（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔ　ｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
Ｉｎｃ、、１２８　Ｓｐｒｉｎｇ　５ｔｒｅｅｔ、Ｌｅ
ｘｉｎｇｔｏｎ。
ＭＡ　０２１７３）］　１　μｆ２および１Ｍトリス−
ＨＣ（ｌＣｐＨ＝９．０）５μｇを用いて６５℃で４５
分間ホスファターゼ処理した。このＤＮＡをフェノール
：クロロホルムで抽出し、次いでクロロホルム：イソア
ミルアルコールで抽出し、エタノール沈澱し、水２０μ
ｇに再懸濁した。ホスファターゼ処理したプラスミドｐ
ＴＰＡ３０１（１０μ１２：〜０．２５μｇ）を、Ｂａ
ｍＨＩ　　５　ｕ（１，ｄｈｆｒ遺伝子を含有する制限
フラグメント（〜１．５μ９）、１０ｘ　　リガーゼ緩
衝液３μＲ，Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ３　μ（２（〜１
５００単位）、および水９μＱに加えた。このライゲー
ション反応液を１５℃で一部インキユベートした。
このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミド１）ＴＰＡ
３０３　　ＤＮＡからなっていた。
プラスミドｐＴＰＡ３０３を用いてＥ、コリＫ１２　　
ＲＲＩ（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５２１０）を形質転換し、得
られたＥ、コリＫ　ｌ　２　　ＲＲ１／ｐＴＰＡ３０３
形質転換体を、そのアンピシリン耐性の表現型およびそ
のプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。
実質的に実施例３の方法に従って、プラスミドｐＴＰＡ
３０３を形質転換体から単離した。
ｐＢＲ３２２レプリコンおよびプラスミドｐＴＰＡ３０
１山来のβ−ラクタマーゼ遺伝子をコードしている〜２
　、７　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−８ｇｌｌｌ制限フラグメ
ントを単離するため、プラスミドｐＴＰＡ３０１約１０
μ９を、全反応液容量４００μρ中、３７℃で、ＩＸ　
８ｇｌｌｌ緩衝液中のＢｇｌ！Ｉ制限酵素２０単位で完
全に消化した。このＢｇｌｌ＋消化の後、トリス−０Ｃ
Ｒ濃度を１１０ｍＭに調整し、Ｂｇｌｌ＋消化したＤＮ
ＡにＥｃｏＲｒ制限酵素２０単位を加えた。〜２　、７
　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−８ｇｌｌｌ制限フラグメントが
他の消化産物から分離するまで、このＥｃ。
ＲＩ　−Ｂｇｌｌｌ消化したＤＮＡをアガロースゲル電
気泳動にかけ、次いで〜２　、７　ｋｂフラグメントを
単離し、ライゲーション用に調製した。
ｄｈｆｒ遺伝子を含有する制限フラグメントを単離する
ため、プラスミドｐＴＰＡ３０３をＨｉｎｄｌｌｌおよ
びＥｃｏＲＩ制限酵素で２重に消化し、ｄｈｆｒ遺伝子
を含有する〜２３４０　ｂｐ　ＥｃｏＲ１−Ｉ−（１ｎ
ｄｌ１１制限フラグメントを単離し、回収した。
ＴＰＡのカルボキシ末端コード化領域およびＳＶ４０プ
ロモーターを含有するプラスミドｐＴＰＡ３０３の〜２
　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ　−Ｓ　ｓｔ　Ｉ制限フラグメ
ントを単離するため、プラスミドｐＴＰＡ３０３を、Ｉ
　Ｘ　ｌ−１ｉｎｄｌｌｌ緩衝液中、Ｈｉｎｄｌｌｌお
よび５ｓｔＴ制限酵素で２重に消化した。〜１．７ｋｂ
フラグメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調
製した。
改良型Ｔ　Ｐ　Ａのアミノ末端コード化領域を含有する
プラスミドＩＩ）ＢＷ２８の〜６８０ｂｐ　Ｘｈｏｌｌ
（ライゲーションに対しては３ｇ１１１重なり部分と適
合しうる）−９ｓｔｒ制限フラグメントを単離するため
、プラスミドｐＢＷ２８約１０μ９を、ＩＸＸｈｏ１１
１衝液［０，１Ｍ　　トリス−Ｈ’ＣＣ（ｐｌ−ｒ＝８
．０）、０　、　ｌ　Ｍ　ＭｇＣＱｘ、０．１％トリト
ンＸ−１００、および］　ｎ／ｍ（ｌ　Ｂ　Ｓ　ＡＥ中
、Ｘｈｏｌｌ酵素で完全に消化した。このＸｈｏｌｌ消
化したＤＮＡをエタノール沈澱で回収し、次いで５ｓｔ
Ｉ酵素で完全に消化した。このＸｈｏｌｌ−Ｓｓｔｌ消
化したＤＮＡをアクリルアミドゲルにかけ、目的のフラ
グメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製し
た。
上記のフラグメント、すなわちプラスミドｐＴＰＡ３０
１の〜２　、７　ｋｂ　ＥｃｏＲｒ　−８ｇｌｌｌ制限
フラグメント、プラスミドｐＴＰＡ３０３の〜２．３４
　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグメン
ト、プラスミドｐＴＰＡ３０３の〜Ｉ　、７ｋｂ　５ｓ
ｔＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグメント、およびプラ
スミドｐＢＷ２８の〜０．６８ｋｂ　５ｓｔｌ　−Ｘｈ
ｏｌｌ制限フラグメントそれぞれ約０．１Ｍｇをいっし
ょにしてライゲートし、プラスミドｐＢＷ３２を得た。
このライゲーション混合物を用い、５０ｍＭ　ＣａＣＬ
を用いること以外は実施例２の教示のようにして、Ｅ。
コリＫＩ２ＭＭ２９４を形質転換した。形質転換体をそ
のアンピシリン耐性の表現型およびそのプラスミドＤＮ
Ａの制限分析によって同定した。
実質的に実施例３の方法に従って、Ｅ、コリＫ１２　Ｍ
Ｍ２９４／ｐＢＷ３２形質転換体からプラスミドｐＢＷ
３２　　ＤＮＡを得た。このプラスミドｐＢＷ３２の制
限部位および機能地図を添付の第１４図に示す。
実施例Ｉ！　プラスミドｐＬＰｃｈｄ１、ｐＬＰＣｈｄ
２、ｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ　ＩおよびｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈ
ｆｒ２の構築Ａ、プラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬ
ＰＣｈｄ２の橡策 ＴＥ緩衝液２０μρ中のプラスミドｐＢＷ３２約２０μ
９を、１０ＸＢ１０ＸＢａ衝液１０μ（！お上液１０μ
μｇに加えた。このプラスミドｐＢＷ３２ＤＮＡの溶液
に、制限酵素１３ａｍＨＩ約１０μ１２（〜５０単位）
を加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベー
トした。このＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＢＷ３２
　　ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、１
０Ｘ　　フレノウ緩衝液５μｇ、水４５μＱおよびフレ
ノウ酵素２μＱ（〜１００単位）に再懸濁した。この反
応液を１６℃で３０分間インキュベートし、次いで消化
産物が明確に分離するまでこの反応混合物をアガロース
ゲル電気泳動にかけた。実質的に実施例４Ａの方法に従
って、ｄｈｆｒ遺伝子を含有する、プラスミドｐ１３Ｗ
３２の〜１．９ｋｂクレノウ処理化ＢａｍＨＩ制限フラ
グメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製し
た。目的のフラグメントが約４μ９得られ、これをＴＥ
Ｉ衝液新液Ｑに懸濁した。
ＴＥ緩衝液１００μσ中のプラスミドｐ１、ｐｃｈｙｇ
１約２００μ９を、１ｏｘＥｃｏＲ［Ｊ新液１５μｇお
よび水３０μりに加えた。このプラスミドｐＬＰＣｈｙ
ｇｌ　　ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＥｃｏＲＩ約５μＱ
（〜５０単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで１
０分間インキュベートした。この短い反応時間は、部分
的なＥｃｏＲＩ消化物が得られるように算出したもので
ある。プラスミドｐＬＰＣｈｙｇｌはＥｃｏＲＩ制限部
位を２箇所有しており、そのうちの１箇所は、ハイグロ
マイソン耐性付与（ＨｍＲ）遺伝子のコード化配列内に
存在している。この）ＴｍＲ遺伝子内ではないプラスミ
ドｐＬＰＣｈｙｇｌのＥｃｏＲ１部位に、ｄｈｆｒ遺伝
子を含有している制限フラグメントを挿入することが望
ましい。１箇所だけ切断したプラスミドｐＬＰｃｈｙｇ
ｌ　　ＤＮＡが未切断プラスミドＤＮＡおよびその他の
消化産物から分離するまで、この部分的にＥｃｏＲＩ消
化したプラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌ　　ＤＮＡをアガロ
ースゲル電気泳動にかけた。実質的に実施例４Ａの方法
に従って、この１箇所だけ切断したＤＮＡをゲルから単
離し、ライゲーション用に調製した。
１箇所だけＥｃｏＲＩ切断したプラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃ
ｈｙｇｌが約２μ９得られ、これをＴＥ緩衝液２５μり
に懸濁した。この試料に、フレノウ酵素的５μＱ（〜２
５単位）、１０×　フレノウ緩衝液５μａ１および水４
０μＱを加え、得られた反応液を１６℃で６０分間イン
キュベートした。このフレノウ処理し、部分的にＥｃｏ
ＲＩ消化したＤＮＡを、フェノールで２回、次いでクロ
ロホルムで１回抽出し、エタノールで沈澱させ、ＴＩＪ
衝液新液μＱに再懸濁した。
プラスミドｐＢＷ３２の〜１．９ｋｂのフレノウ処理し
たＢａｍＨＩ制限フラグメント約５μａ１および１箇所
だけＥｃｏＲＩ切断したプラスミドｐＬＰＣｈｙｇｌ　
　ＤＮＡ約５μＱをいっしょにして混合し、このＤＮＡ
混合物に、１０ｘリガーゼ緩衝液ＩμＱ１水５μＱ、Ｔ
４　　ＤＮＡリガーゼ！μ（２（〜５００単位）、およ
びＴ４　　ＲＮＡリガーゼ！μｇ（〜２単位）を加え、
得られた反応液を１６℃で一部インキユベートした。こ
のライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐＬＰｃｈｄ
ｌおよびｐＬＰＣｈｄ２（これらは、ｄｈｆｒ遺伝子を
含有している〜１．９ｋｂフラグメントの配向だけが異
なっている）からなっていた。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２の方
法に従って、形質転換用にコンピテントにしておいたＥ
、コリに１２１（Ｂ１０Ｉ細胞を形質転換した。形質転
換細胞を１０Ｏμ９／７ａアンピシリン含有のＬ−寒天
で平板培養し、アンピシリン耐性の形質転換体をプラス
ミドＤＮＡの制限酵素分析によって分析して、Ｅ、コリ
に１２ＨＢ１０１／ｐＬＩ’ｃｈｄｌおよびＥ、コリに
１２１−Ｉｎ１０１　／ｐＬ　Ｐ　Ｃｈｄ２形質転換体
を同定した。プラスミドｐＬＰｃｈｄｌの制限部位およ
び機能地図を添付の第１５図に示す。プラスミドｐＬＰ
ＣｈｄｌおよびプラスミドｐＬＰＣｈｄ２　　ＤＮＡを
、実質的に実施例３の方法に従って、適切な形質転換体
から単離した。
プラスミドｐＬＰＣｈｄ３およびｐＬＰＣｈｄ４は、そ
の構造がプラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ
２に類似している。プラスミドｐＬＰＣｈｙｇｌのかわ
りにプラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ２を出発原料として
用いること以外は、実質的にプラスミドｐＬＰＣｈｄｌ
およびｐＬＰＣｈｄ２の構築に用いた方法に従って、プ
ラスミドｐＬＰＣｈｄ３およびｐｔ、ｐｃｈｄ４を構築
する。
Ｂ、プラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ　ｌおよびｐＬ　
Ｐ　Ｃｄｈｆｒ２の構築 ＴＥ緩衝液１００μｅ中のプラスミドｐＢＷ３２約ｔｏ
ｏ７Ｂを、１０Ｘ１０ＸＢａ緩衝液１５μ１２および水
２５μｇに加えた。このプラスミドｐＢＷ３２ＤＮＡの
溶液に、制限酵素ＢａｍＨＩ約１０μＱ（〜２５単位）
を加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベー
トした。このＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＢＷ３２
　　ＤＮＡを、実質的に実施例１１Ａの方法に従って、
フレノウで処理した。この平滑末端にしたフラグメント
をエタノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝液１０μｇに再懸濁
し、次いでジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含有する〜１
　、９　ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントがその他の
消化産物から分離するまで、アガロースゲル電気泳動に
かけた。次いで、実質的に実施例４Ａの方法に従って、
この〜ｌ　、　９　ｋｂ制限フラグメントをゲルから単
離し、ライゲーション用に調製した。目的のフラグメン
トが約１０μ９得られ、これをＴＥ緩衝液５０μｇにｇ
ｌ！、濁した。
Ｎｄｅｌ−ＳＬｕｌ消化したプラスミドｐＬＰＣＤＮＡ
（実施例９で調製した）約５μａを、フレノウ処理した
、プラスミドｐＢＷ３２の〜１．９ｋｂＢａｍＨ！制限
フラグメント５μ＆、ｆｏｘリガーゼ緩衝液新液５μｆ
ｆ、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ１μＣ（〜１０００単位）
、Ｔ４　　ＲＮＡリガーゼ１ｔ１０．（〜２単位）、お
よび水１．５μρに加えた。得られたライゲーション反
応液を１６℃で一部インキユベートした。このライゲー
ト化ＤＮＡは目的のプラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ　
１およびｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ２　（これらは、ｄｈｒ
ｒ遺伝子を含有している〜Ｉ　、　９　ｋｂフラグメン
トの配向だけが異なっている）からなっていた。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２の方
法に従って、Ｅ、コリに１２　　ＨＢ１０Ｉを形質転換
した。形質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平
板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってア
ンピシリン耐性のＥ、コリＫ　ｌ　２　　ＨＢ　１０１
／ｐＬＰｃｄｈｆｒｌおよびＥ、コリＫ　Ｉ　２　ＨＢ
　Ｉ　０１　／ｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｒｒ２形質転換体を同
定した。
実施例１２　プラスミドｐｈｄの構築 プラスミドｐｈｄを構築するためには、アデニンメチラ
ーゼ（たとえばこれをｄａｍ遺伝子がコードしており、
その遺伝子産物は配列：５’−ＧＡＴＣ−３°中のアデ
ニン残基をメチル化する）を欠＜Ｅ。
コリ宿主細胞から、プラスミドｐＬＰＣｈｄｌ　　ＤＮ
Ａ（これをプラスミドｐｈｄ構築の出発原料として用い
る）を調製することが必要であった。Ｅ、コリに１２　
０Ｍ４８（ＮＲＲＬ　Ｂ　−１５７２５）は機能的なｄ
ａｍメチラーゼを欠いており、従って、プラスミドｐｈ
ｄ構築の出発原料として用いろプラスミドｐＬＰｃｈｄ
ｌ　　ＤＮＡを調製する目的で使用するのに適した宿主
である。
実質的に実施例２の方法に従って、Ｅ、コリに１２ＧＭ
４８細胞を培養し、形質転換用にコンピテントにし、プ
ラスミドｐｉ、　Ｐ　Ｃｈｙｇ　Ｉを用いてこのＥ、コ
リＫ１２ＧＭ４８細胞を形質転換した。
実質的に実施例３の方法に従って、この形質転換細胞を
アンピンリン含有のし寒天にプレートし、アンピシリン
耐性のＥ、コリＫ　１２　　Ｇ！、４４８／ｐＬＩ’Ｃ
ｈｄｌ形質転換体がコロニーを形成したら、そのコロニ
ーの１つを用いてプラスミドｐｉ、ｐｃｈｄｉ　　ＤＮ
Ａを調製した。約１ｍｇのプラスミドｐｔ。
ＰＣｈｄｌ　　ＤＮＡが得られ、これをＴＥ緩衝新液ｌ
皮ａに懸濁した。
ＴＥ緩衝液２μρ中のプラスミドｐＬＰｃｈｄｌＤＮＡ
約２μ９を、ｌ０ｘＢｃｌｌｌ衝液［７５０ｍＭＫＣｌ
２．６０ｍＭ）リス−ＨＣＣ（ｐＨ＝７．４）、１００
　ｍＭ　ＭｇＣＱｘ、１０ｍＭＤＴＴ、およびＩＩｇ／
λ＆ＢＳＡ］２μＱおよび水１４μσに加えた。
このプラスミドｐＬＰｃｈｄｌ　　ＤＮＡの溶液に、制
限酵素Ｂｅ１ｌ約２μ（（〜１０単位）を加え、得られ
た反応液を５０℃で２時間インキュベートした。
この混合物をフェノールで１回、クロロホルムで２回抽
出することによって反応を止めた。
Ｂｃｌ　Ｉ消化したプラスミドｐＬＰｃｈｄｌ　　ＤＮ
Ａ約１８ｇを、１０×リガ一ゼ緩衝液１μｇ、水８μａ
１およびＴ４ＤＮＡＩＪガーゼｌμＱ（〜５００単位）
に加えた。このライゲーション反応液を１６℃で一部イ
ンキユベートした。このライゲート化ＤＮＡは目的のプ
ラスミドｐｈｄからなっていた。
プラスミドｐｈｄは、プラスミドｐＬＦｃｈｄｌから全
大きさが約１．４５ｋｂの２個の近接Ｂａ１ｌ制限フラ
グメントおよびプラスミドｐＬＰｃａｔ構築の際に結合
した余分のＢｃｌＩリンカ−を削除することによって得
られる。プラスミドｐｈｄの制限部位および機能地図を
添付の第１６図に示す。発現させようとするＤＮＡを、
プラスミドｐｈｄの唯一のＢｃｌ■部位に、発現のため
の正しい位置で、容易に挿入することができるので、プ
ラスミドｐｈｄは、本発明のＢＫウィルスエンハンサー
ーアデノウィルス後期プロモーターからのすべてのＤＮ
Ａ配列の発現を容易にする。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２の方
法に従って、Ｅ、コリＫＩ２ＧＭ４８を形質転換した。
形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養
し、プラスミドＤ　Ｎ　Ａの制限酵素分析によってアン
ピシリン耐性のＥ、コリＫ　１２　０Ｍ４８／ｐｈｄ形
質転換体を同定した。
プラスミドｐＬＰｃｈｄｌの代わりにプラスミドｐＬＰ
Ｃｈｄ２、ＰＬＰＣｈｄ３またはｐＬＰＣｈｄ４のいず
れかを出発原料として用い、実質的に上記のプラスミド
ｐｈｄ構築法に従って、プラスミドｐｈｄに類似するプ
ラスミドを構築することができる。これらの類似プラス
ミドは、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子および／また
はｄｈｆｒ遺伝子の配向だけがプラスミドｐｈｄと異な
っている。
実施例１３　プラスミドｐＬＰＣＥ１Ａの構築アデノウ
ィルス２　ＤＮＡのＥ１Ａ遺伝子を単離するため、アデ
ノウィルス２　　ＤＮＡ（ＢＲＬから人手）約２０μり
を、１０ＸＢａｌｌ緩衝液１１００ｍＭ）リス−〇Ｃｌ
２（ｐＨ＝７．６）、１２０ａ＋ＭＭｇＣ（ｂｌ　１０
０ｍＭ　２−メルカプトエタノール、および１Ｍ９／Ｒ
（ｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ］　ｌ　Ｏｕ（ｌおよび水８０μａに
溶解した。このアデノウィルス２　　ＤＮＡの溶液に、
制限酵素Ｂａ１Ｉ約１０μり（約２０単位）を加え、得
られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。Ｅ
１Ａ遺伝子を含有する〜１　、８　ｋｂ制限フラグメン
トがその他の消化産物から分離するまで、このＢａ１ｌ
消化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけた。実
質的に実施例４Ａの方法に従って、この〜Ｉ　、　８　
ｋｂフラグメントをゲルから単離し、ライゲーション用
に調製した。目的のフラグメントが約３μり得られ、こ
れをＴＥ緩衝液２０μ（＋、：懸濁した。
ＴＥＡ衝液新液ρ中のプラスミドｐｒ、ｐｃ約５μ９を
、＋ｏｘｓｔｕＢｌ衝液２μＱおよ新液１１μ（に加え
た。このプラスミドｐｔ、ｐｃの溶液に、制限酵素５ｔ
ｕＩ約２μＱ（〜１０単位）を加え、得られた反応液を
３７℃で２時間インキュベートした。
この５ｔｕｒ消化したプラスミドｐＬＰＣＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ、１０ＸＮｄｅｌ緩衝液２μｇおよび
水１６μＱに再懸濁した。この５ｔｕＩ消化したプラス
ミドｐｔ、ｐｃ　ＤＮＡの溶液に制限酵素Ｎｄｅｌ約２
μＱ（〜１０単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃ
で２時間インキュベートした。
このＮｄｅｌ−８ｔｕＩ消化したプラスミドｐＬＰＣＤ
ＮＡをエタノールで沈澱させ、ｔＯＸ　　フレノウ緩衝
液５μＱおよび水４２μＱに再懸濁した。
このＤＮＡ溶液にフレノウ酵素的３μσ（〜６単位）を
加え、得られた反応液を３７℃で３０分間インキュベー
トした。〜５．８２ｋｂの、フレノウ処理したＮｄｅｌ
−Ｓｔｕｌ制限フラグメントかその他の反応生成物から
明確に分離するまで、この反応、昆合物をアガロースゲ
ル電気泳動にかけた。実質的に実施例４Ａの方法に従っ
て、このフラグメントをゲルから単離し、ライゲーショ
ン用に調製した。
プラスミドｐＬＰＣの、〜５．８２ｋｂの、フレノウ処
理したＮｄｅｌ　　５ｔｕＩ制限フラグメントが約２μ
９得られ、ＴＥ緩衝液２５μＱ　ｉ：　＠濁した。
Ｅ１Ａ遺伝子をコードしているアデノウィルス２の〜Ｉ
　、８ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメント約９μａ１お
よびプラスミドｐＬＰＣの〜５．８２ｋｂクレノウ処理
化ＮｄｅＩ−ＳｔｕＩ制限フラグメント３μＣを、１０
×リガーゼ緩衝液２μＱおよび水・１μｇに加えた。こ
のＤＮＡ溶液に、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ約ｌμＱ、（
〜５００単位）およびＴ４　　ＲＮＡリガーゼｌμａ（
〜２単位）を加え、得られた反応液を１６℃で一部イン
キユベートした。
このライゲート化ＤＮＡは目１勺のプラスミドｐＬＰＣ
Ｅ１ＡおよびｐＬＰＣＥ１Ａｌからなっていた（これら
は、Ｅ１Ａ遺伝子の配向が異なり、またおそらくは、Ｂ
Ｋエンハンサ−がプラスミド上のＥ１Ａ遺伝子に対して
有している発現促進効果が異なる）。プラスミドｐＬＰ
ＣＥ１ＡＩよりプラスミドｐＬＰＣＥ１Ａのほうが、Ｂ
Ｋエンハンサ−により近接してＥ１Ａプロモーターが位
置しているので、プラスミドｐＬＰＣＥ１ＡＩを用いる
よりプラスミドｐＬＰＣＥ１Ａを用いるときのほうがＥ
１Ａ発現が高くなるであろう。プラスミドｐＬＰＣＥ１
Ａの制限部位および機能地図を添付の第１７図に示す。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２の方
法に従って、Ｅ、コリＫＩ２ＨＩ３１０１を形質転換し
た。形質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平板
培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってアン
ピシリン耐性形質転換体をスクリーニングして、Ｅ、コ
リＫ１２ＨＩ３１０１／１）ＬＰＣＥ１ＡおよびＥ、コ
リＫＩ２ＨＢ１０１／ｐＬＰＣＥ１Ａ１形質転換体を同
定した。
後の実験にもちいるため、実質的に実施例３の方法に従
って、形質転換体からプラスミドＤＮＡを得た。
実施例Ｉ４　プラスミドＩ）ＢＬＴの構築ＴＥ緩衝新液
μρ中のプラスミドｐＢＷ３２ＤＮＡ（第１４図、実施
例１０）約１μ９を、１０ＸＢａｍＨＩ緩衝液２μＣお
よび水１５μｅに加えた。
このプラスミドｐＢＷ３２　　ＤＮＡの溶液に、制限酵
素ＢａｍＨＩ約２μσ（〜１０単位）を加え、得られた
反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
この反応混合物を始めにフェノールで、次いでクロロホ
ルムで２回抽出することによって反応を止めた。このＢ
ａｍＨＩ消化したプラスミドｐＢＷ３２　　ＤＮＡ約Ｉ
μＱを、１０×リガーゼ緩衝液１μＱおよび水８μぐに
加え、このＤＮＡ溶液にＴ４ＤＮＡリガーゼ約ｌμＱ（
〜５００単位）を加えた後、得られた反応液を１６°Ｃ
で一部インキユベートした。
このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐＢＷ３２
ｄｅｌからなっていた（このプラスミドは大きさが約５
　、６　ｋｂであり、Ｈｉｎｄｌｌｌ制限部位を１−）
だけ含有している）。このライケート化Ｄ　Ｎ　Ａを用
い、実質的に実施例２の方法に従って、Ｅ、コリＫＩ２
　　ＨＢ１０Ｉを形質転換した。目的のＥ。
コリＫ　１２　１−（Ｂ　Ｉ　０１　／ｐＢＷ３２ｄｅ
ｌ形質転換体を、そのアンピシリン耐性の表現型および
そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した
。後の構築にもちいろため、実質的に実施例３の方法に
従って、形質転換体からプラスミドｐ３Ｗ３２ｄｅｌ　
ＤＮＡを得た。
ＴＥ緩衝新液μａ中のプラスミドｐＢ　Ｗ　３２　ｄｅ
ｌ約１μｙを、Ｉ　Ｏｘ　ｒＩｉｎｄｌ［［ｍ新液２μ
σおよび水１５μρに加えた。このプラスミドｐｒ３Ｗ
３２ｄｅｌ　ＤＮＡの溶液に、制限酵素１１ｉｎｄｌｌ
ｌ約２μＱ（〜１０単位）を加え、得られた反応液を３
７℃で２時間インキュベートした。実質的に実施例２記
載の方法に従って、この試料をＴＥ緩衝液で１００μＱ
に希釈し、ラン揚アルカリポスファターゼで処理した。
この反応液をフェノールで２回、次いでクロロホルムで
１回抽出した。次いで、このＨｉｎｄｌｌ！消化したプ
ラスミドｐＢＷ３２ｄｅｌ　ＤＮＡをエタノールで沈澱
させ、水１０ｔｌジに再Ｊ！濁した。
実質的に実施例５の方法に従って、プラスミドｐ［３ａ
ｔ　８　ｃａｔ（実施例！７）を制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ
ｌで消化し、改良型ＢＫエンハンサーーアデノウィルス
２後期プロモーターカセットを含有する〜０６５ｋｂ　
ｌ１ｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントを単離し、これをラ
イゲーション用に調製した。ＴＥＩ衝液新液Ｑ中のプラ
スミドｐＢ　ａｔ　８　ｃａｔの〜０，６５ｋｂ　Ｈｉ
ｎｄＩＩ＋制限フラグメント約０．１４９を、）ｌｉｎ
ｄｌｌｌ消化したプラスミドｐＢ　’ｖＶ　３２　ｄｅ
ｌの溶液３μりに加えた。このＤＮＡ混合物に、Ｔ４　
　ＤＮＡリガーゼ約ｌμρ（〜５００単位）および１０
Ｘリガーゼ緩衝液１μＱを加え、得られた反応液を１６
℃で一部インキユベートした。
このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐＢＬＴか
らなっていた。プラスミドｐＢＬＴの制限部位および機
能地図を添付の第１８図に示す。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２の方
法に従って、Ｅ、コリＫ１２ＨＢ１０１を形質転換した
。形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培
養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピ
シリン耐性のＥ、コリＫ　１２　　ＨＢ　Ｉ　ＯＩ／ｐ
ＢＬＴ形質転換体を同定した。〜０　、６５　ｋｂ　Ｈ
１ｎｄｌｌｌ制限フラグメントは、２つの配向（そのう
ちの１つだけがプラスミドｐＩ３ＬＴを与える）のうち
のどちらででもＨｉｎｄｌｌ！消化したプラスミドｐＢ
　Ｗ　３２　ｄｅｌに挿入することができるので、この
〜０　、６５　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグメント
の配向を決定してＥ、コリに１２ＨＢＩ０１／ｐＢＬＴ
形質転換体を同定した。後の構築にらちいるため、実質
的に実施例３の方法に従って、形質転換体からプラスミ
ドｐＢＬＴ　ＤＮＡを調製した。
実施例１５　プラスミドｐＢＬＴ５、ｐＬＰＣｈｙｇ１
、ｐＢＬＴｈｙｇ　２、ｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ　Ｉ　、
およびｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ２の構築 Ａ、プラスミドｐＢ　Ｌ　Ｔ　ｈｙｇ　１およｉ／ｐＢ
　Ｌ　Ｔ　ｈｙｇ　２の構築 ＴＥ援衝新液μρ中のプラスミドｐＢＬＴＤＮＡ約４μ
２を、１０ＸＢａｍｌｏＸＢａを新液２ｕＱおよび水１
２μＱに加えた。このプラスミドｐＢＬＴＤＮＡの溶液
に、制限酵素ＢａｍＨ［約２μａ（〜■０単位）を加え
、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした
。この反応混合物を始めにフェノールで、次いでクロロ
ホルムで抽出することによって反応を止めた。次いて、
このＢａｍｄ−１１消化したプラスミドｐＢＬＴ　ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝液２μＱに再懸濁
した。
ＴＥ緩衝液１０μ（中のプラスミドｐＳＶ２ｈｙｇ約１
０μｇを、Ｉ　ＯＸ　Ｂａｍ１４　Ｉ　緩衝液１０μｇ
および水７５μりに加えた。このプラスミドｐＳＶ２ｈ
ｙｇＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｂａｎ）（ｒ約５μＱ（
〜２５単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時
間インキュベートした。このＢａｍＨ［消化したプラス
ミドｐＳＶ２ｈｙｇＤＮＡをエタノールで沈澱させ、Ｔ
Ｅ緩衝新液ＯμＱに再懸濁し、ハイグロマイシン耐性付
与遺伝子を含有する〜２　、５　ｉ、ｂＢａｍＨＩ制限
フラグメントがその他の消（１ｊ産物から分離するまで
、アガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的に
実施例４Ａの方法に従って、この〜２　、５　ｋｂ制限
フラグメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調
製した。目的のフラグメント約２μりが得られ、これを
ＴＥＩ衝液新液μＱに懸濁した。
Ｂａｍ）［消化したプラスミドｐＢＬＴＤＮＡ約２μＱ
およびプラスミドｐＳＶ２ｈｙｇの〜２　、５　ｋｂＢ
ａｍＨ［制限フラグメントｌμＱを、１０Ｘリガーゼ緩
衝液新液Ｑ、水５μｇ、およびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ
ｌμｆ２（〜５００単位）に加え、得られた反応液を１
６℃で一晩インキユベートした。このライゲート化ＤＮ
Ａは目的のプラスミドｐＢＬＴｈｙｇｌおよびｐＢＬＴ
ｈｙｇ２からなっていた。プラスミドｐＢ　Ｌ　Ｔｈｙ
ｇ　Ｉの制限部位および機能地図を添付の第１９図に示
す。プラスミドｐＢ　Ｌ　Ｔｈｙｇ　ＩとｐＢＬＴｈｙ
ｇ２は、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子をコードして
いる〜２．５ｋｂ　ＢａｍＨｒ制限フラグメントの配向
だけが異なっている。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２の方
法に従って、Ｅ、コリＫＩ２ＨＢ１０１を形質転換した
。形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培
養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピ
シリン耐性のＥ、コリＫ　Ｉ　２　１−１Ｂ　ｌ　０１
／ｐＢＬＴｈｙｇｌおよびＥ、コリＫ　Ｉ　２　　ＨＢ
　１０１／ｐＢＬＴｈｙｇ２形質転換体を同定した。
Ｂ、プラスミドｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ　ＩおよびｐＢ　
Ｌ　Ｔｄｈｆｒ２の構築 ＴＥ緩衝液１００μσ中のプラスミドｐＢＷ３２約ｔｏ
ｏ７Ｂを、ｌ０ＸＢａｎ＋ＨＩ暖衝液１５μｆ２および
水２５μｅに加えた。このプラスミドｐＢＷ３２ＤＮＡ
の溶液に、制限酵素ＢａｍＨｒ約１０μＱ（〜５０単位
）を加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベ
ートした。このＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＢＷ３
２　　ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝新液Ｏ
μａに再懸詞し、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含有す
る〜１　、９　ｋｂＢａｍＨＩ制限フラグメントがその
他の消化産物から分離するまで、アガロースゲル電気泳
動にかけた。次いで、実質的に実施例４Ａの方法に従っ
て、この〜１　、９　ｋｂ制限フラグメントをゲルから
単離し、ライゲーション用に調製した。目的のフラグメ
ント約ｌθμ９が得られ、これをＴＥ緩衝液５０μＱに
懸濁した。
実施例１５Ａで調製したＢａｍＨＩ消化のプラスミドｐ
ＢＬＴ　　ＤＮＡ約２μＱおよびプラスミド１）ＢＷ３
２の〜１　、９　ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントｌ
μＱを、ｔＯＸリガーゼ緩衝液１μｅ、水５μＱ、およ
びＴ４ＤＮＡリガーゼｌμり（〜５００単位）に加え、
得られた反応液を１６℃で一晩インキユベートした。こ
のライゲート化Ｄ　Ｎ　Ａは目的のプラスミドｐＢ　Ｌ
　Ｔｄｈｒｒ　ｌおよびｐＢ　Ｌ　Ｔ　ｄｈｒｒ　２か
らなっていた。プラスミドｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ　＋の
制限部位および機能地図を添付の第２０図に示す。プラ
スミドｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ　１とｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆ
ｒ２は、ｄｈｆｒ遺伝子をコードしている〜Ｉ　、　９
　ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントの配向だけが異な
っている。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２の方
法に従って、Ｅ、コリＫＩ２１１８１０Ｉを形質転換し
た。形質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平板
培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってアン
ピシリン耐性のＥ、コリＫ　１２　　ＨＢ　Ｉ　０１／
ｐＢＬＴｄｈｒｒｌおよびＥ。
コリＫ　１２　　ＨＢ　１０１／ｐＢＬＴｄｈｆｒ２形
質転換体を同定した。
実施例Ｉ６　プラスミドｐｈｄＴ　Ｐ　Ａおよびｐｈｄ
ＭＴＰＡの構築 Ａ、中間体プラスミドｐＴＰＡ６０２の構築ガラス蒸留
水４５μσ中のプラスミドｐＴＰＡ１０３（実施例１Ｏ
１第１４図）約５０μｑを、１０ｘＥｃｏＲＩ緩衝液３
０μρおよび水２２５μＱに加えた。このプラスミドｐ
ＴＰＡ１０３　　ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＥｃｏＲＩ
約１０μＱ（〜８０単位）を加え、得られた反応液を３
７℃で９０分間インキュベートした。このＩｉ：ｃｏＲ
Ｉ消化したプラスミドｐＴＰＡ　１０３　　ＤＮＡをエ
タノールで沈澱さけ、ｌ×　ローディング緩衝液（１０
％グリセリンおよび０．０２％ブロモフェノールブルー
）５０μＱに再懸局し、〜１．ＩｋｂＥｃｏＲＩ制限フ
ラグメントがその他の反応生成物から分離するまで、ア
ガロースゲル電気泳動にかけた。フラグメントを透析袋
に電気泳動させることによって、ＴＰＡのアミノ末端を
コードしているＤＮＡを含有する〜１゜１　ｋｂ　Ｅｃ
ｏＲＩ制限フラグメントをゲルから単離した。次いで、
このフラグメントをエタノールで沈澱させ、水１６０μ
Ｑに再懸濁した。
１０ＸＨｇａｌ緩衝液［０，５Ｍ　ＮａＣＱ、６０ｎＭ
　トリス−ＨＣｌ２（ｐＨ＝７．４）、および０．１Ｍ
Ｍ　ｇ　ＣＱ　２］約４０μ（、ガラス蒸留水２００７
ｚｆ２．および制限酵素Ｈｇａｌ　　２０μ１２（約１
０単位）を、〜１　、　ｌｋｂ　ＢｃｏＲＩ制限フラグ
メントの溶液に加え、得られた反応液を３７℃で４時間
インキュベートした。このＩ−１ｇａｌ消化したＤＮＡ
をエタノールで沈澱させ、次いで５％アクリルアミドゲ
ルで電気泳動し、ＴＰＡのアミノ末端をコードしている
〜５２０ｂｐ制限フラグメントをＤＥ８１紙に単離し、
回収した。〜５２０ｂｐ　）Ｉｇａｌフラグメント約５
μ９が得られ、これを水５０μσに＠濁した。
１０×　フレノウ緩衝液［０，５Ｎ’　　トリス−ＨＣ
ｌ２（ｐＨ＝７．４）、および０．１〜ｆ　ＭｇＣり、
コ約１２゜５μＱ、　４種類のデオキシヌクレオチド三
リン酸それぞれが６．２５ｍ〜！である溶液２ｕＱ、０
．２ＭＤＴＴ　　２μ（，７ｔｔ９／ＩＩＱ　ＢＳＡ　
　ＩＪｉｆ２、ガラス蒸留水５７．５μＱ１およびフレ
ノウ酵素［ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル
ズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、７９４１　Ｃａｓｔｌｅｗａｙ　
Ｄｒ、、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　５（Ｈ１１６，Ｉｎｄｉａｎ
ａｐｏｌｉｓ、ＩＮ　４６２５０）］　２　ｕＱ（〜１
０単位）を、〜５２０ｂｐ　Ｈｇａｌ制限フラグメント
の溶液に加え、得られた反応液を２０℃で３０分間イン
キュベートした。このフレノウ処理したＤＮＡを７０℃
で１５分間インキュベートし、エタノールで沈澱させた
。
Ｂａｍｆ（Ｉリンカ−（５°−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧ−
３°；２本鎖であり、ニュー・イングランド・バイオラ
ブズから人手した）約５００ピコモルを、合計反応容量
２５μσ中、ポリヌクレオチドキナーゼを用いてホスホ
リル化した。この反応は、実質的に実施例６Ａ記載の方
法に従って行った。フレノウ処理した〜５２０ｂｐ　Ｈ
ｇａＩ制限フラグメントの溶液に、このキナーゼ処理し
たＢａｍＨＩリンカ−を、１０×　リガーゼ緩衝液１５
μＱ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ７μＱ（〜７バイス単位）、
および反応液容量を１５０μＱとするに十分なガラス蒸
留水とともに加えた。得られた反応液を１６℃で一部イ
ンキユベートした。
このライゲーション反応液を加熱して不活性化し、ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、１０ＸＢａｍＨＩ緩衝液５
μＱおよび水４５μＱに再懸濁した。
このＤＮＡ溶液に制限酵素ＢａｍＨＩ約ｌμＱ（〜１６
単位）を加え、得られた反応液を３７℃で９０分間イン
キュベートした。次いで、この反応混合物にＢａｍＨＩ
酵素１６単位をさらに加え、反応液を３７℃でさらに９
０分間インキュベートした。
次いで、実質的に実施例６Ａの方法に従って、反応混合
物を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｂａ
ｍＨＩ末端を有する〜５３０　ｂｐ　Ｈｇａｌ制限フラ
グメントをゲルから精製した。目的のフラグメントが約
２μ９得られ、これを水２０μりに＠濁した。
ＢａｍＨＩ消化し、脱ホスホリル化したプラスミドｐＢ
１１３２２　　ＤＮＡは、ニュー・イングランド・バイ
オラブズから入手することができる。水２μＱ中の、Ｂ
ａｍＨＩ消化し、脱ホスホリル化したプラスミドｐＢＲ
３２２約０．１μｇを、プラスミドｐＴＰＡ１０３の、
ＢａｍＨＩ末端を有する〜５３０ｂｐＨｇａＩ制限フラ
グメントＩｕＱ、水１４μｇ、およびＴ４　　ＤＮＡリ
ガーゼ１μｍ２（〜ｌバイス単位）に加え、得られた反
応液を１６℃で一部インキユベートした。このライゲー
ト化ＤＮＡは、目的のプラスミドｐＴＰＡ６０２および
プラスミドｐＴＰＡ６０１と命名したその等価物（この
プラスミドは、挿入した〜５３０ｂｐ制限フラグメント
の配向だけがプラスミドｐＴＰＡ６０２と異なる）から
なっていた。このプラスミドｐＴＰＡ６０２の制限部位
および機能地図を添付の第２１図に示す。
このライゲート化Ｄ　Ｎ　Ａを用い、５０ｍＭＣａＣＱ
、を用いること以外は実質的に実施例２の方法に従って
、Ｅ、コリに１２ＭＭ２９４を形質転換しにつ形質転換
細胞をアンピンリン含有のし一寒天で平板培養し、プラ
スミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピシリン耐性
のＥ、コリＫ１２　　ＭＭ２９４／ｐＴＰＡ６０２およ
びＥ、コリＫＩ２ＭＭ２９４／ｐＴＰＡ６０１細胞を同
定した。〜５３０ｂｐ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントの
存在は、プラスミドがｐＴＰＡ６０２またはｐＴＰＡ６
０１のどちらかであることを示す。
Ｂ、中間体プラスミドｐＴＰＡ６０３の構築プラスミド
ｐＴＰＡ６０２約５μ９を、１０×Ｂｇｌｌｌｌ衝液２
０μＱおよび水１８０μＱに加えた。
このプラスミドｐＴＰＡ６０２　　ＤＮＡの溶液に、制
限酵素Ｂｇｌｌｌ約３μＱ（〜２４単位）を加え、得ら
れた反応液を３７℃で９０分間インキュベートした。次
いで、この反応混合物に１０ＸＢ１０ＸＢａ衝液〜１３
μＣを加えて、反応混合物の塩濃度を５ａｌｌ消化に推
奨される濃度にし、この反応液に制限酵素５ａ１１　２
μＱ（〜２０単位）を加えた。
この反応液を３７℃でさらに２時間インキュベートし、
次いでＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ローディング緩
衝液７５μＱに再懸濁し、〜４　、２　ｋｂＢｇｌｌｌ
　−Ｓ　ａｌ　Ｉ制限フラグメントかその他の消化産物
から分離するまで、アガロースゲル電気泳動にかけた。
この〜４．２ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ−９ａｌｌ制限フラグメ
ントを含有するゲル領域をゲルから切り出し、凍結させ
、この凍結セグメントをプラスチックで包み、そして圧
搾して〜４　、２　ｋｂフラグメントを取り出した。こ
のＤＮＡを沈澱させ、水２０μρに再懸濁した（目的の
フラグメントが約２００ナノグラム得られた）。
プラスミドｐＴＰＡ１０３約１２μ９を、１０×Ｂｇ１
１＋緩衝液１５μａおよび水１３５μＱに加えた。この
プラスミドｐＴＰＡＩ０３　　ＤＮＡの溶液に、制限酵
素Ｂｇｌｌｌ約２μ０．（〜１６単位）を加え、得られ
た反応液を３７°Ｃで９０分間インキュベートした。こ
のｌ３ｇ１ｌｌｌ肖化したプラスミドｐＴＰＡ１０３Ｄ
ＮＡの溶液に１０ＸＢ１０ＸＢａ衝液約１０μｇを加え
て、反応混合物の塩濃度を５ａｌｌ消化に必要とされる
濃度にした。次いで、このＢｇｌｌｌｌｈ化したプラス
ミドｐＴＰＡ　ｌ　０３　　ＤＮＡの溶液に制限酵素５
ａｉｌ約２μＱ（〜２０単位）を加え、この反応液を３
７℃でさらに９０分間インキュベートした。このＢｇｌ
ｌｌ　−Ｓ　ａｌ　Ｉ消化したプラスミドｐＴＰＡ１０
３　　ＤＮＡをエタノール沈澱によって層線し、次いで
アガロースゲルにかけ、ＴＰＡのアミノ末端以外のすべ
てをコードしている〜２゜０５　ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ　−
Ｓ　ａｌ　Ｉ制限フラグメントをゲルから単離し、エタ
ノールで沈澱させ、水２０μＱに再懸濁した。目的のフ
ラグメントか約２μ９得られた。
プラスミドｌ１ｌＴＰＡ６０２の〜４．２ｋｂ　Ｂｇｌ
ｌｌ−Ｓａｌｒ制限フラグメント約５μＱおよびプラス
ミ　ドＩ＞ＴＰＡＩ０３の〜２．０５ｋｂ　　Ｂｇｌｌ
ｌ−ＳａｌＩ制限フラグメント２μｇを、１０×リガー
ゼ緩衝液２μＱ１水１０μＱ１およびＴ４　　ＤＮＡリ
ガーゼ１μσ（〜ｌバイス単位）に加え、得られたライ
ゲーンヨン反応液を１６℃で一部インキュベートシた。
このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐＴＰＡ６
０３からなっていた。プラスミドｐＴＰＡ６０３の制限
部位および機能地図を添付の第２２図に示す。
このライゲート化ＤＮＡを用い、５０ｍＭＣａＣＱｔを
用いろこと以外は実質的に実施例２の方法に従って、Ｅ
、コリＫ　１２　ＭＭ２９４を形質転換した。この形質
転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平板培養し、
プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピシリン
耐性のＥ　コリＫ１２　ＭＭ２９４／ｐＴＰＡ６０３形
質転換体を同定した。
Ｃ、プラスミドｐＭＴＰＡ６０３の構築ＴＥ緩衝液１０
０μρ中のプラスミドｐＢＬＴ（実施例１４、第１８図
）約１００μ９を、ｌ０ＸＳｓｔｒ（Ｓｓｔｌは制限酵
素Ｓ　ａｃ　Ｉと等価である）緩衝液［６０ｍＭ）リス
−ＨＣ１２（ｐｌ（＝　７　、〜１　）、６０ｍＭ　Ｍ
ｇｃ（ｂ、６０ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、お
よびＩ　ｍ９／ｙｔ（ｌ　Ｂ　Ｓ　Ａコ１０μρおよび
水２５μ＆に加えた。このプラスミドＩ）ＢＬＴ　ＤＮ
Ａの溶液に、制限酵素５ｓｔｌ約１０μｇ（〜５０単位
）を加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベ
ートした。この５ｓｔＩ消化したプラスミドｐＢＬＴ　
Ｄ　Ｎ　Ａをエタノールで沈澱させ、１０ＸＢｇ１１１
緩衝液１０μＱおよび水８５μＣに再懸濁した。
この５ｓｔｌ消化したプラスミドｐＢ　Ｌ、　Ｔ　Ｄ　
Ｎ　Ａの溶液に、制限酵素ＢｇｌＩＩ約５μＱ（〜５０
単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間イン
キュベートした。
実質的に実施例４Ａの方法に従って、このＢｇｌＩＩ−
９ｓｔＩ消化したプラスミドｐＢＬＴ　ＤＮＡをエタノ
ールで沈澱させ、水１０μＱに再懸濁し、アガロースケ
ル電気泳動にかけ、改良型ＴＰＡのコード化配列部分（
改良型ＴＰＡをコードしている配列が得られるような欠
失が生じている）を含有するプラスミドｐＢＬＴの〜６
９０ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ　−３ｓｔｒ制限フラグメントを
ゲルから単離した。目的の、プラスミドｐＢＬＴの〜６
９０ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ　−６ｓロ制限フラグメントが約
５μ９得られ、これを水１００μａに懸濁した。
ＴＥ緩衝液５μρ中のプラスミドｐＴＰＡ６０３（実施
例１６Ｂ１第２２図）約５μ９を、ｌ０ＸＳｓｔＩ緩衝
液１０μＱおよび水９５μａに加えた。このプラスミド
ｐＴＰＡ６０３　　ＤＮＡの溶液に、制限酵素５ｓｔｌ
約５μＱ（〜５０単位）を加え、得られた反応液を３７
６Ｃで２時間インキュベートした。
このＳｓｔ！消化したプラスミドｐＴＰ、Ａ６０３ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、ｌ　Ｏｘ　Ｂｇｌｌｌ緩衝
液１０μＱおよび水８５μｇに再懸濁した。この５ｓｔ
ｌ消化したプラスミドｐＴＰＡ６０３　　ＤＮＡの溶液
に、制限酵素１３ｇ１ｌ＋約５μｇ（〜５０単位）を加
え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュベート
した。実質的に実施例２の方法に従って、このＢｇｌｌ
ｌ　−Ｓｓｔ　Ｉ消化したプラスミドｐ’ｒ　Ｐ　ＡＢ
Ｏ３ＤＮＡＪ！ｅＴＥ緩衝液１００μｍ２に希釈し、ウ
シ腸アルカリホスファターゼで処理した。次いて、この
ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、水１０μＱに再＠濁し
た。
Ｂｇｌｌｌ　−Ｓｓｔ　Ｉ消化したプラスミドｐ’ｒ　
Ｐ　Ａ　６０３約５μρおよびプラスミドｐＢＬＴの〜
６９０ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ　−Ｓ　ｓｔ　Ｉ制限フラグメ
ント２μＱを、１０×リガーゼ緩衝液２μＱ、水１０μ
Ｑ、およびＴ４　　ＤＮＡリガーゼｌμＱ（〜１０００
単位）に加え、得られたライゲーション反応液を１６°
Ｃで一部インキユベートした。このライゲート化ＤＮＡ
は目的のプラスミドｐＭＴＰＡ６０３からなっていた。
従って、プラスミドｐＭＴＰＡ６０３が改良型ＴＰＡを
コードし、プラスミドｐＴＰＡ６０３がＴＰＡをコード
していること以外は、プラスミドｐＭＴＰＡ６０３はそ
の構造がプラスミドｐ’ｒ　Ｐ　ＡＢＯ３（第２２図）
と類似している。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２の方
法に従って、Ｅ、コリＫ１２ＨＢ１０１を形質転換した
。この形質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平
板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってア
ンピシリン耐性のＥ。
コリＫ１２　　ＨＢ１０Ｉ／ｐＭＴＰＡ６０３形質転換
体を同定した。
Ｄ、プラスミドｐｈｄＴ　Ｐ　Ａの構築ＴＥ緩衝液１０
μσ中のプラスミドｐＴｒ’Ａ６０３（実施例１６Ｂ、
第２２図）約１０μ９を、１０Ｘ１０ＸＢａ緩衝液１０
μＱおよび水８５μＱに加えた。このプラスミドｐＴＰ
Ａ６０３　　ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＢａｍＨＩ約５
μｇ（〜５０単位）を加え、得られた反応液を３７℃で
２時間インキュベートした。このＢａｍＨＩ消化したプ
ラスミドｐＴＰＡ６０３　　ＤＮＡをエタノールで沈澱
させ、水１０μＱに再懸濁し、ＴＰＡをコードしている
〜ｌ　、９０ｋｂ　ｌ３ａｌｉＨＩ制限フラグメントが
その他の消化産物から分離するまでアガロースゲル電気
泳動にかけた。この〜１．９０ｋｂ　Ｂａｍ［Ｉ　Ｉ制
限フラグメントをゲルから単離し、ＴＥ１１衝液５０μ
Ｑに再＠濁した。目的のフラグメントか約４μ９得られ
た。
ＴＥ緩衝液２μρ中のプラスミドｐｈｄ　（実施例１２
、第１６図）約２μ９を、１０ＸＢｃｌｌｌ衝液２μｇ
および水１４μｇに加えた。このプラスミドｐｂｄＤＮ
Ａの溶液に、制限酵素Ｂｅ１ｌ約２μＱ（〜１０単位）
を加え、得られた反応液を５０°Ｃで２時間インキュベ
ートした。この反応混合物を始めにフェノールで、次い
でクロロホルムで２回抽出することによって、反応を停
止させた。次いて、このＢｃｌＩ消化したプラスミドｐ
ｈｄＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ＴＥ援衝新液０μ
Ｑに再懸濁した。
Ｂｃｌｌ消化したプラスミドｐｈｄ約ｌμＱおよびプラ
スミドｐＴＰＡ６０３の〜１．９０ｋｂ　ＢａｍＨｒ制
限フラグメント２μＱを、１０×リガーゼ緩衝液１μＱ
１水５μＱ、およびＴ４　ＤＮＡリガーゼｌμＱ（〜５
００単位）に加え、得られたライゲーション反応液を１
６℃で一部インキユベートした。
このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐｈｄＴＰ
Ａからなっていた。このプラスミドＩＩ）ｈｄＴＰＡの
制限部位および機能地図を添付の第２３図に示す。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２の方
法に従って、Ｅ、コリに１２ＨＢ１０１（ＮＲＲＬ　Ｂ
−１５６２６）を形質転換した。この形質転換混合物を
アンピンリン含有のし一寒天で平板培養し、制限酵素分
析によってアンピシリン耐性のＥ、コリＫ　Ｉ　２　　
Ｉ−１Ｂ　１０１／ｐｈｄＴＰＡ細胞を同定した。〜１
．９０ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントは、ＢｃｌＩ
消化したプラスミドｐｈｄに２種類の配向のうちのどち
らかで挿入することができるが、そのうちの１つだけが
、ＢＫエンハンサー−アデノウィルス後期プロモーター
カセットの制御下に発現させるのに適した位置に、ＴＰ
Ａコード化配列配列置している。すなわち、これが目的
のプラスミドｐｈｄＴ　Ｐ　Ａである。
Ｅ、プラスミドｐｈｄＭ　Ｔ　Ｐ　Ａの構築ＴＥ１１１
衝液１０μσ中のプラスミドｐＭＴＰＡ６０３（実施例
１６Ｃ）約１０μ９を、１０ＸＢａ１０ＸＢａ緩衝液１
０μｅおよび水８５μｅに加えた。このプラスミドｐＭ
ＴＰＡ６０３　　ＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｉ３ａｍＨ
１約５μｅ（〜５０単位）を加え、得られた反応液を３
７℃で２時間インキュベートした。このＢａｍＨＩ消化
したプラスミドｐＭＴＰＡ６０３ＤＮＡをエタノールで
沈澱させ、水１０μＣに再懸詞し、改良型ＴＰＡをコー
ドしている〜Ｉ　、３５ｋｂ　ＢａｍＨｒ制限フラグメ
ントがその他の消化産物から分離するまでアガロースゲ
ル電気泳動にかけた。この〜１．３５ｋｂ　ＢａｍＨＩ
制限フラグメントをゲルから単離し、ＴＥ緩衝新液０μ
ｇに再懸濁した。目的のフラグメントが約４μ９得られ
た。
実施例１６Ｄで調製したＢｃｌＩ消化のプラスミドｐｈ
ａ約ｌμＱおよびプラスミドｐＭＴＰＡ６０３の〜１．
３５ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメント２ｕＱを、１０
×リガーゼ緩衝液ｌμＱ１水５μａ１およびＴ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼＩμｅ（〜５００単位）に加え、得られたラ
イゲーション反応液を１６℃で一部インキユベートした
。このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐｈｄＭ
　Ｔ　Ｐ　Ａからなっていた。
プラスミドｐｈｄＭＴ　Ｐ　Ａの制限部位および機能地
図を添付の第２４図に示す。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例２．の
方法に従って、Ｅ、コリＫＩ２ＨＢ１０１を形質転換し
た。この形質転換混合物をアンピシリン含有のし一寒天
で平板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によっ
てアンピシリン耐性のＥ、コリＫ　１２　　ＨＢ　Ｉ　
ＯＩ／ｐｈｄＭＴＰＡ細胞を同定した。〜１．３５　ｋ
ｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントは、Ｂｃｌｌ消化した
プラスミドｐｈｄに２種類の配向のうちのどちらかで挿
入することができるが、そのうちの１つだけが、Ｉ３に
エンハンサーーアデノウィルス後期プロモーターの制御
下に発現させるのに適した位置に、ＴＰＡコード化配列
配列置している。すなわち、これが目的のプラスミドｐ
ｈｄＭＴＰＡである。
実施例１７改良型ＢＫエンハンサー−アデノウィルス後
期プロモーターカセットの構築近接する真核生物性プロ
モーターのＣＡＡＴ領域の５°末端の上流側０〜３００
ヌクレオチドに１３にエンハンサ−を配置することによ
って、該エンハンサ−の転写促進効果を著しく増加させ
ることができる。修飾を加えてより大きい促進活性を達
成する前の、本発明のＢＫエンハンサー−アデノウィル
ス２後期プロモーターカセットの配列および機能成分を
以下に示す： Ｈｉｎｄ［Ｉ［ ５’−ＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴ ＣＡＴＴＡＡＧＧＧＡ　　ＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧ
ＣＡＧＣＴＣＴ　　ＴＴＣＡＡＧＧＣＣＴＡＡＡＡＧＧ
ＴＣＣＡ　　ＴＧＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＴＣ
ＣＣＴＧＴＴＡＡＧＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡＴ　　ＴＴ
ＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣＣＡＡＡＴＡ　　　ＧＴＴＴ
ＴＧＣＴＡＧｔｕｌ ＧＣＣＴＣＡＧＡＡＡ　　ＡＡＧＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣ
ＣＴＴＡＣＴＡ　　ＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＧＴＧ
ＧＡＧＧ　　　ＣＡＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴ
ＣＴ　　ＴＡＴＡＴＡＴＴＡＴ２４０　　　　　＊−−
−−−−− ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ　　ＧＣＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＡ
ＧＣＴＧＣＴＴ　　ＡＣＣＣＡＴＧＧＡＡ−−ＢＫエン
ハンサ−の最初の繰り返し一一−ＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡ
　　ＣＣＡＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡ　　Ｇ
”ｉ″ＧＣＡＴＧＡＣＴ＊−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−ＣＡＣＡＧＧＧＧＡＡ　　　ＴＧＣＡＧ
ＣＣＡＡＡ−−Ｉ３にエンハンサ−の２番目の繰り返し
一−ＣＣＡＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧΔＡＡＧ　Ｔ
　Ｇ　ＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ａ　ＣＴ　　ＣＡ　ＣＡ　Ｇ　Ｇ
　Ｇ　Ａ　Ｇ　ＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＣＣＡＴＧＧＡ
ＡＴＧ−−ＢＫエンハンサ−の３番目の繰り返シー−〇
ＡＧＣＣＡＡＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡ
ＡＡＧＴ　　ＧＣＡＴＧＡＣＴＣ；Ｇ−−−−−−ＢＫ
（ＤＵＮ）には見い出されないＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡ
ＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴ　　ＴＧＣＧ
ＡＧＣＣＴＡＧＧＡＡＴＣＴＴＧＧ　　ＣＣＴＴＧＴＣ
ＣＣＣＡＧＴＴＡＡＡＣＴＧ　　ＧＡＣＡＡＡＧＧＣＣ
５４０Ｓ　ｔｕ　Ｉ　／　Ｐ　ｖｕｌｌＡＴＧＧＴＴＣ
ＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴ５ｔＩ ＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧ　　ＴＧＴＴＣＣＧＣＧＧＴＣＣ
ＴＣＣＴＣＧＴ　　ＡＴＡＧＡＡＡＣＴＣＧＧＡＣＣＡ
ＣＴＣＴ　　ＧＡＧＡＣＧＡＡＧＧＣＴＣＧＣＧＴＣＣ
Ａ　　ＧＧＣＣＡＧＣＡＣＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＡ　　
ＡＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＧ　　ＴＴＧ
ＴＣＣＡＣＴＡＧＧＧＧＧＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＣＣＡ
ＧＧＧＴＧＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡＴＧＴＣＧＣＣＣＴＣ
ＴＴＣＧＧＣＡ　　ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧ
ＴＧＡＣＣＧＧＧＴＧＴＴＣＣ７８０Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａボ
ックス ＴＧＡＡＧＧＧＧＧＧ　　ＣＴＡＴＡＡＡＡＧＧＧＧＧ
ＴＧＧＧＧＧＣＧＣＧＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＴＣＴＣ
ＴＴ　　ＣＣＧＣＡＴＣＧＣＴ８４０　　　　　Ｂｃｌ
ｌ　　リン ＧＴＣＴＧＣＧＡＧＧ　　　ＧＣＣＡＣ；ＣＴＧＡＴカ
ー　　　　　　　　　　　　　　　　Ｈ４ｎＣＡＧＣＣ
ＴＡＧＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴ−３゜ ［配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、およびＴはチミジルである
］。
ＢＫエンハンサ−は、上記配列中に示した３つの繰り返
し配列で定義され、近接する配列に対して、どちらの配
向であっても同様に機能する。このエンハンサ−１すな
わちＢＫエンハンサ−の３番目の繰り返しの３゛末端（
これは配向に依存する）を、アデノウィルス−２後期プ
ロモーターのＣＡＡＴ領域の５°末端のより近くに持っ
てくるため、ＴＥ緩衝液１７０μＱ中の５ｓｔＩ消化し
たプラスミドｐＢ　Ｌ　ｃａｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ約８２μ９
を、５ＸＢａ１３１ヌクレアーゼ緩衝液［０，１Ｍ　　
トリス−ＨＣＱ（Ｐ）Ｉ＝８．１）、　　０．５Ｍ　　
　ＮａＣＬ　　　Ｏ，０６Ｍ　　　ＣａｒＡｔ、および
５ｍＭ　ＮａｔＥＤＴＡ］２０１１（ｌおよびＢａ１３
１ヌクレアーゼ［これは、［早いｊＢａ＋３１酵素６μ
ｇ（〜６単位）および「遅いＪｎａ１３１酵素３μＱ（
〜３単位）からなり、これらはインターナショナル・バ
イオチクノロノーズ社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｐ、Ｏ，
Ｂｏｘ　１５６５．Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、ＣＴ　０６５
０６）から市販されている］９μｇに加えた。
この反応液を３０℃で約３分間インキュベートし、次い
で０．ＩＭ　ＥＧＴＡ約１０μＱを加えて反応を止めた
後、このＢａ１３１消化したＤＮＡをエタノール沈澱お
よび遠心することによって集めた。
実質的に上記記載の方法に従って、このＤＮＡペレット
を１×　フレノウ緩衝液に再懸濁し、フレノウ酵素で処
理した。
このフレノウ処理したＤＮＡをＴＥＩ衝液新液μＱに再
懸濁し、次いて前記のようにして、このＤ　Ｎ　、Ａ約
ｌμｇを、ｌ×　リガーゼ緩衝液１０μρ中、Ｔ４　　
ＤＮＡおよびＲＮＡリガーゼを用いて自己ライゲートさ
せた。このライゲート化ＤＮＡを用いてＥ、コリＫＩ２
ＨＢ１０１を形質転換し、次いでこの形質転換体をアン
ピシリン含有のＬ寒天にプレートした。制限酵素分析を
用いて、どの形質転換体が適当な大きさのＢＫエンハン
サーーアデノウィルス２後後期プロモーター上セント含
有プラスミドを含んでいるかを測定し、ＤＮＡ配列決定
を用いてこのカセットのヌクレオチド配列を確認した。
上記の方法は、アデノウィルス後期プロモーターのＣＡ
ＡＴ領域の上流側０〜３００ヌクレオチド以内にＢＫエ
ンハンサ−が配置された多数のプラスミドを生じる。上
記方法から得られたプラスミドの１つをプラスミドｐＢ
　ａｌ　８　ｃａｔと命名した。このプラスミドｐＢ　
ａｌ　８　ｃａｔのＢＫエンハンサー−アデノウィルス
２後期プロモーターの配列を以下に示す： Ｈｉｎｄｌｌ！ ５°−ＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴ ＣＡＴＴＡＡＧＧＧＡ　　ＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧ
ＣＡＧＣＴＣＴ　　ＴＴＣＡＡ（、ＧＣＣＴＡＡＡＡＧ
ＧＴＣＣＡ　　ＴＧＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＴ
ＣＣＣＴＧＴＴＡＡＧＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡＴ　　　
ＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＴＴＧＣΔＡＡＡＧ　　　ＡＡ
ＴＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＴＡ　　　ＧＴＴＴ
ＴＧＣＴＡＧＳ　ｔｕ　［ ＧＣＣＴＣＡＧＡＡＡ　　　ＡＡＧＣＣＴＣＣＡＣＡＣ
ＣＣＴＴＡＣＴＡ　　　ＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＧ
ＴＧＧＡＧＧ　　　ＣＡＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣ
ＣＴＣＴ　　　Ｔ、ＡＴＡＴΔＴＴＡＴ＊−一−−−−
− ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ　　ＧＣＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＡ
ＧＣＴＣＣＴＴ　　ＡＣＣＣＡＴＧＧＡＡ−−ＢＫエン
ハンサ−の最初の繰り返し一−−ＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡ
　　ＣＣＡＴＧＡＣＣＴＣ−−−−−−−−−−−−−
−−−−−＊ＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡ　　ＧＴＧＣＡＴＧ
ＡＣＴ＊−−−−−−−−−−−−一−−−−−−ＣＡ
ＣＡＧＧＧＣ；ＡＡ　　ＴＣ；ＣＡＧＣＣＡＡＡＧＴＧ
ＣＡＴＧＡＣＴ　　　ＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧ
ＣＴＴＡＣＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＴ
　　　ＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧ
ＴＧＧＣＡＧＴＴＡＡＴＡＣＡＧＧＧＴ　　　ＧＴＧＡ
ＡＧＡＣＡＣＡＴＧＴＣＧＣＣＣＴ　　　ＣＴＴＣＧＧ
ＣＡＴＣＡ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　ＴＡ　Ｇ　Ｇ　ＣＣＡ　
ＣＧ　Ｔ　Ｇ　Ａ　ＣＣＧＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧ　　　
ＡＡＧＧＧＧＧＧＣＴｄ２ＬＰ Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　　　Ｇ　Ｔ
　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　ＣＧ　Ｃ（”、ＴＴｒ、ＧＴＣ
ＣＴ（”ｉ　　　ＡＣＴＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＴＣＧＣ
ＴＧＴ　　　ＣＴＧＣＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧ
ＣＴＴ−３“ ［配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、およびＴはデミジルである
］。
プラスミドｐＢ　ａｌ　８　ｃａｔについて説明したが
、上記方法によって多数の別種プラスミドが得られるこ
とは当業者の理解するところであろう。一群のこれらプ
ラスミドは、Ａｄ２後期プロモーターのＣＡ　Ａ　Ｔ領
域から３００ヌクレオチド以内の様々な距離のところに
ＢＫエンハンサ−を配置したものであり、従って本発明
の重要な態様である。上述の方法または当分野で既知の
その他の方法を用いておこなうことができるこのＢＫエ
ンハンサ−活性を改良する方法は、すべてのＢＫエンハ
ンサ−およびすべての真核生物性プロモーターを用いて
行うことができる。
求廊例１８本発明の発現ベクターの真核宿主細胞形質転
換体の作成およびこれら形質転換体における組換え遺伝
子発現レベルの測定 本発明の態様のうち重要なものは、ＢＫエノハンサーを
用いて、Ｅ１Ａ遺伝子産物の存在下に遺伝子の発現を刺
激することに関する。２９３細胞は構成的にＥ１Ａ遺伝
子産物を発現するので、２９３細胞が本発明の真核生物
性発現ベクターの宿主として好ましい。２９３細胞はア
デノウィルスタイプ５（本発明方法においては、アデノ
ウィルスの特定タイプのいずれかを用いてＥ　Ｉ　、Ａ
遺伝子産物を供給することができることに注き）で形質
転換したヒト胎児腎細胞であり、ＡＴＣＣから取得番号
ＣＲＬＩ５７３のもとて人手できる。しかし本発明の発
現ベクターは、たとえＥ１Ａ遺伝子産物が存在しない場
合であっても、多種多様の宿主細胞において機能する。
さらに、Ｅ１Ａ遺伝子を含有する本発明のベクター（た
とえば、プラスミドｐＬＰＣＥ１ＡおよびｐＬＰＣＥ１
Ａ＋）あるいは完全なアデノウィルスＤＮＡで形質転換
するか、またはアデノウィルスに感染させることによっ
て、Ｅ１Ａ−非産生セルラインにＥ１Ａ遺伝子産物を導
入することができる。
以下に記載する形質転換法は、宿主細胞セルラインとし
て２９３細胞を挙げて言及するが、この方法は、はとん
どの真核生物セルラインに一般的に応用することができ
る。本発明のベクターで多数のセルラインを形質転換し
、実際に作成した形質転換体のいくつか、およびその関
連情報を本実施例中、後記の表に示す。本発明の発現ベ
クターは極めて多数にのぼるので、形質転換法は一般的
に記載し、実際に作成した形質転換体を表中に示す。
２９３細胞を、ＡＴＣＣから取得番号ＣＲＬ　１５７３
のもと、１０％の加熱不活性化したウマ血清を含有する
イーグル（Ｅａｇｌｅ）の最小必須培地中の、約５．５
Ｘ１０６の全面単層細胞を含有する２５ｍｍ’フラスコ
として入手する。このフラスコを３７°Ｃでインキュベ
ートし、培地を週２回交換する。培地を除去し、ハング
（Ｈａｎｋ）のバランス塩溶液（Ｇ　１ｂｃｏ）ですす
ぎ、０．２５％トリブノンを１〜２分間加え、新鮮な培
地ですすぎ、そして１：５または１：１０の継代培養比
で新しいフラスコに吸引、分取することによって細胞を
継代培養する。
形質転換の１日前に０．７ｘ　ｌ　Ｏ１′細胞／皿で細
胞を植え付ける。形質転換の４時間前に培地を交換する
。滅菌し、エタノール沈澱させたプラスミドＤＮＡ（Ｔ
Ｅ緩衝液に溶解した）を用いて、４０μｇ／ｍｆ２ＤＮ
Ａおよび２５０ｍＭ　ＣａＣｆＬを含有する２　Ｘ　Ｄ
　Ｎ　Ａ　　ＣａＣＱｘ溶液を調製する。２８０ｍＭ　
ＮａＣ＆、５０ｍＭヘベスおよび１．５ｍＭリン酸ナト
リウムを含有し、ｐＨを７．０５〜７．１５に調整した
２ｘＨＢＳを調製する。２Ｘ　　ＤＮＡ　　ＣａＣＱｘ
溶液を等容重の滅菌２ＸＨＩ３Ｓに滴下する。細枠をつ
けた１ｏ２の滅菌プラスチックピペットを、２ＸＨＢＳ
を含有する混合管に挿入し、ＤＮＡを添加する間、吹き
込むことによって気泡を導入する。室温で３０〜４５分
間、撹拌することなくカルンウムーリン酸塩−ＤＮＡ沈
澱物を析出させる。
次いで、プラスチックピペットで穏やかにピペット操作
を行って沈澱物を混合し、受容細胞を覆う増殖培地１０
ｍＱに沈澱物１ｘＣ（プレートあたり）を直接加える。
３７℃で４時間インキュベートした後、培地を１０％ウ
シ胎児血清含有のＤＭＥＭに置き換え、選択圧を与える
前にこの細胞をさらに７２時間インキュベートする。組
換えヒトタンパク質Ｃを発現する形質転換体に対しては
、このタンパク質のγカルボキシル化に必要な補助因子
であるビタミンＫ（１−１０μ９／ｆｆ（りを増殖培地
に含有させた。真核生物細胞中で機能する選択マーカー
を含有していないプラスミドに対しては、プラスミド混
合物、すなわち選択マーカーを欠く本発明の発現ベクタ
ー、および真核生物細胞中で機能する選択マーカーを含
有している発現ベクターを用いて形質転換を行った。こ
の共形質転換法は、形質転換させるプラスミドの両者を
含有している細胞の同定を可能にする。
ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有するプラスミド
でトランスフェクションした細胞に対しては、増殖培地
に最終濃度的２００〜４００μ２／ｍＱになるまでハイ
グロマイシンを加える。次いで、培地を３〜４日間隔で
交換しながら３７℃で２〜４週間細胞をインキュベート
する。得られたハイグロマイシン耐性のコロニーを、そ
の特徴を調べるために別々の培養フラスコに移す。ネオ
マイシン（ネオマイシンの代わりにＧ４１８を用いるこ
ともできる）耐性コロニーの選択は、ハイグロマイシン
の代わりにネオマイシンを最終濃度４００μｙ／ｘ（ｌ
になるまで加えること以外は、実質的にハイグロマイシ
ン耐性細胞の選択方法に従って行う。２９３細胞はｄｈ
ｆｒ陽性であるので、ｄｈｆｒ遺伝子を有するプラスミ
ド含有の２９３形質転換体はｄｈ［’ｒ陽性の表現型（
ヒボキサンチンおよびチミンを欠く培地で増殖する能力
）に基づいてのみでは選択されない。機能的なｄｈｆｒ
遺伝子を欠き、そしてｄｈｆｒを含有するプラスミドで
形質転換されたセルラインは、ｄｈｆｒ＋の表現型に基
づいて選択することができる。
ｄｈｆｒ欠失セルラインに遺伝子またはプラスミドを導
入するための選択マーカーとしてジヒドロ葉酸還元酵素
（ｄｈｆｒ）遺伝子を用いること、および後にメトトレ
キセイトを用いてプラスミドのコピー数を増幅すること
は文献上よく認められている。
ｄｈｒｒ産生細胞において選択および増幅マーカーとし
てｄｈｆｒを用いることについては十分に研究が為され
ていないが、文献に挙げられている証拠は、遺伝子増幅
のためおよびｄｈ「ｒ産生細胞における選択マーカーと
してｄｈｆｒを用いることができることを示唆している
。本発明は用いる選択マーカーによっては限定されない
。さらに、メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミ
ナーゼ遺伝子、またはＰ−糖タンパク質で例示される多
重遺伝子耐性族の一員などの増幅しうるマーカーを用い
ることができる。
＊ｚ表　２９３細胞形質転換体における発現レベル第３
表　ＭＫ２（ＡＴＣＣＣＣｌ２）細胞形質転換体におけ
る発現レベル 裏１表　　種々のヒトおよびサル腎細胞セルラインにお
いて組換えプラスミドが産生するクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の相対レベル ＊それぞれのセルラインにおいて産生したＣＡＴの相対
レベル値は、プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔからのＣ
ＡＴレベルを基礎とした（それぞれのセルラインにおい
てｌであるとして）。結果は別個に測定した２〜６測定
値の平均である。ＮＤ＝検出されず。ＮＴ＝試験せず。
プラスミドｐＳＬｃａｔはプラスミドｐＢＬｃａｔに類
似しているが、ＢＫエンハンサ−の代わりにＳＶ４０エ
ンハンサ−を有している。２９３セルラインだけがＥ１
Ａを産生する。
Ｃｏ１およびに８１６−４セルラインはＴ抗原を産生ず
る。
＊＊に８１６−４細胞は、複製起源に欠失を有するＳＶ
４０ゲノムを含有しティろ、ｐＭＫ１６．８−１６と命
名されたプラスミド［グルズマン（Ｙ、引ｕｚｍａｎ、
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ）から人手］
で１次ヒト腎細胞を形質転換することによって調製した
。このセルラインはＳＶ４０のＴ抗原を構成的に産生ず
る。このに８１６−４セルラインは本質的にセルライン
ＳＶ１［ＳＶ４０で形質転換したヒト冑細胞セルライン
であり、メジ＋　−（Ｅ、０．Ｍａｊｏｒ、Ｐｏｔｙｏ
ｍａｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｎｅｕｒｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ
５ｓ、Ｉｎｃ、、Ｎ、Ｙ、１９８３．ｅｄｓ　Ｄ、Ｍａ
ｄｄｅｎ、ａｎｄ　Ｊ。
５ｅｖｅｒ）が開示している］と同じである。
第５表　プラスミドコピー数の相対的な差を補正した種
々のヒトおよびサル腎細胞セルラインにおいて組換えプ
ラスミドが産生ずるクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）の相対レベル＊それぞれのセ
ルラインにおいて産生じたＣＡＴの相対レベル値は、細
胞溶解物中のＣＡＴレベルを、ハイブリダイゼーション
分析で測定した同細胞溶解物中のプラスミドＤＮＡｆｆ
１で割ることによって補正した。２９３細胞におけるプ
ラスミドｐｓ　Ｖ　２　ｃａｔの補正値を１とした。
【図面の簡単な説明】
第１図はＢＫウィルスの、第２図はプラスミドｐＢＫＥ
Ｉの、第３図はプラスミドｐＢＫｎｅｏｌの、第４図は
プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔの、第５図はプラスミ
ドｐＬＰｃａｔの、第６図はプラスミドｐＢＬｃａｔの
、第７図はプラスミドｐＢＫｃａｔの、第８図はプラス
ミドｐＳＢＬｃａｔの、それぞれ制限部位および機能地
図を表す模式図であり、第９図はプラスミドｐＬ　Ｉ　
３３の構築を示す工程図（プラスミド１）Ｌｉ２Ｓの制
限部位および機能地図も合わせて記す）であり、第１Ｏ
図はプラスミドｐＬＰＣの、第１１図はプラスミドｐｔ
、　Ｐ　Ｃ４の、第１２図はプラスミドｐＳ　Ｖ　２　
ｈｙｇの、第１３図はプラスミドｐｌ。 ｐｃｈｙｇ＋の、それぞれ制限部位および機能地図を表
す模式図であり、第１４図はプラスミド１）ＢＷ３２の
構築を示す工程図（プラスミドＰＢＷ３２の制限部位お
よび機能地図も合わせて記す）であり、第１５図はプラ
スミドｐＬＰｃｈｄｌの、第１６図はプラスミドｐｈｄ
の、第１７図はプラスミドｐＬＰＣＥ１Ａの、第１８図
はプラスミドｐＢＬＴの、第１９図はプラスミドｐＢ　
Ｌ　Ｔｈｙｇ　ｌの、第２０図はプラスミドｐＢ　Ｌ　
Ｔ　ｄｈｆｒ　１の、第２１図はプラスミドｐＴＰＡ６
０２の、第２２図はプラスミドｐＴＰＡ６０３の、第２
３図はプラスミドｐｈｄＴｒ’Ａの、第２４図はプラス
ミドｐｈｄＭ　Ｔ　Ｐ　Ａの、それぞれ制限部位および
機能地図を表す模式図である。 特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニー 代理人弁理士　前出　葆　外１名 ＦｔＧ、２ ＦＩ　Ｇ、　Ｉ　１ ＦＩＧ、ｌ２ ＦＩＧ、Ｉ３ ＦＩＧ、１５ ＦＩＧ、ｌ６ ＦＩＧ、＋７ ＦＩＧ、ｌ９ ＦＩＧ、２０ ＦＩＧ、２１ ＦＩＧ、２３ ＦＩＧ、２４

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）真核宿主細胞において機能的なポリペプチドを産
    生させるための方法であって、大きいＤＮＡウィルスま
    たはそのＤＮＡで形質転換され、そして少なくとも ａ）真核生物性プロモーター、 ｂ）該プロモーターを刺激するように配置したＢＫウイ
    ルスエンハンサー、 ｃ）該プロモーターから発現するように配置した、機能
    的なポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列、 を含有する組換えＤＮＡベクターで形質転換された真核
    生物細胞、または上記ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）大き
    いＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物をコードしている
    ＤＮＡ配列、 を含有する組換えＤＮＡベクターで形質転換された真核
    生物細胞を、ｃ）およびｄ）の発現に適した条件下で培
    養することからなる方法。
  2. （２）組換えＤＮＡベクターがプラスミドである第（１
    ）項記載の方法。
  3. （３）大きいＤＮＡウィルスがアデノウィルス、シュー
    ドラビエスウィルスまたは単純性庖疹ウィルスである第
    （１）項または第（２）項記載の方法。
  4. （４）大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物がアデ
    ノウィルスＥ１Ａタンパク質、アデノウィルスＥ１Ｂタ
    ンパク質、シュードラビエスウィルスＩＥタンパク質ま
    たは単純性庖疹ウィルスＩＣＰ４タンパク質である第（
    １）項〜第（３）項のいずれかに記載の方法。
  5. （５）即時型遺伝子産物がアデノウィルスＥ１Ａタンパ
    ク質である第（４）項記載の方法。
  6. （６）真核生物性プロモーターがＳＶ４０初期プロモー
    ター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＢＫ初期プロモータ
    ー、ＢＫ後期プロモーター、ポリオーマウィルス初期プ
    ロモーター、パポバウィルス初期プロモーター、ポリオ
    ーマウィルス後期プロモーター、パポバウィルス後期プ
    ロモーター、単純性庖疹ウィルスチミジンキナーゼプロ
    モーター、インターフェロンα１プロモーター、マウス
    メタロチオネインプロモーター、レトロウィルスプロモ
    ーター、β−グロビンプロモーター、アデノウィルスプ
    ロモーター、アデノウィルス−２後期プロモーター、ウ
    ニＨ２Ａプロモーター、コンアルブミンプロモーター、
    卵アルブミンプロモーター、ヒトβグロビンプロモータ
    ー、ラウス肉腫ウィルスＬＴＲプロモーターである第（
    １）項〜第（５）項のいずれかに記載の方法。
  7. （７）真核生物性プロモーターがアデノウィルス−２後
    期プロモーターである第（６）項記載の方法。
  8. （８）即時型遺伝子産物の発現をコードしているＤＮＡ
    が組換えＤＮＡベクター中に含まれている第（１）項〜
    第（７）項のいずれかに記載の方法。
  9. （９）タンパク質Ｃを産生させるための方法であって、
    プラスミドｐＬＰＣＥ１ＡまたはｐＬＰＣＥ１Ａ１で形
    質転換した真核生物細胞を培養することからなる第（８
    ）項記載の方法。
  10. （１０）ベクターが真核生物性プロモーター、ＢＫエン
    ハンサーおよび有用な物質をコードしているＤＮＡ配列
    を含有するものである第（１）項〜第（７）項のいずれ
    かに記載の方法。
  11. （１１）タンパク質Ｃを産生させるための方法であって
    、アデノウィルス、およびプラスミドｐＬＰＣ、ｐＬＰ
    Ｃ４、ｐＬＰＣ５、ｐＬＰＣｈｙｇ１、ｐＬＰＣｈｙｇ
    ２、ｐＬＰＣｄｈｆｒ１、ｐＬＰＣｄｈｆｒ２、ｐＬＰ
    Ｃｈｄ１またはｐＬＰＣｈｄ２で形質転換した真核生物
    細胞を培養することからなる第（１０）項記載の方法。
  12. （１２）改良型組織プラスミノーゲン活性化因子を産生
    させるための方法であって、アデノウィルス、およびプ
    ラスミドｐＢＬＴｈｙｇ１、ｐＢＬＴｈｙｇ２、ｐＢＬ
    Ｔｄｈｆｒ１、ｐＢＬＴｄｈｆｒ２またはｐｈｄＭＴＰ
    Ａで形質転換した真核生物細胞を培養することからなる
    第（１０）項記載の方法。
  13. （１３）組織プラスミノーゲン活性化因子を産生させる
    ための方法であって、アデノウィルスおよびプラスミド
    ｐｈｄＴＰＡで形質転換した真核生物細胞を培養するこ
    とからなる第（１０）項記載の方法。
  14. （１４）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
    ーゼを産生させるための方法であって、アデノウィルス
    、およびプラスミドｐＢＬｃａｔ、ｐＢＫｃａｔまたは
    ｐＳＢＬｃａｔで形質転換した真核生物細胞を培養する
    ことからなる第（１０）項記載の方法。
  15. （１５）真核宿主細胞がアデノウィルスで形質転換した
    ヒト胎児腎細胞またはサル腎細胞である第（１０）項〜
    第（１４）項のいずれかに記載の方法。
  16. （１６）真核生物性プロモーター、該プロモーターを刺
    激するように配置したＢＫウィルスエンハンサー、該プ
    ロモーターから発現されるように配置した機能的なポリ
    ペプチドをコードしているＤＮＡ配列、および大きいＤ
    ＮＡウィルスの即時型遺伝子産物をコードしているＤＮ
    Ａ配列を含有する組換えＤＮＡベクター。
  17. （１７）プラスミドｐＬＰＣＥ１ＡまたはｐＬＰＣＥ１
    Ａ１である第（１６）項記載のベクター。
  18. （１８）プラスミドｐＢＬｃａｔ、ｐＳＢＬｃａｔ、ｐ
    ＬＰＣ、ｐＬＰＣ４、ｐＬＰＣ５、ｐＬＰＣｈｙｇ１、
    ｐＬＰＣｈｙｇ２、ｐＬＰＣｄｈｆｒ１、ｐＬＰＣｄｈ
    ｆｒ２、ｐＬＰＣｈｄ１、ｐＬＰＣｈｄ２、ｐＢＬＴｈ
    ｙｇ１、ｐＢＬＴｈｙｇ２、ｐＢＬＴｄｈｆｒ２、ｐｈ
    ｄＴＰＡまたはｐｈｄＭＴＰＡである組換えＤＮＡベク
    ター。
  19. （１９）ＤＮＡ配列： 【遺伝子配列があります】 ［配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
    ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジル、およびＲは
    上記ＤＮＡ配列に相補的なデオキシリボ核酸配列、すな
    わちＡに対してはＴ、Ｔに対してはＡ、Ｇに対してはＣ
    、およびＣに対してはＧが対応している配列である］ で示されるＢＫエンハンサー−アデノウィルス後期プロ
    モーターを含有するＤＮＡ化合物。
  20. （２０）第（１９）項記載のＤＮＡ化合物を含有する組
    換えＤＮＡ発現ベクター。
  21. （２１）プラスミドｐｈｄである第（２０）項記載の組
    換えＤＮＡ発現ベクター。
  22. （２２）第（１６）項−第（１８）項のいずれかに記載
    のベクターで形質転換した真核宿主細胞。
  23. （２３）アデノウィルスで形質転換した、ヒト胎児腎細
    胞またはサル腎細胞である第（２２）項記載の真核宿主
    細胞。
  24. （２４）真核生物性プロモーターと関連しているＢＫエ
    ンハンサーの活性を増加させるための方法であって、プ
    ロモーターがＳＶ４０初期プロモーターではないという
    限定のもと、真核生物性プロモーターのＣＡＡＴ領域の
    ５′末端から上流側０−３００ヌクレオチドの範囲内に
    該エンハンサーを配置することからなる方法。
  25. （２５）真核生物性プロモーターがアデノウィルス後期
    プロモーターである第（２４）項記載の方法。
  26. （２６）第（２４）項または第（２５）項の方法によっ
    て調製したＤＮＡ化合物。
  27. （２７）ＤＮＡ配列： 【遺伝子配列があります】 ［配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
    ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジル、およびＲは
    上記ＤＮＡ配列に相補的なデオキシリボ核酸配列、すな
    わちＡに対してはＴ、Ｔに対してはＡ、Ｇに対してはＣ
    、およびＣに対してはＧが対応している配列である］ で示される第（２６）項記載のＤＮＡ化合物。
  28. （２８）第（２７）項記載のＤＮＡ化合物を含有する組
    換えＤＮＡ発現ベクター。
  29. （２９）プラスミドｐＢａ１８ｃａｔまたはｐＢＬＴで
    ある第（２８）項記載のベクター。
  30. （３０）真核生物性プロモーターおよび該プロモーター
    から発現させるように配置した機能的なポリペプチドを
    コードしているＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡベク
    ターで真核宿主細胞を形質転換し、該ベクターを含有す
    る細胞を機能的なポリペプチドの発現に適した条件下で
    培養することからなる、真核宿主細胞において機能的な
    ポリペプチドを産生させるための方法であって、ｍＲＮ
    Ａがアデノウィルスの完全な３分節リーダーを含有しな
    いという限定のもと、 （ａ）アデノウィルスの３分節リーダーの最初の部分を
    コードしているＤＮＡを、転写によって生成したｍＲＮ
    Ａが機能的なポリペプチドをコードし、そしてその５′
    末端に３分節リーダーの最初の部分を含有するように該
    ベクターに導入し、（ｂ）工程（ａ）のベクターを含有
    している細胞に、アデノウィルスのＶＡ遺伝子産物の発
    現をコードしているＤＮＡ配列を付与し、そして （ｃ）ＶＡ遺伝子産物の発現およびｍＲＮＡの翻訳の刺
    激に適した条件下で工程（ｂ）の細胞を培養することか
    らなる方法。
  31. （３１）ｍＲＮＡに含まれる３分節リーダーの最初の部
    分が配列： 【遺伝子配列があります】 ［配列中、Ａはリボアデニル、Ｇはリボグアニル、Ｃは
    リボシチジルおよびＵはウラジルである］で示されるも
    のである第（３０）項記載の方法。
  32. （３２）適当な発現条件下で組換えＤＮＡベクターを含
    有する真核宿主細胞を培養したときに発現されるように
    該ベクター中にコードされているタンパク質であって、
    天然にγカルボキシル化され、正しく折りたたまれ、そ
    してプロセッシングされているタンパク質を産生させる
    に当たり、 （ａ）該ベクターを、アデノウィルスで形質転換したヒ
    ト胎児腎細胞に導入し、そして （ｂ）工程（ａ）の宿主細胞を、カルボキシル化のため
    のビタミンにを十分に含有する培地において、増殖条件
    下で培養することからなる方法。
  33. （３３）アデノウィルスで形質転換したヒト胎児腎細胞
    セルラインが２９３セルラインである第（３２）項記載
    の方法。
  34. （３４）プラスミドｐＢＫＥ１、ｐＢＫＥ２、ｐＢＫｎ
    ｅｏ１、ｐＢＫｎｅｏ２、ｐＢＷ３２ｄｅｌ、ｐＴＰＡ
    ６０１、ｐＴＰＡ６０２、ｐＴＰＡ６０３、ｐＭＴＰＡ
    ６０３、ｐＢＫｃａｔ、またはｐＬＰｃａｔである組換
    えＤＮＡベクター。
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