JP3004660B2 - 真核性発現の改良 - Google Patents

真核性発現の改良

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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物の
存在下でポリ−GT要素を用いて真核宿主細胞における組
換え遺伝子の転写を増強させる方法に関する。本明細書
に例示したポリ−GT要素は化学的に合成される（原型の
ポリ−GT要素を後記実施例１に示した）。発現ベクター
に挿入されたとき、原型（プロトタイプ）のポリ−GT要
素は21個の繰返しGT単位を含有している。しかし、化学
的に合成した配列またはヒトゲノム配列を含む、長さの
異なる繰返し単位を含む多種多様のポリ−GT要素が、本
発明で用いるのに適していることは当業者の認めるとこ
ろであろう。本発明においてエンハンサー要素をポリ−
GT要素とともに用いて転写をさらに増強することもでき
る。ある種の構築物においてはポリ−GT配列はBKエンハ
ンサー結合している。BKエンハンサーは繰返し配列から
なる明確にされているDNAセグメントである（原型のBK
エンハンサーおよび変異型のBKエンハンサーを後記実施
例18に示した）。しかし、多種多様のBKエンハンサー変
異体（すべてが、異なった繰返し配列からなる訳ではな
い）が当分野で知られており、ポリ−GT要素とともに本
発明で用いるのに適している。
［従来の技術］ 交互の配列ポリ（dT−dG）・ポリ（dC−dA）は真核性
ゲノム中で繰返し性の高い配列であり、左回転またはＺ
−DNAを形成することができる［ハマダおおよびカクナ
ガ（Hamada and Kakunaga,1982,Nature 298:396−39
8）；ハマダら（Hamada）,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 79:6465−6469］。例えば、ヒトゲノムは、約100,000
コピーのランダムに分布しているポリ（dT−dG）・ポリ
（dC−dA）の20〜60塩基対（bp）区域を含有している
［ハマダら（Hamada,1984,Mol.Cell.Biol.4:2610−262
1）］。ハマダら［Hamada,1984,Mol.Cell.Biol.4:2622
−2630］は、ポリ（dT−dG）・ポリ（dC−dA）がSV40初
期プロモーターに、およびクロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（CAT）の暗号配列に結合してい
るときには、ポリ（dT−dG）・ポリ（dC・dA）それ自体
がCAT発現のエンハンサーとして作用しうることを明ら
かにした。ハマダら（上記）によると、SV40初期プロモ
ーターと共にあるポリ（dT−dG）・ポリ（dC−dA）のエ
ンハンサー様の活性はSV40初期プロモーターと共にある
SV40エンハンサーの活性に比べかなり弱いものであり、
そして多数のウイルスエンハンサーとは異なり、このポ
リ（dT−dG）・ポリ（dC−dA）はサル（CV−１）または
ヒト（HeLa）において等しく活性であった。
本明細書に例示したBKエンハンサー配列は、免疫抑制
されている患者の尿から初めて単離されたヒトパポバウ
イルス、BKウイルスから得られる。BKウイルスは明確で
はない幼時感染の原因ではないと疑われており、ヒトの
いる処に普遍的に存在している。BKウイルスはヒト細胞
中で最もよく増殖するが、このウイルスは多数の非霊長
類細胞中で不稔サイクルを経、インビトロで齧歯類細胞
を形質転換し、ハムスターにおいて腫瘍を誘導する。BK
ウイルスはSV40に極めて似ているが、これら２種類のパ
ポバウイルスSV40およびBKのエンハンサー配列はそのヌ
クレオチド配列が実質的に異なっている。BKウイルス
（〜5.2kb）の完全なヌクレオチド配列は、セイフら（S
eif et al.,1979,Cell 18:963）、並びに、ヤングおよ
びウー（Yang and Wu,1979,Science 206:456）が開示し
ている。原型のBKウイルスは、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション［ATCC;American Type Culture
Collection,12301 Parklawn Dr.,Rockville,MD 20852
−1776］から、取得番号ATCC VR−837のもとで入手でき
る。原型BKウイルス制限部位および機能地図を添付の第
１図に示す。
エンハンサー要素は、エンハンサー要素の位置および
配向に比較的依存することなく、そのプロモーターから
の隣接遺伝子の転写レベルを増加させるシス作用性の要
素である。事実、コウリーおよびグラス［Khoury and G
russ,1983,Cell 33:313］は、「真核性遺伝子の上流、
その内部、または下流で機能するエンハンサー配列の顕
著な能力はそれを古典的なプロモーター要素と区別する
ものである・・・」と述べ、ある種の実験結果が「エン
ハンサーはかなりの距離（おそらく、＞10kb）を越えて
作用することができる」ことを示すと示唆している。
［発明が解決しようとうる課題］ 本発明は新規エンハンサー系を教示するものである。
これは、ポリ−GT要素が、アデノウイルス後期プロモー
ターなどのある種のプロモーターと組合わせて設置され
たときには、E1A遺伝子産物などのトランス作用性の初
期ウイルス遺伝子産物の存在下でだけエンハンサーとし
て機能するからである。BKエンハンサーなどの他のエン
ハンサー要素を、本発明においてポリ−GT要素とともに
用いてもよい。特に本発明は、シス−作用性のポリ−GT
要素と大きいDNAウイルスのトランス−作用性の即時型
遺伝子産物が組合わさって存在するときにだけ予想外に
転写を増加させることになる、アデノウイルス後期プロ
ーモーターのためのエンハンサー系を教示するものであ
る。即ち、ポリ−GT要素からのエンハンサー活性を活性
化するためにウイルス性のトランス−作用性のタンパク
質が必要とされる。このことは、SV40初期プロモーター
を用いてポリ−GT配列が単独でCAT遺伝子産物の発現を
増強することができるハマダら（上記）のエンハンサー
系とは極めて対照的である。本発明においては、別のエ
ンハンサー要素をポリ−GT要素およびトランス−作用性
ウイルス遺伝子産物とともに用いて、転写、即ち有用な
遺伝子産物の発現をさらに増強することができる。
BKエンハンサーをポリ−GT要素とともに用いるときに
は、有用な物質をコードしているDNA配列を転写させる
ためにBKエンハンサーと直列で用いられる真核性プロモ
ーターの「CCAAT」領域の５′側のすぐ上流にBKエンハ
ンサーを設置すると、さらに高い転写の増加が得られ
る。このCCAAT領域あるいは「すぐ上流の領域」あるい
は「−80相同配列」は、転写活性のための配列が詳しく
調べられているプロモーターで観察されるヌクレオチド
保存領域であるシス−作用性の上流要素である。CCAAT
領域は、すべてではないが多数のプロモーターで見い出
されている。他のプロモーターにおいて、等価なシス−
作用性上流配列が見い出されており、これらにはSP1結
合部位、ATF結合部材、オクタ配列、核因子１結合部位
（CCAAT転写因子と同じ結合部位であることもある）、A
P1およびAP2相同、グルココルチコイド応答要素、およ
び熱ショック応答要素が含まれる。最近になって、上に
挙げた配列を含む現在既知の上流配列を包括的に編纂し
たものが公表された［ウィンゲンダー（Wingender,198
8,Nucl.Acids Res.16:1879−1912）］。アデノウイルス
主後期プロモーターで等価なCCAAT領域は、上流転写因
子（UTF）または主後期転写因子（MLTF）結合部位であ
る（CAP部位の上流のおよそのヌクレオチド−50〜−6
5）。CCAAT配列は転写効率を媒介し、ごく僅かの例外を
除いてプロモーターの長さを短くすることなく削除する
ことができない。
エンハンサー要素は、ネズミポリオーマウイルス、パ
ピローマウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、
肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイル
ス、パポバウイルス類、例えばSV40およびBKを含む多数
のウイルスのDNA中で、および多数の非ウイルス性遺伝
子、例えば免疫グロブリン遺伝子のイントロン中で同定
されている。エンハンサー要素は多種多様の他の生物の
DNA中に存在することもある。エンハンサー要素は別の
宿主細胞中では異なって機能することが多く、この細胞
特異性は遺伝子の発現中にエンハンサー要素と相互作用
する宿主遺伝子産物の差異によるものとすることができ
る。
エンハンサー要素の活性は、宿主細胞に存在するウイ
ルス性の遺伝子産物によって影響される。ベルチヒおよ
びジッフ［Velcich and Ziff,1983,Cell 40:705］；ボ
レリら［Borrelli et al.,1984,Nature 312:608］；お
よびヘンら［Hen et al.,1985,Science 230:1391］は、
アデノウイルス−２初期領域1A（E1A）遺伝子産物がSV4
0、ポリオーマウイルス、マウス免疫グロブリン遺伝子
およびアデノウイルス−2 E1Aエンハンサーによって誘
導される転写の活性を抑制すると記している。このE1A
による作用は宿主細胞依存性である。従って、エンハン
サーを利用して組換え遺伝子の転写を増加させる真核性
発現ベクターは、E1A含有宿主細胞においてエンハンサ
ーを含まないベクターよりも良好に作動するとは予測さ
れなかった。エンハンサーを用いる上記の従来法とは著
しく対照的に、欧州特許公開EPA 0 245 949（出願No.87
303083.7;1987年11月19日公開）はBKウイルスエンハン
サー要素を用いる方法を教示しているが、この方法はE1
A遺伝子産物または大きいDNAウイルスの同様の即時型遺
伝子産物を用いて遺伝子発現を最大にすることからな
る。即ち、欧州特許公開EP A 0 245 949は、DNAの転写
を促進するBKエンハンサーの能力があらゆるアデノウイ
ルスのE1A遺伝子産物存在下で増強されることを初めて
示すものである。
［課題を解決するための手段］ ここに、ポリ−GT要素をBKエンハンサーとともに用い
てあらゆるアデノウイルスのE1A遺伝子産物の存在下でD
NAの転写をさらに増強することができることを予想外に
見い出した。アデノウイルス後期プロモーターを用いて
転写させると、驚くべきことに、ポリ−GT要素はそれ自
体は転写を増強はしないが、E1A遺伝子産物または大き
いDNAウイルスの同様の即時型遺伝子産物の存在下でだ
け活性化され、エンハンサー活性を示す。E1A遺伝子産
物は、試験されたほとんどのエンハンサーによる転写の
活性化を抑制することがわかっていたので、E1Aがポリ
−GT要素のエンハンサー様活性を活性化する能力を有し
ていることは予想外のことであった。E1A遺伝子産物
（実際にはE1A遺伝子は２種類の産物を産生するが、本
明細書ではこれらを一括して「E1A遺伝子産物」と呼
ぶ）は、大きいDNAウイルスであるアデノウイルス由来
のこのような即時型遺伝子産物の１つである。本発明
は、大きいDNAウイルスのあらゆる即時型遺伝子産物ま
たはE1A遺伝子産物と同様に機能するあらゆるレトロウ
イルス性タンパク質産物を用いて、BKエンハンサーなど
の別のエンハンサー要素なしで、またはそれとともにポ
リ−GT要素の活性を増強することを包含している。単純
疱疹ウイルスICP4タンパク質［デルカら（DeLuca et a
l.,1985,Mol.Cell.Biol.5:1997−2008）が記載］、仮性
狂犬病ウイルスIEタンパク質［フェルドマンら（Feldma
n et al.,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:4952−495
6）が記載］、サイトメガロウイルスIEタンパク質［テ
ベチアら（Tevethia et al.,1987,Virology 161:276−2
85）が記載］、およびアデノウイルスのE1Bタンパク質
がすべて、E1Aタンパク質と同様の機能を有する大きいD
NAウイルスの即時型遺伝子産物である。従って、本発明
の方法は、E1Aタンパク質の存在下または非存在下で、I
CP4、IEもしくはE1Bタンパク質、または同様に作用する
他のあらゆる即時型遺伝子産物を用いて、ポリ−GT要素
由来のエンハンサー様活性を生み出すか、または活性化
することを含んでいる。さらに、HIVウイルスのTAT遺伝
子産物またはその他のレトロウイルス性タンパク質など
の他のトランス−作用性ウイルスタンパク質もポリ−GT
要素を活性化する方法において有用である。
本発明は、転写を増加させる目的で、即ち真核宿主細
胞中で組換え遺伝子の発現を改善する目的で、大きいDN
Aウイルスの即時型遺伝子産物、例えばアデノウイルス
のE1A遺伝子産物、または同様に機能するウイルス性遺
伝子産物の存在下にポリ−GT要素を用いる方法に関す
る。本発明の別の重要な態様は、大きいDNAウイルスの
即時型遺伝子産物、例えばアデノウイルスのE1A遺伝子
産物の存在下で、ポリ−GT要素を真核性プロモーター、
例えばアデノウイルス後期プロモーター（MLP）ととも
に用いて、真核宿主細胞中で有用な産物を発現させる多
種の発現ベクターに関する。さらに、BKエンハンサーな
どのエンハンサー要素をポリ−GT要素とともに用いてそ
のような有用な産物の発現をさらに増強することもでき
る。これらの発現ベクターの多くはポリGT−アデノウイ
ルス後期プロモーターカセットを含有しており、これを
本発明方法で用いる他のベクターに容易に移すことがで
きる。このカセットはBKエンハンサーなどのエンハンサ
ー要素をさらに含有していてもよい。本発明ベクターが
多用途であることは、これらのベクターによって成され
るクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、
プロテインＣ、組織プラスミノーゲン活性化因子、修飾
型組織プラスミノーゲン活性化因子、あるいはインター
フェロン（α、β、γインターフェロン）などの多様な
タンパク質の高レベルの発現によって示される。
エンハンサー要素が遠位から転写を増強することがで
きること、およびその活性がその配向に依存しないとい
うことがエンハンサー要素の特徴である。このことと合
致して、本発明のポリ−GT要素は、発現させようとする
構造遺伝子の５′または３′に設置されていてよい。従
って、本発明の一部の組換えDNA発現ベクターの構築に
おいては、ポリ−GT要素は、組換えDNA発現ベクター上
の組換え遺伝子を発現させるように設置されているアデ
ノウイルス後期プロモーターの上流に設置した。また、
このような構築の一部においては、BKエンハンサー要素
をポリ−GT要素の上流に設置した。本発明の他の組換え
DNA発現ベクターの構築においては、ポリ−GT要素は発
現させようとする構造遺伝子の３′末端に設置し、他の
エンハンサー要素について記されているように、ポリ−
GT要素は種々の位置および配向で機能しうることが示さ
れた。
本発明を実施すると、アデノウイルス形質転換した細
胞におけるヒトプロテインＣの発現が増強されることに
なる。このような細胞はヒトプロテインＣなどの完全に
γ−カルボキシル化されたタンパク質を産生させるため
の特に好ましい宿主である。従って、本発明の別の態様
はγ−カルボキシル化されたタンパク質を製造するため
の改良法からなる。本発明のさらに別の重要な態様は、
（ａ）近接の真核性プロモーターに関連させてBKエンハ
ンサーを設置し、（ｂ）このような発現ベクター中にポ
リ−GT要素を設置し、そして（ｃ）大きいDNAウイルス
の即時型遺伝子産物またはE1A遺伝子産物と同様に機能
するあらゆるウイルス性遺伝子産物でポリ−GT要素（お
よびBKエンハンサー）を活性化することによって有用な
遺伝子産物の発現を一層増加させる方法に関する。第１
段階では、BKエンハンサーをMLTF結合部位に極めて近接
させて設置する酵素処理によってこれら誘導体を構築し
た。これらの修飾されたBKエンハンサー−アデノウイル
ス後期プロモーター配列を発現ベクターに導入し、次い
でこれを用いて真核宿主細胞中で有用な遺伝子産物を発
現させると、このような設置を欠く構築物と比較したと
き、発現レベルの劇的な増加が観察された。第２段階で
は、有用産物をコードしている遺伝子の３′末端にどち
らかの配向でポリ−GT要素を設置することによりこれら
の誘導体をさらに構築した。ポリ−GT要素を欠く構築物
と比較すると、発現レベルの一層の増加が観察された。
即ち、本発明は、真核性プロモーターのCCAAT領域また
はCCAAT領域等価域の５′末端のすぐ上流０〜約300ヌク
レオチド以内にBKエンハンサーを設置して近接の真核性
プロモーターに関連しているBKエンハンサーの活性を増
強し、そしてその位置および配向には無関係のポリ−GT
要素をE1A遺伝子産物で活性化することによって、有用
な遺伝子産物の発現を一層増加させる方法を提供するも
のである。
本発明のさらに別の態様は、アデノウイルスの３倍構
成リーダー（TPL）配列の一部が導入されたある種の発
現ベクター中にポリ−GT要素を導入することによって、
本明細書に記したベクターにコードされている組換え産
物の発現を増加させる試みから派生する。TPL配列がそ
のような発現ベクター中にポリ−GT要素とともに導入さ
れ、アデノウイルスのE1A遺伝子産物の存在下でポリ−G
T要素が活性化されると、発現が増強される。アデノウ
イルスのVA遺伝子産物の存在下では、TPL含有ベクター
での一層の発現の増強が得られる。
本発明のために以下の語句を定義する。
抗生物質：天然に、または限定された化学的修飾の後
に、他の微生物または真核細胞の増殖を抑制するか、ま
たはこれらを死滅させる微生物によって産生される物
質。
抗生物質耐性付与遺伝子：ある抗生物質に対する耐性
を付与する活性をコードしているDNAセグメント。
ApR:アンピシリン耐性の表現型またはそれを付与する
遺伝子。
クローニング：組換えDNAクローニングベクターにDNA
のセグメントを導入する過程。
CmR:クロラムフェニコール耐性の表現型またはそれを
付与する遺伝子。
E1A:ポリ−GT要素を活性化してエンハンサー活性を発
現することができるアデノウイルスの即時型遺伝子産
物。
ep:T−抗原遺伝子のSV40初期プロモーター、Ｔ−抗原
結合部位、およびSV40の複製起源を含有するDNAセグメ
ント。
真核性プロモーター：真核細胞中でプロモーターとし
て機能するあらゆるDNA配列。
GTエンハンサー系:MLPなどのプロモーターに関連した
あらゆるポリ−GT要素であって、ポリ−GT要素がそれ自
体はエンハンサー活性を有してしないが、大きいDNAウ
イルスの即時型遺伝子産物、例えばE1A遺伝子産物によ
ってエンハンサーとして活性化される要素、または同様
の活性化を行うあらゆるウイルス性遺伝子産物によって
活性化される要素。
HmR:ハイグロマイシン耐性の表現型またはそれを付与
する遺伝子。
IVS:イントロンをコードしているDNAであり、介在配
列とも呼ばれる。
大きいDNAウイルス：真核細胞に感染し、大きさが〜1
0kb以上のゲノムを有するウイルス、即ち、あらゆるポ
ックスウイルス類、アデノウイルス類、およびヘルペス
ウイルス類。
MLP:アデノウイルスの主後期プロモーターであり、本
明細書ではアデノウイルス後期プロモーター、アデノウ
イルス−２型後期プロモーター、あるいはAd2後期プロ
モーターと呼ぶこともある。
MLTF結合部位：主後期転写因子（MLTF）が結合するア
デノウイルスDNA中の部位；このMLTFはMLP活性に必要と
される。
NeoR:ネオマイシン耐性を付与する遺伝子であり、こ
れを用いて真核宿主細胞にG418耐性を付与することもで
きる。
ori:プラスミドの複製起源。
pA:ポリアデニル化シグナルをコードしているDNA配
列。
ポリ−GT要素：本明細書においてｎが21である配列で
示されている（GT）ｎ−（CA）ｎのDNA配列であるが、
ｎが21より大きいかまたは小さい長さの異なる配列を指
すこともある。また、化学的に合成した（GT）ｎ−（C
A）ｎ配列または（GT）ｎ−（CA）ｎ部分を含むヒトゲ
ノムDNAフラグメントを指すこともある。
プロモーター:DNAをRNAに転写させるDNA配列。
組換えDNAクローニングベクター:1またはそれ以上の
別のDANセグメントを付加したか、または付加すること
ができるDNA分子を含有するあらゆる自律的に複製する
か、または組込まれる媒体。
組換えDNA発現ベクター：有用な産物をコードしてい
るDNA配列を挿入して発現させることが可能な、プロモ
ーターおよび関連の挿入部位を含有するあらゆる組換え
DNAクローニングベクター。
組換えDNAベクター：あらゆる組換えDNAクローニング
ベクターまたは発現ベクター。
レプリコン：組換えDANベクターの複製を支配してい
るあらゆるDNA配列。
制限フラグメント:1またはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成したあらゆる線状DNA。
rRNA:リボソーム性リボ核酸。
感受性宿主細胞：ある抗生物質または他の毒性化合物
の存在下ではそれらに対する耐性を付与するDANセグメ
ントなしでは増殖することができない宿主細胞。
構造遺伝子：開始および停止コドンをコードしている
DNAを含む、ポリペプチドをコードしているあらゆるDNA
配列。
TAT:トランス−作用性のウイルスタンパク質としての
活性を有するレトロウイルスHIVの遺伝子産物。
TcR:テトラサイクリン耐性の表現型またはそれを付与
する遺伝子。
形質転換体：形質転換を受けた受容宿主細胞。
形質転換：受容宿主細胞へのDNAの導入。
tRNA:転移リボ核酸。
第１図は、BKウイルスの制限部位および機能地図を示
す模式図であり、 第２図は、プラスミドpBKneo1の制限部位および機能
地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドpSV2catの制限部位および機能
地図を示す模式図であり、 第４図は、プラスミドpLP（GT）catの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第５図は、プラスミドpBL（GT）catの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第６図は、プラスミドpSBL（GT）catの制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第７図は、プラスミドpL133の制限部位および機能地
図を示し、その構築を示す工程図であり、 第８図は、プラスミドpLPC（GT）の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第９図は、プラスミドpLPC4（GT）の制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第10図は、プラスミドpSV2hygの制限部位および機能
地図を示す模式図であり、 第11図は、プラスミドpLPChyg1（GT）の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第12図は、プラスミドpBW32の制限部位および機能地
図を示し、その構築を示す工程図であり、 第13図は、プラスミドpLPChd1（GT）の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第14図は、プラスミドphd（GT）の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第15図は、プラスミドpLPCE1A（GT）の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第16図は、プラスミドpBLT（GT）の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第17図は、プラスミドpBLThyg1（GT）の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第18図は、プラスミドpBLTdhfr1（GT）の制限部位お
よび機能地図を示す模式図であり、 第19図は、プラスミドpTPA603の制限部位および機能
地図を示す模式図であり、 第20図は、プラスミドphd（GT）TPAの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第21図は、プラスミドphd（GT）MTPAの制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第22図は、プラスミドpBal8cat（GT6）の制限部位お
よび機能地図を示す模式図であり、 第23図は、プラスミドpSV2E1Aの制限部位および機能
地図を示す模式図であり、 第24図は、プラスミドpT6hd（GT）の制限部位および
機能地図を示す模式図である。
これらの図面は本発明の理解を助けるためのものであ
る。図は記載したプラスミドをほぼ正確に縮尺して描い
ている。明示されている制限部位以外の制限部位がプラ
スミドに存在していることもある。
本発明は、真核性プロモーター、該プロモーターを刺
激するように設置されたポリ−GT要素、および該プロモ
ーターから発現されるように設置された有用な物質をコ
ードしているDNA配列を含有する組換えDNAベクターで真
核宿主細胞を形質転換し、該ベクター含有細胞を該有用
物質の発現に適した条件下で培養することにより、真核
宿主細胞において有用な物質を産生させる改良方法であ
って、改良が （ａ）大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物の発現を
コードしているDNA配列を細胞に付与し、そして （ｂ）工程（ａ）の細胞を該即時型遺伝子産物の発現お
よび該ポリ−GT要素活性の刺激に適した条件下で培養す
ること、 からなる方法に関する。当業者なら、多数の樹立セルラ
インが大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物を発現す
ること、およびそのようなセルラインが本発明方法にお
いて特に有用であることを認識している。従って、本発
明は、真核性プロモーター、該プローモーターを刺激す
るように設置されたポリ−GT要素、および該プロモータ
ーから発現されるように設置された有用な物質をコード
しているDNA配列を含有する組換えDNAベクターで真核宿
主細胞を形質転換し、該ベクター含有細胞を該有用物質
の発現に適した条件下で培養することにより、真核宿主
細胞において有用な物質を産生させる改良方法であっ
て、改良が （ａ）大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物を発現す
る真核宿主細胞に該ベクターを挿入し、そして （ｂ）工程（ａ）の細胞を該即時型遺伝子産物の発現お
よび該ポリ−GT要素活性の刺激に適した条件下で培養す
ること、 からなる方法をも包含するものである。
本発明の重要な態様は、アデノウイルス−２後期プロ
モーターとともにポリ−GT要素を含有する新規な一群の
発現ベクターである。この本発明の発現ベクターは、他
のベクター中の、E1A遺伝子産物によるポリ−GT要素の
活性化によって発現を増強するための適切な位置に、有
用な産物をコードしているDNA分子を容易に挿入する
か、または挿入しうるようにして構築した。さらに、
「カセット」が得られるようにポリ−GT要素と真核性プ
ロモーターを組み立てた。このカセットは、発現ベクタ
ーから比較的小さい制限フラグメントとして単離するこ
とができ、多種の発現ベクター間を容易に往復させるこ
とができる。このカセットはポリ−GT要素に加えてエン
ハンサー要素、例えばBKエンハンサーなどを含んでいて
もよい。本明細書中に具体的に例示した発現ベクター
は、本発明方法においてE1A遺伝子産物の存在下で転写
を行わせる、ポリGT−BKエンハンサー−真核性プロモー
ターカセットにおいてアデノウイルス−２後期プロモー
ターを利用している。
ポリ−GT要素の構築に用いる１本鎖のDNAフラグメン
トは、DNAシンセサイザーを用いて化学的に合成した。
多数のDNA合成装置が当分野で知られており、１本鎖の
フラグメントの合成に用いることができる。次いで、こ
の１本鎖フラグメントをアニーリングしてポリ−GT要素
を得る。ポリ−GT要素は（GT）ｎ−（CA）ｎのDNA配列
であり、これを本明細書ではｎが21である配列として例
示しているが、ｎが21よりも大きいかまたは小さい長さ
の異なる配列をも指している。このような配列を化学的
に合成してもよいし、また、ヒトゲノムのDNAフラグメ
ントであってもよい。原型（プロトタイプ）のポリ−GT
要素の配列を実施例１に示した。この示されているポリ
−GT要素はBamH IおよびXho I部位を有しており、従っ
て種々の発現ベクターのBamH IまたはXho I部位に都合
よく挿入することができる。合成のポリ−GT要素が、こ
のポリ−GT要素をあらゆる発現ベクター中に容易に挿入
することが可能なようにするため、BamH IまたはXho I
以外の制限酵素認識部位用の配列を含んでいてもよいこ
とは当業者の認めるところであろう。別法によれば、ポ
リ−GT要素において利用可能な制限酵素認識部位とは関
係なく、このポリ−GT要素をあらゆる適当な発現ベクタ
ー中に平滑末端ライゲート（連結）によって挿入するこ
ともできる。
BKウィルスは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ATCC）（American Type Culture Collecti
on,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852）から取
得番号ATCC VR−837のもとでだれでも入手することがで
きるし、購入することもでき、実施例２記載のようにし
て、BKウイルス配列の供給源、特にBKエンハンサーの供
給源として用いるために、容易かつ大量に単離すること
ができる。また、BKウイルス性DNAをプラスミドクロー
ニングベクターにクローンするのに、およびこの組換え
ベクターをBKウイルス性DNA配列の供給源として用いる
のにも都合がよい。従って、BKウィルスゲノムをプラス
ミドpdBPV−MMTneoの一部と合体させてプラスミドpBKne
o1およびpBKneo2を構築した。プラスミドpdBPV−MMTneo
（大きさが約15kbであり、ATCCから取得番号ATCC 37224
のもとで入手可能）は、プラスミドpBR322由来のレプリ
コンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性
付与酵素をコードしている構造遺伝子を発現させるよう
に設置されているマウス メタロチオネイン プロモー
ター、約8kbのウシ乳頭腫ウィルス（BPV）DNAを含有し
ている。プラスミドpdBVP−MMTneoを制限酵素BamH Iで
消化して２つのフラグメント、即ち、BPV DNAを含有す
る〜8kbのフラグメントおよびその他の上記配列を含有
する〜7kbのフラグメントを得ることができる。BKウィ
ルスはBamH I制限部位を１つだけ有しており、BamH Iで
直線化したBKウィルスDNAにプラスミドpdBPV−MMTneoの
〜7kb BamH I制限フラグメントをライゲート（連結）す
ることによってプラスミドpBKneo1およびpBKneo2を構築
する。BKウィルスDNAの配向だけが異なっているプラス
ミドpBKneo1およびpBKneo2の構築を実施例２で説明し、
プラスミドpBKneo1の制限部位および機能地図を添付の
第２図に示す。
プラスミドpBKneo1およびpBKneo2はエンハンサー配列
を含むBKウィルスの全ゲノムを含有しているので、BKエ
ンハンサーをも含有している本明細書中に記載したポリ
−GT含有発現ベクターの有用な出発物質となる。BKエン
ハンサーを含有していない他の発現ベクターも本発明に
おいて有用である。
発現ベクターの１つであるプラスミドpBLcatは、クロ
ラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ酵素
（CAT）を発現させるように設置されているヒトアデノ
ウィルス２型後期プロモーターに直列してBKエンハンサ
ー配列を含有している。プラスミドpSV2catはCAT遺伝子
の都合のよい供給源として有用であり、ATCCから取得番
号ATCC 37155のもとでだれでも入手することができる。
プラスミドpSV2catの制限部位および機能地図を添付の
第３図に示す。ヒトアデノウィルス２型DNAは市販品か
ら得ることができるし、また、ATCCから取得番号ATCC V
R−２のもとで一般に入手することもできる。BKエンハ
ンサーを含有していない別の発現ベクターであるプラス
ミドpLPcatはクロラムフェニコール アセチルトランス
フェラーゼを発現させるように設置されているヒトアデ
ノウィルス２型後期プロモーターを含有している。ポリ
−GT要素をpLPcatおよびpBLcatの両プラスミドに挿入し
てプラスミドpLP（GT）catおよびpBL（GT）catをそれぞ
れ創製した。
プラスミドpLPcatおよびpBLcatは次のようにして構築
した。ヒトアデノウィルス２型DNAの〜0.32kb後期プロ
モーター含有Acc I−Pvu II制限フラグメントを、平滑
末端にしたBcl Iリンカー（Acc I−Pvu II制限フラグメ
ントのPvu II末端にだけ結合する）にライゲートした。
得られたフラグメントをプラスミドpSV2catの〜4.51kb
Acc I−Stu I制限フラグメントにライゲートしてプラス
ミドpLPcatを得た。プラスミドpBLcatは、BKウィルスDN
Aの複製起源およびエンハンサー含有の〜1.28kb Acc I
−Pvu II制限フラグメントをプラスミドpLPcatの〜4.8k
b Acc I−Stu I制限フラグメントにライゲートすること
によって、プラスミドpLPcatから構築した。ポリ−GT要
素は次のようにしてプラスミドpLPcatおよびpBLcatに挿
入した。Xho Iリンカーを有するポリ−GT要素を、Xho I
消化のプラスミドpLPcatまたはpBLcatにライゲートして
プラスミドpLP（GT）catおよびpBL（GT）catをそれぞれ
創製した。プラスミドpLPcatの唯一のXho I部位はアデ
ノウイルス後期プロモーターの上流に位置している。pB
Lcatの唯一のXho I部位は、BKエンハンサーとアデノウ
イルス後期プロモーターの間に位置している。プラスミ
ドpLPcat、pLP（GT）cat、pBLcat、およびpBL（GT）cat
の構築を実施例４および５でさらに詳しく説明する。プ
ラスミドpLP（GT）catおよびpBL（GT）catの制限部位お
よび機能地図をそれぞれ添付の第４図および第５図に示
す。
プラスミドpBLcatはBKエンハンサー−アデノウイルス
後期プロモーター「カセット」の都合のよい供給源であ
る。このカセットは〜870bpのHind III制限フラグメン
トであり、これを好都合に真核性発現ベクター中に挿入
してこのベクターがコードしている産物の発現を増大さ
せることができる。プラスミドpBL（GT）catは、本発明
のポリGT−BKエンハンサー−アデノウイルス後期プロモ
ーターカセットの都合のよい供給源である。このポリ−
GT含有カセットは〜930bpのHind III制限フラグメント
であり、これを好都合に真核発現ベクター中に挿入し
て、大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物、例えばE1A
遺伝子産物の存在下に、このベクターがコードしている
有用な遺伝子産物の発現をさらに増大させることができ
る。プラスミドpSBLcatおよびpSBL（GT）catは上記のカ
セットを用いて調製することができる。プラスミドpSBL
catについては、プラスミドpSV2catを制限酵素Hind III
で消化し、BKエンハンサー−アデノウイルス後期プロモ
ーターカセットを挿入することによって行われる。得ら
れたプラスミド（プラスミドpSBLcatと命名）は、BKエ
ンハンサーと、さらにSV40複製起源、SV40初期プロモー
ター、およびSV40エンハンサーを含有しており、従って
これらの付加配列が削除されているプラスミドpBLcatと
は異なっている。直列のSV40エンハンサー−BKエンハン
サー−アデノウイルス主後期プロモーター（SBLプロモ
ーター）カセットをプラスミドpSBLcatからPvu II制限
酵素フラグメントとして切り出すことができ、これをあ
らゆる組換えDNA発現ベクター中に都合よく挿入するこ
とができる。
プラスミドpSBLcatは、E1A遺伝子産物が存在しない限
り、プラスミドpBLcatよりも高レベルでCATを発現させ
る。このE1A遺伝子産物の存在しないところでの発現の
増大は、一方がSV40由来であり、他方がBK由来である２
種類のエンハンサーがある種のセルラインにおいて隣接
プロモーターからの転写に加成的な増強作用を有してい
ることを示すものである。即ち、真核性プロモーターの
上流の直列のエンハンサー配列を、多種多様の哺乳動物
細胞における遺伝子の効率的発現のために用いることが
できる。E1A遺伝子産物の存在下では、プラスミドpBLca
tの方がプラスミドpSBLcatよりも高レベルでCATを発現
させるが、これはおそらくはSV40エンハンサーがE1A遺
伝子産物によって阻害されるからであろう。従って、E1
A遺伝子産物の存在下では、プラスミドpSBL（GT）catと
比較してpBL（GT）catの方が高レベルのCATを発現する
と予想される。しかしこれとは反対に、HeLa細胞におい
ては、SV40エンハンサーはアデノウイルス２の後期プロ
モーターからの転写を顕著に刺激したが、BKエンハンサ
ーはアデノウイルス２後期プロモーターからの転写を最
低レベルで刺激したにすぎなかった。HeLa細胞でのBK活
性の基礎レベルは非常に低いので、E1A遺伝子産物など
の大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物によるBK活性
の刺激は最適の発現レベルにまでは至らない。
ポリ−GT要素をBKエンハンサーとともに挿入してもHe
La細胞においては発現の増大には何の効果もないと考え
られる。HeLa細胞におけるこのBKエンハンサーの低レベ
ルの活性は、BKエンハンサーと相互作用するHeLa細胞に
存在するリプレッサー活性によるものと考えられる。こ
のHeLa細胞中のリプレッサー活性を、さらに高いコピー
数のBKエンハンサーをHeLa細胞中に導入することによっ
て滴定することができる。事実、HeLaセルラインにおい
ては、E1Aがリプレッサーのレベルを増加させることも
ある。しかし、HeLa細胞では直列のSV40エンハンサー−
BKエンハンサーを用いて最適の発現レベルを得ることが
できる。従って、この直列のエンハンサーは、HeLa細胞
におけると同様、ある種の宿主細胞において遭遇するこ
ともある細胞特異的なネガティブな相互作用を避けるの
に都合がよい。プラスミドpSBL（GT）catの制限部位お
よび機能地図を添付の第６図に示し、プラスミドpSBLca
tおよびpSBL（GT）catの構築を実施例６で説明する。
BKエンハンサー−アデノウイルス後期プロモーターカ
セットをヒトプロテインＣの発現に用いた。ポリGT−BK
エンハンサー−アデノウイルス後期プロモーターカセッ
トを本発明で用いてヒトプロテインＣの発現を改善し
た。上記カセットのどちらかをプラスミドpL133（米国
特許No.4,775,624;1988年10月４日発行）中にライゲー
トすることによって発現の増加を達成することができ
る。プラスミドpL133の制限部位および機能地図を添付
の第７図に示す。プラスミドpL133（その構築について
は実施例７に示す）を制限酵素Hind IIIで消化し、プラ
スミドpBLcatの〜0.87kb Hind III制限フラグメントに
ライゲートしてプラスミドpLPCを得た。ポリ−GT要素を
プラスミドpLPCの唯一のXho I部位に挿入してプラスミ
ドpLPC（GT）を得た。プラスミドpLPC（GT）の制限部位
および機能地図を添付の第８図に示し、プラスミドpLPC
およびpLPC（GT）の構築を実施例８でさらに詳しく説明
する。別法では、pL133をHind IIIで消化し、次にこれ
をpBL（GT）の〜0.93kb Hind IIIフラグメントとライゲ
ートすることによってプラスミドpLPC（GT）を調製す
る。
プラスミドpLPC（GT）およびpLPCは、プラスミドpL13
3と同様、SV40のエンハンサー、初期おおび後期プロモ
ーター、Ｔ−抗原結合部位、および複製起源を含有して
いる。従って、あらゆる組換え宿主細胞においてプラス
ミドpLPCまたはpLPC（GT）およびこれらの誘導体を用い
ることは、本明細書に記載した直列エンハンサー発現法
を例示するものである。プラスミドpLPCまたはpLPC（G
T）は、プラスミドpSBLおよびpSBL（GT）を含む本明細
書中で説明した多数のベクターの有用な出発物質とな
る。プラスミドpSBLおよびpSBL（GT）は、それぞれプラ
スミドpLPCおよびpLPC（GT）上のプロテインＣをコード
しているDNAを削除することによって構築することがで
きる。この削除は、単に、Bcl Iによる消化と自己ライ
ゲートによってプラスミドpLPCまたはpLPC（GT）の１個
のBcl I制限フラグメントを削除することを必要とする
にすぎない。得られたプラスミドpSBLまたはpSBL（GT）
は本明細書中で説明した直列エンハンサー法において用
いるのに都合のよい発現ベクターとして有用であるが、
これは、所望の暗号配列を唯一残存しているBcl I部位
に容易に挿入することができるからである。
プラスミドpLPCまたはpLPC（GT）に存在しているSV40
の調節要素は互いに密接して位置しており、正確に表す
のは困難である。Ｔ−抗原のＴ−抗原結合部位への結合
（これはSV40の複製に必要である）は、SV40後期プロモ
ーターからの転写を増強することが知られている。通
常、SV40の複製起源を含有しているプラスミドの高レベ
ルのＴ−抗原誘導の複製は宿主細胞にとって致死性であ
るので、SV40 T−抗原の存在下では、例えばプラスミド
pLPCおよびpL133はどちらも安定に保持されない。
BK調節領域の全体の構造はSV40のものとかなり類似し
ており、BKのエンハンサー、複製起源、初期および後期
プロモーター、並びにＴ−抗原結合部位のBK類似体につ
いてはすべて密接して位置しており、それぞれの機能領
域を他のものから分離するのは容易ではない。しかし、
BK T−抗原の存在下で生育させたときには、BKの複製起
源およびＴ−抗原結合部位を含有しているプラスミド
は、必ずしも致死となる量まで複製することがなく、エ
ピソーム性要素として宿主細胞中で安定に保持されう
る。さらに、Ｔ−抗原誘導の複製を利用して、BK複製起
源を含有するベクターのコピー数を増加させることがで
き、これにより、選択圧がかけられたときにはさらに多
くのプラスミドのコピーが宿主細胞の染色体DNA中に組
込まれるようにすることができる。BKおよびSV40 T−抗
原とそれらの各々の結合部位の間の構造−機能の類似関
係から明らかなように、BKの複製もSV40 T−抗原によっ
て刺激される。形質転換された真核細胞において安定に
保持される要素として存在しうるプラスミドpLPCの誘導
体を構築するため、完全なBKゲノムを、EcoR Iで直線化
した制限フラグメントとしてプラスミドpLPCの単一のEc
oR I制限部位に挿入した。この挿入により２種類のプラ
スミド（pLPC4およびpLPC5と命名）が得られたが、これ
らはBKのEcoR Iフラグメントの配向が異なっているだけ
である。プラスミドpLPC4およびpLPC5の構築を実施例9A
でさらに詳しく説明する。実施例9B記載のようにしてポ
リ−GT要素をプラスミドpLPC4またはpLPC5の唯一のXho
I部位に挿入して、それぞれプラスミドpLPC4（GT）およ
びpLPC5（GT）を創製した。プラスミドpLPC4（GT）の制
限部位および機能地図を添付の第９図に示す。
組換えDNA発現ベクターのエピソーム性の保持は、宿
主細胞染色体への組込みより常に好ましいとは限らな
い。しかし、真核細胞において機能する選択マーカーが
存在しないことから、プラスミドpLPCまたはpLPC（GT）
が選択マーカーを含有する別のプラスミドと同時形質転
換されるのでなければ、プラスミドpLPCまたはpLPC（G
T）の安定な真核性形質転換体を同定するのは困難であ
る。従って、プラスミドpLPCまたはプラスミドpLPC（G
T）を修飾して真核宿主細胞中で選択されうる誘導体プ
ラスミドを得た。
プラスミドpLPCの場合は、このプラスミドをプラスミ
ドpSV2hygの一部とライゲートすることによって行っ
た。プラスミドpSV2hygはハイグロマイシン耐性付与遺
伝子を含有するプラスミドである。プラスミドpSV2hyg
は、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー
（NRRL）（Northern Regional Research Labolatory,Pe
oria,IL 61640）から取得番号NRRL B−18039（1986年２
月11日寄託）のもとで入手することができ、その制限部
位および機能地図を添付の第10図に示した。プラスミド
pSV2hygを制限酵素BamH Iで消化し、完全なハイグロマ
イシン耐性付与遺伝子を含有している〜2.5kb BamH I制
限フラグメントを単離し、クレノウ酵素（大腸菌DNAポ
リメラーゼＩのスブチリシン切断によって生成する大き
いフラグメント）で処理し、次にクレノウ処理したプラ
スミドpLPCの〜5.82kb Nde I−Stu I制限フラグメント
にライゲートしてプラスミドpLPChyg1およびpLPChyg2を
得た。プラスミドpLPChyg1とpLPChyg2は、ハイグロマイ
シン耐性付与フラグメントの配向だけが異なっている。
プラスミドpLPChyg1とpLPChyg2の構築プロトコールを実
施例10Aに記載する。実施例10B記載のようにして、ポリ
−GT要素をプラスミドpLPChyg1およびpLPChyg2の唯一の
Xho I部位に挿入して、それぞれプラスミドpLPChyg1（G
T）およびpLPChyg2（GT）を創製した。プラスミドpLPCh
yg1（GT）の制限部位および機能地図を添付の第11図に
示す。
プラスミドpBW32のdhfr遺伝子含有のクレノウ処理し
た〜1.9kb BamH I制限フラグメントを、プラスミドpLPC
の〜5.82kb Nde I−Stu I制限フラグメントに挿入する
ことによって、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子を
含有するプラスミドpLPChyg1およびpLPChyg2に類似する
ヒトプロテインＣ発現プラスミドを構築した。得られた
プラスミド（pLPCdhfr1とpLPCdhfr2と命名）は、dhfr遺
伝子の配向だけが異なっている。ポリ−GT要素をプラス
ミドpLPCdhfr1およびpLPCdhfr2のXho I部位に挿入して
それぞれプラスミドpLPCdhfr1（GT）およびpLPCdhfr2
（GT）を創製した。これらプラスミドの構築を実施例12
で説明する。プラスミドpLPChyg1をさらに修飾してジヒ
ドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子を導入した。このdhfr
遺伝子はdhfr−ネガティブ細胞の選択マーカーであり、
これを用い、宿主細胞を量が増加するメトトレキセート
に暴露することによってDNAセグメントのコピー数を増
加させることができる。dhfr遺伝子は、例えばプラスミ
ドpBW32から得ることができる（このプラスミドは、日
本特許出願No.201225/86、1987年３月３日公開No.48378
/87に開示されている）。この遺伝子の他の供給源は当
業者には明らかであろう（例えば、ATCC37146、プラス
ミドpSV2−dhfr）。プラスミドpBW32の制限部位および
機能地図を添付の第12図に示す。プラスミドpBW32の構
築プロトコールを実施例11で説明する。
プラスミドpBW32のdhrf遺伝子含有の〜1.3kb BamH I
制限フラグメントを単離し、クレノウ酵素で処理し、そ
して部分的にEcoR I消化したプラスミドpLPChyg1に挿入
してプラスミドpLPChd1およびpLPChd2を得た。プラスミ
ドpLPChyg1は、２つのEcoR I制限酵素認識部位を含んで
いる：即ち、その１つはハイグロマイシン耐性付与遺伝
子の中に、他の１つはプラスミドpBR322由来の配列の中
にある。dhfr遺伝子を含有するフラグメントを、プラス
ミドpLPChyg1のpBR322由来配列中に位置しているEcoR I
部位に挿入してプラスミドpLPChd1およびpLPChd2を得
た。プラスミドpLPChd1とpLPChd2はdhfr遺伝子含有DNA
セグメントの配向だけが異なっており、これらプラスミ
ドの構築を実施例12Aで説明する。実施例12B記載のよう
にして、ポリ−GT要素をプラスミドpLPChd1およびpLPCh
d2の唯一のXho I部位に挿入して、それぞれプラスミドp
LPChd1（GT）およびpLPChd2（GT）を創製した。プラス
ミドpLPChd1（GT）の制限部位および機能地図を添付の
第13図に示す。
プラスミドpLChd1を修飾して、BKエンハンサー−アデ
ノウイルス後期プロモーターカセット、並びにハイグロ
マイシン耐性付与遺伝子およびdhfr遺伝子の両方を含有
するプラスミドphdを得た。プラスミドphdを構築するた
め、プラスミドpLPChd1をdam-大腸菌（E.coli）宿主細
胞から調製し、制限酵素Bcl Iで消化し、再環化し、こ
うしてヒトプロテインＣをコードしているDNAを削除し
た。プラスミドphdは１個のBcl I制限酵素認識部位を含
んでおり、この部位は本明細書に記載したBKエンハンサ
ー−アデノウイルス後期プロモーターから発現させよう
とするあらゆる配列の挿入に都合よく配置されている。
プラスミドphdの構築プロトコールを実施例13Aで説明す
る。プラスミドphdは大腸菌GM48（dam-、dcm-）に導入
し、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー
（NRRL）に寄託されている（1989年７月26日）。この形
質転換宿主細胞は取得番号NRRL B−18525のもとで入手
可能である。当業者には既知の常法によりこの宿主から
プラスミドを単離することができる。実施例13Bでさら
に詳しく説明するように、ポリ−GT要素をプラスミドph
dのXho I部位に挿入してプラスミドphd（GT）を得た。
プラスミドphd（GT）の唯一のBcl I制限酵素認識部位
は、本発明のBKエンハンサー−ポリGT−アデノウイルス
後期プロモーターから発現させようとするあらゆる配列
の挿入に都合よく設置されている。プラスミドphd（G
T）の制限部位および機能地図を添付の第14図に示す。
ヒトプロテインＣを発現させる他の発現ベクターはプ
ラスミドpLPCE1AおよびpLPCE1A（GT）である。プラスミ
ドpLPCE1AおよびpLCE1A（GT）は、ヒトアデノウイルス
２型のE1A遺伝子を含有しており、この遺伝子の産物
は、前記のように、BKエンハンサーの活性を増強し、そ
して本明細書で説明したように、ポリ−GT要素のエンハ
ンサー活性を活性化する。即ち、BKエンハンサーおよび
ポリ−GTと直列のプロモーターからの転写はE1A遺伝子
産物の存在下で増大する。プラスミドpLPCE1Aは、ヒト
アデノウイルス２型DNAのE1A遺伝子含有の〜1.8kb Bal
I制限フラグメントを、プラスミドpLPCの〜5.82kb Nde
I−Stu I制限フラグメントとライゲートすることによっ
て構築した。プラスミドpLPCE1Aの構築プロトコールを
実施例14Aで説明する。実施例14Bでさらに説明するよう
に、ポリ−GT要素をプラスミドpLPCE1Aの唯一のXho I部
位に挿入してプラスミドpLPCE1A（GT）を得た。プラス
ミドpLPCE1A（GT）の制限部位および機能地図を添付の
第15図に示す。
本発明の多種の発現ベクターはポリGT−BKエンハンサ
ー−アデノウイルス後期プロモーターカセットまたはBK
エンハンサー−アデノウイルス後期プロモーターカセッ
トを利用して組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）
または修飾TPA（MTPA）を発現させる。TPAまたはMTPAの
ベクターを構築するため、プラスミドpBW32（第12図）
を制限酵素BamH Iで消化し、得られた〜5.6kbのフラグ
メントを再環化してプラスミドpBW32delを得た。修飾型
TPAをコードし、Hind III制限部位を１つだけ含んでい
るプラスミドpBW32delをHind IIIで消化し、次いでプラ
スミドpBal8catの〜0.65kbのHind III制限フラグメント
にライゲートしてプラスミドpBLTを得た。プラスミドpB
al8catは、改良型のBKエンハンサー−アデノウイルス後
期プロモーターカセットを含有しており、これを実施例
18で説明する。ポリ−GT要素をプラスミドpBLTの唯一の
BamH I部位に挿入してプラスミドpBLT（GT）を得た。プ
ラスミドpBLT（GT）の制限部位および機能地図を添付の
第16図に示し、プラスミドpBLTおよびpBLT（GT）の構築
プロトコールを実施例15で説明する。
選択マーカーをBamH I消化のプラスミドpBLTまたはpB
LT（GT）に導入してもよい。例えばプラスミドpBLTを用
いて、ある構築においては、プラスミドpSV2hygのハイ
グロマイシン耐性遺伝子含有の〜2.5kb BamH I制限フラ
グメントを挿入してプラスミドpBLThyg1およびpBLThyg2
を得、別の構築においては、プラスミドpBW32のdhfr遺
伝子含有の〜1.9kb BamH Iフラグメントを挿入してプラ
スミドpBLTdhfr1およびpBLTdhfr2を得た。この４種類の
プラスミドpBLThyg1、pBLThyg2、pBLTdhfr1、およびpBL
Tdhfr2は、選択マーカーの種類および／または配向が異
なっているだけである。プラスミドpBLThyg1、pBLThyg
2、pBLTdhfr1およびpBLTdhfr2、並びにこれらのポリ−G
T含有誘導体であるpBLThyg1（GT）、pBLThyg2（GT）、p
BLTdhfr1（GT）およびpBLTdhfr2（GT）の構築プロトコ
ールを実施例16に示す。プラスミドpBLThyg1（GT）およ
びpBLTdhfr1（GT）の制限部位および機能地図をそれぞ
れ添付の第17図および第18図に示す。
TPAまたは修飾TPAを発現させる本明細書記載の他の発
現ベクターは、プラスミドpBW32の構築において用いる
中間体のプラスミドpTPA103から誘導した。プラスミドp
TPA103の構築プロトコールを実施例11で説明し、プラス
ミドpTPA103の制限部位および機能地図を添付の第19図
に示す。これらの誘導体を構築するため、プラスミドpT
PA103のTPA暗号領域の５′末端の直前にBamH I制限部位
を導入した。プラスミドpTPA103を制限酵素Hga Iで消化
して、TPA暗号領域の５′末端を含有する〜0.52kb Hga
I制限フラゲメントを単離した。クレノウで処理した
後、このHga IをBamH Iリンカーにライゲートし、制限
酵素BamH Iで消化し、BamH I消化したプラスミドpBR322
に挿入してプラスミドpTPA601およびpTPA602を得た。
次いで、プラスミドpTPA602を制限酵素Bgl IIおよびS
al Iで消化し、得られた〜4.2kbのBgl II−Sal I制限フ
ラグメントをプラスミドpTPA103の〜2.05kb Sal I−Bgl
II制限フラグメントにライゲートしてプラスミドpTPA6
03を得た。従って、プラスミドpTPA603は、両末端をBam
H I制限部位で囲まれたTPAの完全な暗号配列を含有して
いる。プラスミドpTPA603の制限部位および機能地図を
添付の第19図に示す。プラスミドpTPA603に類似してい
るが、修飾型のTPAをコードしているプラスミドを構築
するため、プラスミドpTPA603を制限酵素Bgl IIおよびS
st Iで消化し、得られた〜5.02kbのBgl II−Sst Iフラ
グメントをプラスミドpBLTの〜0.69kb Bgl II−Sst I制
限フラグメントにライゲートした。次いで、得られたプ
ラスミド（pMTPA603と命名）を制限酵素BamH Iで消化
し、得られた〜1.35kbのフラグメントを単離した。この
フラグメントおよびプラスミドpTPA603の〜1.90kb BamH
I制限フラグメントを、別のライゲート反応でBcl I消
化のプラスミドphd（第14図）に個々にライゲートし
て、それぞれプラスミドphdMTPAおよびphdTPAを得た。
プラスミドphdTPAおよびphdMTPA、並びにこれらのポリ
−GT含有誘導体phdTPA（GT）およびphdMTPA（GT）の構
築を、プラスミドpTPA602の構築プロトコールから始
め、これを実施例17で説明する。プラスミドphd（GT）T
PAおよびphd（GT）MTPAの制限部位および機能地図をそ
れぞれ添付の第20図および第21図に示す。
本発明は、真核性プロモーターと直列でBKエンハンサ
ーとともにポリ−GT要素を用いて、大きいDNAウイルス
の即時型遺伝子を発現する真核宿主細胞においてDNA配
列を転写および発現させる方法を包含するものである。
当業者なら、本方法において実質的にあらゆる真核性プ
ロモーターをポリ−GT要素およびBKエンハンサーと直列
して用いることができることを認めるであろう。例え
ば、SV40初期および後期プロモーター、BK初期および後
期プロモーター、あらゆるポリオーマウイルスまたはパ
ポバウイルスの初期および後期プロモーター、ヘルペス
ウイルス族のプロモーター、インターフェロンα１プロ
モーター、マウスメタロチオネインプロモーター、レト
ロウイルスのプロモーター、β−グロビンプロモータ
ー、アデノウイルスのプロモーター、ポックスウイルス
のプロモーター、ウニH2Aプロモーター、コンアルブミ
ンプロモーター、卵アルブミンプロモーター、マウスβ
−グロビンプロモーター、およびヒトβ−グロビンプロ
モーターはすべて本発明方法における真核性プロモータ
ーとして有用である。さらに、転写を開始させるのに用
いることができるあらゆる配列、例えば上流の「CCAA
T」配列を含むかまたは含まない「TATA」様の配列から
なる転写開始部位を含有する配列が本発明におけるプロ
モーターとして有用である。このようなプロモーター
を、本方法において用いるに好ましい真核性プロモータ
ーであるアデノウイルス−２後期プロモーターを用いて
本明細書中に例示したような、BKエンハンサーとともに
ポリ−GT要素を含有する発現ベクター中に、常法により
挿入することによってこれらのプロモーターを本発明方
法において用いることができる。
本明細書に記載したベクターで用いるBKエンハンサー
は原型株のBKウイルス（ATCC VR−837）から単離した。
しかし、多数のBKウイルス変異体が単離され、開示され
ている。ガードナーら［Gardner et al.,1971,Lancet
1:1253;Gardner,1973,Brit.Med.J.1:77−78］はBKウイ
ルスの最初の単離を報告し、従ってガードナー株が原型
の、または野生型のBKウイルスと呼ばれている。BKウイ
ルスのガードナー株（第１図）はATCCから取得番号ATCC
VR−837のもとで入手できる。実際のところ、本明細書
に記載されたベクターの構築に使用するためにATCC VR
−837を入手したときに、BKの変異株がウイルス集団中
に存在していることが観察された。他者もこの現象を観
察している［即ち、チュケら（Chuke et al.,1986,J.Vi
rology 60（３）:960）］。真核性プロモーターに直列
させてBKエンハンサーとともにポリ−GT要素を用いて大
きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物の存在下で核酸お
よびタンパク質などの有用な物質を発現させる方法に限
らず、本発明の他のあらゆる方法も、BKエンハンサーの
供給源としてはガードナー株または特定のBK変異株に限
定されるものではないが、原型株から単離した変異エン
ハンサー（実施例18）が好ましい。次の表は本明細書で
説明した方法において使用することができるBK変異株の
多数の代表例を挙げるものである。さらに、BK様のウイ
ルス（サル媒介物12）がBKエンハンサーに相同なエンハ
ンサー要素を含有しており、本明細書記載の方法に用い
ることができる。このサル媒介物12のエンハンサー要素
はカニンガムら［Cunningham et al.,1985,J.Virol.54:
483−492］が開示しており、本発明にとってはBKエンハ
ンサー変異体である。
当業者なら、宿主細胞が大きいDNAウイルスの即時型
遺伝子産物を発現する限り、多種の真核宿主細胞を本発
明方法において用いることができることを認めるであろ
う。即時型の遺伝子産物はプラスミドあるいは他のベク
ターによる形質転換などの多数の方法によって宿主細胞
中に導入することができるので、実質的にはあらゆる真
核細胞を本発明方法において用いることができる。特
に、本発明のGTエンハンサー系を活性化するE1A遺伝子
産物を、（１）ポリ−GT要素、真核性プロモーター、お
よび発現させようとする構造遺伝子とともに、E1A遺伝
子をコードしている１個のプラスミド、例えばプラスミ
ドpLPCE1A（GT）を真核宿主細胞に導入すること；
（２）E1Aをコードしている１個のプラスミド、例えば
プラスミドpSV2E1Aと、ポリ−GT要素、真核性プロモー
ター、および発現させようとする構造遺伝子をコードし
ている１個のプラスミド、例えばプラスミドpBL（GT）c
atの２種類のプラスミドを真核宿主細胞の同時形質転換
によって導入すること；または（３）293あるいはAV12
などのE1A発現セルラインを用い、ポリ−GT、真核性プ
ロモーター、および発現させようとする構造遺伝子をコ
ードしている１個のプラスミドを導入すること、を含む
種々の方法で付与してよいことは当業者の認めるところ
であろう。ヒト細胞は本発明方法において好ましい宿主
細胞である。ヒト腎細胞が宿主細胞として特に好まし
く、E1A遺伝子産物を発現するアデノウイルス−５形質
転換したヒト胚腎セルライイン293が最も好ましく、こ
れをATCCから取得番号ATCC CRL−15753のもとで入手す
ることができる。
293セルラインは、293細胞がE1A遺伝子産物を発現す
るためだけでなく、293細胞がγ−カルボキシル化し、
ほかにプロテインＣなどのコンプレックス遺伝子産物を
適切にプロセッシングするその能力から好ましい。「γ
−カルボキシル化」とはカルボキシル基がγ−炭素のと
ころでグルタミン酸残基に付加される反応を指し、γ−
カルボキシル化されたタンパク質とはいくつかのアミノ
酸残基がγ−カルボキシルを受けたタンパク質である。
通常、腎細胞はある種のタンパク質をγ−カルボキル
化、ほかにプロセッシングするが、293細胞はアデノウ
イルスで形質転換され、これによって通常特別の機能が
失われることになる。従って、本発明は、天然にγ−カ
ルボキシル化され、適切に折り畳まれ、そしてプロセッ
シングされているタンパク質を産生させる改良方法をも
包含するものである；ここで、該タンパク質はアデノウ
イルス後期プロモーターとともにBKエンハンサーおよび
ポリ−GT要素を含有する組換えDNAベクターにコードさ
れている。293セルラインの293N3S誘導体も本発明で用
いるのに適しており、グラハム［Craham,1987,J.Gen.Vi
rol.68:937］の記載のようにして懸濁培養で増殖させる
ことができる。
γ−カルボキシル化されたタンパク質を産生させるこ
の方法は、アデノウイルス形質転換されたヒト胚腎細胞
に限定されるものではない。このγ−カルボキシル化さ
れたタンパク質を産生させる方法はすべてのアデノウイ
ルス形質転換された宿主細胞に広く適用することができ
る。また当業者なら、この方法は、始めに真核細胞をγ
−カルボキシル化タンパク質のための発現ベクターで形
質転換し、次いで得られた形質転換体をアデノウイルス
で形質転換することによって行うことができることを認
めるであろう。ハロルド・ギンズバーグ［Harold Ginsb
erg,The Adenoviruses,1984,Plenum Press,New York］
は、多数のアデノウイルスおよびアデノウイルス形質転
換した宿主細胞を得る方法を記載している。組換えDNA
発現ベクターにコードされているγ−カルボキシル化タ
ンパク質を発現させる目的のために特に好ましいアデノ
ウイルス形質転換された宿主細胞は、シリアン（Syria
n）ハムスターセルラインAV12−664（以下、AV12と記
す）である。このAV12セルラインは、アデノウイルス12
型をシリアンハムスターの首筋に注射し、得られた腫瘍
から細胞を単離することによって作成された。AV12セル
ラインはγ−カルボキシル化されたタンパク質を産生さ
せる目的のためには好ましい宿主である。γ−カルボキ
シル化されるタンパク質の例には、因子VII、因子IX、
因子Ｖ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、
およびプロトロンビンが含まれるが、これらに限定はさ
れない。
実施例18および19に記載されている新規なポリGT−BK
エンハンサー−真核性プロモーター構築物は、真核性プ
ロモーターとともにポリ−GT要素およびBKエンハンサー
を用いる改良発現法を用いて構築した。この方法は、E1
A遺伝子産物の存在下で真核性プロモーターに関して
５′または３′にポリ−GT要素を設置し、BKエンハンサ
ーと直列で用いられる真核性プロモーターのCCAAT領域
またはCCAAT領域等価域の５′末端の上流の０〜300ヌク
レオチド以内にBKエンハンサーを設置することからな
る。
他のウイルス遺伝子産物、例えばアデノウイルスのVA
遺伝子産物は、アデノウイルスの３部構成リーダーを含
有しているmRNA分子の翻訳効率を増強する［カウフマン
（Kaufman,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:689−69
3）；スベンソンおよびアクジャラル（Svensson and Ak
usjarul,1985,EMBO 4;957−964）］。本発明のベクター
を修飾してアデノウイルスの完全な３部構成リーダーを
コードさせるのは容易である；このVA遺伝子産物を用い
てアデノウイルスの３部構成リーダーの第１の部分だけ
を含有するあるmRNAの翻訳を増強してもよい。
アデノウイルスの３部構成リーダーの配列を以下に示
す： ［配列中、Ａはリボアデニルであり、Ｇはリボグアニル
であり、Ｃはリボシチジルであり、そしてＵはウリジル
である］。アデノウイルスDNA中にコードされているよ
うに、３部構成のリーダーは大きいイントロンによって
遮断されている。これらイントロンまたはイントロンの
一部の存在は発現レベルに悪影響を及ぼさない。本明細
書中に記載したプラスミドp4−14およびp2−５はアデノ
ウイルスの３部構成リーダーを含有しており、後記の実
施例24でさらに詳しく説明する。プラスミドp4−14（G
T）およびp2−５（GT）はさらにポリ−GT要素を含有し
ている。
本発明の多数の例示ベクター、例えばプラスミドpBL
（GT）catおよびpLPC（GT）などは、アデノウイルスの
３部構成リーダーの第１の部分だけを含有している。本
明細書においては、アデノウイルスの３部構成リーダー
の「第１の部分」は、mRNAに転写されたときには、少な
くとも以下の配列を含有している： 即ち、本発明は、真核性プロモーターおよび該プロモー
ターから発現されるように設置された有用な物質をコー
ドしているDNA配列の両方を含有する組換えDNAベクター
で真核宿主細胞を形質転換し、該組換えDNAベクター含
有細胞を該有用物質の発現に適した条件下で培養するこ
とにより、真核宿主細胞において有用な物質を産生させ
る方法の改良法であって、改良が （ａ）ポリ−GT要素をベクターに導入し； （ｂ）アデノウイルスの３部構成リーダーの第１の部分
をコードしているDNAを工程（ａ）のベクターに導入し
て、転写されたときには生成したmRNAが有用産物をコー
ドしており、その５′末端には３部構成リーダーの第１
の部分を含んでいるようにし； （ｃ）工程（ｂ）のベクターを含有している細胞に、VA
遺伝子産物の発現をコードしている第１のDNA配列およ
びアデノウイルスのE1A遺伝子産物の配列をコードして
いる第２のDNA配列を付与し；そして （ｄ）工程（ｃ）の細胞を、（ｉ）VA遺伝子産物の発現
およびmRNAの翻訳の刺激、および（ii）E1A遺伝子産物
の発現およびポリ−GT要素のエンハンサー活性の刺激に
適した条件下で培養すること（但し、mRNAはアデノウイ
ルスの完全な３部構成リーダーを含有していないものと
する） からなる方法を包含する。
VAをコードしているプラスミドはアデノウイルスDNA
から構築した。ヌクレオチド9833のSal I部位とヌクレ
オチド11556のHind III部位で範囲を定められている〜1
723bpの制限フラグメントを、アデノウイルス−2 DNAか
ら単離し、Hind III−Sal I消化のプラスミドpBR322に
クローンしてpBR322の〜622bp Sal I−Hind IIIフラグ
メントを置き換え、プラスミドpVAを構築した。プラス
ミドpVAから〜1826bpのNru Iフラグメントを単離し、こ
のフラグメントをクレノウ処理したBamH I消化のプラス
ミドpSVNneo（BRLから入手可能）に挿入することによっ
て、オネマイシン耐性とVAをコードしているプラスミド
を構築した。得られたプラスミド（pVA−neoと命名）を
用い、形質転換後のネオマイシン（G418）耐性の選択に
より、あらゆるセルラインにVA遺伝子を挿入することが
できる。
しかし、アデノウイルスのVA遺伝子産物は、VAをコー
ドしているベクターで宿主細胞を形質転換した後の最初
の数日間においては、アデノウイルスの３部構成リーダ
ーの第１の部分または完全な３部構成リーダーのいずれ
かを含有している組換え遺伝子の発現に、その最大のポ
ジティブな作用を発揮することができる。この最初の数
日間の後の宿主細胞中でのVA遺伝子細胞の発現は最適発
現レベルを与えないこともある。
また、SV40、BKウイルス、あるいは他のあらゆるポリ
オーマウイルスのＴ抗原を本明細書中に記載したベクタ
ーとともに用いて、プロモーター活性を増強し、そして
／または複製の刺激によりプラスミドのコピー数を増大
させることができる。SV40のＴ抗原はアデノウイルスお
よびBKの後期プロモーターの両者からの転写を刺激す
る。SV40のＴ抗原はポリ−GT要素をトランス−活性化し
ないようである。しかし、本発明の発現ベクター上にＴ
抗原の暗号配列を含ませることによって、またはＴ抗原
の暗号配列を有するプラスミドと本ベクターとの同時ト
ランスフェクションによって、実施例22に示したよう
に、選択圧をかける前にコピー数の増幅を得ることがで
きる。これは、発現ベクターの高コピー数の組込みを可
能にする。
上述のように、本発明の好ましい態様では、組換えDN
A発現ベクターは、ポリ−GT要素、アデノウイルス後期
プロモーター（これ自体は、３部構成リーダーの少なく
とも第１の部分および有用な物質をコードしている遺伝
子を発現させるように設置されている）の上流の300ヌ
クレオチド以内に設置された原型株から単離したBKエン
ハンサーを含有している。この好ましいベクターを用い
て、E1A遺伝子産物を継続的に発現するヒト胚腎293細胞
（発現ベクターによる形質転換の前後のどちらかに修飾
してアデノウイルスのVA遺伝子産物を発現させた）を形
質転換する。しかし、安定な形質転換体のためには、VA
遺伝子産物の存在は望ましくないこともある。
以下に実施例を挙げて本発明の方法、化合物、および
組換え微生物をさらに詳しく説明する。当業者なら、実
施例に記載した特定の試薬、装置、および方法が単なる
例示にすぎず、本発明を限定するものではないことを認
めるであろう。
実施例１ ポリ−GT要素の調製 システック（Systec）1450A DNA合成機［システック
・インコーポレーテッド（Systec,Inc.,3816 Chandler
Drive,Minneapolis,MN 55401）］またはABS 380A DNA合
成機［アプライド・バイオシステムズ・インコーポレー
テッド（Applied Biosystems,Inc.,850 Lincoln Centre
Drive,Foster City,CA 94404）提供］を用いて、ポリ
−GT要素の構築に用いる一本鎖DNAフラグメントを化学
的に合成した。当技術分野において多くのDNA合成装置
が知られており、これを用いてこのフラグメントを作成
することができる。また、このフラグメントは、イタク
ラ等［Itakura et al.,1977,Science,198:1056］および
クリ−等［Crea et al.,1978,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,7
5:5765］の方法に実質適に従って調製することもでき
る。
以下のように一本鎖を合成した後、一本鎖ポリ−GT要
素（各500ナノグラム）をアニーリングした。すなわ
ち、エッペンドルフ試験管中で鎖１（16μ）と鎖２
（11μ）とを混合し、10X TM緩衝液［0.5Mトリス−HC
l（pH7.6）、0.1M MgCl2（３μ）を加えた。この試験
管を熱湯浴に２分間放置し、次いで室温で、次に４℃で
インキュベートしてゆっくり冷却した。この操作により
一本鎖がアニーリングして日本鎖のポリ−GT要素を生成
した。このインキュベーション後、試料（30μ）を凍
結乾燥し、次いで、ガラス蒸留したH2O［dH2O］（７μ
）に懸濁した。構築されたポリ−GT要素は、以下の構
造を有していた： 上記に示したとおり、このポリ−GT要素は、（GT）ｎ−
（CA）ｎセグメント（ｎ＝21）［このセグメントの両側
には、制限酵素:BamH I（Ｇ↓GATCC）、Xho I（Ｃ↓TCG
AG）およびEcoR I（Ｇ↓AATTC）の認識部位であるDNA配
列がある］を含むように構築された。したがって、この
ポリ−GT要素を、種々の発現ベクターのBamH I部位また
はXho I部位に容易に挿入することができ、以下の多く
の実施例に記載されているようなポリ−GT含有の発現ベ
クター誘導体を得ることができる。また、発現ベクター
のすべての制限部位に平滑末端ライゲーションによって
ポリ−GT要素を挿入することができる。
実施例２ BKウィルスDNAの調製 BKウィルスを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ATCC）から取得番号ATCC VR−837のもとで
入手する。このウィルスは凍結乾燥品として得られ、こ
れをハンク（Hank）のバランス塩［ギブコ（Gibco,3175
Staley Road,Grand Island,NY 14072）］に再懸濁して
約105プラーク生成単位（pfu）/mlの力価にする。BKウ
ィルスDNA調製用に選択した宿主は１次（プライマリ
ー）ヒト胎児腎（PHEK）細胞であり、この細胞はフロウ
・ラボラトリーズ社（Flow Laboratories,Inc.,7655 Ol
d Springhouse Road,Mc Lean,VA 22101）からカタログ
番号０−100のもとで、またはM.A.バイオプロダクツ
（M.A.Bioproducts）からカタログ番号70−151のもとで
入手することができる。
全面単層の約106のPHEK細胞を含有する75mm2ポリスチ
レンフラスコ約５個を用いてウィルスを調製する。力価
105pfu/mlのBKウィルス（約1ml）を各フラスコに加え、
これを37℃で１時間インキュベートし、次いで新鮮な培
養培地［10％ウシ胎児血清を追加したダルベッコの改良
イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium,G
ibco）］を加え、感染細胞を37℃で10〜14日間またはウ
ィルスの完全な細胞変性効果が認められるまでインキュ
ベートする。この細胞変性効果はセルラインの種類およ
びウィルスの種類によって変わるが、通常、細胞が丸く
なり、凝集し、そして培養盤から剥がれることからな
る。
凍結−解凍を３回繰り返すことによってこの細胞から
ウィルスを放出させ、5000Xgで遠心して細胞破片を除去
する。PEG−6000（100g）を加え、この溶液を４℃で24
時間インキュベートし、そして5000Xgで20分間遠心し
て、上清液（１）中のウィルスを沈澱させ、集める。
このペレットを、最初の容積の1/100となるよう0.1X SS
C緩衝液［1X SSC＝0.15M NaClおよび0.015Mクエン酸ナ
トリウム（pH7）］に溶解する。このウィルス懸濁液
を、試験管中の飽和KBr溶液（15ml）に層状に加え、こ
れを75,000Xgで３時間遠心する。遠心後、このKBr溶液
中に２つのバンドが現れる。完全なピリオンを含有する
低い方のバンドを集め、TE［10mMトリス−HCl（pH7.
8）、および1mM EDTA］を溶離緩衝液として用いてセフ
ァデックス（SephadexR）Ｇ−50カラム［シグマ・ケミ
カル社（Sigma Chemical Co.,P.O.Box 14508,St.Louis,
MO 63178）］で脱塩する。
このカラムから得た精製ビリオン溶液に、ドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）を１％濃度となるように加え、プ
ロナーゼを100μg/ml濃度となるように加え、そしてこ
の溶液を37℃で２時間インキュベートする。次いで、こ
の溶液に塩化セシウムを1.56g/ml密度となるように加
え、臭化エチジウムを最終濃度100μg/mlとなるように
加える。この溶液を、ソーバル（Sorvall;DuPont Inst.
Products,Biomedical Division,Newton,CT 06470）865
ローターまたは同様の垂直ローター中、260,000Xgで24
時間遠心する。遠心後、ウィルスDNAのバンドを単離
し、100mMトリス−HCl（pH7.8）で飽和したイソアミル
アルコールで５回抽出する。次いでこのBKウィルスDNA
の溶液を、DNAの260nm/280nm吸収比が1.75と1.90の間に
入るまで、TE緩衝液に対して透析する。NaCl濃度を0.15
Mに調整し、２倍量のエタノールを加え、この溶液を−7
0℃で少なくとも２時間インキュベートし、そしてこの
溶液を12,000Xgで10分間遠心することによってDNAを沈
澱させる。得られたBKウィルスDNAのペレットを、1mg/m
lの濃度でTE緩衝液に懸濁させる。
実施例３ プラスミドpBKneo1およびpBKneo2の構築 大腸菌K12 HB101/pdBPV−MMTneo細胞を、ATCCから取
得番号ATCC 37224のもと、凍結乾燥品として入手する。
この凍結乾燥細胞を、100μg/mlアンピシリン含有Ｌ−
寒天（１あたり寒天15gを有するＬブロス）プレート
で平板培養し、37℃でインキュベートして単一のコロニ
ー単離体を得る。
50μg/mlのアンピシリンを含有するＬブロス［１あ
たりトリプトン10g、NaCl10g、および酵母抽出物5g］
（１）に大腸菌K12 KB101/pdBPV−MMTneoのコロニー
を接種し、空気振盪器中、37℃で、O.D.590が〜１吸収
単位になるまでインキュベートし、この時点でクロラム
フェニコール（150mg）を培養物に加えた。インキュベ
ートを約16時間続けた。クロラムフェニコールの添加に
よりタンパク質の合成が阻害され、従って細胞分裂が阻
害されるが、プラスミドの複製は継続して起こり得る。
この培養物をGSAローター（ソーバル）中、４℃、600
0rpmで５分間遠心した。得られた上清を廃棄し、細胞ペ
レットをTES緩衝液［10mMトリス−HCl（pH7.5）、10mM
NaCl、および1mM EDTA（40ml）で洗浄し、次いで再ペレ
ット化した。上清を廃棄し、細胞ペレットをドライアイ
ス−エタノール浴中で凍結し、次いで解凍した。解凍し
た細胞ペレットを25％スクロースおよび50mM EDTAの溶
液（10ml）に再懸濁させた。この溶液に、5mg/mlリゾチ
ーム溶液（約1ml）、0.25M EDTA（pH8.0）（3ml）およ
び10mg/ml RNAse A（100μ）を加え、次いで、氷上で
15分間インキュベートした。溶菌液［10％トリトン−X1
00（3ml）、0.25M EDTA（pH8.0）（75ml）、1Mトリス−
HCl（pH8.0）（15ml）、およびdH2O（7ml）を混合して
調製した］（3ml）を、リゾチーム処理した細胞に加
え、混合し、得られた溶液を氷上でさらに15分間インキ
ュベートした。溶菌細胞をドライアイス−エタノール浴
中で凍結し、次いで解凍した。
SW28.1ローター［ベックマン（Beckman,Scientific I
nstrument Division,Campus Drive at Jamboree Blvd.,
Irvine,CA 92713）］中、25,000rpmで40分間遠心し、緩
衝化フェノールで抽出して、この溶液から細胞破片を除
去した。この細胞抽出液にCsCl（約30.44g）および5mg/
ml臭化エチジウム溶液（〜1ml）を加え、次いで、溶液
の容量をTES緩衝液で40mlに調整した。この溶液をVTi50
超遠心管（ベックマン）にデカントし、次いで、密封
し、VTi50ローター中、42,000rpmで〜16時間遠心した。
得られたプラスミドバンドを紫外光で可視化し、これを
単離し、次いでTi75管およびローター（ベックマン）中
に置き、50,000rpmで16時間遠心した。0.761g/ml CsCl
を含有するTESを用いて必要な容量に調整した。プラス
ミドバンドを再度単離し、塩−飽和イソプロパノールで
抽出して臭化エチジウムを除去し、TES緩衝液で1:3に希
釈した。次いで、この溶液にエタノール２倍量および3M
酢酸ナトリウム１倍量を加え、−20℃で一夜インキュベ
ートした。この溶液を、SS34ローター（ソーバル）中、
10,000rpmで15分間遠心してプラスミドDNAをペレット化
した。
この方法によって得られたプラスミドpdBPV−MMTneo
DNA（〜1mg）を、TE緩衝液（1ml）に懸濁させ、−20℃
で保存した。前記プラスミド単離方法は、非常に精製さ
れたプラスミドDNAが多量に必要である場合に一般に用
いられる。この方法を若干変え、培養細胞を約5mlだけ
を用い、適当に量を減らした溶菌緩衝液中で細胞を溶解
し、そして遠心分離工程をフェノールおよびクロロホル
ム抽出に変えることによって、あるプラスミドの存在に
ついて形質転換体をスクリーニングする際に必要である
ような比較的少量の比較的純度の低いDNAを迅速に得る
ことができる。
上記で調製したプラスミドpdBPV−MMTneo DNA（約５
μg;5μ）および実施例２で調製したBKウィルスDNA
（５μg;5μ）を、各々、10X BamH I緩衝液［1.5M Na
Cl、60Mトリス−HCl（pH7.9）、60mM MgCl2、および1mg
/ml BSA］（２μ）、制限酵素BamH I［約20単位；酵
素の実際の供給源は異なっていることもあるが、特記し
ない限り、本明細書における酵素単位の全ては、ニュー
・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs,
32 Tozer Road,Beverly,MA 01915）の単位の定義を指
す］（１μ）、およびdH2O（７μ）を含有する溶液
中、37℃で２時間消化した。同量のフェノールで抽出
し、次いでクロロホルムで２回抽出して、この反応を止
めた。次いで、各BamH I消化DNAを沈澱させ、遠心分離
によって集め、dH2O（５μ）に懸濁させた。
BamH I消化プラスミドpdBPV−MMTneo（１μ）とBam
H I消化BKウィルスDNA（１μ）との混合物に10Xリガ
ーゼ緩衝液（約１μ）を加えた。このDNA混合物にT4
DNAリガーゼ（１μ；〜1000単位）およびdH2O（６μ
）を加えた後、得られた反応液を16℃で一夜インキュ
ベートした。ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドp
BKneo1およびpBKneo2（これらは、BKウィルスDNAの配向
だけが異なっている）からなっていた。プラスミドpBKn
eo1の制限部位および機能地図を添付の第２図に示す。
大腸菌K12 HB101細胞は、取得番号NRRL B−15626（19
83年９月28日寄託）のもと、ノーザン・リージョナル・
リサーチ・ラボラトリー（NRRL）から凍結乾燥品として
入手することができる。以下のように、この大腸菌K12
HB101細胞を培養し、形質転換のためにコンピテントに
し、上記で調製したライゲート化DNAで形質転換した。
Ｌブロス中、大腸菌K12 HB101の培養物（50ml）を、650
ナノメーターでの光学密度（O.D.650）が約0.4吸収単位
になるように増殖した。培養物を氷上で10分間冷却し
た。遠心分離によって細胞を集めた。細胞ペレットを冷
100mM MgCl2（25μ）に再懸濁し、氷上で25分間イン
キュベートした。遠心分離によって細胞をもう１回ペレ
ット化し、このペレットを冷100mM CaCl2（2.5ml）に再
懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。インキュベ
ーション後、形質転換DNAの取り込みのために細胞をコ
ンピテントにする。
この細胞懸濁液（200μ）と、上記で調製したライ
ゲート化DNAとを混合し、氷上で30分間インキュベート
した。この後、氷浴中、42℃で２分間、細胞を放置し、
次いで、氷上にさらに10分間戻した。この細胞を遠心分
離によって集め、Ｌブロス（1ml）に再懸濁し、37℃で
１時間インキュベートした。この細胞混合物の試料を、
100μg/mlアンピシリン含有のＬ寒天プレートで平板培
養した。このプレートを37℃で一夜インキュベートし
た。大腸菌K12 HB101/pBKneo1および大腸菌K12/pBKneo2
形質転換体を、そのアンピシリン耐性表現型およびその
プラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した。上記
のようにして、大腸菌K12 HB101/pBKneo1および大腸菌K
12/pBKneo2細胞からプラスミドDNAを得た。
実施例４ プラスミドpLPcatおよびpLP（GT）catの構築 A.プラスミドpLPcatの構築 アデノウィルス２（Ad2）のビリオンDNAは、約35.94k
bの大きさの、２本鎖の直線状分子である。このAd2の後
期プロモーターは、Ad2ゲノムの〜0.316kb Acc I−Pvu
II制限フラグメントとして単離することができ、この〜
0.32kb制限フラグメントは、Ad2ゲノムのヌクレオチド
位置5755と6071の間の配列に対応している。所望の０〜
32kb Acc I−Pvu II制限フラグメントを単離するため、
始めにAd2 DNAを制限酵素Bal Iで消化し、〜0.32kb Acc
I−Pvu II制限フラグメントの完全な配列を含有する〜
2.4kb Bal I制限フラグメントを単離する。次いで、こ
の〜2.4kb Bal I制限フラグメントをAcc IおよびPvu II
で消化して所望のフラグメントを得る。
Ad2 DNA（BRLから入手可能）（約50μｇ）を、dH2O
（80μ）および10X Bal I緩衝液［100mMトリス−HCl
（pH7.6）;120mM MgCl2;100mM DTT;および1mg/ml BSA］
（10μ）に溶解する。このAd2 DNAの溶液に制限酵素B
al I（10μ；約20単位）を加え、得られた反応液を37
℃で４時間インキュベートする。
制限フラグメントが十分に分離するまで、Bal I消化D
NAを１％アガロースゲル電気泳動にかける。電気泳動し
たDNAの可視化は、臭化エチジウムの希釈溶液（0.5μg/
ml）中でゲルを染色し、染色したゲルに長波長紫外（U
V）光をあてることによって行う。以下のように、アガ
ロースからDNAを単離する。所望のフラグメントを含有
するゲルの細片（UV光によって可視化した）をゲルから
切り出し、エッペンドルフ試験管に入れる。ゲル細片を
含む試験管をまず−70℃で放置するかまたは氷上に置い
てゲルを凍結させ、次いで、室温で放置して解凍し、再
度凍結および解凍した。これらの凍結−解凍を２回繰り
返した後、試験管の液体を集め、イソアミルアルコール
で３回連続抽出し、次にエタノール沈澱してDNAフラグ
メントを液体から取り出した。得られた精製フラグメン
トをTE緩衝液（10μ）に溶解する。
dH2O（約６μ）および10X Acc I緩衝液［60mM NaC
l;60mMトリス−HCl（pH7.5）;60mM MgCl2;60mM DTT、お
よび1mg/ml BSA］（２μ）を、Ad2の〜2.4kb Bal I制
限フラグメントの溶液に加える。このDNA溶液に制限酵
素Acc I（２μ；約10単位）を加えた後、反応液を37
℃で２時間インキュベートする。このAcc I消化後、DNA
をエタノール沈澱によって集め、dH2O（16μ）および
10X Pvu II緩衝液［60mM NaCl;60mMトリス−HCl（pH7.
5）;60mM MgCl2;60mM DTT;および1mg/ml BSA］（２μ
）中に再懸濁する。このDNA溶液に制限酵素Pvu II
（約２μ；約10単位）を加えた後、反応液を37℃で２
時間インキュベートする。
Ad2の後期プロモーターを含有する〜0.32kb Acc I−P
vu II制限フラグメントが他の消化産物から分離するま
で、Acc I−Pvu II消化したAd2の〜2.4kb Bal I制限フ
ラグメントを〜６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かける。このゲルを臭化エチジウムで染色し、UV光を用
いて観察し、〜0.32kb Acc I−Pvu II制限フラグメント
を含有するゲルセグメントをゲルから切り出し、つぶ
し、抽出緩衝液［500mM酢酸アンモニウム;10mM酢酸マグ
ネシウム;1mM EDTA;および0.1％SDS］（250μ）中
に、室温で一夜浸漬する。翌朝、この混合物を遠心し、
ペレットを除去する。上清中のDNAをエタノールで沈澱
させ、tRNA（約２μ）を加えて所望のフラグメントの
沈澱を完全なものにする。〜0.32kb Acc I−Pvu II制限
フラグメント（約0.2μ）が得られ、これをdH2O（７
μ）に懸濁させる。
実質的に下記実施例11Aに記載の方法に従ってキナー
ゼ処理しておいたBcl Iリンカー［５′−CTGATCAG−
３′；ニュー・イングランド・バイオラブズから入手可
能］（約0.25μg;0.5μ中）を、〜0.32kb Acc I−Pvu
II制限フラグメントの溶液に加え、次いでこのDNA溶液
にT4 DNAリガーゼ（１μ；約1000単位）および10Xリ
ガーゼ緩衝液［0.5Mトリス−HCl（pH7.8）;100mM MgC
l2;200mM DTT;10mM ATP;および0.5mg/ml BSA］（１μ
）を加え、得られた反応液を16℃で一夜インキュベー
トした。このBcl Iリンカーは、Acc I−Pvu II制限フラ
グメントのPvu II末端にだけライゲートすることができ
た。後に行ったDNA配列決定により、Acc I−Pvu II制限
フラグメントのPvu II末端には４個のBcl Iリンカーが
結合していることがわかった。これら余分のBcl Iリン
カーをBcl I消化および再ライゲートによって除去する
ことができるが、余分のリンカーはこれらリンカーを含
有するベクターの正しい機能を妨害しないので、これら
余分のBcl Iリンカーを除去しなかった。
大腸菌K12 HB101/pSV2cat細胞をATCCから取得番号ATC
C 37155のもと凍結乾燥品として入手し、実質的に実施
例３の方法に従ってこの細胞からプラスミドpSV2cat DN
Aを単離した。プラスミドpSV2catの制限部位および機能
地図を添付の第３図に示す。プラスミドpSV2cat DNA
（約1mg）が得られ、これをTE緩衝液（1ml）に溶解す
る。プラスミドpSV2cat DNA（約３μg;3μ）を10X Ac
c I緩衝液（２μ）およびdH2O（16μ）に加え、次
いで制限酵素Acc I（３μ；約９単位）をpSV2cat DNA
の溶液に加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュ
ベートした。次に、10X Stu I緩衝液［1.0M NaCl;100mM
トリス−HCl（pH8.0）;100mM MgCl2;60mM DTT;および1m
g/ml BSA］（３μ）、dH2O（５μ）、および制限酵
素Stu I（約２μ；約10単位）を加えることにより、
このAcc I消化したプラスミドpSV2cat DNAを制限酵素St
u Iで消化した。得られた反応液を37℃で２時間インキ
ュベートした。この反応混合物をフェノールで１回、次
いでクロロホルムで２回抽出することによって反応を停
止させた。所望のフラグメント（約0.5μ）が得ら
れ、これをTE緩衝液（20μ）に溶解した。
Acc I−Stu I消化したプラスミドpSV2cat DNA（約４
μ）を、Ad2の〜0.32kb Acc I−Pvu II（Bcl Iリンカ
ーが結合している）制限フラグメント（約７μ）と混
合し、10Xリガーゼ緩衝液（３μ）、dH2O（15μ
）、およびT4 DNAリガーゼ（２μ；約1000単位）を
加えた後、このライゲーション反応液を16℃で一夜イン
キュベートした。このライゲートしたDNAは所望のプラ
スミドpLPcat、すなわち、Ad2の後期プロモーター（ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
を転写させるように配置されており、従ってこれを発現
させる）を含有するプラスミドからなっていた。
実質的に実施例３の方法に従い、このライゲート化DN
Aを用いて大腸菌K12 HB101細胞を形質転換した。形質転
換細胞を、50μg/mlアンピリシン含有のＬ−寒天で平板
培養した。プラスミドDNAの制限酵素分析によって大腸
菌K12 HB101/pLPcat形質転換体を同定した。実質的に実
施例３に記載のプラスミド単離法に従って、後の構築に
用いるためにプラスミドpLPcat DNAを形質転換体から単
離した。
B.プラスミドpLP（GT）catの構築 1.プラスミドpLPcatからの構築 dH2O（30μ）中の実施例１で調製したポリ−GT要素
（約１μｇ）を、10Xコア（Core）緩衝液［50mMトリス
−HCl（pH8.0）;10mM MgCl2;および50mM NaCl2］（15μ
）およびdH2O（95μ）に加える。このポリ−GT要素
の溶液に制限酵素Xho I（10μ；約100単位）を加え、
得られた反応液を37℃で３時間インキュベートする。Xh
o I消化後、エタノール沈澱によってDNAを集め、dH2O
（７μ）に再懸濁する。
TE緩衝液（10μ）中のプラスミドpLPcat DNA（約５
μｇ）を10Xコア緩衝液（10μ）およびdH2O（75μ
）に溶解する。Xho I（５μ；約60単位）をDNA溶液
に加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベート
する。この反応混合液を、まずフェノール：クロロホル
ムで、次いでクロロホルム：イソアミルアルコールで抽
出して反応を停止する。Xho I消化プラスミドpLPcat DN
Aをエタノールで沈澱させ、TE緩衝液（100μ）に再懸
濁した。以下のように、ウシ腸アルカリホスファターゼ
でXho I消化プラスミドpLPcat DNAを処理する。Xho I消
化プラスミドpLPcat DNAをTE緩衝液で100μに希釈
し、この溶液にウシ腸アルカリホスファターゼ［コラボ
レイティブ・リサーチ・インコーポレーテッド（Collab
orative Research,Inc.,128 Spring Street,Lexington,
MA 02173］（約0.06単位）を加え、得られた反応液を37
℃で30分間インキュベートした。1X SET［5mMトリス−H
Cl（pH7.8）;5mM EDTA;および15mM NaCl］、0.3M酢酸ナ
トリウム、および0.5％SDSを含有するように溶液を調整
し、65℃で45分間インキュベートした。ホスファターゼ
処理によって、pLPcat DNAが自己ライゲートするのを防
止する。DNAをエタノール沈澱によって集め、次いで10m
Mトリス−HCl（pH8.0）緩衝液（10μ）に再懸濁し
た。
10Xリガーゼ緩衝液［0.5Mトリス−HCl（pH7.8）;100m
M MgCl2;200mM DTT;10mM ATP;および0.5mg/ml BSA］
（約１μ）を、Xho I消化したホスファターゼ処理プ
ラスミドpLPcat DNA（１μ；約50ng）とXho I消化した
ポリ−GT要素（７μ；約100ng）との混合物に加え
る。T4 DNAリガーゼ（１μ；約1000単位）をDNA溶液
に加え、得られた反応液を16℃で一夜インキュベートす
る。ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドpLP（GT）
catからなっている。プラスミドpLP（GT）catの制限部
位および機能地図を添付の第４図に示す。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌K12 HB101細胞を形質転換する。50μg/m
lアンピシリン含有のＬ−寒天で形質転換細胞を平板培
養し、プラスミドDNAの制限酵素分析を用いて大腸菌K12
HB101/pLP（GT）cat形質転換体を同定する。実質的に
実施例３に記載のプラスミド単離法に従って、後の構築
のためにプラスミドpLP（GT）cat DNAを形質転換体から
単離する。
2.プラスミドpBL（GT）catからの構築 別法として、以下の方法に従って、プラスミドpBL（G
T）cat DNA（下記実施例５に記載）から始め、BKエンハ
ンサーを含有するフラグメントを欠失させてプラスミド
pLP（GT）catを調製した。トリス緩衝液［10mMトリス−
HCl（pH8.0）］（10μ）中の実施例5Bで調製したプラ
スミドpBL（GT）cat DNA（約9.5μｇ）を、10X高塩緩衝
液（10μ）およびdH2O（69μ）に加えた。制限酵素
Mst II（約９μ；約18単位）および制限酵素Bal II
（２μ；約20単位）をDNA溶液に加え、得られた反応
液を37℃で２時間インキュベートした。次に、上記のよ
うに、反応を停止させ、DNAを抽出し、沈澱させた。DNA
沈澱物をdH2O（45μ）に溶解した。
実質的に実施例10の方法に従って、Mst II/Bgl II消
化プラスミドpBL（GT）cat DNA（45μ）に10Xクレノ
ウ緩衝液（５μ）およびクレノウ酵素［BRLによって
市販されている］（１μ；約５単位）を加え、インキ
ュベートした。クレノウ処理したMst II/Bgl II消化プ
ラスミドpBL（GT）cat DNAをフェノール：クロロホルム
で１回、クロロホルム：イソアミルアルコールで１回抽
出し、次いで、エタノールで沈澱させ、最後にトリス緩
衝液（10μ）に再懸濁させた。
クレノウ処理したMst II/Bgl II消化プラスミドpBL
（GT）cat DNA（約１μ；約0.5μｇ）に、10Xリガー
ゼ緩衝液（１μ）、dH2O（７μ）およびT4 DNAリガ
ーゼ（１μ；約100単位）を加えた。得られた反応液
を16℃で一夜インキュベートすると、ライゲートしたDN
Aは、目的のプラスミドpLP（GT）catの別法による構築
物（この構築物はプラスミドpBL（GT）cat△Bal II/Mst
IIと称する）からなっていた。pBL（GT）catからの〜4
80bp Bgl II/Mst IIフラグメントの欠失によってBKエン
ハンサーが除去されるが、これを実施例5Aにおいてプラ
スミドpLPcatにライゲートしてプラスミドpBLcatを創製
する。
実施例５ プラスミドpBLcatおよびpBL（GT）catの構築 A.プラスミドpBLcatの構築 10XのAcc I緩衝液（7.5μ）、dH2O（30μ）、お
よび制限酵素Acc I（15μ；約75単位）に、TE緩衝液
（50μ）中のプラスミドpBKneo1DNA（約88μｇ）を加
え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベートし
た。Acc I消化したBKウィルスDNAをアガロースゲルにか
け、BKエンハンサーを含有する〜１・4kbフラグメント
を他の消化産物から分離した。次いで、実施例4A記載の
方法に実質的に従って、〜1.4kb Acc I制限フラグメン
トを単離した。このフラグメント（約５μｇ）を、10X
Pvu II緩衝液（５μ）、dH2O（45μ）、および制限
酵素Pvu II（５μ；約25単位）中に再懸濁し、得られ
た反応液を37℃で２時間インキュベートした。次いで、
実質的に実施例4Aの方法に従って、Pvu II消化したDNA
をライゲーション用に単離し、調製した。所望の〜1.28
kb Acc I−Pvu IIフラグメントが約２μｇ得られ、これ
をTE緩衝液（５μ）に溶解した。
プラスミドpLPcat DNA（約１μｇ）を、10XのAcc I緩
衝液（５μ）およびdH2O（40μ）に溶解した。制限
酵素Acc I（５μ；約25単位）をプラスミドpLPcat DN
Aの溶液に加え、得られた反応液を37℃でインキュベー
トした。Acc I消化したプラスミドpLPcat DNAをエタノ
ールで沈澱させ、10X Stu I緩衝液（５μ）、dH2O（4
0μ）、および制限酵素Stu I（５μ；約25単位）中
に再懸濁し、得られた反応液を37℃で２時間インキュベ
ートした。Acc I−Stu I消化したプラスミドpLPcat DNA
をエタノールで数回沈澱させて、他の消化産物（大きさ
が約16bpの制限フラグメント）を含まない、大腸菌の複
製起源およびAd2後期プロモーターを含有する〜4.81kb
Acc I−Stu I制限フラグメントを精製した。所望の〜4.
81kb制限フラグメントが約１μｇ得られ、これをTE緩衝
液（20μ）に溶解した。
プラスミドpLPcatの〜4.81kb Acc I−Stu I制限フラ
グメント（５μ）を、BKウィルスの〜1.28kb Acc I−
Pvu II制限フラグメント（５μ）に加えた。このDNA
混合物に、10Xリガーゼ緩衝液（３μ）、dH2O（15μ
）、およびT4 DNAリガーゼ（２μ；約1000単位）を
加えた後、得られたライゲーション反応液を16℃で一夜
インキュベートした。このライゲートしたDNAは所望の
プラスミドpBLcatからなっていた。
実施例３記載の方法に実質的に従い、このライゲート
化DNAを用いて大腸菌K12 HB101細胞を形質転換した。プ
ラスミドDNAの制限酵素分析によって、大腸菌K12 HB101
/pBLcat形質転換体を同定した。実質的に実施例３の方
法に従って、後の構築に用いるためにプラスミドpBLcat
DNAを調製した。
B.プラスミドpBL（GT）catの構築 実質的に実施例4B.1の方法に従って、dH2O（30μ）
中の実施例１で調製したポリ−GT要素（約１μｇ）をXh
o Iで消化した。実質的に実施例4B.1の方法に従って、T
E緩衝液（10μ）中のプラスミドpBLcat DNA（約23μ
ｇ）をXho Iで消化し、ホスファターゼ処理した。実質
的に実施例4B.1の方法に従って、Xho I消化したホスフ
ァターゼ処理プラスミドpBLcat DNAとXho I消化ポリ−G
T要素をライゲートした。ライゲートしたDNAは目的のプ
ラスミドpBL（GT）catからなっていた。プラスミドpBL
（GT）catの制限部位および機能地図を添付の第５図に
示す。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて、大腸菌K12 HB101細胞を形質転換した。形質
転換細胞を、50μg/mlアンピシリン含有のＬ寒天で平板
培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析を用いて、大腸
菌K12 HB101/pBL（GT）cat形質転換体を同定した。実質
的に実施例３に記載のプラスミドの単離方法に従って、
形質転換体からプラスミドpBL（GT）cat DNAを単離し
た。
実施例６ プラスミドpSBLcatおよびpSBL（GT）catの構
築 A.プラスミドpSBLcatの構築 プラスミドpBLcat DNA（約100μｇ）を、10X Hind II
I緩衝液［0.5M NaCl;0.1Mトリス−HCl（pH8.0）;0.1M M
gCl2;および1mg/ml BSA］（10μ）およびdH2O（80μ
）に溶解した。制限酵素Hind III（約10μ）；約10
0単位）をプラスミドpBLcat DNA溶液に加え、得られた
反応液を37℃で２時間インキュベートした。BKエンハン
サーおよびAd2の後期プロモーターを含む〜0.87kb Hind
III制限フラグメントが他の消化産物から充分に分離さ
れるまでHind III消化プラスミドpBLcat DNAを１％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、次いで、実質的に実施例4A
の方法に従って、〜0.87kbフラグメントを単離し、ライ
ゲーション用に調製した。目的のフラグメントが約10μ
ｇ得られ、TE緩衝液50μに溶解した。
TE緩衝液（１μ）中のプラスミドpSV2cat DNA（約
１μｇ）を、10X Hind III緩衝液（２μ）およびdH2O
（16μ）に溶解した。制限酵素Hind III（１μ；約
10単位）をDNA溶液に加え、得られた反応液を37℃で２
時間インキュベートした。反応混合物を、まずフェノー
ルで、次にクロロホルムで２回抽出することによって、
反応を停止させた。Hind III消化のプラスミドpSV2cat
DNAをエタノールで沈澱させ、TE緩衝液（100μ）に再
懸濁させた。実質的に実施例4Bの方法に従って、Hind I
II消化プラスミドpSV2cat DNAを、ウシ腸アルカリホス
ファターゼで処理し、TE緩衝液（10μ）に再懸濁させ
た。
プラスミドpBLcatの〜0.87kb Hind III制限フラグメ
ント（約５μ）をHind III消化のプラスミドpSV2cat
（10μ）に加え、次いで10Xリガーゼ緩衝液（３μ
）、T4 DNAリガーゼ（２μ；約1000単位）、および
dH2O（13μ）を、DNA溶液に加え、得られた反応液を1
6℃で２時間インキュベートした。ライゲートしたDNA
は、目的のプラスミドpSBLcatからなっていた。実質的
に実施例３の方法に従って、ライゲート化DNAを用い
て、大腸菌K12 HB101を形質転換した。形質転換細胞
を、アンピシリン含有のＬ−寒天において平板培養し、
アンピシリン耐性形質転換体のプラスミドDNAを制限酵
素分析によって試験して大腸菌K12 HB101/pSBLcat形質
転換体を同定した。BKエンハンサーおよびAd2の後期プ
ロモーターをコードしている〜0.87kb Hind III制限フ
ラグメントは、Hind III消化プラスミドpSBLcatに、２
つの配向のうちのどちらかで挿入されている（どちらか
一方だけがプラスミドpSBLcatを生じる）。
B.プラスミドpSBL（GT）catの構築 実質的に実施例4B.1の方法に従って、BKエンハンサー
とAd2の後期プロモーターの間にある、プラスミドpSBLc
atの唯一のXho I部位にポリ−GT要素を挿入する。Xho I
消化のポリ−GT要素Xho I消化のプラスミドpSBLcat DNA
をライゲートする。ライゲートしたDNAは、目的のプラ
スミドpSBL（GT）catからなっている。プラスミドpSBL
（GT）catの制限部位および機能地図を添付の第６図に
示す。
実施例７ プラスミドpL133の構築 A.中間体プラスミドpSV2−HPC8の構築 プラスミドpHC7はヒトプロテインＣをコードしている
DNA配列を含有している。15μg/mlテトラサイクル含有
のＬブロス（１）に大腸菌K12 RR1/pHC7（NRRL B−15
926、1985年１月29日寄託）の培養物を接種し、実質的
に実施例３の方法に従ってプラスミドpHC7 DNAを単離
し、精製した。この操作により約1mgのプラスミドpHC7
DNAが得られ、これをTE緩衝液（1ml）に懸濁し、−20℃
で保存した。プラスミドpHC7の制限部位および機能地図
を添付の第７図に示す。
プラスミドpHC7 DNA（50μ）を、制限酵素Ban I
（５μ；約50単位）、10XのBan I反応緩衝液［1.5M N
aCl;60mMトリスHCl（pH7.9）;60mM MgCl2;および1mg/ml
BSA］（10μ）およびdH2O（35μ）と混合し、消化
が完結するまでインキュベートした。次いで、〜1.25kb
Ban I制限フラグメントが他の消化産物から分離するま
で、このBan I消化したプラスミドpHC7 DNAを3.5％ポリ
アクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルア
ミド＝29:1）電気泳動にかけた。
この〜1.25kb Ban I制限フラグメントを含有するゲル
部分をゲルから切り出し、試験管に入れ、小さいフラグ
メントに破砕した。このフラグメントを含有する試験管
に抽出緩衝液［500mM酢酸アンモニウム;10mM酢酸マグネ
シウム;1mM EDTA;1％SDS;および10mg/ml tRNA］（1ml）
を加え、試験管を37℃に一夜保った。遠心して残骸をペ
レット化し、上清を新しい試験管に移した。残骸を抽出
緩衝液（200μ）で１回洗浄し、洗浄液の上清を、最
初の、一夜抽出物からの上清といっしょにした。この上
清をガラスウールのプラグに通した後、２倍量のエタノ
ールを加え、混合した。得られた溶液を〜10分間ドライ
アイス−エタノール浴に入れ、次いで遠心してDNAをペ
レット化した。
この操作により約８μｇの〜1.25kb Ban I制限フラグ
メントが得られた。この精製フラグメントをTE緩衝液
（10μ）に懸濁し、−20℃で保存した。プラスミドpS
V2−2HPC8を構築するためには、リンカーの付加によっ
てBan I制限フラグメントを修飾しなければならなかっ
た。実質的に実施例１記載の方法に従ってリンカーの構
築に用いるDNAフラグメントを合成した。
T4ポリヌクレオチドキナーゼ（約0.5μ;15単位）、
10X リガーゼ緩衝液（２μ）、500μM ATP（10μ
）、およびdH2O（7.5μ）を含む反応緩衝液（20μ
）中で、合成した１本鎖リンカーのそれぞれ500ピコ
モル（pM）をキナーゼ処理した。このキナーゼ反応液を
37℃で30分間インキュベートし、次いで100℃で10分間
インキュベートして反応を止めた。キナーゼ化を完全に
するため、反応液を氷上で冷却し、反応混合物に0.2M D
DT（２μ）、5mM ATP（2.5μ）、およびT4ポリヌク
レオチドキナーゼ（15単位）を加えて混合し、この反応
混合物を37℃でさらに30分間インキュベートした。100
℃でさらに10分間インキュベートすることによって反応
を止め、次いで氷上で冷却した。
キナーゼ処理は別々に行ったが、キナーゼ反応後、２
種類の１本鎖DNAリンカーを混合した。これらの鎖をア
ニールするため、キナーゼ反応混合物を、約150mlの水
を入れた水浴中、100℃で10分間インキュベートした。
インキュベーション後、水浴の加熱を止め、室温まで冷
却した。この過程に約３時間かかった。次いで、キナー
ゼ処理したDNAの試験管を入れたまま水浴を４℃で一夜
インキュベートした。この操作により１本鎖がアニール
された。作成したリンカーは以下の構造を有していた： このリンカーを使用時まで−20℃で保存した。
〜1.25kb Ban Iフラグメント（約８μｇ）を、リンカ
ー（〜50μ；約500pM）、T4 DNAリガーゼ（１μ；
約500単位）、10Xリガーゼ緩衝液（10μ）、およびdH
2O（29μ）に加えて混合し、得られたライゲーション
反応液を４℃で一夜インキュベートした。65℃で10分間
インキュベートすることによってライゲーション反応を
止めた。最終濃度が0.3Mとなるように酢酸ナトリウムを
加え、２倍量のエタノールを加え、ドライアイス−エタ
ノール浴で冷却し、そしてこの溶液を遠心することによ
ってDNAをペレット化した。
このDNAペレットを、10XのApa I反応緩衝液［60mM Na
Cl;60mMトリス−HCl（pH7.4）;60mM MgCl2;および60mM
の２−メルカプトエタノール］（10μ）、制限酵素Ap
a I（５μ；約50単位）およびdH2O（85μ）に溶解
し、反応液を37℃で２時間保った。次いで上記のように
して反応を止め、DNAをペレット化した。このDNAペレッ
トを、10XのHind III反応緩衝液（10μ）、制限酵素H
ind III（５μ；約50単位）およびdH2O（85μ）に
溶解し、反応液を37℃で２時間保った。Hind III消化
後、実質的に実施例4Aに記載の方法に従って、反応混合
物を3.5％ポリアクリルアミドゲルにかけ、目的の〜1.2
3kb Hind III−Apa I制限フラグメントを単離した。目
的のフラグメントが約５μｇ得られ、これをTE緩衝液
（10μ）に懸濁し、−20℃で保存した。
プラスミドpHC7 DNA（50μ）を、制限酵素Pst I
（５μ；約50単位）、10X Pst I反応緩衝液［1.0M Na
Cl;100mMトリス−HCl（pH7.5）;100mM MgCl2;および1mg
/ml BSA］（10μ）およびdH2O（35μ）と混合し、3
7℃で２時間インキュベートした。次いで、実質的に上
記記載の方法に従って、Pst I消化したプラスミドpHC7
DNAを、3.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、
目的の〜0.88kbフラグメントを精製した。目的のフラグ
メントが約５μｇ得られ、これをTE緩衝液（10μ）に
懸濁し、−20℃で保存した。
この〜0.88kb Pst Iフラグメント（約５μｇ）を、実
施例１に記載の自動DNA合成機で作成した以下のリンカ
ー（約50μ）に加えて混合した： このDNA混合物に、T4 DNAリガーゼ（約１μ；約10単
位）、10Xのリガーゼ緩衝液（10μ）、およびdH2O（2
9μ）を加え、得られたライゲーション反応液を４℃
で一夜インキュベートした。
このライゲーション反応を、65℃で10分間インキュベ
ートすることによって止めた。ライゲートしたDNAを沈
澱させた後、DNAペレットを10XのApa I反応緩衝液（10
μ）制限酵素Apa I（５μ；約50単位）およびdH2O
（85μ）に溶解し、反応液を37℃で２時間保った。次
いでもう一度反応を止め、DNAをペレット化した。このD
NAペレットを、10XのBgl II反応緩衝液［1M NaCl;100mM
トリス−HCl（pH7.4）;100mM MgCl2;100mM 2−メルカプ
トエタノール；および1mg/ml BSA］（10μ）、制限酵
素Bal II（５μ；約50単位）およびdH2O（85μ）に
溶解し、反応液を37℃で２時間保った。Bgl II消化の
後、実質的に上記の方法に従って、反応混合物を3.5％
ポリアクリルアミドゲルにかけ、目的の〜0.19kb Apa I
−Bgl II制限フラグメントを単離した。目的のフラグメ
ントが約１μｇ得られ、これをTE緩衝液（10μ）に懸
濁し、−20℃で保存した。
公的に入手可能なプラスミドpSV2gpt DNA（ATCC 3714
5）（約10μｇ）を、10X Hind III反応緩衝液（10μ
）、制限酵素Hind III（５μ；約50単位）およびdH
2O（85μ）に溶解し、反応液を37℃で２時間保った。
次いでこの反応混合物を、酢酸ナトリウムが0.25Mとな
るようにし、２倍量のエタノールを加えてドライアイス
−エタノール浴でインキュベートした後、遠心してDNA
をペレット化した。このDNAペレットを、10X Bgl II緩
衝液（10μ）、制限酵素Bal II（５μ；約50単位）
およびdH2O（85μ）と混合し、反応液を37℃で２時間
保った。Bal II消化の後、反応混合物を１％のアガロー
スゲルにかけ、電気泳動してフラグメントを分離した。
ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で見える
ようにし、目的の〜5.1kb Hind III−Bgl IIフラグメン
トを含有するバンドをゲルから切り出し、これを透析管
に入れ、DNAがアガロースから溶出してしまうまで電気
泳動を続けた。透析管からのDNA含有緩衝液をフェノー
ルおよびクロロホルムで抽出し、次いでDNAをエタノー
ル沈澱させた。このペレットは目的のプラスミドpSV2gp
tの〜5.1kb Hind III−Bgl II制限フラグメント（約５
μｇ）からなり、これをTE緩衝液（10μ）に再懸濁し
た。
〜1.23kb Hind III−Apa I制限フラグメント（２μ
）、〜0.19kb Apa I−Bal IIフラグメント（３μ
）、および〜5.1kb Hind III−Bgl IIフラグメント
（２μ）を混合し、次いで、10Xリガーゼ緩衝液（10
μ）、T4 DNAリガーゼ（１μ；約500単位）、およ
びdH2O（82μ）とともに16℃で一夜インキュベートし
た。このライゲートしたDNAは目的のプラスミドpSV2−H
PC8からなっていた。このプラスミドの制限部位および
機能地図を添付の第７図に示す。
大腸菌K12 RR1（NRRL B−15210、1982年10月19日寄
託）細胞を、実質的に実施例３に記載の方法に従い、形
質転換用にコンピテントにした。上記調製のライゲート
化DNAを用いてこの細胞を形質転換した。形質転換混合
物の一部を、100μg/mlアンピシリン含有のＬ−寒天プ
レートで平板培養した。次いで、このプレートを37℃で
インキュベートした。プラスミドDNAの制限酵素分析に
よって大腸菌K12 RP1/pSV2−HPC8形質転換体を確認し
た。
B.プラスミドpL133の最終的な構築 プラスミドpSV2−HPC8（50μｇ）を、10XのHind III
反応緩衝液（10μ）、制限酵素Hind III（５μ；約
50単位）およびdH2O（85μ）に溶解し、反応液を37℃
で２時間インキュベートした。Hind III消化の後、DNA
を沈澱させ、そのDNAペレットを10X Sal I反応緩衝液
［1.5M NaCl;60mMトリス−HCl（pH7.9）;60mM MgCl2;60
mM 2−メルカプトエタノール；および1mg/ml BSA］（10
μ）、制限酵素Sal I（５μ；約50単位）およびdH2
O（85μ）に溶解した。得られたSal I反応混合物を37
℃で２時間インキュベートした。次に、目的の〜0.29kb
Hind III−Sal I制限フラグメントが他の反応生成物か
ら分離するまで、このHind III−Sal I消化したプラス
ミドpSV2−HPC8を3.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけた。実質的に上記Ａに記載の方法に従って、目
的のフラグメントをゲルから分離した。このフラグメン
トが約２μｇ得られ、これをTE緩衝液（10μ）に懸濁
した。
プラスミドpSV2−HPC8（50μｇ）を、10X Bgl II反応
緩衝液（10μ）、制限酵素Bal II（５μ；約50単
位）、およびdH2O（85μ）に溶解し、反応液を37℃２
時間インキュベートした。Bal II消化の後、DNAを沈澱
させ、そのDNAペレットを10X Sal I反応緩衝液（10μ
）、制限酵素（５μ；約50単位）、およびdH2O（85
μ）に溶解した。得られたSal I反応混合物を37℃で
２時間インキュベートした。目的の〜1.15kb Sal I−Bg
l II制限フラグメントが他の反応生成物から分離するま
で、このSal I−Bgl II消化プラスミドpSV2−HPC8を3.5
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。実質的に
上記Ａに記載の方法に従って、〜1.15kb Sal I−Bgl II
制限フラグメントをゲルから分離して約８μｇのフラグ
メントを得、これをTE緩衝液（10μ）に懸濁させた。
プラスミドpSV2−β−グロビン DNA（NRRL B−1592
8、1985年１月29日寄託）（約10μｇ）を、10XのHind I
II反応緩衝液（10μ）、制限酵素Hind III（５μ；
約50単位）およびdH2O（85μ）に溶解し、反応液を37
℃で２時間保った。次いでこの反応混合物を、酢酸ナト
リウムが0.25Mとなるようにし、２倍量のエタノールを
加えてドライアイス−エタノール浴でインキュベートし
た後、遠心してDNAをペレット化した。このHind III消
化したプラスミドpSV2−β−グロビンDNAを、10X Bal I
I緩衝液（10μ）、制限酵素Bal II（５μ；約50単
位）およびdH2O（85μ）と混合し、反応液を37℃で２
時間保った。Bal II消化の後、反応混合物を１％のアガ
ロースゲルにかけ、電気泳動によってフラグメントを分
離した。実質的に実施例4Aに記載の方法に従って、目的
の4.2kb Hind III−Bal II制限フラグメントをゲルから
分離して約５μｇの目的フラグメントを得、これをTE緩
衝液（10μ）に懸濁させた。
プラスミドpSV2−HPC8の〜0.29kb Hind III−Sal Iフ
ラグメント（２μ）、プラスミドpSV2−HPC8の〜1.15
kb Sal I−Bgl IIフラグメント（２μ）、およびプラ
スミドpSV2−β−グロビンの〜4.2kb Hind III−Bgl II
フラグメント（２μ）を混合し、実質的に上記Ａの方
法に従ってライゲートした。このライゲートしたDNAは
目的のプラスミドpL133からなっていた。このプラスミ
ドpL133の制限部位および機能地図を添付の第７図に示
す。形質転換するDNAとして、プラスミドpSV2−HPC8の
かわりにプラスミドpL133を用いること以外は、実質的
にＡの教示に従って、目的の大腸菌K12 RR1/pL133形質
転換体を作成した。
実施例８ プラスミドpLPCおよびpLPC（GT）の構築 A.プラスミドpLPCの構築 実施例5Aで調製したプラスミドpBLcat DNA（約20μ
ｇ）を、10X Hind III緩衝液（10μ）およびdH2O（80
μ）に溶解した。このプラスミドpBLcat DNA溶液に制
限酵素Hind III（約10μ；約100単位）を加え、得ら
れた反応液を37℃で２時間インキュベートした。次い
で、BKエンハンサーおよびAd2後期プロモーターを含有
する〜0.87kb Hind III制限フラグメントが他の消化産
物から分離するまで、このHind III消化したプラスミド
pBLcat DNAを１％アガロースゲル電気泳動にかけ、次い
で、実質的に実施例4Aの方法に従って、〜0.87kbフラグ
メントを単離し、ライゲーション用に調製した。目的の
フラグメントが約２μｇ得られ、これをTE緩衝液（５μ
）に溶解した。
実施例７で調製したプラスミドpL133 DNA（約1.5μ
ｇ）を、10X Hind III緩衝液（２μ）およびdH2O（16
μ）に溶解した。このDNA溶液に制限酵素Hind III
（約１μ；約10単位）を加え、得られた反応液を37℃
で２時間インキュベートした。次いで、このDNAをTE緩
衝液で100μまで希釈し、実質的に実施例３記載の方
法に従って、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し
た。このHind III消化のプラスミドpL133 DNAをフェノ
ールで２回、クロロホルムで１回抽出し、エタノールで
沈澱させ、TE緩衝液（10μ）に再懸濁した。
プラスミドpBLcatの〜0.87kb Hind III制限フラグメ
ント（約５μ）を、Hind III消化したプラスミドpL13
3（1.5μ）に加え、次いでこのDNA溶液に、10Xリガー
ゼ緩衝液（１μ）、T4 DNAリガーゼ（１μ；約1000
単位）、およびdH2O（1.5μ）を加え、得られた反応
液を16℃で一夜インキュベートした。このライゲートし
たDNAは目的のプラスミドpLPCからなっていた。
このライゲート化DNAを用い、実質的に実施例３の方
法に従って大腸菌K12 HB101を形質転換した。形質転換
細胞をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、制限
酵素分析によってアンピシリン耐性形質転換体のプラス
ミドDNAを試験して、大腸菌K12 HB101/pLPC形質転換体
を同定した。BKエンハンサーおよびAd2後期プロモータ
ーをコードしている〜0.87kb Hind III制限フラグメン
トは、Hind III消化したプラスミドpL133中に、２つの
配向のうちのどちらかで挿入されている（どちらか一方
だけがプラスミドpLPCを生じる）。
B.プラスミドpLPC（GT）の構築 目的のプラスミドpLPC（GT）を得るために、構築にお
いてプラスミドpBLcatの〜0.87kb Hind IIIフラグメン
トの代わりにプラスミドpBL（GT）catの〜0.93kb Hind
IIIプラグメントを用いる以外は、上記Ａと同様の方法
でプラスミドpLPC（GT）を調製した。BKエンハンサー、
ポリ−GT要素およびAd2後期プロモーターをコードして
いる〜0.93kb Hind III制限フラグメントは、Hind III
消化プラスミドpL133中に、２つの配向のうちどちらか
で挿入することができる［どちらか一方だけがプラスミ
ドpLPC（GT）を生じる］。プラスミドpLPC（GT）の制限
部位および機能地図を添付の第８図に示す。プラスミド
pLPCおよびpLPC（GT）の唯一の相違点は、プラスミドpL
PC（GT）にポリ−GT要素が存在していることである。
別法によれば、実質的に実施例4B.1の方法に従って、
BKエンハンサーとAd2後期プロモーターの間にある、プ
ラスミドpLPCの唯一のXho I部位にポリ−GT要素を挿入
することによってプラスミドpLPC（GT）を調製する。
実施例９ プラスミドpLPC4、pLPC5、pLPC4（GT）およ
びpLPC5（GT）の構築 A.プラスミドpLPC4およびpLPC5の構築 実施例２で調製したBKウィルスDNA（約１μg;1μ）
および実施例8Aで調製したプラスミドpLPC（１μg;1μ
）を、10X EcoR I緩衝液［1.0Mトリス−HCl（pH7.
5）;0.5M NaCl;50mM MgCl2;および1mg/ml BSA］（２μ
）およびdH2O（14μ）に溶解した。制限酵素EcoR I
（２μ；約10単位）をDNA溶液に加え、得られた反応
液を37℃で２時間インキュベートした。EcoR I消化し
た、BKウィルスとプラスミドpLPC DNAの混合物を緩衝化
フェノールで１回、およびクロロホルムで１回抽出し
た。次いで、NaCl濃度を0.25Mに調整し、２倍量のフェ
ノールを加え、この溶液をドライアイス−エタノール浴
で２分間インキュベートし、この溶液を遠心してDNAを
ペレット化することによってDNAを集めた。上清を廃棄
し、DNAペレットを70％エタノールで洗浄し、乾燥し、T
E緩衝液12μに再懸濁した。
dH2O（約13μ）および10Xリガーゼ緩衝液（３μ
）を、EcoR I消化した、BKウィルスとプラスミドpLPC
DNAの混合物に加えた。T4 DNAリガーゼ（２μ；約10
0単位）をDNA溶液に加え、得られた反応液を16℃で２時
間インキュベートした。ライゲートしたDNAは、目的の
プラスミドpLPC4およびpLPC5（挿入されたBKウィルスDN
Aの配向だけが異なる）からなっていた。
ライゲートしたDNAは、目的のpLPC4およびpLPC5から
なっており、実質的に実施例３の方法に従って、これを
用いて大腸菌K12 HB101コンピテント細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を100μg/mlアンピシリン含有のＬ−
寒天で平板培養した。大腸菌K12 HB101/pLPC4および大
腸菌K12 HB101/pLPC5形質転換体を、そのアンピシリン
耐性表現型およびそのプラスミドDNAの制限酵素分析に
よって同定した。
B.プラスミドpLPC4（GT）およびpLPC5（GT）の構築 プラスミドpLPCの代わりに、実施例8Bで調製したプラ
スミドpLPC（GT）を構築に用いる以外は、pLPC4およびp
LPC5に関する上記Ａと同じ方法でプラスミドpLPC4（G
T）およびpLPC5（GT）を調製する。別に、実質的に実施
例4B.1の方法に従って、各々、プラスミドpLPC4およびp
LPC5の唯一のXho I部位にポリ−GT要素を挿入すること
によって、プラスミドpLPC4（GT）およびpLPC5（GT）を
調製する。プラスミドpLPC4（GT）の制限部位および機
能地図を添付の第９図に示す。
実施例10 プラスミドpLPChyg1、pLPChyg2、pLPChyg1
（GT）およびpLPChyg2（GT）の構築 A.プラスミドpLPChyg1およびpLPChyg2の構築 大腸菌K12 RR1/pSV2hyg細胞を、NRRLから取得番号NRR
L B−18039のもとで入手する。実質的に実施例３の方法
に従って、この細胞からプラスミドpSV2hyg DNAを得
る。プラスミドpSV2hygの制限部位および機能地図を添
付の第10図に示す。
プラスミドpSV2hyg（約10μg;TE緩衝液10μ中）を1
0X BamH I緩衝液（２μ）およびdH2O（６μ）に加
えた。このDNA溶液に制限酵素BamH I（２μ；約20単
位）を加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベ
ートした。この反応液を始めにフェノールで抽出し、次
いでクロロホルムで２回抽出した。実質的に実施例4Aに
記載の方法に従って、このBamH I消化したプラスミドpS
V2hyg DNAを１％アガロースゲルにかけ、ハイグロマイ
シン耐性遺伝子を含有する〜2.5kbの制限フラグメント
を単離した。
10Xクレノウ緩衝液［４種類のdNTPそれぞれが0.2mM;
0.5Mトリス−HCl（pH7.8）;50mM MgCl2;0.1M 2−メルカ
プトエタノール；および100μg/ml BSA］（約５μ）
およびdH2O（35μ）を、BamH I消化したプラスミドpS
V2hyg DNAの溶液に加え、次にこのDNA混合物にクレノウ
酵素（BRLから市販）（約25単位；約５μ）を加え、
得られた反応液を16℃で30分間インキュベートした。こ
のクレノウ処理してBamH I消化したプラスミドpSV2hyg
DNAをフェノールで１回、クロロホルムで１回抽出し、
次いでエタノールで沈澱させた。目的のフラグメントが
約２μｇ得られ、これをTE緩衝液（５μ）に懸濁させ
た。
プラスミドpLPC DNA（約10μg;10μ）を、10X Stu
I緩衝液（２μ）およびdH2O（６μ）に加えた。こ
のDNA溶液に、制限酵素Stu I（２μ；約10単位）を加
え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベートし
た。このStu I消化したプラスミドpLPC DNAをエタノー
ルで沈澱させ、遠心して集め、10XのNde I緩衝液［1.5M
NaCl;0.1Mトリス−HCl（pH7.8）;70mM MgCl2;60mM 2−
メルカプトエタノール；および1mg/ml BSA］（２μ）
およびdH2O（16μ）に再懸濁した。このStu I消化し
たDNAの溶液に、制限酵素Nde I（２μ；約10単位）を
加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベートし
た。
Nde I−Stu I消化したプラスミドpLPC DNAをエタノー
ルで沈澱させ、遠心して集め、10Xのクレノウ緩衝液
（５μ）およびdH2O（40μ）に再懸濁した。このDN
A溶液にクレノウ酵素（５μ；約25単位）を加え、得
られた反応液を16℃で30分間インキュベートした。クレ
ノウ反応の後、反応混合物を１％アガロースゲルにか
け、〜5.82kb Nde I−Stu I制限フラグメントをゲルか
ら単離した。目的のフラグメントが約５μｇ得られ、こ
れをTE緩衝液（５μ）に懸濁させた。
プラスミドpSV2hygの〜2.5kbのクレノウ処理したBamH
I制限フラグメント（約２μ）を、プラスミドpLPCの
〜5.82kbのクレノウ処理したNde I〜Stu I制限フラグメ
ント（約１μ）と混合し、このDNA溶液に、10Xリガー
ゼ緩衝液（約３μ）、T4 DNAリガーゼ（２μ；約10
00単位）、T4 RNAリガーゼ（１μ；約１単位）、およ
びdH2O（14μ）を加えた。得られた反応液を16℃で一
夜インキュベートした。このライゲートしたDNAは目的
のプラスミドpLPChyg1およびpLPChyg2からなり、それら
はプラスミドpSV2hygの〜2.5のクレノウ処理したBamH I
制限フラグメントの配向だけが異なっていた。このライ
ゲート化DNAを用い、実質的に実施例３の方法に従っ
て、大腸菌K12 HB101を形質転換した。目的の大腸菌K12
HB101/pLPChyg1および大腸菌K12 HB101/pLPChyg2形質
転換体を、アンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、
プラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した。
B.プラスミドpLPChyg1（GT）およびpLPChyg2（GT）の構
築 実質的に実施例4B.1の方法に従って、BKエンハンサー
とAd2後期プロモーターとの間にある、プラスミドpLPCh
yg1またはpLPChyg2の唯一のXho I部位にポリ−GT要素を
挿入する。Xho I消化したポリ−GT要素とXho Iした消化
プラスミドpLPChyg1またはpLPChyg2 DNAをライゲートす
る。このライゲートしたDNAは各々目的のプラスミドpLP
Chyg1（GT）およびpLPChyg2（GT）からなる。プラスミ
ドpLPChyg1（GT）の制限部位および機能地図を添付の第
11図に示す。
実施例11 プラスミドpBW32の構築 A.中間体プラスミドpTPA103の構築 プラスミドpTPA102はヒト組織プラスミノーゲン活性
化因子（TPA）の暗号配列を含有している。プラスミドp
TPA102は大腸菌K12 MM294/pTPA102［この菌株はNRRLか
ら取得番号NRRL B−15834（1984年８月10日寄託）のも
とで入手可能である］から単離することができる。プラ
スミドpTPA102の制限部位および機能地図を添付の第12
図に示す。プラスミドpTPA102 DNAを、実質的に実施例
３の方法に従って、大腸菌K12 MM294/pTPA102から単離
する。
プラスミドpTPA102（約50μg;TE緩衝液約50μ中）
を、10XのTthlll I緩衝液［0.5M NaCl;80mMトリス−HCl
（pH7.4）;80mM MgCl2;80mM 2−メルカプトエタノー
ル；および1mg/ml BSA］（10μ）およびdH2O（80μ
）に加えた。このDNA溶液に制限酵素Tthlll I（10μ
；約50単位）を加え、得られた反応液を65℃で２時間
インキュベートした。この反応混合物を１％アガロース
ゲルにかけ、TPA暗号配列を含有する〜4.4kb Tthlll I
制限フラグメントをゲルから単離した。その他の消化産
物、即ち3.1kbおよび0.5kb制限フラグメントは廃棄し
た。目的の〜4.4kb Tthlll I制限フラグメントが約10μ
ｇ得られ、これをTE緩衝液（10μ）に懸濁させた。
〜4.4kb Tthlll I制限フラグメントを含む溶液に10X
のクレノウ緩衝液（約５μ）およびdH2O（30μ）を
加え、さらにクレノウ酵素（５μ；約５単位）を加え
た後、この反応混合物を16℃で30分間インキュベートし
た。クレノウ反応の後、DNAをエタノールで沈澱させ、1
0Xのリガーゼ緩衝液（３μ）およびdH2O（14μ）に
再懸濁させた。
配列： で示されるBamH Iリンカー（ニュー・イングランド・バ
イオラブズ）を以下の方法によってキナーゼ処理し、ラ
イゲーション用に調製した。リンカー（４μ；約２μ
ｇ）を、dH2O（20.15μ）および10Xキナーゼ緩衝液
［500mMトリス−HCl（pH7.6）および100mM MgCl2］（５
μ）に溶解し、90℃で２分間インキュベートし、次い
で室温まで冷却した。この混合物に、γ−32P−ATP（５
μ；約20mCi）、1M DTT（2.5ml）およびポリヌクレオ
チドキナーゼ（５μ；約10単位）を加え、得られた反
応液を37℃で30分間インキュベートした。次いで、10mM
ATP（約3.35μ）およびキナーゼ（５μ）を加え、
反応液を37℃でさらに30分間保った。この放射活性ATP
は、リンカーが標的DNAにライゲートしたかどうかを決
定するのに役立つ。
キナーゼ処理したBamH Iリンカー（約10μ）を〜4.
4kb Tthlll I制限フラグメントの溶液に加え、さらにT4
RNAリガーゼ（２μ；約２単位）を加えた後、このラ
イゲーション反応液を４℃で一夜インキュベートした。
このライゲートしたDNAをエタノールで沈澱させ、10Xの
Hind III緩衝液（５μ）およびdH2O（40μ）に再懸
濁させた。このDNA溶液に制限酵素Hind III（５μ；
約50単位）を加え、得られた反応液を37℃で２時間イン
キュベートした。
このHind III消化したDNAをエタノールで沈澱させ、1
0X BamH I緩衝液（約10μ）およびdH2O（90μ）に
再懸濁させた。このDNA溶液に制限酵素BamH I（10μ
；約100単位）を加え、得られた反応液を37℃で２時
間インキュベートした。BamH I消化の後、反応混合物を
１％アガロースゲルにかけ、実質的に実施例4Aの方法に
従って、〜2.0kbのBamH I−Hind III制限フラグメント
をゲルから単離した。目的のフラグメントが約４μｇ得
られ、これをTE緩衝液（約５μ）に懸濁させた。
プラスミドpTPA103を構築するために、プラスミドpTP
A102由来の〜2.0kb BamH I−Hind III制限フラグメント
を、BamH I−Hind III消化したプラスミドpRCに挿入し
た。プラスミドpRCは、大腸菌trpオペロンのプロモータ
ーおよびオペレーター（trpPO）配列を含有する〜288bp
EcoR I−Cla I制限フラグメントを、EcoR I−Cla I消
化したプラスミドpKC7に挿入することによって構築し
た。プラスミドpKC7は、大腸菌K12 N100/pKC7として、A
TCCから取得番号ATCC 37084のもとで入手することがで
きる。trpPOを含有する〜288bp EcoR I−Cla I制限フラ
グメントはプラスミドpTPA102［このプラスミドは大腸
菌K12 MM294/pTPA102（NRRL B−15834）から単離するこ
とができる］から単離することができる。プラスミドpK
C7およびプラスミドpTPA102 DNAは、実質的に実施例３
の方法に従って、上記セルラインから得ることができ
る。プラスミドpTPA102の〜0.29kb EcoR I−Cla I制限
フラグメントは、大腸菌trp遺伝子の翻訳活性化配列の
大部分および転写活性化配列を含有し、以下の配列を有
している： すなわち、プラスミドpRCを構築するために、TE緩衝
液（10μ）中のプラスミドpKC7（約２μｇ）を、10X
Cla I緩衝液［0.5M NaCl;60mMトリス−HCl（pH7.9）;60
mM MgCl2;および1mg/ml BSA］（２μ）およびdH2O
（６μ）に加えた。このプラスミドpKC7 DNAの溶液に
制限酵素Cla I（２μ；約10単位）を加え、得られた
反応液を37℃で２時間インキュベートした。このCla I
消化したプラスミドpKC7 DNAをエタノールで沈澱させ、
10X EcoR I緩衝液（２μ）およびdH2O（16μ）に再
懸濁させた。pKC7 DNAに制限酵素EcoR I（２μ；約10
単位）を加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュ
ベートした。
このEcoR I−Cla I消化したプラスミドpKC7 DNAを、
フェノールで１回、次いでクロロホルムで２回抽出し
た。次いで、DNAをエタノールで沈澱させ、10Xリガーゼ
緩衝液（３μ）およびdH2O（20μ）に再懸濁した。
Cla I消化したプラスミドpKC7のプラスミド溶液の制限
部位および機能地図は、マニアティス等［Maniatis et
al.］のMolecular Cloning（Cold Spring Harbor Labor
atory,1982）８頁から入手することができる。
TE緩衝液（約20μ）中のプラスミドpTPA102（約20
μｇ）を、10X Cla I緩衝液（10μ）およびdH2O（60
μ）に加えた。このプラスミドpTPA102 DNAの溶液
に、制限酵素Cla I（10μ；約50単位）を加え、得ら
れた反応液を37℃で２時間インキュベートした。このCl
a I消化したプラスミドpTPA102 DNAをエタノールで沈澱
させ、10X EcoR I緩衝液（10μ）およびdH2O（80μ
）に再懸濁した。このCla I消化したプラスミドpTPA1
02 DNAの溶液に制限酵素EcoR I（10μ；約50単位）を
加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベートし
た。
このEcoR I−Cla I消化したプラスミドpTPA102 DNAを
フェノールで１回抽出し、trpPOを含有する〜288pb Eco
R I−Cla I制限フラグメントが他の消化産物から分離す
るまで、７％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
た。この〜288bp EcoR I−Cla I制限フラグメントをゲ
ルから単離した。目的のフラグメントが約１μｇ得ら
れ、これをTE緩衝液（５μ）に懸濁させ、上記のよう
にして調製したEcoR I−Cla I消化のプラスミドpKC7 DN
Aの溶液に加えた。次いでこのDNA混合物に、T4 DNAリガ
ーゼ（２μ；約1000単位）を加え、得られたライゲー
ション反応液を16℃で２時間インキュベートした。この
ライゲートしたDNAは目的のプラスミドpRC DNAからなっ
ていた。
このライゲート化DNAを用い、実質的に実施例３の方
法に従って、大腸菌K12 HB101コンピテント細胞を形質
転換した。形質転換細胞を100μg/mlアンピシリン含有
のＬ−寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分
析によってアンピシリン耐性形質転換体をスクリーニン
グして目的の大腸菌K12 HB101/pRCコロニーを同定し
た。実質的に実施例３の方法に従って、大腸菌K12 HB10
1/pRC形質転換体からプラスミドpRC DNAを得た。
TE緩衝液（２μ）中のプラスミドpRC DNA（約２μ
ｇ）を、10X Hind III緩衝液（２μ）およびdH2O（16
μ）に加えた。このプラスミドpRC DNAの溶液に、制
限酵素Hind III（２μ；約10単位）を加え、得られた
反応液を37℃で２時間インキュベートした。このHind I
II消化したプラスミドpRC DNAをエタノールで沈澱さ
せ、10X BamH I緩衝液（２μ）およびdH2O（16μ）
に再懸濁した。このHind III消化したプラスミドpRC DN
Aの溶液に制限酵素BamH I（２μ；約10単位）を加
え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベートし
た。
このBamH I−Hind III消化のプラスミドpRC DNAをフ
ェノールで１回、次いでクロロホルムで２回抽出した。
このDNAをエタノールで沈澱させ、10Xリガーゼ緩衝液
（３μ）およびdH2O（20μ）に再懸濁した。このBa
mH I−Hind III消化したプラスミドpRC DNAの溶液に、
プラスミドpTPA102の〜2.0kb Hind III−BamH I制限フ
ラグメント（約４μg;TE緩衝液約５μ中）を加えた。
このDNA混合物に、T4 DNAリガーゼ（２μ；約1000単
位）を加え、得られた反応液を16℃で２時間インキュベ
ートした。このライゲートしたDNAは目的のプラスミドp
TPA103 DNAからなっていた。
目的ではない形質転換体を減少させるため、このライ
ゲート化DNAを制限酵素Nco I（この酵素はプラスミドpR
Cを切断するがプラスミドpTPA103は切断しない）で消化
した。即ち、直線化したDNAは閉環した環状DNAに比べて
大腸菌を形質転換することが少ないので、Nco Iによっ
てライゲート化DNAを消化すると目的ではない形質転換
体が減少する。ライゲート化DNAを消化するため、始め
にDNAをエタノールで沈澱させ、次いで10XのNco I緩衝
液［1.5M NaCl;60mMトリス−HCl（pH7.8）;60mM MgCl2;
および1mg/ml BSA］（２μ）およびdH2O（16μ）に
再懸濁した。このDNA溶液に制限酵素Nco I（２μ；約
10単位）を加え、得られた反応液を37℃で２時間インキ
ュベートした。
ライゲートし、次いでNco I消化したこのDNAを用いて
大腸菌K12 RV308（NRRL B−15624、1983年９月28日寄
託）を形質転換した。実質的に実施例３の方法に従っ
て、大腸菌K12 RV308細胞をコンピテントにし、そして
形質転換した。形質転換混合物を100μg/mlアンピシリ
ン含有のＬ−寒天で平板培養した。プラスミドpRCはカ
ナマイシン耐性を与えるがプラスミドpTPA103は与えな
いので、アンピシリン耐性形質転換体をカナマイシン感
受性について試験した。次いでアンピシリン耐性かつカ
ナマインシン感受性の形質転換体を用いてプラスミドDN
Aを調製し、このプラスミドDNAを制限酵素分析をするこ
とによって大腸菌K12 RV308/pTPA103形質転換体を同定
した。プラスミドpTPA103の制限部位および機能地図を
添付の第12図に示す。実質的に実施例３の方法に従っ
て、大腸菌K12 RV308/pTPA103細胞からプラスミドpTPA1
03 DNAを単離した。
B.中間体プラスミドpBW25の構築 TE緩衝液（１μ）中のプラスミドpTPA103 DNA（約
１μｇ）を、10X Bal II緩衝液（２μ）およびdH2O
（16μ）に加えた。このプラスミドpTPA103 DNAの溶
液に、制限酵素Bal II（１μ；約５単位）を加え、得
られた反応液を37℃で２時間インキュベートした。この
Bal II消化したプラスミドpTPA103 DNAをエタノールで
沈澱させ、10Xクレノウ緩衝液（５μ）およびdH2O（4
4μ）に再懸濁した。このBgl II消化したプラスミドp
TPA103 DNAの溶液に、クレノウ酵素（１μ；約１単
位）を加え、得られた反応液を16℃で２時間インキュベ
ートした。このクレノウ処理してBgl II消化したプラス
ミドpTPA103 DNAをエタノールで沈澱させ、10Xリガーゼ
緩衝液（３μ）およびdH2O（22μ）に再懸濁した。
このクレノウ処理してBgl II消化したプラスミドpTPA
103 DNAの溶液に、配列： で示されるキナーゼ処理していないNde Iリンカー（ニ
ュー・イングランド・バイオラブズ）（約２μ;0.2μ
ｇ）を、T4 DNAリガーゼ（２μ；約1000単位）および
T4 RNAリガーゼ（１μ；約２単位）とともに加え、得
られたライゲート反応液を４℃で一夜インキュベートし
た。ライゲートしたDNAはプラスミドpTPA103derNde Iか
らなっていた（このプラスミドは、pTPA103derNde I
が、プラスミドpTPA103がBgl III認識配列を有している
ところにNde I認識配列を有していること以外は、実質
的にプラスミドpTPA103と同じである）。
このライゲートしたDNAを用い、実質的に実施例３に
記載の方法に従って、大腸菌K12 RV308コンピテント細
胞を形質転換した。この形質転換細胞をアンピシリン含
有のＬ−寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素
分析によって、大腸菌K12 RV308/pTPA103derNde I形質
転換体を同定した。後の構築に用いるため、プラスミド
pTPA103derNde I DNAを、実質的に実施例３の方法に従
って、形質転換体から単離した。
TE緩衝液（10ml）中のプラスミドpTPA103derNde I DN
A（約10μｇ）を、10XのAva II緩衝液［0.6M NaCl;60mM
トリス−HCl（pH8.0）;0.1M MgCl2;60mM 2−メルカプト
エタノール；および1mg/ml BSA］（２μ）およびdH2O
（６μ）に加えた。このDNAに、制限酵素Ava II（２
μ；約10単位）を加え、得られた反応液を37℃で２時
間インキュベートした。〜1.4kb制限フラグメントが他
の消化産物から分離するまで、このAva II消化したDNA
を１％アガロースゲル電気泳動にかけた。次いでこのプ
ラスミドpTPA103derNde Iの〜1.4kb Ava II制限フラグ
メントをゲルから単離し、目的のフラグメント（約２μ
ｇ）を得、これをTE緩衝液（５μ）に懸濁した。
この〜1.4kb Ava II制限フラグメントの溶液に、10X
クレノウ緩衝液（５μ）、dH2O（35μ）、およびク
レノウ酵素（５μ；約５単位）を加え、得られた反応
液を16℃で30分間インキュベートした。このクレノウ処
理したDNAをエタノールで沈澱させ、10Xリガーゼ緩衝液
（３μ）およびdH2O（14μ）に再懸濁した。
実質的に上記Ａの方法に従って、配列： で示されるHpa Iリンカー（約２μ）をキナーゼ処理
した。クレノウ処理した、プラスミドpTPA103derNde I
の〜1.4kb Ava II制限フラグメントの溶液に、このキナ
ーゼ処理したリンカー（約10μ）を、T4 DNAリガーゼ
（２μ；約1000単位）およびT4 RNAリガーゼ（１μ
；約１単位）とともに加え、得られた反応液を16℃で
一夜インキュベートした。
このライゲート化DNAをフェノールで１回、クロロホ
ルムで１回抽出し、エタノールで沈澱させ、10X EcoR I
緩衝液（２μ）およびdH2O（16μ）に再懸濁した。
このDNA溶液に、制限酵素EcoR I（２μ；約10単位）
を加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベート
した。このEcoR I消化したDNAをフェノールで１回、ク
ロロホルムで２回抽出し、エタノールで沈澱させ、10X
リガーゼ緩衝液（３μ）およびdH2O（20μ）に再懸
濁した。このようにして調製した、〜770bpの大きさ
の、trpPOおよびTPAのアミノ末端をコードしているフラ
グメントは、EcoR I適合末端を１つおよび平滑末端を１
つ有しており、これを、以下のとおり、EcoR I−Sma I
消化したプラスミドpUC19にライゲートしてプラスミドp
U19TPAFEを得た。
プラスミドpUC19［BRLから入手可能］（約２μｇ）
を、10XのSma I緩衝液［0.2M KCl;60mMトリス−HCl（pH
8.0）;60mM MgCl2;60mM 2−メルカプトエタノール；お
よび1mg/ml BSA］（２μ）およびdH2O（16μ）に溶
解した。このDNA溶液に、制限酵素Sma I（２μ；約10
単位）を加え、得られた反応液を25℃で２時間インキュ
ベートした。このSma I消化したプラスミドpUC19 DNAを
エタノールで沈澱させ、遠心して集め、10X EcoR I緩衝
液（２μ）およびdH2O（16μ）に再懸濁した。この
Sma I消化したプラスミドpUC19 DNAの溶液に、制限酵素
EcoR I（２μ；約10単位）を加え、得られた反応液を
37℃で２時間インキュベートした。このEcoR I−Sma I
消化したプラスミドpUC19 DNAをフェノールで１回、ク
ロロホルムで２回抽出し、TE緩衝液（５μ）に再懸濁
した。
EcoR I−Sma I消化したプラスミドpUC19 DNAを、プラ
スミドpTPA103derNde I由来の〜77bp EcoR I−平滑末端
制限フラグメントを含有する溶液に加えた。このDNA混
合物に、T4 DNAリガーゼ（２μ；約1000単位）を加
え、得られた反応液を16℃で一夜インキュベートした。
このライゲートしたDNAは目的のプラスミドpUC19TPAFE
からなっていた。プラスミドpUC19TPAFEの制限部位およ
び機能地図を添付の第12図に示す。
プラスミドpUC19TPAFEの構築に用いるEcoR IおよびSm
a I認識配列を含有する、プラスミドpUC19の多重クロー
ニング部位は、lacZ αフラグメントの暗号配列内に位
置している。lacZ ΔM15突然変異（βガラクトシダーゼ
をコードしているlacZ遺伝子における突然変異）を含有
する細胞においてこのlacZ αフラグメントを発現させ
ると、これらの細胞は機能的なβガラクトシダーゼ分子
を発現し、従ってこれらの細胞は、IPTG（イソプロピル
チオガラクトシド）の存在下でＸ−ガル（５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド；無色の化合物）をそのインジゴ色の加水分解産物
に加水分解する。プラスミドpUC19の多重クローニング
部位にDNAを挿入すると、lacZ αフラグメントの暗号配
列が乱され、lacZ ΔM15突然変異を有する（そのような
プラスミドを有する）細胞はＸ−ガルを加水分解するこ
とができない（なぜなら、コロニーは白色であり、イン
ジゴではないからである）。プラスミドpUC19TPAFEを構
成するこのライゲート化DNAを用い、実質的に実施例３
の方法に従って、形質転換用にコンピテントにした大腸
菌K12 RR1ΔM15（NRRL B−15440、1983年５月27日寄
託）細胞を形質転換した。
形質転換細胞を、100μg/mlアンピシリン、40μg/ml
X−ガル、および1mM IPTGを含有するＬ−寒天で平板培
養した。インジゴ色を呈しないコロニーを継代培養し、
これを用いてプラスミドDNAを調製し、プラスミドDNAの
制限酵素分析によって大腸菌K12 RR1ΔM15/pUC19TPAFE
形質転換体を同定した。後の構築にもちいるため、プラ
スミドpUC19TPAFE DNAを、実質的に実施例３の方法に従
って、大腸菌K12 RR1ΔM15/pUC19TPAFE細胞から単離し
た。
TE緩衝液（20μ）中のプラスミドpUC19TPAFE（約７
μｇ）を、10X Hpa I緩衝液［0.2M KCl;0.1Mトリス−HC
l（pH7.4）；および0.1M MgCl2］（10μ）およびdH2O
（70μ）に加えた。このプラスミドpUC19TPAFE DNAの
溶液に、制限酵素Hpa I（３μ；約６単位）を加え、
得られた反応液を37℃で20分間インキュベートした（こ
の短い反応時間は部分的にHpa I消化するために設定し
た）。この反応液を、1X BamH I緩衝液［150mM NaCl;10
mMトリス−HCl（pH＝8.0）；および10mM MgCl2;塩濃度
を高くするとHpa Iが不活性化する］（150μ）に調整
した。このHpa I（部分的）消化したDNAの溶液に、制限
酵素BamH I（１μ；約16単位）を加え、この得られた
反応液を37℃で90分間インキュベートした。
このBamH I−Hpa I（部分的）消化プラスミドpUC19TP
AFE DNAをエタノール沈澱で濃縮し、1.5％アガロースゲ
ルにかけ、実質的に実施例4Aの方法に従って、プラスミ
ドpUCATPAFEのレプリコン、βラクタマーゼ遺伝子、お
よびTPAコード化DNAのすべてを含有する〜3.42kb Hpa I
−BamH I制限フラグメントをゲルから単離した。目的の
フラグメントが約１μｇ得られ、これをTE緩衝液（20μ
）に懸濁した。
TE緩衝液（10μ）のプラスミドpTPA103（約10μ
ｇ）を、10X Sca I緩衝液［1.0M NaCl;60mMトリス−HCl
（pH7.4）;60mM MgCl2;10mM DTT;および1mg/ml BSA］
（10μ）およびdH2O（80μ）に溶解した。このプラ
スミドpTPA103 DNAの溶液に、制限酵素Sca I（３μ；
約18単位）を加え、得られた反応液を37℃で90分間イン
キュベートした。この反応液の容積を、1XのBamH I緩衝
液で150μに調整し、この混合物に制限酵素BamH I
（１μ；約16単位）を加え、次いで、37℃で90分間イ
ンキュベートした。このDNAをエタノールで沈澱させ、
遠心して集め、電気泳動用の調製物に再懸濁した。この
Sca I−BamH I消化したプラスミドpTPA103 DNAを、〜1.
015kb Sca I−BamH I制限フラグメントが他の消化産物
から分離するまで、1.5％アガロースゲル電気泳動にか
けた。上記のように、プラスミドpTPA103のTPAカルボキ
シ末端コード化DNAを含有する〜1.015kb Sca I−BamH I
制限フラグメントをゲルから単離し、目的のフラグメン
トが約0.5μ得られ、これをdH2O（20μ）に溶解し
た。
プラスミドpTPA103の〜1.015kb Sca I−BamH I制限フ
ラグメント（２μ）に、プラスミドpUC19TPAFEの〜3.
42kb BamH I−Hap I制限フラグメント（約２μ）を、
10X T4 DNAリガーゼ緩衝液（２μ）およびT4 DNAリガ
ーゼ（１μ）［約１バイス（Weiss）単位；このリガ
ーゼはプロメガ・バイオテック（Promega Biotec,2800
S.Fish Hatchery Road,Madison,WI 53711）から入手し
た］とともに加え、得られた反応液を16℃で一夜インキ
ュベートした。このライゲートしたDNAは目的のプラス
ミドpBW25からなっていた。このプラスミドpBW25の制限
部位および機能地図を添付の第14図に示す。
50mM CaCl2を用いること以外は実質的に実施例３の方
法に従い、このライゲート化DNAを用いて形質転換用に
コンピテントにしておいた大腸菌K12 JM105（BRLから入
手できる）を形質転換した。形質転換細胞を100μg/ml
アンピシリン含有のブレイン−ハート インフュージョ
ン寒天（BHI）［ディフコ・ラボラトリーズ（Difco Lab
oratories,Detroit,MI）］で平板培養し、プラスミドDN
Aの制限酵素分析によって大腸菌K12 JM105/pBW25形質転
換体を同定した。プラスミドpBW25を制限酵素EcoR Iで
消化すると、〜3.38kbおよび〜1.08kbの制限フラグメン
トが得られる。後の構築に用いるため、実質的に実施例
３の方法に従って、プラスミドpBW25を調製した。
C.TPA暗号領域の部位特異的な突然変異誘発およびプラ
スミドpBW28の構築 dH2O（10μ）中のプラスミドpBW25（約５μｇ）
を、10X Hind III反応緩衝液（10μ）およびdH2O（80
μ）に加えた。このプラスミドpBW25 DNAの溶液に、
制限酵素Hind III（１μ；約20単位）を加え、得られ
た反応液を37℃で90分間インキュベートした。このHind
III消化したプラスミドpBW25 DNAの溶液に、制限酵素E
coR I（３μ；約24単位）および1Mトリス−HCl（pH7.
6）（10μ）を加え、得られた反応液を37℃で90分間
インキュベートした。このEcoR I−Hind III消化したプ
ラスミドpBW25 DNAをエタノール沈澱で濃縮し、〜810bp
EcoR I−Hind III制限フラグメントが他の消化産物か
ら分離するまで、1.5％アガロースゲル電気泳動にかけ
た。実質的に実施例4Aの方法に従って、〜810bp EcoR I
−Hind III制限フラグメント（約0.5μｇ）をゲルから
単離し、ライゲーション用に調製し、これをdH2O（20μ
）に再懸濁した。
dH2O（35μ）中の複製型（RF）のM13mp8 DNA（ニュ
ー・イングランド・バイオラブズから入手できる）（約
4.5μｇ）を、10XのHind III緩衝液（10μ）およびdH
2O（55μ）に加えた。このM13mp8 DNAの溶液に、制限
酵素Hind III（１μ；約20単位）を加え、得られた反
応液を37℃で１時間インキュベートした。このHind III
消化したM13mp8 DNAの溶液に、制限酵素EcoR I（３μ
；約24単位）および1Mトリス−HCl（pH7.6）（10μ
）を加え、得られた反応液を37℃で１時間インキュベ
ートした。上記に従って、このHind III−EcoR I消化し
たM13mp8 DNAをエタノール沈澱で集め、アガロースゲル
電気泳動用の調製物に再懸濁し、大きい制限フラグメン
トをゲル電気泳動によって単離した。M13mp8の大きいEc
oR I−Hind III制限フラグメント（約１μｇ）が得ら
れ、これをdH2O（20μ）に懸濁した。M13mp8の大きい
EcoR I−Hind III制限フラグメント（約２μ）、10X
T4 DNAリガーゼ緩衝液（２μ）、dH2O（12μ）、お
よびT4 DNAリガーゼ（１μ；約１バイス単位）を、プ
ラスミドpBW25の〜810bp EcoR I−Hind III制限フラグ
メント（３μ）に加え、得られたライゲーション反応
液を16℃で一夜インキュベートした。
トランスフェクションに用いるDNAの量を変えること
以外は、実質的にBRL M13クローニング／‘ジデオキ
シ’シークエンシング・インストランクション・マニュ
アル（BRL M13 Cloning/‘Dideoxy'Sequencing Instruc
tion Manual）記載の方法に従って、大腸菌JM103細胞
（BRLから入手可能）をコンピテントにし、ライゲーシ
ョン混合物でトランスフェクションした。挿入によるβ
ガラクトシダーゼαフラグメントをコードしている遺伝
子の不活性化（これにより、Ｘ−ガルをそのインジゴ色
の切断産物に切断する能力が失われる）によって組換え
体プラークを同定した。スクリーニングするため、白い
プラーク６個を、各々、Ｌブロス（2.5ml）に入れ、こ
れに、最小培地ストックで培養してproABを有するＦエ
ピソームの保持を確実なものにした、大腸菌K12 JM103
（0.4ml）を、対数増殖期において加えた。このプラー
クを含有する細胞懸濁液（2.5ml）を、空気振盪器中、3
7℃で８時間インキュベートした。この溶液（1.5ml）か
ら得た細胞をペレット化し、実質的にバーンボイムおよ
びドーリィ［Birnboim and Doly,Nuc.Acids Res.,7:151
3（1979）］のアルカリ・ミニスクリーン法に従って、R
F DNAを単離した。各培養物の残りは４℃で保存した。
目的のファージ（MP8BW26と命名した）は、M13mp8の〜
7.2kb EcoR I−Hind III制限フラグメントにライゲート
したプラスミドpBW25の〜810bp EcoR I−Hind III制限
フラグメントを含有していた。
対数期の大腸菌JM103（約50ml）をMP8BW26で感染さ
せ、空気振盪器中、37℃で18時間インキュベートした。
低速遠心することによって感染細胞をペレット化し、上
記インストラクション・マニュアルの方法をスケールア
ップすることによって培養物上清から１本鎖MP8BW26 DN
Aを調製した。クレノウ反応を、室温で30分間、次いで3
7℃で60分間、次いで10℃で18時間行うこと以外は、実
質的にアデルマン等［Adelman et al.,DNA 2（３）:183
−193（1983）］の教示に従って、１本鎖MP8BW26を突然
変異誘発にかけた。さらに、S1処理を20℃で行ない、緩
衝液の塩濃度を製造元推奨の半分にし、そしてM13配列
決定（シークエンシング）プライマー（BRL）を用い
た。天然TPAのアミノ酸残基87から261に対応する暗号配
列を削除するために用いた合成オリゴデオキシリボヌク
レオチド・プライマーは以下の配列で示される： 得られた突然変異誘発混合物を用い、実質的に上記の
感染方法に従って、大腸菌K12 JM103をトランスフェク
ションした。RF DNAの制限酵素分析、およびマクサムお
よびギルバート（Maxam and Gilbert）のDNA配列決定に
よって目的の特然変異体を同定した。天然TPAのアミノ
酸残基87から261に対応する暗号配列が削除された目的
の突然変異体をMP8BW27と命名した。
プラスミドpBW28を構築するためには、多種のDNAフラ
グメントが必要である。それらフラグメントの第１のも
のを以下のようにして得た。dH2O（20μ）中のRF MP
8BW27 DNA（約20μｇ）を、10X Nde I緩衝液（10μ
）およびdH2O（60μ）に加えた。このプラスミドMP
8BW27 DNAの混合物に、制限酵素Nde I（10μ；約50
単位）を加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュ
ベートした。このNde I消化したMP8BW27 DNAをエタノー
ルで沈澱させ、遠心して集め、10X EcoR I緩衝液（10μ
）およびdH2O（90μ）に再懸濁した。このNde I消
化したプラスミドMP8BW27 DNAの溶液に、制限酵素EcoR
I（10μ；〜50単位）を加え、得られた反応液を37℃
で２時間インキュベートした。欠失部位を含むTPA暗号
配列の一部を含有する〜560bp Nde I−EcoR I制限フラ
グメントが他の消化産物から分離するまで、このEcoR I
−Nde I消化したMP8BW27 DNAをアガロースゲル電気泳動
にかけた。上記にしたがって、この〜560bp Nde I−Eco
R I制限フラグメントをゲルから単離し、目的のフラグ
メント（約0.5μｇ）を得、これをdH2O（20μ）に再
懸濁した。
プラスミドpBW28の構築に必要な第２のフラグメント
は、実質的に実施例１の方法に従って、鎖１本ずつ自動
DNA合成機で合成する。実質的に実施例7Aの方法に従っ
て、２本の相補的な鎖（これらの鎖は、ハイブリダイズ
してXba IおよびNde Iの重なり部分を有する２本鎖DNA
セグメントを形成する）をキナーゼ処理し、アニーリン
グする。このリンカーは以下の構造を有している： プラスミドpBW28の構築に必要な第３のフラグメトは
以下のようにして調製した。TE緩衝液（20μ）中のプ
ラスミドpTPA103（約20μｇ）を、10X BamH I緩衝液（1
0μ）およびdH2O（60μ）に加えた。このプラスミ
ドpTPA103 DNAの溶液に、制限酵素BamH I（10μ；約5
0単位）加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュ
ベートした。このBamH I消化のプラスミドpTPA103 DNA
をエタノールで沈澱させ、遠心して集め、10X EcoR I緩
衝液（10μ）およびdH2O（80μ）に再懸濁した。こ
のBamH I消化したプラスミドpTPA103 DNAの溶液に、制
限酵素EcoR I（10μ；約50単位）を加え、得られた反
応液を37℃で２時間インキュベートした。TPAのカルボ
キシ末端の暗号配列を含有する〜689bp EcoR I−BamH I
制限フラグメントが他の消化産物から分離するまで、こ
のBamH I−EcoR I消化したプラスミドpTPA103 DNAを1.5
％アガロースゲル電気泳動にかけた。上記のように、こ
の〜689bpフラグメント（約0.5μｇ）をゲルから単離
し、次いでdH2O（10μ）に再懸濁した。
プラスミドpBW28の構築に必要な最後のフラグメント
はプラスミドpL110［欧州特許出願第86306452.3号（198
7年４月８日にEP A 0 217 529のもと公開された）に記
載のプラスミド］から単離した。プラスミドpL110の制
限部位および機能地図は添付の第12図に示されており、
プラスミドpL110の構築は本実施例の下記Ｄに記載され
ている。
TE緩衝液（25μ）中のプラスミドpL110（約25μ
ｇ）を、10X Xba I緩衝液［0.5M NaCl:60mM トリス−HC
l（pH7.9）;60mM MgCl2;および1mg/ml BSA］（10μ）
およびdH2O（55μ）に加えた。このプラスミドpL110
DNAの溶液に、制限酵素Xba I（10μ；約50単位）を加
え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベートし
た。このXba I消化したプラスミドpL110 DNAをエタノー
ルで沈澱させ、遠心して集め、10X BamH I緩衝液（10μ
）およびdH2O（89μ）に再懸濁した。このXba I消
化したプラスミドpL110 DNAの溶液に、制限酵素BamH I
（１μ；約５単位）を加え、得られた反応液を37℃で
30分間インキュベートして、BamH I部分消化物を得た。
〜6.0kb Xba I−BamH Iフラグメントが他の消化産物か
ら明確に分離するまで、このXba I−BamH I部分消化し
たプラスミドpL110 DNAを１％アガロースゲル電気泳動
にかけた。上記に従って、この〜6.0kb制限フラグメン
トをゲルから単離し、約0.5μｇの〜6.0kb Xba I−BamH
I制限フラグメントを得、これをdH2O（約40μ）に懸
濁した。この〜6.0kb Xba I−BamH I制限フラグメント
は、EK−BGHをコードしているDNAを除き、プラスミドpL
110のすべてを含有している。
プラスミドpBW28を構築するため、次のフラグメン
ト、即ち、（１）プラスミドpL110の〜6.0kb BamH I−X
ba I制限フラグメント（約0.1μg:8μ）、（２）MP8B
W27の〜560bp Nde I−EcoR I制限フラグメント（約0.05
μg;2μ）、（３）プラスミドpTPA103の〜689bp EcoR
I−BamH I制限フラグメント（約0.1μg;2μ）、およ
び（４）〜45bp Xba I−Nde I合成リンカー（約0.02μ
g;1μ）を混合する。このDNA混合物に、10X T4 DNAリ
ガーゼ緩衝液（２μ）およびT4 DNAリガーゼ（１μ
；約１バイス単位）を加え、得られたライゲーション
反応液を４℃で一夜インキュベートする。ライゲートし
たDNAは目的のプラスミドpBW28からなっている。プラス
ミドpBW28の制限部位および機能地図を添付の第12図に
示す。
このライゲート化DNAを用い、50mM CaCl2を用いるこ
と以外は実質的に実施例３の方法に従って、コンピテン
トにしておいた大腸菌K12 MM294（NRRL B−15625、1983
年９月28日寄託）を形質転換した。プラスミドpBW28上
にラムダpLプロモーターおよび感温性ラムダpLリプレッ
サーをコードしている遺伝子が存在しているため、形質
転換方法および形質転換体の培養方法を若干変えた。形
質転換および次いで行う培養において、細胞を32℃以上
の温度にしなかった。ラムダpLプロモーターおよびその
感温性リプレッサーをコードするプラスミドを操作する
方法を、本実施例のＤにおいてさらに詳述する。目的の
大腸菌K12 MM294/pBW28形質転換体を、そのテトラサイ
クリン耐性かつアンピシリン感受性の表現型およびその
プラスミドDNAの制限酵素分析にって同定した。
D.プラスミドpL110の構築 プラスミドpKC283を出発物質として用いてプラスミド
pL110を構築した。大腸菌K12 BE1201/pKC283の凍結乾燥
品を、取得番号NRRL B−15830（1984年８月３日寄託）
のもと、NRRLから入手した。この凍結乾燥品をＬブロス
（10ml）の入った試験管内にデカンテーションし、32℃
で２時間インキュベートした。この時点で培養物を50μ
g/mlアンピシリンとし、次いで、32℃で一夜インキュベ
ートした。プラスミドpKC283はpLプロモーターを含んで
おり、かつ大腸菌K12 BE1201細胞は細胞性DNAに組込ま
れた温度感受性のcIリプレッサー遺伝子を含有している
ので、大腸菌K12 BE1201/pKC283細胞を32℃で培養し
た。本明細書中、後の実施例に記すように、このプラス
ミドの単離工程に野生型のラムダpLリプレッサー遺伝子
を含む細胞、あるいはラムダpLプロモーターを含まない
細胞を用いる場合には、インキュベーション温度を37℃
とした。
一夜培養の少量をとり、大腸菌K12 BE1201/pKC283の
単一のコロニー単離体が得られる様な方法で、50μg/ml
アンピシリン含有のＬ−寒天プレートに蒔いた。得られ
た単一のコロニーを50μg/mlアンピシリン含有のＬブロ
ス（10ml）に接種し、激しく振盪しながら32℃で一夜イ
ンキュベートした。この10mlの一夜培養物をＬブロス
（500ml）に接種し、培養物が定常相に達するまで激し
く振盪しながら32℃でインキュベートした。次いで、実
質的に実施例３の方法に従って、この細胞からプラスミ
ドpKC 283 DNAを調製した。約1mgのプラスミドpKC283が
得られ、これをTE緩衝液中、約１μg/mlの濃度で、４℃
に保存した。プラスミドpKC283の制限部位および機能地
図を添付の第12図に示す。
プラスミドpKC283 DNA（10μ、約10μｇ）を、10X
の中−塩制限緩衝液［500mM NaCl;100mMトリス−HCl（p
H7.5）;100mM MgCl2;および10mM DTT］（20μ）、1mg
/ml BSA（20μ）、制限酵素Pvu II（５μ、約25単
位）およびdH2O（145μ）と混合し、得られた反応液
を37℃で２時間インキュベートした。本明細書中に記載
の制限酵素反応は、常法により、フェノール、次いでク
ロロホルムで抽出することによって停止させ、続いてDN
Aを沈澱させ、エタノール洗浄し、そしてDNAをTE緩衝液
に再懸濁させる。上記のようにしてPvu II消化を停止さ
せた後、Pvu II消化プラスミド pKC283 DNAを沈澱さ
せ、次いで、TE緩衝液（５μ）を再懸濁した。
Xho Iリンカー（５′−CCTCGAGG−３′）［約600ピコ
モル（pM）］を、5Xミナーゼ緩衝液［300mMトリス−HCl
（pH7.8）;50mM MgCl2;および25mM DTT］（10μ）、5
mM ATP（５μ）、dH2O（24μ）、T4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ［0.5μ;P−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−L B
iochemicals）の定義であり約2.5単位］、1mg/ml BSA
（５μ）、および10mMスペルミジン（５μ）を含む
混合物中、混合物を37℃で30分間インキュベートするこ
とによってキナーゼ処理した。このキナーゼ処理したXh
oリンカー（約12.5μ）をPvu II−消化プラスミドpKC
283 DNA（５μ）に加え、このDNAに、10Xリガーゼ緩
衝液（2.5μ）、T4 DNAリガーゼ［2.5μ；約2.5単
位（Ｐ−Ｌバイオケミカルズの定義）］、10mMスペルミ
ジン（2.5μ）およびdH2O（12.5μ）を加えた。得
られたライゲーション反応液を４℃で一夜インキュベー
トした。ライゲーション反応の後、反応混合物の組成を
高−塩緩衝液［0.1M NaCl;0.05Mトリス−HCl（pH7.5）;
10mM MgCl2;および1mM DTT］の組成に調節した。この混
合物に制限酵素Xho I（約10μ;100単位）を加え、得
られた反応液を37℃で２時間インキュベートした。
ライゲーション混合物にXho Iリンカーを加えないと
いうこと以外は上記と同様にして、反応を停止させ、Xh
o I消化DNAを沈澱させ、再懸濁し、ライゲートさせた。
ライゲートしたDNAは所望のプラスミドpKC283PXからな
っていた。プラスミドpKC283PXの制限部位および機能地
図を添付の第12図に示す。
大腸菌K12 MO（λ＋）は、NRRLから、取得番号NRRL B
−15993（1984年８月14日寄託）のもと入手することが
できる。この大腸菌K12 MO（λ＋）は野生型のラムダpL
c Iリプレッサー遺伝子を含有しているので、ラムダpL
プロモーターからの転写は、この大腸菌K12MO（λ＋）
細胞内では起こらない。大腸菌K12MO（λ＋）の単一コ
ロニーを単離し、そしてこの細胞の一夜培養物（10ml）
を調製する（増殖培地にアンピシリンを用いない）。一
夜培養物（50μ）を10mM MgSO4および10mM MgCl2含有
のＬブロス（5ml）に接種した。この培養物を、激しく
振盪しながら37℃で一夜インキュベートした。翌朝、培
養物を10mM MgSO4および10mM MgCl2含有のＬブロスで20
0mlに希釈した。この希釈培養物を激しい振盪下におい
て、O.D.590が約0.5（約１×108細胞/mlの細胞密度を示
す）に達するまで、37℃でインキュベートした。氷−水
浴中で10分間、培養物を冷却し、次に４℃、4000Xgで10
分間遠心して細胞を集めた。この細胞ペレットを冷10mM
NaCl（100ml）に再懸濁した後、直ちに遠心して再ペレ
ット化した。この細胞ペレットを30mM CaCl2（100ml）
に再懸濁し、氷上で20分間インキュベートした。
遠心して細胞を再び集め、30mM CaCl2（10ml）中に再
懸濁した。細胞（0.5ml）を上記で調製したライゲート
化DNAに加えた（このDNAは30mM CaCl2に調製しておい
た）。この細胞−DNA混合物を氷上で１時間インキュベ
ートし、42℃で90秒間熱ショックを加えた後、氷上で約
２分間冷却した。この細胞−DNA混合物を125mlのフラス
コ中のＬブロス（10ml）に希釈し、37℃で１時間インキ
ュベートした。この100μずつをアンピシリン含有の
Ｌ−寒天プレートで平板培養し、コロニーが現われるま
で37℃でインキュベートした。
コロニーを個々に培養し、各コロニーのプラスミドDN
Aを制限酵素分析とゲル電気泳動によって調べた。プラ
スミドDNAの単離は、実質的に実施例３の方法に従い、
小さいスケールで行なったが、所望の大腸菌K12 MO（λ
＋）/pKC283PX形質転換体が同定されるまではCsCl勾配
の工程を削除した。プラスミドpKC283PXの制限部位およ
び機能地図を添付の第12図に示す。
プラスミドpKC283PX DNA（10μｇ）を、10Xの高−塩
緩衝液（20μ）、1mg/ml BSA（20μ）、制限酵素Bg
l II（５μ；約50単位）、制限酵素Xho I（５μ；
約50単位）およびdH2O（150μ）に溶解し、得られた
反応液を37℃で２時間インキュベートした。反応を止
め、Bgl II−Xho I消化DNAを沈澱させた後、DNAをTE緩
衝液（５μ）に再懸濁した。
実施例１に記載のように自動DNA合成機を用いて、Bgl
IIおよびXho I制限酵素切断の特徴を有する１本鎖DNA
末端のDNAリンカーを合成し、実施例7Aに記載したよう
にキナーゼ処理した。このDNAリンカーは次の構造を有
している： このリンカーとBgl II−Xho I消化プラスミドpKC283PX
とを実質的に上記のライゲーション方法に従ってライゲ
ートさせた。ライゲートしたDNAは所望のプラスミドpKC
283−Ｌをからなっていた。プラスミドpKC283−Ｌの制
限部位および機能地図を添付の第12図に示す。プラスミ
ドpKC283−L DNAを用いて大腸菌K12 MO（λ＋）を形質
転換し、得られた大腸菌K12 MO（λ＋）/pKC283−Ｌ形
質転換体を、そのアンピシリン耐性の表現型およびその
プラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した。
プラスミドpKC283−L DNA（約10μｇ）を、10Xの高−
塩緩衝液（20μ）、1mg/ml BSA（20μ）、制限酵素
Xho I（５μ；約50単位）、およびdH2O（155μ）に
溶解し、得られた反応液を37℃で２時間インキュベート
した。次いで、Xho I消化プラスミドpKC283−LDNAを沈
澱させ、そして10Xのニック−トランスレーション緩衝
液［0.5Mトリス−HCl（pH7.2）;0.1M MgSO4;および1mM
DTT］（２μ）、デオキシヌクレオチドトリホスフェ
ート各2mMずつを含む溶液（１μ）、dH2O（15μ
）、クレノウ酵素［１μ；約６単位（Ｐ−Ｌバイオ
ケミカルズの定義）」、および1mg/ml BSA（１μ）中
に再懸濁した。得られた反応液を25℃で30分間インキュ
ベートし、この反応液を70℃で５分間インキュベートす
ることにより反応を止めた。
BamH Iリンカー（５′−CGGGATCCCG−３′）をキナー
ゼ処理し、Xho I消化してクレノウ処理したプラスミドp
KC283−L DNAに、実質的に上記のリンカーのライゲーシ
ョン方法に従ってライゲートさせた。ライゲーション反
応の後、このDNAを、高−塩緩衝液中、37℃で約２時
間、BamH I（約100単位）で消化した。このBamH I消化
の後、DNAをライゲーション用に調製し、実質的に上記
の方法に従い、〜5.9kb BamH I制限フラグメントをライ
ゲーションによって環化し、大腸菌K12 MO（λ＋）に形
質転換した。大腸菌K12 MO（λ＋）/pKC283−LB形質転
換体を同定し、次いで、実質的に実施例３の方法に従っ
て、この形質転換体からプラスミドpKC 283−LB DNAを
調製した。プラスミドpKC283−LBの制限部位および機能
地図を添付の第12図に示す。
実質的に上記の方法に従い、プラスミドpKC 283PX
（約10μｇ）を高−塩緩衝液中で制限酵素Sal Iにより
消化し、クレノウ酵素処理し、EcoR Iリンカー（５′−
GAGGAATTCCTC−３′）とライゲートさせた。制限酵素Ec
oR Iで消化することにより〜2.1kbのDNAを除去した後、
ライゲーションして〜4.0kb EcoR I制限フラグメントを
環化し、プラスミドpKC283PRSを得た。このライゲート
化DNAを用いて大腸菌K12MO（λ＋）を形質転換し、大腸
菌K12MO（λ＋）/pKC283PRS形質転換体を同定した後、
実質的に実施例３の方法に従って、この形質転換体から
プラスミドpKC283PRS DNAを調製した。プラスミドpKC28
3PRSの制限部位および機能地図を添付の第12図に示す。
プラスミドpKC283PRS（約10μｇ）を、高−塩緩衝液
（200μ）中、制限酵素Pst IおよびSph I（それぞれ
約50単位）で消化した。反応液を37℃で約２時間インキ
ュベートした後、反応混合物を、0.6％低−融解温度ア
ガロース［FMCコーポレイション（FMC Corporation,Mar
ine Colloids Division,Rockland,Maine 04841）］ゲル
により電気泳動した。
ゲルを臭化エチジウムの希溶液で染色し、〜0.85kb P
stI−SphI制限フラグメントを含有するDNAバンドを長波
長のUV光で観察し、これを小さなセグメントとしてゲル
から切り取った。このゲルセグメントの容積をセグメン
トの重量と密度から求め、ゲルセグメントを入れた試験
管に等容量の10mMトリス−HCl（pH7.6）を加えた。次い
で、このゲルセグメントを72℃でインキュベーションし
て溶融した。２回フェノール抽出し、エタノール沈澱さ
せた後、プラスミドpK C283PRSの〜0.85kb Pst I−Sph
I制限フラグメント（約１μｇ）を約100μ容量中に得
た。同様にして、プラスミドpKC283−LBを制限酵素Pst
IとSph Iで消化し、アガロースゲル電気泳動によって〜
3.0kb制限フラグメントを単離し、ライゲーション用に
調製した。
プラスミドpKC283PRSの〜0.85kb Pst I−Sph I制限フ
ラグメントをプラスミドpKC283−LBの〜3.0kb Pst I−S
ph I制限フラグメントにライゲートした。このライゲー
トしたDNAは所望のプラスミドpL32からなっていた。プ
ラスミドpL32の制限部位および機能地図を添付の第12図
に示す。プラスミドpL32を大腸菌K12 MO（λ＋）細胞に
形質転換し、実質的に実施例３の方法に従い、大腸菌K1
2 MO（λ＋）/pL32形質転換体からプラスミドpL32 DNA
を調製した。プラスミドpL32 DNAの分析の結果、プラス
ミドpKC283PXのクレノイ処理したSal I末端には１以上
のEcoR Iリンカーが結合していることが分った。１以上
のEcoR Iリンカーの存在はプラスミドpL32またはプラス
ミドpL32誘導体の有用性には何ら影響を及ぼさず、また
そのことは、２個のEcoR Iリンカーが一緒にライゲート
した場合には必ず生成するXho I制限部位の存在によっ
て検出することができる。
プラスミドpCC101は、米国特許第4,745,069号（1988
年５月17日発行）の実施例３に記載されている（引用し
て本明細書に記載する）。プラスミドpCC101の制限部位
および機能地図を添付の第12図に示す。EK−BGH−暗号
化DNAを単離するために、プラスミド101（約10μｇ）
を、制限酵素Xba IおよびBamH I（それぞれ約50単位）
を含む高−塩緩衝液（200μ）中で消化した。消化産
物をアガロースゲル電気泳動で分離し、EK−BGHをコー
ドしている〜0.6kb Xba I−BamH I制限フラグメントを
ゲルから単離してライゲーションに備えた。
プラスミドpL32も制限酵素Xba IおよびBamH Iで消化
し、〜3.9kb制限フラグメントを単離し、ライゲーショ
ン用に備えた。プラスミドpL32の〜3.9kb Xba I−BamH
I制限フラグメントをプラスミドpCC101の〜0.6kb Xba I
−BamH I制限フラグメントにライゲートして、プラスミ
ドpL47を得た。プラスミドpL47の制限部位および機能地
図を添付の第12図に示す。プラスミドpL47を大腸菌K12
MO（λ＋）に形質転換し、大腸菌K12 MO（λ＋）/pL47
形質転換体を同定した。実質的に実施例３の方法に従っ
て形質転換体からプラスミドpL47 DNAを調製した。
プラスミドpPR12は、温度感受性pLリプレッサー遺伝
子cI857とプラスミドpBR322のテトラサイクリン耐性付
与遺伝子を含有している。プラスミドpPR12は米国特許
第4,436,815（1984年３月13日発行）に開示され、特許
請求されている。プラスミドpPR12の制限部位および機
能地図を添付の第12図に示す。
プラスミドpPR12（約10μｇ）を、高−塩緩衝液（200
μ）中、制限酵素EcoR I（約50単位）により、37℃で
２時間消化した。このEcoR I消化プラスミドpPR12 DNA
を、実質的に上記の方法に従って沈澱させ、次いでクレ
ノウ酵素で処理した。クレノウ反応の後、EcoR I消化し
てクレノウ処理したプラスミドpPR12 DNAをライゲーシ
ョンして再環化した。実質的に実施例３の方法に従い、
所望のプラスミドpPR12ΔR1を構成しているライゲート
化DNAを用いて大腸菌K12 RV308を形質転換した。形質転
換体は、テトラサイクリン（10μg/ml）耐性に基づいて
選択を行った。大腸菌K12 RV 308/pPR12ΔR1形質転換体
を同定した後、実質的に実施例３の方法に従い、プラス
ミドpPR12ΔR1 DNAを形質転換体から調製した。
プラスミドpPR12ΔR1（約10μｇ）を、中−塩緩衝液
（200μ）中、制限酵素Ava I（約50単位）により37℃
で２時間消化した。Ava I消化プラスミドpPR12ΔR1 DNA
を沈澱させ、クレノウ酵素で処理した。クレノウ反応の
後、このAva I消化してクレノウ処理したプラスミドpPR
12ΔR1 DNAとEcoR Iリンカー（５′−GAGGAATTCCTC−
３′）をライゲートし、沈澱させ、約50単位の制限酵素
EcoR Iを含む高−塩緩衝液（約200μ）に再懸濁し、3
7℃で約２時間インキュベートした。このEcoR I消化の
後、実質的に上記の方法に従って、反応混合物を0.6％
低−溶融アガロースゲルにかけ、〜5.1kbのEcoR I制限
フラグメントをゲルから精製し、ライゲーションにより
再環化し、所望のプラスミドpPR12AR1を得た。実質的に
実施例３の方法に従い、プラスミドpPR12AR1 DNAを用い
て大腸菌K12 RV308を形質転換した。形質転換体の選択
はテトラサイクリン耐性に基づいた。実質的に実施例１
の方法に従って、形質転換体からプラスミドpPR12AR1 D
NAを調製した。プラスミドpPR12AR1の制限部位および機
能地図を添付の第12図に示す。
プラスミドpPR12AR1 DNA（約10μｇ）を、制限酵素Ps
t IおよびEcoR I（それぞれ約50単位）を含む高−塩緩
衝液（約200ml）に懸濁し、この消化反応液を37℃で約
２時間インキュベートした。次いで、実質的に実施例３
の方法に従い、この反応混合物を１％アガロースゲルに
かけ、プラスミドpPR12AR1の2.9kb Pst I−EcoR I制限
フラグメントを単離し、ライゲーション用に調製した。
プラスミドpL47（約10μｇ）を、高−塩緩衝液（200
μ）中、制限酵素Pst IおよびBamH Iにより37℃で２
時間消化した。このPst I−BamH I消化DNAを、実質的に
実施例３の方法に従って１％アガロースゲルにかけ、複
製起源およびアンピシリン耐性付与遺伝子の一部を含有
する〜2.7kbのPst I−BamH I制限フラグメントを単離
し、ライゲーション用に調製した。別の反応系で、プラ
スミドpL47 DNA（約10μｇ）を、高−塩緩衝液（200μ
）中、制限酵素EcoR IおよびBamH Iにより37℃で２時
間消化し、ラムダpL転写活性化配列、大腸菌lpp翻訳活
性化配列とEK−BGH−暗号化DNAを含有する〜1.03kbのEc
oR I−BamH I制限フラグメントを単離し、ライゲーショ
ン用に調製した。
プラスミドpL47の〜2.7kb Pst I−BamH I制限フラグ
メントおよび〜1.03kb EcoR I−BamH I制限フラグメン
トを、プラスミドpPR12AR1の〜2.9kb Pst I−EcoR I制
限フラグメントにライゲートしてプラスミドpL110を構
築し、このライゲート化DNAを用いて大腸菌K12 RV308を
形質転換した。形質転換体の選択はテトラサイクリン耐
性に基づいた。
EK−BGH暗号化領域には、添付図面に示した制限部位
および機能地図には表わされていない２つのPst I制限
酵素認識部位が存在する。プラスミドpL110の制限部位
および機能地図を添付の第12図に示す。
E.プラスミドpBW32の最終的な構築 プラスミドpSV2−β−グロビンDNA（NRRL B−15928）
（約10μｇ）を、10X Hind III反応緩衝液（10μ）、
制限酵素Hind III（５μ：約50単位）、およびdH2O
（85μ）に溶解し、この反応液を37℃で２時間保っ
た。次いでこの反応混合物を0.15M LiClとし、2.5倍量
のエタノール加え、ドライアイス−エタノール浴でイン
キュベートした後、遠心してDNAをペレット化した。
このDNAペレットを、10XのBgl II緩衝液（10μ）、
制限酵素Bgl II（５μ：〜50単位）、およびdH2O（85
μ）に溶解し、この反応液を２時間37℃に保った。こ
のBgl II消化の後、反応混合物を0.85％アガロースゲル
にかけ、電気泳動によってフラグメントを分離した。前
記と同様にして、臭化エチジウムおよび紫外光を用いて
ゲルを可視化し、目的の〜4.2kb Hind III−Bal IIフラ
グメントを含有するバンドをゲルから切り出し、実質的
に実施例4Aの方法に従って精製した。ペレットをdH2O
（10μ）に再懸濁した。このペレットは目的のプラス
ミドpSV2−β−グロビンの〜4.2kb Hind III−Bgl II制
限フラグメント（〜５μｇ）からなっていた。実質的に
上記教示に従って、TPAをコードしているプラスミドpTP
A103の〜2.0kb Hind III−BamH I制限フラグメントをプ
ラスミドpTPA103から単離した。プラスミドpTPA103の〜
2.0kb Hind III−BamH I制限フラグメント（約５μｇ）
が得られ、これをdH2O（10μ）に懸濁し、−20℃で保
存した。
プラスミドpSV2−β−グロビンの〜4.2kb Bgl II−Hi
nd III制限フラグメント（２μ）およびプラスミドpT
PA103の〜2.0kb Hind III−BamH Iフラグメント（４μ
）を混合し、次いで10Xリガーゼ緩衝液（２μ）、d
H2O（11μ）、およびT4 DNAリガーゼ（１μ；約500
単位）とともに４℃で一夜インキュベートした。ライゲ
ートしたDNAは目的のプラスミドpTPA301からなってい
た。このプラスミドの制限部位および機能地図を添付の
第12図に示す。実質的に実施例３の教示に従い、このラ
イゲート化DNAを用いて、形質転換用のコンピテントに
した大腸菌K12 PR1細胞（NRRL B−15210）を形質転換し
た。実質的に実施例３の方法に従って、大腸菌K12 RR1/
pTPA301形質転換体からプラスミドDNAを得た。
プラスミドpSV2−dhfrは、ジヒドロ葉酸還元酵素（dh
fr）遺伝子に共有結合したDNAの増幅および形質転換し
た真核生物細胞の選択に有用であるdhfr遺伝子を含有し
ている。プラスミドpSV2−dhfr［公的に入手可能な大腸
菌K12 HB101/pSV2−dhfr（ATCC 37146）から単離した］
（10μｇ）を、10X Pvu II緩衝液（10μ）、Pvu II制
限酵素（２μ；約20単位）、およびdH2O（88μ）と
混合し、得られた反応液を37℃で２時間インキューベー
トした。フェノールおよびクロロホルム抽出によって反
応を止め、次いでこのPvu II消化したプラスミドpSV2−
dhfr DNAを沈澱させ、遠心して集めた。
以下の方法により、BamH Iリンカー（５′−CGGATCCC
G−３′）をキナーゼ処理しライゲーション用に調製し
た。dH2O（５μ）中のリンカー（１μｇ）に、5Xキナ
ーゼ緩衝液（10μ）、5mM ATP（５μ）、BSA（1mg/
ml、５μ）、10mMスペルミジン（５μ）、dH2O（19
μ）、およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ（約10単
位、１μ）を加えた。次いでこの反応液を37℃で60分
間インキュベートし、−20℃で保存した。Pvu II消化プ
ラスミドpSV2−dhfr（５μ；約５μｇ）およびキナー
ゼ処理したBamH Iリンカー（12μ；約0.25μ）を混
合し、dH2O（11μ）、10Xリガーゼ緩衝液（２μ）
およびT4 DNAリガーゼ（１μ；約1000単位）とともに
16℃で一夜インキュベートした。
このライゲーション反応混合物に、10XのBamH I反応
緩衝液（10μ）、BamH I制限酵素（10μ；約50単
位）、およびdH2O（48μ）を加え、次いで、この溶液
を37℃で３時間インキュベートした。実質的に実施例4A
の方法に従って、この反応液を１％アガロースゲルにか
け、dhfr遺伝子を含有する目的の〜1.9kbフラグメント
をゲルから単離した。これらの実施例で行なったリンカ
ー付加のすべては、常法によりアガロースゲルで精製す
ることによって最終ベクターにおける多重リンカー配列
の可能性を減少させた。フラグメント約３μｇが得ら
れ、これをTE緩衝液（10μ）に懸濁した。
次に、プラスミドpTPA301（約15μ；約１μｇ）
を、上記のようにしてBamH I制限酵素で消化した。プラ
スミドpTPA301にはBamH I部位が１つしか存在しないの
で、このBamH I消化により直線状のプラスミドpTPA301
DNAが生成する。このBamH I消化したプラスミドpTPA301
をエタノールで沈澱させ、dH2O（94μ）に再懸濁し、
ウシ腸アルカルホスファターゼ（１μ）および1M−ト
リス−HCl（pH9.0）（５μ）を用いて65℃で45分間ホ
スファターゼ処理した。このDNAをフェノール；クロロ
ホルムで抽出し、次いでクロロホルム：イソアミルアル
コールで抽出し、エタノール沈澱し、dH2O（20μ）に
再懸濁した。ホスファターゼ処理したプラスミドpTPA30
1（10μ；約0.25μｇ）を、BamH I dhfr遺伝子を含有
する制限フラグメント（５μ、約1.5μｇ）、10Xリガ
ーゼ緩衝液（３μ）、T4 DNAリガーゼ（３μ；約15
00単位）、およびdH2O（９μ）に加えた。このライゲ
ーション反応液を15℃で一夜インキュベートした。この
ライゲート化DNAは目的のプラスミドpTPA303 DNAからな
っていた。
プラスミドpTPA303を用いて大腸菌K12 RR1（NRRL B−
15210）を形質転換し、得られた大腸菌K12 RR1/pTPA303
形質転換体を、そのアンピシリン耐性の表現型およびそ
のプラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した。実
質的に実施例３の方法に従って、プラスミドpTPA303を
形質転換体から単離した。
pBR322レプリコンおよびプラスミドpTPA301由来のβ
−ラクタマーゼ遺伝子をコードしている〜2.7kb EcoR I
−Bgl II制限フラグメントを単離するため、プラスミド
pTPA301（約10μｇ）を、全反応液容量（400μ）中、
37℃で、1X Bgl II緩衝液中のBgl II制限酵素（20単
位）で完全に消化した。このBgl II消化の後、トリス−
HCl濃度を110mMに調整し、37℃で、Bgl II消化したDNA
にEcoR I制限酵素（20単位）を加えた。EcoR I消化の
後、〜2.7kb EcoR I−Bgl II制限フラグメントが他の消
化産物から分離するまで、このEcoR I−Bgl II消化した
DNAを１％アガロースゲル電気泳動にかけ、次いで〜2.7
kbフラグメントを単離し、ライゲーション用に調製し
た。
dhfr遺伝子を含有する制限フラグメントを単離するた
め、プラスミドpTPA303をHind IIおよびEcoR I制限酵素
で２重に消化し、dhfr遺伝子を含有する〜2340bp EcoR
I−Hind II制限フラグメントを単離し、回収した。
TPAのカルボキシ末端暗号領域およびSV40プロモータ
ーを含有するプラスミドpTPA303の〜2.0kb Hind III−S
st I制限フラグメントを単離するため、プラスミドpTPA
303を、1X Hind III緩衝液中、Hind IIIおよびSst I制
限酵素で２重に消化した。〜1.7kbフラグメントをゲル
から単離し、ライゲーション用に調製した。
改良型TPAのアミノ末端暗号領域を含有するプラスミ
ドpBW28の〜680bp Xho II（ライゲーションに対してはB
gl II重なり部分と適合しうる）−Sst I制限フラグメン
トを単離するため、プラスミドpW28（約10μｇ）を、1X
Xho II緩衝液［0.1Mトリス−HCl（pH8.0）;0.1M MgC
l2;0,1％トリトンＸ−100;および1mg/ml BSA］中、Xho
II酵素で完全に消化した。このXho II消化したDNAをエ
タノール沈澱で回収し、次いでSst I酵素で完全に消化
した。実質的に実施例4Aの方法に従って、このXho II−
Sst I消化したDNAをアクリルアミドゲルにかけ、目的の
フラグメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調
製した。
上記のフラグメント、即ち（１）プラスミドpTPA301
の〜2.7kb EcoR I−Bgl II制限フラグメント、（２）プ
ラスミドpTPA303の〜2.34kb EcoR I−Hind III制限フラ
グメント、（３）プラスミドpTPA303の〜1.7kb Sst I−
Hind III制限フラグメント、および（４）プラスミドpB
W28の〜0.68kb Sst I−Xho II制限フラグメント（それ
ぞれ約0.1μｇ）を一緒にライゲートし、プラスミドpBW
32を得た。このライゲーション混合物を用い、50mM CaC
l2を用いること以外は実施例３の教示のようにして、大
腸菌K12 MM294を形質転換した。形質転換体をそのアン
ピシリン耐性の表現型およびそのプラスミドDNAの制限
分析によって同定した。実質的に実施例３の方法に従っ
て、大腸菌K12 MM294/pBW32形質転換体からプラスミドp
BW32 DNAを得た。このプラスミドpBW32の制限部位およ
び機能地図を添付の第12図に示す。
実施例12 プラスミドpLPChd1、pLPChd2、pLPChd1（G
T）、pLPCh2（GT）、pLPCdhfr1、pLPCdhfr2、pLPCdhfr1
（GT）およびpLPCdhfr2（GT）の構築 A.プラスミドpLPChd1およびpLPChd2の構築 TE緩衝液（20μ）中のプラスミドpBW32（実施例1
1）（約20μｇ）を、10X BamH I緩衝液（10μ）およ
びdH2O（60μ）に加えた。このプラスミドpBW32 DNA
の溶液に、制限酵素BamH I（10μ；約50単位）を加
え、得られた反応液を37で２時間インキュベートした。
このBamH I消化したプラスミドpBW32 DNAをエタノール
で沈澱させ、遠心して集め、10X クレノウ緩衝液（５
μ）、dH2O（45μ）およびクレノウ酵素（２μ；
約100単位）に再懸濁した。この反応液を16℃で30分間
インキュベートし、次いで消化産物が明確に分離するま
でこの反応混合物を１％アガロースゲル電気泳動にかけ
た。実質的に実施例4Aの方法に従って、dhfr遺伝子を含
有する、プラスミドpBW32の〜1.9kbクレノウ処理したBa
mH I制限フラグメントをゲルから単離し、ライゲーショ
ン用に調製した。目的のフラグメンドが約４μｇ得ら
れ、これをTE緩衝液（５μ）に懸濁した。
TE緩衝液（100μ）中のプラスミドpLPChyg1（実施
例10）（約200μｇ）を、10X EcoR I緩衝液（15μ）
およびdH2O（30μ）に加えた。このプラスミドpLPChy
g1 DNAの溶液に、制限酵素EcoR I（約５μ；約50単
位）を加え、得られた反応液を37℃で約10分間インキュ
ベートした。この短い反応時間は、部分的なEcoR I消化
物が得られるように算出したものである。プラスミドpL
PChyg1はEcoR I制限部位を２箇所有しており、そのうち
の１箇所は、ハイグロマイシン耐性付与（HmR）遺伝子
の暗号配列内に存在している。このHmR遺伝子内ではな
いプラスミドpLPChyg1のEcoR I部位に、プラスミドpBW3
2由来の〜1.9kb dhfr遺伝子含有制限フラグメントを挿
入することが望ましい。１箇所だけ切断したプラスミド
pLPChyg1 DNAが未切断プラスミドDNAおよびその他の消
化産物から分離するまで、この部分的にEcoR I消化した
プラスミドpLPChyg1 DNAをアガロースゲル電気泳動にか
けた。実質的に実施例4Aの方法に従って、この１箇所だ
け切断したDNAをゲルから単離し、ライゲーション用に
調製した。１箇所だけEcoR I切断したプラスミドpLPChy
g1が約２μ得られ、これをTE緩衝液（25μ）に懸濁
した。この試料に、クレノウ酵素（５μ；約25単
位）、10X クレノウ緩衝液（５μ）、およびdH2O（4
0μ）を加え、得られた反応液を16℃で60分間インキ
ュベートした。このクレノウ処理してEcoR I部分的消化
したプラスミドpLPChyg1 DNAを、フェノールで２回、次
いでクロロホルムで１回抽出し、エタノールで沈澱さ
せ、TE緩衝液（25μ）に再懸濁した。
プラスミドpBW32の〜1.9kbのクレノウ処理したBamH I
制限フラグメント（約５μ）、および１箇所だけEcoR
I切断したプラスミドpLPChyg1 DNA（約５μ）を混合
し、このDNA混合物に、10Xリガーゼ緩衝液（１μ）、
dH2O（５μ）、T4 DNAリガーゼ（１μ；約500単
位）、およびT4 RNAリガーゼ（１μ；約２単位）を加
え、得られた反応液を16℃で一夜インキュベートした。
このライゲート化DNAは目的のプラスミドpLPChd1および
pLPChd2（これらは、dhfr遺伝子を含有している〜1.9kb
フラグメントの配向だけが異なっている）からなってい
た。
このライゲート化DNAを用い、実質的に実施例３の方
法に従って、形質転換用にコンピテントにしておいた大
腸菌K12 HB101細胞を形質転換した。形質転換細胞を100
μg/mlアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、アン
ピシリン耐性の形質転換体をプラスミドDNAの制限酵素
分析によって分析して、大腸菌K12 HB101/pLPChd1およ
び大腸菌K12 HB101/pLPChd2形質転換体を同定した。プ
ラスミドpLPChd1およびプラスミドpLPChd2 DNAを、実質
的に実施例３の方法に従って、適切な形質転換体から単
離した。
プラスミドpLPChd3およびpLPChd4はプラスミドpLPChd
1およびpLPChd2と同様な構造である。プラスミドpLPChd
3およびpLPChd4は、プラスミドpLPChyg1の代わりに出発
物質としてプラスミドpLPChyg2を用いる以外は、プラス
ミドpLPChd1およびpLPChd2を構築するために用いる方法
に実質的に従って構築される。
B.プラスミドpLPChd1（GT）、pLPChd2（GT）、pLPChd3
（GT）、およびpLPChd4（GT）の構築 実質的に実施例4B.1の方法に従って、プラスミドpLPC
hd1、pLPChd2、pLPChd3またはpLPChd4中のBKエンハンサ
ーとAd2後期プロモーターの間にある唯一のXho I部位に
ポリ−GT要素を挿入する。Xho I消化したポリ−GT要素
およびXho I消化したプラスミドpLPChd1、pLPChd2、pLP
Chd3またはpLPChd4 DNAをライゲートする。このライゲ
ートしたDNAは、各々、目的のプラスミドpLPChd1（G
T）、pLPChd2（GT）、pLPChd3（GT）およびpLPChd4（G
T）からなっている。プラスミドpLPChd1（GT）の制限部
位および機能地図を添付の第13図に示す。
C.pLPCdhfr1およびpLPCdhfr2の構築 TE緩衝液（100μ）中のプラスミドpBW32（約100μ
ｇ）を、10X BamH I緩衝液（15μ）およびdH2O（25μ
）に加えた。このプラスミドpBW32 DNAの溶液に制限
酵素BamH I（10μ；約25単位）を加え、得られた反応
液を37℃で２時間インキュベートした。実質的に実施例
10Aの方法に従って、BamH I消化したプラスミドpBW32 D
NAをクレノウ酵素で処理した。末端平滑化フラグメント
をエタノールで沈澱させ、TE緩衝液（10μ）中で再懸
濁させ、dhfr遺伝子を含有する〜1.9kb BamH I制限フラ
グメントが他の消化産物から分離するまで１％アガロー
スゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的に実施例4Aの
方法に従って、〜1.9kb制限フラグメントをゲルから単
離し、ライゲーション用に調製した。目的のフラグメン
トが約10μｇ得られ、これをTE緩衝液（50μ）に懸濁
させた。
実施例10で調製したNde−Stu I消化プラスミドpLPC D
NA（約５μ）を、プラスミドpBW32のクレノウ処理し
た〜1.9kb BamH I制限フラグメント（５μ）、10Xリ
ガーゼ緩衝液（1.5μ）、T4 DNAリガーゼ（１μ；
約1000単位）、T4 RNAリガーゼ（１μ；約２単位）、
およびdH2O（1.5μ）に加えた。得られたライゲーシ
ョン反応液を16℃で一夜インキュベートした。ライゲー
ト化DNAは目的のプラスミドpLPCdhfr1およびpLPCdhfr2
（これらは、dhfr遺伝子を含有している〜1.9kbフラグ
メントの配合だけが異なっている）からなっていた。実
質的に実施例３の方法に従って、このライゲート化DNA
を用いて、大腸菌K12 HB101を形質転換した。形質転換
細胞をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、この
プラスミドDNAの制限酵素分析によって、アンピシリン
耐性大腸菌K12 HB101/pLPCdhfr1および大腸菌K12 HB101
/pLPCdhfr2形質転換体を同定した。
D.プラスミドpLPCdhfr1（GT）およびpLPCdhfr2（GT）の
構築 実質的に実施例4B.1の方法に従って、BKエンハンサー
とAd2後期プロモーターとの間にある、pLPCdhfr1または
pLPCdhfr2の唯一のXho I部位にポリ−GT要素を挿入す
る。Xho I消化したポリ−GT要素とXho I消化したプラス
ミドpLPCdhfr1またはpLPCdhfr DNAとをライゲートする
と、このライゲート化DNAは、各々、目的のプラスミドp
LPCdhfr1（GT）およびpLPCdhfr2（GT）からなってい
る。
実施例13 プラスミドphdおよびphd（GT）の構築 A.プラスミドphdの構築 プラスミドphdを構築するためには、アテニンメチラ
ーゼ（たとえばこれをdam遺伝子がコードしており、そ
の遺伝子産物は配列:5′−GATC−３′中のアデニン残基
をメチル化する）を欠く大腸菌宿主細胞から、プラスミ
ドpLPChd1 DNA（実施例12）（これをプラスミドphd構築
の出発原料として用いる）を調製することが必要であっ
た。大腸菌K12 GM48（NRRL B−15725、1983年11月23日
寄託）は機能的なdamメチラーゼを欠いており、従っ
て、プラスミドphd構築の出発原料として用いるプラス
ミドpLPChd1 DNAを調製する目的で使用するのに適した
宿主である。
実質的に実施例３の方法に従って、大腸菌K12 GM48細
胞を培養し、形質転換用にコンピテントにし、プラスミ
ドpLPChd1を用いてこの大腸菌K12 GM48細胞を形質転換
した。実質的に実施例３の方法に従って、この形質転換
細胞をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、アン
ピシリン耐性の大腸菌K12 GM48/pLPChd1形質転換体がコ
ロニーを形成したら、そのコロニーの１つを用いてプラ
スミドpLPChd1 DNAを調製した。約1mgのプラスミドpLPC
hd1 DNAが得られ、これをTE緩衝液（約1ml）に懸濁し
た。
TE緩衝液（２μ）中のプラスミドpLPChd1 DNA（約
２μｇ）を、10X Bcl I緩衝液［750mM KCl;60mM トリ
ス−HCl（pH7.4）;100mM MgCl2;10mM DTT;および1mg/ml
BSA］（２μ）およびdH2O（14μ）に加えた。この
プラスミドpLPChd1 DNAの溶液に、制限酵素Bcl I（２μ
；約10単位）を加え、得られた反応液を50℃で２時間
インキュベートした。この混合物をフェノールで１回、
クロロホルムで２回抽出するとによって反応を止めた。
Bcl I消化したプラスミドpLPChd1 DNA（約１μ）
を、10X T4 DNAリカーゼ緩衝液（１μ）、dH2O（８μ
）、およびT4 DNAリガーゼ（１μ；約500単位）に
加えた。このライゲーション反応液を16℃で一夜インキ
ュベートした。このライゲート化DNAは目的のプラスミ
ドphdからなっていた。プラスミドphdは、プラスミドpL
PChd1から全大きさが約1.45kbの２個の近接Bcl I制限フ
ラグメントおよびプラスミドpLPcat構築の際に結合した
余分のBcl Iリンカーを欠失することによって得られ
る。発現させようとするDNAを、プラスミドphdの唯一の
Bcl I部位に、発現のための正しい位置で、容易に挿入
することができるので、プラスミドphdは、本発明のBK
ウィルスエンハンサー−アデノウィルス後期プロモータ
ーからのすべてのDNA配列の発現を容易にする。
このライゲート化DNAを用い、実質的に実施例３の方
法に従って、大腸菌K12 GM48を形質転換した。形質転換
細胞をアンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、プラ
スミドDNAの制限酵素分析によってアンピシリン耐性の
大腸菌K12 GM48/phd形質転換体を同定した。
プラスミドpLPChd1の代りに出発原料としてプラスミ
ドpLPChd2、pLPChd3、またはpLPChd4を用いて前述のプ
ラスミドphdを構築する方法に実質的に従って、プラス
ミドphdに類似のプラスミドを構築することができる。
これらの類似のプラスミドとプラスミドphdはハイグロ
マイシン耐性付与および／またはdhfr遺伝子の配向だけ
が異なっている。
B.プラスミドphd（GT）の構築 1.プラスミドphdを用いる構築 実質的に実施例4B.1の方法に従って、BKエンハンサー
とAd2後期プローモーターの間にあるphdの唯一のXho I
部位にポリ−GT要素を挿入する。Xho I消化したポリ−G
T要素とXho I消化したプラスミドphd DNAとをライゲー
トした。このライゲート化DNAは目的のプラスミドphd
（GT）からなっている。プラスミドphd（GT）の制限部
位および機能地図を添付の第14図に示す。発現させよう
とするDNAを、プラスミドphd（GT）の唯一のBcl I部位
に、発現のための正しい位置で容易に挿入することがで
きるので、プラスミドphd（GT）は、本発明のポリ−GT
−BKウイルスエンハンサー−アデノウィルス後期プロモ
ーターからのすべてのDNA配列の発現を容易にする。E1A
遺伝子産物のような大きいDNAウィルスの即時型遺伝子
産物の存在下、プラスミドphd（GT）は挿入されたDNA配
列の全てに対して改良された発現ベクターを与える。
実質的に上記Ａの方法に従って、ライゲート化DNAを
用いて大腸菌K12 GM48を形質転換し、大腸菌K12 GM48/p
hd（GT）形質転換体を選択する。
2.プラスミドpLPChd1（GT）、pLPChd2（GT）、pLPChd3
（GT）またはpLPChd4（GT）を用いる構築 別法によれば、プラスミドpLPChd1、pLPChd2、pLPChd
3またはpLPChd4の代わりにプラスミドpLCPhd1（GT）、p
LPChd2（GT）、pLCPhd3（GT）またはpcLPhd4（GT）（実
施例12Bに記載）を出発原料として用いる以外は、実質
的に本実施例の上記Ａの方法に従って、プラスミドphd
（GT）を調製する。
実施例14 プラスミドpLPCE1AおよびpLPCE1A（GT）の構
築 A.プラスミドpLPCE1Aの構築 アデノウィルス2DNAのE1A遺伝子を単離するために、
アデノウィルス2DNA（BRLから入手）（約20μｇ）を、1
0X Bal I緩衝液［100mMトリス−HCl（pH7.6）;120mM Mg
Cl2:100mM 2−メルカプトエタノール；および1mg/ml BS
A］（10μ）およびdH2O（80μ）に溶解した。アデ
ノウィルス2DNA溶液に制限酵素Bal I（10μ；約20単
位）を加え、得られた溶液を37℃で２時間インキュベー
トした。E1A遺伝子を含有する〜1.8kb制限フラグメント
が他の消化産物から分離するまで、Bal I消化DNAを１％
アガロースゲル電気泳動にかけた。実質的に実施例4Aの
方法に従って、このゲルから〜1.8kbフラグメントを単
離し、ライゲーション用に調製した。目的のフラグメン
トが約３μｇ得られ、これをTE緩衝液（20μ）に懸濁
した。
TE緩衝液（５μ）中のプラスミドpLPC DNA（約５μ
ｇ）を、10X Stu I緩衝液（２μ）およびdH2o（11μ
）に加えた。このプラスミドpLPC DNA溶液に制限酵素
Stu I（２μ；約10単位）を加え、得られた反応液を3
7℃で２時間インキュベートした。Stu I消化プラスミド
pLPC DNAをエタノールで沈澱させ、10X Nde I緩衝液
（２μ）およびdH2O（16μ）に再懸濁した。このSt
u I消化プラスミドpLPC DNAの溶液に制限酵素Nde I（２
μ；約10単位）を加え、得られた反応液を37℃で２時
間インキュベートした。
Nde I−Stu I消化プラスミドpLPC DNAをエタノールで
沈澱させ、10Xクレノウ緩衝液（５μ）およびH2O（42
μ）に懸濁させた。DNA溶液にクレノウ酵素（３μ
；約６単位）を加え、得られた反応液を37℃で30分間
インキュベートした。次いで、〜5.82kbのクレノウ処理
Nde I−Stu I制限フラグメントが他の反応生成物から明
確に分離されるまで、反応混合物を１％アガロースゲル
電気泳動にかけた。実質的に実施例4Aの方法に従って、
ゲルからフラグメントを単離し、ライゲーション用に調
製した。プラスミドpLPCの〜5.82クレノウ処理Nde I−S
tu I制限フラグメントが約２μｇ得られ、これをTE緩衝
液（25μ）に懸濁した。
E1A遺伝子をコードするアデノウィルス２の〜1.8kb B
al I制限フラグメント（約９μ）およびプラスミドpL
PCの〜5.82kbクレノウ処理Nde I−Stu I制限フラグメン
ト（３μ）を、10Xリガーゼ緩衝液（２μ）およびd
H2O（４μ）に加えた。T4 DNAリガーゼ（１μ；約5
00単位）およびT4 RNAリガーゼ（１μ；約２単位）を
DNA溶液に加え、得られた反応液を16℃で一夜インキュ
ベートした。
ライゲートしたDNAは目的のプラスミドpLPCE1Aおよび
pLPCE1A1（これらは、E1A遺伝子の配向が異なってお
り、そしておそらくはBKエンハンサーがプラスミドのE1
A遺伝子に有している発現促進効果が異なっている）か
らなっていた。プラスミドpLPCE1A1と比較するとプラス
ミドpLPCE1Aの方がE1AプロモーターがBKエンハンサーに
近接して設置されているため、プラスミドpLPCE1Aを用
いると、プラスミドpLPCE1A1に比べE1A発現が高くな
る。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌K12 HB101を形質転換した。形質転換細
胞を、アンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、アン
ピシリン耐性形質転換体をそのプラスミドDNAの制限酵
素分析によってスクリーニングし、大腸菌K12 HB101/pL
PCE1Aおよび大腸菌K12 HB101/pLPCE1A形質転換体を同定
した。実質的に実施例３の方法に従って、後の試験に用
いるために形質転換体からプラスミドDNAを得た。
B.プラスミドpLPCE1A（GT）およびpLPCE1A1（GT）の構
築 実質的に実施4B.1の方法に従って、BKエンハンサーお
よびAd2後期プロモーターの間にあるプラスミドpLPCE1A
またはpLPCE1A1の唯一のXho I部位にポリ−GT要素を挿
入する。Xho I消化ポリ−GT要素およびXho I消化プラス
ミドpLPCE1AまたはpLPCE1A1 DNAをライゲートする。こ
のライゲートしたDNAは、各々、目的のプラスミドpLPCE
1A（GT）およびpLPCE1A1（GT）からなっている。プラス
ミドpLPCE1A（GT）の制限部位および機能地図を添付の
第15図に示す。
実施例15 プラスミドpBLTおよびpBLT（GT）の構築 A.プラスミドpBLTの構築 TE緩衝液（１μ）中のプラスミドpBW32 DNA（第12
図、実施例11）（約１μｇ）を、10X BamH I緩衝液（２
μ）およびdH2O（15μ）に加えた。プラスミドpBW3
2 DNA溶液に制限酵素BamH I（約２μ；約10単位）を
加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベートし
た。まず反応混合物をフェノールで抽出し、次いで反応
混合物をクロロホルムで２回抽出することによって反応
を止めた。BamH I消化プラスミドpBW32 DNA（約１μ
）を、10Xリガーゼ緩衝液（１μ）およびdH2O（18
μ）に加え、DNA溶液にT4 DNAリガーゼ（約１μ；
約500単位）を加えた後、得られた反応液を16℃で一夜
インキュベートした。
ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドpBW32del
（約5.6kbの大きさであり、１つのHind III制限部位を
有している）からなっていた。実質的に実施例３の方法
に従って、ライゲート化DNAを用いて大腸菌K12 HB101を
形質転換した。目的の大腸菌K12 HB101/pBW32del形質転
換体を、そのアンピシリン耐性表現型およびそのプラス
ミドDNAの制限酵素分析によって同定した。実質的に実
施例３の方法に従って、後の構築に用いるために形質転
換体からプラスミドpBW32del DNAを得た。
TE緩衝液（１μ）中のプラスミドpBW32del（約１μ
ｇ）を、10X Hind III緩衝液（２μ）およびdH2O（15
μ）に加えた。制限酵素Hind III（２μ；約10単
位）を、プラスミドpBW32del DNA溶液に加え、得られた
反応液を37℃で２時間インキュベートした。実質的に実
施例4Bに記載の方法に従って、試料をTE緩衝液（100μ
）で希釈し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し
た。反応液をフェノールで２回、次いでクロロホルムで
１回抽出した。次いで、Hind III消化プラスミドpBW32d
el DNAをエタノールを沈澱させ、dH2O（10μ）に再懸
濁した。
実質的に実施例6Aの方法に従って、プラスミドpBal8c
at（実施例18）を制限酵素Hind IIIで消化し、修飾した
BKエンハンサー−アデノウィルス２後期プロモーターカ
セットを含有する〜0.65kb Hind III制限フラグメント
を単離し、ライゲーション用に調製した。TE緩衝液（５
μ）中のプラスミドpBal8catの〜0.65kb Hind III制
限フラグメント（約0.1μｇ）をHind III消化プラスミ
ドpBW32delの溶液（３μ）に加えた。DNA混合物にT4
DNAリガーゼ（１μ；約500単位）および10Xリガーゼ
緩衝液（１μ）を加え、得られた反応液を16℃で一夜
インキュベートした。
ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドpBLTからな
っていた。実質的に実施例３の方法に従って、このライ
ゲート化DNAを用いて、大腸菌K12 HB101を形質転換し
た。形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ寒天で平板培
養し、アンピシリン耐性大腸菌K12 HB101/pBLT形質転換
体を、そのプラスミドDNAの制限酵素分析によって同定
した。〜0.65kb Hind III制限フラグメントは、Hind II
I消化プラスミドpBW32delに、２つの配向のうちどちら
かで挿入することができ（どちらか一方だけがプラスミ
ドpBLTを生じる）、0.65kb Hind III制限フラグメント
の配向を決定して大腸菌K12 HB101/pBLT形質転換体を同
定した。実質的に実施例３の方法に従って後の構築に用
いるために形質転換体からプラスミドpBLT DNAを調製し
た。
B.プラスミドpBLT（GT）の構築 実質的に実施例19の方法に従って、BKエンハンサーお
よびAd2後期プロモーターの間にあるプラスミドpBLTの
唯一のBamH I部位にポリ−GT要素を挿入する。ポリ−GT
要素およびBamH I消化プラスミドpBLT DNAをライゲート
する。ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドpBLT（G
T）からなっている。プラスミドpBLT（GT）の制限部位
および機能地図を添付の第16図に示す。
実施例16 プラスミドpBLThyg1、pBLThyg2、pBLThyg1
（GT）、pBLThyg2（GT）、pBLTdhfr1、pBLTdhfr2、pBLT
dhfr1（GT）およびpBLTdhfr2（GT）の構築 A.プラスミドpBLThyg1およびpBLThyg2の構築 TE緩衝液（４μ）中のプラスミドpBLT DNA（実施例
15A）（約４μｇ）を、10X BamH I緩衝液（２μ）お
よびdH2O（12μ）に加えた。プラスミドpBLT DNA溶液
に制限酵素BamH I（２μ；約10単位）を加え、得られ
た反応液を37℃で２時間インキュベートした。反応混合
物をまずフェノールで、次いでクロロホルムで抽出する
ことによって反応を停止させた。次いで、BamH I消化プ
ラスミドpBLT DNAをエタノールで沈澱させ、TE緩衝液
（２μ）に再懸濁した。
TE緩衝液（10μ）中のプラスミドpSV2hyg（約10μ
ｇ）を、10X BamH I緩衝液（10μ）およびdH2O（75μ
）に加えた。制限酵素BamH I（５μ；約25単位）
を、プラスミドpSV2hyg DNA溶液に加え、得られた反応
液を37℃で２時間インキュベートした。BamH I消化プラ
スミドpSV2hyg DNAをエタノールで沈澱させ、TE緩衝液
（10μ）に再懸濁し、ハイグロマイシン耐性付与遺伝
子を含有する〜2.5kb BamH I制限フラグメントが他の消
化産物から分離するまで、１％アガロースゲル電気泳動
にかけた。次いで、実質的に実施例4Aの方法に従って、
〜2.5kb制限フラグメントをゲルから単離し、ライゲー
ション用に調製した。目的のフラグメントが約２μｇ得
られ、TE緩衝液（10μ）に懸濁した。
BamH I消化プラスミドpBLT DNA（約２μ）およびプ
ラスミドpSV2hygの〜2.5kb BamH I制限フラグメント
（１μ）を、10Xリガーゼ緩衝液（１μ）、dH2O
（５μ）およびT4 DNAリガーゼ（１μ；約500単
位）に加え、得られた反応液を16℃で一夜インキュベー
トした。ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドpBLTh
yg1およびpBLThyg2からなっていた。プラスミドpBLThyg
1およびpBLThyg2は、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子
をコードしている〜2.5kb BamH I制限フラグメントの配
向が異なるだけである。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌K12 HB101を形質転換した。形質転換細
胞をアンピシリン含有のＬ寒天で平板培養し、アンピシ
リン耐性大腸菌K12 HB101/pBLThyg1および大腸菌K12 HB
101/pBLThyg2形質転換体を、そのプラスミドDNAの制限
酵素分析によって同定した。
B.プラスミドpBLThyg1（GT）およびpBLThyg2（GT）の構
築 BamH Iでプラスミドを部分消化した後、tPAとハイグ
ロマイシンストロンの間にあるプラスミドpBLThyg1また
はpBLThyg2のBamH I部位にポリ−GT要素を挿入する。部
分消化は、実質的に実施例11Cに記載のBamH I部分消化
に関する一般的な方法に従って行う。ポリ−GT要素およ
び部分的にBamH I消化した直線状のプラスミドpBLThyg1
またはpBLThyg2 DNAをライゲートする。ライゲートした
DNAは、各々、目的のプラスミドpBLThyg1（GT）およびp
BLThyg2（GT）からなっている。プラスミドpBLThyg1（G
T）の制限部位および機能地図を添付の第17図に示す。
C.プラスミドpBLTdhfr1およびpBLTdhfr2の構築 TE緩衝液（100μ）中のプラスミドpBW32（実施例1
1）（約100μｇ）を、10X BamH I緩衝液（15μ）およ
びdH2O（25μ）に加えた。このプラスミドpBW32 DNA
溶液に制限酵素BamH I（10μ；約50単位）を加え、得
られた反応液を37℃で２時間インキュベートした。BamH
I消化プラスミドpBW32 DNAをエタノールで沈澱させ、T
E緩衝液（10μ）に再懸濁し、dhfr遺伝子を含有する
〜1.9kb BamH I制限フラグメントが他の消化産物から分
離するまで１％アガロースゲル電気泳動にかけた。次い
で、実質的に実施例4Aの方法に従って、〜1.9kb制限フ
ラグメントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製
した。目的のフラグメントが約10μｇ得られ、これをTE
緩衝液（50μ）に懸濁した。
本実施例のＡで得られたBamH I消化プラスミドpBLT D
NA（約２μ）およびプラスミドpBW32の〜1.9kb BamH
I制限フラグメント（１μ）を10Xリガーゼ緩衝液（１
μ）、dH2O（５μ）およびT4 DNAリガーゼ（１μ
；約500単位）に加え、得られた反応液を16℃で一夜
インキュベートした。ライゲートしたDNAは、目的のプ
ラスミドpBLTdhfr1およびpBLTdhfr2からなっていた。プ
ラスミドpBLTdhfr1およびpBLTdhfr2は、dhfr遺伝子をコ
ードしている〜1.9kb BamH I制限フラグメントの配合が
異なるだけである。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌K12 HB101を形質転換した。形質転換細
胞をアンピシリン含有のＬ寒天で平板培養し、アンピシ
リン耐性大腸菌K12 HB101/pBLTdhfr1および大腸菌K12 H
B101/pBLTdhfr2形質転換体を、そのプラスミドDNAの制
限酵素分析によって同定した。
D.プラスミドpBLTdhfr1（GT）およびpBLTdhfr2（GT）の
構築 実質的に実施例16Bの方法に従って、プラスミドpBLTd
hfr1またはpBFTdhfr2のBamH I部位にポリ−GT要素を挿
入する。ポリ−GT要素および部分的にBamH I消化した直
線状のプラスミドpBLTdfr1またはpBLTdhfr2 DNAのライ
ゲートする。ライゲートしたDNAは、各々、プラスミドp
BLTdhfr1（GT）およびpBLdhfr2（GT）からなっている。
プラスミドpBLTdhfr1（GT）の制限部位および機能地図
を添付の第18図に示す。
実施例17 プラスミドphdTPA、phd（GT）TPA、phdMTPA
およびphd（GT）MTPAの構築 A.中間体プラスミドpTPA602の構築 dH2O（45μ）中のプラスミドpTPA103（実施例11、
第12図）（約50μｇ）を10X EcoR I緩衝液（30μ）お
よびdH2O（225μ）に加えた。制限酵素EcoR T（10μ
；約80単位）をプラスミドpTPA103 DNA溶液に加え、
得られた反応液を37℃で90分間インキュベートした。Ec
oR I消化プラスミドpTPA103 DNAをエタノールで沈澱
し、1Xローディング緩衝液［10％グリセロールおよび0.
02％ブロモフェノールブルー］（50μ）に再懸濁し、
〜1.1kb EcoR I制限フラグメントが他の反応生成物から
分離するまで１％アガローゲル電気泳動にかけた。TPA
のアミノ末端をコードしているDNAを含有する〜1.1kb E
coR I制限フラグメントを、透析バッグに電気泳動させ
ることによってゲルから単離した。次いで、フラグメン
トをエタノールで沈澱させ、dH2O（160μ）に再懸濁
した。
10X Hga I緩衝液［0.5M NaCl;60mMトリス−HCl（pH7.
4）；および0.1M MgCl2］（約40μ）、dH2O（200μ
）、および制限酵素Hga I（20μ；約10単位）を、
1.1kb EcoR I制限フラグメントの溶液に加え、得られた
反応液を37℃で４時間インキュベートした。Hga I消化D
NAをエタノールで沈澱し、次いで、５％アクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、TPAのアミノ末端をコードする〜5
20bp制限フラグメントをDE81紙によって分離し、回収し
た。〜520bp Hga Iフラグメントが約５μｇ得られ、こ
れをdH2O（50μ）に懸濁した。
10Xクレノウ緩衝液［0.5Mトリス−HCl（pH7.4）；お
よび0.1M MgCl2］（約12.5μ）、４種類のデオキシヌ
クレオチドトリホスファターゼが各々6.25mMである溶液
（２μ）、0.2M DTT（２μ）、７μg/ml BSAR（１
μ）、dH2O（57.5μ）、およびクレノウ酵素［ベー
リンガー−マンヘイム・バイオケミカルズ（Boehringer
−Mannheim Biochemicals,7941 Castleway Dr.,P.O.Box
50816,Tndianapolis,IN 46250）］（２μ；約10単
位）を、〜520bp Hga I制限フラグメントの溶液に加
え、得られた反応液を20℃で30分間インキュベートし
た。クレノウ処理したDNAを70℃で15分間インキュベー
トし、エタノールで沈澱させた。
BamH Iリンカー［５′−CGGGATCCCG−３′、二本鎖、
ニュー・イングランド・バイラブズから入手した］（約
500pM）を、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて全反応
液量25μ中でリン酸化した。実質的に実施例7Aに記載
の方法に従って、この反応を行った。キナーゼ処理した
BamH Iリンカーを、クレノウ処理した〜520bp Hga I制
限フラグメントの溶液に、10Xリガーゼ緩衝液（15μ
）、T4 DNAリガーゼ（７μ；約７バイス単位）およ
び全反応液量を150μにするのに十分な量のdH2と一緒
に加えた。得られた反応液を16℃で一夜インキュベート
した。
このライゲーション反応液を熱不活性し、DNAをエタ
ノールで沈澱させ、10X BamH I緩衝液（５μ）および
dH2O（45μ）に懸濁した。制限酵素BamH I（１μ；
約16単位）をDNA溶液に加え、得られた反応液を37℃で9
0分間インキュベートした。反応混合物にさらにBamH I
酵素（16単位）を加え、反応液を37℃でさらに90分間イ
ンキュベートした。次いで、反応混合液を５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけ、実質的に実施例7Aの方
法に従って、BamH I末端を有する〜530bp Hga I制限フ
ラグメントをゲルから精製した。目的のフラグメントが
約２μｇ得られ、dH2O（20μ）に懸濁した。
BamH I消化した脱リン酸プラスミドpBR322 DNAは、ニ
ュー・イングランド・バイラブズから入手できる。dH2O
（２μ）中のBamH I消化した脱リン酸プラスミドpBR3
22（約0.1μｇ）を、プラスミドpTPA103のBamH I末端を
有する〜530bp Hga I制限フラグメント（１μ）、dH2
O（14μ）およびT4 DNAリガーゼ（１μ；約１バイ
ス単位）に加え、得られた反応液を16℃で一夜インキュ
ベートした。ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドp
TPA602およびpTPA601と命名した等価なプラスミド（〜5
30bp制限フラグメントの配向だけがプラスミドpTPA602
と異なる）からなっていた。
50mM CaCl2を用いる以外は、実質的に実施例３の方法
に従って、ライゲート化DNAを用いて大腸菌K12 MM294を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ寒
天で平板培養し、アンピシリン耐性大腸菌K12 MM2 94/p
TPA602および大腸菌K12 MM294/pTPA601細胞を、そのプ
ラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した。〜530bp
BamH I制限フラグメントの存在によって、プラスミド
がプラスミドpTPA6026またはpTPA601であることが示さ
れた。
B.中間体プラスミドpTPA603の構築 プラスミドpTPA602（約５μｇ）を10X Bgl III緩衝液
（20μ）およびdH2O（180μ）に溶解した。制限酵
素Bal II（３μ；約24単位）をプラスミドpTPA602 DN
A溶液に加え、得られた反応液を37℃で90分間インキュ
ベートした。次いで、反応混合物に10X BamH I緩衝液
（約13μ）を加えて反応混合物の塩濃度をSal I消化
用に望ましい濃度にし、制限酵素Sal I（２μ；約20
単位）を反応液に加えた。反応液を37℃でさらに２時間
インキュベートし、次いで、DNAをエタノールで沈澱さ
せ、ローディング緩衝液（75μ）に懸濁させ、〜4.2k
b Bal II−Sal I制限フラグメントが他の消化産物から
分離するまで１％アガロースゲル電気泳動にかけた。〜
4.2kb Bgl II−Sal I制限フラグメントを含有するゲル
部分をゲルから切り取り、凍結し、この凍結セグメント
をプラスチックで包み、圧搾して〜4.2kbフラグメント
を取り出した。DNAを沈澱させ、H2O（20μ）に再懸濁
させ、目的のフラグメントを約200ng得た。
プラスミドpTPA103（約12μｇ）を10X Bgl II緩衝液
（15μ）およびdH2O（135μ）に溶解した。制限酵
素Bgl II（２μ；約16単位）をプラスミドpTPA103 DN
A溶液に加え、得られた反応液を37℃で90分間インキュ
ベートした。10X BamH I緩衝液（約10μ）をBgl II消
化プラスミドpTPA103 DNAの溶液に加え、反応混合物の
塩濃度をSal I消化用の濃度にした。制限酵素Sal I（約
２μ；約20単位）を、Bgl II消化プラスミドpTPA103
DNAの溶液に加え、反応液を37℃でさらに90分間インキ
ュベートした。Bgl II−Sal I消化のプラスミドpTPA103
DNAをエタノール沈澱によって濃縮し、次いで、１％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、TPAのアミノ末端以外の
すべてをコードする〜2.05kb Bgl II−Sal I制限フラグ
メントをゲルから単離し、エタノールで沈澱させ、dH2O
（20μ）に再懸濁した。目的のフラグメントが約２μ
ｇ得られた。
プラスミドpTPA602の〜4.2kb Bgl II〜Sal I制限フラ
グメント（約５μ）およびプラスミドpTPA103の〜2.0
5kb Bgl II−Sal I制限フラグメント（２μ）を、10X
リガーゼ緩衝液（２μ）、dH2O（10μ）およびT4 D
NAリガーゼ（１μ；約１バイス単位）に加え、得られ
たライゲーション反応液を16℃で一夜インキュベートし
た。ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドpTPA603か
らなっていた。プラスミドpTPA603の制限部位および機
能地図を添付の第19図に示す。
50mM CaCl2を用いた以外は、実質的に実施例３の方法
に従って、ライゲート化DNAを用いて大腸菌K12 MM294を
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有のＬ寒
天で平板培養し、アンピシリン耐性大腸菌K12 MM294/pT
PA603形質転換体を、そのプラスミドDNAの制限酵素分析
によって同定した。
C.プラスミドpMTPA603の構築 TE緩衝液（100μ）中のプラスミドpBLT（実施例1
5）（約100μｇ）を、10X Sst I（Sst Iは制限酵素Sac
Iと等価である）緩衝液［60mMトリス−HCl（pH7.4）;60
mM MgCl2;60mM 2−メルカプトエタノール；および1mg/m
l BSA］（10μ）およびdH2O（25μ）に加えた。制
限酵素Sst I（10μ；約50単位）をプラスミドpBLT DN
A溶液に加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュ
ベートした。Sst I消化プラスミドpBLT DNAをエタノー
ルで沈澱させ、10X Bgl II緩衝液（10μ）およびdH2O
（85μ）に再懸濁させた。制限酵素Bgl I（５μ；
約50単位）をSst I消化プラスミドpBLT DNA溶液に加
え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベートし
た。
実質的に実施例4Aの方法に従って、Bgl I−Sst I消化
プラスミドpBLT DNAをエタノールで沈澱させ、dH2O（10
μ）に再懸濁し、1.5％アガロースゲル電気泳動にか
け、プラスミドpBLTの〜690bp Bgl II−Sst I制限フラ
グメント［装飾TPAの暗号配列を得るための削除が為さ
れている装飾TPA暗号配列の部分を含有する］をゲルか
ら単離した。目的の、プラスミドpBLTの〜690bp Bgl II
−Sst I制限フラグメントが約５μｇ得られ、これをdH2
O（100μ）に懸濁した。
TE緩衝液（５μ）中のプラスミドpTPA603（本実施
例のＢ、第19図）（約５μｇ）を10X Sat I緩衝液（10
μ）およびdH2O（95μ）に加えた。制限酵素Sst I
（約５μ；約50単位）をプラスミドpTPA603 DNAの溶
液に加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベー
トした。Sst I消化プラスミドpTPA603 DNAをエタノール
で沈澱し、10X Bgl II緩衝液（10μ）およびdH2O（85
μ）に再懸濁した。制限酵素Bgl II（５μ；約50単
位）をSst I消化プラスミドpTPA603 DNA溶液に加え、得
られた反応液を37℃で２時間インキュベートした。実質
的に実施例4Bの方法に従って、Bgl II−Sst I消化のプ
ラスミドpTPA603 DNAをTE緩衝液で100μに希釈し、ウ
シ腸アルカリホスファターゼで処理した。次いで、DNA
をエタノールで沈澱させ、dH2O（10μ）に再懸濁し
た。
Bgl II−Sst I消化プラスミドpTPA603（約５μ）お
よびプラスミドpBLTの〜690bp Bgl II−Sst I制限フラ
グメント（２μ）を、10Xリガーゼ緩衝液（２μ
）、dH2O（10μ）、およびT4 DNAリガーゼ（１μ
；約1000単位）に加え、得られたライゲーション反応
液を16℃で一夜インキュベートした。ライゲートしたDN
Aは目的のプラスミドpMTPA603からなっていた。プラス
ミドpMTPA603はプラスミドpTPA603（第19図）の構造に
類似しているが、プラスミドpMTPA603が修飾TPAをコー
ドし、プラスミドpTPA603がTPAをコードしていることが
異なっている。
実施例３の方法に従って、ライゲート化DNAを用いて
大腸菌K12 HB101を形質転換した。形質転換細胞をアン
ピシリン含有のＬ寒天で平板培養し、アンピシリン耐性
大腸菌K12 HB101/pMTPA603形質転換体を、そのプラスミ
ドDNAの制限酵素分析によって同定した。
D.プラスミドphdTPAの構築 TE緩衝液（10μ）中のプラスミドpTPA603［本実施
例のＢ、第19図］（第10μｇ）を、10X BamH I緩衝液
（10μ）およびdH2O（85μ）に加えた。制限酵素Ba
mH I（５μ；約50単位）をプラスミドpTPA603 DNA溶
液に加え、得られた反応液を37℃で２時間インキュベー
トした。BamH I消化プラスミドpTPA603 DNAをエタノー
ルで沈澱させ、dH2O（10μ）に再懸濁させ、TPAをコ
ードする〜1.90kb BamH I制限フラグメントを他の消化
産物から分離するまで１％アガロースゲル電気泳動にか
けた。〜1.90kb BamH I制限フラグメントをゲルから単
離し、TE緩衝液（50μ）に再懸濁し、目的のフラグメ
ントを約４μｇ得た。
10X Bcl I緩衝液（２μ）およびdH2O（14μ）にT
E緩衝液（２μ）中のプラスミドphd（実施例13）（約
２μｇ）を加えた。制限酵素Bcl I（２μ；約10単
位）をプラスミドphd DNA溶液に加え、得られた反応液
を50℃で２時間インキュベートした。反応混合物をまず
エタノールで、次いでクロロホルムで２回抽出すること
によって反応を止めた。次いで、Bcl I消化プラスミドp
hd DNAをエタノールで沈澱させ、TE緩衝液（20μ）中
に再懸濁させた。
Bcl I消化プラスミドphd（約１μ）およびプラスミ
ドpTPA603の〜1.90kb BamH I制限フラグメント（２μ
）を、10Xリガーゼ緩衝液（１μ）、dH2O（５μ
）、およびT4 DNAリガーゼ（１μ；約500単位）に
加えた。得られたライゲーション反応液を16℃で一夜イ
ンキュベートした。ライゲートしたDNAは、目的のプラ
スミドphdTPAからなっていた。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌K12 HB101（NRRL B−15626）を形質転換
した。形質転換混合物をアンピシリン含有のＬ寒天で平
板培養し、アンピシリン耐性大腸菌K12 HB101/phdTPA細
胞を制限酵素分析によって同定した。〜1.90kb BamH I
制限フラグメントは、プラスミドphd中に、２つの配向
のうちどちらかで挿入することができ、その一方におい
てのみ、BKエンハンサー−アデノウィルス後期プロモー
ターカセットのコントロール下で発現され得る適切な位
置にTPA暗号配列が配置されており、これが目的のプラ
スミドphdTPAとなる。
E.プラスミドphd（Ｇ）TPAの構築 実質的に実施例4B.1の方法に従って、BKエンハンサー
とAd2後期プロモーターの間にあるプラスミドphdTPA
（本実施例のＤ）の唯一のXho I部位にポリ−GT要素を
挿入する。Xho I消化ポリ−GT要素およびXho I消化プラ
スミドphdTPA DNAをライゲートする。ライゲートしたDN
Aは、目的のプラスミドphd（GT）TPAからなっている。
プラスミドphd（GT）TPAの制限部位および機能地図を添
付の第20図に示す。
F.プラスミドphdMTPAの構築 TE緩衝液（10μ）中のプラスミドpMTPA603［本実施
例のＣ］（約10μｇ）を10X BamH I緩衝液（10μ）お
よびdH2O（85μ）に加えた。制限酵素BamH I（５μ
；約50単位）をプラスミドpMTPA603 DNA溶液に加え、
得られた反応液を37℃で２時間インキュベートした。Ba
mH I消化プラスミドpMTPA603 DNAをエタノールで沈澱さ
せ、dH2O（10μ）に再懸濁し、修飾TPAをコードする
〜1.35kb BamH I制限フラグメントが他の消化産物から
分離するまで１％アガロースゲル電気泳動にかけた。〜
1.35kb BamH I制限フラグメントをゲルから単離し、こ
れをTE緩衝液（20μ）に再懸濁し、目的のフラグメン
トを約４μｇ得た。
Bcl I消化プラスミドphd［本実施例のＤ］（約１μ
）およびプラスミドpMTPA603の〜1.35kb BamH I制限
フラグメント（２μ）を10Xリガーゼ緩衝液（１μ
）、dH2O（５μ）およびT4 DNAリガーゼ（１μ；
約500単位）に加えた。得られたライゲーション反応液
を16℃で一夜インキュベートした。ライゲートしたDNA
は目的のプラスミドphdMTPAからなっていた。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌K12 1HB01を形質転換した。形質転換混
合物をアンピシリン含有のＬ寒天で平板培養し、アンピ
シリン耐性大腸菌K12 HB101/phdMTPA細胞をそのプラス
ミドDNAの制限酵素分析によって同定した。〜1.35kb Ba
mH I制限フラグメントは、Bcl I消化プラスミドphd中
に、２つの配向のどちらかで挿入することができ、その
一方だけがBKエンハンサー−アデノウィルス後期プロモ
ーターのコントロール下で発現し得る適切な位置にTPA
暗号配列を配置しており、これが目的のプラスミドphdM
TPAとなる。
G.プラスミドphd（GT）MTPAの構築 実施例4B.1の方法に従って、BKエンハンサーおよびAd
2後期プロモーターの間にあるプラスミドphdMTPA［本実
施例のＦ］の唯一のXho I部位にポリ−GT要素を挿入し
た。Xho I消化のポリ−GT要素とXho I消化のプラスミド
phd MTPA DNAをライゲートする。ライゲートしたDNA
は、目的のプラスミドphd（GT）MTPAからなっていた。
プラスミドphd（GT）MTPAの制限部位および機能地図を
添付の第21図に示す。
実施例18 改良されたエンハンサー−プロモーターカセ
ットの構築 近接の真核性プロモーターのCCAAT領域またはCCAAT領
域等価域の５′末端の上流の０〜300ヌクレオチドのと
ころにエンハンサーを設置することによって、BKエンハ
ンサーの転写−促進効果を有意に増強することができ
る。実施例19に記載のように、大きいDNAウィルスの即
時型遺伝子産物（例えば、E1A遺伝子産物）の存在下、B
Kエンハンサー−Ad2後期プロモーターカセットの上流ま
たは下流にポリ−GT要素を設置することによって転写の
促進をさらに増強することができる。さらに大きい促進
活性を達成するための修飾を行う前の、本BKエンハンサ
ー−アデノウィルス２後期プローターカセットの配列お
よび機能的要素は以下のとおりである： この図から、BKエンハンサーはATCCからVR−837の下で
入手可能なBKウイルスのプロトタイプ株を起源とすると
予測される。しかしながら、ATCC VR−837はBKエンハン
サー変異体の混合物である。本明細書記載のプラスミド
pBal8catおよび他のBKエンハンサー含有プラスミドは記
載のBKプロトタイプエンハンサーではなく、プロトタイ
プ株から単離されたBKエンハンサー変異体を含有してい
る。上記のプロトタイプエンハンサーの配列式の243位
から467位に対応する変異体エンハンサーの配列がプロ
トタイプpBal8catおよび他のプラスミト類に見い出さ
れ、下記式で示される： しかしながら、上記のごとく、本発明方法および本発明
化合物には任意のBKエンハンサー変異体を用いることが
できる。
プロトタイプBKエンハンサーは上記式で示されるよう
に、２つの反復される配列であって、いずれの方向にあ
っても隣接する配列に関して同様に機能するものと定義
される。エンハンサー、具体的には、BKエンハンサーの
第３リピート（反復）の３′末端（これは方向性に依存
する）を、アデノウイルス−２のCCAAT領域の５′末端
に近付けるために、TE緩衝液（170μ）中のSst II消
化プラスミドpB1catDNA（実施例５）（約82μｇ）を５
×Bal31ヌクレアーゼ緩衝液（0.1M Tris−HCl、pH8.1、
0.5M NaCl、0.06M CaCl2、および5mM Na2EDTA）（20μ
）およびBal31ヌクレアーゼ（９μ）、これは６μ
（約６単位）の“早い"Bal31要素と３μ（約３単
位）の“遅い"Bal31酵素からなる［インターナショナル
・バイオテクノロジーズ（International Biotechnolog
ies,Inc.）P.O.Box 9558、275 Winchester Ave.,New Ha
ven,CT 06506から市場化されている］に加えた。反応混
合物を30℃で約３分間インキュベートし、1.0M EDTA
（約10μ）を加えて反応を停止させた後、Bal31−消
化DNAをエタノール沈殿と遠心によって収集した。DNAペ
レットを１×クレノウ緩衝液に再懸濁し、本明細書に記
述の方法と実質上、同様にしてクレノウ酵素で処理し
た。
クレノウ−処理DNAをTE緩衝液（10μ）に再懸濁
し、次いで、DNA（約１μ）を記述のごとく、１×リ
ガーゼ緩衝液（10μ）中、T4DNAおよびRNAリガーゼを
用いて自己結合させた。結合したDNAを用いて大腸菌K12
HB101を形質転換体し、次いで、得られた形質転換体を
アンピシリン含有Ｌ−寒天上で平板培養した。どの形質
転換体が適切な大きさのBKエンハンサー−アデノウイル
ス２後期プロモーターカセットを含有しているかを決定
するために制限酵素分析を行った。前記の工程によっ
て、アデノウイルス後期プロモーターのCCAAT領域の上
流０〜300ヌクレオチドの間にBKエンハンサーが位置し
ている多数のプラスミドが生成した。この工程で得られ
た１つのプラスミドをプラスミドpBal8catと命名した。
プラスミドpBal8catはNRRLから受託番号NRRL B−18267
の下で入手可能である（寄託日:1987年12月１日）。プ
ラスミドpBal8catは上記のごとく、約100bpづつの２個
のリピート（繰返し）配列を含んだBKエンハンサー変異
体を含有している。この変異体のエンハンサーは、第２
リピートの３′末端をアデノウイルス後期プロモーター
のCCAT領域の１〜300ヌクレオチドの間に設置すること
によって、本発明方法に用いることができる。
当業者ならば、上記工程で多くの別のプラスミドが得
られ、プラスミドpBal8catがその例示のプラスミドであ
ることを認識するであろう。これらのプラスミドは、Ad
2後期プローモーターのCCAAT領域から300ヌクレオチド
以内の様々な位置にBKエンハンサーが存在している１群
のプラスミドである。上記の工程または他の当業者既知
の工程によって達成可能な、このBKエンハンサー活性の
改善法は任意のBKエンハンサーおよび任意の真核性プロ
モーターを用いて達成することができる。
実施例19 改善されたポリGT−エンハンサープロモータ
ー−カセットの構築 上記実施例18記載の、プラスミドpBal8catで例示され
る種々のプラスミド各々にポリ−GT要素（エレメント）
を挿入することができる。この１群のポリ−GT含有プラ
スミドはAd2後期プロモーターのTCCAAT領域から300ヌク
レオチド以内の様々な距離のところにBKエンハンサーが
配された発現ベクター内の、CAT遺伝子の３′または
５′側にいずれの方向でポリ−GT要素が配置されてお
り、本発明の重要な態様を構成している。ポリ−GTのプ
ラスミドpBal8catへの挿入は以下のようにして行われ
た。TE緩衝液（１μ）中のpBal8catDNA（実施例18）
（約１μｇ）を10xコア（Core）緩衝液（２μ）およ
び水（16μ）に溶かした。制限酵素BamH T（１μ、
約10単位）をDNA溶液に加え、得られた反応混合物を37
℃で２時間インキュベートした。このインキュベーショ
ンに次いで、混合物を70℃で10分間、熱−活性化した。
BamH I消化pBal8catDNA（１μ、約50ng）と実施１
で調製したポリ−GT合成断片（７μ、約500ng）の混
合物に10xリガーゼ緩衝液（１μ）を加えた。このDNA
溶液にT4DNAリガーゼ（１μ、約400単位）を加え、得
られた反応混合物を16℃で一夜インキュベートした。結
合したDNAは、挿入ポリ−GT要素のCAT暗号配列に関する
方向性のみが異なる、所望のプラスミドpBal8cat（GT
6）（センス）およびpBal8cat（GT9）（アンチセンス）
をそれぞれ構成していた。E1A遺伝子のような大きいDNA
ウイルスの即時型遺伝子産物の存在下におけるポリ−GT
要素のエンハンサー活性は、それが挿入されたプラスミ
ド発現ベクター内でのポリ−GT要素の方法によって左右
されない。従って、例えば、プラスミドpBal8cat（GT
6）およびプラスミドpBal8cat（GT9）はE1Aの存在下、
同等に有効なCAT遺伝子産物のための発現ベクターであ
り得る。プラスミドpBal8cat（GT6）の制限部位および
機能地図を添付の第22図に示す。
大腸菌K12 HB101細胞（NRRL B−15626）を培養して形
質転換コンピテントとし、実質上、実施例３記載の方法
に従い、上で調製した結合DNAにより形質転換した。形
質転換細胞をアンピシリン（100μg/ml）含有Ｌ−寒天
プレート上で平板培養した。大腸菌K12 HB101/pBal8cat
（GT6）および大腸菌K12 HB101/pBal8cat（GT9）形質転
換体をアンピシリン耐性表現型およびそのプラスミドDN
Aの制限酵素分析によって同定した。実質上、実施例３
記載の方法に従ってプラスミドpBal8cat（GT6）DNAおよ
びpBal8cat（GT9）DNAを調製した。
実施例20 プラスミドpSV2E1Aの構築 大腸菌K12 HB101/pSV2cat細胞を凍結乾燥品の形でATC
Cから受託番号ATCC37155の下で入手し、実質上、実施例
３記載の方法に従って細胞からプラスミドpSV2catDNAを
単離する。プラスミドpSV2catの制限部位および機能地
図を添付の第３図に示す。プラスミドpSV2catDNA（約１
μｇ、１μ）を10xコア（Core）緩衝液（２μ）お
よびdH2O（14μ）に加え、次いで、このpSV2catDNA溶
液に制限酵素Stu I（1.5μ、約15単位）および制限酵
素EcoR I（1.5μ、約15単位）を加え、得られた反応
混合物を37℃で２時間インキュベートした。70℃で10分
間、熱不活化して反応を停止させた。熱不活化の後、DN
A混合物にdH2O（25）を加え、10xクレノウ緩衝液（約
５μ）およびクレノウ酵素（２μ、約10単位）を加
え、得られた反応混合物を16℃で１時間インキュベート
した。次いで、クレノウ処理、Stu I/EcoR I消化プラス
ミドpSV2catDNAをエタノール：クロロホルムで２回、次
いでクロロホルム：イソアミルアルコールで１回抽出
し、エタノール沈澱させた後、トリス緩衝液（20μ）
に再懸濁した。
実質上、実施例12A記載の方法に従ってアデノウイル
ス−2DNAのE1A遺伝子を含有する断片を単離した。E1A遺
伝子を含有する〜1.8kbBal I断片を単離し、この断片
（約９μ、約500ng）をdH2O（１μ）および10xリガ
ーゼ緩衝液2.5μと一緒に、上記のクレノウ処理したS
tu I/EcoR I消化プラスミドpSV2catDNA（10μ、約100
ng）に加えた。このDNA溶液にT4DNAリガーゼ（2.5μ
、約1250単位）を加え、得られた反応混合物を16℃で
一夜インキュベートした。結合したDNAは、pSV2E1Aを構
成していた。プラスミドpSV2E1Aの制限部位および機能
地図を添付の第23図に示す。
プラスミドpSV2E1Aはポリ−GT要素、真核性プロモー
ター、および形質転換された宿主細胞内で発現されるべ
き組換え遺伝子を含有する任意の他のプラスミド類との
同時形質転換実験におけるE1A遺伝子供給源として本発
明にとって有用である。そのようなプラスミドには、pL
P（GT）cat、pBL（GT）cat、pSBL（GT）cat、pLCP（G
T）、pLPC4（GT）、pLPC5（GT）、pLPChyg1（GT）、pLP
Chyg2（GT）、pLPCdhfr1（GT）、pLPCdhfr2（GT）、pLP
Chd1（GT）、pLPChd2（GT）、pLPChd3（GT）、pLPChd4
（GT）、pBLT（GT）、pBLThyg1（GT）、pBLThyg2（G
T）、pBLTdhfr1（GT）、pBLTdhfr2（GT）、phdTPA（G
T）、phdMTPA（GT）、pBal8cat（GT6）、pBal8cat（GT
9）、p4−14（GT）、p2−５（GT）およびpT6hd（GT）が
含まれる。別法として、E1A遺伝子は、ポリ−GT要素、
真核性プロモーターおよび形質転換細胞内で発現される
べき組換え遺伝子と一緒に、例えば実施例14Bに記載の
プラスミドpLPCE1Aのような単一のプラスミドに担持さ
せて供給してもよい。
実施例21 プラスミドpT6hdおよびpT6hd（GT）の構築 A.ATP暗号領域の部位特異的突然変異誘発およびプラス
ミドpT6hdの構築 TPA暗号領域の部位特異的突然変異誘発およびプラス
ミドpT6hdの構築は以下のようにして行われる。dH2O（1
0μ）中のプラスミドpTPA103（実施例17、約５μｇ）
を10xHind III緩衝液（約10μ）およびdH2O（80μ
）に加える。このプラスミドpTPA103DNA溶液に制限酵
素Hind III（１μ、約20単位）を加え、得られた反応
混合物を37℃で90分間インキュベートする。このHind I
II消化プラスミドpTPA103DNA溶液に制限酵素Sst I（１
μ、約20単位）と1M Tris−HCl（pH7.6）（10μ）
を加え、得られた反応混合物を37℃で90分間インキュベ
ートする。Hind III−Sst I消化プラスミドpTPA103DNA
をエタノール沈澱によって濃縮し、1.5％アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、〜1.4kb Hind III−Sst I制限断片
が他の消化産物から分離するまで泳動する。実質上、実
施例4A記載の方法に従って〜1.4kb Hind III−Sst I制
限断片をゲルから単離し、ライゲーション用に調製し、
dH2O（20μ）に再懸濁する。
dH2O（35μ）中の複製型（RF）M13mp18DNA（New En
gland Biolabsら入手可能）（約4.5μｇ）を10xHind II
I緩衝液（10μ）およびdH2O（55μ）に加える。こ
のM13mp18DNA溶液に制限酵素Hind III（１μ、約20単
位）を加え、得られた反応混合物を37℃で１時間インキ
ュベートする。Hind III消化M13mp18DNA溶液に制限酵素
Sst I（１μ、約20単位）および1MTris−HCl（pH7.
6）（10μ）を加え、得られた反応混合物を37℃で１
時間インキュベートする。Hind III−Sst I消化M13mp18
DNAをエタノール沈澱によって収集し、アガロースゲル
電気泳動用の標本として再懸濁し、上記のごとくゲル電
気泳動にかけて大きい制限断片を単離する。M13mp18の
大きいHind III−Sst I制限断片（約１μ）を得、dH2
O（20μ）に懸濁する。プラスミドpTPA103の〜1.4kb
Hind III−Sst I制限断片（３μ）にM13mp18の大きい
Hind III−Sst I制限断片（約２μ）、10xT4DNAリガ
ーゼ緩衝液（２μ）、dH2O（12μ）、およびT4DNA
リガーゼ（〜１μ、約1Weiss単位）を加え、得られた
反応混合物を16℃で一夜インキュベートする。
大腸菌JM103細胞（BRLから入手可能）をコンピテント
細胞にし、トランスフェクショあたりのDNA使用量を変
化させる外は、実質上、BRL M13クローニング／‘ジデ
オキシ’シークエンシング・インストラクション・マニ
ュアルに記載の方法に従い、ライゲーション混合物を用
いてトランスフェクションする。組換えプラークを、挿
入するβ−ガラクトシダーゼのα断片をコードする遺伝
子の不活化、これはＸ−galを開裂してインジゴ色の開
裂産物に変換する能力の喪失を招く、に基づいて同定す
る。スクリーニングのために、幾つかの白色プラークを
Ｌブロス（2.5ml）中にとり、proABを担持するＦエピソ
ームを確実に保持するために最少培地ストックで培養さ
れている対数増殖期の大腸菌K12 JM103（0.4ml）を加え
る。プラーク含有細胞懸濁液（2.5ml）を空気振盪機に
より、37℃で８時間インキュベートする。1.5mlずつ、
細胞をペレット化し、実質上、BirnboimとDolyのアルカ
リ性ミニスクリーン法（1979年、Nuc.Acids Res.7:151
3）記載の方法にしたがってRF DNAを単離する。各培養
物の残余は４℃でストックとして保存する。所望のMP18
BW47と命名されたファージはM13mp18の〜7.2kb EcoR I
−Hind III制限断片に結合したプラスミドpBW25の〜1.4
kb Hind III−Sst I制限断片を含有している。
対数増殖期の大腸菌K12 JM103（約50ml）をMP18BW47
に感染させ、空気振盪機中で37℃において18時間インキ
ュベートする。感染細胞を低速遠心によってペレット化
し、インストラクション・マニュアル記載の方法を大規
模にして培養上清から１本鎖MP18BW47DNAを調製する。
クレノウ反応を、室温で30分間、次いで37℃で60分間、
さらに10℃で18時間行う外は、実質上、アデルマンらの
方法［Adelman,1983,DNA2（３）:183−193］に従って１
本鎖MP18BW47に突然変異を誘発する。さらに、S1処理を
20℃で行い、緩衝液の塩濃度を業者の指示の1/2とし、M
13シークエンシングプライマー（BRL）を用いる。天然
のTPAのアミノ酸残基４から175までの暗号配列を欠失す
るために用いるオリゴデオキシリボヌクレオチド・プラ
イマーは、以下の配列式で示される。
得られた突然変異混合物を用い、実質上、上記の感染
法に従って大腸菌K12 JM103をトランスフェクションす
る。RFDNAの制限酵素分析およびマキサムおよびギルバ
ートのDNA配列決定法によって所望の突然変異体を同定
する。天然のTPAのアミノ酸残基４〜175をコードする配
列が削除された暗号配列を有する所望の突然変異体をMP
18BW52と命名する。
制限酵素消化、断片の単離およびライゲーションはす
べて、実質上、実施例４記載の方法に従って行われた。
プラスミドpT6hdは以下のごとくにして構築された。ま
ず、プラスミドpTPA603（実施例17、第19図）から〜1.9
kbBamH I断片を得た。次いで、プラスミドpAc373［ミヤ
モトら（Miyamoto）、1985、Mol.cell Biol.5:2860−28
65］をBamH I消化に付し、プラスミドpTPA603の〜1.9kb
BamH I断片と結合させてプラスミドpL100を得た。次い
で、プラスミドpL100DNAを制限酵素Bgl IIおよびSst I
で消化し〜1.2kb Bgl II−Sst I断片を単離した。
上で得たMP18BW52DNAを制限酵素Bgl IIおよびSst Iで
消化し、〜718bp断片を単離した。MP18BW52の〜718bpBg
l II−Sst I断片とプラスミドpL100の〜1.2kbBgl II−S
st I断片と結合させて中間体プラスミドpL229を得た。
次いで、プラスミドpL229DNAを制限酵素BamH Iで消化
し、〜1.4kbBamH I断片を単離した。プラスミドphd（実
施例13）をBcl Iで消化し、プラスミドpL229の〜1.4kbB
amH I断片と結合させて所望のプラスミドpT6hdを創製し
た。
B.pT6hd（GT）の構築 実質上、実施例4B.1.記載の方法に従い、プラスミドp
T6hdのBKエンハンサーとAd2後期プロモーターとの間の
唯一のXho I部位にポリ−GT要素を挿入した。Xho I消化
ポリ−GT要素およびXho I消化プラスミドpT6hdを結合さ
せると、結合したDNA構築物は所望のプラスミドpT6hd
（GT）を構成していた。プラスミドpT6nd（GT）の制限
部位および機能地図を添付の第24図に示す。
別法によれば、プラスミドpL229（上記A.に記載）の
〜1.4kb BamH I断片とBcl I消化プラスミドphd（GT）
（実施例13、第14図）とを結合させてプラスミドpT6hd
（GT）を作成することによっても、プラスミドpT6hd（G
T）を構築することができる。
実施例22 幾つかの発現ベクターの真核性宿主細胞形質
転換体の構築 本明細書記載の発現ベクターの重要な態様は、これら
発現ベクター中のポリ−GT要素およびBKエンハンサーを
用いて、E1A遺伝子産物の存在下に遺伝子発現を刺激す
ることに関連する。293細胞はE1A遺伝子産物を構成的
（継続的）に発現するので、293細胞は本発明の真核性
発現ベクターの好ましい宿主である。293細胞は５型ア
テノウイルスによって形質転換されたヒト胚性腎細胞で
あり（本発明においては、E1A遺伝子の供給源としてど
のような型のアデノウイルスを用いてもよいことに注意
されたい）ATCCから受託番号RL1573の下で何人も入手可
能である。本明細書記載の発現ベクターの多くは、たと
えE1A遺伝子が存在しなくとも広範な宿主細胞内で機能
する。しかしながら、E1A遺伝子（または同様に作用す
る大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物）は、本発明
のポリ−GT含有発現ベクターからの遺伝子発現を促進す
るためのポリ−GT要素の活性化に必要である。非E1A産
生セルラインを、プラスミドpSV2E1A、pLPCE1AおよびpL
PCE1A1等のE1A遺伝子含有ベクター、または剪断したア
デノウイルスDNAで形質転換するか、あるいはアデノウ
イルスに感染させることにより、E1A遺伝子産物を該セ
ルラインに導入することができる。
下記の形質転換工程は宿主細胞として293細胞に関し
て述べられているが、これは大多数の真核性セルライン
に一般的に適用することができる。本明細書記載のベク
ターを用いて様々なセルラインを形質転換することがで
きる。本明細書には多数の発現ベクターが記載されてい
るので、形質転換法を一般的に記述する。
293細胞は、ATCCから受託番号CRL1573の下、25mm2フ
ラスコ中、10％熱不活化ウマ血清を含有するイーグル
（Egale's）の最少必須培地中で全面波長した約5.5x106
個の細胞の単一層として入手する。フラスコを37℃でイ
ンキュベートし、培地を週２回交換する。培地を捨て、
ハンク（Hank's）を均衡塩類溶液（HBS）（Gibco）で洗
浄し、0.25％トリプシンを１−２分間加え、新鮮な培地
で洗浄し、吸引し、継代培養比1:5または1:10で新しい
フラスコに分けることにより細胞を継代培養する。
トランスフェクションの１日前に細胞を皿あたり0.7x
106細胞で撤く。トランスフェクションの４時間前に培
地を交換する。TE緩衝液に溶かした、滅菌してエタノー
ル沈澱させたプラスミドDNAを用いて40μg/ml DNAと250
mMCaCl2を含有する2xDNA−CaCl2を調製する。2xHBSは28
0mM NaCl、50mM HEPES、および1.5mM リン酸ナトリウム
を含有させ、pHを7.05−7.15に調節して調製する。2xDN
A−CaCl2溶液を等容量の滅菌2xHBSに滴下する。2xHBS含
有混合管中に綿栓を付けた1mlの滅菌プラスチックピペ
ットを挿入し、DNA添加の間を通して気泡を吹き込む。
撹拌せずに、室温で30−45分間をかけ、リン酸カルシウ
ム−DNA沈澱を形成させる。
次いで、静かにプラスチックピペットで撹拌して沈澱
を混合し、沈澱1ml（プレートあたり）を直接、受容体
細胞を覆っている増殖培地10mlに加える。37℃で４時間
インキュベートした後、培地を10％ウシ胎児血清を含有
するDMEMで置換し、さらに72時間細胞をインキュベート
した後、選択圧をかける。組換えヒトプロテインＣを発
現する形質転換体を得るために、増殖培地にタンパク質
のγカルボキシル化に必要な１〜10μg/mlビタミンＫを
含有させる。プラスミドが真核性細胞内で機能する選択
マーカーを含有していない場合には形質転換工程にプラ
スミド混合物による同時形質転換を用いる：本明細書記
載の選択マーカー不含の発現ベクターと、真核性細胞内
で機能する選択マーカーを含有する発現ベクターとの混
合物。この同時形質転換法により、形質転換プラスミド
の両方を含有する細胞を同定することができる。
ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有するプラスミ
ドでトランスフェクションされた細胞については、増殖
培地にハイグロマイシンを終濃度約200〜400μg/mlとな
るように加える。次いで、培地を３〜４日間隔で交換し
ながら細胞を37℃で２−４週間インキュベートする。得
られたハイグロマイシン耐性コロニーをそれぞれ別個の
培養フラスコに入れ、特性化する。ネオマイシン耐性コ
ロニーの選択（ネオマイシンの代わりにG418を用いても
よい）は、ハイグロマイシンでなく、G418を終濃度400
μg/mlで加える外は、実質上、ハイグロマイシン耐性細
胞の選択法にしたがって行う。293細胞はdhfr陽性であ
るので、dhfr遺伝子含有プラスミドを有する293形質転
換体は、ヒポキサンチンおよびチミン不含の培地で増殖
する能力であるdhfr−陽性表現型のみに基づいて選択す
ることはできない。機能的なdhfr遺伝子を欠失してお
り、dhfr含有プラスミドで形質転換されたセルラインは
dhfr陽性表現型に基づいて選択される。
dhfr欠失セルラインに遺伝子またはプラスミドを導入
するための選択マーカーとしてdhfr遺伝子を用い、次い
でメトトレキセートを用いてプラスミドのコピー数を増
大する方法は十分に確立され文献に記載されている。dh
fr産生細胞における選択可能かつ増幅可能なマーカーと
してのdhfrの使用はあまり研究されていないが、文献に
はdhfrをdhfr酸性細胞に、選択マーカーとして、また遺
伝子増幅のために用い得ることが示唆されている。本発
明の用途は用いる選択マーカーによって限定されること
ない。さらに、メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデ
アミナーゼ遺伝子、またはＰ−グリコプロテインに例示
されるマルチ遺伝子耐性ファミリー（多耐性遺伝子ファ
ミリー）などの増幅可能なマーカーを用いることができ
る。293細胞中では、ハイグロマイシンＢ耐性付与遺伝
子のような選択マーカーを含有するベクターで形質転換
し、次いでメトトレキセートを用いて増幅すると便利で
あるが、これは293細胞中のネズミdhfr含有プラスミド
の直接選択の場合には用いることができない。
実施例23 AV12真核性宿主細胞形質転換体 実質上、実施例22で293細胞について述べたと同様に
してAV12セルライン（ATCC CRL 9525）を形質転換する
ことができる。しかしながら、293細胞と異なり、AV12
細胞は、ネズミdhfr遺伝子を含有するベクターを用いて
形質転換した場合には、メトトレキセート（200−500n
m）で直接選択することができる。アデノウイルスで形
質転換された細胞が、活性化されたヒトプロテインＣの
ようなγ−カルボキシル化タンパク質を産生することの
利点は、そのような細胞が完全にγ−カルボキシル化さ
れた活性なヒトプロテインＣ産生するという点である。
形質転換体を、ハイグロマイシンＢまたはメトトレキセ
ートで選択する；そのような形質転換体はヒトプロテイ
ンＣを約２〜４μg/ml産生することができる。メトトレ
キセートにより、プロテインＣ濃度を約50μg/mlまで上
昇させることができる。プロテインＣを活性化すること
ができ、その活性はグリンネルら（Grinnell,1987,Bio/
Technology,5:1189）の方法によって測定することがで
きる。
アデノウイルス−形質転換宿主細胞、例えばAV12によ
り産生される組換えプロテインＣの活性は、少なくとも
ヒト血中のそれと同一活性である。アデノウイルスで形
質転換されていない宿主細胞においては、産生された組
換えプロテインＣの抗議固活性はヒト血液−誘導プロテ
インＣの活性の60％を越えることはなかった。
実施例24 アデノウイルスの３部構成リーダーをコード
するプラスミド類、プラスミドp4−14、p2−５、p4−14
（GT）およびp2−５（GT）の構築 プラスミドp4−14（GT）およびp2−５（GT）はいずれ
もヒトプロテインＣを真核性宿主細胞内で高レベルに発
現させるために、修飾されたポリGT−BKエンハンサーア
デノウイルス後期プロモーター系およびアデノウイルス
の３部構成リーダー（TPL）を使用している。プラスミ
ドp4−14およびp2−５は、それぞれプラスミドp4−14
（GT）およびp2−５（GT）と同一であるが、ポリGT要素
を欠いている。アデノウイルスの３部構成リーダー（TP
L）をコードするDNAをアデノウイルスから単離した。制
限酵素切断部位の後方の括弧内の数字はアデノウイルス
のマップ単位を表す。
プラスミドpUC13（BRLから市販品を入手可能）を制限
酵素Sph IおよびBamH Iで消化した後、２型アデノウイ
ルスのTPLをコードする〜7.2kb Sph I（5135）−Bcl I
（12、301）制限断片と結合させてプラスミドpTPL4を得
た。プラスミドpTPL4を制限酵素Sau I（7616）およびBg
l II（8904）で消化してTPLをコードするDNAからイント
ロンの１部を除去し、クレノウ酵素で処理して再結合
し、プラスミドpDTPLを得た。次いでプラスミドpvTPLを
制限酵素Xho Iで消化し、TPLをコードする〜2.62kb Xho
I断片（アデノウイルスの5799および9689Xho I部位）
を単離し、ライゲーションに備えた。
プラスミドpBLcatを制限酵素Bcl Iで消化した。下記
の配列： を有するリンカーを合成し、実質上、実施例１記載の方
法に従ってアニーリングし、このリンカーをBcl I消化
プラスミドpBLcatと結合させ、次いでXho I消化に付し
た。次いで、結合したリンカーを伴うXho I消化プラス
ミドpBLcatDNAを結合させ、プラスミドpBΔLcatを得
た。この構築によりプラスミドpBLcat上のアデノウイル
ス後期プロモーターがリンカー配列で置き換えられた。
プラスミドpBΔLcatを制限酵素Xho Iで消化し、プラス
ミドｐΔTPLの〜2.62kb Xho I制限断片と結合させ、TPL
をコードする断片が、CAT遺伝子の発現のためにBKエン
ハンサー、アデノウイルス主後期プロモーター、および
TPLが一直線上に正しく位置するように配されたプラス
ミドpBΔＬ−TPLを得た。
次いで、これらの断片、（１）dhfr遺伝子をコードす
る、プラスミドpLPChdlのAat II−Bcl I制限断片、
（２）プロテインＣをコードする、プラスミドpLPChdl
のBcl I制限断片、（３）TPLをコードする、プラスミド
pBΔＬ−TPLのPvu II−Bcl I制限断片、および（４）BK
エンハンサー−Ad2MLP−コードするプラスミドpBal8cat
のPvu II−Aat II制限断片を結合させてプラスミドp2−
５を構築した。このように、プラスミドp2−５は選択可
能かつ増幅可能なマーカーとしてのdhfr遺伝子およびヒ
トプロテインＣを発現させる正しい位置にBKエンハンサ
ー、Ad2MLP、およびAd2TPLを含有している。
プラスミドp4−14はプラスミドp2−５と類似するが、
pBal8TPLと称する中間体プラスミドを経て構築される。
プラスミドpBal8TPLは、上記パラグラフに記載のプラス
ミドp2−５の構築に基いた断片１、３および４を結合さ
せて構築された。次いで、プラスミドpBal8TPLを制限酵
素Xho Iで消化し、クレノウ酵素処理によりXho I末端を
平滑末端化した後、ヒトプロテインＣをコードする、ク
レノウ処理したプラスミドpLPChdlのBcl I制限断片と結
合させ、プラスミドp4−14を得た。このように、プラテ
インＣをコードするDNAが、プラスミドp2−５ではプラ
スミドpBΔＬ−TPL由来のDNAのBcl I部位に挿入されて
いるのに対して、プラスミドp4−14ではプラスミドpBΔ
Ｌ−TPL由来の断片のXho I部位に挿入されているという
点においてのみこれらはは相異する。
プラスミドp4−14およびp2−５はヒトプロテインＣを
高レベルに発現させる。AV12細胞においては、プラスミ
ドp4−14およびp2−５を200−500nmのメトトレキセート
を用いて直接、選択することができる。AV12/p4−14形
質転換体は、増幅前に、AV12/pLPCdhfr形質転換体より
も５−６倍高くヒトプロテインＣを発現する。メトトレ
キセートによる増幅によってさらに細胞のヒトプロテイ
ンＣ産生量は増加する。このように、プラスミドp4−14
およびp2−５はアデノウイルスのBal8プロモーターとTP
Lとを用いてより高レベルの発現を達成したことを例示
するものである。
E1A遺伝子産物の存在下でのより高度の発現は、以下
のようにしてプラスミドp4−14またはp2−５にポリ−GT
要素を挿入することにより達成し得る。ポリ−GT要素
を、プラスミドp4−14のプロテインＣ暗号配列の３′末
端における唯一のBcl I部位（Bcl I部位はBamH I部位と
一致）に挿入し、プラスミドp4−14（GT）を得る。プラ
スミドp2−５のTPLとプロテインＣ暗号配列との連結部
位にある唯一のXho I部位にポリ−GT要素を挿入してプ
ラスミドp2−５（GT）を得る。
実施例25 数個のポリ−GT発現ベクターによる真核性宿
主細胞トランスフェクタントにおける組換え遺伝子発現
レベルの測定 本発明にポリ−GT含有発現ベクターで様々な真核性宿
主細胞をトランスフェクションした。これらのトランス
フェクタントの幾つかについて、これらの組換えポリ−
GT含有発現ベクターにコードされている構造遺伝子の発
現レベルを測定し、ポリ−GT要素を含有しない対応する
発現ベクターからの発現レベルと比較した。数回の実験
で、３種の異なるセルラインを、実質上、実施例21記載
の方法に従い、プラスミドpLPcat、pLP（GT）cat、pBLc
at、pBL（GT）cat、pBal8cat、およびpBal8cat（GT6）
でトランスフェクションした。上に列挙したプラスミド
はそれぞれ、クロラムフェニコール・アセチルトランス
フェラーゼ（CAT）の遺伝子−暗号配列を含有してい
る。CAT活性の相対レベルはゴーマンら（Gorman,1982,M
ol.Cell.Biol.,2:10441051）記載の方法で測定された。
１−５回の別々の実験で得た結果の平均値として、各プ
ラスミドによるCAT活性レベルを下記第２表に示す。実
験間での相対的CAT活性の変化は10〜15％にすぎなかっ
た。
プラスミドpLP（GT）catはポリGT要素含有、エンハン
サー不含、Ad2後期ポリモーター含有の例示発現ベクタ
ーであり、他方、プラスミドpBL（GT）catはポリGT要
素、BKエンハンサーおよびAd2後期プロモーター含有の
例示発現ベクターである。プラスミドpBal8cat（GT6）
はCAT遺伝子の３′側にポリGT要素と一緒に修飾された
エンハンサー−プロモーター領域を含有することを除
き、プラスミドpBL（GT）catと同様である。ポリGT要素
の効果を調べるために、第２表に記載のプラスミド発現
ベクターを用いて様々なセルラインをトランスフェクシ
ョンし、上記のごとくCAT活性を測定した。第２表はMK2
セルライン中ではポリGT要素がAd2後期プロモーターと
一緒に刺激作用またはエンハンサー様作用を有していな
いことを示しており、プラスミドpLPcatおよびpLP（G
T）からのCAT産生量はほぼ同じであった。しかしなが
ら、E1Aの存在下での、293（E1A+）セルライン中のプラ
スミドpLPcatおよびpLP（GT）catによる結果から分かる
ように、ポリGT要素を含有するpPL（GT）catではプラス
ミドpLPcatに比較して、CAT活性の４倍増が観察され
た。これはポリGT要素に対するE1Aのトランス−活性化
を示すものである。
プラスミドpBL（GT）catおよびpBLcatを用いて293細
胞をトランスフェクションした場合にも、ポリGT要素に
対するE1Aのトランス活性化が示された。プラスミドpBL
catに比較して、プラスミドpBL（GT）catではCAT活性が
約４倍増大していた。プラスミドpBL（GT）catはE1Aの
存在下、ポリGT要素とBKエンハンサーとの結合エンハン
サー活性により、プラスミドpLPcatの200倍以上の活性
を示した。MK2セルラインおよびＴ抗原産生COS−１セル
ラインを用いると、プラスミドpBL（GT）catおよびpBLc
atからの発現レベルはほぼ同一であり、ここでもポリGT
要素のトランス活性化にはE1Aが必要であることが示さ
れ、さらに、ポリGT要素がＴ抗原によってはトランス活
性化されないことが示された。
最高レベルの発現はプラスミドpBal8cat（GT6）によ
って達成され、それはプラスミドpLPcatによるCATレベ
ルに対して、相対的に1000倍近い増大を示した。プラス
ミドpBal8cat（GT6）は本発明の改善された発現ベクタ
ーを例示するものであり、それはE1Aで活性化されたポ
リGT要素と改良されたBKエンハンサー−プロモーター領
域とを含有している。
【図面の簡単な説明】
第１図は、BKウイルスの制限部位および機能地図を示す
模式図であり、 第２図は、プラスミドpBKneo1の制限部位および機能地
図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドpSV2catの制限部位および機能地
図を示す模式図であり、 第４図は、プラスミドpLP（GT）catの制限部位および機
能地図を示す模式図図であり、 第５図は、プラスミドpBL（GT）catの制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第６図は、プラスミドpSBL（GT）catの制限部位および
機能地図を示す模式図であり 第７図は、プラスミドpL133の構築を示す工程図であ
り、 第８図は、プラスミドpLPC（GT）の制限部位および機能
地図を示す模式図であり、 第９図は、プラスミドpLPC4（GT）の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第10図は、プラスミドpSV2hygの制限部位および機能地
図を示す模式図であり、 第11図は、プラスミドpLPChyg1（GT）の制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第12図は、プラスミドpBW32の構築を示す工程図であ
り、 第13図は、プラスミドpLPChd1（GT）の制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第14図は、プラスミドphd（GT）の制限部位および機能
地図を示す模式図であり、 第15図は、プラスミドpLPCE1A（GT）の制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第16図は、プラスミドpBLT（GT）の制限部位および機能
地図を示す模式図であり、 第17図は、プラスミドpBLThyg1（GT）の制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第18図は、プラスミドpBLTdhfr1（GT）の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第19図は、プラスミドpTPA603の制限部位および機能地
図を示す模式図であり、 第20図は、プラスミドphd（GT）TPAの制限部位および機
能地図を示す模式図であり、 第21図は、プラスミドphd（GT）MTPAの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第22図は、プラスミドpBal8cat（GT6）の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第23図は、プラスミドpSV2E1Aの制限部位および機能地
図を示す模式図であり、 第24図は、プラスミドpT6hd（GT）の制限部位および機
能地図を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−12296（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/85 - 15/86 C12P 21/00 - 21/02 C12N 5/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (25)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】真核性プロモーター、該プロモーターを刺
    激するように設置されたポリ−GT要素、および該プロモ
    ーターから発現されるように設置された有用な物質をコ
    ードしているDNA配列を含有する組換えDNAベクターで真
    核宿主細胞を形質転換し、該ベクター含有細胞を該有用
    物質の発現に適した条件下で培養することにより、真核
    宿主細胞において有用な物質を産生させる改良方法であ
    って、 （ａ）アデノウイルスE1Aタンパク質の発現をコードし
    ているDNA配列を細胞に付与し、そして （ｂ）工程（ａ）の細胞を該遺伝子産物の発現および該
    ポリ−GT要素活性の刺激に適した条件下で培養するこ
    と、 からなる方法。
  2. 【請求項２】大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物が
    アデノウイルスE1Aタンパク質である請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】有用な物質がヒトプロテインＣである請求
    項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】工程（ｂ）で培養される真核宿主細胞がア
    デノウイルス形質転換された宿主細胞である請求項１〜
    ３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】真核宿主細胞が293またはAV12細胞である
    請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】真核性プロモーターがSV40初期プロモータ
    ー、SV40後期プロモーター、BK初期プロモーター、BK後
    期プロモーター、ポリオーマウイルス初期プロモータ
    ー、パポバウイルス初期プロモーター、ポリオーマウイ
    ルス後期プロモーター、パポバウイルス後期プロモータ
    ー、ヘルペスウイルスプロモーター、インターフェロン
    a1プロモーター、マウスメタロチオネインプロモータ
    ー、レトロウイルスプロモーター、β−グロビンプロモ
    ーター、ポックスウイルスプロモーター、アデノウイル
    スプロモーター、アデノウイルス−２後期プロモータ
    ー、ウニH2Aプロモーター、コンアルブミンプロモータ
    ー、卵アルブミンプロモーター、マウスβ−グロビンプ
    ロモーター、ヒトβ−グロビンプロモーター、およびラ
    ウス肉腫ウイルス長末端繰返しプロモーターである請求
    項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】下記の機能地図で表されるプラスミドpLP
    （GT）cat、_pSBL（GT）cat、pLPC（GT）、pLPC4（G
    T）、_pLPChyg1（GT）、_pLPChd1（GT）、_pBLT（G
    T）、pBLTyg1（GT）、_pBLTdhfr1（GT）、_phdTPA（G
    T）、phdMTPA（GT）、pBal8cat（GT6）、_pT6hd（G
    T）、pLPCE1A（GT）。
  8. 【請求項８】アデノウイルスE1Aタンパク質の存在下で
    アデノウイルス−２後期プロモーターからの転写を刺激
    するように設置されているポリ−GT要素を含有するプラ
    スミド。
  9. 【請求項９】アデノウイルス−２後期プロモーターから
    の転写を刺激するように設置されているBKエンハンサー
    をさらに含有する請求項８記載のプラスミド。
  10. 【請求項１０】下記の機能地図で表されるプラスミドph
    d（GT）。
  11. 【請求項１１】大きいDNAウイルスの即時型遺伝子産物
    の存在下で、アデノウイルス−２後期プロモーターから
    の、タンパク質をコードしているDNA配列の転写を刺激
    するように設置されているポリ−GT要素を含有する請求
    項10記載のプラスミド。
  12. 【請求項１２】タンパク質がクロラムフェニコールアセ
    チルトランスフェローゼである請求項11記載のプラスミ
    ド。
  13. 【請求項１３】下記の機能地図で表されるpLP（GT）cat
    である請求項12記載のプラスミド。
  14. 【請求項１４】アデノウイルス−２後期プロモーターか
    らの転写を刺激するように設置されているBKエンハンサ
    ーをさらに含有する請求項12記載のプラスミド。
  15. 【請求項１５】下記の機能地図で表されるプラスミドpB
    L（GT）catである請求項14記載のプラスミド。
  16. 【請求項１６】タンパク質がヒトプロテインＣである請
    求項11記載のプラスミド。
  17. 【請求項１７】タンパク質が組織プラスミノーゲン活性
    化因子である請求項11記載のプラスミド。
  18. 【請求項１８】下記の機能地図で表されるプラスミドph
    dTPA（GT）。
  19. 【請求項１９】タンパク質が修飾型の組織プラスミノー
    ゲン活性化因子である請求項11記載のプラスミド。
  20. 【請求項２０】下記の機能地図で表されるプラスミドph
    dMTPA（GT）またはpT6hd（GT）。
  21. 【請求項２１】タンパク質がα−インターフェロン、β
    −インターフェロン、またはγ−インターフェロンであ
    る請求項11記載のプラスミド。
  22. 【請求項２２】アデノウイルス−２後期プロモーターと
    タンパク質をコードしているDNA配列の間に、アデノウ
    イルスの３部構成のリーダーをコードしているDNAをさ
    らに含有している請求項11記載のプラスミド。
  23. 【請求項２３】請求項７〜22のいずれかに記載のプラス
    ミドで形質転換した真核宿主細胞。
  24. 【請求項２４】293またはAV12細胞である請求項23記載
    の真核宿主細胞。
  25. 【請求項２５】293/pLPC（GT）、293/pLPC4（GT）、293
    /pLPChyg1（GT）、_293/pLChd1（GT）、_293/pT6hd（G
    T）、AV12/pLPC（GT）、AV12/pLPC4（GT）、AV12/pLPCh
    yg1（GT）、_AV12/pLPChd1（GT）、_AV12/pT6hd（GT）
    である請求項24記載の真核宿主細胞。
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