JPH02171198A - 真核性発現の改良 - Google Patents

真核性発現の改良

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JPH02171198A
JPH02171198A JP1262833A JP26283389A JPH02171198A JP H02171198 A JPH02171198 A JP H02171198A JP 1262833 A JP1262833 A JP 1262833A JP 26283389 A JP26283389 A JP 26283389A JP H02171198 A JPH02171198 A JP H02171198A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物の
存在下でポリーＧＴ要素を用いて真核宿主細胞における
組換え遺伝子の転写を増強させる方法に関する。本明細
書に例示したボ！Ｊ−ＧＴ要素は化学的に合成される（
原型のボ１，１−ＧＴ要素を後記実施例１に示した）。
発現ベクターに挿入されたとき、原型（プロトタイプ）
のポリーＧＴ要素は２１個の繰返しＧＴｔ１位を含有し
ている。しかし、化学的に合成した配列またはヒトゲノ
ム配列を含む、長さの異なる繰返し単位を含む多種多様
のポリーＧＴ要素が、本発明で用いるのに適しているこ
とは当業者の認めるところであろう。本発明ニおいてエ
ンハン司′−要素をポリーＧＴ要素七ともに用いて転写
をさらに増強することもできる。
ある種の構築物においてはポリーＧＴ配列はＢＫエンハ
ンサ−結合している。ＩＮＫエンハンサーハ繰返し配列
からなる明確にされているＤ　Ｎ　Ａセグメントである
（原型のＢＫエンハンサ−および変異型のＢＫエンハン
サ−を後記実施例１８に示した）。しかし、多種多様の
ＢＫエンハンサ−変異体（すべてが、異なった繰返し配
列からなる訳ではない）が当分野で知られており、ポリ
ーＧＴ要素とともに本発明で用いるのに適している。
［従来の技術１ 交互の配列ポ’Ｊ　（ｄＴ　−ｄＧ　）　、ポリ（、Ｉ
Ｃ−ｄＡ　）ハ真核性ゲノム中で繰返し性の高い配列で
あり、左回転またはＺ　−Ｄ　Ｎ　Ａを形成することが
できる［ハマグおおよびカクナガ（Ｈａｍａｄａ　ａｎ
ｄ　Ｋａｋｕｎａｇａ、　　１９ｇ２．　Ｎａｔｕｒｅ
　２９８　：　３９６−３９８）　；　””、ダら（ｌ
ｌａｍａｄａ）。
１９ｇ２．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
υＳＡ　７９　：　６４６５−６４６９］。
例えば、ヒトゲノムは、約１ｏｏ、ｏｏｏコピーのラン
ダムに９市しているポリ（ｄＴ−ｄＧ）・ポリＣｄＣ−
ｄΔ）の２０〜６０塩基対（ｂｐ）区域を含有している
［ハマダら（Ｉｌａｍａｄａ、　１９８４＋　Ｍｏ１．
　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。
４　：　２６１０−２６２１＞］。ハマダら［Ｈａｍａ
ｄａ、　１９８４．　Ｍｏｌ。
Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　４　：　２６２２−２６３０コ
は、ポリ（ｄＴ−ｄＧ）−ボ’７（ｄＣ−ｄＡ）がＳＶ
４０初期ブＩ：ｌモーター１：、およびクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の暗号配
列に結合しているときには、ボ’Ｊ（ｄＴ−ｄＧ）−ボ
！／（ｄＣ−ｄＡ）それ自体ｈ＜ｃＡＴ発現のエンハン
サ−として作用しうろことを明らかにした。ハマダら（
上記）によると、ＳＶ４０初期プロモーターと共にある
ポリ（ｄＴ−ｄＧ）・ポリＣｄＣ−ｄＡ）のエンハンサ
−様の活性はＳＶ４０初期プロモーターと共にある５Ｖ
４Ｑエンハンサ−の活性に比べかなり弱いものであり、
そして多りのウィルスエンハンサ−とは異なり、このポ
！Ｊ（ｄＴ−ｄＧ）　・ポ！ｊ（ｄＣ−ｄＡ）はサル（
ＣＶ−１）またはヒト（ＨｅＬａ）において等しく活性
であった。
本明細書に例示したＢＫエンハンサ−配列は、免疫抑制
されている患者の尿から初めて単離されたヒトパボバウ
ィルス、ＢＫウィルスから得られる。ＢＫウィルスは明
確ではない幼時感染の原因ではないかと疑われており、
ヒトのいる所にＷ遍的に存在している。ＢＫウィルスは
ヒト細胞中で最もよく増殖するが、このウィルスは多数
の非；長類細胞中で不稔サイクルを経、インビトロで誓
歯類細胞を形質転換し、ハムスターにおいてｐａ瘍を誘
導する。ＢＫウィルスは５Ｖ４Ｑに極めて似ているが、
これら２ｇ！類のパポバウイルス　ＳＶ４０およびＢＫ
のエンハンサ−配列はそのヌクレオチド配列が実質的に
異なっている。ＢＫウィルス（〜５．２ｋｂ）の完全な
ヌクレオチド配列は、セイフら（Ｓｅｉｆ　ｅｔ　ａｌ
、、　１９７９．　Ｃｅ１ｌ　１８　：　９６３）、並
びに、ヤングおよびウー（Ｙａｎｇ　ａｎｄ　Ｎｕ、　
　１９７９．５ｃｉｅｎｃｅ　２０６　：　４５６）が
開示している。原型のＢＫウィルスは、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション［Ａ　Ｔ　ＣＣ；　Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ
、、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ２０８５２−１７７
６］から、取得番号ＡＴＣＣＶＲ−８３７のもとて入手
できる。原型ＢＫウィルス制限部位および機能地図を添
付の第１図に示す。
エンハンサ−要素は、エンハンサ−要素の位ｔおよび配
向に比較的依存することなく、そのプロモーターからの
隣接遺伝子の転写レベルを増加させるシス作用性の要素
である。事実、コウリーおよびグラス［Ｋｈｏｕｒｙ　
ａｎｄ　Ｇｒｕｓｓ、　ｆ９８３．　Ｃｅ１ｌ　３３：
３１３］は、「真核性遺伝子の上流、その内部、または
下流で機能するエンハンサ−配列の顕著な能力はそれを
古典的なプロモーター要素と区別するものである・・・
Ｊと述べ、ある種の実験結果が「エンハンサ−はかなり
の距Ｗｉ（おそら（、＞　ｌ　Ｏｋｂ）を越えて作用す
ることができる」ことを示すと示唆している。
［発明か解決しようとする課題］ 本発明は新規エンハンサ−系を教示するものである。こ
れは、ポリーＧＴ要素が、アデノウィルス後期プロモー
ターなどのある種のプロモーターと組合わせて設置され
たときには、Ｅ１Ａ遺伝子産物などのトランス作用性の
初期ウィルス遺伝子産物の存在下でだけエンハンサ−と
して機能するからである。ＢＫエンハンサ−などの他の
エンハンサ−要素を、本発明においてポリーＧＴ要素と
ともに用いてもよい。特に本発明は、シス−作用性のポ
リーＧＴ要素と大きいＤＮＡウィルスのトランス−作用
性の即時型遺伝子産物が組合わさって存在するときにだ
け予想外に転写を増加させることになる、アデノウィル
ス後期プロモーターのためのエンハンサ−系を教示する
ものである。即ち、ポリーＧＴ要素からのエンハンサ−
活性を活性化するためにウィルス性のトランス−作用性
のタンパク質が必要とされる。このことは、ｓ■４０初
期プロモーターを用いてポリーＧＴ配列か単独でＣへＴ
遺伝子産物の発現を増強することができるハマダら（上
記）のエンハンサ−系とは極めて対照的である。本発明
においては、別のエンハンサ−要素をポリーＧＴ要素お
よびトランス−作用性ウィルス遺伝子産物とともに用い
て、転写、即ち有用な遺伝子産物の発現をさらに増強す
ることができる。
ＢＫエンハンサ−をポリーＧＴ要素とともに用いるとき
には、有用な物質をコードしているＤＮＡ配列を転写さ
せるためにＢＫエンハンサ−と直列で用いられる真核性
プロモーターのｒＣＣＡ　ＡＴ」領域の５′画のすぐ上
流にＢＫエンハンサ−を設置すると、さらに高い転写の
増加が得られる。
このＣＣＡＡＴ領域あるいは「すぐ−上流の領域」ある
いは「−８０相同配列」は、転写活性のだめの配列が詳
しく調べられているプロモーターで観察されるヌクレオ
チド保存領域であるシス−作用性の上流要素である。Ｃ
ＣＡＡＴ領域は、すべてではないが多数のプロモーター
で見い出されている。
他のプロモーターにおいて、等価なシス−作用性上流配
列が見い出されており、これらにはＳＰｌ結合部位、Ａ
ＴＦ結合部位、オクタ配列、核因子ｌ結合部位（ＣＣＡ
　Ａ　Ｔ転写因子と同じ結合部位であることもある）、
ＡＰＩおよびＡＰ２相同、グルココルチコイド応答要素
、および熱ンヨック応答要素が含まれる。最近になって
、上に挙げた配列を含む現在既知の上流配列を包括的に
編纂したものが公表された［ウインゲングー（Ｗｉｎｇ
ｅｎｄｅｒ。
１９８ｇ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６：
　１８７９−１９１２）］。アデノウィルス主後期プロ
モーターで等価なＣＣＡＡＴ領域は、上流転写因子（Ｕ
　Ｔ　ｌ；”）または玉後期転写因子（Ｍ　Ｌ　Ｔ　Ｆ
　）結合部位である（ＣＡＰ部位の一ト流のおよそのヌ
クレオチド−５０〜−６５）。
ＣＣＡＡＴ配列は転写効率を媒介し、ごく僅かの例外を
除いてプロモーターの長さを短くすることなく削除する
ことかできない。
エンハンサ−要素は、ネズミボリオーマウイルス、パピ
ローマウィルス、アデノウィルス、レトロウィルス、肝
炎ウィルス、サイトメガロウィルス、ヘルペスウィルス
、バポバウイルス’ｆｆ、例、ｔばＳＶ４０およびＢに
を含む多数のウィルスのＤＮＡ中で、および多数の非ウ
ィルス性遺伝子、例えば免疫グロブリン遺伝子のイント
ロン中で同定されている。エンハンサ−要素は多種多様
の他の生物のＤＮＡ中に存在することもある。エンハン
サ−要素は別の宿主細胞中では異なって機能することが
多く、この細胞特異性は遺伝子の発現中にエンハンサ−
要素と相互作用する宿主遺伝子産物の差異によるものと
することができる。
エンハンサ−要素の活性は、宿主細胞に存在するウィル
ス性の遺伝子産物によって影響される。
ベルチヒおよびシッフ［Ｖｅｌｃｉｃｈ　ａｎｄ　Ｚｉ
ｆＬ　　１９８３Ｃｅｌｌ　４０　ニア０５］　：ボレ
リら［Ｂｏｒｒｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４゜
Ｎａｔｕｒｅ　３１２　：　６０ｇ］　：およびヘンら
［Ｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　１９８５、５ｃｉｅｎｃ
ｅ　２３０　：　１３９１］は、アデノウイルス−２初
期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）遺（云子産物が５Ｖ４Ｑ、ポリオ
ーマウィルス、マウス免疫グロブリン遺伝子およびアデ
ノウイルス−２Ｅ１Ａエンハンサ−によって誘導される
転写の活性を抑制すると記している。このＥ１Ａによる
作用は宿主細胞依存性である。従って、エンハンサ−を
利用して組換え遺伝子の転写を増加させる真核性発現ベ
クターは、Ｅ１Ａ含有宿主細胞においてエンハンサ−を
含まないベクターよりも良好に作動するとは予測されな
かった。エンハンサ−を用いる上記の従来法とは著しく
対照的に、欧州特許公開ＥＰＡＯ２４５９４９（出願Ｎ
　ｏ、　８７３０３（１８３，７；　１９ｇ７年１１月
１９日公開）はＢＫウィルスエンハンサ−要素を用いる
方法を教示しているが、この方法はＥ１Ａ遺伝子産物ま
たは大きいＤ　Ｎ　Ａウィルスの同様の即時型遺伝子産
物を用いて遺伝子発現を最大にすることからなる。
即ち、欧州特許公開ＥＰ　Ａ　Ｏ２４５９４９は、ＤＮ
Ａの転写を促進するＢＫエンハンサ−の能力があらゆる
アゾ７ウイルスのＥ１Ａ遺ｆｚ＝子産物存在下で増強さ
れることを初めて示すものである。
［課題を解決するための手段］ ここに、ポリーＧＴ要素をＢＫエンハンサ−とともに用
いてあらゆるアゾンウィルスのＥ１Ａ遺伝子産物の存在
下でＤＮＡの転写をさらに増強することができることを
予想外に見い出した。アゾンウイルス後期プロモーター
を用いて転写させると、驚くべきことに、ポリーＧＴ要
素はそれ自体は転写を増強はしないが、Ｅ１Ａ遺伝子産
物または大きいＤＮＡウィルスの同様の即時型遺伝子産
物の（ｊ在下でだけ活性化され、エンハンサ−活性を示
す。Ｅ１Ａ遺伝子産物は、試験されたほとんどのエンハ
ンサ−による転写の活性化を抑制することがわかってい
たので、Ｅ１ＡがポリーＧＴ要素のエンハンサ−様活性
を活性化する能力を有していることは予想外のことであ
った。Ｃ１Ａ遺伝子産物（実際にはＥ１Ａ遺伝子は２種
類の産物を産生ずるが、本明細書ではこれらを一括して
「Ｅ１Ａ遺伝子産物」と呼ぶ）は、大きいＤＮＡウィル
スであるアデノウィルス由来のこのような即時型遺伝子
産物の１つである。本発明は、大きいＤＮＡウィルスの
あらゆる即時型遺伝子産物またはＥ１Ａ遺伝子産物と同
様に機能するあらゆるレトロウィルス性タンパク質産物
を用いて、ＢＫエンハンサ−などの別のエンハンサ−要
素なしで、またはそれとともにポリーＧＴ要素の活性を
増強することを包含している。単純疱疹ウィルスＩＣＰ
４タンパク質［デル力ら（ＤｅＬｕｃａ　ｅｔ　ａｔ、
、　　１９８５．　Ｍｏｌ。
Ｃｅｌ　ｌ　Ｂｉｏｌ、　５　：　ｌ　９９７−２００
８）が記載Ｊ１仮性狂犬病ウィルスＩＥタンパク質［フ
ェルドマンラ（Ｆｅｌｄｍａｎｅｔ　ａｌ、、　１９８
２．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ　７９　：　４９５２−４９５６）が記載］、サイ
トメガロウィルス［Ｅタンパク質［テベチアら（Ｔｅｖ
ｅｔｈｉａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ　１６１　：　２７６−２８５）が記載］、およ
びアデノウィルスのＥ１Ｂタンパク質がすべて、Ｅ１Ａ
タンパク質と同様の機能を有する大きいＤＮＡウィルス
の即時型遺伝子産物である。従って、本発明の方法は、
ＥｌΔタンパク質の存在下または非存在下で、ＩＣＰ４
、ＩＥもしくはＥ１Ｂタンパク質、または同様に作用す
る他のあらゆる即時型遺伝子産物を用いて、ポリーＧＴ
要素由来のエンノ＼ンサー様活性を生み出すか、または
活性化することを含んでいる。さらに、ＨＩＶウィルス
のＴＡＴ遺伝子産物またはその池のレトロウィルス性９
７バク質などの他のトランス−作用性ウィルスタンパク
質もポリーＧＴ要素を活性化する方法において有用であ
る。
本発明は、転写を増加させる目的で、即ち真核宿主細胞
中で組換え遺伝子の発現を改善する目的で、大きいＤＮ
Ａウィルスの即時型遺伝子産物、例えばアデノウィルス
のＥ１Ａ遺伝子産物、または同様に機能するウィルス性
遺伝子産物の存在下にポリーＧＴ要素を用いる方法に関
する。本発明の別の重要な態様は、大きいＤＮＡウィル
スの即時型遺伝子産物、例えばアデノウィルスのＥ１Ａ
遺伝子産物の存在下で、ポリーＧＴ要素を真核性プロモ
ーター、例えばアデノウィルス後期プロモーター（ＭＬ
Ｐ）とともに用いて、真核宿主細胞中で有用な産物を発
現させる多種の発現ベクターに関する。さらに、ＢＫエ
ンハンサ−などのエンハンサ−要素をポリーＧＴ要素と
ともに用いてそのような有用な産物の発現をさらに増強
することもできる。これらの発現ベクターの多くはポリ
ＧＴ−アデノウイルス後期プロモーターカセットを含有
しており、これを本発明方法で用いる他のベクターに容
易に移すことができる。このカセットはＢＫエンハンサ
−などのエンハンサ−要素をさらに含有していてもよい
。本発現ベクターが多用途であることは、これらのベク
ターによって成されるクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ、プロティンＣＳ組織プラスミ／−ゲ
ン活性化因子、修飾型組織プラスミノーゲン活性化因子
、あるいはインターフェロン（α、β、γインターフェ
ロン）などの多様なタンパク質の高レベルの発現によっ
て示される。
エンハンサ−要素が遠位から転写を増強することができ
ること、およびその活性がその配向に依存しないという
ことがエンハンサ−要素の特徴である。このことと合致
して、本発明のポリーＧＴ要素は、発現させようとする
構造遺伝子の５゛または３°に設置されていてよい。従
って、本発明の一部の組換えＤＮＡ発現ベクターの構築
においては、ポリーＧＴ要素は、組換えＤＮＡ発現ベク
ター上の組換え遺伝子を発現させるように設置されてい
るアデノウィルス後期プロモーターの上流に設置した。
また、このような構築の一部においては、ＢＫエンハン
サ−要素をポリー〇Ｔ要素の上流に設置した。本発明の
他の組換えＤＮＡ発現ベクターの構築においては、ポリ
ーＧＴ要素は発現させようとする構造遺伝子の３°末端
に設置し、他のエンハンサ−要素について記されている
ように、ポリーＧＴ要素は種々の位置および配向で機能
しうろことが示された。
本発明を実施すると、アデノウィルス形質転換した細胞
におけるヒトプロティンＣの発現が増強されることにな
る。このような細胞はヒトブロテインＣなどの完全にγ
−カルボキシル化されたタンパク質を産生させるための
特に好ましい宿主である。従って、本発明の別の態様は
γ−カルボキシル化されたタンパク質を製造するための
改良法からなる。本発明のさらに別の重要な態様は、（
ａ）近接の真核性プロモーターに関連させてＢＫエンハ
ンサ−を設置し、（ｂ）このような発現ベクター中にポ
リーＧＴ要素を設置し、そして（ｃ）大きいＤＮＡウィ
ルスの即時型遺伝子産物またはＥ１Ａ遺伝子産物と同様
に機能するあらゆるウィルス性遺伝子産物でポリーＧＴ
要素（およびＢＫエンハンサ−）を活性化することによ
って有用な遺伝子産物の発現を一層増加させる方法に関
する。第１段階では、ＢＫエンハンサ−をＭＬＴＦ結合
部位に極めて近接させて設置する酵素処理によってこれ
ら誘導体を構築した。これらの修飾されたＢＫエンハン
サー−アデノウィルス後期プロモーター配列を発現ベク
ターに導入し、次いでこれを用いて真核宿主細胞中で有
用な遺伝子産物を発現させると、このような設置を欠（
構築物と比較したとき、発現レベルの劇的な増加が観察
された。第２段階では、有用産物をコードしている遺伝
子の３゛末端にどちらかの配向でポリ〜ＧＴ要素を設置
することによりこれらの誘導体をさらに構築した。ポリ
ＧＴ要素を欠（構築物と比較すると、発現レベルの一層
の増加が観察された。即ち、本発明は、真核性プロモー
ターのＣＣＡＡＴ領域またはＣＣＡＡＴ領域等価域の５
゛末端のすぐ上流Ｏ〜約３００ヌクレオチド以内にＢＫ
エンハンサ−を設置して近接の真核性プロモーターに関
連しているＢＫエンハンサ−の活性を増強し、そしてそ
の位置および配向には無関係のポリーＧＴ要素をＣ１Ａ
遺伝子産物で活性化することによって、有用な遺伝子産
物の発現を一層増加させる方法を提供するものである。
本発明のさらに別の籾様は、アデノウィルスの３部構成
リーダー（ＴＰＬ）配列の一部が導入されたある種の発
現ベクター中にポリーＧＴ要素を導入することによって
、本明細書に記したベクターにコードされている組換え
産物の発現を増加させる試みから派生する。ＴＰＬ配列
がそのような発現ベクター中にポリーＧＴ要素とともに
導入され、アデノウィルスのＥ１Ａ遺伝子産物の存在下
でポリーＧＴ要素が活性化されると、発現が増強される
。アデノウィルスのＶＡ遺伝子産物の存在下では、ＴＰ
Ｌ含有ベクターでの一層の発現の増強が得られる。
本発明のために以下の語句を定義する。
抗生物質：天然に、または限定された化学的修飾の後に
、他の微生物または真核細胞の増殖を抑制するか、また
はこれらを死滅させる微生物によって産生される物質。
抗生物質耐性付与遺伝子二ある抗生物質に対する耐性を
付与する活性をコードしているＤＮＡセグメント。
ＡｐＲ：アンビシリン耐性の表現型またはそれを付与す
る遺伝子。
クローニング：組ｍ、ｔＤＮＡクローニングベクターに
ＤＮＡのセグメントを導入する過程。
ＣｍＲ：クロラムフエニコール耐性の表現型マたはそれ
を付与する遺伝子。
Ｅ１Ａ：ボリーＧＴ要素を活性化してエンハンサ−活性
を発現することができるアデノウィルスの即時型遺伝子
産物。
ｅｐ：Ｔ−抗原遺伝子のＳＶ４　Ｑ初期プロモータ、Ｔ
−抗原結合部位、および５Ｖ４Ｑの？Ｉ製起源を含有す
るＤＮＡセグメント。
真核性プロモーター：真核細胞中でプロモーターとして
機能するあらゆるＤＮＡ配列。
ＧＴエンハンサ−系：　ＭＬＰなとのプロモーターに関
連したあらゆるポリーＧＴ要素であって、ポリーＧＴ要
素がそれ自体はエンハンサ−活性を有してしないが、大
きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物、例えばＥ１Ａ
遺伝子産物によってエンハンサ−として活性化される要
素、または同様の活性化を行うあらゆるウィルス性遺伝
子産物によって活性化される要素。
ＨｍＲ：ハイグロマイシン耐性の表現型またはそれを付
与する遺伝子。
ＩＶＳ：イントロンをコードしているＤＮＡであり、介
在配列とも呼ばれる。
大きいＤＮＡウィルス：真核細胞に感染し、大きさが〜
１ｏｋｂ以上のゲノムを有するウィルス、即ち、あらゆ
るポックスウィルス類、アゾンウィルス類、およびヘル
ペスウィルス類。
ＭＬＰ：アデノウィルスの主後期プロモーターであり、
本明細書ではアデノウィルス後期プロモーター、アデノ
ウイルス−２型後期プロモーターあるいはＡｄ２後期プ
ロモーターと呼ぶこともある。
ＭＬＴＦ結合部位：主後期転写因子（ＭＬＴＦ）が結合
するアデノウィルスＤＮＡ中の部位：このＭＬＴＦはＭ
ＬＰ活性に必要とされる。
ＮｅｏＲ：ネオマイシン耐性を付与する遺伝子であり、
これを用いて真核宿主細胞にＧ４１８耐性を付与するこ
ともできる。
ｏｒｉ　ニプラスミドの複製起源。
ｐＡ：ポリアデニル化シグナルをコードしているＤＮＡ
配列。
ポリーＧＴ要素：本明細書においてｎが２１である配列
で示されている（Ｇ　Ｔ　）ｎ−（ＣＡ　）ｎのＤＮＡ
配列であるが、ｒｌが２１より大きいかまたは小さい長
さの異なる配列を指すこともある。また、化学的に合成
した（Ｇ　Ｔ　）ｎ　−（ＣＡ　）ｎ配列または（ＧＴ
）ｎ−（ＣＡ）ｎ部分を含むヒトゲノムＤＮＡフラグメ
ントを指すこともある。
プロモーター：　ＤＮＡをＲＮＡに転写させるＤＮＡ配
列。
組換えＤＮＡクローニングベクター：１またはそれ以上
の別のＤＮＡセグメントを付加したか、または付加する
ことができるＤＮＡ分子を含有するあらゆる自律的に複
製するか、または組込まれる媒体。
組換えＤＮＡ発現ベクター；有用な産物をコードしてい
るＤＮＡ配列を挿入して発現させることが可能な、プロ
モーターおよび関連の挿入部位を含有するあらゆる組換
えＤＮＡクローニングベクター 組換えＤＮＡベクター：あらゆる組換えＤＮＡクローニ
ングベクターまたは発現ベクターレプリコン：組換えＤ
ＮＡベクターの複製を支配しているあらゆるＤＮＡ配列
。
制限フラグメント；ｌまたはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成したあらゆる線状ＤＮＡ０ｒＲＮＡ：リポ
ソーム性リボ核酸。
感受性宿主細胞：ある抗生物質または他の毒性化合物の
存在下ではそれらに対する耐性を付与するＤＮＡセグメ
ントなしでは増殖することができない宿主細胞。
構造遺伝子二開始および停止コドンをコードしているＤ
ＮＡを含む、ポリペプチドをコードしているあらゆるＤ
ＮＡ配列。
ＴＡＴニドランス−作用性のウィルスタンパク質として
の活性を有するレトロウィルスＨＩＶの遺伝子産物。
ＴｃＲ：テトラサイクリン耐性の表現型またはそれを付
与する遺伝子。
形質転換体；形質転換を受けた受容宿主細胞。
形質転換・受容宿主細胞へのＤＮＡの導入。
ｔＲＮＡ：転移リボ核酸。
第１図は、ＢＫウィルスの制限部位および機能地図を示
す模式図であり、 第２図は、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、 第４図は、プラスミドｐＬ　Ｐ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔの
制限部位および機能地図を示す模式図であり、第５図は
、プラスミドｐＢ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第６図は、プラス
ミドｐＳ　Ｂ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ）ｃａｔの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、第７図は、プラスミドｐ
Ｌ　ｌ　３３の制限部位および機能地図を示し、その構
築を示す工程図であり、 第８図は、プラスミドｐｔ、ｐｃ（ｃＴ）の制限部位お
よび機能地図を示す模式図であり、第９図は、プラスミ
ドｐＬＰＣ４（ＧＴ）の制限部位および機能地図を示す
模式図であり、第１０図は、プラスミドｐＳＶ２ｈｙｇ
の制限部位および機能地図を示す模式図であり、 第１１図は、プラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ　ｌ　（Ｇ
　Ｔ）の制限部位および機能地図を示す模式図であり、
第１２図は、プラスミドｐＢＷ３２の制限部位および機
能地図を示し、その構築を示す工程図であり、 第１３図は、プラスミドｐＬＰｃｈｄ１（ＧＴ）の制限
部位および機能地図を示す模式図であり、第１４図は、
プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）の制限部位および機能地
図を示す模式図であり、 第１５図は、プラスミドｐＬＰＣＥ　１Ａ（ＧＴ）の制
限部位および機能地図を示す模式図であり、第１６図は
、プラスミドｐＢＬＴ（ＧＴ）の制限部位および機能地
図を示す模式図であり、第１７図は、プラスミドｐＢＬ
Ｔｈｙｇ１（ＧＴ）の制限部位および機能地図を示す模
式図であり、第１８図は、プラスミドｐＢＬＴｄｈｆｒ
１（ＧＴ）の制限部位および機能地図を示す模式図であ
り、第１９図は、プラスミドｐＴＰＡ６０３の制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第２０図は、プラ
スミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）Ｔ　Ｐ　Ａの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、第２１図は、プラスミド
ｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）Ｍ　Ｔ　Ｐ　Ａの制限部位および機
能地図を示す模式図であり、第２２図は、プラスミドｐ
Ｂ　ａｌ　８　ｃａｔ（Ｇ　Ｔ　６　）の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、第２３図は、プラスミ
ドｐｓＶ２Ｅ１Ａの制限部位および機能地図を示す模式
図であり、第２４図は、プラスミドｐＴ　６　ｈｄ（Ｇ
　Ｔ　）の制限部位および機能地図を示す模式図である
。
これらの図面は本発明の理解を助けるためのものである
。図は記載したプラスミドをほぼ正確に縮尺して描いて
いる。明示されている制限部位以外の制限部位かプラス
ミドに存在していることもある。
（以下、余白） 本発明は、真核性プロモーター、該プロモーターを刺激
するように設置されたポリーＧＴ要素、および該プロモ
ーターから発現されるように設置された有用な物質をコ
ードしているＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡベクタ
ーで真核宿主細胞を形質転換し、該ベクター含有細胞を
該有用物質の発現に適した条件下で培養することにより
、真核宿主細胞において有用な物質を産生させる改良方
法であって、改良が （ａ）大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物の発現
をコードしているＤＮＡ配列を細胞に付与し、そして （ｂ）工程（ａ）の細胞を該即時型遺伝子産物の発現お
よび該ポ’Ｊ−ＧＴ要素活性の刺激に適した条件下で培
養すること、 からなる方法に関する。当業者なら、多数の樹立セルラ
インが大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物を発現
すること、およびそのようなセルラインが本発明方法に
おいて特に有用であることを認識している。従って、本
発明は、真核性プロモーター、該プロモーターを刺激す
るように設置されたポリ−Ｇ　Ｔ　５素、および該プロ
モーターから発現されるように設置された有用な物質を
コードしているＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡベク
ターで真核宿主細胞を形質転換し、該ベクター含有細胞
を該有用物質の発現に適し、た条件下で培養することに
より、真核宿主細胞において有用な物質を産生させる改
良方法であって、改良か（ａ）大きいＤＮＡウィルスの
即時型遺伝子産物を発現する真核宿主細胞に該ベクター
を挿入し、そして （ｂ）工程（ａ）の細胞を該即時型遺伝子産物の発現お
よび該ポリーＧＴ要素活性の刺激に適した条件下で培養
すること、 からなる方法をも包含するものである。
本発明の重要な態様は、アデノウイルス−２後期プロモ
ーターとともにポリーＧＴ要素を含有する新規な一群の
発現ベクターである。この本発明の発現ベクターは、他
のベクター中の、Ｅ１Ａ遺伝子産物によるポリーＧＴ要
素の活性化によって発現を増強するための適切な位置に
、有用な産物をコードしているＤＮＡ分子を容易に挿入
するか、または挿入しつるようにして構築した。さらに
、「カセット」が得られるようにポリーＧＴ要素と真核
性プロモーターを組み立てた。このカセットは、発現ベ
クターから比較的小さい制限フラグメントとして単離す
ることができ、多種の発現ベクター間を容易に往復させ
ることができる。このカセットはポリ〜ＧＴ要素に加え
てエンハンサ−要素、例えばＢＫエンハンサ−などを含
んでいてもよい。
本明細書中に具体的に例示した発現ベクターは、本発明
方法においてＥ１Ａ遺伝子産物の存在下で転写を行わせ
る、ポリＧＴ−ＢＫエンハンサーー真核性プロモーター
カセットにおいてアデノウイルス−２後期プロモーター
を利用している。
ポリーＧＴ要素の構築に用いる１本鎖のＤＮＡフラグメ
ントは、ＤＮＡシンセサイザーを用いて化学的に合成し
た。多数のＤＮＡ合成装置が当分野で知られており、１
本鎖のフラグメントの合成に用いることができる。次い
で、この１本鎖フラグメントをアニーリングしてポリー
ＧＴ要素を得る。ポリーＧＴ要素は（ＧＴ）ｎ　　（Ｃ
Ａ）ｎのＤＮＡ配列であり、これを本明細書ではｎが２
１である配列として例示しているが、ｎが２１よりも大
きいかまたは小さい長さの異なる配列をも指している。
このような配列を化学的に合成してもよいし、また、ヒ
トゲノムのＤＮＡフラグメントであってもよい。原型（
プロトタイプ）のポリーＧＴ要素の配列を実施例１に示
した。この示されているポリＧＴ要素はＢａｍＨＩおよ
びＸｂｏ１部位を有しており、従って種々の発現ベクタ
ーのＢａｍＨＩまたはＸｈｏ１部位に都合よく挿入する
ことができる。
合成のポリーＧＴ要素が、このポリー〇Ｔ要素をあらゆ
る発現ベクター中に容易に挿入することが可能なように
するため、ＢａｍＨＩまたはＸｈｏＴ以外の制限酵素認
識部位用の配列を含んでいてもよいことは当業者の認め
るところであろう。別法によれば、ポリーＧＴ要素にお
いて利用可能な制限酵素認識部位とは関係なく、このポ
リーＧＴ要素をあらゆる適当な発現ベクター中に平滑末
端ライゲート（連結）によって挿入することもできる。
ＢＫウィルスは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ＡＴＣＣＸ＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　　！２３０
１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ、　ＭＤ　２０８５２）から取得番号ＡＴＣＣＶＲ
−８３７のもとでだれでも入手することができるし、購
入することもでき、実施例２記載のようにして、ＢＫウ
ィルス配列の供給源、特にＢＫエンハンサ−の供給源と
して用いるために、容易かつ大量に単離することができ
る。また、ＢＫウィルス性ＤＮＡをプラスミドクローニ
ングベクターにクローンするのに、およびこの組換えベ
クターをＢＫウィルス性ＤＮＡ配列の供給源として用い
るのにも都合がよい。従って、ＢＫウィルスゲノムをプ
ラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏの一部と合体させて
プラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２を構築
した。
プラスミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ−ＭＭＴｎｅｏ　（大きさが
約１５ｋｂであり、ＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ３７
２２４のもとて入手可能）は、プラスミドｐＢ　Ｒ３２
２由来のレプリコンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子、ネ
オマイシン耐性付与酵素をコードしている構造遺伝子を
発現させるように設置されているマウスメタロチオネイ
ンプロモーター、約８ｋｂのウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰ
Ｖ）ＤＮＡを含有している。プラスミドｐｄ　Ｂ　Ｐ　
Ｖ　・−Ｍ　Ｍ　Ｔ　ｎｅｏを制限酵素ＢａｍＨ１で消
化して２つのフラグメント、即ち、ＢＰＶ　　ＤＮＡを
含有する〜８ｋｂのフラグメントおよびその他の上記配
列を含有する〜７ｋｂのフラグメントを得ることができ
る。ＢＫウィルスはＢａｍＨＩ制限部位を１つだけ有し
ており、ＢａｍＨＩで直線化したＢＫウィルスＤＮＡに
プラスミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ　−ＭＭＴ　ｎｅｏの〜７　
ｋｂ　Ｂ　ａｍＨＩ制限フラグメントをライゲート（連
結）することによってプラスミドＩ）ＢＫｎｅｏｌおよ
びｐＢＫｎｅｏ２を構築する。
ＢＫウィルスＤＮＡの配向だけが異なっているプラスミ
ドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２の構築を実施例
２で説明し、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの制限部位およ
び機能地図を添付の第２図に示す。
プラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２はエン
ハンサ−配列を含むＢＫウィルスの全ゲノムを含有して
いるので、ＢＫエンハンサ−をも含有している本明細書
中に記載したポリーＧＴ含有発現ベクターの有用な出発
物質となる。ＢＫエンノ＼ンサーを含有していない池の
発現ベクターも本発明において有用である。
発現ベクターの１つであるプラスミドｐＢＬｃａｔは、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素
（ＣＡＴ）を発現させるように設置されているヒトアデ
ノウィルス２型後Ｊｔｌ１７’ロモーターに直列してＢ
Ｋエンハンサ−配列を含有している。
プラスミドｐＳ　Ｖ　２ｃａｔはＣＡＴ遺伝子の都合の
よい供給源として有用であり、ＡＴＣＣから取得番号Ａ
ＴＣＣ３７１５５のもとでだれでも入手することができ
る。プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔの制限部位および
機能地図を添付の第３図に示す。ヒトアデノウィルス２
型ＤＮＡは市販品から得ることができるし、また、ＡＴ
ＣＣから取得番号ＡＴＣＣＶＲ−２のもとて一般に入手
することもできる。
ＢＫエンハンサ−を含有していない別の発現ベクターで
あるプラスミドｐＬＰｃａｔはクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼを発現させるように設置され
ているヒトアデノウィルス２型後期プロモーターを含有
している。ポリーＧＴ要素をｐＬＰｃａｔおよびｐＢＬ
ｃａｔの両プラスミドに挿入してプラスミドｐＬ　Ｐ　
（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔおよびｐＢＬ（ＧＴ）ｃａｔをそれ
ぞれ１１１１製した。
プラスミドｐＬＰｃａｔおよびｐＢＬｃａｔは次のよう
にして構築した。ヒトアゾンウィルス２型ＤＮＡの〜０
．３２ｋｂ後期プロモーター含有Ａｃｃ［Ｐｖｕｌｌ制
限フラグメントを、平滑末端にしたＢｃｌＩリンカ−（
Ａｃｃ　Ｉ　−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントのＰｖｕｌ
ｌ末端にだけ結合する）にライゲートした。
得られたフラグメントをプラスミドｐｓＶ２ｃａｔの〜
４．５１ｋｂ　Ａｃｃ［−３ｔｕｌ制限フラグメントに
ライゲートしてプラスミドｐＬＰｃａｔを得た。プラス
ミドｐＢＬｃａｔは、ＢＫウィルスＤＮＡの複製起源お
よびエンハンサ−含有の〜１．２８ｋｂ　Ａｃｃ　Ｉ−
Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントをプラスミドｐＬＰｃａｔ
の〜４．８　］　ｋｂ　Ａｃｃｌ−８ｔｕｌ制限フラグ
メントにライゲートすることによって、プラスミドｐＬ
Ｐｅａｔから構築した。ポリーＧＴ要素は次のようにし
てプラスミドｐＬＰｃａｔおよびｐＢＬｃａｔに挿入し
た。Ｘｈｏｌリンカ−を有するポリーＧＴ要素を、Ｘｈ
ｏｌ消化のプラスミドｐＬＰｃａｔまたはｐＢＬｃａｔ
にライゲートしてプラスミドｐＬ　Ｐ　（Ｇ　Ｔ　）ｃ
ａｔおよびｐＢ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔをそれぞれ創
製した。プラスミドｐＬＰｃａｔおよびｐＢＬｃａｔの
唯一のＸｈｏ１部位は、ＢＫエンハンサ−とアデノウィ
ルス後期プロモーターの間に位置している。プラスミド
ｐＬＰｃａｔ。
ｐＬ　Ｐ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔ、　ｐＢ　Ｌ　ｃａｔ、
およびｐＢＬ（ＧＴ）ｃａｔの構築を実施例４および５
でさらに詳しく説明する。プラスミドｐＬ　Ｐ　（Ｇ　
Ｔ　）ｃａｔおよびｐＢＬ（ＧＴ　）ｃａｔの制限部位
および機能地図をそれぞれ添付の第４図および第５図に
示す。
プラスミドｐＢＬｃａｔはＢＫエンハンサー−アデノウ
ィルス後期プロモーター「カセット」の都合のよい供給
源である。このカセットは〜８７０ｂｐのＨｉｎｄｌｌ
！制限フラグメントであり、これを好都合に真核性発現
ベクター中に押入してこのベクターがコードしている産
物の発現を増大させることができる。プラスミドｐＢ　
Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔは、本発明のボＩＪＧＴ−ＢＫ
エンハンサーーアデノウイルス後期プロモーターカセン
トの都合のよい供給源でアル。
このポリーＧＴ＠有カセットは〜９３０ｂｐのＨｉｎｄ
ｌ１１制限フラグメントであり、これを好都合に真核性
発現ベクター中に挿入して、大きいＤＮＡウィルスの即
時型遺伝子産物、例えばＥ１Ａ遺伝子産物の存在下に、
このベクターがコードしている有用な遺伝子産物の発現
をさらに増大させることができる。プラスミドｐＳＢＬ
ｃａｔおよびｐｓＢｆ、（ＧＴ　）ｃａｔは上記のカセ
ットを用いて：Ａ製することができる。プラスミドｐＳ
　Ｂ　Ｌｃａｔについては、プラスミドｐＳ　Ｖ　２ｃ
ａｔを制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌで消化し、ＢＫエンハン
サー−アテ゛ノウイルス？＆　１０１７”ロモーターカ
セットを挿入することによって行われる。
得られたプラスミド（プラスミドｐＳ　Ｂ　Ｌｃａｔと
命名）は、ＢＫエンハンサ−と、さらにＳ　Ｖ　４０　
？！２製起源、ＳＶ４０初期プロモーター、およびＳ■
４０エンハンサ−を含ａしており、従ってこれらの付加
配列が削除されているプラスミドｐＢＬｃａｔとは異な
っている。直列の５Ｖ４Ｑエンハンサー−ＢＫエンハン
サー−アデノウイルス主後期−ｊ口モーター（Ｓ　Ｂ　
Ｌプロモーター）カセットをプラスミドｐＳ　Ｂ　Ｌｃ
ａｔからＰｖｕｌｌ制限酵素フラグメントとして切り出
すことができ、これをあらゆる組換えＤＮＡ発現ベクタ
ー中に都合よく挿入することができる。
プラスミドｐＳ　Ｂ　Ｌｃａｔは、Ｅ１Ａ遺伝子産物が
存在しない限り、プラスミドｐＢＬｃａｔよりも高レベ
ルでＣＡＴを発現させる。このＥ１Ａ遺伝子産物の存在
しないところでの発現の増大は、一方が５Ｖ４Ｑ由来で
あり、他方がＢＫ由来である２種類のエンハンサ−があ
る種のセルラインにおいて隣接プロモーターからの転写
に加酸的な増強作用を有していることを示すものである
。即ち、真核性プロモーターの上流の直列のエンハンサ
−配列を、多種多様の哺乳動物細胞における遺伝子の効
率的発現のために用いることができる。Ｅ１Ａ遺伝子産
物の存在下では、プラスミドｐＢＬｃａｔの方がプラス
ミドｐＳ　Ｂ　Ｌｃａｔよりも高レベルでＣＡＴを発現
させるが、これはおそらくはＳ　Ｖ、４　Ｑエンハンサ
−がＥ１Ａ遺伝子産物によって阻害されるからであろう
。従って、Ｅ１Ａ遺伝子産物の存在°下では、プラスミ
ドｐＳ　Ｂ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔと比較してｐＢ　
Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔの方が高レベルのＣＡＴを発現
すると予想される。しかしこれとは反対に、ＨｅＬａ細
胞においては、ＳＶ４０エンハンサ−はアデノウィルス
２の後期プロモーターからの転写を顕著に刺激したが、
ＢＫエンハンサ−はアゾンウィルス２後期プロモーター
からの転写を最低レベルで刺激したにすぎなかった。Ｈ
ｅＬａ細胞でのＢＫ活性の基礎レベルは非常に低いので
、Ｅ１Ａ遺伝子産物などの大きいＤＮＡウィルスの即時
型遺伝子産物によるＢＫ活性の刺激は最適の発現レベル
にまでは至らない。
ボ。リーＧＴ要素をＢＫエンハンサ−とともに挿入して
もＨｅＬａ細胞においては発現の増大には何の効果もな
いと考えられる。ＨｅＬａ細胞におけるこのＢＫエンハ
ンサ−の低レベルの活性は、ＢＫエンハンサ−と相互作
用するＨｅＬａ細胞に存在するリプレッサー活性による
ものと考えられる。このＨｅＬａ細胞中のリプレッサー
活性を、さらに高いコピー数のＢＫエンハンサ−をＨ’
ｅＬａ細胞中に導入することによって滴定することがで
きる。事実、ＨｅＬａセルラインにおいては、Ｅ１Ａが
リプレッサーのレベルを増加させることもある。しかり
、、ＨｅＬａ細胞では直列の５Ｖ４Ｑエンハンサ−ＢＫ
エンハンサ−を用いて最適の発現レベルを得ることがで
きる。従って、この直列のエンハンサ−は、ＨｅＬａ細
胞におけると同様、ある種の宿主細胞において遭遇する
こともある細胞特異的なネガティブな相互作用を避ける
のに都合がよい。
プラスミドｐＳ　Ｂ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔの制限部
位および機能地図を添付の第６図に示し、プラスミドｐ
ＳＢＬ　ｃａｔおよびｐＳ　Ｂ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａ
ｔの構築を実施例６で説明する。
ＢＫエンハンサー−アデノウィルス後期プロモーターカ
セットをヒトプロティンＣの発現に用いた。ポリＧＴ−
ＢＫエンハンサーーアデノウイルス後期プロモーターカ
セットを本発明で用いてヒトプロティンＣの発現を改善
した。上記カセットのどちらかをプラスミドｐＬ１３３
（米国特許Ｎｏ、４゜７７５、６２４　；　１９８８年
１０月４日発行）中にライゲートすることによって発現
の増加を達成することができる。プラスミドｐＬ　１３
３の制限部位および機能地図を添付の第７図に示す。プ
ラスミドｐＬ１３３（その構築については実施例７に示
す）を制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌで消化し、プラスミドｐ
ＢＬｃａｔの〜０８７　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラ
グメントにライゲートしてプラスミドｐＬＰＣを得た。
ポリーＧＴ要素をプラスミドｐＬＰＣの唯一のＸｈｏｒ
部位に挿入してプラスミドｐＬＰＣ（ＧＴ）を得た。プ
ラスミドｐＬＰＣ（ＧＴ）の制限部位および機能地図を
添付の第８図に示し、プラスミドｐＬＰＣおよびｐＬＰ
Ｃ（ＧＴ）の構築を実施例８でさらに詳しく説明する。
別法では、ｐＬ　１３３をＨｉ口ｄｌｌ＋で消化し、次
にこれをｐＢＬ（ＧＴ）の〜０　、９３　ｋｂ　Ｈ１ｎ
ｄｌｌｌフラグメントとライゲートすることによってプ
ラスミドｐＬＰＣ（ＧＴ）を調製する。
プラスミドｐＬＰＣ（ＧＴ）およびｐＬＰＣは、プラス
ミドｐＬ　１３３と同様、ＳＶ４０のエンハンサ−１初
期および後期プロモーター、Ｔ−抗原結合部位、および
複製起源を含有している。従って、あらゆる組換え宿主
細胞においてプラスミドｐＬＰＣまたはｐＬＰＣ（ＧＴ
）およびこれらの誘導体を用いることは、本明細書に記
載した直列エンハンサ−発現法を例示するものである。
プラスミドｐＬＰＣまたはｐＬＰＣ（ＧＴ）は、プラス
ミドｐｓＢＬおよびｐｓ　Ｂ　ｌ、（ＧＴ）を含む本明
細書中で説明した多数のベクターの有用な出発物質とな
る。
プラスミドｐＳＢＬおよびｐＳ　Ｂ　Ｌ（ＧＴ）は、そ
れぞれプラスミドｐＬＰＣおよびｐＬＰＣ（ＧＴ）上の
プロティンＣをフードしているＤＮＡを削除することに
よって構築することができる。この削除は、単に、Ｂｃ
ｌｌによる消化と自己ライゲートによってプラスミドｐ
ＬＰＣまたはｐＬＰＣ（ＧＴ）の１個のＢｃｌｌ制限フ
ラグメントを削除することを必要とするにすぎない。得
られたプラスミドｐＳＢＬまたはｐＳＢＬ（ＧＴ）は本
明細書中で説明した直列エンハンサ−法において用いる
のに都合のよい発現ベクターとして有用であるか、これ
は、所望の暗号配列を唯一残存している［３ａｌ１部位
に容易に挿入することができるからである。
プラスミドｐＬＰＣまたはｐＬＰＣ（ＧＴ）に存在して
いる５Ｖ４Ｑの調節要素は互いに密接して位置しており
、正確に表すのは困難である。Ｔ−抗原のＴ−抗原結合
部位への結合（これは５Ｖ４Ｑの複製に必要である）は
、ＳＶ４　Ｑ後期プロモーターからの転写を増強するこ
とが知られている。通常、ＳＶ４０の複製起源を含有し
ているプラスミドの高レベルのＴ−抗原誘導の複製は宿
主ｆ、ＩＩＩ胞にとって致死性であるので、５Ｖ４Ｑ　
′Ｆ−抗原の存在下では、例えばプラスミドｐＬＰＣお
よびｐＬ１３３はどちらも安定に保持されない。
ＢＫ調節領域の全体の構造はＳＶ４０のものとかなり類
似しており、ＢＫのエンハンサ−１１３Ｊ起源、初期お
よび後期プロモーター、並びにＴ抗原結合部位のＢＫ類
似体についてはすべて密接して位置しており、それぞれ
の機能領域を曲のものから分離するのは容易ではない。
しかし、ＢＫＴ−抗原の存在下で生育させたときには、
ＢＫの複製起源およびＴ−抗原結合部位を含有している
プラスミドは、必ずしも致死となる量まて′ＦＪ製する
ことがなく、エピソーム性要素として宿主細胞中で安定
に保持されうる。さらに、Ｔ−抗原誘導の複製を利用し
て、ＢＫ複製起源を含有するベクターのコピー数を増加
させることができ、これにより、選択圧がかけられたと
きにはさらに多くのプラスミドのコピーが宿主細胞の染
色体ＤＮＡ中に組込まれるようにすることができる。Ｂ
ＫおよびＳＶ４０　Ｔ−抗原とそれらの各々の結合部位
の間の構造−機能の類似関係から明らかなように、ＢＫ
の複製も５Ｖ４Ｑ　　Ｔ−抗原によって刺激される。形
質転換された真核細胞において安定に保持される要素と
して存在しうるプラスミドｐＬＰＣの誘導体を構築する
ため、完全なりＫゲノムを、ＥｃｏＲＩで直線化した制
限フラグメントとしてプラスミドｐＬＰＣの単一のＥ　
ｃｏＲＩ　制限部位に挿入した。この挿入により２種類
のプラスミド（ｐ　１．。
ＰＣ４およびｐＬＰＣ５と命名）が得られたが、これら
はＩ３にのＥｃｏＲ１フラグメントの配向が異なってい
るだけである。プラスミドｐＬＰＣ４およびｐＬＰＣ５
の構築を実施例９Ａでさらに詳しく説明する。実施例９
Ｂ記載のようにしてポリーＧＴ要素をプラスミドｐＬＰ
Ｃ４またはｐＬＰＣ５の唯一のＸｈｏ１部位に挿入して
、それぞれプラスミドｐＬＰＣ４（ＧＴ）およびｐＬＰ
Ｃ５（ＧＴ）を創製した。プラスミドｐＬＰＣ４（ＧＴ
）の制限部位および機能地図を添付の第９図に示す。
組換えＤＮＡ発現ベクターのエビソーム性の保持は、宿
主細胞染色体への組込みより常に好ましいとは限らない
。しかし、真１６　Ｉｎ胞において機能する選択マーカ
ーが存在しないことから、プラスミドｐＬＰＣまたはｐ
ＬＰＣ（ＧＴ）が選択マーカーを含有する別のプラスミ
ドと同時形質転換されるのでなければ、プラスミドｐＬ
ＰＣまたはｐＬＰＣ（ＧＴ）の安定な真核性形質転換体
を同定するのは困難である。従って、プラスミドｐｌ、
ＰＣまたはプラスミドｐＬ））Ｃ（ＧＴ）を修飾して真
核宿主１１１１胞中で選択されうる誘導体プラスミドを
ＩＪだ。
プラスミドｐｔ、ｐｃの場合は、このプラスミドをプラ
スミドｐＳＶ２ｈｙｇの一部とライゲートすることによ
って行った。プラスミドｐＳＶ２ｈｙｇはハイグロマイ
シン耐性付与遺伝子を含有するプラスミドである。プラ
スミドｐＳＶ２ｈｙｇは、ノーザン・リージョナル・リ
サーチ・ラボラトリ−（ＮＲＲＬ）　（Ｎｏｒｔｈｅｒ
ｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｌ
ａｔｏｒｙ。
Ｐｅｏｒｉａ、　ＩＬ　６１６４０）から取得番号ＮＲ
ＲＬ　Ｂ−１８０３９（１９８６年２月１１日寄託）の
もとで入手することができ、その制限部位および機能地
図を添付の第１０図に示した。プラスミドｐＳＶ２ｈｙ
ｇを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、完全なハイグロマイ
シン耐性付与遺伝子を含有している〜２．５ｋｂＢａｍ
ＨＩ制限フラグメントを単離し、フレノウ酵素（大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩのスブチリシン切断によって生成
する大きいフラグメント）で処理し、次にフレノウ処理
したプラスミドｐＬＰＣの〜５゜８２ｋｂ　Ｎｄｅｌ−
３ｔｕＩ制限フラグメントにライゲートしてプラスミド
ｐＬＰｃｈｙｇｌおよびｐＬＰＣｈｙｇ　２を得た。プ
ラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌとｐＬＰＣｈｙｇ２は、ハイ
グロマイシン耐性付与フラグメントの配向だけが異なっ
ている。プラスミドｐＬｐ　ｃ　ｈｙｇ　１とｐＬＰＣ
ｈｙｇ２の構築プロトコールを実施例１０Ａに記載する
。実施例１０Ｂ記載のようにして、ポリーＧＴ要素をプ
ラスミドρＬＰＣｈｙｇｌおよびｐＬＰＣｈｙｇ２（７
）唯一１７）　Ｘ　ｈｏ　ｒ部位に挿入して、それぞれ
プラスミドｐＬＰｃｈｙｇ１（ＧＴ）およびｐＬＰＣｈ
ｙｇ２（ＧＴ）を創製した。プラスミドｐＬＰＣｈｙｇ
１（ＧＴ）の制限部位および機能地図を添付の第１１図
に示す。
プラスミドｐＢＷ３２のｄｈｆｒ遺伝子含有のフレノウ
処理した〜１．９ｋｂ　ＢａｍＨｒ制限フラグメントを
、プラスミドｐｔ、ｐｃの〜５．８２ｋｂ　ＮｄｅｌＳ
Ｌｕｌ制限フラグメントに挿入することによって、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を含有するプラス
ミドｐＬＰｃｈｙｇｌおよびｐＬＰＣｈｙｇ２に類似す
るヒトプロティンＣ発現プラスミドを構築した。得られ
たプラスミド（ｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ　ｌとｐＬＰＣｄ
ｈｆｒ２と命名）は、ｄｈｒｒ遺伝子の配向だけが異な
っている。ポリーＧＴ要素をプラスミドｐＬＰＣｄｈｆ
ｒｌおよびｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ２のＸｈｏ１部位に挿
入してそれぞれプラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ　ｌ　
（Ｇ　Ｔ）およびｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ２　（ＧＴ）を
創製した。これらプラスミドの構築を実施例１２で説明
する。プラスミドｐＬＰｃｈＹｇｌをさらに修飾してジ
ヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を導入した。こ
のｄｈｆｒ遺伝子はｄｈ４ｒ−ネガティブ細胞の選択マ
ーカーであり、これを用い、宿主細胞を量が増加するメ
トトレキセートに暴露することによってＤＮＡセグメン
トのコピー数を増加させることができる。ｄｈｆｒ遺伝
子は、例えばプラスミドｐＢＷ３２から得ることができ
る（このプラスミドは、日本特許出願Ｎｏ、　２０１２
２５／８Ｂ、１９８７年３月３日公開Ｎ　ｏ、　４８３
７８／８７に開示されている）。この遺伝子の他の供給
源は当業者には明らかであろう（例えば、ＡＴＣＣ３７
１４６、プラスミドｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆｒ）。プラス
ミドｐＢＷ３２の制限部位および機能地図を添付の第１
２図に示す。プラスミドｐＢＷ３２の構築プロトコール
を実施例１１で説明する。
プラスミドｐＢＷ３２のｄｈｆｒ遺伝子含有の〜１９　
ｋｂ　Ｂ　ａｍＨＩ制限フラグメントを単離し、フレノ
ウ酵素で処理し、そして部分的にＥｃｏＲＩ消化したプ
ラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌに挿入してプラスミドｐＬＰ
ｃｈｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２を得た。プラスミドｐＬ
Ｐｃｈｙｇｌは、２つのＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を
含んでいる：即ち、その１つはハイグロマイシン耐性付
与遺伝子の中に、他の１つはプラスミドｐＢＲ３２２由
来の配列の中にある。ｄｈｆｒ遺伝子を含有するフラグ
メントを、プラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌのｐＢ　Ｒ３２
２由来配列中に位置しているＥｃｏＲ１部位に挿入して
プラスミドｐＬＰＣｈｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２を得た
。プラスミドｐｔ。
Ｐ　Ｃｈｄ　ｌとｐＬＰＣｈｄ２はｄｈｒｒ遺伝子含有
ＤＮＡセグメントの配向たけが異なっており、これらプ
ラスミドの構築を実施例１２Ａで説明する。実施例１２
Ｂ記載のようにして、ポリーＧＴ要素をプラスミドｐＬ
ＰｃｈｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２の唯一のＸｈｏ１部位
に挿入して、それぞれプラスミドｐＬＰＣｈｄ１（ＧＴ
）およびｐＬＰＣｈｄ２（ＧＴ）を創製した。プラスミ
ドｐＬ、ＰＣｈｄ１（ＧＴ）の制限部位および機能地図
を添付の第１３図に示す。
プラスミドｐＬＰｃｈｄｌを修飾して、ＢＫエンハンサ
ーーアデノウイルス後後期プロモーター上セント並びに
ハイグロマイシン耐性付与遺伝子およびｄｈｆｒ遺伝子
の両方を含有するプラスミドｐｈａを得た。プラスミド
ｐｈｄを構築するため、プラスミドｐＬＰｃｈｄｌをｄ
ａｍ−大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主細胞から調製し、制
限酵素Ｂｃｌｒで消化し、再環化し、こうしてヒトプロ
ティンＣをコードしているＤＮＡを削除した。プラスミ
ドｐｈｄは１個のＢｃｌＩ制限酵素認識部位を含んでお
り、この部位は本明細書に記載したＢＫエン／％ンサー
−アデノウィルス後期プロモーターから発現させようと
するあらゆる配列の挿入に都合よく配置されている。プ
ラスミドＩ）ｈｄの構築プロトコールを実施例１３Ａで
説明する。プラスミドｐｈｄは大腸菌Ｇ　Ｍ　４８　（
ｄａｍ＼ｄａＩ１１−）に導入し、ノーザン・リージョ
ナル・リサーチ・ラボラトリ−（ＮＲＲＬ）に寄託され
ている（１９８９年７月２６日）。この形質転換宿主細
胞は取得番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８５２５のもとて入手
可能である。当業者には既知の常法によりこの宿主から
プラスミドを単離することができる。実施例１３Ｂでさ
らに詳しく説明するように、ポリーＧＴ要素をプラスミ
ドｐｈｄのＸｈｏ１部位に挿入してプラスミドｐｈｄ（
Ｇ　Ｔ　）を得た。プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）の唯
一のＢａ１ｌ制限酵素認識部位は、本発明のＢＫエンハ
ンサー−ボリＧＴ−アデノウィルス後期プロモーターか
ら発現させようとするあらゆる配列の挿入に都合よく設
置されている。プラスミドｐｈｄ（ＧＴ）の制限部位お
よび機能地図を添付の第１４図に示す。
ヒトプロティンＣを発現させる他の発現ベクターはプラ
スミドｐＬＰｃＥ１ＡおよびｐＬＰｃＥ１Ａ（ＧＴ）で
ある。プラスミドｐＬＰｃＥｌΔおよびｐＬＰｃＥ１Ａ
（ＧＴ）は、ヒトアデノウィルス２型のＥ１Ａ遺伝子を
含有しており、この遺伝子の産物は、前記のように、Ｂ
Ｋエンハンサ−の活性を増強し、そして本明細書で説明
したように、ポリーＧＴ要素のエンハンサ−活性を活性
化する。
即ち、ＢＫエンハンサ−およびポリ−ＧＴと直列のプロ
モーターからの転写はＥ１Ａ遺伝子産物の存在下で増大
する。プラスミドｐＬＰｃＥ１Ａは、ヒトアデノウィル
ス２型ＤＮＡのＥ　Ｉ　Ａ遺伝子ａ有の〜１．８ｋｂＢ
ａｌｌ制限フラグメントを、プラスミドｐＬＰＣの〜５
．８２ｋｂ　Ｎｄｅｌ−Ｓｔｕｌ制限フラグメントとラ
イゲートすることによって構築した。プラスミドｐＬＰ
ｃＥ１Ａの構築プロトコールを実施例１４Ａで説明する
。実施例１４Ｂでさらに説明するように、ポリーＧＴ要
素をプラスミドｐＬＰｃＥ１Ａの唯一のＸｈｏ１部位に
挿入してプラスミドｐＬＰＣＥ　１Ａ（ＧＴ）を得た。
プラスミドｐＬＰＣＥ　１Ａ（ＧＴ）の制限部位および
機能地図を添付の第１５図に示す。
本発明の多種の発現ベクターはポリＧＴ−ＢＫエンハン
サーーアデノウイルス後期フロモーターカセントまたは
ＢＫエンハンサー−アデノウィルス後期プロモーターカ
セットを利用して組織プラスミノーゲン活性化因子（’
Ｔ’ＰＡ）または修飾ＴＰＡ（ＭＴＰＡ）を発現させる
。ＴＰＡまたはＭＴＰＡのベクターを構築するため、プ
ラスミドｐＢＷ３２（第１２図）を制限酵素ＢａｍＨＩ
で消化し、得られた〜５．６ｋｂのフラグメントを再環
化してプラスミドｐＢＷ３２ｄｅｌを得た。修飾型Ｔ　
））　Ａをコードし、Ｈｉｎｄｌｌｌ制限部位を１つた
け含んでいるプラスミドｐＢ　Ｗ　３２　ｄｅｌをＨｉ
ｎｄｌｌｌで消化し、次いでプラスミドｐＢａｌ３ｃａ
ｔの〜０．６５ｋｂのＨｉｎｄＩＩ＋制限フラグメント
にライゲートしてプラスミドｐＢＬＴを得た。プラスミ
ドｐＢａｌ８ｃａｔは、改良型のＢＫエンハンサーーア
デノウイルス後期プロモーターカセットを含有しており
、これを実施例１８で説明する。ポリー〇Ｔ要素をプラ
スミドｐＢＬＴの唯一のＢａｍ８１部位に挿入してプラ
スミドｐＢＬＴ（ＧＴ）を得た。プラスミドｐＢＬＴ（
ＧＴ）の制限部位および機能地図を添付の第１６図に示
し、プラスミドｐＢＬ′ｒおよびｐＢＬＴ（ＧＴ）の構
築プロトフールを実施例１５で説明する。
選択マーカーをＢａｍｆ（Ｉ消化のプラスミドｐＢＬＴ
またはｐＢ　Ｌ　Ｔ　（Ｇ　”［”）に導入してもよい
。例えばプラスミドｐＢＬＴを用いて、ある溝築におい
ては、プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｈｙｇのハイグロマイ
シン耐性遺伝子含有の〜２．５ｋｂ　Ｂａｍ）Ｔ　Ｉ制
限フラグメントを挿入してプラスミドｐＢ　Ｌ　Ｔｈｙ
ｇ　１およびｐＢＬＴｈｙｇ２を得、別の溝築において
は、プラスミドｐＢＷ３２のｄｈｆｒ遺伝子含有の〜１
．９ｋｂＢａｍＨＩ制限フラグメントを挿入してプラス
ミドｐＢ　＋−Ｔｄｈｆｒ　ｌおよびｐＢＬＴｄＭｒ２
を得た。この４種類のプラスミドｐＢＬＴｈｙｇｌ、ｐ
ＢＬＴｈｙｇ２、ｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｒｒ　ｌ　、および
ｐＢ　Ｌ、　Ｔｄｈｆｒ２は、選択マーカーの種類およ
び／または配向が異なっているだけである。プラスミド
ｐＢＬＴｈｙｇｌ　ｐＢＬＴｈｙｇ　２、ｐＢ　Ｌ　ｒ
ａｈｒｒ　ｌおよびｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ２、並びにこ
れらのポリーＧＴ含有誘導体であるｐＢＬＴｈｙｇ１（
ＧＴ）、ｐＢＬＴｈｙｇ２（ＧＴ）、ｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈ
ｆｒ１（ＧＴ）およびｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ２　（Ｇ　
Ｔ）の構築プロトコールを実施例１６に示す。プラスミ
ドｐＢＬＴｈｙｇ１（ＧＴ）およびｐＢＬＴｄｈｒｒ１
（ＧＴ）の制限部位および機能地図をそれぞれ添付の第
１７図および第１８図に示す。
ＴＰＡまたは修飾ＴＰＡを発現させる本明細書記載の他
の発現ベクターは、プラスミドｐＢＷ３２の構築におい
て用いる中間体のプラスミドｐＴＰΔ１０３から誘導し
た。プラスミドｐＴＰＡ１０３の構築プロトフールを実
施例１１で説明し、プラスミドｐＴＰＡ１０３の制限部
位および機能地図を添付の第１９図に示す。これらの誘
導体を構築するため、プラスミドｐＴＰＡＩ０３のＴＰ
Ａ暗号領域の５′末端の直前にＢａｍ）［１制限部位を
導入した。プラスミドｐＴＰＡ１０３を制限酵素ＩＩ　
ｇａ　Ｔで消化して、ＴＰＡ暗号領域の５゛末端を含有
する〜０．５２ｋｂＨｇａｌ制限フラグメントを単離し
た。フレノウで処理した後、このＨｇａ［をＢａｍＨ［
リンカ−にライゲートし、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し
、ＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＢ　Ｒ３２２に挿入
してプラスミドｐ′ｒＰＡ６０１およσｐＴＰＡ６０２
を得た。
次いで、プラスミドｐＴＰ　Ａ　６０２を制限酵素Ｂｇ
ｌ１１およびＳａｌ［で消化し、得られた〜４．２ｋｂ
のＢｇｌｌｌ　−Ｓ　ａｌ　Ｉ制限フラグメントをプラ
スミドｐＴＰＡ１０３の〜２．０５ｋｂ　　５ａｉｌ　
−Ｂｇｌｌ！制限フラグメントにライゲートしてプラス
ミドｐＴＰＡ６０３を得た。従って、プラスミドｐＴＰ
Ａ６０３は、両末端をＢａｍＨ１制限部位で囲まれたＴ
ＰＡの完全な暗号配列を含有している。プラスミドｐＴ
ＰＡ６０３の制限部位および機能地図を添付の第１９図
に示す。プラスミドｐＴＰ　Ａ　６０３に類似している
が、修飾型のＴＰＡをコードしているプラスミドを構築
するため、プラスミドｐＴＰ　Ａ　６０３を制限酵素Ｂ
ｇｌ１１および５ｓｔｌで消化し、得られた〜５．０２
ｋｂのＢｇｌｌｌ　−Ｓ　ｓｔ　１フラグメントをプラ
スミドｐＢＬＴの〜０．６９ｋｂＢｇｌｌｌ　−Ｓ　ｓ
ｔ　Ｉ制限フラグメントにライゲートした。次いで、得
られたプラスミド（ｐＭＴＰＡ６０３と命名）を制限酵
素ＢａｍＨＩで消化し、得られた〜１．３５ｋｂのフラ
グメントを単離した。このフラグメントおよびプラスミ
ドｐＴＰ　Ａ　６０３の〜１．９０　ｋｂ　ＢａｍＨＩ
制限フラグメントを、別のライゲート反応でＢｃｌ［消
化のプラスミドｐｈｄ　（第１４図）に個々にライゲー
トして、それぞれプラスミドｐｈｄＭＴ　Ｐ　Ａおよび
ｐｈｄＴ　Ｐ　Ａを得た。プラスミドｐｈａ”ｒ　Ｐ　
ＡおよびｐｈｄＭＴ　Ｐ　Ａ、並びにこれらのポリーＧ
Ｔ含有誘導体ｐｈｄＴＰＡ（ＧＴ）およびｐｈｄＭＴＰ
Ａ（ＧＴ）の構築を、プラスミドｐＴＰＡ６０２の構築
プロトコールから始め、これを実施例１７で説明する。
プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）Ｔ　Ｐ　Ａおよびｐｈｄ
（Ｇ　Ｔ　）ＭＴ　Ｐ　Ａの制限部位および機能地図を
それぞれ添付の第２０図および第２１図に示す。
本発明は、真核性プロモーターと直列でＢＫエンハンサ
−とともにポリーＧＴ要素を用いて、大きいＤＮＡウィ
ルスの即時型遺伝子を発現する真核宿主細胞においてＤ
ＮＡ配列を転写および発現させる方法を包含するもので
ある。当業者なら、本方法において実質的にあらゆる真
核性プロモーターをポリーＧＴ要素およびＢＫエンハン
サ−と直列して用いることができることを認めるであろ
う。例えば、ＳＶ４０初期および後期プロモータ、ＢＫ
初期および後期プロモーター、あらゆるポリオーマウィ
ルスまたはパボバウイルスの初期および後期プロモータ
ー　ヘルペスウィルス族のプロモーター、インターフェ
ロンα１プロモータ−、マウスメタロチオネインプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーター、β−グロビン
プロモーター、アデノウィルスのプロモーター、ポック
スウィルスのプロモーター、ウニＨ２Ａプロモーター、
コンアルブミンプロモーター、卵アルブミンプロモータ
ー、マウスβ−グロビンプロモーター、およびヒトβ−
グロビンプロモーターはすべて本発明方法における真核
性プロモーターとして有用である。さらに、転写を開始
させるのに用いることができるあらゆる配列、例えば上
流の「ＣＣΔＡＴＩ配列を含むかまたは含まないｒＴＡ
ＴΔ」様の配列からなる転写開始部位を含有する配列が
本発明におけるプロモーターとして有用である。
このようなプロモーターを、本方法において用いるに好
ましい真核性プロモーターであるアデノウイルス−２後
期プロモーターを用いて本明細書中に例示したような、
ＢＫエンハンサ−とともにボ１）−ＧＴ要素を含有する
発現ベクター中に、常法により挿入することによってこ
れらのプロモーターを本発明方法において用いることが
できる。
本明細書に記載したベクターで用いるＢＫエンハンサ−
は原型株のＢＫウィルス（ＡＴＣＣＶＲ８３７）から単
離した。しかし、多数のＢＫウィルス変異体が単離され
、開示されている。ガードナーら［Ｇａｒｄｎｅｒ　ｅ
ｔ　ａｔ、、　１９７１．　Ｌａｎｃｅｔ　ｌ　：　１
２５３；　Ｇａｒｄｎｅｒ、　１９７３．　Ｂｒ１ｔ、
Ｍｅｄ、Ｊ、　　Ｉ　：　７７−７８］はＢＫウィルス
の最初の単離を報告し、従ってガードナー味が原型の、
または野生型のＢＫウィルスと呼ばれている。ＢＫウィ
ルスのガードナー味（第１図）はＡＴＣＣから取得番号
ＡＴＣＣＶＲ−８３７のもとて人手できる。実際のとこ
ろ、本明細書に記載されたベクターの構築に使用するた
めにＡＴＣＣＶＲ−８３７を入手したときに、１３にの
変異株がウィルス集団中に存在していることが観察され
た。他者もこの現象を観察している［即ら、チュケら（
Ｃｈｕｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　　１９８６．　Ｊ、Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ　６０（３）＋　９６０）］。真核性プロ
モーターに直列させてＢＫエンハンサ−とともにポリー
〇Ｔ要素を用いて大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子
産物の存在下で核酸およびタンパク質などの有用な物質
を発現させる方法に限らず、本発明の他のあらゆる方法
も、ＢＫエンハンサ−の供給源としてはガードナー味ま
たは特定のＢＫ変異株に限定されるものではないが、原
型株から単離した変異エンノ・ンサー（実施例１８）が
好ましい。次の表は本明細書で説明した方法において使
用することができるＢＫ変異株の多数の代表例を挙げる
ものである。さらに、ＢＫ様のウィルス（サル媒介物１
２）がＢＫエンノ−ンサーに相同なエンノ＼ンサー要素
を含有しており、本明細書記載の方法に用いることがで
きる。このサル媒介物１２のエンハンサ−要素はカニン
ガムら［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　　１
９８５．　　ＪＪｉｒｏｌ、　　５４　：　４８３−４
９２１が開示しており、本発明にとってはＢＫエンハン
サ−変異体である。
（以下、余白） ＢＫＶ（ＤＵＮ） ＢＫ（ＧＳ） および Ｂ　Ｋ　（ＭＭ） ＢＫ（ＪＬ） 第１表 ＢＫＶ（ＤＵＮ）はウィルス エンハンサ−コアの側面ｔ ぐの０、γｍ、ｕ、のところに 〜４０ｂｐの欠失を含んでい る これらの変異体ハコン）、ロ ー小領域における転位およ び重複を含む多数の塩基の 相違を有し、相違の一部は エンハンサ−中に生じてい る 制限エンドヌクレアーセ パターンに小さな相違 Ｖｉｒａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ。
１９８０、　（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ。
Ｎ、　Ｙ、　、　ｅｄ、　Ｇ、　Ｋｌｅｉｎ）。
ｐｐ、　４８９−５４０ Ｐａｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　、　１９７９゜Ｊ　Ｖｉｒ
ｏｌ、３２：２２０−２２５：５ｅｉｆ　ｅｔ　ａｌ、
、　１９７９゜Ｃｅ１ｌ　１８　：　９６３−９７７ Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９７９Ｎｕｃ、＾ｃｉ
ｄｓ　Ｒｅｓ、　７゜ ６５１−６６８　・Ｐａｔｅｒ　ｅｔ ａｌ、　、　＋９７９．　Ｖｉｒｏｔｏｇｙ１３１：４
２６−４３６ Ｐａｕｗ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９７８゜Ａｒｃｂ、　
Ｖｉｒｏｌ、　５７：３５株の名称 Ｂ　Ｋ（ＲＦ） および ＢＫ（ＭＧ） ｍ５２２ 第一１表（続き） 説明（野生型に対する） これらの変異体は２種類の 相補性欠損分子からなり、 その両者は感染性に必要と され、原型のＢＫウィルス とはヌクレオチド配列が広 範囲に異なっている 増殖中の自然突然変異によ って、おそら（は２組の短 い方の３７ｂｐの繰返しの存 在および３つのエンハンサ 一繰返しの内の２つの削除 により、宿主範囲および 形質転換能の相違が導か れている 参考文献 Ｐａｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０゜Ｊ、Ｖｉｒｏ
ｌ、３６二４８０−４８７°Ｐａｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、
　、　１９８１、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　３９：９６８
−９７２　；　Ｐａｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８
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　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８２、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、
　４２：９７ｇ−９８５； Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８４　Ｊ、
　Ｖｉｒｏｌ、　５１：ｌ−６ｔｒ５３０ ｒ５３１ ｔｒ５３２ ＫＶ９ ＢＫウィルス Ｒ 第１表（続き） ｐｍ５２２配列から派生する　ＷａＬａｎａｂｅ　ｅｔ
　ａｌ、　、　１９短いセグメントの一層の重　８４．
　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５１：ｌ−６複を有し、ｐｍ５
２２エンハ ンサー領域を含有する組換 えＢＫウィルスの増殖中の 自然突然変異 原型（ｗｔ）　Ｂ　Ｋウィルスの調 製物から単離されたＢＫウ ィルスの生存性の変異株； 不完全なエンハンサ−繰返 しとエンハンサ−の後期側 に至る配列の宙複を含んで いる Ｃｈｕｋｅ　ｅｔ　ａｔ、、　１９１１ｔ６゜Ｊ、　Ｖ
ｉｒｏｌ、　６０：９６０−９７１エンハンサ−領域中
に挿入　Ｐａｇｎａｎｉ　ｅｔ　ａＬ　、　１９と転位
を含むヒト腫瘍から　８６．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５
９：５００単離されたＢＫウィルス変　−５０５ 異株；このウィルスは変化 した形質転換表現型を有し ている 当業者なら、宿主細胞が大きいＤＮＡウィルスの即時型
遺伝子産物を発現する限り、多種の真核宿主細胞を本発
明方法において用いることができることを認めるであろ
う。即時型の遺伝子産物はプラスミドあるいは他のベク
ターによる形質転換なとの多数の方法によって宿主細胞
中に導入することができるので、実質的にはあらゆる真
核細胞を本発明方法において用いることができる。特に
、本発明のＧＴエンハンサ−系を活性化するＥ１Ａ遺伝
子産物を、（１）ボ１Ｊ−ＧＴ要素、真核性プロモータ
ー、および発現させようとする構造遺伝子とともに、Ｃ
１Ａ遺伝子をコードしている１個のプラスミド、例えば
プラスミドｐＬＰｃＥ１Δ（ＧＴ）を真核宿主細胞に導
入すること；（２）Ｅ１Ａをコードしている１個のプラ
スミド、例えばプラスミドｐｓＶ２Ｅ１Ａと、ポリーＧ
Ｔ要素、真核性プロモーター、および発現させようとす
る構造遺伝子をコードしている１個のプラスミド、例え
ばプラスミドｐＢＬ（ＧＴ）ｃａｔの２種類のプラスミ
ドを真核宿主細胞の同時形質転換によって導入すること
；または（３）２９３あるいはＡＶ１２などのＥ１Ａ発
現セルラインを用い、ポリーＧＴ、真核性プロモーター
、および発現させようとする構造遺伝子をコードしてい
る１個のプラスミドを導入すること、を含む種々の方法
で付与してよいことは当業者の認めるところであろう。
ヒト細胞は本発明方法において好ましい宿主細胞である
。ヒト腎細胞が宿主細胞として特に好ましく、Ｅ１Ａ遺
伝子産物を発現するアデノウイルス−５形質転換したヒ
ト胚腎セルライン２９３が最も好ましく、これをＡＴＣ
Ｃから取得番号ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７５３のもとで入
手することができる。
２９３セルラインは、２９３細胞がＥ１Ａ遺伝子産物を
発現するためだけでなく、２９３細胞がγ−カルボキシ
ル化し、ほかにプロティンＣなどのコンプレックス遺伝
子産物を適切にプロセッシングするその能力から好まし
い。「γ−カルホキシル化」とはカルボキシル基がγ−
炭素のところでグルタミン酸残基に付加される反応を指
し、γ−カルボキシル化されたタンパク質とはいくつか
のアミノ酸残基がγ−カルボキシルを受けたタンパク質
である。通常、腎細胞はある種のタンパク質をγ−カル
ボキシル化し、ほかにプロセッシングするが、２９３細
胞はアデノウィルスで形質転換され、これによって通常
特別の機能が失われることになる。従って、本発明は、
天然にγ−カルボキシル化され、適切に折り畳まれ、そ
してプロセッシングされているタンパク質を産生させる
改良方法をも包含するものである；ここで、該タンパク
質はアデノウィルス後期プロモーターとともにＢＫエン
ハンサ−およびポリーＧＴ要素を含有する組換えＤＮＡ
ベクターにコードされている。２９３セルラインの２９
３Ｎ３Ｓ誘導体も本発明で用いるのに適しており、グラ
ハム［Ｇｒａｈａｍ、　１９８７゜Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖ
ｉｒｏｌ、　６８　：　９３７コの記載のようにして懸
濁培養で増殖させることができる。
γ−カルボキシル化されたタンパク質を産生させるこの
方法は、アデノウィルス形質転換されたヒト胚腎細胞に
限定されるものではない。このγ−カルボキシル化され
たタンパク質を産生させる方法はすべてのアデノウィル
ス形質転換された宿主細胞に広く適用することかできる
。また当業者なら、この方法は、始めに真核細胞をγ−
カルボキシル化タンパク質のための発現ベクターで形質
転換し、次いで得られた形質転換体をアゾンウィルスで
形質転換することによって行うことができることを認め
るであろう。ハロルド・ギンズバーク’［１Ｉａｒｏｌ
ｄ　Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、　Ｔｈｅ　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕ
ｓｅｓ、　　１９８４＋Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ］は、多数のアデノウィルスおよびア
デノウィルス形質転換した宿主細胞を得る方法を記載し
ている。組換えＤＮＡ発現ベクターにコードされている
γ−カルボキシル化タンパク質を発現させる目的のため
に特に好ましいアデノウィルス形質転換された宿主細胞
は、シリアン（Ｓｙｒｉａｎ）ハムスターセルラインＡ
Ｖ１２−６６４（以下、ＡＶ１２と記す）である。この
ＡＶＩ２セルラインは、アデノウィルス１２型をシリア
ンハムスターの首筋に注射し、得られた腫瘍から細胞を
単離することによって作成された。ＡＶＩ２セルライン
はγ−カルボキフル化されたタンパク質を産生させる目
的のためには好ましい宿主である。γ−カルボキシル化
されるタンパク質の例には、因子■、因子■、因子■、
プロティンＣ、プロティンＳ１プロテインＺ１およびプ
ロトロンビンが含まれるが、これらに限定はされない。
実施例１８および１９に記載されている新規なポリＧＴ
−ＢＫエンハンサーー真核性プロモーター構築物は、真
核性プロモーターとともにポリーＧＴ要素およびＢＫエ
ンハンサ−を用いる改良発現法を用いて構築した。この
方法は、Ｅ１Ａ遺伝子産物の存在下で真核性プロモータ
ーに関して５′または３°にポリーＧＴ要素を設置し、
ＢＫエンハンサ−と直列で用いられる真核性プロモータ
ーのＣＣＡＡＴ領域またはＣＣＡＡＴ領域等価域の５°
末端の上流の０〜３００ヌクレオチド以内にＢＫエンハ
ンサ−を設置することからなる。
他のウィルス遺伝子産物、例えばアゾ７ウイルスのＶＡ
遺伝子産物は、アデノウィルスの３部構成リーダーを含
有しているｍＲＮＡ分子の翻訳効率を増強する［カウフ
マン（Ｋａｕｆｍａｎ、　　１９８５．　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８２　：　
６８９−６９３）　；スベンソンおよびアクジャラル（
Ｓｖｅｎｓｓｏｎ　ａｎｄ　Ａｋｕｓｊａｒｕｌ、　　
１９８５、　ＥＭＢＯ４：　９５７−９６４）］。本発
明のベクターを修飾してアデノウィルスの完全な３部構
成リーダーをコードさせるのは容易である；このＶＡ遺
伝子産物を用いてアデノウィルスの３部構成リーダーの
第１の部分だけを含有するあるｍＲＮＡの翻訳を増強し
てもよい。
アデノウィルスの３部構成リーダーの配列を以下に示す
： ＊−−−−−−−−−−−−−−一第１の部分−−−−
−−−−−−−−−−＊５’　−ＡＣＵＣ：ＵＣＵＵＣ
ＣＣＣＡＵＣＧＣＩＪＧＵＣＵＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＧ
ＣＵＧＵＵＧＧＧ＊−−−−−−−−−−−−−−−−
−一第２の部分−一−−−−−−−−−−ＣＵＣＧＣＧ
ＧＵＵＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＵＣＵＵＣＧＣＧＧＵＣＵ
ｔｌＵＣＣＡＧＤＡＣＵＣＵＵ−−−一−−−〜−−−
−−−−−−−−−−−−−−−＊＊−−−−−−−−
−ＧＧ　Ａ　ｔｌｃＧＧＡ　ＡＡＣＣＣＧ　ＬＩＣＧＧ
ＣＣ［ＩＣＣＧＡ　Ａ　ＣＧ　ＩＪＡｃＵｃｃＧｃｃＡ
ｃｃＧＡｃＧ−−一−−−−−−−−−−−−−第３の
部分−−−一一−−−−ＧＡＣＣＵＧＡＧＣＧＡＧＵＣ
ＣＧＣＡＵＣＧＡＣＣＧＧＡＵＣＧＧＡＡＡＡＣＣＵｆ
ＪＣＧＡＧ−一−−−−−−−−−−−〜−−−−−−
−−−−−−＊ＡＡＡＧＧＣＧＩＪＣＵＡＡＣＣＡＧＵ
ＣＡＣＡＧＵＣＧＣＡ−３’［配列中、Ａはリボアデニ
ルであり、Ｇはリボグアニルであり、Ｃはリホシチンル
であり、そしてＵはウリジルであるコ。アデノウィルス
ＤＮＡ中にフードされているように、３部構成のリーダ
ーは大きいイントロンによって遮断されている。これら
イントロンまたはイントロンの一部の存在は発現レベル
に悪影響を及ぼさない。本明細書中に記載したプラスミ
ドｐ４−１４およびｐ２−５はアデノウィルスの３部構
成リーダーを含有しており、後記の実施例２４でさらに
詳しく説明する。プラスミドｐ４−１４　（ＧＴ）およ
びｐ２−５　（Ｇ　Ｔ）はさらにポリ〜ＧＴ要素を含有
している。
本発明の多数の例示ベクター、例えばプラスミドｐ　Ｂ
　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔおよびｐｔ、ｐｃ（ｃＴ）な
どは、アデノウィルスの３部構成リーダーの第１の部分
だけを含有している。本明細書においては、アデノウィ
ルスの３部構成リーダーの「第１の部分」は、ｍＲＮＡ
に転写されたときには、少なくとも以下の配列を含有し
ている： ５’−ＡＣＵＣＵＣＵＵＣＣＧＣＡＵＣＧＣＵＧＵＣＵ
ＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＧ−３’。
即ち、本発明は、真核性プロモーターおよび該プロモー
ターから発現されるように設置された有用な物質をコー
ドしているＤＮＡ配列の両方を含有する組換えＤＮＡベ
クターで真核宿主細胞を形質転換し、該組換えＤＮＡベ
クター含有細胞を該有用物質の発現に適した条件下で培
養することにより、真核宿主細胞において有用な物質を
産生させる方法の改良法であって、改良が （ａ）ポリーＧＴ要素をベクターに導入し；（ｂ）アデ
ノウィルスの３部構成リーダーの第１の部分をコードし
ているＤＮＡを工程（ａ）のベクターに導入して、転写
されたときには生成したｍＲＮＡか有用産物をコードし
ており、その５′末端には３部構成リーダーの第１の部
分を含んでいるようにし； （ｃ）工程（ｂ）のベクターを含有している細胞に、Ｖ
Ａ遺伝子産物の発現をコードしている第１のＤＮＡ配列
およびアデノウィルスのＥ１Ａ遺伝子産物の配列をコー
ドしている第２のＤＮＡ配列を付与し；そして （ｄ）工程（ｃ）の細胞を、（ｉ）Ｖ　Ａ遺伝子産物の
発現およびｍＲＮＡの翻訳の刺激、および（ｉｉ）Ｅ１
Ａ遺伝子産物の発現およびポリーＧＴ要素のエンノーン
サー活性の刺激に適した条件下で培養すること（但シ、
ｍＲＮＡはアデノウィルスの完全な３部構成リーダーを
含有していないものとする）からなる方法を包含する。
ＶＡをコードしているプラスミドはアデノウィルスＤＮ
Ａから構築した。ヌクレオチド９８３３の５ａ１１部位
とヌクレオチド１１５５６のＨｉｎｄ１１１部位で範囲
を定められている〜１７２３ｂｐの制限フラグメントを
、アデノウイルス−２ＤＮＡから月１離し、Ｈ１ｎｄｌ
ｌｌ　−Ｓ　ａｌ　［消化のプラスミドｐＢ　Ｒ３２２
にクローンしてｐＢ　Ｒ３２２の〜６２２　ｂｐ　Ｓ　
ａｌ　Ｉ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントを置き換え、
プラスミドｐＶＡを構築した。プラスミドｐＶＡから〜
１８２６ｂｐのＮｒｕｌフラグメントを単離し、このフ
ラグメントをフレノウ処理したＢａｍＨｒ消化のプラス
ミドｐＳ　Ｖ　Ｎｎｅｏ（Ｂ　ＲＬから人手可能）に挿
入することによって、ネオマイシン耐性とＶＡをコード
しているプラスミドを構築した。得られたプラスミド（
ｐＶ　Ａ−ｎｅｏと命名）を用い、形質転換後のネオマ
イシン（Ｇ４１８）耐性の選択により、あらゆるセルラ
インにＶＡ遺伝子を挿入することができる。
しかし、アデノウィルスのＶＡ遺伝子産物は、ＶＡをコ
ードしているベクターで宿主細胞を形質転換した後の最
初の数日間においては、アデノウィルスの３部構成リー
ダーの第１の部分または完全な３部構成リーダーのいず
れかを含有している組換え遺伝子の発現に、その最大の
ポジティブな作用を発揮することができる。この最初の
数日間の後の宿主細胞中でのＶ’Ａ遺伝子細胞の発現は
最適発現レベルを与えないこともある。
また、５Ｖ４Ｑ、ＢＫウィルス、あるいは池のあらゆる
ポリオーマウィルスのＴ抗原を本明細書中に記載したベ
クターとともに用いて、プロモーター活性を増強し、そ
して／または複製の刺激によりプラスミドのコピー数を
増大させることができる。５Ｖ４ＱのＴ抗原はアデノウ
ィルスおよびＢＫの後期プロモーターの両者からの転写
を刺激する。５Ｖ４ＱのＴ抗原はポリーＣ，Ｔ要素をト
ランスー活性化しないようである。しかし、本発明の発
現ベクター上にＴ抗原の暗号配列を含ませることによっ
て、またはＴ抗原の暗号配列を有するプラスミドと本ベ
クターとの同時トランスフェクションによって、実施例
２２に示したように、選択圧をかける前にコピー数の増
幅を得ることができる。これは、発現ベクターの高コピ
ー数の組込みを可能にする。
上述のように、本発明の好ましい態様では、組換えＤＮ
Ａ発現ベクターは、ポリーＧＴ要素、アデノウィルス後
期プロモーター（これ自体は、３部構成リーダーの少な
くとも第１の部分および有用な物質をコードしている遺
伝子を発現させるように設置されている）の上流の３０
０ヌクレオチド以内に設置された原型株から単離したＢ
Ｋエンハンサ−を含有している。この好ましいベクター
を用いて、Ｅ１Ａ遺伝子産物を継続的に発現するヒト胚
腎２９３細胞（発現ベクターによる形質転換の前後のど
ちらかに修飾してアデノウィルスのＶＡ遺伝子産物を発
現させた）を形質転換する。
しかし、安定な形質転換体のためには、ＶＡ遺伝子産物
の存在は望ましくないこともある。
以下に実施例を挙げて本発明の方法、化合物、および絹
換え微生物をさらに詳しく説明する。当業者なら、実施
例に記載した特定の試薬、装置、および方法がｆｌｌな
る例示にすぎず、本発明を限定するものではないことを
認めるであろう。
実施例１　ポリー〇Ｔ要素の調製 シスチック（Ｓｙｓｔｅｃ）１４５０Ａ　ＤＮＡ合成機
［シスチック・インコーボレーテソト（３ｙｓｔｅｃ、
　Ｉｎｃ、　。
３８１６　Ｃｈａｎｄｌｅｒ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｍｉｎｎ
ｅａｐｏｌｉｓ、　ＭＮ　５５４０１）］またはＡＢ３
　３８０Ａ　ＤＮＡ合成機［アプライド・バイオシステ
ムズ・インコーボレーテノド（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、、　８５０　Ｌｉｎｃｏｌ
ｎ　ＣｅｎｔｒｅＤｒｉｖｅ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔ
ｙ、　ＣＡ　９４４０４）提供］を用いて、ポリーＧＴ
要素の構築に用いる一本鎖Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントを化
学的に合成した。当技術分野において多くのＤＮＡ合成
装置が知られており、これを用いてこのフラグメントを
作成することができる。
また、このフラグメントは、イタクラ等［１ｔａｋｕｒ
ａｅｔ　ａｌ。、　　！９７７、５ｃｉｅｎｃｅ、　１
９８：１０５６］およびクリ−等［Ｃｒｅａ　ｅＬ　ａ
ｌ、＋　１９７８．　Ｐｒｏｃ、　？ｌａＬ、＾ｃａｄ
、　Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、　７５：５７８５］の方法に実質的に従って調
製することらできる。
以下のように一本鎖を合成した１麦、−本鎖ボリーＧＴ
要素（各５００ナノグラム）をアニーリングした。すな
わち、エツペンドルフ試験管中で鎖１（１６μＱ）と鎖
２（１１μσ）とを？捏合し、ｔＯＸ　　ＴＭ緩柚ｉ液
［０，５Ｍ）リス−ＨＣｆ！（ｐＨ７，６）、ＯＩＭ　
ＭｇＣ９ｔｌ（３μＱ）を加えた。この試験管を熱湯浴
に２分間放置し、次いで室温で、次ぎに４°Ｃティン牛
ユベートしてゆっくり冷却した。このｔｉ作により一本
鎖がアニーリングして二本鎖のポリーＧＴ要素を生成し
た。このインキュベー／−Ｊン彼、試料（３０μｅ）を
凍結乾燥し、次いて、ガラス蒸留したＨ　、Ｏ［ｄＨ、
Ｏ］（７ｕ＆）ｌ−４％濁した。構築されたポリーＧＴ
要素は、以下の構造を有していた： 旦１がＩＸ 五９ΩＲニ ジ■田工 上記に示したとおり、このポリー〇Ｔ要素は、（ＧＴ）
ｎ−（ＣＡ）、、セグメント（ｎ−２１）［このセグメ
ントの両側には、制限酵素：　ＢａｍＨＩ　（Ｇ↓ＧΔ
ＴＣＣ）、Ｘｈｏｌ（Ｃ↓Ｔ　ＣＧ　Ａ　Ｇ　）および
ＥｃｏＲｌ　（Ｃ４ＡＡＴＴＧ）の認識部位であるＤＮ
Ａ配列がある］を含むように構築された。したがって、
このポリーＧ′Ｆ要素を、種々の発現ベクターのＢａｍ
８１部位またはＸｈｏ１部位に容易に挿入することがで
き、以下の多くの実施例に記載されているようなポリー
〇Ｔ含有の発現ベクター誘導体を得ることかできる。ま
た、発現ベクターのすべての制限部位に平滑末端ライゲ
ーションによってポリーＧＴ要素を挿入することができ
る。
害頼週λＢＫウィルスＤＮＡの調装 ＢＫウィルスを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ＡＴＣＣ）から取得番号ＡＴＣＣＶＲ−８
３７のもとで人手する。このウィルスは凍結乾燥品とし
て得られ、これをバンク（ｆｌａｎｋ）のバランス塩［
ギブコ（Ｇｉｂｃｏ、　３１７５５ｔａｌｅｙ　Ｒｏａ
ｄＧｒａｎｄ　１ｓｌａｎｄ、　　ＮＹ　１４０７２）
コに再懸濁して約１０’プラーク生成単位（ｐｆｕ）／
１２の力価にする。ＢＫウィルスＤＮＡ調製用に選択し
た宿主は１次（プライマリ−）ヒト胎児腎（Ｐ　ＨＥ　
Ｋ）細胞であり、この細胞はフロラ・ラボラトリーズ社
（Ｐｌｏｗ　Ｌａｂ。
ｒａＬｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　７６５５０１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ　ＲｏａｃＬ　ＭｃＬｅａｎ、Ｖ
Ａ　２２１０１）からカタログ番号０−１００のもとで
、またはＭ、Ａ、バイオプロダクツ（Ｍ、＾、Ｂｉｏｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ）からカタログ番号７０−１５１のもと
で入手することができる。
全面単層の約１０８のＰＨＥＫ細胞を含有する７５次１
ポリスチレンフラスコ約５個を用いてウィルスを調製す
る。力価１０５ｐｆｕ／ｍＱのＢＫウィルス（約ｉ　ｙ
ａ＞を各フラスコに加え、これを３７℃で１時間インキ
ュベートし、次いで新鮮な培養培地［１０％ウシ胎児血
清を追加したダルベツコの改良イーグル培地（Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ’　ｓ　Ｍｏｄｉｒｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’　ｓ
Ｍｅｄ　ｉ　ｕｎ、　Ｇ　ｉ　ｂｃｏ）　］を加え、感
染細胞を３７°ＣでｌＯ〜１４日間またはウィルスの完
全な細胞変性効果が認められるまでインキュベートする
。この細胞変性効果はセルラインの種類およびウィルス
の種類によって変わるが、通常、細胞か丸くなり、凝集
し、そして培養盤から剥がれることからなる。
凍結−解凍を３回繰り返すことによってこの細胞からウ
ィルスを放出させ、５０００Ｘｇで遠心して細胞破片を
除去する。ＰＥＧ−６０００（１００９）を加え、この
溶液を４°Ｃで２４時間インキュベートし、そして５０
００Ｘｇで２０分間遠心して、上清液（１１り中のウィ
ルスを沈澱させ、集める。このペレットを、最初の容積
の１／１００となるよう０．ｌＸ５ＳＣ緩衝液［ＩＸ　
５ＳＣ＝０゜１５ＭＮａＣ（および０．．０１５Ｍクエ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７）］に溶解する。このウィルス
懸濁液を、試験管中の飽和ＫＢｒ溶液（１５Ｒのに層状
に加え、これを７５，０００Ｘｇで３時間遠心する。遠
心後、このＫＢｒ溶液中に２つのバンドが現れる。完全
なピリオンを含有する低い方のバンドを集め、ＴＥ［１
０ｍＭト’ＪスーＨＣ（２（ｐＨ７，８）、および１ｍ
ＭＥＤＴＡ］を溶離緩衝液として用いてセファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘｌｌ）Ｇ　−５０カラム［シグマ−
ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、＋
　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　１４５０８Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍ
Ｏ６３１７ｇ）コで脱塩する。
このカラムから得た精製ピリオン溶液に、ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）を１％濃度となるように加え、プ
ロナーゼを１００μ９／Ｒσ濃度となるように加え、そ
してこの溶液を３７°Ｃで２時間インキュベートする。
次いで、この溶液に塩化セシウムを１．５６９／ｙ＋２
密度となるように加え、臭化エチジウムを最終濃度１０
０μ９／ｘ（ｌとなるように加える。この溶液を、ソー
パル（Ｓｏｒｖａｌｌ　；　ＤｕＰｏｎｔｌｎｓｔ、Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉ
ｏｎ、　Ｎｅｗｔｏｎ。
ＣＴ　０６４７０）　８６５０−ターまたは同様の垂直
ローター中、２６０，０００Ｘｇで２４時間遠心する。
遠心後、ウィルスＤＮＡのバンドを単［，１００ｍＭ）
リス−ＨＣ１２（ｐＨ７，８）で飽和したイソアミルア
ルコールで５回抽出する。次いでこのＢＫウィルスＤＮ
Ａの溶液を、ＤＮＡの２６０ｎｍ／２８０ｎｍ吸収比が
１、γ５と１．９０の間に入るまで、ＴＥ緩衝液に対し
て透析する。ＮａＣＱ濃度を０゜１５Ｍに調整し、２倍
量のエタノールを加え、この溶液を一７０℃で少なくと
も２時間インキュベートシ、そしてこの溶１夜を１２．
ＯＯＯＸｇで１０分間遠心することによってＤＮＡを沈
澱させる。
得うれたＢＫウィルスＤＮＡのペレットを、Ｉｎ９７Ｍ
（ｌの濃度でＴＥ緩衝液に懸濁させる。
実施例３　プラスミドｐＢ　Ｋ　ｎｅｏｌおよびｐＢＫ
ｎｅ。
２の構築 大腸菌に１２　ＨＢＩＯＩ／ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ
細胞を、ＡＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ３７２２４のも
と、凍結乾燥品として入手する。この凍結乾燥細胞を、
ｌＯＯμ９／ｙＱアンピシリン含有のし一寒天（１１２
あたり寒天１５９を有するしブロス）プレートで平板培
養し、３７℃でインキュベートして単一のコロニー単離
体を得る。
５０μ９／ｘＱのアンピシリンを含有するしブロス［Ｉ
Ｑあたりトリプトン１０ｇ、ＮａＣＣｌ０ｇ、および酵
母抽出物５ｇコ（Ｉρ）に大腸菌ＫＩ２　ＨＤＩＯ１／
ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏのコロニーを接種し、空気振
盪型中、３７°Ｃで、０．Ｄ、、、。が〜１吸収単位に
なるまでインキュベートし、この時点でクロラムフェニ
コール（１５０Ｒ９）を培養物に加えた。
インキュベートを約１６時間続けた。クロラムフェニコ
ールの添加によりタンパク質の合成が阻害され、従って
細胞分裂が阻害されるが、プラスミドの複製は継続して
起こり得る。
この培養物をＧＳＡＯ−ター（ソーパル）中、４°Ｃ１
６０００ｒｐｎで５分間遠心した。得られた上清を廃棄
し、細胞ペレットをＴ　Ｅ　Ｓ　ｔＢ街液［１０ｍＭト
リス−ＨＣ１２（ｐＨ７，５）、ｌＯｍＭＮａｃσ、お
よびｌ＋ｎＭＥＤＴＡコ（４０ｉＲ）で洗浄し、次いで
再ペレット化した。上清を廃棄し、細胞ペレットをドラ
イアイス−エタノール浴中で凍結し、次いで解凍した。
解凍した細胞ペレットを２５％スクロースおよび５０Ｑ
ＩＭＥＤＴＡの溶液（ＩＯＩＲ）に再懸濁させた。この
溶液に、５巧／村リゾチーム溶液（約Ｉ　Ｍ（１’）、
０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）（３酎）および１
０ｍ９／ｚＱ　ＲＮＡ５ｅ　Ａ（１００ｕ（りを加え、
次いで、水上で１５分間インキュベートした。溶菌液［
１０％トリトン−Ｘ１００（３ｊ１１２）、０．２５Ｍ
　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）（７５ｘＣ）、ＩＭＩ−リ
ス−ＨＣ＆（ｐＨ８，０）（１５ｘ（１”）、オヨびｄ
Ｈ，０（７ズＱ）を混合して、調製した］（３３ＩＣ）
を、リゾチーム処理した細胞に加え、混合し、得られた
溶液を水上でさらに１５分間インキュベートした。溶菌
細胞をドライアイス−エタノール浴中で凍結し、次いで
解凍した。
５Ｗ２８．１０−ター［ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ、
　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ、　Ｃａｍｐｕｓ　Ｄｒｉｖｅ　ａＬ　Ｊ
ａｍｂｏｒｅｅ　Ｂｌｖｄ、、　Ｉｒｖｉｎｅ、　ＣＡ
　９２７１３）］中、２５０００　ｒｐｍで４０分間遠
心し、緩衝化フェノールで抽出して、この溶液から細胞
破片を除去した。
この細胞抽出液にＣｓＣａ（約３０．４４ｙ）および５
１９／峠臭化エチジウム溶液（〜ｌ　Ｍ（１）を加え、
次いで、溶液の容量をＴＢＳ緩衝液で４．ＯｙＱに調整
した。この溶液をＶＴｉ５０超遠心管（ベックマン）に
デカントし、次いで、密封し、ＶＴｉ５０ローター中、
４２．ＯＯＯｒｐｍで〜１６時間遠心した。
得られたプラスミドバンドを紫外光で可視化し、これを
単離し、次いでＴｉ７５管およびローター（ベックマン
）中に置き、５０．　ＯＯＯｒｐｍで１６時間遠心した
。０、γ６１９７ｘＱ　Ｃ５Ｃ（ｌを含有するＴＥＳを
用いて必要な容量に調整した。プラスミドバンドを再度
単離し、塩−飽和インプロパノールで抽出して臭化エチ
ジウムを除去し、ＴＢＳ緩衝液で１：３に希釈した。次
いで、この溶液にエタノール２倍量および３Ｍ酢酸ナト
リウム１倍量を加え、−２０℃で一夜インキユベートし
た。この溶液を、５ｓ３４０−ター（ソーパル）中、１
０゜００　Ｏｒｐｍで１５分間遠心してプラスミドＤＮ
Ａをペレット化した。
この方法によって得られたプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭ
　Ｔ　ｎｅｏ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（〜ｌ　ｇ９）を、ＴＥ緩
衝液（ＩＲ（１＞に懸濁させ、−２０’Ｃで保存した。
前記プラスミド単離方法は、非常に精製されたプラスミ
ドＤＮＡが多量に必要である場合に一般に用いられる。
この方法を若干変え、培養細胞を約５３１１２だけを用
い、適当に量を減らした溶菌緩衝液中で細胞を溶解し、
そして遠心分離工程をフェノールおよびクロロホルム抽
出に変えることによって、あるプラスミドの存在につい
て形質転換体をスクリーニングする際に必要であるよう
な比較的少量の比較的純度の低いＤＮＡを迅速に得るこ
とができる。
上記で調製したプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅ。
ＤＮＡ（約５μ９；５μａ）および実施例２で調製した
ＢＫウィルスＤＮＡ（５μり；５μｇ）を、各々、ｌＱ
ＸＢａｍＨＩｉ街液［１，５Ｍ　ＮａＣ（！、６０Ｍ　
トリス−ＨＣ（（ｐＨ７，９）、６０　ｍＭ　ＭｇＣ（
ｌｆｆｉ、およびｌ　ｍ９／ｘ（ｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ］（２
μｉ２）、制限酵素ＢａｍＨＩ［約２０単位；酵素の実
際の供給源は異なっていることもあるが、特記しない限
り、本明細書における酵素単位の全ては、ニュー・イン
グランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ、　３２　Ｔｏｚｅｒ　Ｒｏａｄ。
Ｂｅｖｅｒ！ｙ、　ＭＡ　０１９１５）の単位の定義を
指す］（１μの、およびｄＨ，Ｏ（７μのを含有する溶
液中、３７°Ｃで２時間消化した。同量のフェノールで
抽出し、次いでクロロホルムで２回抽出して、この反応
を止めた。次いで、各ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡを沈澱させ
、遠心分離によって集め、ｄＨ，ｏ（５μＱ）に懸濁さ
せた。
Ｂａｍ）（ｌ消化プラスミドバンド　Ｐ　Ｖ−ＭＭＴｎ
ｅｏ（１μのとＢａｍＨＩ消化ＢＫウィルスＤＮＡ（１
μのとの混合物にＩＯＸリガーゼ緩衝液（約１μｇ）を
加えた。このＤＮＡ混合物にＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（
１ｕＱ、　；　〜１０００単位）およびｄＨｔｏ　（６
ｕ（りヲ加工た後、得られた反応液を１６°Ｃで一夜イ
ンキユベートシた。ライゲートしたＤＮＡは、目的のプ
ラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢ　Ｋ　ｎｅｏ２　（
これらは、ＢＫウィルスＤＮＡの配向だけが異なってい
る）からなっていた。プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの制限
部位および機能地図を添付の第２図に示す。
大腸菌に１２　ＨＢＩＯＩ細胞は、取得番号ＮＲＲＬ　
　Ｂ　−１５６２６（１９８３年９月２８日寄託）のも
と、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラ１−（
ＮＲＲＬ）から凍結乾燥品として入手することができる
。以下のように、この大腸菌に１２ＨＢＩＯＩ細胞を培
養し、形質転換のためにコンピテントにし、上記で調製
したライゲート化ＤＮＡで形質転換した。Ｌブロス中、
大腸菌に１２ＨＢ１０１の培養物（５０ｍ１２）を、６
５０ナノメーターでの光学密度（０，Ｄ、、、。）が約
０．４吸収単位になるように増殖した。培養物を水上で
１０分間冷却し、遠心分離によって細胞を集めた。細胞
ペレットを冷１００ｍＭ　ＭｇＣｆｆ！（２５１１のに
再懸濁し、水上で２５分間インキュベートした。遠心分
離によって細胞をもう１回ペレ・ット化し、このベレッ
トを冷１００ｍＭ　ＣａＣＱ２Ｃ２，５ｘＱ）に再懸濁
し、水上で３０分間インキュベートした。インキュベー
ション後、形質転換ＤＮＡの取り込みのために細胞をコ
ンピテントにする。
この細胞懸濁液（２００μｇ）と、上記で調製したライ
ゲート化ＤＮＡとを混合し、氷上で３０分間インキュベ
ートした。この後、水浴中、４２°Ｃで２分間、細胞を
放置し、次いで、水上にさらにｌＯ分間戻した。この細
胞を遠心分離によって集め、Ｌブロス（ｌ　ｉＱ）に再
懸濁し、３７°Ｃで１時間インキュベートした。この細
胞混合物の試料を、１００μ９／ｘ（ｌアンピシリン含
有のＬ寒天プレートで平板培養した。このプレートを３
７°Ｃで一夜インキユベートした。大腸菌に１２　　［
（ＢＩＯＩ／ｐＢＫｎｅｏ１および大腸菌に’　１２　
／　ｐＢ　Ｋ　ｎｅｏ２形質転換体を、そのアンピシリ
ン耐性表現型およびそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分
析によって同定した。
上記のようにして、大腸菌に１２　ＨＢＩＯＩ／ｐＢＫ
ｎｅｏｌおよび大腸菌Ｋ　ｌ　２　／ｐＢ　Ｋ　ｎｅｏ
２細胞からプラスミドＤＮＡを得た。
（以下、余白） 実施例４　プラスミドｐＬＰｃａｔおよびｐＬＰ（ＧＴ
）ｃａｔの構築 Ａ、プラスミドｐＬＰｃａｔの構築 アデノウィルス２　（Ａｄ２　）のピリオンＤＮＡは、
約３５．９４ｋｂの大きさの、２本鎖の直線状分子であ
る。このＡｄ２の後期プロモーターは、Ａｄ２ゲノムの
〜０．３１６ｋｂ　Ａｃｃｌ　−Ｐｖｕｌｌ制限フラグ
メントとして単離することができ、この〜０゜３２ｋｂ
制限フラグメントは、Ａｄ２ゲノムのヌクレオチド位置
５７５５と６０７１の間の配列に対応している。所望の
〜０．３２ｋｂ　Ａｃｃｌ　−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメ
ントを単離するため、始めにＡｄ２ＤＮＡを制限酵素Ｂ
ａ１ｌで消化し、〜０．３２ｋｂＡｃｅ　Ｉ　−Ｐｖｕ
ｌｌ制限フラグメントの完全な配列を含有する〜２．４
ｋｂＢａｌ［制限フラグメントを単離する。次いで、こ
の〜２．４ｋｂＢａｌｌ制限フラグメントをＡｃｃｌお
よびＰｖｕｌｌで消化して所望のフラグメントを得る。
Ａｄ２　　ＤＮＡ（ＢＲＬから入手可能）（約５０μｇ
）を、ｄＨ，０（８０ｄ）およびＩＯＸ　Ｂａ１ｌ緩衝
液Ｃ１０Ｃ１０Ｏリス−ＨＣ（１（ｐＨ７，６）：１２
０ｍＭＭｇＣＬ；　ｌｏｏｍＭ　ＤＴＴ；および１　ｍ
９／　ｙ（１ＢＳＡ］（１０μ（１’）に溶解する。こ
のＡｌ１　　ＤＮＡの溶液に制限酵素Ｂａ１ｌ（１０μ
Ｑ；約２０単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで
４時間インキュベートする。
制限フラグメントが十分に分離するまで、Ｂａｌ■消化
ＤＮＡを１％アガロースゲルｔ　気泳動ｉ’：かける。
電気泳動したＤＮＡの可視化は、臭化エチジウムの希釈
溶液（０，５μ９／＊＆）中でゲルを染色し、染色した
ゲルに長波長紫外（ＵＶ）光をあてることによって行う
。以下のように、アガロースからＤＮＡを単離する。所
望のフラグメントを含有するゲルの細片（ＵＶ光によっ
て可視化した）をゲルから切り出し、エッベンドルフ試
験管に入れる。
ゲル細片を含む試験管をまず一７０’Ｃで放置するかま
たは氷上に置いてゲルを凍結させ、次いで、室温で放置
して解凍し、再度凍結および解凍した。
これらの凍結−解凍を２回繰り返した後、試験管の液体
を集め、イソアミルアルコールで３　回連続抽出し、次
にエタノール沈澱してＤＮＡフラグメントを液体から取
り出した。得られた精製フラグメントをＴＥ緩衝液（１
０μｇ）に溶解する。
ｄＩ４ｔｏ（約６μ＆）およびＩＯＸ　Ａｃｃｌ緩衝液
［６０ｍＭ　ＮａＣｆ２；　６０＋ｎＭ　トリス−ＨＣ
＆（ｐＨ７，５）６ＱｍＭ　ＭｇＣＱｔ：　６０ｍＭ　
ＤＴＴ、およびｌａｙ／ｒｔｔＱ　Ｂ　Ｓ　Ａ］（２μ
１２）を、Ａｌ１の〜２．４ｋｂＢａ１１制限フラグメ
ントの溶液に加える。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ａｃｃ
ｌ（２μｇ；約１０単位）を加えた後、反応液を３７°
Ｃで２時間インキュベートする。このＡｃｃｌ消化後、
ＤＮＡをエタノール沈澱ニヨッテ集め、ｄＨｘｏ（１６
μ（りおよび１ＯＸＰｖｕｌｌ緩衝液［６００ａ＋Ｍ　
ＮａＣｆｆ；　６０ｍＭ　トリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，
５）；　６０ｍＭ　ＭｇＣＬ；　６０ｍＭＤＴＴ；およ
び１　ｍ９／ａ（ｌ　Ｂ　Ｓ　Ａコ（２ｕＣ）中に再懸
濁する。このＤＮＡ溶液に制限酵素ＰＶＩＩＩＩ（約２
μＱ；約１０単位）を加えた後、反応液を３７°Ｃで２
時間インキュベートする。
Ａｌ１の後期プロモーターを含有する〜０．３２ｋｂ　
Ａｃｅ　Ｉ　−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントが他の消化
産物から分離するまで、Ａｃｃｌ　−Ｐｖｕｌｌ消化し
たＡｌ１の〜２．４ｋｂＢａｌｌ制限フラグメントを〜
６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。
このゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光を用いて観
察し、〜０．３２ｋｂ　Ａｃｃ［−Ｐｖｕｌｌ制限フラ
グメントを含有するゲルセグメントをゲルから切り出し
、つぶし、抽出緩衝液［５００ｍＭ酢酸アンモニウム：
ＬＯｎ＋Ｍ酢酸マグネシウム；１ｍＭＥＤＴＡ　、およ
び０．１％ＳＤＳ］（２５０μの中に、室温で一夜浸漬
する。翌朝、この混合物を遠心し、ベレットを除去する
。上清中のＤＮＡを工９／−ルで沈澱させ、ｔＲＮＡ（
約２μＱ）を加えて所望のフラグメントの沈澱を完全な
ものにする。〜０゜３２ｋｂ　Ａｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制
限フラグメント（約０２μａ）が得られ、これをｄＨ，
ｏ（７μのに懸濁させる。
実質的に下記実施例１１Ａに記載の方法に従ってキナー
ゼ処理しておいたＢａ１ｌリンカ−［５’　−ＣＴＧＡ
ＴＣＡＧ−３’　、二ニー・イングランド・バイオラブ
ズから入手可能１（約０．２５μｙ；０．５μσ中）を
、〜０．３２ｋｂ　Ａｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメ
ントの溶液に加え、次いでこのＤＮＡ溶液にＴＪ　　Ｄ
ＮＡリガーゼ（１μＱ；約１０００単位）およびＩＯＸ
リガーゼ緩衝液［０，５Ｍ）リス−ＨＣ（＋（ｐＨ７，
８）１００ｍＭ　ＭｇＣｆ２ｅ；　２００ｍＭ　ＤＴＴ
　；　ＩＱｍＭＡＴＰ；および０．５ｍｇ／ｌＱ　Ｂ　
Ｓ　Ａ］（１μ（りを加え、得られた反応液を１６°Ｃ
で一夜インキユベートした。このＢａ１Ｉリンカ−は、
Δｅｅｌ−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントのＰｖｕｌｌ末
端にだけライゲートすることができた。後に行ったＤＮ
Ａ配列決定により、Δｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメ
ントのＰｖｕｌｌ末端には４個のＢａ１ｌリンカ−が結
合していることがわかった。これら余分のＢｃｌｌ！／
ンカーをＢｃｌｌ消化および再ライゲートによって除去
することができるが、余分のリンカ−はこれらリンカ−
を含有するベクターの正しい機能を妨害しないので、こ
れら余分のＢａ１ｌリンカ−を除去しなかった。
大腸菌Ｋ１２　ＨＢＩＯＩ／ｐＳＶ２ｃａｔ細胞をＡＴ
ＣＣから取得番号ＡＴＣＣ３７１５５のもと凍結乾燥品
として入手し、実質的に実施例３の方法に従ってこの細
胞からプラスミドｐＳ　Ｖ　２ｃａｔＤ　Ｎ　Ａを単離
した。プラスミドｐｓＶ２ｃａｔの制限部位および機能
地図を添付の第３図に示す。プラスミドｐｓＶ２ｃａｔ
　ＤＮＡ（約１　ｍｇ）が得られ、これをＴＥ緩衝液（
１ａ１２）に溶解する。プラスミドｐｓＶ２ｃａｔ　Ｄ
ＮＡ（約３μ９；３μｆｆ）を１ＱＸＡｃｃＩ緩衝液（
２μのおよびｄｔｒ、ｏ（ｉ６μｇ）に加え、次いで制
限酵素Ａｃｃｌ（３μｅ；約９単位）をｐＳ　ｖ　２ｃ
ａｔＤＮＡの溶液に加え、得られた反応液を３７℃で２
時間インキュベートした。次に、１０ＸＳｔｕｌ緩衝液
［１，ＯＭ　ＮａＣｇ：　１００ｍＭトリスＨＣ（ｌｃ
ｐＨ８，０＞：　ｌ　００ｍＭ　ＭｇＣ（！ｔ：　６０
ｍＭＤＴＴ；およびＩＱ／ｙｆｆ　Ｂ　Ｓ　Ａ］（３μ
１２）、ｄＨ，Ｏ（５μ＆）、および制限酵素５ｔｕｌ
（約２ｕ（１：約１０単位）を加えることにより、この
Ａｃｃｌ消化したプラスミドｐｓＶ２ｃａｔ　ＤＮＡを
制限酵素５ｔｕｌで消化した。得られた反応液を３７℃
で２時間インキュベートした。この反応混合物をフェノ
ールで１回、次いでクロロホルムで２回抽出することに
よって反応を停止させた。所望のフラグメント（約０．
５μＱ）が得られ、これをＴＥ緩衝液（２０ｐのに溶解
した。
Ａｃｃｌ−Ｓｔｕｆ消化したプラスミドｐｓＶ２ｃａｔ
ＤＮＡ（約４μ１２）を、Δｄ２の〜０．３２ｋｂＡｃ
ｃｌ−Ｐｖｕｌｌ（Ｂｃｌ　Ｉリンカ−が結合している
）制限フラグメント（約７μＱ）と混合し、ｌＯｘリガ
ーゼ緩衝液（３μの、ｄＨ，０（１５μＱ）、およびＴ
４　　ＤＮＡリガーゼ（２μＱ；約１０００単位）を加
えた後、このライゲーション反応液を１６°Ｃで一夜イ
ンキユベートした。このライゲートしたＤＮＡは所望の
プラスミドｐＬＰｃａｔ、すなわち、Ａｄ２の後期プロ
モーター（クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子を転写させるように配置されており、従っ
てこれを発現させる）を含有するプラスミドからなって
いた。
実質的に実施例３の方法に従い、このライゲート化ＤＮ
Ａを用いて大腸菌Ｋ１２　ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を、５０μ９／酎アンピシリン含有の
し一寒天で平板培養した。プラスミドＤＮＡの制限酵素
分析によって大腸菌に１２　ＨＢ　Ｉ　Ｏ１／ｐＬ　Ｐ
ｅａｔ形質転換体を同定した。実質的に実施例３に記載
のプラスミド単離法に従って、後の構築に用いるために
プラスミドｐＬＰｃａｔ　ＤＮＡを形質転換体から単離
した。
Ｂ、プラスミドｐＬＰ（ＧＴ）ｃａｔの構築■、プラス
ミドｐＬＰｃａｔからの構築ｄＨ，０（３０Ｉ１５）中
の実施例１で調製したポリーＧＴ要素（約１μ９）を、
ＩＯＸコア（Ｃｏｒｅ）緩衝液［５０ＩＩＩＭトリスー
ＨＣ１２（ｐＨ８，０）；ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣＱ＊：お
よび５０ｎ＋Ｍ　ＮａＣ１２！］（１５μ＆）およびｄ
Ｈｌｏ（９５μＱ〉に加える。このポリーＧＴ要素の溶
液に制限酵素Ｘｈｏｌ　（Ｉ　０ｔｔ（１：約１００単
位）を加え、得られた反応液を３７℃で３時間インキュ
ベートする。Ｘｈｏｌ消化後、エタノール沈澱によって
ＤＮＡを集め、ｄｔｉ、ｏ（７μｍ２）に再懸濁する。
ＴＥ緩？ｌＩ液（ｌｏμｊ）中のプラスミドｐＬＰｃａ
ｔＤＮＡ（約５μ９）を１０Ｘコア緩衝液（１０μＱ）
およびｄＨｌｏ（７５μ１２）に溶解する。Ｘｈｏｌ（
５ｕ（１：約６０単位）をＤＮＡ溶液に加え、得られた
反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートする。この反
応混合液を、まずフェノール：クロロホルムで、次いで
クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出して反応を
停止する。Ｘｈｏｒ消化プラスミドｐＬＰｃａｔＤＮＡ
をエタノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝液（１００ｇのに再
懸濁した。以下のように、ウシ腸アルカリホスファター
ゼでＸｈｏｌ消化プラスミドρＬＰｃａｔＤＮＡを処理
する。Ｘｈｏ！消化プラスミドｐＬＰｃａｔ　ＤＮＡを
ＴＥ緩衝液でｌＯＯμＱに希釈し、この溶液にウシ腸ア
ルカリホスファターゼ［コラボレイティブ・リサーチ・
インコーホレーテッド（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、、　　１２８Ｓｐｒｉｎ
ｇ　５ｔｒｅｅｔ、　Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、　ＭＡ　０
２１７３］（約０．０６単位）を加え、得られた反応液
を３７°Ｃで３０分間インキュベートした。ＩＸ　　Ｓ
ＥＴ［５ｍＭトリス−ＨＣ１２（ｐＨ７，８）；　５＋
ｎＭ　ＥＤＴＡ　；およびｌ　５ｍＭ　Ｎａ（Ｊ！］、
０．３Ｍ酢酸ナトリウム、および０．５％ＳＤＳを含有
するように溶液を調整し、６５°Ｃで４５分間インキュ
ベートした。ホスファターゼ処理によって、ｐＬＰｃａ
ｔ　ＤＮＡが自己ライゲートするのを防止する。ＤＮＡ
をエタノール沈澱によって集め、次いでｌＯｍＭ）リス
−ＨＣ１２（ｐＨ８，０）緩衝液（１０μＱ）に再懸濁
した。
１０Ｘリガーゼ緩衝液［０，５Ｍトリス−ＨＣ（（ｐＨ
７，８）；　１００ｍＭ　Ｍｇ（１！−：　２００ｍＭ
　ＤＴＴ　；　１０ｍＭ　ＡＴＰ　；および０．５ａ＋
ｙ／ｙ（Ｂ　ＳＡ］（約１μのを、Ｘｈｏｌ消化したホ
スファターゼ処理プラスミドｐＬＰｃａｔ　ＤＮＡ（１
μ；約５０ｎ９）とＸｈｏｒ消化したポリーＧＴ要素（
７μぐ：約１００　ｎｙ）との混合物に加える。Ｔ４　
　ＤＮＡリガーゼ（１μＱ；約１０００単位）をＤＮＡ
溶液に加え、得られた反応液を１６°Ｃで一夜インキコ
ベートする。
ライゲートしたＤＮＡは、目的のプラスミド単離法　（
Ｇ　Ｔ　）ｃａｔからなっている。プラスミドｐＬＰ（
ＧＴ）ｃａｔの制限部位および機能地図を添付の第４図
に示す。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化ＤＮＡ
を用いて大腸菌Ｋ１２　ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換する
。５０μ９／好アンピシリン含有のし一寒天で形質転換
細胞を平板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析を
用いて大腸菌Ｋ１２ＨＢ　１０１／ｐＬ　Ｐ（ＧＴ）ｃ
ａｔ形質転換体を同定する。実質的に実施例３に記載の
プラスミド単離法に従って、後の構築のためにプラスミ
ドｐＬＰ（ＧＴ）ｃａｔ　ＤＮＡを形質転換体から単離
する。
２、プラスミドｐＢＬ（ＧＴ）ｃａｔからの構築別法と
して、以下の方法に従って、プラスミドｐＢＬ（ＧＴ）
ｃａｔ　ＤＮＡ（下記実施例５に記載）かう始め、ＢＫ
エンハンサ−を含有するフラグメントを欠失させてプラ
スミドＩ）　Ｌ　Ｐ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔを調製した。
トリス緩衝液［１０ｍＭトリス−ＨＣｆ２（ｐｆ４８．
０）］（１０μｅ）中の実施例５Ｂで調製したプラスミ
ドｐＢＬ（ＧＴ）ｃａｔ　ＤＮＡ（約９　、５１ｔ９）
を、１０Ｘ高塩緩衝液（１０μＱ）およびｄＨ，０（６
９μのに加えた。制限酵素Ｍｓｔｌｌ（約９μＱ；約１
８単位）および制限酵素Ｂｇｌ１１（２μＱ；約２０単
位）をＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を３７℃で２
時間インキコベートした。次に、上記のように、反応を
停止させ、ＤＮＡを抽出し、沈澱させた。ＤＮＡ沈澱物
をｄＨ，０（４５μｇ）に溶解した。
実質的に実施例１０の方法に従って、Ｍｓｔｌｌ／Ｂｇ
ｌｌ＋消化プラスミドｐＢＬ（ＧＴ）ｃａｔ　ＤＮＡ（
４５μのに１０ｘクレ／つ緩衝液（５μＱ）およびフレ
ノウ酵素［Ｂ　ＲＬによって市販されている］（１μジ
；約５単位）を加え、インキユベートした。フレノウ処
理したＭｓｔｌｌ／　Ｂｇｌｌｌ消化プラスミドｐＢＬ
（ＧＴ）ｃａｔ　ＤＮＡをフェノール；クロロホルムで
１回、クロロホルム：イソアミルアルコールで１回抽出
し、次いで、エタノールで沈澱させ、最後にトリス緩衝
液（１０μｍ２）に再懸濁させた。
フレノウ処理したＭｓｔｌｌ／　Ｂｇｌｌｌ消化プラス
ミドｐＢＬ（ＧＴ）ｃａｔ　ＤＮＡ（約１　ｕＱ　；約
０　、５　Ｍｇ）に、１０Ｘリガーゼ緩衝液（１μＱ）
、ｄＨ，０（７μＱ）およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（ｌｕ
（！：約１００単位）を加えた。得られた反応液を１６
°Ｃで一夜インキコベートすると、ライゲートしたＤＮ
Ａは、目的のプラスミドｐ　Ｌ　Ｐ（ＧＴ）ｃａｔの別
法による構築物（この構築物はプラスミドｐＢ　Ｌ　（
Ｇ　Ｔ　）ｃａｔ△Ｂｇｌ＋１　／　Ｍ　ｓ　ｔ　Ｉ　
Ｉと称する）からなっていた。ｐＢＬ（ＧＴ）ｃａｔか
らの〜４８０ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ／Ｍｓｔｌ１７５グメン
トの欠失によってＢＫエンハンサ−が除去されるが、こ
れを実施例５ＡにおいてプラスミドｐＬＰｃａｔにライ
ゲートしてプラスミドｐＢＬｃａｔを創製する。
実施例５　プラスミドｐＢＬｃａｔおよびｐＢＬ（ＧＴ
　）ｃａｔの構築 Ａ、プラスミドｐＢＬｃａＬの構築 １０ＸのＡｃｃ！緩衝液（７，５μの、ｄｌ−１，０（
３０μ１２）、および制限酵素Ａｃｃｌ（１５ｕ１２；
約７５単位）に、ＴＥ緩衝液（５０μの中のプラスミド
ｐＢＫｎｅ。
ＩＤＮＡ（約８８μｇ）を加え、得られた反応液を３７
℃で２時間インキコベートした。Ａｃｃｌ消化したＢＫ
ウィルスＤＮＡをアガロースゲルにかけ、ＢＫエンハン
サ−を含有する〜１．４ｋｂフラグメントを他の消化産
物から分離した。次いで、実施例４Ａ記載の方法に実質
的に従って、〜１．４ｋｂＡｃｃ！制限フラグメントを
単離した。このフラグメント（約５μ９）を、ＩＱＸ　
　Ｐｖｕｌｌ緩衝１（５μ０、ｄＨ，０（４５ｕ（１）
、および制限酵素Ｐｖｕｌ！（５μ＆；約２５単位）中
に再懸濁し、得られた反応液を３７℃で２時間インキュ
ベートした。次いで、実質的に実施例４Ａの方法に従っ
て、Ｐｖｕｌｌｆ’ｌ化したＤＮＡをライゲーション用
に単離し、調製した。
所望の〜１．２８ｋｂ　ＡｃｃＩ−Ｐｖｕｌｌフラグメ
ントが約２μ９得られ、これをＴＥ緩衝液（５μＱ）に
溶解した。
プラスミドｐＬＰｃａｔ　ＤＮＡ（約１μｇ）を、１０
ＸのＡｃｃｌ緩衝液（５ｕｃ）およびｄＨ、Ｏ（４０ａ
Ｑ）に溶解した。制限酵素Ａｃｃｌ（５μＱ；約２５単
位）をプラスミドｐＬＰｃａｔ　ＤＮＡの溶液に加え、
得られた反応液を３７℃でインキュベートした。Ａｃｃ
Ｉ消化したプラスミドｐＬＰｃａｔＤＮＡをエタノール
テ沈澱させ、１ＱＸｓｔｕｌ緩衝液（５μＣ）、ｄ　Ｈ
ｘ　Ｏ（４０μ１２）、および制限酵素５ｔｕｌ（５μ
１２；約２５単位）中に再懸濁し、得られた反応液を３
７°Ｃで２時間インキュベートした。Ａｃｃｌ　−３ｔ
ｕＩ消化したプラスミドＰＬＰｃａｔ　ＤＮＡをエタノ
ールで数回沈澱させて、他の消化産物（大きさが約１６
ｂｐの制限フラグメント）を含まない、大腸菌の複製起
源およびＡｄ２後期プロモーターを含有する〜４．８１
ｋｂ　Ａｃｃｌ　−３ｔｕ［制限フラグメントを精うｌ
した。所望の〜４．８１ｋｂ制限フラグメントが約１μ
９得られ、これをＴ　Ｅ　ｒ＆　ｉ！Ｊｉｉｆｆｌ　（
２０μのに溶解した。
プラスミドｐＬＰｃａｔの〜４．８１ｋｂ　Ａｃｃｌ−
３ｔｕＩ制限フラグメント（５μａ＞を、ＢＫウィルス
の〜１．２８ｋｂ　Ａｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメ
ント（５ｐのに加えた。このＤＮＡ混合物に、１０Ｘリ
ガーゼ１麦衝１夜（３μＱ）、ｄＨ，０（１５μσ）、
およびＴ４ＤＮＡリガーセ（２μＱ；約１０００単位）
を加えた後、得られたライゲーション反応液を１６℃で
一夜インキユベートした。このライゲートしたＤＮＡは
所望のプラスミドｐＢＬｃａｔからなっていた。
実施例３記載の方法に実質的に従い、このライゲート化
ＤＮＡを用いて大腸菌Ｋ１２　ＨＢＩＯ１細胞を形質転
換した。プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって、大
腸菌Ｋ１２ＨＢ１０１．／ｐＢＬｃａｔ形質転換体を同
定した。実質的に実施例３の方法に従って、後の構築に
用いるためにプラスミド１）ＢＬｃａｔ　ＤＮＡを調製
した。
Ｂ、プラスミドｐＢ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔの構築実
質的に実施例４Ｂ、ｌの方法に従って、ｄＨ。
０（３０μの中の実施例１で調製したポリーＧＴ要素（
約ｌμｇ）をＸｈｏｌで消化した。実質的に実施例４Ｂ
、１の方法に従って、ＴＥ緩衝液（１０μｇ）中のプラ
スミドｐＢＬｃａｔ　ＤＮＡ（約２３μｇ）をＸｈ。
■で消化し、ホスファターゼ処理した。実質的に実施例
４Ｂ、１の方法に従って、Ｘｈｏｌ消化したホスファタ
ーゼ処理プラスミドｐＢＬｃａｔ　ＤＮＡとＸｈｏｌ消
化ポリ−ＧＴ要素をライゲートした。
ライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミドｐＢＬ（ＧＴ
　）ｃａｔからなっていた。プラスミドｐＢＬ（ＧＴ）
ｃａｔの制限部位および機能地図を添付の第５図に示す
。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化ＤＮＡ
を用いて、大腸菌に１２　ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を、５０μ９／ＩＩ（１アンピシリン
含有のし寒天で平板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵
素分析を用いて、大腸菌に１２　ＨＢ　１０１／ｐＢ　
Ｌ（ＧＴ）ｃａｔ形質転換体を同定した。実質的に実施
例３に記載のプラスミドの１ｉ’ｉ（４方法に従って、
形質転換体からプラスミドｐＢＬ（ＧＴ）ｃａｔ　ＤＮ
Ａを単離した。
Ｉｊ裡Ｍ６　　プラスミドｐＳ　Ｂ　Ｌｃａｔおよびｐ
ｓ　Ｂ　Ｌ（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔの構築 Ａ、プラスミドｐＳ　Ｂ　Ｌｅａｔの１Ｍ築プラスミド
ｐＢＬｃａｔ　ＤＮＡ（約ｌＯＯμ９）を、１０　Ｘ　
Ｈ１ｎｄｌｌｌ緩衝液［０，５Ｍ　ＮａＣ１２；　０．
　ＩＭ）’）　ス−ＨＣＲ（ｐＨ８，０）；　Ｏ，ＩＭ
　ＭｇＣ１２２；および１Ｍ９／酎ＢＳＡコ（１０Ａｔ
（りおよびｄＨ，０（８０μＱ）に溶解した。制限酵素
）ｉｉｎｄｌｌｌ（約１０μｅ約１００単位）をプラス
ミドｐＢＬ、ｃａｔ　ＤＮＡ溶液に加え、得られた反応
液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。ＢＫエンハ
ンサ−およびＡｄ２の後期プロモーターを含む〜０．８
７　ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントが他の消化
産物から充分に分離されるまで）（ｉｎｄｌｌｌ消化プ
ラスミドｐＢＬｃａｔ　ＤＮＡを１％アガロースゲル電
気泳動にかけ、次いで、実質的に実施例４Ａの方法に従
って、〜０．８７ｋｂフラグメントを単離し、ライゲー
ション用に調製した。目的のフラグメントか約１０ｕ９
得られ、ＴＥ緩衝樹液０μｇに溶解した。
ＴＥ緩衝１ｆｆｌ（ｌμ１２）中のプラスミドｐＳＶ２
ｃａｔＤＮＡ（約１μｇ）を、ｌ　ＯＸ　Ｈ１ｎｄｌｌ
ｌ緩衝液（２ｕ（りおよびｄＨ、ｏ　（１６μＱ）に溶
解した。制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ（ｌμｆ！；約１０単
位）をＤ　Ｎ　Ａ溶液に加え、得られた反応液を３７°
Ｃで２時間インキュベートした。反応混合物を、まずフ
ェノールで、次にクロロホルムで２回抽出することによ
って、反応を停止させた。Ｈｉｎｄｌｌｌｉｉ′１化の
プラスミドｐＳ　Ｖ　２ｃａｔＤＮＡをエタノールで沈
澱させ、Ｔ　Ｅ　ｕ　？！＋液（１００μｇ）に再懸濁
させた。実質的に実施例４Ｂの方法に従って、Ｈｉｎｄ
ｌｌｌ消化プラスミドｐｓｖ２ｃａｔＤＮＡを、ウシ腸
アルカリホスファターゼで処理し、ＴＥ緩衝液（１０μ
ｇ）に再懸濁させた。
プラスミドｐＢＬｃａｔの〜０．８７ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ制限フラグメント（約５μｅ）をＨｉｎｄｌｔｌ消
化のプラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔ（１０μ０に加え
、次いで１０　Ｘ　！Ｊガーゼ緩衝液（３μＱ、）、Ｔ
４　　ＤＮＡリガーゼ（２μＱ；約１０００単位）、お
よびｄＨｔｏ　（１３ｕＱ）を、ＤＮＡ溶液に加え、得
られた反応液を１６°Ｃて２時間インキュベートした。
ライゲートしたＤＮＡは、目的のプラスミドｐｓＢＬｃ
ａｔからなっていた。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化ＤＮＡ
を用いて、大腸菌に１２ＨＢ１０１を形質転換した。形
質転換細胞を、アンピシリン含有の■、−寒天において
平板培養し、アンピシリン耐性形質転換体のプラスミド
ＤＮＡを制限酵素分析によって試験して大腸菌Ｋ　１２
　ＨＢ　１０１／ｐＳＢＬｃａｔ形質転換体を同定した
。ＢＫエンハンサ−およびΔｄ２の後期プロモーターを
コードしている〜０．８７ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ制限フ
ラグメントは、Ｈｉｎｄｌｌｌ消化プラスミドｐｓＢＬ
ｃａｔに、２つの配向のうちのどちらかで挿入されてい
る（どちらか一方だけがプラスミドｐＳ　Ｂ　Ｌｃａｔ
を生じる）。
Ｂ、プラスミドｐＳ　Ｂ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔの構
築実質的に実施例４Ｂ川の方法に従って、ＢＫエンハン
サ−とＡｄ２の後期プロモーターの間にある、プラスミ
ドｐＳ　Ｂ　Ｌｃａｔの唯一のＸｈｏ１部位にポリーＧ
Ｔ要素を挿入する。Ｘｈｏｌ消化のポリーＧＴ要素およ
びＸｈｏｌ消化のプラスミドｐＳＢＬｃａｔＤＮへをラ
イゲートする。ライゲートしたＤＮ　Ａは、目的のプラ
スミドｐＳ　Ｂ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔからなってい
る。プラスミドｐＳ　Ｂ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔの制
限部位および機能地図を添付の第６図に示す。
実施例７　プラスミドｐＬ１３３の構築Ａ、中間体プラ
スミドｐｓＶ２−ＨＰＣ８の構築プラスミドｐＨＣ７は
ヒトプロティンＣをコードしているＤＮＡ配列を含有し
ている。１５μｇ／Ｘｇテトラサイクリン含有のしブロ
ス（ｌのに大腸菌に１２　ＲＲＩ／ｐＨＣ７（ＮＲＲＬ
　Ｂ−１５９２６，１９８５年１月２９日寄託）の培養
物を接種し、実質的に実施例３の方法に従ってプラスミ
ドｐＨＣ７ＤＮＡを単離し、精製した。この操作により
約１ｙ９のプラスミドｐ）ＩＣ７ＤＮＡが得られ、これ
をＴＥ緩衝液（ＩＩρ）に懸濁し１、−２０’Ｃで保存
した。プラスミドｐＨＣ７の制限部位および機能地図を
添付の第７図に示す。
ブーｔスミＦｐＨＣ７ＤＮＡ（５０μｆ２）を、制限酵
素Ｂａｎ１（５μに約５０単位）、ＩＯＸのＢａｎ１反
応緩衝液［１，５Ｍ　Ｎａ１Ｊ！；　６０ｍＭｈリスー
ＨＣ＆（ｐＨ７，９）：　６０ｍＭ　ＭｇＣｆ２２；お
よびｌ巧／肩ＱＢＳＡコ（１０μＩ２）およびｄＨ，ｏ
（３５μのと混合し、消化が完結するまでインキュベー
トした。次いで、〜１．２５ｋｂ　Ｂａｎ■制限フラグ
メントが他の消化産物から分離するまで、このＢａｎ１
？ｔｎ化したプラスミドｐＨＣ７ＤＮＡを３．５％ポリ
アクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルア
ミド−２９：　ｌ）電気泳動にかけた。
コノ〜ｉ、　２５ｋｂ　Ｂａｎ１　制限フラグメントを
含有するゲル部分をゲルから切り出し、試験管に入れ、
小さいフラグメントに破砕した。このフラグメントを含
有する試験管に抽出緩衝液［５００ｍＭ酢酸アンモニウ
ム：１０ｍＭ０ｍＭ酢酸マグネ／ラム　ＥＤＴＡ　；　
Ｊ％ＳＤＳ、およびｆｏｚｇ／ｘ（！ｔＲＮＡ］（ｌ肩
Ｑ）を加え、試験管を３７°Ｃに一夜１♀った。遠心し
て残骸をペレット化し、上清を新しい試験管に移した。
残骸を抽出緩衝液（２００μＱ）で１回洗浄し、洗浄液
の上清を、最初の、夜抽出物からの上清といっしょにし
た。この上ｃＲをガラスウールのプラグに通した後、２
倍量のエタノールを加え、混合した。得られた溶液を〜
ｌＯ分間ドライアイスーエタノール浴に入れ、次いで遠
心してＤＮＡをペレット化した。
この操作により約８μ９の〜１．２５ｋｂＢａｎｌ制限
フラグメントが得られた。この精製フラグメントをＴＥ
緩衝液（ｌｏμ６）に懸濁し、−２０°Ｃで保存した。
プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣＢを構築するためには、リ
ンカ−の付加によってＢａｎ１制限フラグメントを修飾
しなければならなかった。実質的に実施例１記載の方法
に従ってリンカ−の構築に用いるＤＮＡフラグメントを
合成した。
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（約０．５μａ；１５単
位）、ＩＯＸ　　リガーゼ緩衝液（２μｌ！＞、５００
μＭＡＴＰ（ＩＱμの、およびｄｔ−ｔ、ｏ（７，５μ
ｍ２）を含む反応緩衝液（２０μＱ）中で、合成した１
本鎖リンカ−のそれぞれ５００ピコモル（ｐＭ）をキナ
ーゼ処理した。このキナーゼ反応液を３７°Ｃで３０分
間インキユベートシ、次いで１００℃で１０分間インキ
ュベートして反応を止めた。キナーゼ化を完全にするた
め、反応液を水上で冷却し、反応混合物に０．２Ｍ　Ｄ
ＤＴ（２μＱ）、５ｍＭＡＴＰ（２，５μＩ２）、およ
びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１５単位）を加えて
ｌし、この反応混合物を３７°Ｃでさらに３０分間イン
キュベートした。１００°Ｃでさらに１０分間インキュ
ベートすることによって反応を止め、次いで水上で冷却
した。
キナーゼ処理は別々に行ったが、キナーゼ反応後、２種
類の１本鎖ＤＮＡリンカ−を混合した。
これらの鎖をアニールするため、キナーゼ反応混合物を
、約１５０ｆｆ１２の水を入れた水浴中、１００℃で１
０分間インキュベートした。インキュベーション後、水
浴の加熱を止め、室温まで冷却した。
この過程に約３時間かかった。次いで、キナーゼ処理し
たＤＮＡの試験管を入れたまま水浴を４°Ｃで一夜イン
キユベートした。この操作により１本鎖がアニールされ
た。作成したリンカ−は以下の構造を有していた： このリンカ−を使用時まで一２０℃で保存した。
〜１．２５ｋｂ　Ｂａｎ１フラグメント（約８　μｙ）
を、リンカ−（〜５０μｅ；約５００ｐＭ）、Ｔ４　　
ＤＮＡリガーゼ（ｌμＱ；約５００単位）、ＩＯＸリガ
ーゼ綬衝液樹液０μＱ）、およびｄＨ，ｏ（２９μｇ）
に加えて混合し、得られたライゲージジン反応液を４°
Ｃで一夜インキユベートした。６５°Ｃで１０分間イン
キュベートすることによってライゲーション反応を止め
た。最終濃度が０．３Ｍとなるように酢酸ナトリウムを
加え、２倍量のエタノールを加え、ドライアイス−エタ
ノール浴で冷却し、そしてこの溶液を遠心することによ
ってＤＮＡをペレット化した。
このＤＮＡペレットを、ＩＯＸのＡｐａ１反応緩衝液［
６０ｍＭ　ＮａＣｆ２；　６０＋ｎＭ　トリス−ＨＣ＆
（ｐＨ７，４）；　６０ｆｆ＋Ｍ　ＭｇＣＬ；および６
０　ｍＭ（７）　２−メルカプトエタノール］（１０μ
ｍ２）、制御ａ酵ｘ　Ａ　ｐａｌ（５μＣ；約５０単位
）およびｄＨｔｏ（８５μｍ２）に溶解し、反応液を３
７°Ｃで２時間保った。次いで上記のようにして反応を
止め、ＤＮＡをペレット化した。このＤＮＡぺＬ／　ノ
ドを、ＩＯＸのＨｉｎｄ［ｌ１反応緩衝液（ｌｏｕ＆）
、制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌｌ（５μ＆　：約５０中位）お
よびｄＨ，ｏ（８５μのに溶解し、反応液を３７°Ｃで
２時間保った。Ｈｉｎｄｌｌｌ消化後、実質的に実施例
４Ａに記載の方法に従って、反応混合物を３．５％ポリ
アクリルアミドゲルにかけ、目的の〜１．２３ｋｂ　Ｈ
ｉｎｄ！ＩＩ−Ａｐａｒ制限フラグメントを単離した。
目的のフラグメントが約５μ９得られ、これをＴＥ緩衝
液（１０μＱ）に懸濁し、２０°Ｃで保存した。
プラスミドｐｉ−１ｃ７　　ＤＮＡ（５０μＱ）を、制
限酵素Ｐｓｔｌ（５ｕ１２；約５０単位）、ＩＯＸ　Ｐ
ｓｔ１反応緩衝液［１，ＯＭ　ＮａＣＱ；　ｌ　００ｍ
Ｍ　トリス−ＨＣＣ（ｐＨ７−５）　；　ｌ　ＯＯｍＭ
　ＭｇＣＱｔ　；およびｌａｙ／肩ｆｆＢｓＡ］（１０
μＱ）およびｄＨ，ｏ（３５μρ）と混合し、３７°Ｃ
で２時間インキユヘートした。次いで、実質的に上記記
載の方法に従って、Ｐｓｔｌ消化したプラスミドｐＨＣ
７ＤＮＡを、３，５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけ、目的の〜０．８８ｋｂフラグメントを精製した
。目的のフラグメントが約５μ９得られ、これをＴＥ　
ｆｉｂ　？ｈ液（１０μＱ）に懸濁し、−２０°Ｃで保
存した。
この〜０．８８　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉフラグメント（約５
　ｕｙ）を、実施例１に記載の自動ＤＮＡ合成機で作成
した以下のリンカ−（約５０μＱ）に加えて混合した：
このＤＮＡ混合物に、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（約ｌμ
ｑ；約１０単位）、ＩＯＸのりガーゼ緩衝液（１０μの
、およびｄＨ，０（２９μｇ）を加え、得られたライゲ
ーション反応液を４°Ｃで一夜インキユベートした。
このライゲーション反応を、６５°Ｃで１０分間インキ
ュベートすることによって止めた。ライゲート化たＤＮ
Ａを沈澱させた後、ＤＮＡベレットをＩＯＸのＡｐａ１
反応緩衝液（１０μの、制限酵素Ａｐａ！（５μ（２；
約５０単位）およびｄＨ、Ｏ（８５μ（りに溶解し、反
応液を３７°Ｃで２時間保った。次いでもう一度反応を
止め、ＤＮＡをペレット化した。
このＤＮＡベレットを、ＩＯＸのＢｇｌｌ＋反応緩衝液
［ＩＭ　ＮａＣｆ！：　１００ｍＭ　トリフ、　−ＨＣ
ｆ２（ｐＨ７４）：　Ｉ　００ｍＭ　ＭｇＣ（ｈ：　ｌ
　００ｍＭ　　２−メルカブトエタ／−ル；および１１
１９／酎ＢＳＡ］（１０μＱ）、ｆｆ（１限ｆｉ？ｉＢ
ｇｌｌｌ（５ｕ（！　；約５０単位）およびｄＨ，○（
８５μＱ）に溶解し、反応液を３７°Ｃで２時間保った
。８ｇｌ１１消化の後、実質的に上記の方法に従って、
反応混合物を３．５％ポリアクリルアミドケルにかけ、
目的の〜Ｏ，Ｉ　９ｋｂ　Ａｐａｌ　−８ｇｌｌｌ制限
フラグメントを単離した。目的のフラグメントが約１μ
７得られ、これをＴＥ緩衝液（１０μＩ２）に懸濁し、
−２０°Ｃで保存した。
公的に入手可能なプラスミドｐＳＶ２ｇｐｔＤＮＡ（Ａ
ＴＣＣ３７１４５）（約ｌＯμＬｉ）を、ｌｏＸＨｉｎ
ｄｌｌｌ反応緩衝液（１０μ１２）、制限酵素Ｈｉｎｄ
ｌｌｌ（５ｕ（！；約５０単位）およびｄＨｔｏ（８５
μ（りに溶解し、反応液を３７℃で２時間作った。次い
でこの反応混合物を、酢酸ナトリウムが０．２５Ｍとな
るようにし、２倍量のエタノールを加えてドライアイス
−エタノール浴でインキュベートした後、遠心してＤＮ
Ａをペレット化した。このＤＮＡベレットを、ＩＯＸ　
８ｇｌｌｌ緩衝液（１０μの、制限酵素Ｂｇ１１１（５
μ＆；約５０単位）およびｄＨ，０（８５μＱ）と混合
し、反応液を３７℃で２時間保った。
Ｂｇ＋ｌＩｉｔＭ化の後、反応混合物を１％のアガロー
スゲルにかけ、電気泳動してフラグメントを分離した。
ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で見える
ようにし、目的の〜５．　ｌｋｂ　ＨｉｎｄｌｌｌＢｇ
ｌ１１フラグメントを含有するバンドをゲルから切り出
し、これを透析管に入れ、ＤＮＡがアガロースから溶出
してしまうまで電気泳動を続けた。
透析管からのＤＮＡ含有緩衝液をフェノールおよびクロ
ロホルムで抽出し、次いでＤＮＡをエタノール沈澱させ
た。このベレットは目的のプラスミドｐＳＶ２ｇｐｔの
〜５．　ｌｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−８ｇｌｌｌ制限フラ
グメント（約５ｕ９）からなり、これをＴＥ緩衝液（１
０μｍ２）に再懸濁した。
〜１．２３ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ａｐａｌルミｌ制限
フラグメントの、〜０．　ｌ　９ｋｂ　Ａｐａｌ−８ｇ
ｌｌｌフラグメント（３μｉ２）、および〜５．　ｌｋ
ｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−８ｇｌｌｌフラグメント（２μｇ
）を混合し、次いで、ｌＯｘリガーゼ緩衝液（１０μの
、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（１μＱ；約５００単位）、
およびｄＨ，０（８２μのとともに１６°Ｃで一夜イン
キユベートした。このライゲートしたＤＮＡは目的のプ
ラスミドルＳ　ｖ　２０　Ｐ　Ｃ８からなっていた。こ
のプラスミドの制限部位および機能地図を添付の第７図
に示す。
大腸菌Ｋ１２　　ＲＲＩ（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５２１０
，１９８２年１０月１９０寄託）細胞を、実質的に実施
例３に記載の方法に従い、形質転換用にコンピテントに
した。上記調製のライゲート化ＤＮＡを用いてこの細胞
を形質転換した。形質転換混合物の一部を、１００μ９
／ｘ（ｌアンピシリン含有のＬ−寒天プレートで平板培
養した。次いで、このプレートを３７°Ｃでインキュベ
ートした。プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって大
腸菌Ｋ１２ＲＲ１／ｐＳＶ２−ＨＰＣ３形質転換体を確
認した。
Ｂ、プラスミドｐＬ１３３の最終的な構築プラスミドｐ
ＳＶ２−ＨＰＣ８（５０μ９）を、１０ｘのＨｉｎｄｌ
ｌ１反応緩衝液（１０ｕ（１’）、制限酵素Ｈ１ｎｄｌ
ｌ！（５１１Ｑ　：約５０単位）およびｄＨ，Ｏ（８５
μのに溶解し、反応液を３７℃で２時間インキュベート
した。Ｈｉｎｄｌｌｌ＃化の後、ＤＮＡを沈澱させ、そ
のＤＮＡペレットをＩＯＸ　５μｌ１反応緩衝液［１，
５Ｍ　ＮａＣＱ；　６０ｍＭ　トリス−ＨＣ＆（ｐＨ７
，９）；　６０ｍＭ　ＭｇＣＣ，；　６０ｍＭ　　２−
メルカプトエタノール：および１λ９／ＲＱ　Ｂ　Ｓ　
Ａ］（１０μｆ２）、制限酵素５ａｌｌ（５μｆｆ：約
５０単位）およびｄＨ，０（８５μｇ）に溶解した。得
られた５μｌ１反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュ
ベートした。次に、目的の〜０．２９　ｋｂ　Ｈ１ｎｄ
ｌｌｌ　−Ｓ　ａｔ　Ｉ制限フラグメントが他の反応生
成物から分離するまで、このＨ１ｎｄｌｌｌ　−Ｓ　ａ
ｌ　Ｉ消化したプラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８を３．５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。実質的に
上記入に記載の方法に従って、目的のフラグメントをゲ
ルから分離した。このフラグメントが約２ｕｇ得られ、
これをＴＥ緩衝液（１０μ１２）に懸濁した。
ブラフ、ミｌ’ｐｓＶ２−ＨＰＣ８（５０μ９）を、１
０Ｘ　Ｂｇｌｌ１反応緩衝液（ｔＯμの、制限酵素Ｂｇ
１１１（５μＣ；約５０単位）、およびｄＨ＊ｏ（８５
μのに溶解し、反応液を３７°Ｃで２時間インキュベー
トした。Ｂｇｌｌ＋消化の後、ＤＮＡを沈澱させ、その
ＤＮＡペレットをＩＱＸ　５μｆｆ反応緩衝液（１０μ
Ｑ）、制限酵素（５μＱ；約５０単位）、およびｄＨ２
０（８５μＱ）に溶解した。得られたＳ　ａｌ１反応反
応物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。目的の〜
１．　ｌ　５ｋｂ　Ｓａｌｔ−８ｇｌｌｌ制限フラグメ
ントが他の反応生成物から分離するまで、このＳａｌｌ
−Ｂｇｌｌ＋消化プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣＢを３．
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。実質的
に上記Ａに記載の方法に従って、〜１．１５ｋｂ　Ｓａ
ｌｌ−８ｇｌｌｌ制限フラグメントをゲルから分離して
約８μ嘗のフラグメントを得、これをＴＥ緩衛液（１０
μｇ）に懸濁させた。
プラスミドｐｓｖ２−β−グロビンＤ　Ｎ　Ａ　（ＮＲ
ＲＬ　　Ｂ−１５９２８，１９８５年１月２９日寄託）
（約１０μ９）を、ＩＯＸのＨｉｎｄｌｌ１反応緩衝液
（１０ｕｆｆ）、制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌｌ（５μ（２；
約５０単位）およびｄ　Ｈｔ　Ｏ（８５ｄ）　ニ溶解し
、反応液を３７°Ｃテ２時間保った。次いでこの反応混
合物を、酢酸ナトリウムが０．２５Ｍとなるようにし、
２倍量のエタノールを加えてドライアイス−エタノール
浴でインキュベートした後、遠心してＤＮＡをベレット
化した。このＨｉｎｄｌｌｒ消化したプラスミドｐＳＶ
２−９−グｏビアＤＮＡを、ＩＯＸ　　Ｂｇｌｌｌ緩ｉ
ｉ＆（１０μ（り、制限酵素Ｂｇ＋１ｌ（５ｕ１２；約
５０単位）およびｄＨ，ｏ（８５μｇ）と混合し、反応
液を３７℃で２時間保った。Ｂｇ目１消化の後、反応混
合物を１％のアガロースゲルにかけ、電気泳動によって
フラグメントを分離した。実質的に実施例４Ａに記載の
方法に従って、目的の〜４．２ｋｂＨｉｎｄ１１１−Ｂ
ｇｌｌｌ制限フラグメントをゲルから分離して約５μ９
の目的フラグメントを得、これをＴＥ緩衝液（１０μの
に懸濁させた。
”ｊラスミ）’ｐＳＶ２−ＨＰＣ８（７）〜０．２９ｋ
ｂＨ１ｎｄｆｌｌ　−Ｓ　ａｌ　Ｉフラグメント（２μ
ρ）、プラスミドｐｓＶ２−ＨＰＣ８の〜１．１５ｋｂ
　　５ａｌｌ’−８ｇｌｌｌフラグメント（２μＱ）、
およびプラスミドＩ）ＳＶ２−β−グロビンの〜４．２
ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−８ｇｌｌｌフラグメント（２μ
ｌ）を混合し、実質的に上記Ａの方法に従ってライゲー
トした。このライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミド
ｐＬ１３３からなっていた。このプラスミドｐＬ１３３
の制限部位および機能地図を添付の第７図に示す。形質
転換するＤＮＡとして、プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣＢ
のかわりにプラスミドｐＬ１３３を用いること以外は、
実質的にへの教示に従って、目的の大腸菌ＫＩ２　　Ｒ
ＲＩ／ｐＬ１３３形質転換体を作成した。
実施例８プラスミドｐＬＰＣおよびｐＬＰＣ（ＧＴ）の
構築 Ａ、プラスミドｐＬＰＣの構築 実施例５Ａで調製したプラスミドｐＢＬｃａｔＤＮＡ（
約２０ｕｙ）を、ｌ　ＯＸ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ緩衝液（１
０μＱ）およびｄｘ−ｉ２ｏ（８０μＩ２）に溶解した
。このプラスミドｐＢＬｃａｔ　ＤＮＡ溶液に制限酵素
Ｈｉｎｄｌｌｌ（約１０μρ；約１００単位）を加え、
得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした
。次いで、ＢＫエンハンサ−およびＡｄ２後期プロ（−
一夕−を含有する〜０．８７　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ制
限フラグメントが曲の消化産物から分離するまで、この
ＨｉｎｄＩＩ肖化したプラスミドｐＢＬｃａｔ　ＤＮＡ
を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、次いで、実質的
に実施例４Ａの方法に従って、〜０．８７ｋｂフラグメ
ントを単離し、ライゲーション用に調製した。
目的のフラグメントが約２ｕ９得られ、これをＴＥ緩衝
液（５μＱ）に溶解した。
実施例７で調製したプラスミドｐＬ１３３ＤＮＡ（約１
．５μｇ）を、１０　Ｘ　Ｈ１ｎｄｌｌ！緩衝液（２１
）およびｄｔ−（、○（１６μＱ）に溶解した。このＤ
ＮＡ溶液に制限酵素）１ｉｎｄｌｌｌ（約１μに約１０
単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間イン
キユベートシた。次いで、このＤＮＡをＴＥ緩衝液で１
００μＱまで希釈し、実質的に実施例３記載の方法に従
って、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。この
Ｈｉｎｄｌｌｌｉ肖化のプラスミドｐＬ１３３ＤＮＡを
フェノールで２回、クロロホルムで１回抽出し、エタ／
−ルで沈澱させ、ＴＥ緩衝液（１０μＱ）に再懸濁した
。
プラスミドｐＢＬｃａｔの〜０．８７ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ制限フラグメント（約５μｇ）を、Ｈｉｎｄｌｌ！
消化したプラスミドｐＬ１３３（１，５μのに加え、次
いでこのＤＮＡ溶液に、ＩＯＸリガーセ緩面液（１μの
、Ｔ４ＤＮＡＩＩガーセ（１μＣ；約１０００単位）、
およびｄＨ，ｏ（１，５μＱ）を加え、得られた反応液
を１６°Ｃで一夜インキユベートした。このライケート
したＤＮＡは目的のプラスミドｐＬＰＣからなっていた
。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例３の方
法に従って大腸菌Ｋ１２　）（Ｂｌｏｔを形質転換した
。形質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平板培
養し、制限酵素分析によってアンビンリン耐性形質転換
体のプラスミドＤＮＡを試験して、大腸菌Ｋ　］　２　
　ＨＢ　１０１／ｐｔ、ｐｃ形質転換体を同定した。Ｂ
Ｋエンハンサ−およびＡｄ２後期プロモーターをコード
している〜０，８７　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグ
メントは、Ｈｉｎｄｌｌ！消化したプラスミドｐＬ１３
３中に、２つの配向のうちのどちらかで挿入されている
（どちらか一方だけがプラスミドｐＬＰＣを生じる）。
目的のプラスミドｐＬＰＣ（ＧＴ）を得るために、構築
においてプラスミドｐＢＬｃａｔの〜０．８７ｋｂＨｉ
ｎｄｌｌｌフラグメントの代わりにプラスミドｐＢＬ　
（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔの〜０．９３　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌ［
Ｉフラグメントを用いる以外は、上記Ａと同様の方法で
プラスミドｐＬＰＣ（ＧＴ）を調製した。ＢＫエンハン
サ−、ポリーＧＴ要素およびＡｄ２後期プロモーターを
コードしている〜０　、９３　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ制
限フラグメントは、Ｈｉｎｄｌｌｌ消化プラスミドｐＬ
１３３中に、２つの配向のうちどちらかで挿入すること
かできる［どちらか一方だけがプラスミドｐＬＰＣ（Ｇ
Ｔ）を生じる］。プラスミドｐＬＰＣ（ＧＴ）の制限部
位および機能地図を添付の第８図に示す。
プラスミドｐｉ、ｐｃおよびｐＬＰＣ（ＧＴ）の唯一の
相違点は、プラスミドｐＬＰＣ（ＧＴ）にポリー〇Ｔ要
素が存在していることである。
別法によれば、実質的に実施例４Ｂ、１の方法ニ従って
、ＢＫエンハンサ−とＡｄ２後期プロモーターの間にあ
る、プラスミドｐＬＰＣの唯一のＸｈｏ１部位にポリー
ＧＴ要素を挿入することによってプラスミドｐＬＰＣ（
ＧＴ）を調製する。
衷奥形プラスミドｐＬＰＣ４、ｐＬＰＣ５、ｐｔ、　ｌ
：）　Ｃ４，（、Ｇ　Ｔ）およびｐＬＰＣ５（ＧＴ）の
構築Ａ、プラスミドｐｔ、ｐｃ４およびｐＬＰＣ５の構
築実施例２で調製したＢＫウィルスＤＮＡ（約１μ９．
１μｍ２）および実施例８Ａで調製したプラスミドｐＬ
ＰＣ（Ｊμｌ　Ｌμのを、ｌ０ＸＥｃｏＲＩ緩衝液［１
，０Ｍト＋７スーＨＣ（（ｐＨ７，５）；　０．５ＭＮ
ａＣ１２　：　５０ｍＭ　ＭｇＣ（２：およびＩ　ｍ９
／　ｘ（ｌ　Ｂ　ＳＡ］（２μＩ２）およびｃｕ］、０
（１４μＱ）に溶解した。制限酵素ＥｃｏＲｌ　（２μ
ρ；約１０単位）をＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液
を３７°Ｃで２時間インキュベートした。ＥｃｏＲ［ｃ
白化した、ＢＫウィルスとプラスミドｐＬＰＣＤＮＡの
混合物を緩衝化フェノールで１回、およびクロロホルム
で１回抽出シた。次いで、ＮａＣ（ｌンａ度を０．２５
Ｍに調整し、２漬けのフェノールを加え、この溶液をド
ライアイス−エタノール浴で２分間インキュベートし、
この溶液を遠心してＤＮＡをペレット化することによっ
てＤ　Ｎ　Ａを集めた。上清を廃棄し、ＤＮＡペレット
を７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＴＥ緩衝液１２
μＱに再懸濁した。
ｄＨ，０（約１３μｍ２）およびＩＯＸリガーゼ緩衝液
（３ｕＱ）を、ＥｃｏＲＩ消化した、ＢＫウィルスとプ
ラスミドｐＬＰＣＤＮＡの混合物に加えた。Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（２μｇ；約１００単位）をＤＮＡ溶液に加え
、得られた反応液を１６°Ｃで２時間インキュベートし
た。ライゲートしたＤＮＡは、目的のプラスミドｐＬＰ
Ｃ４およびｐＬＰＣ５（挿入されたＢＫウィルスＤＮＡ
の配向だけが異なる）からなっていた。
ライゲートしたＤＮＡは、目的のｐＬＰＣ４およびｐＬ
、ＰＯ２からなっており、実質的に実施例３の方法に従
って、これを用いて大腸菌Ｋ１２ＨＢＩＯＩコンピテン
ト細胞を形質転換した。形質転換細胞をｌＯＯμ９／峠
アンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養した。大腸菌に
１２　ＨＢＩＱ１／ｐＬ　Ｐ　Ｃ４オヨヒ大腸ｍＫ１２
　ＨＢＩＯＩ／ｐＬＰＣ５形質転換体を、そのアンピシ
リン耐性表現型およびそのプラスミドＤＮＡの制限酵素
分析によって同定した。
Ｂ、プラスミドｐｔ、ｐｃ４（ｃ”ｒ）およびｐＬＰＣ
５（ＧＴ）の構築 プラスミドｐＬＰＣの代わりに、実施例８Ｂで調製した
プラスミドｐＬＰＣ（ＧＴ）を構築に用いる以外は、ｐ
ＬＰＣ４およびｐＬＰＣ５に関する上記へと同じ方法で
プラスミドｐＬＰＣ４（ＧＴ）およびｐＬＰＣ５（ＧＴ
）を調製する。別に、実質的に実施例４Ｂ、１の方法に
従って、各々、プラスミドｐＬ、ＰＣ４およびｐＬＰＣ
５の唯一のＸｈｏ１部位にポリーＧＴ要素を挿入するこ
とによって、プラスミドｐＬＰＣ４（ＧＴ）およびｐＬ
Ｐ、Ｃ３（ＧＴ）を調製する。プラスミドｐＬＰＣ４（
ＧＴ）の制限部位および機能地図を添付の第９図に示す
。
（以下、余白） 実施例１０　プラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ　１、ｐｔ
、ｐｃｈｙｇ　２、ｐＬＰｃｈｙｇ１（ＧＴ）およびｐ
ＬＰＣｂｙｇ２（ＧＴ）の構築 Ａ、プラスミドｐＬＰｃｂｙｇｌおよびｐＬＰＣｈｙｇ
２ｑ通困 大腸菌Ｋ　１２　　ＲＲ１／ｐＳ　Ｖ　２ｈｙｇ細胞を
、ＮＲＲＬから取得番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０３９のも
とで入手する。実質的に実施例３の方法に従って、この
細胞からプラスミドｐＳＶ２ｈｙｇＤＮＡを得る。プラ
スミドｐＳ　Ｖ　２　ｈｙｇの制限部位および機能地図
を添付の第１０図に示す。
プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｈｙｇ（約１０μ９；　ＴＥ
緩衝液１０μσ中）を１０Ｘ１０ＸＢａ緩衝液（２μ＋
２）およびｄＨ！Ｏ（６μＱ）に加えた。このＤＮＡ溶
液に制限酵素Ｂａ５ＨＩ（２μ（２：約２０単位）を加
え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュベート
した。この反応液を始めにフェノールで抽出し、次いで
クロロホルムで２回抽出した。実質的に実施例４Ａに記
載の方法に従って、このＢａａ＋ＨＩ消化したプラスミ
ドｐＳＶ２ｈｙｇ　ＤＮＡを１％アガロースゲルにかけ
、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する〜２．５ｋｂ
の制限フラグメントを単離した。
１０Ｘクレノウ緩衝液［４種類のｄＮＴＰそれぞれが０
．２ｍＭ：　０．５Ｍ　ト’）　ス−ＨＣ１２（ｐＨ７
，８）：５０ｍＭ　ＭｇＯム；Ｏ，１Ｍ２−メルカプト
エタノール；および１００μ９／肩１２ＢｓＡ］（約５
μＱ）およびｄＨｔ　Ｏ（３５ｕのを、ＢａｍＨＩ消化
したプラスミドｐＳＶ２ｈｙｇＤＮＡの溶液に加え、次
にこのＤＮＡ７ｉ！合物にフレノウ酵素（ＢＲＬから市
販）（約２５単位；約５μＱ）を加え、得られた反応液
を１６℃で３０分間インキコベートした。このフレノウ
処理してＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐｓＶ２ｈｙｇ
ＤＮΔをフェノールで１回、クロロホルムで１回抽出し
、次いでエタノールで沈澱させた。目的のフラグメント
が約２μ９得られ、これをＴＥｉ衝液樹液μｇ）に懸濁
させた。
プラスミドｐＬＰＣＤＮＡ（約ｌＯμ９：１０μのを、
ＩＯＸ　５ｔｕｌ緩衝液（２ｕ１２）およびｄＨｔｏ（
６μｇ）に加えた。このＤＮＡ溶液に、制限酵素Ｓ　ｔ
ｕｌく２μ１２：約１０単位）を加え、得られた反応液
を３７℃で２時間インキュベートした。この５ｔｕｌ消
化したプラスミドｐＬＰＣＤＮＡをエタノールで沈澱さ
せ、遠心して集め、ｌＯｘのＮｄｅＩ緩衝液［１，５Ｍ
　ＮａＣＱ：　０．１Ｍ）リス−ＨＣ１２（ＰＨ７゜８
）；　７０ｍＭ　ＭｇＣＱ−；　６０ｍＭ　２−メルカ
プトエタノール；および１次９ＩＲＱ　Ｂ　Ｓ　Ａｌ（
２μＱ）およびａＨ，０（１６ｕ１２）に再懸濁した。
この５ｔｕｌ消化したＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｎｄｅ
ｌ（２μ１２；約１０単位）を加え、得られた反応液を
３７℃で２時間インキスペードした。
Ｎｄｅｌ−３ｊｕｌ消化したプラスミドｐＬＰＣＤＮＡ
をエタノールで沈澱させ、遠心して集め、１ＱＸ（Ｄ９
Ｌ／／’７緩衝液（５ｕｆｆ）およびｃｉＨ，ｏ（４０
μｍ２）に再懸濁した。このＤＮＡ溶液にフレノウ酵素
（５μｅ：約２５単位）を加え、得られた反応液を１６
℃で３０分間インキュベートした。フレノウ反応の後、
反応混合物を１％アガロースゲルにかけ、〜５．８２ｋ
ｂ　Ｎｄｅｌ−３ｔｕｌ制限フラグメントをゲルから単
離した。目的のフラグメントが約５μ２得られ、これを
ＴＥ緩衝液（５μｍ２）に懸濁させた。
プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｈｙｇの〜２．５ｋｂのフレ
ノウ処理したＢａｍｆ（Ｉ制限フラグメント（約２μＱ
）を、プラスミドｐＬＰＣの〜５．８２ｋｂのフレ／つ
処理したＮｄｅｌ−３ｔｕｌ制限フラグメント（約１μ
Ｑ）と混合し、このＤＮＡ溶液に、１０Ｘリガーゼ緩衝
液（約３μＱ）、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（２μＱ；約
１０００単位）、Ｔ４　　ＲＮΔＮｄ−ゼ（１μＱ；約
１単位）、およびｄＨｔｏ　（１４ｕＱ）を加えた。得
られた反応液を１６℃で一夜インキユベートした。この
ライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミドｐＬＰＣｈｙ
ｇｌおよびｐＬＰＣｈｙｇ２からなり、それらはプラス
ミドｐＳＶ２ｈｙｇの〜２．５ｋｂのフレノウ処理した
Ｂａｍｔ（Ｉ制限フラグメントの配向だけが異なってい
た。このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例３
の方法に従って、大腸［１１Ｋ　１２ＨＢＩＱＩを形質
転換した。目的の大腸菌に１２ＨＢ　１０１／ｐＬ　Ｐ
Ｃｈｙｇｌおよび大腸菌Ｋ１２ＨＢ　１０１／ｐＬ　Ｐ
Ｃｈｙｇ２形質転換体を、アンピシリン含有のし一寒天
で平板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によっ
て同定した。
実質的に実施例４Ｂ、１の方法に従って、ＢＫエンハン
サ−とＡｄ２後期プロモーターとの間にある、プラスミ
ドｐＬＰｃｈｙｇｌまたはｐＬＰＣｈｙｇ２の唯一のＸ
ｈｏｒ部位にポリーＧＴ要素を挿入する。Ｘｈｏｌ消化
したポリーＧＴ要素とＸｈｏｌＬ、た消化プラスミドｐ
ＬＰｃｈｙｇｌまたはｐＬＰＣｈｙｇ２ＤＮＡをライゲ
ートする。このライゲートしたＤＮＡは各々目的のプラ
スミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ　１．　（ＧＴ）およびｐＬ
ＰＣｈｙｇ２（ＧＴ）からなる。プラスミドｐＬ　Ｐ　
Ｃｈｙｇ　１　（Ｇ　Ｔ）の制限部位および機能地図を
添付の第１１図に示す。
実施例１１　プラスミドｐＢＷ３２の構築Ａ、中間体プ
ラスミドｐＴＰＡ１０３の構築プラスミドｐＴＰＡ１０
２はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）の
暗号配列を含有している。プラスミドｐＴＰＡ１０２は
大腸菌に１２　ＭＭ２９４／ｐＴＰ、ＡｌＯ２［この菌
株はＮＲＲＬから取得番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８３４（
１９８４年８月１０日寄託）のもとて入手可能である］
から単離することができる。プラスミドｐＴＰＡ１０２
の制限部位および機能地図を添付の第１２図に示す。プ
ラスミドＩ）ＴＰＡ１０２　　ＤＮＡを、実質的に実施
例３の方法に従って、大腸菌Ｋ１２ＭＭ２９４／ｐＴＰ
Ａ１０２から単離する。
プラスミドｐＴＰＡ１０２（約５０μ９：　ＴＥ緩衝液
約５０ｕ（ｌ中）を、１０　Ｘノｒｔｈｔ１ｕｌ衝１ｆ
ｆｌ［０゜５Ｍ　ＮａＣＱ：　８０ｍＭトリス−ＨｃＱ
ｃｐＨ７，４）；８０ｍＭ　ＭｇＣ＆−；　８０ｍＭ　
２−メルカプトエタノール；およびｌ　Ｒ９／村ＢＳＡ
］（１０μＱ）およびｄＨ、Ｏ（８０ｕ（りに加えた。
このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｔ　ｔｈｌｌｌＩ（１０μＱ
：約５０単位）を加え、得られた反応液を６５°Ｃで２
時間インキュベートした。
この反応混合物を１％アガロースゲルにかけ、］゛ＰＡ
暗号配列を含有する〜４　、４　ｋｂ　Ｔ　ｔｈｌｌｌ
ｌ制限フラグメントをゲルから単離した。その他の消化
産物、即ち３．１ｋｂおよび０．５ｋｂ制限フラグメン
トは廃棄した。目的の〜４　、４　ｋｂ　Ｔ　ｔｈｉｌ
ｌ＋制限フラグメントが約１０μ９得られ、これをＴＥ
緩衝液（１０μｍ２）に懸濁させた。
〜４．４　ｋｂ　′ｒｔｈｌｌｌｌ制限フラグメントを
含む溶液にＩＯＸのフレノウ緩衝液（約５μＩ２）オよ
びｄＨ７Ｏ（３０μのを加え、さらにフレノウ酵素（５
μＱ；約５単位）を加えた後、この反応混合物を１６°
Ｃで３０分間インキュベートした。フレノウ反応の後、
ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ＩＯＸのりガーゼ緩衝
液（３μｍ２）およびｄＨｔｏ（１４μのに再懸濁させ
た。
配列； で示されるＢａｍＨＩリンカ−（二ニー・イングランド
・バイオラブズ）を以下の方法によってキナーゼ処理し
、ライゲーション用に調製した。りンカー（４μ（２：
約２μ９）を、ｄＨ，ｏ（２０，１５μ１２）およびＩ
ＯＸ　キナーゼ緩衝液［５００…ＭトリスーＨＣＱ（ｐ
Ｈ７，６）および１００　ｍＭ　ＭｇＣＣ＊］　（５ｕ
のに溶解し、９０°Ｃで２分間インキニベートシ、次い
で室温まで冷却した。この混合物に、γ−３２ｐΔＴＰ
（５μｆｆ；約２０　ｍｃ　ｉ）、ＩＭ　ＤＴＴ（２，
５ｍＱ）およびポリヌクレオチドキナーゼ（５μｅ；約
ｌＯ単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで３０分
間インキュベートした。次いで、ｌｏｘＭＡＴＰ（約３
．３５μ（１’）およびキナーゼ（５μのを加え、反応
液を３７°Ｃでさらに３０分間保った。この放射活性Ａ
ＴＰは、リンカ−が標的ＤＮＡにライゲートしたかどう
かを決定するのに役立つ。
キナーゼ処理したＢａｍＨＩリンカ−（約１０μのを〜
４　、４　ｋｂ　Ｔｔｈｌｌｌ＋制限フラグメントの溶
液に加え、さらにＴ４　　ＲＮＡリガーゼ（２μＱ；約
２単位）を加えた後、このライゲーション反応液を４０
０で一夜インキユベートした。このライゲートしたＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、ｌＯＸのＨｉｎｄｌｌ＋緩
衝液（５μのおよびｄＨ，０（４０μ１２）ｆ：再懸濁
させた。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ（５
μＣ；約５０単位）を加え、得られた反応液を３７００
で２時間インキュベートした。
このＨｉｎｄｌｌｌ消化したＤＮＡをエタノールで沈澱
させ、ｌＯＸ１０ＸＢａ緩衝液（約１０μのおよびｄＨ
，０（９０μＣｔ＞に再懸濁させた。このＤＮＡ溶液に
制限酵素ＢａｍＨＩ（１０１１（１：約１００単位）を
加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベート
した。ＢａｍＨＩ消化の後、反応混合物を１％アガロー
スゲルにかけ、実質的に実施例４Ａの方法に従って、〜
２．ＯｋｂのＢ　ａｍＨＩ　−Ｈ１ｎｄｌ　ＩＩ制限フ
ラグメントをゲルから単離した。目的のフラグメントが
約４μ９得られ、これをＴＥｆＪ衝液（樹液μＱ）に懸
濁させた。
プラスミドｐＴＰＡ１０３を構築するために、プラスミ
ドｐＴＰＡ１０２由来の〜２．ＯｋｂＢａｍＨＩ　−Ｈ
１ｎｄｌｌ！制限フラグメントを、Ｂａ１ＨＩ−［（ｉ
ｎｄｌｌｌ消化したプラスミドｐＲＣに挿入した。
プラスミドｐＲＣは、大腸菌Ｌｒｐオペロンのプロモー
ターおよびオペレーター（ｔｒｐＰＯ）配列を含有する
〜２８８ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＣＩａＩ制限フラグメン
トを、ＥｃｏＲｌ−Ｃ１ａｌ消化したプラスミドｐＫＣ
７に挿入することによって構築した。プラスミドｐＫＣ
７は、大腸菌に１２　Ｎ１００／ｐＫＣ７として、ＡＴ
ＣＣから取得番号ＡＴＣＣ３７０８４のもとで入手する
ことができる。ｔｒｐＰＯを含有する〜２８８ｂｐ　Ｅ
ｃｏＲｌ−Ｃ１ａｌ制限フラグメントはプラスミドｐＴ
ＰＡ１０２にのプラスミドは大腸菌Ｋ１２　ＭＭ２９４
／ｐＴＰＡ１０２（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５８３４）から
単離することができる］から単離することができる。プ
ラスミドｐＫＣ７およびプラスミドｐ’ｒ　Ｐ　Ａ　１
０２ＤＮＡは、実質的に実施例３の方法に従って、上記
セルラインから得ることができる。プラスミドｐＴＰＡ
１０２の〜０．２９ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｃｌａｌ制限
フラグメントは、大腸菌ｔｒｐ遺伝子の翻訳活性化配列
の大部分および転写活性化配列を含有し、以下の配列を
有している： ＋００ すなわち、プラスミドｐＲＣを構築するために、ＴＥ緩
衝液（１０μの中のプラスミドｐＫＣ７（約２ｔ１ｇ）
を、１ＱＸｃｌａｌ緩衝液［０，５Ｍ　ＮａＣＣ６０ｍ
Ｍｈリス−ＨＣＣ（ｐＨ７，９）：　６０ｍＭ　ＭｇＣ
ｂ：および１ＩＩｙ／ｎρＢＳＡＩ（２μρ）およびｄ
Ｈ。
０（６μのに加えた。このプラスミドｐＫＣ７ＤＮＡの
溶液に制限酵素Ｃｌａ［（２μＱ；約１０単位）を加え
、得られた反応液を３７°Ｃて２時間インキュベートし
た。このＣ１ａＩ消化したプラスミドｐＫＣ７Ｄ　Ｎ　
Ａをエタノールで沈澱させ、１０ＸＥｃｏＲＩ緩衝１（
ｔ（２μ１２）およびｄＨ，ｏ（１６μのに再懸濁させ
た。ｐＫＣ７ＤＮＡに制限酵素ＥｃｏＲ［（２μＱ；約
ｌＯ単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間
インキュベートした。
このＥｃｏＲｌ−Ｃ１ａｌ消化したプラスミドｐＫＣ７
ＤＮＡを、フェノールで１回、次いでクロロホルムで２
回抽出した。次いで、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、
１０Ｘリガーゼ緩衝液（３μ１２）およびｄＨ，０（２
０μＱ）に再懸濁した。Ｃ１ａｌ消化したプラスミドｐ
ＫＣ７のプラスミド溶液の制限部位および機能地図は、
マニアティス等［ＭａｎｉａＬｉｓ　ｅｔ　ａｌ、］の
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　１ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　
１９ｇ２）８頁から入手することができる。
ＴＥ緩衝液（約２０μＱ）中のプラスミドｐＴＩ）八１
０２（約２０μ９）を、１ＱＸｃ１ａｌ緩衝液（１０μ
のおよびｄＨ，０（６０μＱ）に加えた。このプラスミ
ドｐＴＰＡ１０２　　ＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｃ１ａ
Ｉ（ｌｏｇ＆：約５０単位）を加え、得られた反応液を
３７°Ｃで２時間インキュベートした。このＣ１ａｌ消
化したプラスミドｐＴＰＡ１０２　　ＤＮＡをエタノー
ルで沈澱させ、ｌ　ＯＸ　　ＥｃｏＲ，Ｉ緩衝１夜（１
０ｕ□およびｄＨｔｏ　（８０〕１ｆｆ）ニ再懸ｌ蜀シ
タ。
このＣ１ａｌ消化したプラスミドｐＴＰＡ１０２ＤＮＡ
の溶液に制限酵素ＥｃｏＲＩ　（１０ｕＱ　：約５０単
位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキ
ュベートした。
このＥｃｏＲｌ−Ｃ１ａｌ消化したプラスミドｐＴＰΔ
１０２　ＤＮＡをフェノールで１回抽出し、ｔｒｐＰｏ
を含有する〜２８８ｂｐ　ＥｃｏＲｌ　−Ｃ１ａｌ制限
フラグメントが他の消化産物から分離するまで、７％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。この〜２８８
ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｃ１ａｆ制限フラグメントをゲル
から単離した。目的のフラグメントが約１μ９得られ、
これをＴＥ緩衝液（５μｇ）に懸濁させ、上記のように
して調製したＥ　ｃｏＲＩ−ＣｌａＩ消化のプラスミド
ρＫＣ７ＤＮＡの溶液に加えた。次いでこのＤＮＡ混合
物に、Ｔ４ＤＮＡすｉｆ−セ（２μＱ；約１０００単位
）を加え、得られたライゲーション反応液を１６°Ｃで
２時間インキュベートした。このライデー１−　したＤ
ＮＡは目的のプラスミドｐＲＣＤＮＡからなっていた。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例３の方
法に従って、大腸菌に１２　　ＨＢＩＯＩコンピテント
細胞を形質転換した。形質転換細胞を１００μｇ、／ｖ
＋２アンピシリン含有のし一寒天で平板培養し、プラス
ミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピシリン耐性形
質転換体をスクリーニングシテ目的ノ大腸ｆ’ａＫ　１
２　ＨＢ　１０１／ｐＲｃコ０ニーを同定しｆコ。実質
的に実施例３の方法に従って、大腸菌に１２　ＨＢＩＯ
Ｉ／ｐＲＣ形質転換体からプラスミドｐＲＣＤＮＡを得
た。
ＴＥ緩衝液（２μＱ）中のプラスミドｐＲＣ，ＤＮＡ（
約２ｕｇ）を、１０　Ｘ　Ｈｆｎｄ［Ｉｌ緩衝液（２μ
σ）およびｄＨ＊ｏ（１６μｍ２）に加えた。このプラ
スミドｐＲＣＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌ！
（２μ（！　：約１０単位）を加え、得られた反応液を
３７°Ｃで２時間インキュベートした。このＨｉｎｄｌ
ｌｌ消化したプラスミドｐＲＣＤＮＡをエタノールで沈
澱させ、ｌＱＸＢａｍＨＩ緩衝液（２ｕ１２）およびｄ
Ｈ，ｏ（１６μＱ）に再懸濁した。このＨｉｎｄｌｌｌ
消化したプラスミドｐＲＣＤＮＡの溶液に制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ（２μａ；約１０単位）を加え、得られた反応液
を３７°Ｃで２時間インキュベートした。
このＢａｍＨ［−Ｈ１ｎｄｌｌｌ消化のプラスミドｐＲ
ＣＤＮＡをフェノールで１回、次いでクロロホルムで２
回抽出した。このＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ＩＯ
Ｘリガーゼ緩衝液（３μＱ）およびｄ　Ｈ＊　Ｏ（２０
ｕ１２）に再懸濁した。このＢａｍＨｒ−Ｈｉｎｄｌｌ
ｌ消化したプラスミドｐＲＣＤＮＡの溶液に、プラスミ
ドｐＴＰＡ１０２の〜２．　Ｏｋｂ　ＨｉｎｄｌｌｌＢ
ａｆｆｌ）１１制限フラグメント（約４μＣＴＥ緩衝液
約５μＱ中）を加えた。このＤＮＡＵ合物に、Ｔ４　　
ＤＮΔリガーゼ（２μ＆：約２０００単位）を加え、得
られた反応液を１６°Ｃで２時間インキュベートした。
このライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミドｐＴＰＡ
１０３　　ＤＮＡからなっていた。
目的ではない形質転換体を減少させるため、このライゲ
ート化ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ（この酵素はプラスミ
ドｐＲＣを切断するがプラスミドｐＴＰΔ１０３は切断
しない）で消化した。即ち、直線化したＤＮＡは閉環し
た環状ＤＮＡに比べて大腸菌を形質転換することが少な
いので、Ｎｃｏｌによってライゲート化ＤＮＡを消化す
ると目的ではない形質転換体が減少する。ライゲート化
ＤＮＡを消化するため、始めにＤＮＡをエタノールで沈
澱させ、次いでｌＯＸのＮｃｏｌ緩衝液［１，５ＭＮａ
ＣＱ：　６０＋＋＋Ｍ　トリス−ＨＣ１２（ｐＨ７，８
）；　６０ｍＭ　ＭｇＣ（ｂ：および１１９／Ｌ（ｌ　
Ｂ　Ｓ　Ａ　］（２ｕ（ＤおよびｄＨ，ｏ（１６μのに
再懸濁した。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｎｃｏｌ（２μ
ａ：約１０単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで
２時間インキュベートした。
ライゲート化、次いでＮｃｏＩ消化したこのＤＮＡを用
いて大腸菌に１２　　ＲＶ３０８（ＮＲＲＬＢ−１５６
２４，１９８３年９月２８日寄託）を形質転換した。実
質的に実施例３の方法に従って、大腸菌Ｋ１２　　ＲＶ
３０８細胞をコンピテントにし、そして形質転換した。
形質転換混合物を１００μｇ／蛙アンピシリン含有のし
一寒天で平板培養した。
プラスミドｐＲＣはカナマイシン耐性を与えるがプラス
ミドｐＴＰＡ１０３は与えないので、アンピシリン耐性
形質転換体をカナマイシン感受性について試験した。次
いでアンピシリン耐性かつカナマイシン感受性の形質転
換体を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、このプラスミ
ドＤＮＡを制限酵素分析をすることによって大腸菌に１
２ＲＶ３０８／ｐＴＰＡ１０３形質転換体を同定した。
プラスミドｐＴＰＡ１０３の制限部位および機能地図を
添付の第１２図に示す。実質的に実施例３の方法に従っ
て、大腸菌Ｋ１２　　ＲＶ３０８／ｐＴＰＡ１０３細胞
からプラスミドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡを単離した。
Ｂ、中間体プラスミドｐＢＷ２５の構築ＴＥ緩衝液（１
ｕ１２）中のプラスミドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡ（約
ｌμｇ）を、ＬＯＸ　８ｇｌｌｌ緩衝液（２μｇ）およ
びｄｔｒｔｏ（ｉｓμｇ）に加えた。このプラスミドｐ
ＴＰＡ１０３　　ＤＮＡの溶液に、制御！ａ酵素Ｂｇ１
１１（１μｇ；約５単位）を加え、得られた反応液を３
７°Ｃで２時間インキュベートした。このＢａ１ｌｌ消
化したプラスミドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡをエタノー
ルで沈澱させ、ＩＯＸクレノウ緩衝液（５μσ）および
ｄＨ，０（４４μのに再懸濁した。このＢｇｌｌ＋消化
したプラスミドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡの溶液に、フ
レ／つ酵素（Ｉμσ；約１単位）を加え、得られた反応
液を１６°Ｃで２時間インキュベートした。このフレノ
ウ処理してＢｇｌ１１消化したプラスミドｐＴＰＡ１０
３　　ＤＮＡをエタノールテ沈澱すセ、１０Ｘリガーゼ
緩衝１夜（３μのおよびｄＨ，ｏ（２２μＱ）に再懸濁
した。
このフレノウ処理して８ｇ１１１ｔｒ４化したプラスミ
ドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡの溶液に、配列・で示され
るキナーゼ処理していないＮｄｅｌリンカ−にュー・イ
ングランド・バイオラブズ）（約２μＱ：０．２μ９）
を、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（２μＱ；約１０００単位
）およびＴ４　　ＲＮＡリガーゼく１頭約２単位）とと
もに加え、得られたライゲート反応液を４℃で一夜イン
キユベートした。ライゲートしたＤＮＡはプラスミドｐ
Ｔ　Ｐ　Ａ　ｌ　０３ｄｅｒＮｄｅＩからなっていた（
このプラスミドは、ｐＴＰＡｌ　０３　ｄｅｒＮｄｅ　
Ｉが、プラスミドｐＴＰＡ１０３がＢｇｌｌｌ認識配列
を有しているところにＮｄｅｌ認識配列を有しているこ
と以外は、実質的にプラスミドｐＴＰＡ１０３と同じで
ある）。
このライゲートしたＤＮＡを用い、実質的に実施例３に
記載の方法に従って、大腸菌Ｋ１２　　Ｒ■３０８コン
ピテント細胞を形質転換した。この形質転換細胞をアン
ピシリン含有のし一寒天で平板培養し、プラスミドＤＮ
Ａの制限酵素分析によって、大腸菌に１２　　ＲＶ３０
８／ｐＴＰＡ１０３ｄｅｒＮｄｅｌ形質転換体を同定し
た。後の構築に用いるため、プラスミドｐＴＰＡ１０３
ｄｅｒＮｄｅｌ　　ＤＮＡを、実質的に実施例３の方法
に従って、形質転換体から単離した。
ＴＥ緩衝液（１０μＱ）中のプラスミドｐＴＰＡ１０３
ｄｅｒＮｄｅｌ　　ＤＮＡ（約１０μ９）を、ＩＯＸの
ＡＶａｌｌｌ衝液［０，樹液　ＮａＣＱ：　６０ｍＭｈ
リスーＨＣｆ２（ｐＨ８，０）；　Ｏ，ＩＭ　ＭｇＣ１
！−；　６０ｍＭ　２−メルカプトエタノール；および
１所／ｘ（！ＢＳＡ］（２μＱ）およびｄＨ，Ｏ（６μ
Ｑ）に加えた。このＤＮＡに、制限酵素Ａ　ｖａｌ！（
２ｕ（１；約１０単位）を加え、得られた反応液を３７
°Ｃで２時間インキユベートシた。〜１．４ｋｂ制限フ
ラグメントが他の消化産物から分離するまで、このＡＶ
ａｌ１Ｍ化したＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動に
かけた。次いでこのプラスミドｐＴ　ＰＡ　１０３ｄｅ
ｒＮｄｅＩの〜１　、４　ｋｂ　ＡＶａｉｌ制限フラグ
メントをゲルから単離し、目的のフラグメント（約２μ
ｇ）を得、これをＴＥ緩衝液（５μｇ）に懸濁した。
この〜１　、４　ｋｂ　ＡＶａｉ！制限フラグメントの
溶液に、ＩＯＸクレノウ緩衝液（５μＱ）、ｄＨ，０（
３５μｍ２）、およびフレノウ酵素（５μｅ；約５単位
）を加え、得られた反応液を１６°Ｃで３０分間インキ
ュベートした。このフレノウ処理したＤＮＡをエタノー
ルで沈澱させ、ＩＯＸリガーゼ緩衝液（３μのおよびｄ
Ｈｔｏ（ｉ４μＱ）に再懸濁した。
実質的に上記Ａの方法に従って、配列：で示されるＨｐ
ａＴリンカ−（約２μＱ）をキナーゼ処理した。フレノ
ウ処理した、プラスミドｐＴＰＡ１０３　ｄｅｒＮｄｅ
　Ｉの〜１．４　ｋｂ　ＡＶａｉｌ制限フラグメントの
溶液に、このキナーゼ処理したリンカ−（約１０ｕ＆）
を、Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（２μｆｆ；約１０００単位
）およびＴ４　　ＲＮＡリガーゼ（ｌμＱ；約１単位）
とともに加え、得られた反応液を１６℃で一夜インキユ
ベートした。
このライゲート化ＤＮＡをフェノールで１回、クロロホ
ルムで２回抽出し、エタノールで沈澱させ、ｌ　ＯＸ　
Ｅ　ｃｏＲＩ　ｆａ第１夜（２μＩ２）およびｄＨ、Ｏ
（１６μＱ）に再懸濁した。このＤＮＡ溶液に、制限酵
素ＥｃｏＲｌ　（２μ１２；約１０単位）を加え、得ら
れた反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。こ
のＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡをフェノールで１回、クロ
ロホルムで２回抽出し、エタノールで沈、殿させ、ＩＯ
Ｘ　　リガーゼ緩衝液（３μＱ）およびｄＨ、Ｏ（２０
μｇ）に再懸濁した。このようにして調製した、〜７７
０ｂｐの大きさの、ｔｒｐＰＯおよびＴＰＡのアミノ末
端をフードしているフラグメントは、ＥｃｏＲＩ適合末
端を１つおよび平滑末端を１つ有しており、これを、以
下のとおり、ＥｃｏＲＩ　−３ｍａＩ消化したプラスミ
ドｐＵｃ１９にライゲートしてプラスミドｐＵｃ１９Ｔ
ＰＡＦＥを得た。
プラスミドｐＵｃ１９［ＢＲＬから入手可能］（約２μ
９）を、ＩＯＸのＳ　ｍａ　Ｉ緩衝液［０，２Ｍ　ＫＣ
に６０ｍＭトリス−ＨＣ（！（ｐＨ８，０）；　６０ｍ
Ｍ　ＭｇＣＬ：　６０ｍＭ　２−メルカプトエタノール
；および１ｍ９／＊Ｑ　ＢＳＡ］（２ｕ□およびｄＨ！
　Ｏ（１６μＱ）に溶解した。このＤＮＡｍ液に、制限
酵素Ｓ　ｍａ　１（２μＩ２：約ｌＯ単位）を加え、得
られた反応液を２５°Ｃで２時間インキュベートした。
このＳｍａＩ？ｍ化したプラスミドｐＵｃ１９　　ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、１ＱＸＥｃ
ｏＲＩ緩衝液（２μのおよびｄＨ，ｏ（１（３μＱ）に
再懸濁した。
このＳｍａｌ消化したプラスミドｐＵｃ１９　　ＤＮＡ
の溶液に、制限酵素ＥｃｏＲＩ　（２ｕ！２　：約１０
単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間イン
キュベートした。このＥｃｏＲＩ−３ｍａｒ消化したプ
ラスミドｐＵｃ１９　　ＤＮＡをフェノールで１回、ク
ロロホルムで２回抽出し、ＴＥ緩衝液（５１）に再懸濁
した。
ＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ消化したプラスミドｐＵｃ１９　
　ＤＮＡを、プラスミドｐＴ　Ｐ　Ａ　１０３　ｄｅｒ
ＮｄｅＩ由来の〜７７０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−平滑末端制
限フラグメントを含有する溶液に加えた。このＤＮＡ混
合物ニ、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（２μ（！；約１００
０単位）を加え、得られた反応液を１６°Ｃで一夜イン
キニベートした。このライゲートしたＤＮＡは目的のプ
ラスミドｐＵｃ１９ＴＩ）八ＦＥからなっていた。プラ
スミドｐＵｃＩ９ＴＰＡＦＥの制限部位および機能地図
を添付の第１２図に示す。
プラスミドｐＵｃ１９ＴＰＡＦＥの構築に用いるＥｃｏ
Ｒ［およびＳ　ｍａ　ｌ認識配列を含有する、プラスミ
ドｐＵｃ１９の多重クローニング部位は、１ａｃＺ　α
フラグメントの暗号配列内に位置している。ＩａｃＺ　
６Ｍ１５突然変異（βガラクトシターセをコードしてい
る１ａｃＺ遺伝子における突然変異）を含有する細胞に
おいてこのｌａｃ　Ｚ　　αフラグメントを発現させる
と、これらの細胞は機能的なβガラクト／ダーゼ分子を
発現し、従ってこれらの細胞は、ＩＰＴＧ（イソプロピ
ルチオガラクトシド）の存在下てＸ−ガル（５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノ／ド；無色の化合物）をそのインジゴ色の加水分解産
物に加水分解する。プラスミドｐＵｃ１９の多重クロー
ニング部位にＤＮＡを挿入すると、ＩａｃＺ　αフラグ
メントの暗号配列が乱され、１ａｃＺΔＭ１５突然変異
を有する（そのようなプラスミドを有する）細胞はＸ−
ガルを加水分解することができない（なぜなら、コロニ
ーは白色であり、インジゴではないからである）。プラ
スミドｐＵＣ１９ＴＰＡＦＥを構成するこのライゲート
化ＤＮＡを用い、実質的に実施例３の方法に従って、形
質転換用にコンピテントにした大腸菌Ｋ１２　ＲＲ１Δ
Ｍ１５（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５４４０，１９８３年５月
２７日寄託）細胞を形質転換した。
形質転換細胞を、■００μ９／ｚ（ｌアンピシリン、４
０μ９／ＪＩＱ　Ｘ−ガル、および１ｍＭＩＰＴＧを含
有するし一寒天で平板培養した。インジゴ色を呈しない
コロニーを継代培養し、これを用いてプラスミドＤＮＡ
を調製し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって大
腸菌に１２　ＲＲ１ΔＭ１５／ｐＵｃ１９ＴＰＡＦＥ形
質転換体を同定した。
後の構築にもちいるため、プラスミドｐＵｃ１９ＴＰＡ
ＦＥ　ＤＮＡを、実質的に実施例３の方法に従って、大
腸菌に１２　　ＲＲＩΔＭ１５／ｐＵＣ１９ＴＰＡＦＥ
細胞から単離した。
ＴＥ緩衝液（２０μり）中のプラスミドｐＵｃ１９ＴＰ
ＡＦＥ（約７　ｕ９）を、ＩＱＸ　Ｈｐａｌ緩衝液［０
２Ｍ　ＫＣ（！；　ｏ、ＩＭ　ト１）　スーＨＣ＆（ｐ
Ｈ７，４）；および０　、　Ｉ　Ｍ　ＭｇＣｆｆ−］（
］、　ＯｕＱ＞およびｄＦ（、ｏ（７０μのに加えた。
このプラスミドｐＵｃ１９ＴＰΔＦＥ　　ＤＮＡの溶液
に、制限酵素Ｈｐａｌ（３ｕｅ；約６単位）を加え、得
られた反応液を３７°Ｃで２０分間インキュベートした
（この短い反応時間は部分的にＨｐａ［消化するために
設定した）。この反応液を、ｌＸＢａｍＨ１緩衝液［１
５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ！：１０ｍＭ）リス−〇Ｃり（ｐＨ
＝８．０）：および１０ｍＭ　ＭｇＣσ、；塩濃度を高
くするとＨｐａｌが不活性化する］（１５０μｍ２）に
調整した。このＨｐａｌ（部分的）消化したＤＮＡの溶
液に、制限酵素ＢａｍＨＩ（１μＱ；約１６単位）を加
え、この得られた反応液を３７℃で９０分間インキュベ
ートした。
このＢａｍＨＩ　−ＨｐａＩ　（部分的）消化プラスミ
ドｐＵｃ１９ＴＰＡＦＥ　　ＤＮＡをエタノール沈澱で
濃縮し、１．５％アガロースゲルにかけ、実質的に実Ｍ
ｔｔ＋例４Ａの方法に従って、プラスミドｐＵＣＡＴＰ
ＡＦＥのレプリコン、βラクタマーゼ遺伝子、およびＴ
ＰＡコード化ＤＮＡのすべてを含有する〜３．４２ｋｂ
　Ｈｐａｌ　−ＢａｍＨＩ制限フラグメントをゲルから
単離した。目的のフラグメントか約１μ９得られ、これ
をＴＥ緩衝液（２０μのに懸濁した。
ＴＥ緩衝液（１０μの中のプラスミドｐＴＰＡ１０３（
約１０ｕ９）を、１ＱＸｓｃａｌ緩衝１ｆｆｌ［１，Ｏ
Ｍ　ＮａＣ１２；　６０ｍＭ　トリス−ＨＣ＆（ｐＨ７
，４）；６０ｍＭ　ＭｇＣＩＩＬ　：　ｌ　ＯｍＭ　Ｄ
ＴＴ　；およびＩｎ／ａＱ　Ｂ　Ｓ　Ａ］（１０μ０お
よびｄＨ，Ｏ（８０ｕｆ２）ニ溶解した。このプラスミ
ドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡの溶液に、制限酵素５ｃａ
ｌ（３μＱ；約１８単位）を加え、得られた反応液を３
７°Ｃで９０分間インキュベートした。この反応液の容
積を、ＩＸのＢａｍＨＩ緩衝液で１５０μＱに調整し、
この混合物に制限酵素ＢａｍＨＩ　（１μ１２　：約１
６単位）を加え、次いで、３７°Ｃで９０分間インキュ
ベートした。このＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心
して集め、電気泳動用の調製物に再懸濁した。このＳ　
ｃａ　Ｉ　　Ｂ　ａｎ＋Ｈ１消化したプラスミドｐＴＰ
Ａ１０３　　ＤＮＡを、〜１．Ｏ１５ｋｂ　５ｅａｌ　
−ＢａｍＨＩ制限フラグメントが他の消化産物から分離
するまで、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。
上記のように、プラスミドｐＴＰＡ１０３のＴＰＡカル
ボキシ末端フード化ＤＮＡを含有する〜１．　Ｏｌ　５
ｋｂ　Ｓｅａｌ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントをゲルか
ら単離し、目的のフラグメントが約０．５μｇ得られ、
これをｄＨ，０（２０μρンに溶解した。
プラスミドｐＴＰＡ１０３の〜１．０１５ｋｂＳｃａｌ
　−ＢａｍＨＩ制限フラグメント（２μぐ）に、プラス
ミ　ＦｐＵＣ１９’ＦＰＡＦＥの〜３．４２ｋｂ　　Ｂ
ａｍＨｌ−ＨｐａＩ制限フラグメント（約２μのを、１
０Ｘ　Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２μのおよびＴ
４ＤＮＡリガーゼ（１μの［約１バイス（Ｗｅｉｓｓ）
単位；このリガーゼはプロメガ・バイオチック（Ｐｒｏ
ｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ、　２８００　Ｓ、　Ｆｉｓｈ　
Ｈａｔｃｈｅｒｙ　Ｒｏａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ。
Ｗｌ　５３７１１）から入手したＪとともに加え、得ら
れた反応液を１６°Ｃで一夜インキユベートした。この
ライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミドｐＢＷ２５か
らなっていた。このプラスミドｐＢＷ２５の制限部位お
よび機能地図を添付の第１４図に示す。
５０　ｍＭ　ＣａＣ１２！を用いること以外は実質的に
実施例３の方法に従い、このライゲート化ＤＮＡを用い
て形質転換用にコンピテントにしておいた大腸菌に１２
　　ＪＭ１０５（ＢＲＬから入手できる）を形質転換し
た。形質転換細胞をｌ　ＯＯｕ９／　ｍＱアンピンリン
含有のプレイン−ハート　インフュージョン寒天（ＢＨ
Ｉ）［デイフッ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃ。
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｌ
）］で平板培養し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
よって大腸菌に１２　　ＪＭ１０５／ｐＢＷ２５形質転
換体を同定した。
プラスミドｐＢＷ２５を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化する
と、〜３．３８ｋｂおよび〜１．０８ｋｂの制限フラグ
メントが得られる。後の構築に用いるため、実質的に実
施例３の方法に従って、プラスミドｐＢＷ２５を調製し
た。
ｄＨｔ　Ｏ（ｌ　Ｏｄ’）中のプラスミドｐＢＷ２５（
約５μり）を、１０Ｘ　Ｈｉｎｄｌｌ１反応緩衝液（１
０μｉ２）およびｄＨ，ｏ（８０μＱ）に加えた。この
プラスミドｐＢＷ２５　ＤＮＡの溶液に、制限酵素Ｈ１
ｎｄｌｌ！（１μａ；約２０単位）を加え、得られた反
応液を３７℃で９０分間インキュベートした。このＨｉ
ｎｄｌｌｌ消化したプラスミドｐＢＷ２５　　ＤＮＡの
溶液に、制限酵素ＥｃｏＲＩ　（３μ（：約２４単位）
およびＩＭ）ＩＪスーＨＣ（！（ｐＨ７，６０１Ｏμ（
りを加え、得られた反応液を３７°Ｃで９０分間インキ
ュベートした。このＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ消化
したプラスミドｐＢＷ２５　　ＤＮＡをエタノール沈澱
で濃縮し、〜８１０ｂｐ　ＥｃｏＲＪ−Ｈｉｎｄｌｌｌ
制限フラグメントが池の消化産物から分離するまで、１
．５％アカロースケル電気泳動にかけた。実質的に実施
例４Δの方法に従って、〜８１０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−
Ｈ１ｎｄＩＩ＋制限フラグメント（約０．５μｇ）をゲ
ルから単離し、ライゲーション用に調製し、これをｄＨ
，０（２０μＱ、）に再懸濁した。
ｄＨ，○（３５μの中の複製型（ＲＦ）のＭ１３ｍｐ８
ＤＮＡにュー・イングランド・バイオチックかラ入手で
きル）（約４　、５　μ！？）を、ＩＯＸのＨｉｎｄｌ
ｌｌ緩衝液（１０μＱ）およびｄＨｔＯ（５５μＱ）に
加えた。
このＭ１３ｍｐ８　　ＤＮＡの溶液に、制限酵素分析１
１ｔ（１ｕ１２；約２０単位）を加え、得られた反応液
を３７℃で１時間インキニベートした。このＨｉｎｄｌ
ｌ＋消化したＭ１３信ｐ８　　ＤＮＡの溶液に、制限酵
素ＥｃｏＲＩ　（３μ１２　：約２４単位）および１Ｍ
トリス−ＨＣｇ（ｐＨ７，６）（１０μのを加え、得ら
れた反応液を３７°Ｃで１時間インキニベートした。上
記に従って、この旧ｎｄｌｌｌ　−ＥｃｏＲＩ消化した
Ｍ１３ｍｐ８　　ＤＮＡをエタノール沈澱で集め、アガ
ロースゲル電気泳動用の調製物に再懸濁し、大きい制限
フラグメントをゲル電気泳動によって単離した。Ｍ１３
ｍｐ８の大きいＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フ
ラグメント（約１μ９）が得られ、これをｄｔｉ　、０
（２０μＱ）に懸濁した。Ｍ１３ｍｐ８の大きいＥｃｏ
Ｒｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ制限フラグメント（約２　μ（２
）、ｌ０ＸＴ４　　ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２μＱ）、
ｄＨｔＯ（１２μＱ）、およびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ
（１μＱ：約１バイス単位）を、プラスミドｐＢＷ２５
の〜８１０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ト１ｉｎｄｌｌｌ制限フ
ラグメント（３μのに加え、得られたライゲーション反
応液を１６°Ｃで一夜インキユベートした。
トランスフェクションに用いるＤＮＡの量を変えること
以外は、実質的にＢＲ［、、Ｍ１３　　クローニンク／
゛ジデオキジシークエンシング・インストラクション”
　？　ニュアル（ＢＲＬ　Ｍ１３　Ｃｌｏｎｉｎｇ／’
Ｄｉｄｅｏｘｙ’ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｉｎ５ｔｒｕ
ｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ）記載の方法に従って、大腸
菌ＪＭ１０３細胞（ＢＲＬから人手可能）をコンピテン
トにし、ライゲーション混合物でトランスフェクション
した。挿入によるβガラクトシダーゼαフラグメントを
コードしている遺伝子の不活性化（これにより、Ｘ−ガ
ルをそのインジゴ色の切断産物に切断する能力が失われ
る）によって組換え体プラークを同定した。
スクリーニングするため、白いプラーク６個を、各々、
Ｌブロス（２，５ＪＩのに入れ、これに、最小培地スト
ックで培養してｐｒｏＡ　Ｂを有するＦエビソームの保
持を確実なものにした、大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３（０，
４３１１２）を、対数増殖期において加えた。このプラ
ークを含有する細胞懸濁液（２，５肩のを、空気振盪器
中、３７°Ｃで８時間インキコベートした。この溶液（
１，５ｆｆｉのから得た細胞をベレット化し、実質的に
バーンボイムおよびドーリ４　［Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａ
ｎｄ　Ｄｏｌｙ、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
、　７：１５１３（１９７９）］のアルカリ・ミニスク
リーン法に従って、ＲＦ　　ＤＮＡを単離した。各培養
物の残りは４℃で保存した。目的の７１−ジ（ＭＰ８Ｂ
Ｗ２６と命名した）は、Ｍ１３ｍｐ８の〜７．２ｋｂ　
ＥｃｏＲＩＨｉｒ＋ｄｌｌｌ制限フラグメントにライゲ
ートしたプラスミドｐＢＷ２５の〜８１０ｂｐ　Ｅｃｏ
ＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌ！制限フラグメントを含有してい
た。
対数期の大腸菌ＪＭ１０３（約５０５１２）をＭＰ８Ｂ
Ｗ２６で感染させ、空気振盪器中、３７°Ｃで１８時間
インキュベートした。低速遠心することによって感染細
胞をベレット化し、上記インストラクション・マニュア
ルの方法をスケールアップすることによって培養物上清
から１本鎖ＭＰ３ＢＷ２６　　ＤＮＡを調製した。フレ
ノウ反応を、室温で３０分間、次いで３７°Ｃで６０分
間、次いで１０’ｃで１８時間行うこと以外は、実質的
にアデルマン等［Ａｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＤＮ
Ａ　２（３）：１８３−１９３（１９８３）］の教示に
従って、１本鎖ＭＰ８ＢＷ２６を突然変異誘発にかけた
。さらに、Ｓ１処理を２０°Ｃで行ない、緩衝液の塩濃
度を製造元推奨の半分にし、そしてＭ１３配列決定（シ
ーフェンシング）ブライマー（Ｂ　ＲＬ）を用いた。天
然ＴＰＡのアミノ酸残基８７から２６１に対応する暗号
配列を削除するために用いた合成オリゴデオキシリボヌ
クレオチド・プライマーは以下の配列で示される５’　
−ＧＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＴＡＴＣＣＡＣＣ
ＴＧＣＧＧＣＣＴＧＡＧ＾−３得られた突然変異誘発混
合物を用い、実質的に上記の感染方法に従って、大腸菌
Ｋ１２ＪＭ１０３をトランスフェクションした。ＲＦ　
　ＤＮＡの制限酵素分析、およびマクサムおよびギルバ
ート（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）のＤＮＡ
配列決定によって目的の突然変異体を同定した。天然Ｔ
ＰＡのアミノ酸残基８７から２６１に対応する暗号配列
が削除された目的の突然変異体をＭＰ８ＢＷ２７と命名
した。
プラスミドＩ）ＢＷ２８を構築するためには、多種のＤ
ＮＡフラグメントが必要である。それらフラグメントの
第１のものを以下のようにして得た。
ｄＨ，ｏ（２０μの中のＲＦ　ＭＰ８ＢＷ２７　　ＤＮ
Ａ（約２０μ９）を、１ＯＸＮｄｅｌ緩衝液（ｌｏμｃ
）およびｄＨ，○（６０μＱ）に加えた。このプラスミ
ドＭＰ８ＢＷ２７　　ＤＮＡの混合物に、制限酵素Ｎｄ
ｅＩ（１０μＱ；約５０単位）を加え、得られた反応液
を３７℃で２時間インキュベートした。このＮｄｅｌ消
化したＭＰ８ＢＷ２７　　ＤＮＡをエタノールで沈澱さ
せ、遠心して集め、］、　ｏｘ　　ＥｃｏＲ１緩衝液（
１０μＱ）およびａＨ，ｏ（９０μＱ）に再懸濁した。
このＮｄｅｌ消化したプラスミドＭＰ８ＢＷ２７　　Ｄ
　Ｎ　Ａ　（Ｄ溶ｉ（Ｉニ、制限酵素ＥｃｏＲＩ（１０
ｕ１２：〜５０単位）を加え、得られた反応液を３７°
Ｃで２時間インキュベートした。欠失部位を含むＴＰＡ
暗号配列の一部を含有する〜５６０ｂｐ　Ｎｄｅｌ−Ｅ
ｃｏＲＩ制限フラグメントが他の消化産物から分離する
まで、このＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅｌ消化したＭＰ８ＢＷ２
７　　ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけた。上記
にしたがって、この〜５６０　ｂｐＮｄｃｌ　−Ｅｃｏ
Ｒ［制限フラグメントをゲルから単離し、目的のフラグ
メント（約０．５ｕｙ）を得、これをｄｔ−＋、ｏ（２
０μｉ２）に再懸濁した。
プラスミドｐＢＷ２８の構築に必要な第２のフラグメン
トは、実質的に実施例１の方法に従って、鎖１本ずつ自
動ＤＮＡ合成機で合成する。実質的に実施例７Ａの方法
に従って、２本の相捕的な鎖（これらの鎖は、ハイブリ
ダイズしてＸｂａ［およびＮｄｅｌの重なり部分を有す
る２本鎖ＤＮＡセグメントを形成する）をキナーセ処理
し、アニーリングする。このリンカ−は以下の構造を有
している ｄｅ　１ プラスミドｐＢＷ２８の構築に必要な第３のフラグメン
トは以下のようにして調製した。ＴＥ緩衝液（２０μの
中のプラスミドｐＴＰＡ１０３（約２０μ９）を、１０
ＸＢａ＋ｍＨＩ緩衝液（ｌＯμＱ）およびｄＨｔＯ（６
０μ＆）に加えた。このプラスミドｐＴＰＡ１０３　Ｄ
ＮＡの溶液に、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０μａ；約５０
単位）を加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキ
ュベートした。このＢａｍＨＩ消化のプラスミドｐＴＰ
Ａ１０３　　ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心して
集め、１０　Ｘ　ＥｃｏＲＩ緩衝液（１０μＱ）および
ｄＨｔＯ（８０μＱ）に再懸濁した。このＢａｍＨＩ消
化したプラスミドｐ’ｒ　Ｐ　ＡＩＱ３　ＤＮＡの溶液
に、制限酵素ＥｃｏＲＩ（１０μＱ；約５０単位）を加
え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートし
た。ＴＰＡのカルボキシ末端の暗号配列を含有する〜６
８９ｂｐＥｃ。
Ｒ［−ＢａｍＨＩ制限フラグメントが他の消化産物から
分離するまで、このＢａｎＨＩ　−ＥｃｏＲＩ消化した
プラスミドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡを１．５％アガロ
ースゲル電気泳動にかけた。上記のように、この〜６８
９ｂｐフラグメント（約０．５μ９）をゲルから単離し
、次いでｄＨ，０（ｔｏμｇ）に再懸濁した。
プラスミドｐＢＷ２８の構築に必要な最後のフラグメン
トはプラスミドｐＬ１１０［欧州特許出願節８６３０６
４５２．３号（１９８７年４月８日にＥＰ　Ａ　Ｏ２１
７５２９のもと公開された）に記載のプラスミド］から
単離した。プラスミドｐＬ１１０の制限部位および機能
地図は添付の第１２図に示されており、プラスミドｐＬ
］ｌｏの構築は本実施例の下記りに記載されている。
ＴＥ緩衝液（２５μＱ）中のプラスミドｐ［，１１０（
約２Ｆｌｊ）を、１ＱＸＸｂａｌ緩衝液［０，５ＭＮａ
ＣＱ：　６０ｍＭ　　Ｉ−リス＝ＦＩＣ＆（ｐＨ７，９
）＋　６０　ｍＭ　ＭｇＣｈ　；および１１１９／ＪＩ
ｆ２　ＢＳＡ３（ＩＭ）およびｄＨ１○（５５μのに加
えた。このプラスミドｐＬ１１０ＤＮＡの溶液に、制限
酵素Ｘｂａｌ（１０μＣ；約５０単位）を加え、得られ
た反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。この
Ｘ　ｂａ　ｌ　ｆｉｉｌ化したプラスミドｐＬ１１０Ｄ
ＮＡをエタノールで沈設させ、遠心して集め、１０　Ｘ
　　ＢａｍＨ！緩衝液（１０μＱ）およびａ＋４．０（
８９μＱ）に再懸濁した。
このＸｂａｌ消化したプラスミドｐＬＩＩＯＤＮＡの溶
液に、制限酵素ＢａｍＨＩ（ｌμＱ；約５単位）を加え
、得られた反応、１ｋを３７°Ｃで３０分間インキュベ
ートして、ＢａｍＨ１部分消化物を得た。〜６゜Ｏｋｂ
　ＸｂａＴ　−ＢａｍＨＩフラグメントが池の消化産物
から明確に分離するまで、このＸｂａｌ　−Ｂａｍ８１
部分消化したプラスミドｐＬ１１０ＤＮＡを１％アガロ
ースゲル電気泳動にかけた。上記に従って、この〜６．
Ｏｋｂ制限フラグメントをゲルから単離し、約０．５μ
ｙの〜６．Ｏｋｂ　Ｘｂａｌ　−ＢａｍＨＩ制限フラグ
メントを得、これをｄＨ、Ｏ（約４０μｅ）に！ＰＪ、
濁した。この〜６．Ｏｋｂ　ＸｂａＩ　−ＢａｍＨＩ制
限フラグメントは、ＥＫ−ＢＧＨをコードしているＤＮ
Ａを除き、プラスミドｐＬ１１０のすべてを含有してい
る。
プラスミドｐＢＷ２８を構築するため、次のフラグメン
ト、即ち、（１）プラスミドｐＬ１１０の〜６、　Ｏｋ
ｂ　ＢａｍＨＩ−Ｘｂａ［制限フラグメント（約０．１
μ９；８μＱ）、（２）ＭＰ　８　ＢＷ２７の〜５６０
ｂｐ　Ｎｄｅｌ　−Ｅ’ｃｏＲＩ制限フラグメント（約
０．０５μ９；２μの、（３）プラスミドｐＴＰＡ１０
３の〜６８９ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ制限フラ
グメント（約０．１μ９；２μＱ）、および（４）〜４
５　ｂｐ　Ｘ　ｂａ　１Ｎｄｅ１合成リンカー（約０．
０２μ９；ｌμのを混合する。このＤＮＡ混合物に、Ｉ
ＯＸ　Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２μのおよびＴ
４　　ＤＮＡリガ＝ゼ（１μｅ；約１バイス単位）を加
え、得られたライゲーション反応液を４℃で一夜インキ
ユベートする。ライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミ
ドｐＢＷ２８からなっている。プラスミドｐＢＷ２８の
制限部位および機能地図を添付の第１２図に示す。
このライゲート化ＤＮＡを用い、５ＱｍＭＣａＣＱ、を
用いること以外は実質的に実施例３の方法に従って、コ
ンピテントにしておいた大腸１Ｋ１２　ＭＭ２９４（Ｎ
ＲＲＬ　　Ｂ−１５６２５，１９８３年９月２８日寄託
）を形質転換した。プラスミドｐＢＷ２８上にラムダｐ
ｔ、プロモーターおよび感温性ラムダｐＬリプレッサー
をコードしている遺伝子が存在しているため、形質転換
方法および形質転換体の培養方法を若干変えた。形質転
換および次いで行う培養において、細胞を３２°Ｃ以上
の温度にしなかった。ラムダｐＬプロモーターおよびそ
の感温性リプレッサーをコードするプラスミドを操作す
る方法を、本実施例のＤにおいてさらに詳述する。目的
の大腸菌Ｋ　１２　ＭＭ２９４／ｐＢＷ２８形質転換体
を、そのテトラサイクリン耐性かつアンピシリン感受性
の表現型およびそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
よって同定した。
（以下、余白） Ｄ、プラスミドｐＬ１１０の構築 プラスミドｐＫＣ２８３を出発物質として用いてプラス
ミドｐＬ　１１０を構築した。大腸菌Ｋ１２　　ＢＥ　
１２０１／ｐＫＣ２８３の凍結乾燥品を、取得番号ＮＲ
ＲＬ　　Ｂ−１５８３０（１９８４年８月３日寄託）の
もと、ＮＲＲＬから人手した。この凍結乾燥品をＬブロ
ス＜　ｔ　ｏ　ＩＩ（２）の入った試験管内にデカンテ
ーションし、３２℃で２時間インキュベートした。この
時点で培養物を５０μ９／ｍＱアンピシリンとし、次い
で、３２°Ｃで一夜インキコベートした。プラスミドｐ
ＫＣ２８３はｐＬプロモーターを含んでおり、かつ大腸
菌に１２　　ＢＥ１２０１細胞は細胞性ＤＮＡに組込ま
れた温度感受性のＣＩリプレッサー遺伝子を含有してい
るので、大腸菌Ｋ１２　　ＢＥ１２０１／ｐＫＣ２８３
細胞を３２°Ｃで培養した。本明細書中、後の実施例に
記すように、このプラスミドの単離工程に野生型のラム
ダｐＬリプレッサー遺伝子を含む細胞、あるいはラムダ
ｐＬプロモーターを含まない細胞を用いる場合には、イ
ンキュベーション温度を３７°Ｃとした。
一夜培養物の少量をとり、大腸菌に１２　　ＢＥ１２０
１／ｐＫＣ２８３の単一のコロニー単離体が得られる様
な方法で、５０μｙ／ｍＱアンピシリンａ有のし一寒天
プレートに蒔いた。得られた単一のコロニーを５０Ｍｇ
／ｙｐＱアンピシリン含有のしブロス（１０ｘＱ＞に接
種し、激しく振盪しながら３２℃で一夜インキユベート
した。このｌｏｗ（の−夜培養物をＬブロス（５００５
１（りに接種し、培養物が定常相に達するまで激しく振
盪しながら３２℃でインキュベートした。次いで、実質
的に実施例３の方法に従って、この細胞からプラスミド
ｐＫＣ２８３ＤＮＡを調製した。約ｌａｗのプラスミド
ｐＫＣ２８３が得られ、これをＴＥ緩衝液中、約１μ９
／　ｘ（ｌの濃度で、４°Ｃで保存した。プラスミドｐ
ＫＣ２８３の制限部位および機能地図を添付の第１２図
に示す。
プラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡ（１０μＱ、約１０μ９
）を、１０Ｘの中−塩制限緩衝１ｆｆｌ［５００ｍＭＮ
ａＣｆｆ；　１００ｍＭ　　トリｘ−ＨＣ＆（ｐＨ７，
５）；１００　ｍＭ　ＭｇＣ（１２；および１０ｍＭ　
ＤＴＩＩ（２０ｕρ）、１ＩＩｙ／＋ρＢ　ＳΔ（２０
μＲ）、制限酵素Ｐｖｕ１１（５μＱ、約２５単位）お
よびｄ［−１，０（１４５μｇ）と混合し、得られた反
応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。本明細書
中に記載の制限酵素反応は、常法により、フェノール、
次いてクロロホルムで抽出することによって停止させ、
続いてＤ　Ｎ　Ａを沈澱させ、エタノール洗浄し、そし
てＤＮＡをＴＥ緩１１１液に再懸濁させる。上記のよう
にしてＰｖｕ１１消化を停止させた後、Ｐｖｕｌｌ消化
プラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡを沈澱させ、次いで、Ｔ
Ｅ緩衝液（５μＱ）に再懸濁した。
Ｘｈｏｌリンカ−（５’−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３“）［
約６００ピコモル（ｐＭ）］を、５ｘキナーセ緩ｆｆ１
ｉ＆［３００ｍＭトリス−Ｈ（１！（ｐｉ−＋　７．８
）　：　５０＋ｎＭ　Ｍｇ、ＣＱ、　；および２５ｍＭ
　ＤＴＴ］（ｌ　Ｏｕの、５ｍＭＡＴＰ（５μＱ）、ｄ
Ｈ，○（２４頭）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ［０
，５μＱ：　Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の定義で約２．５単位］、Ｌａ９
／ｍ（１ＢＳＡ（５μｇ）、およびＩＯｏ＋Ｍスペルミ
ジン（５μρ）を含む混合物中、混合物を３７°Ｃで３
０分間インキュベートすることによってキナーゼ処理し
た。このキナーゼ処理したＸｈｏリンカ−（約１２．５
　μｆｆ）をＰｖｕｌｌ−消化プラスミドｐＫＣ２８３
ＤＮＡ（５μＱ）に加え、次いで、このＤＮＡに、１０
Ｘ　ＩＪガーゼ緩衝液（２，ＦＭ２）、Ｔ４　ＤＮＡリ
ガーゼ［２，５μＱ：約２．５単位（Ｐ−Ｌバイオケミ
カルズの定義）］、ｌＯｎＭスペルミジン（２，５μの
およびｃｕｔｔｏ（１２，５μρ）を加えた。得られた
ライゲーション反応液を４℃で一夜インキユベートした
。
ライゲーション反応の後、反応混合物の組成を高塩緩衝
液［０，ＩＭ　ＮａＣＱ：　０．０５Ｍ　トリス−ＨＣ
ｆ２（＋）Ｈ７，５）；　１０ｍＭ　ＭｇＣ＆ｆｆｉ：
および１ｍＭＤＴＴ］の組成に調節した。この混合物に
制限酵素Ｘｈｏｌ（約１０μＣ；１００単位）を加え、
得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした
。
ライゲーション混合物にＸｈｏｌリンカ−を加えないと
いうこと以外は上記と同様にして、反応を停止させ、Ｘ
ｈｏｌ消化ＤＮＡを沈澱させ、再懸濁し、ライゲートさ
せた。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＫＣ
２８３ＰＸからなっていた。プラスミドｐＫＣ２８３Ｐ
Ｘの制限部位および機能地図を添付の第１２図に示す。
大腸菌に１２Ｍ０（λ゛）は、ＮＲＲＬから、取得番号
ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５９９３（１９８４年８月１４日寄
託）のもと入手することができる。この大腸菌に１２Ｍ
０（λ゛）は野生型のラムダｐＬｃｌリプレッサー遺伝
子を含有しているので、ラムダｐＬプロモーターからの
転写は、この大腸菌Ｋ１２Ｍ０（λ゛）細胞内では起こ
らない。大腸菌に１２Ｍ０（λ゛）の単一コロニーを単
離し、そしてこの細胞の一夜培養物（ｌ　Ｏ＊Ｃ）を調
製する（増５１へ培地にアンピシリンを用いない）。−
夜培ｉ物（５０μのを１０　ｍＭ　ＭｇＳ　Ｏ、および
ｌ　ＱｍＭ　ＭｇＣσ、含有の１７ブロス（５ＲＩ２）
に接種した。この培養物を、激しく振盪しなから３７℃
で一夜インキユベートした。翌朝、培養物をｌ　ＯｍＭ
　Ｍｇ５Ｏ，および１０ｍＭ　ＭｇＣ（ｌｚ含ｆｆのＬ
ブロスで２００ＲＱに希釈した。この希釈培養物を激し
い振−は下において、ＯＤ、ｓｓｏが約０．５（約ｌＸ
ｌ０”細胞／ＩＱの細胞密度を示す）に達するまで、３
７°Ｃでインキュベートした。氷−水浴中で１０分間、
培養物を冷却し、次に４℃、４０００Ｘ９で１０分間遠
心して細胞を集めた。この細胞ペレットを冷１０ｍＭＮ
ａｃｌ（１００ｍのに再懸濁した後、直ちに遠心して再
ペレ、ト化した。この細胞ペレットを３０ｍＭＣａＣ１
２！（１００＊Ｑ＞に再懸濁し、水上で２０分間インキ
ュベートした。
遠心して細胞を再び集め、３０ｍＭ　ＣａＣｅ、（１０
ｍの中に再懸濁した。細胞（０，５＋ｙのを上記で調製
したライゲート化ＤＮＡに加えたくこのＤＮＡは３０ｍ
Ｍ　ＣａＣＱｅに調製しておいた）。この細胞−ＤＮＡ
混合物を水上で１時間インキュベートし、４２°Ｃで９
０秒間熱シヨツクを加えた後、氷上で約２分間冷却した
。この細胞−ＤＮＡ混合物を１２５１Ｒ１２のフラスコ
中のＬブ’　ス（１０ｚＮ）＋＝希釈し、３７℃で１時
間インキュベートした。この１００μａずつをアンピシ
リン含有のし一寒天プレートで平板培養し、コロニーが
現われるまで３７℃でインキュベートした。
コロニーを個々に培養し、各コロニーのプラスミドＤＮ
Ａを制限酵素分析とゲル電気泳動によって調べた。プラ
スミドＤＮＡの単離は、実質的に実施例３の方法に従い
、小さいスケールで行なったが、所望の大腸菌に１２　
Ｍ○（λ’）／ｐＫＣ２８３ＰＸ形質転換体が同定され
るまではＣ５ＣＱ勾配の工程を削除した。プラスミドｐ
ＫＣ２８３ＰＸの制限部位および機能地図を添付の第１
２図に示す。
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸ　ＤＮＡ（１０μ９）を、
１０Ｘの高−塩緩樹液（２０μの、１　ｏ／　ａ（ｌ　
ＢＳＡ（２０μＱ）、制限酵素Ｂｇｌｌ＋（５μＱ；約
５０単位）、制限酵素Ｘｈｏｌ（５ｕ（！；約５０単位
）およびｄ　Ｈｔ　Ｏ（１５０ｉｔＱ’）に溶解し、得
られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。
反応を止め、Ｂｇｌｌｌ−Ｘｈｏｌ消化ＤＮＡを沈澱さ
せた後、ＤＮＡをＴＥ緩衝液（５μのに再懸濁した。
実施例１に記載のように自動ＤＮＡ合成機を用いて、Ｂ
ｇｌｌｌおよびＸｈｏｒ制限酵素切断の特徴を有する１
本鎖ＤＮＡ末端のＤＮＡリンカ−を合成し、実施例７Ａ
に記載のようにキナーゼ処理した。
このＤＮＡリンカ−は次の構造を有している：こめリン
カ−とＢｇｌｌｌ−ＸｈｏＩ消化プラスミドｐＫＣ２８
３ＰＸとを実質的に上記のライゲージコン方法に従って
ライゲートさせた。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラ
スミドｐＫＣ２８３Ｌをからなっていた。プラスミドｐ
ＫＣ２８３−Ｌの制限部位および機能地図を添付の第１
２図に示す。
プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　ＤＮＡを用いて大腸菌に
１２Ｍ０（λ°）を形質転換し、得られた大腸菌Ｋ　１
２Ｍ０（λ”）／ｐＫＣ２８３−Ｌ形質転換体を、その
アンピシリン耐性の表現型およびそのプラスミドＤＮＡ
の制限酵素分析によって同定した。
プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　　ＤＮＡ（約１０μｇ）
を、ｌＯｘの高−塩緩樹液（２０μ１２）、ｌｘ９／ｘ
ｆｆ　ＢＳＡ（２０μ０、制限酵素Ｘｈｏｌ（５μ＋２
；約５０単位）、およびｄＨｔｏ　（１５５ｕ（りニ溶
解シ、得うした反応液を３７°Ｃで２時間インキュベー
トした。
次いで、ＸｈｏＩ消化プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＤＮ
Ａを沈澱させ、そしてＩＯＸのニック−トランスレーシ
ョン緩衝液［０，５Ｍ１−リス−ＨＣ１２（ｐＨ７，２
）：　Ｏ，ＩＭ　Ｍｇ５Ｏ，；および１ｍＭＤＴＴ］（
２μＱ）、デオキシヌクレオチドトリホスフェート各２
ＩＩＩＭずツヲ含む溶液（ｌｕ□、ｄＨｔｏ　（１５μ
＋り、フレノウ酵素［１μＱ；約６単位（Ｐ−Ｌバイオ
ケミカルズの定義）］、および１１９７ＲＱ　ＢＳＡ（
１ｕＣ）中に再懸濁した。得られた反応液を２５°Ｃで
３０分間インキュベートし、この反応液を７０°Ｃで５
分間インキュベートすることにより反応を止めた。
ＢａｍＨＩリンカ−（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧ−３
°）をキナーゼ処理し、Ｘｈｏｌ消化してフレノウ処理
したプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　ＤＮＡに、実質的に
上記のリンカ−のライゲーション方法に従ってライゲー
トさせた。ライゲーション反応の後、このＤＮＡを、高
−塩緩衝液中、３７°Ｃで約２時間、ＢａｍＨｌ（約１
００単位）で消化した。このＢａｍＨｒ消化の後、ＤＮ
Ａをライゲーション用に調製し、実質的に上記の方法に
従い、〜５．９ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメントをラ
イゲーションによって環化し、大腸菌に１２Ｍ０（λ°
）に形質転換した。大腸菌に１２Ｍ０（λ”）／ｐＫＣ
２８３−ＬＢ形質転換体を同定し、次いで、実質的に実
施例３の方法に従って、この形質転換体からプラスミド
ｐＫＣ２８：３−ＬＢ　　ＤＮＡを調製した。プラスミ
ドｐＫＣ２８３−ＬＢの制限部位および機能地図を添付
の第１２図に示す。
実質的に上記の方法に従い、プラスミドｐＫＣ２８３Ｐ
Ｘ（約ｌＯμｇ）を高−塩緩衝液中で制限酵素５ａｌＩ
により消化し、フレノウ酵素処理し、ＥｃｏＲＩリンカ
−（５°−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣ−３’　）とライ
ゲートさせた。制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することによ
り〜２．ｌｋｂのＤＮＡを除去した後、ライゲーション
して〜４．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを環化
し、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３を得た。このライゲ
ート化ＤＮＡを用いて大腸菌Ｋ　ｌ　２Ｍ０（λ°）を
形質転換し、大腸菌に１２Ｍ０（λ゛）／ｐＫＣ２８３
ＰＲＳ形質転換体を同定した後、実質的に実施例３の方
法に従って、この形質転換体からプラスミドｐＫＣ２８
３ＰＲ３ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＫＣ２８３Ｐ
Ｒ８の制限部位および機能地図を添付の第１２図に示す
。
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３（約１０μ９）を、高−
塩緩樹液（２０Ｏｕ□中、制限酵素Ｐｓｔｌおよび５ｐ
ｈｌ（それぞれ約５０単位）で消化した。反応液を３７
°Ｃで約２時間インキュベートした後、反応混合物を、
０．６％低−融解温度アガロース［ＦＭＣフーポレイン
ヨン（ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｍａｒｉｎｅ
Ｃｏｌｌｏｉｄｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｌａ
ｎｄ、　Ｍａｉｎｅ　０４８４１）］ゲルにより電気泳
動した。
ゲルを臭化エチジウムの希溶液で染色し、〜０８５ｋｂ
　ＰｓＬ［−３ｐｈ［制限フラグメントを含有するＤＮ
Ａバンドを長波長のＵＶ光で観察し、これを小さなセグ
メントとしてゲルから切り取った。
このゲルセグメントの容積をセグメントのｆｆ１ｆｆｉ
と密度から求め、ゲルセグメントを入れた試験管に等容
ｆｆ１（７）１０ａ＋ＭＦ’ＪスーＨＣＱ（ｐＨ７，６
）を加えた。次いで、このゲルセグメントを７２℃でイ
ンキュベーションして溶融した。２回フェノール抽出し
、エタノール沈澱させた後、プラスミドｐＫＣ２８３Ｐ
ＲＳの〜０．８５ｋｂ　Ｐｓｔｌ−３ｐｈｌ制限フラグ
メント（約１μ９）を約ｌＯＯμＱ容量中に得た。同様
にして、プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢを制限酵素Ｐｓ
ｔｌとＳｐｈ［で消化し、アガロースゲル電気泳動によ
って〜３．Ｏｋｂ制限フラグメントを単離し、ライゲー
ジコン用に調製した。
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３の〜０．８５ｋｂＰｓｔ
ｒ−３ｐｈｌ制限フラグメントをプラスミドｐＫＣ２８
３−ＬＢの〜３．Ｏｋｂ　Ｐｓｔｌ　−３ｐｈｌ制限フ
ラグメントにライゲートした。このライゲート化たＤＮ
Ａは所望のプラスミドｐＬ　３２からなっていた。プラ
スミドｐＬ３２の制限部位および機能地図を添付の第１
２図に示す。プラスミドｐＬ３２を大腸菌に１２Ｍ０（
λ°）細胞に形質転換し、実質的に実施例３の方法に従
い、大腸菌に１２Ｍ０（λ”）／ｐＬ３２形質転換体か
らプラスミドｐＬ３２　ＤＮＡを調製した。プラスミド
１）Ｌ３２　ＤＮＡの分析の結果、プラスミドｐＫＣ２
８３ＰＸのフレノウ処理した５ａｌｌ末端には１以上の
ＥｃｏＲ［リンカ−が結合していることが分った。１以
上のＥｃｏＲ１リンカ−の存在はプラスミドｐＬ３２ま
たはプラスミドｐＬ３２誘導体の有用性には何ら影響を
及ぼさず、またそのことは、２個のＥｃｏＲ１リンカ−
が−緒にライゲートした場合には必ず生成するＸｈｏＩ
制限部位の存在によって検出することができる。
プラスミドｐｃｃｌｏ１は、米国特許筒４、γ４５．０
６９号（１９８８年５７１ｘ７日発行）の実施例３に記
載されている（引用して本明細書に記載する）。プラス
ミドｐｃｃ１０１の制限部位および機能地図を添付の第
１２図に示す。Ｅ　Ｋ−Ｂ　Ｇ　Ｉ（−暗号化ＤＮＡを
単離するために、プラスミド川０１（約１０μ９）を、
制限酵素Ｘｂａ［およびＢａｍＨＩ（それぞれ約５０単
位）を含む高−塩緩衝ｉｌ＆（２００μＱ）中で消化し
た。消化産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、Ｅ　
Ｋ−Ｂ　Ｇ　Ｈをコードしている〜０．６ｋｂＸｂａｌ
　−Ｂａ第１−１１制限フラグメントをゲルから単離し
てライゲーションに備えた。
プラスミドｐＬ３２も制限酵素Ｘｂａ［およびＢａｍＨ
Ｉで消化し、〜３．９ｋｂ制限フラグメントを単順し、
ライゲーション用に備えた。プラスミドｐＬ３２の〜３
．９ｋｂ　Ｘｂａｌ　−ＢａｍＨ［制限フラグメントを
プラスミドｐｃｃ１０１の〜０．６ｋｂＸｂａｌ　−Ｂ
ａｍＨＩ制限フラグメントにライゲートして、プラスミ
ドｐＬ４７を得た。プラスミドｐＬ４７の制限部位およ
び機能地図を添付の第１２図に示す。プラスミドｐＬ４
７を大腸菌Ｋ１２Ｍ０（λ°）に形質転換し、大腸菌Ｋ
Ｉ２ＭＯ（λ゛）／ｐＬ４７形質転換体を同定した。実
質的に実施例３の方法に従って形質転換体からプラスミ
ドｐＬ４７　　ＤＮＡを調製した。
プラスミドｐＰＲ１２は、温度感受性ｐＬリプレッサー
遺伝子ｃ［８５７とプラスミドｐＢ　Ｒ３２２のテトラ
サイクリン耐性付与遺伝子を含有している。
プラスミドｐＰＲ１２は米国特許第４．４３６．８１５
（１９８４年３月１３日発行）に開示され、特許請求さ
れている。プラスミドｐＰＲ１２の制限部位および機能
地図を添付の第１２図に示す。
プラスミドｐＰＲ１２（約１０μのを、高−基紙樹液（
２００μの中、制限酵素ＥｃｏＲＩ（約５０単位）によ
り、３７℃で２時間消化した。このＥｃ。
Ｒ１消化プラスミドｐＰＲ１２ＤＮＡを、実質的ニ上記
の方法に従って沈澱させ、次いでフレ７つ酵素で処理し
た。フレノウ反応の後、ＥｃｏＲ１消化してフレノウ処
理したプラスミドｐＰＲ１２ＤＮＡをライゲーションし
て再環化した。実質的に実施例３の方法に従い、所望の
プラスミドｐＰＲ１２△Ｒ１を構成しているライゲート
化ＤＮＡを用いて大腸菌Ｋ１２　　ＲＶ３０８を形質転
換した。
形質転換体は、テトラサイクリン（ｌＯｕ９／ＩＲＩ２
）耐性に基づいて選択を行った。大腸菌に１２　ＲＶ３
０８／ｐＰＲ１２△Ｒ１形質転換体を同定した後、実質
的に実施例３の方法に従い、プラスミドｐＰＲ１２△Ｒ
ＩＤＮＡを形質転換体から調製した。
プラスミドｐＰＲ１２△Ｒ１（約ｌＯμ９）を、中−基
紙樹液（２００ｕＣ）中、制限酵素ＡＶａｌ（約５０単
位）により３７℃で２時間消化した。ＡＶａｌ消化プラ
スミドｐＰＲ１２△ＲＩ　　ＤＮＡを沈澱させ、フレノ
ウ酵素で処理した。フレノウ反応の後、このΔｖａｌ？
ｆ’ｌ化してフレノウ処理したプラスミドｐＰＲ１２△
ＲＩＤＮＡとＥｃｏＲＩリンカ−（５′ＧＡＧＧＡＡＴ
ＴＣＣＴＣ−３’　）をライゲートし、沈澱させ、約５
０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを含む高−基紙樹液（約２
００μＱ）に再懸濁し、３７°Ｃで約２時間インキュベ
ートした。このＥｃｏＲＩ消化の後、実質的に上記の方
法に従って、反応混合物を０．６％低溶融アガロースゲ
ルにかけ、〜５．ｌｋｂのＥｃｏＲＩ制限フラグメント
をゲルから精製し、ライゲーションにより再環化し、所
望のプラスミドｐＰＲ１２ΔＲ１を得た。実質的に実施
例３の方法に従い、プラスミドｐＰＲ１２ＡＲＩ　　Ｄ
ＮＡを用いて大腸菌Ｋ１２　ＲＶ３０８を形質転換した
。形質転換体の選択はテトラサイクリン耐性に基づいた
。
実質的に実施例１の方法に従って、形質転換体からプラ
スミドｐＰＲ１２ＡＲＩ　　ＤＮＡを調製した。
プラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１の制限部位および機能地図
を添付の第１２図に示す。
プラスミドｐＰＲ１２ＡＲＩ　　ＤＮＡ（約１０μ９）
を、制限酵素ＰｓＬＩおよびＥｃｏＲＩ（それぞれ約５
０単位）を含む高−基紙樹液（約２００　ｒｔｔＱ）に
懸濁し、この消化反応液を３７°Ｃで約２時間インキュ
ベートした。次いで、実質的に実施例３の方法に従い、
この反応混合物を１％アガロースゲルにかけ、プラスミ
ドｐＰＲ１２ΔＲ１の〜２．９ｋｂＰｓｔｌ−ＥｃｏＲ
Ｉ制限フラグメントを単離し、ライゲーション用に調製
した。
プラスミドｐＬ　４７　（約１０μ９）を、高−基紙樹
液（２００μｆ））中、制限酵素ＰｓｔｌおよびＢａｍ
Ｈｌにより３７°Ｃで２時間消化した。このＰｓｔｌ　
−Ｂａｍ）−［［消化ＤＮＡを、実質的に実施例３の方
法に従って１％アガロースゲルにかけ、複製起源および
アンピシリン耐性付与遺伝子の一部を含有する〜２、γ
ｋｂのＰｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを単
離し、ライゲーション用に調製した。別の反応系で、プ
ラスミドｐＬ４７　　ＤＮＡ（約１０μｇ）を、高−基
紙樹液（２００祿）中、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨｌにより３７℃で２時間消化し、うムダｐＬ転写活
性化配列、大腸菌１ｐｐｆＨ訳活性化配列とＥＫ−ＢＧ
Ｈ−暗号化ＤＮＡを含有する〜１゜０３ｋｂのＥｃｏＲ
Ｉ　−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを単離し、ライゲー
ション用に調製した。
プラスミドｐＬ４７の〜２、γｋｂ　Ｐｓｔｌ　−Ｂａ
ｍＨＩ制限フラグメントおよび〜１．０３ｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩ　　ＢａｍＨｉ制限フラグメントを、プラスミドｐ
ＰＲ１２ＡＲ１の〜２．９ｋｂ　Ｐｓｔｌ　−ＥｃｏＲ
Ｉ制限フラグメントにライゲートしてプラスミドｐＬ　
１１０を構築し、このライゲート化ＤＮＡを用いて大腸
菌に１２　ＲＶ３０８を形質転換した。
形質転換体の選択はテトラサイタリン耐性に基づいた。
ＥＫ−ＢＧＭ暗号化領域には、添付図面に示した制限部
位および機能地図には表わされていない２つのＰｓｔｌ
制限酵素認識部位が存在する。プラスミドｐＬ１１０の
制限部位および機能地図を添付の第１２図に示す。
Ｅ、プラスミドｐＢＷ３２の最終的な構築プラスミドｐ
Ｓ　ｖ　２−β−グロビンＤＮＡ（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１
５９２８）（約１０μｇ）を、１ＱＸｌ＋ｉｎｄ＋１１
反応緩衝液（１０μ＆）、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ（５
μＱ；約５０単位）、およびｄＨ２０（８５μのに溶解
し、この反応液を３７°Ｃで２時間保った。次いでこの
反応混合物を０．１５Ｍ　ＬｉＣｆ２とし、２．５倍量
のエタノール加え、ドライアイス−エタン−ル浴でイン
キュベートした後、遠心してＤＮＡをベレット化した。
このＤＮＡベレットを、ｔＯＸの８ｇｌｌｌ緩衝液（１
０μの、制限酵素Ｂｇｕｌ（５μＱ；〜５０単位）、お
よびｄＨ，０（８５μのに溶解し、この反応液を２時間
３７°Ｃに（Ｖっだ。このＢｇｌｌ＋消化の後、反応混
合物を０．８５％アガロースゲルにかけ、電気泳動によ
ってフラグメントを分離した。前記と同様にして、臭化
エチジウムおよび紫外光を用いてゲルを可視化し、目的
の〜４　、２　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ　−Ｂｇｉ１１フ
ラグメントを含有するバンドをゲルから切り出し、実質
的に実施例４Ａの方法に従って精製した。ベレットをａ
Ｈ，ｏ（ｔＯμＱ）に再懸濁した。
このベレットは目的のプラスミドｐＳ　ｖ　２−β−グ
ロビンの〜４．２ｋｂ　Ｈｉｎｄ！ＩＩ−８ｇｌｌｌ制
限フラグメント（〜５μ９）からなっていた。実質的に
上記教示に従って、ＴＰＡをコードしているプラスミド
ｐＴＰＡ１０３の〜２．Ｏｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｂａ
ｍＨ■制限フラグメントをプラスミドｐＴＰＡ１０３か
ら単離した。プラスミドＰＴＰＡ１０３の〜２゜Ｏｋｂ
　Ｈ１ｎｄｌｌｌ　−Ｂ　ａｍＨＩ制限フラグメント（
約５μ９）が得られ、これをｄＨ，０（ＩＱμのに懸濁
し、２０°Ｃで保存した。
プラスミドｐＳ　ｖ　２−β−グロビンの〜４．２ｋｂ
Ｂｇｌｌｌ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグメント（２μ
Ｑ）およびプラスミドｐＴｐΔ１０３の〜２．Ｏｋｂ　
Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメント（４μＱ）を
混合し、次いでＩＯＸリガーゼ緩衝液（２μＩ２）、ｄ
Ｈ，ｏ（１１μｇ）、およびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（
１μ１２：約５００単位）とともに４°Ｃで一夜インキ
ユベートした。ライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミ
ドｐＴＰＡ３０１からなっていた。このプラスミドの制
限部位および機能地図を添付の第１２図に示す。実質的
に実施例３の教示に従い、このライゲート化ＤＮＡを用
いて、形質転換用にコンピテントにした大腸菌に１２　
ＲＲ１細胞（ＮＲＲＬ　Ｂ１５２１０）を形質転換した
。実質的に実施例３の方法に従って、大腸菌Ｋ　ｌ　２
　　ＲＲ１／ｐＴＰＡ３０１形質転換体からプラスミド
ＤＮＡを得た。
プラスミドｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆｒは、ジヒドロ葉酸１
元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子に共有結合したＤＮＡの増幅
および形質転換した真核生物細胞の選択に有用であるｄ
ｈｆｒ遺伝子を含有している。プラスミドｐＳＶ　２−
ｄｈｆｒ［公的に入手可能な大腸菌Ｋ１２ＨＢ１０１／
ｐＳＶ２−ｄｈｒｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）から単離し
た］（１０μｇ）を、ＩＯＸ　　Ｐｖｕｌｌ緩衝液（ｌ
Ｏμ１２）、Ｐｖｕｌｌ制限酵素＜２μＱ：約２０１１
１位）、およびｄｌ−１ｔＯ（８８μＱ）と混合し、得
られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。
フェノールおよびクロロホルム抽出によって反応を止め
、次いでこのＰｖｕｌｌｉ肖化しｔコプラスミドｐＳ　
Ｖ　２−ｄｈｆｒＤＮＡを沈澱させ、遠心して集めた。
以下の方法により、ＢａｍＨＩリンカ−（５−ＣＧＧＡ
ＴＣＣＣＧ−３°）をキナーセ処理しライゲーション川
に調製シタ。ｄＨｔｏ　（５ｕＱ）中のリンカ−（１μ
ｇ）ニ、５Ｘキナーゼ緩衝液（１０μの、５ｍＭＡＴＰ
（５ｕＱ）、Ｂ　Ｓ　Ａ　（１ｕ／ｘ（１，５ｕｉ、１
０ｍＭスペルミジ７　（５μｃ）、ｄＨ−０（１９μ（
り、およびｒ　４　ホＩＪ　ヌクレオチドキナーゼ（約
１０単位、ｌμＱ）を加えた。
次いでこの反応液を３７°Ｃで６０分間インキュベート
し、−２０’Ｃで保存した。Ｐｖｕｌｌ消化したプラス
ミドｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆｒ（５１７ｇ：約５μ９）お
よびキナーゼ処理したＢａｍＨＩリンカ−（１２ｕ＆；
約０゜２５μのを混合し、ｄＨ、Ｏ（１１ｕ１２）、１
０　Ｘ　ＩＪガーゼ緩衝液（２μＱ）およびＴ４　　Ｄ
ＮＡリガーゼ（１μｇ：約１０００単位）とともに１６
°Ｃで一夜インキユベートした。
このライゲーション反応混合物に、１０ＸのＢａｍＨＩ
反応緩衝液（１０ｕＱ）、ＢａｍＨＩ制限酵素（１０ｕ
Ｑ：約５０単位）、およびｄ　Ｈｔ　Ｏ（４８ｕＱ）　
ヲ加え、次いで、この溶液を３７℃で３時間インキュベ
ートした。実質的に実施例４Ａの方法に従って、この反
応液を１％アガロースゲルにかけ、ｄｈｒｒ遺伝子を含
有する目的の〜１．９ｋｂフラグメントをゲルから単離
した。これらの実施例で行なったリンカ−付加のすべて
は、常法によりアガロースゲルで精製することによって
最終ベクターにおける多重リンカ−配列の可能性を減少
させた。フラグメント約３μ９が得られ、これをＴＥ緩
衝液（１０μＱ）に懸濁した。
次に、プラスミドｐＴＰＡ３０１（約１５μＩ２：約ｌ
μｇ）を、上記のようにしてＢａａＨＩ制限酵素で消化
した。プラスミドｐＴＰＡ３０１にはＢａｍＨ【部位が
１つしか存在しないので、このＢａＩＩＩＨＩ消化によ
り直線状のプラスミドｐＴＰＡ３０１　　ＤＮＡが生成
する。このＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＴＰＡ３０
１をエタ／−ルで沈澱させ、ｄＨ。
０（９４μ１２）に再懸濁し、ウシ腸アルカリホスファ
ターゼ（１μのおよび１Ｍトリス−ＨＣｆ２（ｐＨ９，
０）（５μＱ）を用いて６５°Ｃで４５分間ホスファタ
ーゼ処理した。このＤＮＡをフェノール：クロロホルム
で抽出し、次いでクロロホルム：イソアミルアルコール
で抽出し、エタノール沈澱し、ｄＨ，ｏ（２０μＱ）に
再懸濁した。ホスファターゼ処理したプ５スミｌ’ｐＴ
ＰＡ３０１（ｌ　Ｏμ（１：約０．２５ｕ９）を、Ｂａ
ｍＨＩ　　ｄｈｆｒ遺伝子を含有する制限フラグメント
（５μＱ１約１．５μ９）、ＩＯＸリガーゼ緩衝液（３
μＱ）、′ｒ４ＤＮＡＩＪガーゼ（３μ１２：約１５０
０単位）、およびｄＨ，Ｏ（９μＩ２）に加えた。この
ライゲーション反応液を１５°Ｃで一夜インキユベート
した。このライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐＴ
ＰＡ３０３　　ＤＮＡからなっていた。
プラスミドｐ’ｒ　Ｐ　Ａ　３０３を用いて大腸菌Ｋ１
２　　ＲＲＩ（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５２１０）を形質転
換し、得られた大腸菌に１２　　ＲＲＩ／ｐＴＰＡ３０
３形質転換体を、そのアンピシリン耐性の表現型および
そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した
。実質的に実施例３の方法に従って、プラスミドｐ”ｒ
　Ｐ　Ａ　３０３を形質転換体から単離した。
ｐＢＲ３２２レプリコンおよびプラスミドｐＴＰＡ３０
１由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子をコードしている〜２
、γｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−８ｇｌｌｌ制限フラグメント
を単離するため、プラスミドｐＴＰ　Ａ　３０１（約１
０μｇ）を、全反応液容量（４００μＱ）中、３７°Ｃ
で、Ｉ　Ｘ　８ｇｌｌｌ緩衝液中の８ｇｌ１１制限酵素
（２０単位）で完全に消化した。このＢｇｌｌ＋消化の
後、トリス−ＨＣｆ２濃度をｌｌｏｍＭに調整し、３７
℃で、８ｇｌ１１消化したＤＮＡにＥｃｏＲＩ制限酵素
（２０単位）を加えた。ＥｃｏＲＩ消化の後、〜２、γ
ｋｂＥｃｏＲＩ　−８ｇｌｌｌ制限フラグメントが他の
消化産物から分離するまで、このＥ　ｃｏＲＩ　−Ｂ　
ｇ１１１消化したＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動
にかけ、次いで〜２、γｋｂフラグメントを単離し、ラ
イゲージジン用に調製した。
ｄｈｆｒ遺伝子を含有する制限フラグメントを単離する
ため、プラスミドｐＴＰ　Ａ　３０３をＨｉｎｄｌｌｌ
およびＥｃｏＲＩ制限酵素で２重に消化し、ｄｈｆｒ遺
伝子を含有する”−２３４０ｂｐ　Ｅ　ｃｏＲＩ　−Ｈ
１ｎｄｌｌｌ制限フラグメントを単離し、回収した。
ＴＰＡのカルボキシ末端暗号領域およびＳＶ４０プロモ
ーターを含有するプラスミドｐＴＰＡ３０３の〜２．Ｏ
ｋｂ　Ｈ４ｎｄ！ｌｌ−３ｓｔｌ制限フラグメントを単
離するため、プラスミドｐＴＰＡ３０３を、Ｉ　Ｘ　Ｈ
１ｎｄｌｉｌ緩衝液中、Ｈ４ｎｄｌｌｌおよび５ｓｔＩ
制限酵素で２重に消化した。〜１、γｋｂフラグメント
をゲルから単離し、ライゲーション用に調製した。
改良型ＴＰＡのアミン末端暗号領域を含有するプラスミ
ドｐＢＷ２８の〜６８０ｂｐ　Ｘｈｏｌｌ（ライゲーシ
ョンに対しては８ｇ１１１重なり部分と適合しうる）　
−Ｓ　ｓｔ　Ｉ制限フラグメントを単離するため、プラ
スミドｐＢＷ２８（約１０μ？）を、１ＸＸｈｏｌｌ緩
衝液［０，１Ｍトリス−ＨＣｇ（ｐＨ８，０）　；　０
．　ＩＭ　ＭｇＣＱｔ　；　０　、１％トリト：／Ｘ−
１００；および１即／＊ＱＢＳＡ］中、Ｘｈｏｌｌ酵素
で完全に消化した。このＸｈｏｌｌ消化したＤＮＡをエ
タノール沈澱で回収し、次いで５ｓｔｌ酵素で完全に消
化した。
実質的に実施例４Ａの方法に従って、このＸｈｏｌｌＳ
ｓｔ［消化したＤＮＡをアクリルアミドゲルにかけ、目
的のフラグメントをゲルから単離し、ライゲーション用
に調製した。
上記のフラグメント、即ち（１）プラスミドｐＴＰＡ３
０１の〜２、γ　ｋｂ　ＥｃｏＲｒ　−８ｇｌｌｌ制限
フラグメント、（２）プラスミドｐＴＰＡ３０３の〜２
３４　ｋｂ　Ｅ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラ
グメント、（３）プラスミドｐＴＰＡ３０３の〜１、γ
ｋｂＳｓｔｌＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメント、および
（４）プラスミドｐＩ３Ｗ２８の〜０゜６８ｋｂ　５ｓ
ｔｌ　−Ｘｈｏｌ！制限フラグメント（それぞれ約０．
１重ｇ）を−緒にライゲートし、プラスミドｐＢＷ３２
を得た。このライゲーション混合物を用い、５重ｍＭ　
ＣａＣＣ２を用いること以外は実施例３の教示のように
して、大腸菌Ｋ１２ＭＭ２９４を形質転換した。形質転
換体をそのアンピシリン耐性の表現型およびそのプラス
ミドＤＮＡの制限分析によって同定した。
実質的に実施例３の方法に従って、大腸菌Ｋ１２ＭＭ２
９４／ｐＢＷ３２形質転換体からプラスミドｐＢＷ３２
　　ＤＮＡを得た。このプラスミドｐＢＷ３２の制限部
位および機能地図を添付の第１２図に示す。
実施例１２　プラスミドｐＬＰｃｈｄｌ、ｐｔ、ｐｃｈ
ｄ２、ｐＬｐｃｂｄ１（ＧＴ）、ｐＬ　Ｐ　Ｃｈｄ２　
（Ｇ　Ｔ）、ｐＬＰｃｄｈｆｒｌ、ｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆ
ｒ２、ｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈ４ｒ　１　（ＧＴ）およびｐＬ
ＰＣｄｈｆｒ２（ＧＴ）の構築Ａ、プラスミドｐＬＰｃ
ｈｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２の構築 ＴＥ緩衝液（２０μＱ）中のプラスミドｐＢＷ３２（実
施例１１）（約２０ｕ９）を、１０１０ＸＢａ［緩衝液
（ｌｏμＮ）およびｄＨｔｏ（６０μ＋りに加えた。コ
ノプラスミドｐＢＷ３２　　ＤＮＡの溶液に、制限酵素
ＢａｍＨＩ（１０μ１２；約５０単位）を加え、得られ
た反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。この
ＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐＢＷ３２　ＤＮＡをエ
タノールで沈澱させ、遠心して集め、ＩＯＸクレノウ緩
衝液（５μＱ）、ｄＨｔｏ（４５ｕ□およびフレノウ酵
素（２μＱ；約ｌＯＯ単位）に再懸濁した。
この反応液を１６°Ｃで３０分間インキュベートし、次
いで消化産物が明確に分離するまでこの反応混合物を１
％アガロースゲル電気泳動にかけた。実質的に実施例４
Ａの方法に従って、ｄｈｆｒ遺伝子を含有する、プラス
ミドｐＢＷ３２の〜１．９ｋｂクレノウ処理したＢａｍ
ＨＩ制限フラグメントをゲルから単離し、ライゲーショ
ン用に調製した。目的のフラグメントが約４μ９得られ
、これをＴＥ緩ｒＪｉ液（５μａ）に懸濁した。
ＴＥ緩衝液（１００μＱ）中のプラスミドｐＬＰＣｈｙ
ｇｌ（実施例１０）（約２００μ９）を、１０ＸＥｃ。
Ｒ１緩衝液（１５μ１２）およびｄＨ，０（３０μＱ）
に加えた。このプラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌ　　ＤＮＡ
の溶液に、制限酵素ＥｃｏＲＩ’（約５μ（！；約５０
単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで約１０分間
インキコベートした。この短い反応時間は、部分的なＥ
ｃ。
ＲＩ消化物が得られるように算出したものである。
プラスミドｐＬｐｃｈｙｇｔはＥｃｏＲＩ制限部位を２
箇所有しており、そのうちの１箇所は、ハイグロマイシ
ン耐性付与（ＨｍＲ）遺伝子の暗号配列内に存在してい
る。このＩ−１ｍＲ遺伝子内ではないプラスミドｐＬＰ
ｃｈｙｇｌのＥｃｏＲ１部位に、プラスミドｐＢＷ３２
由来の〜１　、９　ｋｂ　ｄｈｆｒ遺伝子含有制限フラ
グメントを挿入することが望ましい。１箇所だけ切断し
たプラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌ　　ＤＮＡが未切断プラ
スミドＤ　Ｎ　Ａおよびその他の消化産物から分離する
まで、この部分的にＥｃｏＲＩ消化したプラスミドｐＬ
Ｐｃｈｙｇｌ　　ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にか
けた。実質的に実施例４Ａの方法に従って、この１箇所
だけ切断したＤＮＡをゲルから単離し、ライゲーション
用に調製した。
１箇所だけＥｃｏＲＩ切断したプラスミドｐｔ、ｐｃｈ
ｙｇｌが約２μＱ得られ、これをＴＥ緩衝液（２５μｍ
２）に懸濁した。この試料に、フレノウ酵素（５μＱ；
約２５単位）、ＩＯＸ　フレノウ緩衝液（５μｅ）、お
よびｄＨ２０（４Ｑμのを加え、得られた反応液を１６
°Ｃで６０分間インキニベートした。このフレノウ処理
してＥｃｏＲ１部分的消化したプラスミドｐＬＰｃｈｙ
ｇｌ　　ＤＮＡを、フェノールで２回、次いでクロロホ
ルムで１回抽出し、エタノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝液
（２５μＱ）に再懸濁した。
プラスミドｐＢＷ３２の〜１．９ｋｂのフレノウ処理し
たＢａｍＨＩ制限フラグメント（約５μＱ）、および１
箇所だけＥｃｏＲＩ切断したプラスミドｐＬＰＣｈｙｇ
　ｌ　　Ｄ　Ｎ　Ａ　（約５μのを混合し、このＤＮＡ
混合物に、１０　Ｘ　！Ｊガーゼ緩衝液（１ｕ（１＞、
ｄＨ，０（５ｕＯ）、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ（１ｔｔＱ
　：約５００単位）、およびＴ４　　ＲＮＡリガーゼ（
ｌμＱ：約２単位）を加え、得られた反応液を１６°Ｃ
で一夜インキユベートした。このライゲート化ＤＮＡは
目的のプラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２
（これらは、ｄｈｆｒ遺伝子を含有している〜ｌ　、　
９　ｋｂフラグメントの配向だけが異なっている）から
なっていた。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例３の方
法に従って、形質転換用にコンピテントにしておいた大
腸菌に１２　ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換した。形質転換
細胞をｌＯＯμ９／πｇアンピシリン含有のし一寒天で
平板培養し、アンピンリン耐性の形質転換体をプラスミ
ドＤＮＡの制限酵素分析によって分析して、大腸菌Ｋ１
２　ＨＢＩ０１／ｐＬＰｃｈｄｌおよび大腸菌Ｋ１２　
ＨＢＩＯ１／ｐＬＰＣｈｄ２形質転換体を同定した。プ
ラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびプラスミドｐＬＰＣｈｄ
２　　ＤＮＡを、実質的に実施例３の方法に従って、適
切な形質転換体から単離した。
プラスミドｐＬＰＣｈｄ３およびｐＬＰＣｈｄ４はプラ
スミドｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２と同様な構
造である。プラスミドｐＬＰＣｈｄ３およびｐＬＰＣｈ
ｄ４は、プラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌの代わりに出発物
質としてプラスミドｐＬＰＣｈｙｇ２を用いる以外は、
プラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬＰＣｈ、ｄ２を構
築するために用いる方法に実質的に従って構築される。
（ＧＴ）の構築 実質的に実施例４Ｂ、１の方法に従って、ブラスミ　ド
ｐＬ　ＰＣｈｄｌ、ｐＬ　ＰＣｈｄ２、ｐＬＰＣｈｄ３
またはｐＬＰＣｈｄ４中のＢＫエンハンサ−とＡｄ２後
期プロモーターの間にある唯一のＸｈｏ１部位にポリー
ＧＴ要素を挿入する。ＸｈｏＩ消化したポリＧＴ要素お
よびＸｈｏｌ消化したプラスミドｐＬＰＣｈｄｌ、ｐＬ
ＰＣｈｄ２、ｐＬＰＣｈｄ３またはｐＬＰＣｈｄ４　　
ＤＮＡをライゲートする。このライゲート化たＤＮＡは
、各々、目的のプラスミドｐＬＰＣｈｄ１（ＧＴ）、ｐ
ＬＰＣｈｄ２（ＧＴ）、ｐＬＰＣｈｄ３（ＧＴ）および
ｐｔ、ＰＣｈｄ４（ＧＴ）からなっている。プラスミド
ｐＬＰｃｈｄ１（ＧＴ）の制限部位および機能地図を添
付の第１３図に示す。
Ｃ，ｐＬＰｃｄｈｆｒｌおよびｐｔ、　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ
２の構築ＴＥ緩衝液（ｌｏｏμ１２）中のプラスミドｐ
ＢＷ３２（約１００ｕ９）を、１０Ｘ１０ＸＢａ緩衝液
（１５μＱ）およびｄＨ！０（２５μｅ）に加えた。こ
のプラスミドｐＢＷ３２　　ＤＮＡの溶液に制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（１０μＱ；約２５単位）を加え、得られた反
応液を３７℃で２時間インキュベートした。実質的に実
施例１０Ａの方法に従って、ＢａｍＨＩ消化したプラス
ミドｐＢＷ３２　　ＤＮ’Ａをフレノウ酵素で処理した
。末端平滑化フラグメントをエタノールで沈澱させ、Ｔ
Ｅ緩衝液（１０μ＋２）中で再懸濁させ、ｄｈｆｒ遺伝
子を含有する〜１．９　ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フラグメ
ントが他の消化産物から分離するまで１％アガロースゲ
ル電気泳動にかけた。次いで、実質的に実施例４Ａの方
法に従って、〜１　、９　ｋｂ制限フラグメントをゲル
から単離し、ライゲーション用に調製した。目的のフラ
グメントが約１０μ９得られ、これをＴＥ緩衝液（５０
μｍ２）に懸濁させた。
実施例１０で調製したＮｄｅ−３Ｌｕｌ消化プラスミド
ｐＬＰＣＤＮＡ（約５　ｕＱ＞を、プラスミドｐＢＷ３
２のフレノウ処理した〜１．９　ｋｂ　ＢａｍＨ［制限
フラグメント（５μ１２）、ＩＯＸリガーゼ緩衝液（１
５μの、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（１μＱ；約１０００
単位）、Ｔ４　　ＲＮＡリガーゼ（１μＱ；約２単位）
、およびｄＨｌｏ（１，５μのに加えた。得られたライ
ゲーション反応液を１６°Ｃで一夜インキコベートした
。ライゲート化ＤＮＡは目的のプラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃ
ｄｈｆｒ　１およびｐＬＰｃｄｈｆｒ２（これらは、ｄ
ｈｆｒ遺伝子を含有している〜ｌ　、　９　ｋｂフラグ
メントの配向だけが異なっている）からなっていた。
実質的に実施例３の方法に従って、このライゲート化Ｄ
ＮＡを用いて、大腸菌Ｋ１２　　ＨＢＩＯＩを形質転換
した。形質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平
板培養し、このプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によっ
て、アンピシリン耐性大腸菌Ｋ　１２　ＨＢ　１０１／
ｐＬＰｃｄｈｆｒｌおよび大腸菌に１２　ＨＢ１０１／
ｐＬＰｃｄｈｆｒ２形質転換体を同定した。
Ｄ、プラスミドｐＬ、　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ　１　（Ｇ　Ｔ
）およびｐＬＰ実質的に実施例４Ｂ、ｌの方法に従って
、ＢＫエンハンサ−とＡｄ２後期プロモーターとの間に
ある、ｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ　１またはｐＬ　Ｐ　Ｃｄ
ｈｆｒ２の唯一のＸｈｏ１部位にポＩＪ−ＧＴ要素を挿
入する。Ｘ１１０１消化したポリーＧＴ要素とＸ　ｈｏ
　！　？ｎ化したプラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ　ｌ
またはｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ　Ｄ　Ｎ　ｌ＼とをライゲ
ートすると、このライケート化ＤＮＡは、各／Ｊ、［１
的ノプラスミドｐＬＰｃｄｈｔ’ｒ１（ＧＴ）およびｐ
ＬＰＣｄｈｆｒ２（ＧＴ）からなっている。
（以下、余白） 実施例１３　プラスミドｐｈｄおよびｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　
）の構築 Ａ、プラスミドｐｈｄの構築 プラスミドｐｈｃ＋を構築するためには、アデニンメチ
ラーゼ（たとえばこれをｄａｍ遺伝子がコードしており
、その遺伝子産物は配列：　５’−ＧＡＴＣ−３’中の
アデニン残基をメチル化する）を欠く大腸菌宿主細胞か
ら、プラスミドｐＬＰｃｈｄｌ　　ＤＮＡ（実施例１２
）（これをプラスミドｐｈｄ構築の出発原料として用い
る）を調製することが必要であった。大腸菌に１２０Ｍ
４８（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５７２５，１９８３年１１月
２３日寄託）は機能的なｄａｍメチラーゼを欠いており
、従って、プラスミドｐｈｄ構築の出発原料として用い
るプラスミドｐＬＰｃｈｄｌ　　ＤＮＡを調製する目的
で使用するのに適した宿主である。
実質的に実施例３の方法に従って、大腸菌に１００Ｍ４
８細胞を培養し、形質転換用にコンピテントにし、プラ
スミドｐＬＰｃｈｄｌを用いてこの大腸菌に１００Ｍ４
８細胞を形質転換した。
実質的に実施例３の方法に従って、この形質転換細胞を
アンピシリン含有のＬ−寒天で平板培養し、アンピシリ
ン耐性の大腸菌Ｋ　１２　０Ｍ４８／ｐＬＰ　Ｃｈｄ　
１形質転換体がコロニーを形成したら、そのコロニーの
１つを用いてプラスミドｐＬＰＣｈｄｌ　　ＤＮＡを調
製した。約１１のプラスミドｐＬＰＣｈｄｌ　　ＤＮＡ
が得られ、これをＴＥ緩１ｉｉｉ夜（約ｌ肩Ｑ）に懸濁
した。
ＴＥ緩衝液（２μＱ）中のプラスミドＰＬＰＣｈｄｌＤ
ＮＡ（約２μ９）を、ＩＱＸ　　Ｂｃｌｌ緩衝液［７５
０ＩＩＩＭＫＣ１２；６０ｍＭ　トリス−ＨＣｒ２（ｐ
Ｈ７，４）１００ｍＭ　Ｍｇ（Ｊｊｚ　；　ｌ　ＯｍＭ
　Ｄ　ＴＴ　；および１ｒｉ９／ｙｘＱ　Ｂ　Ｓ　Ａ］
（２μ０およびａｌ（、○（１４μのに加えた。このプ
ラスミドｐＬＰｃｈｄｌ　　ＤＮへの溶液に、制限Ａｔ
素Ｂ　ｃｌ　Ｉ　（２ｕ（１；約１０単位）を０口え、
得られた反応液を５０’Ｃて２時間インキユヘートした
。このｌ見合物をフェノールで１回、クロロホルムで２
回抽出することによって反応を止めた。
Ｂｃｌｌｔ肖化したプラスミドｐＬＰｃｈｄｌ　　ＤＮ
Ａ（約Ｉ　Ａｌｆりを、ＩＯＸ　Ｔ４　　ＤＮＡリガー
セ緩ｉ！ｊｉ液（１ｕＱ）、ｄＨ，Ｏ（８μ＆）、およ
びＴ４ＤＮＡＩＪガ−ゼ（ｌ　ｕＱ　；約５００単位）
に加えた。このライゲージコン反ＬＪをｌ　６°Ｃで一
夜インキユベートした。このライゲート化ＤＮＡは目的
のプラスミドｐｈｄからなっていた。プラスミドｐｈｄ
は、プラスミドｐＬＰｃｈｄｌから全大きさが約１．４
５ｋｂの２個の近接Ｂａ１ｌ制限フラグメントおよびプ
ラスミドｐＬＰｃａｔ構築の際に結合した余分のＢａ１
ｌリンカ−を欠失することによって得られる。発現させ
ようとするＤＮＡを、プラスミドｐｈｄの唯一のＢａ１
１部位に、発現のための正しい位置で、容易に挿入する
ことができるので、プラスミドｐｈｄは、本発明のＢＫ
ウィルスエンハンサー−アデノウィルス後期プロモータ
ーからのすべてのＤＮＡ配列の発現を容易にする。
このライゲート化ＤＮＡを用い、実質的に実施例３の方
法に従って、大腸菌に１００Ｍ４８を形質転換した。形
質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平板培養し
、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってアンピシリ
ン耐性の大腸菌に１２　ＧＭ４８／Ｐｈｄ形質転換体を
同定した。
プラスミドｐＬＰｃｈｄｌの代わりに出発原料としてプ
ラスミドｐＬＰＣｈｄ２、ｐＬＰＣｈｄ３、またはｐＬ
ＰＣｈｄ４を用いて前述のプラスミドｐｈｄを構築する
方法に実質的に従って、プラスミドｐｈｃ＋に類似のプ
ラスミドを構築することができる。これらの類似のプラ
スミドとプラスミドｐｈｄはハイグロマイシン耐性付与
および／またはｄｈｆｒ遺伝子の配向だけが異なってい
る。
Ｂ、プラスミドｐｈｄ（ＧＴ）の構築 １、プラスミドｐｈｄを用いる構築 実質的に実施例４Ｂ、１の方法に従って、ＢＫエンハン
サ−とＡｄ２後期プロモーターの間にあるｐｈｄの唯一
のＸｈｏ１部位にポリーＧＴ要素を挿入する。Ｘｈｏｌ
消化したポリーＧＴ要素とＸｈｏｌ消化したプラスミド
ｐｈｄＤＮＡとをライゲートした。このライゲート化Ｄ
ＮＡは目的のプラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）からなって
いる。プラスミドｐｈｄ（ＧＴ）の制限部位および機能
地図を添付の第１４図に示す。発現させようとするＤＮ
Ａを、プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）の唯一のＢａ１１
部位に、発現のための正しい位置で容易に挿入すること
ができるので、プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）は、本発
明のポリーＧＴ−ＢＫウイルスエンハンサーーアデノウ
ィルス後期プロモーターからのすべてのＤＮＡ配列の発
現を容易にする。Ｅ１Ａ遺伝子産物のような大きいＤＮ
Ａウィルスの即時型遺伝子産物の存在下、プラスミドｐ
ｈｄ（Ｇ　Ｔ　）は挿入されたＤＮＡ配列の全てに対し
て改良された発現ベクターを与える。
実質的に上記への方法に従って、ライゲート化ＤＮＡを
用いて大腸菌に１００Ｍ４８を形質転換し、大腸菌Ｋ　
１２０Ｍ４８／ｐｈｄ（ＧＴ）形質転換体を選択する。
２、プラスミドｐＬＰｃｈｄ１（ＧＴ）、ｐＬＰＣｈｄ
２（ＧＴ）、ｐＬＰＣｈｄ３（ＧＴ）またはｐＬＰＣｈ
ｄ４（ＧＴ）を用いる構築 別法によれば、プラスミドｐＬＰＣｈｄｌ　ｐＬＰＣｈ
ｄ２、ｐＬＰＣｈｄ３またはｐＬＰＣｈｄ４の代わりに
プラスミドｐＬＰＣｈｄ１　（ＧＴ）、ｐＬＰＣｈｄ２
（ＧＴ）、ｐＬＰＣｈｄ３（ＧＴ）またはｐｔ、　Ｐ　
Ｃｈｄ４　（ＧＴ）（実施例１２Ｂに記載）を出発原料
として用いる以外は、実質的に本実施例の上記Ａの方法
に従って、プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）を調製する。
実施例１４　プラスミドｐＬＰｃＥ１Ａおよびｐｔ、　
ｐｃ　Ｅ　Ｉ　Ａ（ＧＴ）の構築Ａ、プラスミドｐＬＰ
ｃＥ１Ａの構築 アデノウィルス２ＤＮＡのＥ１Ａ遺伝子を単離するため
に、アデノウィルス２ＤＮＡ（ＢＲＬから人手）（約２
０ｕ９）を、ＩＱＸ　Ｂａ１ｌ緩衝液［１１００ＩＩＩ
トリス−ＨＣ（２（ｐＨ７，６）；　１２０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１２＝；　１００ｍＭ　２−メルカプトエタノール；
お、［ｌ’ｉｏ／ｘｃＢｓＡコ（１０μのオヨびｄＨ，
ｏ（８０μのに溶解した。アデノウィルス２ＤＮＡ溶液
に制限酵素Ｂａ１ｌ（ｌ　０ｐ（１；約２０単位）を加
え、得られた溶液を３７℃で２時間インキュベートした
。
Ｅ１Ａ遺伝子を含有する〜１．８ｋｂ制限フラグメント
が他の消化産物から分離するまで、Ｂａ１ｌ消化ＤＮＡ
を１％アガロースゲル電気泳動にかけた。
実質的に実施例４Ａの方法に従って、このゲルから〜１
．８ｋｂフラグメントを単離し、ライゲージコン用に調
製した。目的のフラグメントが約３μ９得られ、これを
ＴＥ緩衝液（２０μのに懸濁した。
ＴＥ緩衝液（５μＣ）中のプラスミドｐＬＰＣＤＮＡ（
約５μｇ）を、１ＱＸｓｔｕｌ緩衝１ｆｆｌ（２μＱ）
およびａＨ，ｏ（１１μ１２）に加えた。このプラスミ
ドｐＬＰＣＤＮＡ溶液に制限酵素Ｓ　ｔｕｔ（２ｔｔＱ
　：約１０単位）を加え、得られた反応液を３７℃で２
時間インキュベートした。Ｓ　ｔｕｌ消化プラスミドｐ
ＬＰＣＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ｌ０ＸＮｄｅｌ
緩衝液（２μのおよびｄＨ，０（１６μｇ）に再懸濁し
た。
このＳ　ｔｕｌ消化プラスミドｐｔ、ｐｃ　　ＤＮＡの
溶液に制限酵素Ｎｄｅｌ（２μｇ；約１０単位）を加え
、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした
。
Ｎ　ｄｅｌ　−Ｓ　Ｌｕｌ？肖化プ白化ミドｐＬＰＣＤ
ＮＡをエタノールで沈澱させ、ＩＯＸクレノウ緩衝液（
５μ１２）およびＨ，０（４２μ１２）に懸濁させた。
ＤＮＡ溶液にフレノウ酵素（３μｅ；約６単位）を加え
、得られた反応液を３７℃で３０分間インキュベートし
た。次いで、〜５．８２ｋｂのフレノウ処理Ｎｄｅｌ−
３ｔｕｌ制限フラグメントが他の反応生成物から明確に
分離されるまで、反応混合物を１％アガロースゲル電気
泳動にかけた。実質的に実施例４Ａの方法に従って、ゲ
ルからフラグメントを単離し、ライゲーション用に調製
した。プラスミドｐＬＰＣの〜５．８：２ｔｂクレノウ
処理Ｎｄｅｌ−３ｔｕｌ制限フラグメントが約２μ９得
られ、これをＴＥ緩衝液（２５μのに懸濁した。
Ｅｌ、ＡｊＲ伝子をコードするアデノウィルス２の〜１
．８ｋｂ　Ｂａ１ｌ制限フラグメント（約９μのおよび
プラスミドｐｔ、ｐｃの〜５．８２ｋｂクレ／つ処理Ｎ
ｄｅｌ　−Ｓ　ｔｕｔ制限フラグメント（３μのを、Ｉ
ＯＸリガーゼ緩衝液く２μＱ）およびｄＨ，Ｏ（４μＱ
）に加えた。Ｔ４　　ＤＮＡリガーセ（１μＱ：約５０
０単位）およびＴ４　　ＲＮＡリガーゼ（ｌμρ；約２
単位）をＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を１６℃で
一夜インキユベートした。
ライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミドｐＬＰＣＥ１
ＡおよびｐＬＰｃＥ１Ａｌ（これらは、Ｅ１Ａ遺伝子の
配向が異なっており、そしておそらくはＢＫエンハンサ
−がプラスミドのＥ１Ａ遺伝子に有している発現促進効
果が異なっている）からなっていた。プラスミドｐＬＰ
ｃＥ１Ａ１と比較するとプラスミドｐＬＰｃＥ１Ａの方
がＥ１ＡプロモーターがＢＫエンハンサ−に近接して設
置されているため、プラスミドｐＬＰｃＥ１Ａを用いる
と、プラスミドｐＬＰｃＥ１Ａｌに比べＥＩ八へ現が高
くなる。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化ＤＮＡ
を用いて大腸菌に１２　　ＨＢＩＯＩを形質転換した。
形質転換細胞を、アンピシリン含有のし一寒天で平板培
養し、アンピシリン耐性形質転換体をそのプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素分析によってスクリーニングし、大腸［
ｌＫ１２ＨＢ１０１／ｐＬＰｃＥ１Ａおよび大腸菌に１
２　ＨＢＩ０１／ｐＬＰｃＥｌΔ１形質転換体を同定し
た。
実質的に実施例３の方法に従って、後の試験に用いるた
めに形質転換体からプラスミドＤＮＡを得た。
実質的に実施例４Ｂ川の方法に従って、ＢＫエンハンサ
−およびＡｄ２後期プロモーターの間にあるプラスミド
ｐＬＰｃＥ１ＡまたはｐＬ、ＰＣＥ１ＡＩの唯一のＸｈ
ｏ１部位にポリーＧＴ要素を挿入する。Ｘｈｏｌ消化ポ
リ−ＧＴ要素およびＸｈｏｌ消化プラスミドｐＬＰＣＥ
１ＡまたはｐＬＰｃＥ１ＡＩ　　ＤＮＡをライゲートす
る。このライゲートしたＤＮＡは、各々、目的のプラス
ミドｐＬＰＣＥ１Ａ（ＧＴ）およびｐＬＰＣＥ　１Ａ　
１（ＧＴ）からなっている。プラスミドｐＬＰＣＥ　１
Ａ（ＧＴ）の制限部位および機能地図を添付の第１５図
に示す。
実施Ｐ月５　プラスミドｐＢＬＴおよびｐＢＬＴ（ＧＴ
）の構築 Ａ、プラスミドｐＢＬＴの構築 ＴＥ緩衝液（１μＱ）中のプラスミドｐＢＷ３２　　Ｄ
ＮＡ（第１２図、実施例１１）（約１μ９）を、ＩＯＸ
ＢａｍＨ１緩衝液（２μＩ２）およびｄＨｔｏ（１５μ
のに加えた。プラスミドｐＢＷ３２　　ＤＮＡ溶液に制
限酵素ＢａｍＨＩ（約２μρ；約ｌＯ単位）を加え、得
られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。
まず反応混合物をフェノールで抽出し、次いで反応混合
物をクロロホルムで２回抽出することによって反応を止
めた。ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＢＷ３２　　ＤＮＡ
（約１μのを、ＩＯＸリガーゼ緩衝液（１μＱ）および
ｄＨｔｏ　（１８ａ１２）ニ加え、ＤＮＡ溶ＭＩ−Ｔ４
　　ＤＮＡリガーゼ（約１μＱ；約５００単位）を加え
た後、得られた反応液を１６°Ｃで一夜インキニベート
した。
ライゲートしたＤＮＡは、目的のプラスミドｐＢＷ３２
ｄｅｌ（約５．６ｋｂの大きさであり、１つのＨｉｎｄ
ｌｌｌ制限部位を有している）からなっていた。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化ＤＮＡ
を用いて大腸菌に１２　　ＨＢＩＯＩを形質転換した。
目的の大腸菌Ｋ　１２　ＨＢ　１０１／ｐＢＷ３２ｃｆ
ｅｌ形質転換体を、そのアンピシリン耐性表現型および
そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した
。実質的に実施例３の方法に従って、後の構築に用いる
ために形質転換体からプラスミドｐＢＷ３２ｄｅｌ　Ｄ
ＮＡを得た。
ＴＥ緩衝液（１ｔｔ１２）中のプラスミドｐＢＷ３２ｄ
ｅｌ（約１　ｕ９）を、１０　Ｘ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ緩衝
液（２μ＆）およびｄＨｔ　Ｏ（１５ｕＱ）に加えた。
制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ（２１７１２；約１０単位）を
、プラスミドｐＢＷ３２ｄｅｌ　ＤＮＡ溶液に加え、得
られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。
実質的に実施例４Ｂに記載の方法に従って、試料をＴＥ
緩衝液（１００μので希釈し、ウシ腸アルカリホスファ
ターゼで処理した。反応液をフェノールで２回、次いで
クロロホルムで１回抽出した。次いで、Ｈｉｎｄｌｌｌ
消化プラスミドｐＢＷ３２ｄｅｌ　ＤＮＡをエタノール
で沈澱させ、ｄＨ！０（１０μｍ２）に再懸濁した。
実質的に実施例６Ａの方法に従って、プラスミドｐＢ　
ａｌ８　ｃａｔ（実施例１８）を制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ
ｌで消化し、修飾したＢＫエンハンサー−アブ／ウィル
ス２後期プロモーターカセットを含有する〜０゜６５　
ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限フラグメントを単離し、ライ
ゲージジン用に調製した。ＴＥ緩衝液（５ｕの中のプラ
スミドｐＢ　ａｌ　８　ｃａｔの〜０．６５　ｋｂ　Ｈ
１ｎｄｌｌｌ制限フラグメント（約０．１μｇ）をＨｉ
ｎｄｌｌｌ消化プラスミドｐＢＷ３２ｄｅｌの溶液（３
μ＋２）に加えた。ＤＮＡ混合物にＴ４　　ＤＮＡリガ
ーゼ（！μσ；約５００単位）およびＩＯＸリガーゼ緩
衝液（１μｍ２）を加え、得られた反応液を１６°Ｃで
一夜インキユベートした。
ライゲートしたＤＮＡは、目的のプラスミドｐＢＬＴか
らなっていた。実質的に実施例３の方法に従って、この
ライゲート化ＤＮＡを用いて、大腸菌に１２　ＨＢＩＯ
Ｉを形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有の
し寒天で平板培養し、アンピシリン耐性大腸菌に１２　
　ＨＢＩＯＩ／ｐＢＬＴ形質転換体を、そのプラスミド
ＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。〜０．６５ｋ
ｂＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントは、Ｈｉｎｄｌｌｌ
消化プラスミドｐＢＷ３２ｄｅｌに、２つの配向のうち
どちらかで挿入することができ（どちらか一方だけがプ
ラスミドｐＢＬＴを生じる）、〜０．６５ｋｂ　Ｈｉｎ
ｄｌＩＩ制限フラグメントの配向を決定して大腸菌に１
２　ＨＢＩＯＩ／ｐＢＬＴ形質転換体を同定した。
実質的に実施例３の方法に従って後の構築に用いるため
に形質転換体からプラスミドｐＢＬＴ　ＤＮＡを調製し
た。
Ｂ、プラスミドｐＢＬＴ（ＧＴ）の構築実質的に実施例
１９の方法に従って、ＢＫエンハンサ−およびＡｄ２後
期プロモーターの間にあるプラスミドｐＢＬＴの唯一の
ＢａｍＨ１部位にポリＧＴ要素を挿入する。ポリーＧＴ
要素およびＢａｍＨ１？肖化プラスミドｐＢＬＴ　　Ｄ
ＮＡをライゲートする。ライゲートしたＤＮＡは、目的
のプラスミドｐＢＬＴ（ＧＴ）からなっている。プラス
ミドｐＢＬＴ（Ｃ；Ｔ）の制限部位および機能地図を添
付の第１６図に示す。
実施例１６　プラスミドｐＢＬＴｈｙｇｌ、ｐＢＬＴｈ
ｙｇ　２、ｐＢ　Ｌ　Ｔ　ｈｙｇｌ（Ｇ　Ｔ　）、ｐＢ
ＬＴｈｙｇ２（ＧＴ）、ｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ　１、ｐ
ＢＬＴｄｈ４ｒ２、ｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｒｒ　１　（ＧＴ
）およびｐＢＬＴｄｈｆｒ２（ＧＴ）の構築Ａ、プラス
ミドｐＢ　Ｌ　Ｔｈｙｇ　１およびｐＢＬＴｈｙｇ２の
横築 ＴＥ緩衝液（４μの中のプラスミドｐＢＬＴ　ＤＮＡ（
実施例１５ＡＸ約４μ９）を、ｌＯＸ１０ＸＢａ緩循ｉ
　ｉ（！＜　（２μＱ）およびｄＨ２０（１２μのに加
えた。プラスミドｐＢＬＴ　　ＤＮＡ溶液に制限酵素Ｂ
ａｍＨ１（２μＱ；約１０単位）を加え、得られた反応
液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。反応混合物
をまずフェノールで、次いでクロロホルムで抽出するこ
とによって反応を停止させた。次いで、ＢａｍＨ１消化
プラスミドｐＢＬＴ　ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、
ＴＥ緩衝液（２メｌＱ）に再懸濁した。
ＴＥ緩衝液（１０μρ）中のプラスミドｐＳ　Ｖ　２　
ｈｙｇ（約１０μｇ）を、ＩＯＸ　ＢａｎＨＩ緩衝液（
１０μ０およびｄＨｔｏ　（７５ｕＱ）に加えた。制限
酵素ＢａｍＨ１（５μＱ：約２５単位）を、プラスミド
ｐＳＶ２ｈｙｇＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を３
７°Ｃで２時間インキュベートした。ＢａｍＨＩ消化プ
ラスミドｐＳＶ２ｈｙｇＤＮＡをエタノールで沈澱させ
、ＴＥ緩衝液（１０μ１２）に再懸濁し、ハイグロマイ
シン耐性付与遺伝子を含有する〜２．５ｋｂ　ＢａｍＨ
１制限フラグメントが他の消化産物から分離するまで、
１％アガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的
に実施例４Ａの方法に従って、〜２．５ｋｂ制限フラグ
メントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した
。目的のフラグメントが約２μ９得られ、ＴＥ緩神ｉｌ
夜（１０μのに）騒濁した。
ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＢＬＴ　　ＤＮＡ（約２　
ｔｔ＋２）およびプラスミドｐＳＶ２ｈｙｇの〜２．５
ｋｂ　ＢａｍＨ１制限フラグメント（１μのを、ＩＯＸ
リガーゼ緩衝液（ｌ　ｕ（Ｄ、ｄＨ，○（５μ（りおよ
びＴ４ＤＮＡリガーゼ（ｌμＱ；約５００単位）に加え
、得られた反応液を１６°Ｃで一夜インキユベートした
。ライゲート化たＤＮＡは、目的のプラスミドｐＢＬＴ
ｈｙｇｌおよびｐＢ　Ｌ　Ｔｈｙｇ２からなっていた。
プラスミドｐＢＬＴｈｙｇｌおよびｐＢＬＴｈＹｇ２は
、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子をコードしている〜
２５ｋｂＢａｍＨ＋制限フラグメントの配向が異なるた
けである。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化ＤＮＡ
を用いて大腸菌に１２ＨＢＩＯ１を形質転換した。形質
転換細胞をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し、ア
ンピシリン耐性大腸菌に１２　ＨＢ　１０１／ｐＢＬＴ
ｈｙｇｌおよび大腸菌に１２　ＨＢ　１０１／ｐＢ　Ｌ
　Ｔｈｙｇ２形質転換体を、そのプラスミドＤＮＡの制
限酵素分析によって同定した。
ＢａｍＨＩでプラスミドを部分消化した後、ＬＰＡとハ
イグロマイシンシストロンの間にあるプラスミドｐＢＬ
ＴｈｙｇｌまたはｐＢＬＴｈｙｇ２のＢａｍＨＩ部位に
ボ１−ＧＴ要素を挿入する。部分消化は、実質的に実施
例１１Ｃに記載のＢａｍＨｔ部分消化に関する一般的な
方法に従って行う。ポリーＧＴ要素および部分的にＢａ
ｍＨ１消化した直線状のプラスミドｐＢＬ’ｒｈｙｇｔ
またはｐＢＬＴｈｙｇ２　　ＤＮＡをライゲートする。
ライゲートしたＤＮＡは、各々、目的のプラスミドｐＢ
　Ｌ　Ｔｈｙｇ　ｌ　（Ｇ　Ｔ）およびｐＢＬＴｈｙｇ
２（ＧＴ）からなっている。プラスミドｐＢＬＴｈｙｇ
１（ＧＴ）の制限部位および機能地図を添付の第１７図
に示す。
Ｃ，プラスミドｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ　１およびｐＢ　
Ｌ　Ｔｄｈｆｒ２の構築 ＴＥ緩衝液（１００μＱ）中のプラスミドｐＢＷ３２（
実施例１１）（約１００μ９）を、ＩＯＸ　　ＢａｍＨ
Ｉ緩衝′に！ｉ、（１５μＱ）およびｄＨａ○（２５μ
Ｑ）に加えた。
このプラスミドｐＢＷ３２　ＤＮＡ溶液にＩｌｌ限酵素
Ｂａｍ１月（１０μρ；約５０単位）を加え、得られた
反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。Ｂａｍ
）Ｉｔ消化プラスミドｐＢＷ３２　　ＤＮＡをエタノー
ルで沈澱させ、ＴＥ緩衝液（１０μＱ）に再懸濁し、ｄ
ｈｆｒ遺伝子を含有する〜１．９　ｋｂ　ＢａｍＨＩ制
限フラグメントが池の消化産物から分離するまで１％ア
ガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的に実施
例４Ａの方法に従って、〜１．　、９　ｋｂ制限フラグ
メントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した
。目的のフラグメントか約１０μ？得られ、これをＴＥ
緩衝液（５０μＱ）に懸濁した。
本実施例のＡで得られたＢａｍＨｌ消化プラスミドｐＢ
ＬＴ　　ＤＮＡ（約２μのおよびプラスミドｐＢＷ３２
の〜１．９ｋｂ　ＢａｍＨｌ制限フラグメント（１μ０
をｔＯＸリガーゼ緩衝液（１μの、ｄＨ，Ｏ（５μのお
よびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（ｌμＱ；約５００単位）
に加え、得られた反応液を１６°Ｃて−夜インキュベー
トした。ライゲートしたＤＮＡは、目的のブラスミｔ’
ｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｒｒ　１およびｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ
２からなっていた。プラスミドｐＢＬＴｄＭｒｌおよび
ｐＢＬＴｄｈｆｒ２は、ｄｈｆｒ遺伝子をフードしてい
る〜１゜９ｋｂＢａｍＨＩ制限フラグメントの配向が異
なるだけである。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化ＤＮＡ
を用いて大腸菌に１２　ＨＢＩＯＩを形質転換した。形
質転換細胞をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し、
アンピシリン耐性大腸菌に１２　　ＨＢ　１０１／ｐＢ
　ＬＴｄｈｆｒｌおよび大腸菌に１２　ＨＢ　１０１／
ｐＢＬＴｄＭｒ２形質転換体を、そのプラスミドＤＮＡ
の制限酵素分析によって同定した。
実質的に実施例１６Ｂの方法に従って、プラスミドｐＢ
　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ　１またはｐＢＬＴｄＭｒ２のＢａｍ
Ｈ１部位にポリーＧＴ要素を挿入する。ポリーＧＴ要素
および部分的にＢａｍＨＩ消化した直線状のプラスミド
ｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ　ｌまたはｐＢＬＴｄｈｆｒ２　
　ＤＮＡをライゲートする。ライゲートしたＤＮＡは、
各々、プラスミドｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｆｒ　ｌ　（ＧＴ）
およびｐＢＬＴｄｈｆｒ２（ＧＴ）からなっている。プ
ラスミドｐＢＬＴｄｈｆｒ１（ＧＴ）の制限部位オヨヒ
機能地図を添付の第１８図に示す。
実施例１７　プラスミドｐｈｄＴ　Ｐ　Ａ　、　ｐｈｄ
（Ｇ　Ｔ　）Ｔ　Ｐ　Ａ、　ｐｈｄＭＴ　Ｐ　Ａおよび
Ｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）Ｍ　Ｔ　Ｐへの構築 Ａ、中間体プラスミドｐＴＰＡ６０２の構築ｄＨ３Ｏ（
４５μ１２）中のプラスミドｐＴＰＡ１０３（実施例１
１、第１２図）（約５０μｇ）を１０ＸＥｃｏＲＩ緩衝
液（３０μＩ２）オヨびｄＨ、Ｏ（２２５μ＆）ニ加え
た。制限酵素ＥｃｏＲＩ（１０ｕＱ　：約８０単位）を
プラスミドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡ溶液に加え、得ら
れた反応液を３７°Ｃで９０分間インキュベートした。
ＥｃｏＲ１消化プラスミドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡを
エタノールで沈澱し、ＩＸローディング緩衝Ｍ［１０％
グリセロールおよび０．０２％ブロモフェノールブルー
］（５０μのに再懸濁し、〜１．１ｋｂＥｃｏＲＩ制限
フラグメントが他の反応生成物から分離するまで１％ア
ガロースゲル電気泳動にかけた。ＴＰＡのアミノ末端を
コードしているＤＮＡを含有する〜１．ｌｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩ制限フラグメントを、透析バッグに電気泳動させる
ことによってゲルから単離した。次いで、フラグメント
をエタノールで沈澱させ、ｄＨ＊ｏ（１６０μｍ２）に
再懸濁した。
ｌＱＸＨｇａｌ緩衝液［０，５Ｍ　ＮａＣ（！；　６０
＠ＭトリスーＨ（Ｊ！（ｐＨ７，４）：およびＯ、ｌ　
Ｍ　ＭｇＣＱｔコ（約４０μの、ｄ　Ｈｔ　Ｏ（２００
ｕ１２）、および制限酵素Ｈｇａｌ（２０ｕＱ　：約１
０単位）を、１．１ｋｂ　ＥｃｏＲＩ制限フラグメント
の溶液に加え、得られた反応液を３７°Ｃで４時間イン
キュベートした。Ｈｇａｌ消化ＤＮＡをエタノールで沈
澱し、次いで、５％アクリルアミドゲル電気泳動にかけ
、ＴＰＡのアミノ末端をコードする〜５２０ｂｐ制限フ
ラグメントをＤＥ８１紙によって分離し、回収した。〜
５２０ｂｐＨｇａｌフラグメントが約５μ２得られ、こ
れをｄＨｔｏ　（５０ｕＱ＞に懸濁した。
１０ｘクレノウ緩衝液［０，５Ｍ　）　１７７．−ＨＣ
１２（ｐＨ７，４）；および０　、１　Ｍ　ＭｇＣ１２
ｔ］（約１２．５μ１２）、４種類のデオキシヌクレオ
チドトリホスファターゼが各々６．２５ｎ＋Ｍである溶
液（２μＱ）、０２Ｍ　ＤＴＴ（２μＩ２）、７μｇ／
１ｔ１２８　Ｓ　Ａ　（１μｍ２）、ｄＨ。
０（５７，５μＩ２）、およびフレノウ酵素［ベーリン
ガーーマンヘイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒ　ｉ
ｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
、　７９４１　Ｃａｓｔｌｅｗａｙ　Ｄｒ、、　ＰＯ，
Ｂｏｘ　５０８１６．１ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉ
Ｎ　４６２５０）］（２ｕ１２：約１０単位）を、〜５
２０ｂｐ　Ｈｇａｌ制限フラグメントの溶液に加え、得
られた反応液を２０°Ｃで３０分間インキュベートした
。フレノウ処理したＤＮＡを７０°Ｃで１５分間インキ
ュベートし、エタノールで沈澱させた。
ＢａｍＨＩリンカ−［５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧ−３
’、二本鎖、二ニー・イングランド・バイラブズから入
手した］（約５００ｐＭ）を、ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いて全反応液量２５μσ中でリン酸化した。実質
的に実施例７Ａに記載の方法に従って、この反応を行っ
た。キナーゼ処理したＢａｍＨＩリンカ−を、フレノウ
処理した〜５２０ｂｐ　Ｈｇａｌ制限フラグメントの溶
液に、ＩＯＸリガーゼ緩衝液（１５μＱ）、Ｔ４　　Ｄ
ＮＡリガーゼ（７μＱ；約７バイス単位）および全反応
液量を１５０μＱにするのに十分な量のｄＨ，０と一緒
に加えた。得られた反応液を１６℃で一夜インキュベー
トシた。
このライゲーション反応液を熱不活性し、ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ、ｌＱＸＢａ第１刊緩衝液（５μ０お
よびｄ）１．０（４５μＱ）に懸濁した。制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ（１μＣ＋約１６単位）をＤＮＡ溶液に加え、得
られた反応液を３７°Ｃで９０分間インキュベートした
。反応混合物にさらにＢａｍＨ１酵素（１６単位）を加
え、反応液を３７°Ｃでさらに９０分間インキュベート
した。次いで、反応混合液を５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、実質的に実施例７Ａの方法に従って
、ＢａｍＨＩ末端を有する〜５３０ｂｐ　Ｈｇａｌ制限
フラグメントをゲルから精製した。目的のフラグメント
が約２μ９得られ、ａＨ，ｏ（２０μＱ）に懸濁した。
ＢａｍＨＩ消化した脱リン酸プラスミドｐＢ　Ｒ３２２
ＤＮＡは、ニュー・イングランド・パイラブズから入手
できる。ｄＨｔｏ（２μσ）中のＢａｍＨＩ消化した脱
リン酸プラスミドｐＢＲ３２２（約０．１ｕｇ）を、プ
ラスミドｐ”ｒｐΔ１０３のＢａｍＨ１末端を有する〜
５３０ｂｐ　Ｈｇａｌ制限フラグメント（１μＱ）、ａ
Ｈｔｏ　（１４μＱ）およびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（
１μｇ；約１バイス単位）に加え、得られた反応液を１
６°Ｃで一夜インキコベートした。ライゲートしたＤＮ
Ａは、目的のプラスミドｐＴＰＡ６０２およびｐＴＰＡ
６０１と命名した等価なプラスミド（〜５３０ｂｐ制限
フラグメントの配向だけがプラスミドｐＴＰ　Ａ　６０
２と異なる）からなっていた。
５０　ｍＭ　ＣａＣ１２２を用いる以外は、実質的に実
施例３の方法に従って、ライゲート化ＤＮＡを用いて大
腸菌に１２ＭＭ２９４を形質転換した。
形質転換細胞をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し
、アンピシリン耐性大腸菌に１２ＭＭ２９４／ｐＴＰＡ
６０２および大腸菌Ｋ　１２　ＭＭ　２９４／ｐＴＰＡ
６０１細胞を、そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
よって同定した。〜５３０ｂｐＢａＴＩＩＨＩ制限フラ
グメントの存在によって、プラスミドがプラスミドｐＴ
ＰＡ６０２またはｐＴＰＡ６０１であることが示された
。
Ｂ、中間体プラスミドｐＴＰ　Ａ　６０３の構築プラス
ミドｐＴＰＡ６０２（約５μりをＩＯＸ　Ｂｇｉ１１緩
衝液（２０μのおよびａｕｔｏ（１８０μのに溶解した
。制限酵素Ｂｇｌｌｌ（３μＱ；約２４単位）をプラス
ミドｐＴＰＡ６０２　　ＤＮＡ溶液に加え、得られた反
応液を３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、
反応混合物にＩＯＸ　　ＢａｍＨＩ緩衝液（約１３μａ
）を加えて反応混合物の塩濃度を５ａｌｔ消化用に望ま
しい濃度にし、制限酵素５ａｌｌ（２μＱ；約２０単位
）を反応液１こ加えた。反応液を３７°Ｃでさらに２時
間インキコベートし、次いで、ＤＮＡをエタノールで沈
澱させ、ローディング緩衝液（７５μ１２）に懸濁させ
、〜４．２ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ−３ａｌＩ制限フラグメン
トが他の消化産物から分離するまで１％アガロースゲル
電気泳動にかけた。〜４゜２ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ−５ａｌ
ｔ制限フラグメントを含有するゲル部分をゲルから切り
取り、凍結し、この凍結セグメントをプラスチックで包
み、圧搾して〜４゜２ｋｂフラグメントを取り出した。
ＤＮＡを沈澱させ、Ｈ，０（２０μＱ）に再懸濁させ、
目的のフラグメントを約２０Ｏｎ９得た。
ブラスミ）’ｐＴＰＡ１０３（約１２ｕ９）を１０ＸＢ
ｇ１１１ｆａｆｆｉ液（１５ｕ＆）およびｄＨ，Ｏ（１
３５μのに溶解した。制限酵素Ｂｇｌｌ＋（２μＱ；約
１６単位）をプラスミドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡ溶液
に加え、得られた反応液を３７°Ｃで９０分間インキュ
ベートした。ＩＱＸ　　ＢａｍＨＩ緩衝液（約１０μ（
りをＢｇｌ［ｌ消化プラスミドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮ
Ａの溶液に加え、反応混合物の塩濃度を５ａｉｌ消化用
の濃度にした。制限酵素５ａｌｌ（約２μＱ：約２０単
位）を、Ｂｇｌ１１消化プラスミドｐＴｐΔ１０３　　
ＤＮへの溶液に加え、反応液を３７°Ｃでさらに９０分
間インキュベートした。Ｂｇｌｌｌ　−Ｓ　ａｌｌ消化
のプラスミドｐＴＰＡ１０３　　ＤＮＡをエタ／−ル沈
澱によって濃縮し、次いで、１％アカロースゲル電気泳
動にかけ、ＴＰＡのアミノ末端以外のすべてをコードす
−る〜２．０５ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ−５ａｉｌ制限フラグ
メントをゲルから単離し、エタノールで沈澱させ、ｄ）
（，０（２０μρ）に再懸濁した。目的のフラグメント
が約２μ９得られた。
プラスミドｐＴＰ　Ａ　６０２の〜４．２ｋｂ　Ｂｇｌ
ｌｌＳ　ａｌｌ制限フラグメント（約５μのおよびプラ
スミ　ドｐＴＰＡ１０３の〜２．０５　ｋｂ　　Ｂｇｌ
ｌｌ　−Ｓ　ａｌｌ制限フラグメント（２μρ）を、１
．ＯＸリガーゼ緩衝ｌ夜（２ｕＱ’）、ｄＨｔｏ（ｌｏ
μのおよびＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（１μａ：約１バイス
単位）に加え、得られたライゲーション反応液を１６°
Ｃで一族インキユベートした。ライゲートしたＤＮＡは
、目的のプラスミドｐＴＰ　Ａ　６０３からなっていた
。プラスミドｐＴＰＡ６０３の制限部位および機能地図
を添付の第１９図に示す。
５０　ｍＭ　ＣａＣＱｔを用いた以外は、実質的に実施
例３の方法に従って、ライゲート化ＤＮＡを用いて大腸
菌に１２ＭＭ２９４を形質転換した。
形質転換細胞をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し
、アンピシリン耐性大腸菌に１２ＭＭ２９４／ｐＴＰＡ
６０３形質転換体を、そのプラスミドＤＮＡの制限酵素
分析によって同定した。
Ｃ，プラスミドｐＭＴＰＡ６０３の溝築ＴＥ緩衝液（１
００μ（１’）中のプラスミドｐＢＬＴ（実施例１５）
（約１００　μｙ）を、１０　Ｘ　　Ｓ　５ｔｌ（Ｓ　
ｓｔｌは制限酵素５ａｃｌと等価である）緩衝液［６０
ｍＭ）リス−ＨＣ（！（＋））（７，４）；　６０ｍＭ
　ＭｇＣ（、；　６０ｍＭ　２−メルカプトエタノール
、および１　ｘｇ／　ｍ（１ＢＳＡ］（ｔｏμＣ）およ
びｄＨｔｏ（２５μυに加えた。
制限酵素５ｓｔｌ（１０μａ；約５０単位）をプラスミ
ドｐＢＬＴＤＮΔ溶液に加え、得られた反応液を３７°
Ｃで２時間インキュベートした。ＳｓｔｌｉＭ化プラス
ミドｐＢＬＴ　　ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ＩＯ
Ｘ　Ｂａ１ｌｌ緩衝液（１０μのむよびｄＨ，０（８５
μＱ）に再懸濁させた。制限酵素Ｂｇｌｌ（５μＱ：約
５０単位）を５ｓｔｌ消化プラスミドｐＢＬＴ　ＤＮＡ
溶液に加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキ
ュベートした。
実質的に実施例４Ａの方法に従って、Ｂｇｌｌ−３ｓｔ
ｌ消化プラスミドｐＢＬＴ　　ＤＮＡをエタノールで沈
澱させ、ｄＨ’、Ｏ（１０μＣ）に再懸濁し、１５％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、プラスミドｐＢＬＴの〜
６９０ｂｐ　Ｂｇｌ！ｌ−３ｓｔｌ制限フラグメント［
修飾ＴＰＡの暗号配列を得るための削除が為されている
修飾ＴＰＡ暗号配列の部分を含有するコをゲルから単離
した。目的の、プラスミドｐＢＬＴの〜６９０ｂｐ　Ｂ
ｇｌｌｌ−３ｓｔｌ制限フラグメントが約５μ９得られ
、これをｄＨ，ｏ（１００μＱ）に懸濁した。
ＴＥ緩衝液（５バ）中のプラスミドｐ’ｒ　Ｐ　Ａ　６
０３（本実施例のＢ、第１９図）（約５μｇ）をｌ０Ｘ
Ｓｓｔｌ緩衝液（ｌ　Ｏμ＋２）およびｄＨ，ｏ（９５
μのに加えた。制限酵素５ｓｔｌ（約５μσ、約５０単
位）をプラスミドｐＴＰＡ６０３　　ＤＮＡの溶液に加
え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュベート
した。Ｓｓｔ！消化プラスミドｐＴＰ、Ａ６０３　　Ｄ
ＮＡをエタノールで沈澱し、ＩＯＸ　　Ｂｇｌｌ＋緩衝
液（１０μＱ）およびｄＨｔｏ（８５μＱ）に再懸濁し
た。制限酵素Ｂｇ１１１（５μｍ２；約５０単位）をＳ
ｓｔ１Ｍ化プラスミドｐＴＰＡ６０３　　ＤＮＡ溶液に
加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュベー
トした。
実質的に実施例４Ｂの方法に従って、Ｂｇｌｌｌ−Ｓｓ
ｔｌ肖化のプラスミドｐＴ　Ｐ　Ａ　６０３　　ＤＮＡ
をＴＥ緩衝液で１００μρに希釈し、ウシ腸アルカリホ
スファターセで処理した。次いで、ＤＮＡをエタノール
で沈澱させ、ａＨｚｏ（１０ｕρ）に再懸濁した。
Ｂｇｌｌｌ　−Ｓ　ｓｔｌ消化プラスミドｐ′ＦＰＡ６
０３（約５μのおよびプラスミドｐＢＬＴの〜６９０ｂ
ｐＢｇ１１１−３ｓｔｌ制限フラグメント（２μ（りを
、ＩＯＸリガーセｇＢ衝液樹液μＩ２）、ｄＨ，０（１
０Ｉｌ＆）、およびＴ４ＤＮＡリカーゼ（１μＱ：約１
０００単位）に加え、得られたライゲーション反応液を
１６°Ｃで一族インキユベートした。ライゲートしたＤ
ＮＡは目的のプラスミドｐＭＴＰＡ６０３からなってい
た。プラスミドｐＭＴＰＡ６０３はプラスミドｐＴＰＡ
６０３（第１９図）の構造に類似しているが、ブラフ、
ミｈｐＭ′ｒＰＡ６０３が修飾ＴＰＡをコードし、プラ
スミドｐＴＰＡ６０３がＴＰＡをコードしていることが
異なっている。
実施例３の方法に従って、ライゲート化ＤＮＡを用いて
大腸菌Ｋ１２ＨＢＩＯ１を形質転換した。形質転換細胞
をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し、アンピシリ
ン耐性大腸菌に１２ＨＢ　１０１．／ｐＭＴＰＡ６０３
形質転換体を、そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
よって同定した。
Ｄ、プラスミドｐｈｄ′ＦＰ　Ａの構築ＴＥ緩衝液（１
０μ１２）中のプラスミドｐ’ｒ　Ｐ　Ａ　５０３［本
実施例のＢ、第１９図］（約ｉｏμｇ）を、１０１０Ｘ
Ｂａ！緩衝液（１０μのおよびｄＨ，○（８５μのに加
えた。制限酵素Ｂａｍ）ＩＩ（５μｇ、約５０単位）を
プラスミドｐＴＰＡ６０３　　ＤＮＡ溶液に加え、得ら
れた反応液を３７°Ｃで２時間インキユベートシた。Ｂ
ａｍＨＩ消化プラスミドｐＴＰＡ６０３ＤＮＡをエタノ
ールテ沈澱させ、ｄＨｔｏ　（１０ｕＱ）に再懸濁させ
、ＴＰＡをコードする〜１．９０ｋｂＢａｍＨＩ制限フ
ラグメントを他の消化産物から分離するまで１％アガロ
ースゲル電気泳動にかけた。
〜１．９０ｋｂ　ＢａｍＨｌ制限フラグメントをゲルか
ら単離し、ＴＥ緩衝液（５０μのに再懸濁し、目的のフ
ラグメントを約４μ９得た。
１０Ｘ　Ｂａ１ｌ緩衝液（２μＣ）およびｄＨｔｏ（１
４μのにＴＥ緩衝液（２μＱ）中のプラスミドｐｈｄ　
（実施例１３）（約２μ９）を加えた。制限酵素Ｂｃｌ
ｌ（２μ＆：約１０単位）をプラスミドｐｈｄ　Ｄ　Ｎ
　Ａ　溶液ニ加え、得られた反応液を５０°Ｃで２時間
インキュベートした。反応混合物をまずエタノールで、
次いでクロロホルムで２回抽出することによって反応を
止めた。次いで、Ｂａ１ｌ消化プラスミドｐｈｄＤＮΔ
をエタノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝液（２０μＱ）中に
再懸濁させた。
Ｂｃｌ！消化プラスミドｐｈｄ（約１μのおよびプラス
ミドｐ’ｒ　Ｐ　Ａ　６０３の〜１．９０ｋｂ　Ｂａｍ
ＨＩ制限フラグメント（２μ１２）を、ＩＯＸリガーセ
緩衝液（１μの、ｄＨ，Ｏ（５μ０、およびＴ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼ（１μＱ；約５００単位）に加えた。得られ
たライゲーンヨン反応液を１６°Ｃで一夜インキユベー
トした。ライゲートしたＤＮＡは、目的のプラスミドｐ
ｈｄＴ　Ｐ　Ａからなっていた。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化ＤＮＡ
を用いて大腸菌に１２　ＨＢＩＯＩ（ＮＲＲＬ　　Ｂ−
１５６２６）を形質転換した。形質転換混合物をアンピ
シリン含有のし寒天で平板培養し、アンピシリン耐性大
腸菌Ｋ　ｌ　２　　ＨＢ　１０１／ｐｈｄＴＰＡ細胞を
制限酵素分析によって同定した。〜１、９０ｋｂ　Ｂａ
ｍＨｌ制限フラグメントは、プラスミドｐｈｄ中に、２
つの配向のうちどちらかで挿入することができ、その一
方においてのみ、ＢＫエンハンサーーアデノウィルス後
期プロモーターカセットのコントロール下で発現され得
る適切な位置にＴＰＡ暗号配列が配置されており、これ
が目的のプラスミドｐｈｄＴ　Ｐ　Ａとなる。
Ｅ、プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）Ｔ　Ｐ　Ａの構築実
質的に実施例４Ｂ。■の方法に従って、ＢＫエンハンサ
−とＡｄ２後期プロモーターの間にあるプラスミドｐｈ
ｄＴ　Ｐ　Ａ　（本実施例のＤ）の唯一のＸｈｏ１部位
にポリーＧＴ要素を挿入する。Ｘｈｏｌ消化ポリ−ＧＴ
要素およびＸｈｏｌ消化プラスミドｐｈｄＴＰＡ　　Ｄ
ＮＡをライゲートする。ライゲートしたＤＮＡは、目的
のプラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）Ｔ　Ｐ　Ａからなって
いる。プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）Ｔ　Ｐ　Ａの制限
部位および機能地図を添付の第２０図に示す。
Ｆ、プラスミドｈｄＭＴＰＡの構築 ＴＥ緩衝液（ｌｏμ＋り中のプラスミドｐＭＴＰＡ６０
３［本実施例のＣ］（約１０ｕｙ）を１０Ｘ１０ＸＢａ
緩衝液（１０μＱ）およびｄＨ，０（８５μｌｌりに加
えた。制限酵素ＢａｍＨＩ（５μＱ；約５０単位）をプ
ラスミドｐＭＴＰＡ６０３　　ＤＮＡ溶液に加え、得ら
れた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
Ｂａ耐１１消化プラスミドｐＭＴＰＡ６０３　　ＤＮＡ
をエタノールで沈澱させ、ｄＨ，０（１０μＱ）に再懸
濁し、修飾ＴＰＡをコードする”−１，３５ｋｂ　Ｂａ
ｍＨ＋制限フラグメントが他の消化産物から分離するま
で１％アガロースゲル電気泳動にかけた。
１、３５　ｋｂ　ＢａｍＨｌ制限フラグメントをゲルか
ら単離し、これをＴＥ緩衝液（２０μａ）に再懸濁し、
目的のフラグメン七を約４μ９得た。
Ｂ　ａｌｌ消化プラスミドｐｈｄ［本実施例のＤ］（約
１μｍ２）およびプラスミドｐＭＴＰΔ６０３の〜１３
５ｋｂＢａｍＨＩ制限フラグメント（２μρ）をＩＯＸ
リガーゼ緩衝液（１μＱ）、ｄＨ，ｏ（５μのおよびＴ
４ＤＮＡリガーゼ（ｌμａ；約５００単位）に加えた。
得られたライゲーション反応液を１６°Ｃで一夜インキ
ユベートした。ライゲートしたＤＮＡは目的のプラスミ
ドｐｈｄＭ　Ｔ　Ｐ　Ａからなっていた。
実質的に実施例３の方法に従って、ライゲート化ＤＮＡ
を用いて大腸菌Ｋ１２ｌ−１ＢＩＯＩを形質転換した。
形質転換混合物をアンピシリン含有のし寒天で平板培養
し、アンピシリン耐性大腸菌Ｋ　１２　　ＨＢ　１０１
／ｐｈｄＭＴＰＡ細胞をそのプラスミドＤＮＡの制限酵
素分析によって同定した。
〜１．３５ｋｂ　ＢａｍＨ１制限フラグメントは、Ｂｃ
ｌｌ消化プラスミドｐｈｄ中に、２つの配向のどちらか
で挿入することができ、その一方だけがＢＫエンハンサ
ーーアデノウィルス後期プロモーターのコントロール下
で発現し得る適切な位置にＴＰＡ暗号配列を配置してお
り、これが目的のプラスミドｐｈｄＭＴ　Ｐ　Ａとなる
。
Ｇ、プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）Ｍ　Ｔ　Ｐ　Ａの構
築実施例４Ｂ、１の方法に従って、ＢＫエンハンサ−お
よびＡｄ２後期プロモーターの間にあるプラスミドｐｈ
ｄＭＴＰＡ［本実施例のＦ３の唯一のｘｈ０１部位にポ
リーＧＴ要素を挿入した。Ｘｈｏｌ消化ノポリーＧＴ要
素とＸｈｏｌ消化のプラスミドｐｈｄＭＴＰＡ　　ＤＮ
Ａをライケートする。ライゲートしたＤＮＡは、目的の
プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）Ｍ　Ｔ　ＰＡからなって
いた。プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）Ｍ　Ｔ　ＰＡの制
限部位および機能地図を添付の第２１図に示す。
実施例１８改良されたエンハンサーープロモーターカセ
ットの構築 近接の真核性プロモーターのＣＣＡＡＴ領域またはＣＣ
ＡＡＴ領域等価域の５゛末端の上流のＯ〜３００ヌクレ
オチドのところにエンハンサ−を設置することによって
、ＢＫエンハンサ−の転写促進効果を有意に増強するこ
とができる。実施例１９に記載のように、大きいＤＮＡ
ウィルスの即時型遺伝子産物（例えば、Ｅ１Ａ遺伝子産
物）の存在下、ＢＫエンハンサー−Ａｄ２後ＪＯ１７’
ロモーターカセットの上流または下流にポリー〇Ｔ要素
を設置することによって転写の促進をさらに増強するこ
とができる。さらに大きい促進活性を達成するための修
飾を行う前の、本ＢＫエンハンサーーアデノウィルス２
後期ブローターカセットの配列および機能的要素は以下
のとおりである；ＡＡＧＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＣ？Ｉ’
ＡＣＴＡ　　ＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡ　　ＡＧＧＧＴＧＧ
ＡＧＧＧＡＣＡＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧＣＧＣ
ＣＡＧＧＣＴＧＴ　ＣＣｒＣＧＡＧＣＧＧＳ≦ｔｘ ＧＡＧＡＣＧＡＡＧＧ　　ＣＴＣＧＣＧＴＣＣＡ　　Ｇ
ＧＣＣＡＧＣＡＣＧ　　ＡＡＧＧＡＧＧＣＴＡＡＧＴＧ
ＧＧＡＧＧＧ　　ＧＴＡＧＣＧＧＴＣＧ　　ＴＴＧＴＣ
ＣＡＣＴＡ　　ＧＧＧＧＧＴＣＣＡＣＧＣＧＴＩ’ＣＧ
ＴＣＣＴＣＡＣＴＣＴＣＴＴ　　ＣＣＧＣＡＴＣＧＣＴ
　　ＧＴＣｒＧＣＧＡＧＧ（式中、Ａはデオキシアデニ
ル、Ｇはデオキシグアニル、Ｃはチオキシシチジル、Ｔ
はチミジルを表す）。
この図から、ＢＫエン／％ンサーはＡ　Ｔ　ＣＣから■
Ｒ−８３７の下で人手可能なりＫウィルスのプロトタイ
プ株を起源とすると予測される。しかしながら、ＡＴＣ
ＣＶＲ−８３７はＢＫエンＩ＼ンサー変異体の混合物で
ある。本明細書記載のプラスミドｐＢａｌ８ｃａｔおよ
び他のＢＫエンハンサ−含有プラスミドは記載のＢＫプ
ロトタイプエンノ＼ンサーではなく、プロトタイプ株か
ら単離されたＢＫエンハンサ−変異体を含有している。
上記のプロトタイブエンノ・ンサーの配列式の２４３位
から４６７位に対応する変異体エンノ・ンサーの配列が
プロトタイプｐＢａｌ８ｃａｔおよび他のプラスミド類
に見い出され、下記式で示される： しかしながら、上記のごとく、本発明方法および本発明
化合物には任意のＢＫ二ンノ１ンサー変異体を用いるこ
とができる。
プロトタイプＢＫエンハンサ−は上記式で示されるよう
に、３つの反復される配列であって、いずれの方向にあ
っても隣接する配列に関して同様に機能するものと定義
される。エンノ＼ンサー、具体的には、ＢＫエンハンサ
−の第３リピート（反復）の３′末端（これは方向性に
依存する）を、アデノウイルス−２のＣＣＡＡＴ領域の
５°末端に近付けるために、ＴＥ緩衝液（１７０μＱ）
中の５ｓｔｆｆ消化プラスミドｐＢ　ＩｃａｔＤＮＡ（
実施例５）（約８２μｇ）を５ｘＢａ１３１ヌクレアー
ゼ緩衝液（０，１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１２．ｐＨ８，Ｌ
　０．５Ｍ　ＮａＣｔ！、０．０６Ｍ　ＣａＣＱ、、お
よび５　ｍＭ　Ｎ　ａ　＊　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）（２０
μｅ）およびＢａ１３１ヌクレアーゼ（９μの、これは
６μ１２（約６単位）の°°早い”Ｂａ１３１酵素と３
ｒｔＱ（約３単位）の″遅い”Ｂａ１３１酵素からなる
［インターナショナル・バイオチクノロシーズ（Ｉ　ｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ＋　Ｉｎｃ、　）　Ｐ、Ｏ，ＢＯＸ　９５５８．２
７５　Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ　ＡＶｅ、＋　Ｎｅｖ　Ｈ
ａｖｅｎ、ＣＴ　０６５０６から市場化されている］に
加えた。反応混合物を３０℃で約３分間インキュベート
し、１．ＱＭ　ＥＤＴＡ（約１０μＣ）を加えて反応を
停止させた後、Ｂａ１３１−消化ＤＮＡをエタノール沈
殿と遠心によって収集した。ＤＮＡベレットをＩ×クレ
ノウ緩衝液に再懸濁し、本明細書に既述の方法と実質上
、同様にしてフレ／つ酵素で処理した。
フレノウ−処理ＤＮＡをＴＥ緩衝液（Ｊｏｕ（Ｊ）に再
懸濁し、次いで、ＤＮＡ（約１μＱ）を既述のごとく、
Ｉ×リガーゼ緩衝液（Ｊｏｕｆｆ）中、Ｔ４．ＤＮＡお
よびＲＮＡリガーゼを用いて自己結合させた。
結合したＤＮＡを用いて大腸菌に１２ＨＢ１０１を形質
転換体し、次いで、得られた形質転換体をアンピシリン
含有し一寒天上で平板培養した。
どの形質転換体が適切な大きさのＢＫエンハンサー−ア
デノウイルス２後期プロモーターカセットを含有してい
るかを決定するために制限酵素分析を行った。前記の工
程によって、アデノウィルス後期プロモーターのＣＣＡ
ＡＴ領域の上流Ｏ〜３００ヌクレオチドの間にＢＫエン
ノ１ンサーか位置している多数のプラスミドが生成した
。この工程で得られた１つのプラスミドをプラスミドｐ
Ｂａｌ８ｃａｔと命名した。プラスミドｐＢａｌ８ｃａ
ｔはＮＲＲＬから受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８２６７
の下で入手可能である（寄託日：　１９８７年１２月１
日）。プラスミドｐＢａｌ８ｃａｔは上記のごとく、約
１００ｂｐづつの２個のリピート（繰返し）配列を含ん
だＢＫエンハンサ−変異体を含有している。この変異体
エンハンサ−は、第２リピートの３′末端をアデノウィ
ルス後期プロモーターのＣＣＡ　Ｔ領域の１〜３００ヌ
クレオチドの間に設置することによって、本発明方法に
用いることができる。
当業者ならば、上記工程で多くの別のプラスミドが得ら
れ、プラスミドｐＢａｌ８ｃａｔがその例示のプラスミ
ドであることを認識するであろう。これらのプラスミド
は、Ａｄ２後期プロモーターのＣＣＡＡＴｔＪＩｂＪｉ
から３００ヌクレオチド以内の様々な位置にＢＫエンハ
ンサ７が存在している１群のプラスミドである。上記の
工程または他の当業者既知の工程によって達成可能な、
このＢＫエンハンサ−活性の改善法は任意のＢＫエンノ
−ンサーおよび任意の真核性プロモーターを用いて達成
することができる。
実施例１９　改善されたポリＧＴ−エンノ＼ンサープロ
モーターーカセットの構築 上記実施例１８記載の、プラスミドｐＢａｌ８ｃａｔで
例示される種々のプラスミド各々にポリー〇Ｔ要素（エ
レメント）を挿入することができる。この１群のポリー
ＧＴ含有プラスミドはＡｄ２後期プロモーターのＣＣＡ
ＡＴ領域から３００ヌクレオチド以内の様々な距離のと
ころにＢＫエンノ＼ンサーが配された発現ベクター内の
、ＣＡＴ遺伝子の３°または５゛側にいずれかの方向で
ポリーＧＴ要素が配置されており、本発明の重要な聾様
を構成している。ポリ−ＧＴのプラスミドｐＢ　ａｔ　
８　ｃａｔへの挿入は以下のようにして行われた。ＴＥ
緩衝液（１μｆ２）中のｐＢ　ａｌ８　ｃａｔＤ　Ｎ　
Ａ　（実施例１８）（約１μ９）をＩＯＸ：Ｉア（Ｃｏ
ｒｅ）緩衝液（２μ（りおよび水（１６ｕ１２）に溶か
した。制限酵素ＢａｍＨ’　（ｌμ１２、約１０単位）
をＤＮＡ溶液に加え、得られた反応混合物を３７°Ｃで
２時間インキュベートした。このインキュベーションに
次いで、１合物を７０°Ｃで１０分間、熱−活性化した
。
Ｉ３ａｍＨＩ３μｐＢａｌ８ｃａｔＤＮＡ（１μｍ２、
約５０ｎｇ）と実施例１で調製したポリーＧＴ合成断片
（７μＱ、約５００　ｎｇ）の混合物に１０ｘリガーゼ
緩衝液（１μｍ２）を加えた。このＤＮＡ溶液にＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（１μｅ、約４００単位）を加え、得られ
た反応混合物を１６°Ｃで一夜インキユベートした。
結合したＤＮＡは、挿入ポリ−ＧＴ要素のＣＡＴ暗号配
列に関する方向性のみが異なる、所望のプラスミドｐＢ
　ａｌ　８　ｃａｔ（Ｇ　Ｔ　６　）（センス）および
ｐＢａｌ８　ｃａｔ（Ｇ　Ｔ　９　）（アンチセンス）
をそれぞれ構成していた。Ｅ１Ａ遺伝子のような大きい
ＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物の存在下におけるポ
リーＧＴ要素のエンハンサ−活性は、それが挿入された
プラスミド発現ベクター内でのポリーＧＴ要素の方向に
よって左右されない。従って、例えば、プラスミドｐＢ
　ａｌ８　ｃａｔ（Ｇ　Ｔ　６　）およびプラスミドｐ
Ｂ　ａｌ　８　ｃａｔ（Ｇ　Ｔ　９　）はＥ１Ａの存在
下、同）に有効なＣＡＴ遺伝子産物のための発現ベクタ
ーであり得る。プラスミドｐＢ　ａｌ　８　ｃａｔ（Ｇ
　Ｔ　６　）の制限部位および機能地図を添付の第２２
図に示す。
大腸菌Ｋ１２　ＨＢＩＯＩ細胞（ＮＲＲＬＢ１５６２６
）を培養して形質転換コンピテントとし、実質上、実施
例３記載の方法に従い、上で調製した結合ＤＮＡにより
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン（１００μ
ｇ／１１２）含有し一寒天プレート上で平板培養した。
大腸菌Ｋ１２　ＨＢｌ　０１／ｐＢａｌ８ｃａｔ（ＧＴ
　６）および大腸菌Ｋ１２　ＨＢ　１０１／ｐＢａｌ８
ｃａｔ（ＧＴ９）形質転換体をアンピシリン耐性表現型
およびそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同
定した。実質上、実施例３記載の方法に従ってプラスミ
ドｐＢ　ａｌ　８　ｃａｔ（ＧＴ６）ＤＮＡおよびｐＢ
　ａｌ　８　ｃａｔ（Ｇ　Ｔ　９　）Ｄ　ＮＡを調製し
た。
実１ｍ例２０　　プラスミドｐｓＶ２Ｅ１Ａの構築大腸
菌に１２　ＨＢＩＯＩ／ｐｓＶ２ｃａｔ細胞を凍結乾燥
品の形でＡＴＣＣから受託番号ＡＴＣＣ３７］５５の下
で入手し、実質上、実施例３記載の方法に従って細胞か
らプラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔＤＮＡを単離する。
プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔの制限部位および機能
地図を添付の第３図に示す。プラスミドｐＳＶ２ｃａｔ
ＤＮＡ（約１μ９．１　μ０を１０ｘフア（Ｃｏｒｅ）
緩衝液（２ＡＩＱ）およびｄＨ，○（１４μのに加え、
次いで、このｐＳＶ２ｃａｔＤＮＡ溶液に制限酵素５ｔ
ｕｌ（１，５μｃ、約１５単位）および制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ（１，５μ（、約１５単位）を加え、得られた反応
混合物を３７°Ｃで２時間インキコベートした。７０°
Ｃで１０分間、熱不活化して反応を停止させた。熱不活
化の後、ＤＮＡ混合物にｄＨ，０（２５Ｑ）を加え、ｔ
ＯＸクレ／つ緩衝液（約５μＱ）およびフレノウ酵素（
２μａ、約１０単位）を加え、得られた反応混合物を１
６°Ｃで１時間インキユベートシた。次いで、フレノウ
処理、５ｔｕｌ／Ｅｃ。
Ｒ１消化プラスミドｐｓＶ２ｃａｔＤＮＡをエタノール
：クロロホルムで２回、次いでクロロホルム：イソアミ
ルアルコールで１回抽出し、エタノール沈澱させた後、
トリス緩衝液（２０μｇ）に再懸濁した。
実質上、実施例１２Ａ記載の方法に従ってアデノウイル
ス−２ＤＮＡのＥ１Ａ遺伝子を含有する断片を単離した
。Ｅ１Ａ遺伝子を含有する〜１８ｋｂＢａｌｌ断片を単
離し、この断片（約９μＱ、約５００　ｎｇ）をｄＨ２
０（ｌ　ｕ（１）および１０ｘリガーゼ緩衝液２．５μ
ｇと一緒に、上記のフレノウ処理した５Ｌｕｌ／Ｅｃｏ
ＲＩ消化プラスミドルＳ　Ｖ　２ｃａｔＤＮＡ（ｌｏμ
（、約１００　ｎｇ）に加えた。このＤＮＡ溶液にＴ４
ＤＮＡリガーゼ（２，５μＱ１約１２５０単位）を加え
、得られた反応混合物を１６°Ｃで一夜インキユベート
した。結合したＤＮＡは、ｐＳＶ２Ｅ１Ａを構成してい
た。プラスミドｐＳ　ｖ　２Ｅ１Ａの制限部位および機
能地図を添付の第２３図に示す。
ブー７スミ）’ｐＳＶ２Ｅ　１Ａはポ！ｊ−ＧＴ要素、
真核性プロモーター、および形質転換された宿主細胞内
で発現されるべき組換え遺伝子を含有する任意の他のプ
ラスミド類との同時形質転換実験におけるＥ１Ａ遺伝子
供給源として本発明にとって有用である。そのようなプ
ラスミドには、ｐＬＰ（ＧＴ）ｃａｔ、ｐＢ　Ｌ（ＧＴ
）ｃａｔ、　ｐＳ　Ｂ　Ｌ（ＧＴ）ｃａｔ、　ｐＬＰＣ
（ＧＴ）、ｐＬＰＣ４（ＧＴ）、ｐＬＰＣ５（ＧＴ）、
ｐＬＰＣｈｙｇ１（ＧＴ）、ｐｌ−ＰＣｈｙｇ２（ＧＴ
）、ｐｔ。
ＰＣｄｈｆｒ１（ＧＴ）、ｐＬＰＣｄｈｆｒ２（ＧＴ）
、ｐＬＰＣｈｄ１（ＧＴ）、ｐＬＰＣｈｄ２（ＧＴ）、
ｐＬＰＣｈｄ３（ＧＴ）、ｐＬＰＣｈｄ４（ＧＴ）、ｐ
ＢＬＴ（ＧＴ）、ｐＢＬＴｈｙｇ１（ＧＴ）、ｐＢ　Ｌ
　Ｔｈｙｇ２　（Ｇ　Ｔ）、ｐＢＬＴｄｈｒｒ１（ＧＴ
）、ｐＢＬＴｄＭｒ２（ＧＴ）、ｐｈｄＴＰＡ（ＧＴ）
、　ｐｈｄＭＴＰＡ（ＧＴ）、　ｐＢ　ａｌ　８　ｃａ
ｔ（ＧＴ６）、ｐＢ　ａｌ　８　ｃａｔ（Ｇ　Ｔ　９　
）、ｐ４−１４　（ＧＴ）、ｐ２−５（ＧＴ）およびｐ
Ｔ　６　ｈｄ（Ｇ　Ｔ　）が含まれる。
別法として、Ｅ１Ａ遺伝子は、ポリーＧＴ要素、真核性
プロモーターおよび形質転換細胞内で発現されるべき組
換え遺伝子と一緒に、例えば実施例１４Ｂに記載のプラ
スミドｐＬＰｃＥ１Ａのような単一のプラスミドに担持
させて供給してもよい。
実施例２１　プラスミドｐＴ６ｈｄおよびｐＴ６ｈｄ（
ＧＴ）の構築 Ａ、ＴＰＡ暗号領域の部位特異的突然変異誘発およびプ
ラスミドｐＴ６ｈｄの構築 ＴＰＡ暗号領域の部位特異的突然変異誘発およびプラス
ミドｐ７６ｈｄの構築は以下のようにして行われる。ｄ
Ｈ，○（１０μＱ）中のプラスミドｐ’ｒｐＡ１０３（
実施例１７、約５μ９）を１ＱｘＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液
（約ｌＯμＱ）およびｄＨ，０（８０μＩ２）に加える
。このプラスミドｐＴＰＡ１０３ＤＮＡ溶液に制限酵素
Ｈ１ｎｄＩ［ｒ　（１ｕＱ、約２０単位）を加え、得ら
れた反応混合物を３７°Ｃで９０分間インキュベートす
る。このＨｉｎｄｌＩ［消化プラスミドｐＴＰＡＩＱ３
ＤＮＡ溶液に制限酵素５ｓｔｌ（１μ＆、約２０単位）
とＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＣ（ｐＨ７，６）（ｌ　Ｏμ０
を加え、得られた反応混合物を３７℃で９０分間インキ
ュベートする。ＨｉｎｄＩ［ｌ−３ｓｔｌ消化プラスミ
ドｐＴＰＡ１０３ＤＮＡをエタノール沈澱によっテ濃縮
し、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、〜１．４
ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［ｌ−３ｓｔｌ制限断片が他の消化産
物から分離するまで泳動する。実質上、実施例４Ａ記載
の方法に従って〜ｌ　、　４　ｂｐ　Ｈ１ｎｄｌＩ［５
ｓｔｌ制限断片をゲルから単離し、ライゲーシジン用に
調製し、ｄＨ，○（２０μのに再懸濁する。
ｄｌｌ　ｔｏ　（３５ｕの中の複製型（ＲＦ）Ｍ　１３
ｍｐｌ　８Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓから入手可能）（約４５８ｇ）を１０　ｘ
　Ｈ１ｎｄＩ［［緩衝１ｆｆｌ（１０μＣ）およびｄＨ
。
０（５５ｕのに加える。このＭｌ　３ｍｐｌ　８ＤＮＡ
溶液に制限酵素旧ｎｄＩｒｌ（ｌμｅ、約２０単位）を
加え、得られた反応混合物を３７°Ｃで１時間インキュ
ベートする。ＨｉｎｄＩｎ消化Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ溶
液に制限酵素５ｓＬＩ（１ｕ（！、約２０単位）および
ＩＭＴｒｉｓ−ＨＣｆｆ（ｐ）１７．６）（１０μＱ）
を加え、得られた反応混合物を３７°Ｃで１時間インキ
ュベートする。Ｈｉｎｄｏｌ−３ｓｔｒ消化Ｍ１３ｍｐ
１８ＤＮ八をエタノール沈澱によって収集し、アガロー
スゲル電気泳動用の標本として再懸濁し、上記のごとく
ゲル電気泳動にかけて大きい制限断片を単離する。Ｍ１
３ａ＋ｐ１８の大きいＨｉｎｄｌＩＩ−３ｓｔｌ制限断
片（約１ｕ□を得、ｄＨ、Ｏ（２０ｔ、ｔ１２）ニ懸濁
する。
プラスミドｐＴＰＡ１０３の〜１．４ｋｂ　［（ｉｎｄ
［１−５ｓｔｌ制限断片（３ｕＱ）にＭ１３ｍｐ１８の
大きいＨｉｎｄＩ［Ｉ　−Ｓ　ｓｔ　Ｉ制限断片（約２
ｕ（１’）、１０ｘＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２μＱ
）、ｄＨ３Ｏ（１２μの、およびＴ４　ＤＮＡリガーゼ
（〜１μＱ、約ＩＷｅｉｓｓ単位）を加え、得られた反
応混合物を１６°Ｃで一夜インキユベートする。
大腸菌ＪＭ１０３細胞（Ｂ　ＲＬから入手可能）をコン
ピテント細胞にし、トランスフェクションあたりのＤＮ
Ａ使用量を変化させる外は、実質上、ＢＲＬ　　Ｍ１３
クローニング／°　ジデオキシ　シーフェンシング・イ
ンストラクション・マニュアルに記載の方法に従い、ラ
イゲー７−ｉン混合物を用いてトランスフェクションす
る。組換えプラークを、挿入によるβ−ガラクトシダー
ゼのα断片をコードする遺伝子の不活化、これはＸ　−
ｇａｌを開裂してインジゴ色の開裂産物に変換する能力
の喪失を招く、に基づいて同定する。スクリーニングの
ために、幾つかの白色プラークをＬブロス（２゜５　Ｒ
ｒＤ中にとり、ｐｒｏＡ　Ｂを担持するＦエビソームを
確実に保持するために最少培地ストックで培養されてい
る対数増殖期の大腸ｍ　Ｋ１２　　ＪＭＩＯ３（０，４
ｙ１２）を加える。プラーク含有細胞懸濁液（２，５ｘ
ｅ）を空気振盪機により、３７℃で８時間インキュベー
トする。１．５Ｊｌ（！づつ、細胞をペレット化し、実
質上、ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙのアルカリ性ミニス
クリーン法（１９７９年、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、　７：１５１３）記載の方法にしたがってＲＦ　　
ＤＮＡを単離する。各培養物の残余は４℃でストックと
して保存する。所望のＭＰ１８ＢＷ４７と命名されたフ
ァージはＭ１３ａ＋ｐ１８の〜７．２ｋｂ　ＥｃｏＲ［
−Ｈ１ｎｄＩＩ＋制限断片に結合したプラスミドｐＢＷ
２５の〜１．４ｋｂ　Ｈｉｎｄ［ｌｌ−３ｓｔｆ制限断
片を含有している。
対数増殖期の大腸菌に１２　　ＪＭ１０３（約５０Ｉｆ
Ｉ２）をＭＰ１８ＢＷ４７に感染させ、空気振盪機中で
３７℃において１８時間インキュベートする。感染細胞
を低速遠心によってペレット化し、インストラクション
・マニュアル記載の方法を大規模にして培養上清から１
本鎖ＭＰ１８ＢＷ４７ＤＮＡを調製する。フレノウ反応
を、室温で３０分間、次いで３７°Ｃで６０分間、さら
に１０℃で１８時間行う外は、実質上、アデルマンらの
方法［＾ｄｅｌＩＩｌａｎ、　　１９８３＋　ＤＮＡ２
（３）　：　１８３−１９３］に従って１本鎖ＭＰ１８
ＢＷ４７に突然変異を誘発する。さらに、ｓｌ処理を２
０°Ｃで行い、緩衝液の塩濃度ヲ業者の指示の１／２と
し、Ｍ１３シークエンジングプライマー（ＢＲＬ）を用
いる。天然のＴＰＡのアミノ酸残基４から１７５までの
暗号配列を欠失するために用いるオリゴデオキシリボヌ
クレオチド・ブライマーは、以下の配列式で示される。
５°−ＧＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＴＡＣ−３得られた突然変異混
合物を用い、実質上、上記の感染法に従って大腸菌に１
２　　ＪＭ１０３をトランスフェクションする。ＲＦＤ
ＮＡの制限Ｑｌ　素分析およびマキサムおよびギルバー
トのＤＮＡ配列決定法によって所望の突然変異体を同定
する。
天然のＴＰＡのアミノ酸残基４〜１７５をコードする配
列が削除された暗号配列を有する所望の突然変異体をＭ
Ｐ１８ＢＷ５２と命名する。
制限酵素消化、断片の単離およびライゲーションはすべ
て、実質上、実施例４記載の方法に従って行われた。プ
ラスミドｐ７６ｈｄは下記のごとくにして構築された。
まず、プラスミドｐＴＰＡ６０３（実施例１７、第１９
図）から〜１　、９　ｋｂＢ　ａ第１（ｌ断片を得た。
次いで、プラスミドｐＡｃ３７３［ミャモトら（Ｍ　ｉ
ｙａｍｏｔｏ）、１９８５、Ｍｏ１．ｃｅｌｌ　Ｂｉｏ
ｌ、　　５：２８６０−２８６５１をＢａｍＨＩ消化に
付し、プラスミドｐＴＰＡ６０３の〜１．９　ｋｂＢ　
ａｍＨｌ断片と結合させてプラスミドｐＬｌｏｏを得た
。次いで、プラスミドｐＬ１００ＤＮＡを制限酵素Ｂｇ
ｌ■および５ｓｔｌで消化し〜１．２ｋｂ　Ｂｇｌｌｒ
−５ｓｔｌ断片を単離した。
上で得たＭＰｌ　８ＢＷ５２ＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌｎ
および５ｓｔｌで消化し、〜７１８ｂｐ断片を単離した
。ＭＰ１８ＢＷ５２の〜７１８ｂｐＢｇｌｌＩ　−３ｓ
ｔｌ断片とプラスミドｐＬ１００の〜１．２ｋｂＢｇｌ
ＩＩ−３ｓｔｌ断片とを結合させて中間体プラスミドｐ
Ｌ　２２９を得た。次いで、プラスミドｐＬ２２９ＤＮ
Ａを制限酵素ＢａａＨＩで消化し、〜１．４ｋｂＢａｍ
ＨＩ断片を単離した。プラスミドｐｈｄ　（実施例１３
）をＢａ１ｌで消化し、プラスミドｐＬ２２９の〜１．
４　ｋｂＢａｓ＋ＨＥ断片と結合させて所望のプラスミ
ドｐ７６ｈｄを創製した。
Ｂ、　ｐ７６ｈｄ（ＧＴ）の構築 実質上、実施例４Ｂ、１．記載の方法に従い、プラスミ
ドｐ７６　ｈｄのＢＫエンハンサ−とＡｄ２後期プロモ
ーターとの間の唯一のＸｈｏ［部位にポリーＧＴ要素を
挿入した。Ｘｈｏｌ消化ポリ−ＧＴ要素およびＸｈｏｌ
消化プラスミドｐＴ６ｈｄを結合させると、結合したＤ
ＮＡ構築物は所望のプラスミドＩ）Ｔ　６　ｈｄ（ｃ　
Ｔ　）を構成していた。プラスミドｐＴ６　ｈｄ（Ｇ　
Ｔ　）の制限部位および機能地図を添付の第２４図に示
す。
別法によれば、プラスミドｐＬ２２９（上記Ａ３に記載
）の〜１．４　ｋｂ　ＢａＩＩｄ（ｌ断片とＢｃｌ［消
化プラスミドｐｈｄ（ＧＴ）（実施例１３、第１４図）
とを結合させてプラスミドｐ’［’　６　ｈｄ（Ｇ　Ｔ
　）を作成することによっても、プラスミドｐ”ｒ　６
　ｈｄ（Ｇ　Ｔ　’）を構築することができる。
実施例２２　幾つかの発現ベクターの真核性宿主細胞形
質転換体の構築 本明細書記載の発現ベクターの重要な態様は、これら発
現ベクター中のポリーＧＴ要素およびＢＫエンハンサ−
を用いて、Ｅ１Ａ遺伝子産物の存在下に遺伝子発現を刺
激することに関連する。２９３細胞はＥ１Ａ遺伝子産物
を構成的（継続的）に発現するので、２９３細胞は本発
明の真核性発現ベクターの好ましい宿主である。２９３
細胞は５型アデノウイルスによって形質転換されたヒト
胚性腎細胞であり（本発明においては、Ｅ１Ａ遺伝子の
供給源としてどのような型のアデノウィルスを用いても
よいことに注意されたい）Ａ　Ｔ　ＣＣから受託番号Ｒ
Ｌ１５７３の下で何人も入手可能である。本明細書記載
の発現ベクターの多くは、たとえＥ１Ａ遺伝子が存在し
なくとも広範な宿主細胞内で機能する。しかしながら、
Ｅ１Ａ遺伝子（または同様に作用する大きいＤＮＡウィ
ルスの即時型遺伝子産物）は、本発明のポＩＪ−ＧＴ含
イｆ発現ベクターからの遺伝子発現を促進するためのポ
リＧ′Ｆ要素の活性化に必要である。非Ｅ　Ｉ　Ａ産生
セルラインを、プラスミドｐＳＶ２Ｅ　１Ａ、ｐＬＰＣ
Ｅ　１ＡおよびｐＬＰｃＥ１Ａｌ等のＥ１Ａ遺伝子含有
ベクター、または剪断したアデノウィルスＤＮＡで形質
転換するか、あるいはアデノウィルスに感染させること
により、Ｅ１Ａ遺伝子産物を該セルラインに導入するこ
とができる。
下記の形質転換工程は宿主細胞として２９３細胞に関し
て述べられているが、これは大多数の真核性セルライン
に一般的に適用することができる。
本明細書記載のベクターを用いて様々なセルラインを形
質転換することができる。本明細書には多数の発現ベク
ターが記載されているので、形質転換法を一般的に記述
する。
２９３細胞は、ＡＴＣＣから受託番号ＣＲＬ　１５７３
の下、２５ｍｍ’フラスコ中、１０％熱不活化ウマ血清
を含有するイーグル（Ｅａｇｌｅ″Ｓ）の最少必須培地
中で全面成長した約５．５ｘｌＯ”個の細胞の単一・層
として入手する。フラスコを３７°Ｃてインキュベート
し、培地を週２回交換する。培地を捨て、バンク（Ｈａ
ｎｋ’　ｓ）の均衡塩類溶液（ＨＢ　Ｓ　）（Ｇｉｂｃ
ｏ）で洗浄し、０．２５％トリプシンを１−２分間加え
、新鮮な培地で洗浄し、吸引し、継代培径比ｌ：５また
はｌ：ｌＯで新しいフラスコに分けることにより細胞を
継代培養する。
トランスフェクションの１日前に細胞を皿あたり０、γ
ｘｌＯ’細胞で撒く。トランスフェクションの４時間前
に培地を交換する。ＴＥ緩ｉ！ｉ　′ｔ＆、に溶かした
、滅菌してエタノール沈澱させたプラスミドＤＮＡを用
いて４０μ９／ｘＱＤ　Ｎ　Ａと２５０ｍＭＣａＣＱ、
を含有する２ＸＤＮΔ−ＣａＣＱｌを調製する。２ＸＨ
ＢＳは２８０ｍＭ　ＮａＣｇ、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、
および１．５ｍＭ　　リン酸ナトリウムを含有させ、ｐ
Ｈを７．０５−７．１５に調節して調製する。２ＸＤＮ
Ａ　　ＣａＣ（２を溶液を等容量の滅菌２　ｘ　ＨＢ　
Ｓに滴下する。２ｘ　ＨＢ　Ｓ含有混合管中に綿栓を付
けたＬｘ（ｌの滅菌プラスチックピペットを挿入し、Ｄ
ＮＡ添加の間を通して気泡を吹き込む。撹拌せずに、室
温で３０−４５分間をかけ、リン酸カルシウム−ＤＮＡ
沈澱を形成させる。
次いで、静かにプラスチックピペットで撹拌して沈澱を
混合し、沈ｒｌｆｆｉＬｍｃ（プレートあたり）を直接
、受容体細胞を覆っている増殖培地１０ｘ＆に加える。
３７℃で４時間インキュベートした後、培地をｌＯ％ウ
シ胎児血清を含有するＤＭＥＭで置換し、さらに７２時
間細胞をインキコベートした後、選択圧をかける。組換
えヒトプロティンＣを発現する形質転換体を得るために
、増殖培地にタンパク質のγカルボ牛シル化に必要な１
〜１０μ２／肩Ｑビタミンにを含有させる。プラスミド
が真核性細胞内で機能する選択マーカーを含有していな
い場合には形質転換工程にプラスミド混合物による同時
形質転換を用いる・本明細書記載の選択マーカー不含の
発現ベクターと、真核性細胞内で機能する選択マーカー
を含有する発現ベクターとの混合物。この同時形質転換
法により、形質転換プラスミドの両方を含有する細胞を
同定することができる。
ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含伺するプラスミド
でトランスフェクションされた細胞については、増殖培
地にハイグロマイシンを終濃度約２００〜４００μ９７
ｘ（ｌとなるように加える。次いで、培地を３〜４日間
隔で交換しながら細胞を３７°Ｃで２−４週間インキュ
ベートする。得られたハイグロマイシン耐性コロニーを
それぞれ別個の培養フラスコに入れ、０性化する。ネオ
マイシン耐性コロニーの選択（２Ａオマイシンの代わり
に６４１８を用いてもよい）は、ハイグロマイシンでな
く、０４１８を終濃度４００μ９／肩Ｑで加える外は、
実質上、ハイグロマイシン耐性細胞の選択法にしたがっ
て行う。２９３細胞はｄｈｆｒ陽性であるので、ｄｈｆ
ｒ遺伝子含有プラスミドを有する２９３形質転換体は、
ヒボキサンチンおよびチミン不含の培地で増殖する能力
であるｄｈｆｒ−陽性表現型のみに基づいて選択するこ
とはできない。機能的なｄｈｆｒ遺伝子を欠失しており
、ｄｈｒｒｆｉ有プラスミドで形質転換されたセルライ
ンはｄｈｒｒ陽性表現型に基づいて選択される。
ｄｂｆｒ欠失セルラインに遺伝子またはプラスミドを導
入するための選択マーカーとしてｄｈｆｒ遺伝子を用い
、次いでメトトレキセートを用いてプラスミドのコピー
数を増大する方法は十分に確立され文献に記載されてい
る。ｄｈ［’ｒ産生細胞における選択可能かつ増幅可能
なマーカーとしてのｄＭｒの使用はあまり研究されてい
ないが、文献にはｄｈｒｒをｄｈｆｒ産生細胞に、選択
マーカーとして、また遺伝子増幅のために用い得ること
が示唆されている。
本発明の用途は用いる選択マーカーによって限定される
ことはない。さらに、メタロチオネイン遺伝子、アデノ
シンデアミナーゼ遺伝子、またはＰ−グリコプロティン
に例示されるマルチ遺伝子耐性ファミリー（多耐性遺伝
子ファミリー）などの増幅可能なマーカーを用いること
ができる。２９３細胞中では、ハイグロマイシンＢｉ４
性付与遺伝子のような選択マーカーを含有するベクター
で形質転換し、次いでメトトレキセートを用いて増幅す
ると便利であるが、これは２９３細胞中の不ズミｄｈｆ
ｒ含有プラスミドの直接選択の場合には用いることがで
きない。
聚施例２３　　ＡＶ１２真核性宿主細胞形質転換体 実質上、実施例２２で２９３細胞について述べたと同様
にしてＡＶ１２セルライン（ＡＴＣＣＣＲＬ　　９５２
５）を形質転換することができる。
しかしながら、２９３細胞と異なり、ＡＶ１２細胞は、
ネズミｄｈｆｒ遺伝子を含有するベクターを用いて形質
転換した場合には、メトトレキセート（２００５００ｎ
ｍ）で直接選択することができる。
アデノウィルスで形質転換された細胞が、活性化された
ヒトプロティンＣのようなγ−カルボキシル化タンパク
質を産生ずることの利点は、そのような細胞が完全にγ
−カルボキシル化された活性なヒトプロティンＣ産生ず
るという点である。形質転換体を、ハイグロマイシンＢ
またはメトトレキセートで選択する；そのような形質転
換体はヒトプロティンＣを約２〜４μ９／ｍＱ産生ずる
ことができる。メトトレキセートにより、プロティンＣ
濃度を約５０μ９７Ｒ（ｌまで上昇させることができる
。
プロティンＣを活性化することができ、その活性はグリ
ンネルら（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ、　　１９８７　、Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌ。
ｇｙ、　５：１１８９）の方法によって測定することが
できる。
アデノウイルス−形質転換宿主細胞、例えばＡＶ１２に
より産生される組換えプロティンＣの活性は、少なくと
もヒト血中のそれと同一活性である。アデノウィルスで
形質転換されていない宿主細胞においては、産生された
組換えプロティンＣの抗凝固活性はヒト血液−誘導プロ
チインＣの活性の６０％を越えることはなかった。
実施例２４　アデノウィルスの３部構成リーダーをコー
ドするプラスミド類、プラスミドｐ４１４、ｐ２−５、
ｐ４−１４（ＧＴ）およびｐ２−５　（ＧＴ）の構築 プラスミドｐ４−１４　（ＧＴ）およびｐ２−５　（Ｇ
Ｔ）はいずれもヒトプロティンＣを真核性宿主細胞内で
高レベルに発現させるために、修飾されたポリＧＴ−Ｂ
Ｋエンハンサーアデノウィルス後期プロモーター系およ
びアデノウィルスの３部構成リーダー（ＴＰＬ）を使用
している。プラスミドｐ４−１４およびｐ２−５は、そ
れぞれプラスミドｐ４−１４　（ＧＴ）およびｐ２−５
（ＧＴ）と同一であるが、ポリＧＴ要素を欠いている。
アデノウィルスの３部構成リーダー（ＴＰＬ）をコード
するＤＮＡをアデノウィルスから単離した。制限酵素切
断部位の後方の括弧内の数字はアデノウィルスのマツプ
単位を表す。
プラスミドｐＵｃ１３（ＢＲＬから市販品を人手可能）
を制限酵素５ｐｈｌおよびＢａ＠）（Ｉで消化した後、
２型アデノウイルスのＴＰＬをコードする〜７．２ｋｂ
Ｓｐｈ［（５１３５）　　ＢｃｌＩ（１２，３０ｆ）制
限断片と結合させてプラスミドｐＴＰ　Ｌ　４を得た。
プラスミドｐＴＰ　Ｌ　４を制限酵素５ａｕｌ（７６１
６）およびＢｇｌＩ［（８９０４）で消化してＴＰＬを
コードするＤＮＡからイントロンの１部を除去し、フレ
ノウ酵素で処理して再結合し、プラスミドｐＤＴＰＬを
得た。次いでプラスミドｐｖＴＰＬを制限酵素Ｘｈｏｌ
で消化し、ＴＰＬをコードする〜２．６２ｋｂ　Ｘｈｏ
Ｉ断片（アデノウィルスの５７９９および９６８９Ｘｈ
ｏ１部位）を単離し、ライゲーションに備えた。
プラスミドｐＢＬｃａｔを制限酵素ｆ３ｃｌｒで消化し
た。下記の配列： を有するリンカ−を合成し、実質上、実施例１記載の方
法に従ってアニーリングし、このリンカ−をＢｃｌｌ消
化プラスミドｐＢＬｃａｔと結合させ、次いでＸｈｏＩ
消化に付した。次いで、結合したリンカ−を伴うＸｈｏ
ｌ消化プラスミドｐＢＬｃａｔＤＮＡを結合させ、プラ
スミドｐＢ△Ｌ　ｃａｔを得た。この構築によりプラス
ミドｐＢＬｃａｔ上のアデノウィルス後期プロモーター
がリンカ−配列で置き換えられた。プラスミドｐＢ△Ｌ
　ｃａｔを制限酵素Ｘｈｏｌで消化し、プラスミドｐ△
ＴＰＬの〜２．６２ｋｂＸｈｏ１制限断片と結合させ、
ＴＰＬをコードする断片が、ＣＡＴ遺伝子の発現のため
にＢＫエンハンサ−、アデノウィルス主後期プロモータ
ー、およびＴＰＬが一直線上に正しく位置するように配
されたプラスミドｐＢ△Ｌ−ＴＰＩ、を得た。
次いで、これらの断片、（１）ｄｈｆｒ遺伝子をフード
する、プラスミドｐＬＰｃｈｄｌのＡａｔＩＩ−Ｂａｌ
ｌ制限断片、（２）プロティンＣをコードする、プラス
ミドｐＬＰｃｈｄｌのＢａｌｌ制限断片、（３）ＴＰＬ
をフードする、プラスミドｐＢ△Ｌ−ＴＰＬのＰｖｕｎ
−Ｂａｌｌ制限断片、および（４）Ｂ　Ｋエンハンｆ−
−Ａｄ２ＭＬＰ−をコードするプラスミドｐＢ　ａｔ　
８　ｃａｔのＰｖｕＩｒ−Ａａｔ［Ｉ制限断片を結合さ
せてプラスミドｐ２−５を構築した。このように、プラ
スミドｐ２−５は選択可能かつ増幅可能なマーカーとし
てのｄｈｆｒ遺伝子およびヒトプロティンＣを発現させ
る正しい位置にＢＫエンハンサ−Ａｄ２ＭＬＰ、および
Ａ　ｄ　２　Ｔ　Ｐ　Ｌを含有しティる。
プラスミドｐ４−１４はプラスミドｐ２−５と類似する
が、ｐＢａｌ３　Ｔ　Ｐ　Ｌと称する中間体プラスミド
を経て構築される。プラスミドｐＢａｌ８７ＰＬは、上
記バラグラフに記載のプラスミドｐ２−５の構築に用い
た断片１．３および４を結合させて構築された。次いで
、プラスミドｐＢａｌ８ＴＰＬを制限酵素Ｘｈｏｌで消
化し、フレ／つ酵素処理によりＸ　ｈｏ　Ｉ末端を平滑
末端化した後、ヒトプロティンＣをコードする、フレノ
ウ処理したプラスミドｐＬＰｃｈｄｌのＢａｌｌ制限断
片と結合させ、プラスミドｐ４−１４を得た。このよう
に、プロティンＣをコードするＤＮＡが、プラスミドｐ
２−５ではプラスミドｐＢ△Ｌ　−Ｔ　Ｐ　Ｌ由来のＤ
ＮＡのＢｃｌｒ部位に挿入されているのに対して、プラ
スミドｐ４−１４ではプラスミドｐＢ△Ｌ−ＴＰＬ由来
の断片のＸｈｏ１部位に挿入されているという点におい
てのみこれらは相異する。
プラスミドｐ４−１４およびｐ２−５はヒトプロティン
Ｃを高レベルに発現させる。ＡＶ１２細胞においては、
プラスミドｐ４−１４およびｐ２−５を２００　５００
ｔ＋ｍのメトトレキセートを用いて直接、選択すること
ができる。ＡＶ　ｌ　２／ｐ４−１４形質転換体は、増
幅前に、Ａ　Ｖ　ｌ　２／ｐＬ　Ｐ　Ｃｄｈｆｒ形質転
換体よりも５−６倍高くヒトプロティンＣを発現する。
メトトレキセートによる増幅によってさらに細胞のヒト
プロティンＣ産生量は増加する。このように、プラスミ
ドｐ４．−１４およびｐ２−５はアデノウィルスのＢａ
１８プロモーターとＴＰＬとを用いてより高レベルの発
現を達成したことを例示するものである。
Ｅ１Ａ遺伝子産物の存在下でのより高度の発現は、以下
のようにしてプラスミドｐ４−１４またはｐ２−５にポ
リーＧＴ要素を挿入することにより達成し得る。ポリー
ＧＴ要素を、プラスミドｐ４−１４のプロティンＣ暗号
配列の３°末端における唯一のＢｃ１１部位（Ｂｃ１１
部位はＢａｍ８１部位と一致）に挿入し、プラスミドｐ
４−１４　（ＧＴ）を得る。プラスミドｐ２−５のＴ　
Ｐ　ＬとプロティンＣ暗号配列との連結部位にある唯一
のＸｈｏ［部位にポリーＧＴ要素を挿入してプラスミド
ｐ２５（ＧＴ）を得る。
実施例２５　数個のポリー〇Ｔ発現ベクターによる真核
性宿主細胞トランスフェクシントにおける組換え遺伝子
発現レベルの測定 本発明のポリ−Ｇ　Ｔ　ｉ有発現ベクターで様々な真核
性宿主細胞をトランスフエタンヨンした。これらのトラ
ンスフェクシントの幾つかについて、これらの組換えポ
リ−Ｇ　Ｔ　含有発現ベクターにコードされている構造
遺伝子の発現レベルを測定し、ポリーＧＴ要素を含有し
ない対応する発現ベクターからの発現レベルと比較した
。数回の実験で、３種の異なるセルラインを、実質上、
実施例２１記載の方法に従い、プラスミドｐＬ　Ｐｃａ
ｔ、　ｐＬ　Ｐ　（ＧＴ）ｃａｔ、　ｐＢ　Ｌｃａｔ、
　ｐＢ　Ｌ（ＧＴ）ｃａｔ、　ｐＢａｌ３ｃａｔ。
およびｐＢ　ａｌ　８　ｃａｔ（Ｇ　Ｔ　６　）でトラ
ンスフェクションした。上に列挙したプラスミドはそれ
ぞれ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラ
ーゼ（ＣＡＴ）の遺伝子−暗号配列を含有している。
ＣＡＴ活性の相対レベルはゴーマンら（Ｇ　ｏｒｍａｎ
。
１９８２、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　２：１
０４４−１０５１）記載の方法で測定された。１−５回
の別々の実験で得た結果の平均値として、各プラスミド
によるＣＡＴ活性レベルを下記第２表に示す。実験間で
の相対的ＣＡＴ活性の変化は１０〜１５％にすぎなかっ
た。
ｍ２ｆｉ［々のヒトおよびサル腎セルラインにおいて組
換えプラスミドにより産生されたクロラムフェニコール
・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の相対レベル セルライン中のＣＡ　Ｔ　ｔ［］対レしル＊プラスミド
　　　　　　　　　２９３＊＊　　　　　　　　　ＭＫ
２＊＊　　　　　　Ｃ０５−ＩＪ＊ＡＴＣＣＣＲＬ１５
７３　　ＡＴＣＣＣＣ１２　　ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０
ｐＬＰｃａｔ　　　　　　　　１　　　　１　　　　　
　１ｐＬＰ（ＧＴ）ｃａｔ　　　　　　４　　　　４　
　　　　　Ｎ　ＴｐＢＬｃａｔ　　　　　　　６６　　
　２８　　　　　８ｐＢＬ（ＧＴ）ｃａｔ　　　　２０
８　　　２１　　　　　８ｐＢａｌ８ｃａｔ　　　　　
４７９　　　２０　　　　　　ＮＴｐＢ　ａ１８ｃａｔ
（ＧＴ６）　　９５８　　　　Ｎ　Ｔ　　　　　ｌ　１
＊各セルラインによって産生されるＣＡＴの相対的レベ
ルはプラスミドｐＬＰｃａｔによってそのセルラインに
より産生されるＣＡＴを単位とする値である。ＮＴ＝試
験せず。２９３セルラインのみかＥ１Ａを産生する（Ｍ
Ｋ２およびＣＯ３−１はＥ１Ａ陰性である）。ＣＯ３−
１セルラインのみがＴ抗原を産生ずる（２９３およびＭ
Ｋ２はＴ抗原陰性である）。
＊＊一般に入手可能。
プラスミドｐＬ　Ｐ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔはポリＧＴ要
素含有、エンハンサ−不含、Ａｄ２後期プロモーター含
有の例示発現ベクターであり、他方、プラスミドｐＢ　
Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔはポリＧＴ要素、ＢＫエンハン
サ−およびＡｄ２後期プロモーター含有の例示発現ベク
ターである。プラスミドｐＢ　ａ１８　ｃａｔ（Ｇ　Ｔ
　６　）はＣＡＴ遺伝子の３゛側にポＩＪＧＴ要素と一
緒に修飾されたエンハンサーープロモーター領域を含有
することを除き、プラスミドｐＢ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃ
ａｔと同様である。ポリＧＴ要素の効果を調べるために
、第２表に記載のプラスミド発現ベクターを用いて様々
なセルラインをトランスフェクションし、上記のごと＜
ＣＡＴ活性を測定した。第２表はＭＫ２上２セルライン
中ポリＧＴ要素がＡｄ２後期プロモーターと一緒に刺激
作用またはエンハンサ−補作用を有していないことを示
しており、プラスミドｐＬＰｃａｔおよびｐＬＰ（ＧＴ
）からのＣＡＴ産生量はほぼ同じであった。しかしなが
ら、Ｅ１Ａの存在下での、２９３（Ｅ　１Ａ”）セルラ
イン中のプラスミドｐＬＰｃａｔおよびｐＬ　Ｐ　（Ｇ
　Ｔ　）ｃａｔによる結果から分かるように、ポリＧＴ
要素を含有するｐＬ　Ｐ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔではプラ
スミドｐＬＰｃａｔに比較して、ＣＡＴ活性の４倍増が
観察された。これはポリＧＴ要素に対するＥ１Ａのトラ
ンス−活性化を示すものである。
プラスミドｐＢ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔおよびｐＢＬ
ｃａｔを用いて２９３細胞をトランスフェクションした
場合にも、ポリＧＴ要素に対するＥ１Ａのトランス活性
化が示された。プラスミドｐＢＬｃａＬに比較して、プ
ラスミドｐＢ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔではＣＡＴ活性
が約４倍増大していた。プラスミドｐＢ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ
　）ｃａｔはＥ１Ａの存在下、ポリＧＴ要素とＢＫエン
ハンサ−との結合エンハンサ−活性により、プラスミド
ｐＬＰｃａｔの２００倍以上の活性を示した。ＭＫ２セ
ルラインおよびＴ抗原産生ＣＯ３−１セルラインを用い
ると、プラスミドｐＢ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔおよび
ｐＢＬｃａｔからの発現レベルはほぼ同一であり、ここ
でもポリＧＴ要素のトランス活性化にはＥ１Ａが必要で
あることが示され、さらに、ポリＧＴ要素がＴ抗原によ
ってはトランス活性化されないことが示された。
最高レベルの発現はプラスミドｐＢ　ａ１８　ｃａｔ（
ＧＴ６）によって達成され、それはプラスミドｐＬＰｃ
ａｔによるＣＡＴレベルに対して、相対的に１０００倍
近い増大を示した。プラスミドｐＢａｌ８ｃａｔ（ＧＴ
６）は本発明の改善された発現ベクターを例示するもの
であり、それはＥ１Ａで活性化されたポリＧＴ要素と改
良されたＢＫエンハンサーープロモーター領域とを含有
している。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＢＫウィルスの制限部位および機能地図を示
す模式図であり、 第２図は、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｃａｔの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、 第４図は、プラスミドｐＬ　Ｐ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔの
制限部位および機能地図を示す模式図であり、第５図は
、プラスミドｐＢ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第６図は、プラス
ミドｐＳ　Ｂ　Ｌ　（Ｇ　Ｔ　）ｃａｔの制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、第７図は、プラスミド
ｐＬ　１３３の構築を示す工程図であり、 第８図は、プラスミドｐＬＰＣ（ＧＴ）の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、第９図は、プラスミド
ｐＬＰＣ４（ＧＴ）の制限部位および機能地図を示す模
式図であり、第１０図は、プラスミドｐＳ　Ｖ　２ｈｙ
ｇの制限部位および機能地図を示す模式図であり、 第１１図は、プラスミドｐＬＰｃｈｙｇ１（ＧＴ）の制
限部位および機能地図を示す模式図であり、第１２図は
、プラスミドｐＢＷ３２の構築を示す工程図であり、 第１３図は、プラスミドｐＬＰｃｈｄ１（ＧＴ）の制限
部位および機能地図を示す模式図であり、第１４図は、
プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　’）の制限部位および機能
地図を示す模式図であり、 第１５図は、プラスミドｐＬＰｃＥ１Ａ（ＧＴ）の制限
部位および機能地図を示す模式図であり、第１６図は、
プラスミドｐＢＬＴ（ＧＴ）の制限部位および機能地図
を示す模式図であり、第１７図は、プラスミドｐＢＬＴ
ｈｙｇ１（ＧＴ）の制限部位および機能地図を示す模式
図であり、第１８図は、プラスミドｐＢ　Ｌ　Ｔｄｈｒ
ｒ　ｌ　（Ｇ　Ｔ）の制限部位および機能地図を示す模
式図であり、第１９図は、プラスミドｐＴＰＡ６０３の
制限部位および機能地図を示す模式図であり、第２０図
は、プラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）Ｔ　Ｐ　Ａの制限部
位および機能地図を示す模式図であり、第２１図は、プ
ラスミドｐｈｄ（Ｇ　Ｔ　）Ｍ　Ｔ　Ｐ　Ａの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第２２図は、プラ
スミドｐＢ　ａｌ　８　ｃａｔ（Ｇ　Ｔ　６　）の制限
部位および機能地図を示す模式図であり、第２３図は、
プラスミドＩ）ＳＶ２Ｅ１Ａの制限部位および機能地図
を示す模式図であり、第２４図は、プラスミドｐＴ６　
ｈｄ（Ｇ　Ｔ　）の制限部位および機能地図を示す模式
図である。 特許出願人イーライ・リリー・アンド・カンパニー代理
　人　弁理士　青　山　葆　はか１名ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ＳｔｕＩ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、ＩＯ ＢａｍＨＩ ｃｏＲＩ ＦＩ　Ｇ、　Ｉ　ｌ ＦＩＧ、１３ ＦＩＧ、＋４ ＦＩＧ、ｊ５ ＦＩＧ、ｌ７ ＦＩＧ、１６ ＦＩＧ、１Ｂ ＦＩＧ、ｊ９ ＦＩＧ、２１ ＦＩＧ、２０ ｇｌＩＩ ＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ ＦＩＧ、２２ ｔｕＩ Ｓ）Ｔｕｌ ｃ１１ ＦＩＧ、２３ δｔｕＩ／Ｂａｌ工 ＦＩＧ、２４

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、真核性プロモーター、該プロモーターを刺激するよ
    うに設置されたポリ−ＧＴ要素、および該プロモーター
    から発現されるように設置された有用な物質をコードし
    ているＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡベクターで真
    核宿主細胞を形質転換し、該ベクター含有細胞を該有用
    物質の発現に適した条件下で培養することにより、真核
    宿主細胞において有用な物質を産生させる改良方法であ
    って、 （ａ）大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物の発現
    をコードしているＤＮＡ配列を細胞に付与し、そして （ｂ）工程（ａ）の細胞を該遺伝子産物の発現および該
    ポリーＧＴ要素活性の刺激に適した条件下で培養するこ
    と、 からなる方法。 ２、大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物がアデノ
    ウィルスＥ１Ａタンパク質、アデノウィルスＥ１Ｂタン
    パク質、仮性狂犬病ウィルスＩＥタンパク質、または単
    純疱疹ウィルスＩＣＰ４タンパク質である請求項１記載
    の方法。 ３、大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物がアデノ
    ウィルスＥ１Ａタンパク質である請求項１または請求項
    ２記載の方法。 ４、有用な物質がヒトプロテインＣである請求項１〜３
    のいずれかに記載の方法。 ５、工程（ｂ）で培養される真核宿主細胞がアデノウィ
    ルス形質転換された宿主細胞である請求項１〜４のいず
    れかに記載の方法。 ６、真核宿主細胞が２９３またはＡＶ１２細胞である請
    求項５記載の方法。 ７、真核性プロモーターがＳＶ４０初期プロモーター、
    ＳＶ４０後期プロモーター、ＢＫ初期プロモーター、Ｂ
    Ｋ後期プロモーター、ポリオーマウィルス初期プロモー
    ター、パポバウイルス初期プロモーター、ポリオーマウ
    ィルス後期プロモーター、パポバウイルス後期プロモー
    ター、ヘルペスウィルスプロモーター、インターフェロ
    ンａ１プロモーター、マウスメタロチオネインプロモー
    ター、レトロウイルスプロモーター、β−グロビンプロ
    モーター、ポックスウィルスプロモーター、アデノウィ
    ルスプロモーター、アデノウイルス−２後期プロモータ
    ー、ウニＨ２Ａプロモーター、コンアルブミンプロモー
    ター、卵アルブミンプロモーター、マウスβ−グロビン
    プロモーター、ヒトβ−グロビンプロモーター、および
    ラウス肉腫ウィルス長末端繰返しプロモーターである請
    求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８、プラスミドｐＬＰ（ＧＴ）ｃａｔ、ｐＢＰ（ＧＴ）
    ｃａｔ、ｐＳＢＬ（ＧＴ）ｃａｔ、ｐＬＰＣ（ＧＴ）、
    ｐＬＰＣ４（ＧＴ）、ｐＬＰＣ５（ＧＴ）、ｐＬＰＣｈ
    ｙｇ１（ＧＴ）、ｐＬＰＣｈｙｇ２（ＧＴ）、ｐＬＰＣ
    ｄｈｆｒ１（ＧＴ）、ｐＬＰＣｄｈｆｒ２（ＧＴ）、ｐ
    ＬＰＣｈｄ１（ＧＴ）、ｐＬＰＣｈｄ２（ＧＴ）、ｐＬ
    ＰＣｈｄ３（ＧＴ）、ｐＬＰＣｈｄ４（ＧＴ）、ｐＢＬ
    Ｔ（ＧＴ）、ｐＢＬＴｈｙｇ１（ＧＴ）、ｐＢＬＴｈｙ
    ｇ２（ＧＴ）、ｐＢＬＴｄｈｆｒ１（ＧＴ）、ｐＢＬＴ
    ｄｈｆｒ２（ＧＴ）、ｐｈｄＴＰＡ（ＧＴ）、ｐｈｄＭ
    ＴＰＡ（ＧＴ）、ｐＢａｌ８ｃａｔ（ＣＴ６）、ｐＢａ
    ｌ８ｃａｔ（ＧＴ９）、ｐ４−１４（ＧＴ）、ｐ２−５
    （ＧＴ）、ｐＴ６ｈｄ（ＧＴ）、ｐＬＰＣＥ１Ａ（ＧＴ
    ）、ｐＬＰＣＥ１Ａ１（ＧＴ）。 ９、大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物の存在下
    でアデノウイルス−２後期プロモーターからの転写を刺
    激するように設置されているポリ−ＧＴ要素を含有する
    プラスミド。 １０、アデノウイルス−２後期プロモーターからの転写
    を刺激するように設置されているＢＫエンハンサーをさ
    らに含有する請求項９記載のプラスミド。 １１、プラスミドｐｈｄ（ＧＴ）。 １２、大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物の存在
    下で、アデノウイルス−２後期プロモーターからの、タ
    ンパク質をコードしているＤＮＡ配列の転写を刺激する
    ように設置されているポリ−ＧＴ要素を含有する請求項
    ９記載のプラスミド。 １３、タンパク質がクロラムフェニコールアセチルトラ
    ンスフェラーゼである請求項１２記載のプラスミド。 １４、ｐＬＰ（ＧＴ）ｃａｔである請求項１３記載のプ
    ラスミド。 １５、アデノウイルス−２後期プロモーターからの転写
    を刺激するように設置されているＢＫエンハンサーをさ
    らに含有する請求項１３記載のプラスミド。 １６、プラスミドｐＢＬ（ＧＴ）ｃａｔ、ｐＢａｌ８ｃ
    ａｔ（ＧＴ６）、またはｐＢａｌ８ｃａｔ（ＧＴ９）で
    ある請求項１５記載のプラスミド。 １７、タンパク質がヒトプロテインＣである請求項１２
    記載のプラスミド。 １８、タンパク質が組織プラスミノーゲン活性化因子で
    ある請求項１２記載のプラスミド。 １９、プラスミドｐｈｄＴＰＡ（ＧＴ）。 ２０、タンパク質が修飾型の組織プラスミノーゲン活性
    化因子である請求項１２記載のプラスミド。 ２１、プラスミドｐｈｄＭＴＰＡ（ＧＴ）またはｐＴ６
    ｈｄ（ＧＴ）。 ２２、タンパク質がα−インターフェロン、β−インタ
    ーフェロン、またはγ−インターフェロンである請求項
    １２記載のプラスミド。 ２３、アデノウイルス−２後期プロモーターとタンパク
    質をコードしているＤＮＡ配列の間に、アデノウィルス
    の３部構成のリーダーをコードしているＤＮＡをさらに
    含有している請求項１２記載のプラスミド。 ２４、プラスミドｐ４−１４（ＧＴ）またはｐ２−５（
    ＧＴ）。 ２５、請求項８〜２４のいずれかに記載のプラスミドで
    形質転換した真核宿主細胞。 ２６、２９３またはＡＶ１２細胞である請求項２５記載
    の真核宿主細胞。 ２７、２９３／ｐＬＰＣ（ＧＴ）、２９３／ｐＬＰＣ４
    （ＧＴ）、２９３／ｐＬＰＣｈｙｇ１（ＧＴ）、２９３
    ／ｐＬＰＣｄｈｆｒ１（ＧＴ）、２９３／ｐＬＰＣｈｄ
    １（ＧＴ）、２９３／ｐ４−１４（ＧＴ）、２９３／ｐ
    Ｔ６ｈｄ（ＧＴ）、ＡＶ１２／ｐＬＰＣ（ＧＴ）、ＡＶ
    １２／ｐＬＰＣ４（ＧＴ）、ＡＶ１２／ｐＬＰＣｈｙｇ
    １（ＧＴ）、ＡＶ１２／ｐＬＰＣｄｈｆｒ１（ＧＴ）、
    ＡＶ１２／ｐＬＰＣｈｄ１（ＧＴ）、ＡＶ１２／ｐ４−
    １４（ＧＴ）、ＡＶ１２／ｐＴ６ｈｄ（ＧＴ）である請
    求項２６記載の真核宿主細胞。 ２８、天然にγ−カルボキシル化され、適切に折り畳ま
    れ、そしてプロセッシングされているタンパク質を産生
    させる改良方法であって、該タンパク質が組換えＤＮＡ
    ベクターにコードされており、該ベクターを含有する真
    核宿主細胞が適切な発現条件下で培養されるときには該
    タンパク質が発現されるものであり、改良が （ａ）ポリ−ＧＴ要素を組換えＤＮＡベクターに挿入し
    、 （ｂ）Ｅ１Ａ遺伝子産物を発現するアデノウィルス形質
    転換した宿主細胞中に工程（ａ）のベクターを挿入し、 （ｃ）カルボキシル化のための十分量のビタミンにを含
    む培地中および増殖条件下で工程（ｂ）の宿主細胞を培
    養すること、 からなる方法。 ２９、アデノウィルス形質転換した宿主細胞がヒト胚腎
    ２９３またはＡＶ１２細胞である請求項２８記載の方法
    。 ３０、γ−カルボキシル化されるタンパク質がヒトプロ
    テインＣである請求項２９記載の方法。 ３１、真核宿主細胞中でタンパク質を産生させる方法で
    あって、 （ａ）（１）ポリ−ＧＴ要素、 （２）第１のエンハンサー、 （３）第１のエンハンサーとは別の第２のエンハンサー
    、 （４）真核性プロモーター、および （５）タンパク質をコードしており、該プロモーターか
    ら発現されるように設置されて いるＤＮＡ配列、 を含有する組換えＤＮＡベクタ−で宿主細胞を形質転換
    し；そして （ｂ）工程（ａ）で形質転換した宿主細胞を遺伝子発現
    が可能な条件下で培養すること、 からなる方法。 ３２、第１のエンハンサーがＳＶ４０エンハンサーであ
    り、第２のエンハンサーがＢＫエンハンサーである請求
    項３１記載の方法。 ３３、タンパク質がヒトプロテインＣである請求項３１
    記載の方法。
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