JPH02171198A - 真核性発現の改良 - Google Patents
真核性発現の改良Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、大きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物の
存在下でポリーGT要素を用いて真核宿主細胞における
組換え遺伝子の転写を増強させる方法に関する。本明細
書に例示したボ!J−GT要素は化学的に合成される(
原型のボ1,1−GT要素を後記実施例1に示した)。
存在下でポリーGT要素を用いて真核宿主細胞における
組換え遺伝子の転写を増強させる方法に関する。本明細
書に例示したボ!J−GT要素は化学的に合成される(
原型のボ1,1−GT要素を後記実施例1に示した)。
発現ベクターに挿入されたとき、原型(プロトタイプ)
のポリーGT要素は21個の繰返しGTt1位を含有し
ている。しかし、化学的に合成した配列またはヒトゲノ
ム配列を含む、長さの異なる繰返し単位を含む多種多様
のポリーGT要素が、本発明で用いるのに適しているこ
とは当業者の認めるところであろう。本発明ニおいてエ
ンハン司′−要素をポリーGT要素七ともに用いて転写
をさらに増強することもできる。
のポリーGT要素は21個の繰返しGTt1位を含有し
ている。しかし、化学的に合成した配列またはヒトゲノ
ム配列を含む、長さの異なる繰返し単位を含む多種多様
のポリーGT要素が、本発明で用いるのに適しているこ
とは当業者の認めるところであろう。本発明ニおいてエ
ンハン司′−要素をポリーGT要素七ともに用いて転写
をさらに増強することもできる。
ある種の構築物においてはポリーGT配列はBKエンハ
ンサ−結合している。INKエンハンサーハ繰返し配列
からなる明確にされているD N Aセグメントである
(原型のBKエンハンサ−および変異型のBKエンハン
サ−を後記実施例18に示した)。しかし、多種多様の
BKエンハンサ−変異体(すべてが、異なった繰返し配
列からなる訳ではない)が当分野で知られており、ポリ
ーGT要素とともに本発明で用いるのに適している。
ンサ−結合している。INKエンハンサーハ繰返し配列
からなる明確にされているD N Aセグメントである
(原型のBKエンハンサ−および変異型のBKエンハン
サ−を後記実施例18に示した)。しかし、多種多様の
BKエンハンサ−変異体(すべてが、異なった繰返し配
列からなる訳ではない)が当分野で知られており、ポリ
ーGT要素とともに本発明で用いるのに適している。
[従来の技術1
交互の配列ポ’J (dT −dG ) 、ポリ(、I
C−dA )ハ真核性ゲノム中で繰返し性の高い配列で
あり、左回転またはZ −D N Aを形成することが
できる[ハマグおおよびカクナガ(Hamada an
d Kakunaga、 19g2. Nature
298 : 396−398) ; ””、ダら(l
lamada)。
C−dA )ハ真核性ゲノム中で繰返し性の高い配列で
あり、左回転またはZ −D N Aを形成することが
できる[ハマグおおよびカクナガ(Hamada an
d Kakunaga、 19g2. Nature
298 : 396−398) ; ””、ダら(l
lamada)。
19g2. Proc、Natl、Acad、Sci、
υSA 79 : 6465−6469]。
υSA 79 : 6465−6469]。
例えば、ヒトゲノムは、約1oo、oooコピーのラン
ダムに9市しているポリ(dT−dG)・ポリCdC−
dΔ)の20〜60塩基対(bp)区域を含有している
[ハマダら(Ilamada、 1984+ Mo1.
Ce11. Biol。
ダムに9市しているポリ(dT−dG)・ポリCdC−
dΔ)の20〜60塩基対(bp)区域を含有している
[ハマダら(Ilamada、 1984+ Mo1.
Ce11. Biol。
4 : 2610−2621>]。ハマダら[Hama
da、 1984. Mol。
da、 1984. Mol。
Ce11.Biol、 4 : 2622−2630コ
は、ポリ(dT−dG)−ボ’7(dC−dA)がSV
40初期ブI:lモーター1:、およびクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)の暗号配
列に結合しているときには、ボ’J(dT−dG)−ボ
!/(dC−dA)それ自体h<cAT発現のエンハン
サ−として作用しうろことを明らかにした。ハマダら(
上記)によると、SV40初期プロモーターと共にある
ポリ(dT−dG)・ポリCdC−dA)のエンハンサ
−様の活性はSV40初期プロモーターと共にある5V
4Qエンハンサ−の活性に比べかなり弱いものであり、
そして多りのウィルスエンハンサ−とは異なり、このポ
!J(dT−dG) ・ポ!j(dC−dA)はサル(
CV−1)またはヒト(HeLa)において等しく活性
であった。
は、ポリ(dT−dG)−ボ’7(dC−dA)がSV
40初期ブI:lモーター1:、およびクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)の暗号配
列に結合しているときには、ボ’J(dT−dG)−ボ
!/(dC−dA)それ自体h<cAT発現のエンハン
サ−として作用しうろことを明らかにした。ハマダら(
上記)によると、SV40初期プロモーターと共にある
ポリ(dT−dG)・ポリCdC−dA)のエンハンサ
−様の活性はSV40初期プロモーターと共にある5V
4Qエンハンサ−の活性に比べかなり弱いものであり、
そして多りのウィルスエンハンサ−とは異なり、このポ
!J(dT−dG) ・ポ!j(dC−dA)はサル(
CV−1)またはヒト(HeLa)において等しく活性
であった。
本明細書に例示したBKエンハンサ−配列は、免疫抑制
されている患者の尿から初めて単離されたヒトパボバウ
ィルス、BKウィルスから得られる。BKウィルスは明
確ではない幼時感染の原因ではないかと疑われており、
ヒトのいる所にW遍的に存在している。BKウィルスは
ヒト細胞中で最もよく増殖するが、このウィルスは多数
の非;長類細胞中で不稔サイクルを経、インビトロで誓
歯類細胞を形質転換し、ハムスターにおいてpa瘍を誘
導する。BKウィルスは5V4Qに極めて似ているが、
これら2g!類のパポバウイルス SV40およびBK
のエンハンサ−配列はそのヌクレオチド配列が実質的に
異なっている。BKウィルス(〜5.2kb)の完全な
ヌクレオチド配列は、セイフら(Seif et al
、、 1979. Ce1l 18 : 963)、並
びに、ヤングおよびウー(Yang and Nu、
1979.5cience 206 : 456)が
開示している。原型のBKウィルスは、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション[A T CC; A
merican Type Cu1ture Co11
ection、 12301 Parklawn Dr
、、 Rockville、 MD20852−177
6]から、取得番号ATCCVR−837のもとて入手
できる。原型BKウィルス制限部位および機能地図を添
付の第1図に示す。
されている患者の尿から初めて単離されたヒトパボバウ
ィルス、BKウィルスから得られる。BKウィルスは明
確ではない幼時感染の原因ではないかと疑われており、
ヒトのいる所にW遍的に存在している。BKウィルスは
ヒト細胞中で最もよく増殖するが、このウィルスは多数
の非;長類細胞中で不稔サイクルを経、インビトロで誓
歯類細胞を形質転換し、ハムスターにおいてpa瘍を誘
導する。BKウィルスは5V4Qに極めて似ているが、
これら2g!類のパポバウイルス SV40およびBK
のエンハンサ−配列はそのヌクレオチド配列が実質的に
異なっている。BKウィルス(〜5.2kb)の完全な
ヌクレオチド配列は、セイフら(Seif et al
、、 1979. Ce1l 18 : 963)、並
びに、ヤングおよびウー(Yang and Nu、
1979.5cience 206 : 456)が
開示している。原型のBKウィルスは、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション[A T CC; A
merican Type Cu1ture Co11
ection、 12301 Parklawn Dr
、、 Rockville、 MD20852−177
6]から、取得番号ATCCVR−837のもとて入手
できる。原型BKウィルス制限部位および機能地図を添
付の第1図に示す。
エンハンサ−要素は、エンハンサ−要素の位tおよび配
向に比較的依存することなく、そのプロモーターからの
隣接遺伝子の転写レベルを増加させるシス作用性の要素
である。事実、コウリーおよびグラス[Khoury
and Gruss、 f983. Ce1l 33:
313]は、「真核性遺伝子の上流、その内部、または
下流で機能するエンハンサ−配列の顕著な能力はそれを
古典的なプロモーター要素と区別するものである・・・
Jと述べ、ある種の実験結果が「エンハンサ−はかなり
の距Wi(おそら(、> l Okb)を越えて作用す
ることができる」ことを示すと示唆している。
向に比較的依存することなく、そのプロモーターからの
隣接遺伝子の転写レベルを増加させるシス作用性の要素
である。事実、コウリーおよびグラス[Khoury
and Gruss、 f983. Ce1l 33:
313]は、「真核性遺伝子の上流、その内部、または
下流で機能するエンハンサ−配列の顕著な能力はそれを
古典的なプロモーター要素と区別するものである・・・
Jと述べ、ある種の実験結果が「エンハンサ−はかなり
の距Wi(おそら(、> l Okb)を越えて作用す
ることができる」ことを示すと示唆している。
[発明か解決しようとする課題]
本発明は新規エンハンサ−系を教示するものである。こ
れは、ポリーGT要素が、アデノウィルス後期プロモー
ターなどのある種のプロモーターと組合わせて設置され
たときには、E1A遺伝子産物などのトランス作用性の
初期ウィルス遺伝子産物の存在下でだけエンハンサ−と
して機能するからである。BKエンハンサ−などの他の
エンハンサ−要素を、本発明においてポリーGT要素と
ともに用いてもよい。特に本発明は、シス−作用性のポ
リーGT要素と大きいDNAウィルスのトランス−作用
性の即時型遺伝子産物が組合わさって存在するときにだ
け予想外に転写を増加させることになる、アデノウィル
ス後期プロモーターのためのエンハンサ−系を教示する
ものである。即ち、ポリーGT要素からのエンハンサ−
活性を活性化するためにウィルス性のトランス−作用性
のタンパク質が必要とされる。このことは、s■40初
期プロモーターを用いてポリーGT配列か単独でCへT
遺伝子産物の発現を増強することができるハマダら(上
記)のエンハンサ−系とは極めて対照的である。本発明
においては、別のエンハンサ−要素をポリーGT要素お
よびトランス−作用性ウィルス遺伝子産物とともに用い
て、転写、即ち有用な遺伝子産物の発現をさらに増強す
ることができる。
れは、ポリーGT要素が、アデノウィルス後期プロモー
ターなどのある種のプロモーターと組合わせて設置され
たときには、E1A遺伝子産物などのトランス作用性の
初期ウィルス遺伝子産物の存在下でだけエンハンサ−と
して機能するからである。BKエンハンサ−などの他の
エンハンサ−要素を、本発明においてポリーGT要素と
ともに用いてもよい。特に本発明は、シス−作用性のポ
リーGT要素と大きいDNAウィルスのトランス−作用
性の即時型遺伝子産物が組合わさって存在するときにだ
け予想外に転写を増加させることになる、アデノウィル
ス後期プロモーターのためのエンハンサ−系を教示する
ものである。即ち、ポリーGT要素からのエンハンサ−
活性を活性化するためにウィルス性のトランス−作用性
のタンパク質が必要とされる。このことは、s■40初
期プロモーターを用いてポリーGT配列か単独でCへT
遺伝子産物の発現を増強することができるハマダら(上
記)のエンハンサ−系とは極めて対照的である。本発明
においては、別のエンハンサ−要素をポリーGT要素お
よびトランス−作用性ウィルス遺伝子産物とともに用い
て、転写、即ち有用な遺伝子産物の発現をさらに増強す
ることができる。
BKエンハンサ−をポリーGT要素とともに用いるとき
には、有用な物質をコードしているDNA配列を転写さ
せるためにBKエンハンサ−と直列で用いられる真核性
プロモーターのrCCA AT」領域の5′画のすぐ上
流にBKエンハンサ−を設置すると、さらに高い転写の
増加が得られる。
には、有用な物質をコードしているDNA配列を転写さ
せるためにBKエンハンサ−と直列で用いられる真核性
プロモーターのrCCA AT」領域の5′画のすぐ上
流にBKエンハンサ−を設置すると、さらに高い転写の
増加が得られる。
このCCAAT領域あるいは「すぐ−上流の領域」ある
いは「−80相同配列」は、転写活性のだめの配列が詳
しく調べられているプロモーターで観察されるヌクレオ
チド保存領域であるシス−作用性の上流要素である。C
CAAT領域は、すべてではないが多数のプロモーター
で見い出されている。
いは「−80相同配列」は、転写活性のだめの配列が詳
しく調べられているプロモーターで観察されるヌクレオ
チド保存領域であるシス−作用性の上流要素である。C
CAAT領域は、すべてではないが多数のプロモーター
で見い出されている。
他のプロモーターにおいて、等価なシス−作用性上流配
列が見い出されており、これらにはSPl結合部位、A
TF結合部位、オクタ配列、核因子l結合部位(CCA
A T転写因子と同じ結合部位であることもある)、
APIおよびAP2相同、グルココルチコイド応答要素
、および熱ンヨック応答要素が含まれる。最近になって
、上に挙げた配列を含む現在既知の上流配列を包括的に
編纂したものが公表された[ウインゲングー(Wing
ender。
列が見い出されており、これらにはSPl結合部位、A
TF結合部位、オクタ配列、核因子l結合部位(CCA
A T転写因子と同じ結合部位であることもある)、
APIおよびAP2相同、グルココルチコイド応答要素
、および熱ンヨック応答要素が含まれる。最近になって
、上に挙げた配列を含む現在既知の上流配列を包括的に
編纂したものが公表された[ウインゲングー(Wing
ender。
198g、 Nucl、Ac1ds Res、 16:
1879−1912)]。アデノウィルス主後期プロ
モーターで等価なCCAAT領域は、上流転写因子(U
T l;”)または玉後期転写因子(M L T F
)結合部位である(CAP部位の一ト流のおよそのヌ
クレオチド−50〜−65)。
1879−1912)]。アデノウィルス主後期プロ
モーターで等価なCCAAT領域は、上流転写因子(U
T l;”)または玉後期転写因子(M L T F
)結合部位である(CAP部位の一ト流のおよそのヌ
クレオチド−50〜−65)。
CCAAT配列は転写効率を媒介し、ごく僅かの例外を
除いてプロモーターの長さを短くすることなく削除する
ことかできない。
除いてプロモーターの長さを短くすることなく削除する
ことかできない。
エンハンサ−要素は、ネズミボリオーマウイルス、パピ
ローマウィルス、アデノウィルス、レトロウィルス、肝
炎ウィルス、サイトメガロウィルス、ヘルペスウィルス
、バポバウイルス’ff、例、tばSV40およびBに
を含む多数のウィルスのDNA中で、および多数の非ウ
ィルス性遺伝子、例えば免疫グロブリン遺伝子のイント
ロン中で同定されている。エンハンサ−要素は多種多様
の他の生物のDNA中に存在することもある。エンハン
サ−要素は別の宿主細胞中では異なって機能することが
多く、この細胞特異性は遺伝子の発現中にエンハンサ−
要素と相互作用する宿主遺伝子産物の差異によるものと
することができる。
ローマウィルス、アデノウィルス、レトロウィルス、肝
炎ウィルス、サイトメガロウィルス、ヘルペスウィルス
、バポバウイルス’ff、例、tばSV40およびBに
を含む多数のウィルスのDNA中で、および多数の非ウ
ィルス性遺伝子、例えば免疫グロブリン遺伝子のイント
ロン中で同定されている。エンハンサ−要素は多種多様
の他の生物のDNA中に存在することもある。エンハン
サ−要素は別の宿主細胞中では異なって機能することが
多く、この細胞特異性は遺伝子の発現中にエンハンサ−
要素と相互作用する宿主遺伝子産物の差異によるものと
することができる。
エンハンサ−要素の活性は、宿主細胞に存在するウィル
ス性の遺伝子産物によって影響される。
ス性の遺伝子産物によって影響される。
ベルチヒおよびシッフ[Velcich and Zi
fL 1983Cell 40 ニア05] :ボレ
リら[Borrelli et al、、 1984゜
Nature 312 : 60g] :およびヘンら
[Hen et al、、 1985、5cienc
e 230 : 1391]は、アデノウイルス−2初
期領域1A(E1A)遺(云子産物が5V4Q、ポリオ
ーマウィルス、マウス免疫グロブリン遺伝子およびアデ
ノウイルス−2E1Aエンハンサ−によって誘導される
転写の活性を抑制すると記している。このE1Aによる
作用は宿主細胞依存性である。従って、エンハンサ−を
利用して組換え遺伝子の転写を増加させる真核性発現ベ
クターは、E1A含有宿主細胞においてエンハンサ−を
含まないベクターよりも良好に作動するとは予測されな
かった。エンハンサ−を用いる上記の従来法とは著しく
対照的に、欧州特許公開EPAO245949(出願N
o、 87303(183,7; 19g7年11月
19日公開)はBKウィルスエンハンサ−要素を用いる
方法を教示しているが、この方法はE1A遺伝子産物ま
たは大きいD N Aウィルスの同様の即時型遺伝子産
物を用いて遺伝子発現を最大にすることからなる。
fL 1983Cell 40 ニア05] :ボレ
リら[Borrelli et al、、 1984゜
Nature 312 : 60g] :およびヘンら
[Hen et al、、 1985、5cienc
e 230 : 1391]は、アデノウイルス−2初
期領域1A(E1A)遺(云子産物が5V4Q、ポリオ
ーマウィルス、マウス免疫グロブリン遺伝子およびアデ
ノウイルス−2E1Aエンハンサ−によって誘導される
転写の活性を抑制すると記している。このE1Aによる
作用は宿主細胞依存性である。従って、エンハンサ−を
利用して組換え遺伝子の転写を増加させる真核性発現ベ
クターは、E1A含有宿主細胞においてエンハンサ−を
含まないベクターよりも良好に作動するとは予測されな
かった。エンハンサ−を用いる上記の従来法とは著しく
対照的に、欧州特許公開EPAO245949(出願N
o、 87303(183,7; 19g7年11月
19日公開)はBKウィルスエンハンサ−要素を用いる
方法を教示しているが、この方法はE1A遺伝子産物ま
たは大きいD N Aウィルスの同様の即時型遺伝子産
物を用いて遺伝子発現を最大にすることからなる。
即ち、欧州特許公開EP A O245949は、DN
Aの転写を促進するBKエンハンサ−の能力があらゆる
アゾ7ウイルスのE1A遺fz=子産物存在下で増強さ
れることを初めて示すものである。
Aの転写を促進するBKエンハンサ−の能力があらゆる
アゾ7ウイルスのE1A遺fz=子産物存在下で増強さ
れることを初めて示すものである。
[課題を解決するための手段]
ここに、ポリーGT要素をBKエンハンサ−とともに用
いてあらゆるアゾンウィルスのE1A遺伝子産物の存在
下でDNAの転写をさらに増強することができることを
予想外に見い出した。アゾンウイルス後期プロモーター
を用いて転写させると、驚くべきことに、ポリーGT要
素はそれ自体は転写を増強はしないが、E1A遺伝子産
物または大きいDNAウィルスの同様の即時型遺伝子産
物の(j在下でだけ活性化され、エンハンサ−活性を示
す。E1A遺伝子産物は、試験されたほとんどのエンハ
ンサ−による転写の活性化を抑制することがわかってい
たので、E1AがポリーGT要素のエンハンサ−様活性
を活性化する能力を有していることは予想外のことであ
った。C1A遺伝子産物(実際にはE1A遺伝子は2種
類の産物を産生ずるが、本明細書ではこれらを一括して
「E1A遺伝子産物」と呼ぶ)は、大きいDNAウィル
スであるアデノウィルス由来のこのような即時型遺伝子
産物の1つである。本発明は、大きいDNAウィルスの
あらゆる即時型遺伝子産物またはE1A遺伝子産物と同
様に機能するあらゆるレトロウィルス性タンパク質産物
を用いて、BKエンハンサ−などの別のエンハンサ−要
素なしで、またはそれとともにポリーGT要素の活性を
増強することを包含している。単純疱疹ウィルスICP
4タンパク質[デル力ら(DeLuca et at、
、 1985. Mol。
いてあらゆるアゾンウィルスのE1A遺伝子産物の存在
下でDNAの転写をさらに増強することができることを
予想外に見い出した。アゾンウイルス後期プロモーター
を用いて転写させると、驚くべきことに、ポリーGT要
素はそれ自体は転写を増強はしないが、E1A遺伝子産
物または大きいDNAウィルスの同様の即時型遺伝子産
物の(j在下でだけ活性化され、エンハンサ−活性を示
す。E1A遺伝子産物は、試験されたほとんどのエンハ
ンサ−による転写の活性化を抑制することがわかってい
たので、E1AがポリーGT要素のエンハンサ−様活性
を活性化する能力を有していることは予想外のことであ
った。C1A遺伝子産物(実際にはE1A遺伝子は2種
類の産物を産生ずるが、本明細書ではこれらを一括して
「E1A遺伝子産物」と呼ぶ)は、大きいDNAウィル
スであるアデノウィルス由来のこのような即時型遺伝子
産物の1つである。本発明は、大きいDNAウィルスの
あらゆる即時型遺伝子産物またはE1A遺伝子産物と同
様に機能するあらゆるレトロウィルス性タンパク質産物
を用いて、BKエンハンサ−などの別のエンハンサ−要
素なしで、またはそれとともにポリーGT要素の活性を
増強することを包含している。単純疱疹ウィルスICP
4タンパク質[デル力ら(DeLuca et at、
、 1985. Mol。
Cel l Biol、 5 : l 997−200
8)が記載J1仮性狂犬病ウィルスIEタンパク質[フ
ェルドマンラ(Feldmanet al、、 198
2. Proc、Natl、^cad、 Sci、 U
SA 79 : 4952−4956)が記載]、サイ
トメガロウィルス[Eタンパク質[テベチアら(Tev
ethia et al、、 1987. Virol
ogy 161 : 276−285)が記載]、およ
びアデノウィルスのE1Bタンパク質がすべて、E1A
タンパク質と同様の機能を有する大きいDNAウィルス
の即時型遺伝子産物である。従って、本発明の方法は、
ElΔタンパク質の存在下または非存在下で、ICP4
、IEもしくはE1Bタンパク質、または同様に作用す
る他のあらゆる即時型遺伝子産物を用いて、ポリーGT
要素由来のエンノ\ンサー様活性を生み出すか、または
活性化することを含んでいる。さらに、HIVウィルス
のTAT遺伝子産物またはその池のレトロウィルス性9
7バク質などの他のトランス−作用性ウィルスタンパク
質もポリーGT要素を活性化する方法において有用であ
る。
8)が記載J1仮性狂犬病ウィルスIEタンパク質[フ
ェルドマンラ(Feldmanet al、、 198
2. Proc、Natl、^cad、 Sci、 U
SA 79 : 4952−4956)が記載]、サイ
トメガロウィルス[Eタンパク質[テベチアら(Tev
ethia et al、、 1987. Virol
ogy 161 : 276−285)が記載]、およ
びアデノウィルスのE1Bタンパク質がすべて、E1A
タンパク質と同様の機能を有する大きいDNAウィルス
の即時型遺伝子産物である。従って、本発明の方法は、
ElΔタンパク質の存在下または非存在下で、ICP4
、IEもしくはE1Bタンパク質、または同様に作用す
る他のあらゆる即時型遺伝子産物を用いて、ポリーGT
要素由来のエンノ\ンサー様活性を生み出すか、または
活性化することを含んでいる。さらに、HIVウィルス
のTAT遺伝子産物またはその池のレトロウィルス性9
7バク質などの他のトランス−作用性ウィルスタンパク
質もポリーGT要素を活性化する方法において有用であ
る。
本発明は、転写を増加させる目的で、即ち真核宿主細胞
中で組換え遺伝子の発現を改善する目的で、大きいDN
Aウィルスの即時型遺伝子産物、例えばアデノウィルス
のE1A遺伝子産物、または同様に機能するウィルス性
遺伝子産物の存在下にポリーGT要素を用いる方法に関
する。本発明の別の重要な態様は、大きいDNAウィル
スの即時型遺伝子産物、例えばアデノウィルスのE1A
遺伝子産物の存在下で、ポリーGT要素を真核性プロモ
ーター、例えばアデノウィルス後期プロモーター(ML
P)とともに用いて、真核宿主細胞中で有用な産物を発
現させる多種の発現ベクターに関する。さらに、BKエ
ンハンサ−などのエンハンサ−要素をポリーGT要素と
ともに用いてそのような有用な産物の発現をさらに増強
することもできる。これらの発現ベクターの多くはポリ
GT−アデノウイルス後期プロモーターカセットを含有
しており、これを本発明方法で用いる他のベクターに容
易に移すことができる。このカセットはBKエンハンサ
−などのエンハンサ−要素をさらに含有していてもよい
。本発現ベクターが多用途であることは、これらのベク
ターによって成されるクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ、プロティンCS組織プラスミ/−ゲ
ン活性化因子、修飾型組織プラスミノーゲン活性化因子
、あるいはインターフェロン(α、β、γインターフェ
ロン)などの多様なタンパク質の高レベルの発現によっ
て示される。
中で組換え遺伝子の発現を改善する目的で、大きいDN
Aウィルスの即時型遺伝子産物、例えばアデノウィルス
のE1A遺伝子産物、または同様に機能するウィルス性
遺伝子産物の存在下にポリーGT要素を用いる方法に関
する。本発明の別の重要な態様は、大きいDNAウィル
スの即時型遺伝子産物、例えばアデノウィルスのE1A
遺伝子産物の存在下で、ポリーGT要素を真核性プロモ
ーター、例えばアデノウィルス後期プロモーター(ML
P)とともに用いて、真核宿主細胞中で有用な産物を発
現させる多種の発現ベクターに関する。さらに、BKエ
ンハンサ−などのエンハンサ−要素をポリーGT要素と
ともに用いてそのような有用な産物の発現をさらに増強
することもできる。これらの発現ベクターの多くはポリ
GT−アデノウイルス後期プロモーターカセットを含有
しており、これを本発明方法で用いる他のベクターに容
易に移すことができる。このカセットはBKエンハンサ
−などのエンハンサ−要素をさらに含有していてもよい
。本発現ベクターが多用途であることは、これらのベク
ターによって成されるクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ、プロティンCS組織プラスミ/−ゲ
ン活性化因子、修飾型組織プラスミノーゲン活性化因子
、あるいはインターフェロン(α、β、γインターフェ
ロン)などの多様なタンパク質の高レベルの発現によっ
て示される。
エンハンサ−要素が遠位から転写を増強することができ
ること、およびその活性がその配向に依存しないという
ことがエンハンサ−要素の特徴である。このことと合致
して、本発明のポリーGT要素は、発現させようとする
構造遺伝子の5゛または3°に設置されていてよい。従
って、本発明の一部の組換えDNA発現ベクターの構築
においては、ポリーGT要素は、組換えDNA発現ベク
ター上の組換え遺伝子を発現させるように設置されてい
るアデノウィルス後期プロモーターの上流に設置した。
ること、およびその活性がその配向に依存しないという
ことがエンハンサ−要素の特徴である。このことと合致
して、本発明のポリーGT要素は、発現させようとする
構造遺伝子の5゛または3°に設置されていてよい。従
って、本発明の一部の組換えDNA発現ベクターの構築
においては、ポリーGT要素は、組換えDNA発現ベク
ター上の組換え遺伝子を発現させるように設置されてい
るアデノウィルス後期プロモーターの上流に設置した。
また、このような構築の一部においては、BKエンハン
サ−要素をポリー〇T要素の上流に設置した。本発明の
他の組換えDNA発現ベクターの構築においては、ポリ
ーGT要素は発現させようとする構造遺伝子の3°末端
に設置し、他のエンハンサ−要素について記されている
ように、ポリーGT要素は種々の位置および配向で機能
しうろことが示された。
サ−要素をポリー〇T要素の上流に設置した。本発明の
他の組換えDNA発現ベクターの構築においては、ポリ
ーGT要素は発現させようとする構造遺伝子の3°末端
に設置し、他のエンハンサ−要素について記されている
ように、ポリーGT要素は種々の位置および配向で機能
しうろことが示された。
本発明を実施すると、アデノウィルス形質転換した細胞
におけるヒトプロティンCの発現が増強されることにな
る。このような細胞はヒトブロテインCなどの完全にγ
−カルボキシル化されたタンパク質を産生させるための
特に好ましい宿主である。従って、本発明の別の態様は
γ−カルボキシル化されたタンパク質を製造するための
改良法からなる。本発明のさらに別の重要な態様は、(
a)近接の真核性プロモーターに関連させてBKエンハ
ンサ−を設置し、(b)このような発現ベクター中にポ
リーGT要素を設置し、そして(c)大きいDNAウィ
ルスの即時型遺伝子産物またはE1A遺伝子産物と同様
に機能するあらゆるウィルス性遺伝子産物でポリーGT
要素(およびBKエンハンサ−)を活性化することによ
って有用な遺伝子産物の発現を一層増加させる方法に関
する。第1段階では、BKエンハンサ−をMLTF結合
部位に極めて近接させて設置する酵素処理によってこれ
ら誘導体を構築した。これらの修飾されたBKエンハン
サー−アデノウィルス後期プロモーター配列を発現ベク
ターに導入し、次いでこれを用いて真核宿主細胞中で有
用な遺伝子産物を発現させると、このような設置を欠(
構築物と比較したとき、発現レベルの劇的な増加が観察
された。第2段階では、有用産物をコードしている遺伝
子の3゛末端にどちらかの配向でポリ〜GT要素を設置
することによりこれらの誘導体をさらに構築した。ポリ
GT要素を欠(構築物と比較すると、発現レベルの一層
の増加が観察された。即ち、本発明は、真核性プロモー
ターのCCAAT領域またはCCAAT領域等価域の5
゛末端のすぐ上流O〜約300ヌクレオチド以内にBK
エンハンサ−を設置して近接の真核性プロモーターに関
連しているBKエンハンサ−の活性を増強し、そしてそ
の位置および配向には無関係のポリーGT要素をC1A
遺伝子産物で活性化することによって、有用な遺伝子産
物の発現を一層増加させる方法を提供するものである。
におけるヒトプロティンCの発現が増強されることにな
る。このような細胞はヒトブロテインCなどの完全にγ
−カルボキシル化されたタンパク質を産生させるための
特に好ましい宿主である。従って、本発明の別の態様は
γ−カルボキシル化されたタンパク質を製造するための
改良法からなる。本発明のさらに別の重要な態様は、(
a)近接の真核性プロモーターに関連させてBKエンハ
ンサ−を設置し、(b)このような発現ベクター中にポ
リーGT要素を設置し、そして(c)大きいDNAウィ
ルスの即時型遺伝子産物またはE1A遺伝子産物と同様
に機能するあらゆるウィルス性遺伝子産物でポリーGT
要素(およびBKエンハンサ−)を活性化することによ
って有用な遺伝子産物の発現を一層増加させる方法に関
する。第1段階では、BKエンハンサ−をMLTF結合
部位に極めて近接させて設置する酵素処理によってこれ
ら誘導体を構築した。これらの修飾されたBKエンハン
サー−アデノウィルス後期プロモーター配列を発現ベク
ターに導入し、次いでこれを用いて真核宿主細胞中で有
用な遺伝子産物を発現させると、このような設置を欠(
構築物と比較したとき、発現レベルの劇的な増加が観察
された。第2段階では、有用産物をコードしている遺伝
子の3゛末端にどちらかの配向でポリ〜GT要素を設置
することによりこれらの誘導体をさらに構築した。ポリ
GT要素を欠(構築物と比較すると、発現レベルの一層
の増加が観察された。即ち、本発明は、真核性プロモー
ターのCCAAT領域またはCCAAT領域等価域の5
゛末端のすぐ上流O〜約300ヌクレオチド以内にBK
エンハンサ−を設置して近接の真核性プロモーターに関
連しているBKエンハンサ−の活性を増強し、そしてそ
の位置および配向には無関係のポリーGT要素をC1A
遺伝子産物で活性化することによって、有用な遺伝子産
物の発現を一層増加させる方法を提供するものである。
本発明のさらに別の籾様は、アデノウィルスの3部構成
リーダー(TPL)配列の一部が導入されたある種の発
現ベクター中にポリーGT要素を導入することによって
、本明細書に記したベクターにコードされている組換え
産物の発現を増加させる試みから派生する。TPL配列
がそのような発現ベクター中にポリーGT要素とともに
導入され、アデノウィルスのE1A遺伝子産物の存在下
でポリーGT要素が活性化されると、発現が増強される
。アデノウィルスのVA遺伝子産物の存在下では、TP
L含有ベクターでの一層の発現の増強が得られる。
リーダー(TPL)配列の一部が導入されたある種の発
現ベクター中にポリーGT要素を導入することによって
、本明細書に記したベクターにコードされている組換え
産物の発現を増加させる試みから派生する。TPL配列
がそのような発現ベクター中にポリーGT要素とともに
導入され、アデノウィルスのE1A遺伝子産物の存在下
でポリーGT要素が活性化されると、発現が増強される
。アデノウィルスのVA遺伝子産物の存在下では、TP
L含有ベクターでの一層の発現の増強が得られる。
本発明のために以下の語句を定義する。
抗生物質:天然に、または限定された化学的修飾の後に
、他の微生物または真核細胞の増殖を抑制するか、また
はこれらを死滅させる微生物によって産生される物質。
、他の微生物または真核細胞の増殖を抑制するか、また
はこれらを死滅させる微生物によって産生される物質。
抗生物質耐性付与遺伝子二ある抗生物質に対する耐性を
付与する活性をコードしているDNAセグメント。
付与する活性をコードしているDNAセグメント。
ApR:アンビシリン耐性の表現型またはそれを付与す
る遺伝子。
る遺伝子。
クローニング:組m、tDNAクローニングベクターに
DNAのセグメントを導入する過程。
DNAのセグメントを導入する過程。
CmR:クロラムフエニコール耐性の表現型マたはそれ
を付与する遺伝子。
を付与する遺伝子。
E1A:ボリーGT要素を活性化してエンハンサ−活性
を発現することができるアデノウィルスの即時型遺伝子
産物。
を発現することができるアデノウィルスの即時型遺伝子
産物。
ep:T−抗原遺伝子のSV4 Q初期プロモータ、T
−抗原結合部位、および5V4Qの?I製起源を含有す
るDNAセグメント。
−抗原結合部位、および5V4Qの?I製起源を含有す
るDNAセグメント。
真核性プロモーター:真核細胞中でプロモーターとして
機能するあらゆるDNA配列。
機能するあらゆるDNA配列。
GTエンハンサ−系: MLPなとのプロモーターに関
連したあらゆるポリーGT要素であって、ポリーGT要
素がそれ自体はエンハンサ−活性を有してしないが、大
きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物、例えばE1A
遺伝子産物によってエンハンサ−として活性化される要
素、または同様の活性化を行うあらゆるウィルス性遺伝
子産物によって活性化される要素。
連したあらゆるポリーGT要素であって、ポリーGT要
素がそれ自体はエンハンサ−活性を有してしないが、大
きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物、例えばE1A
遺伝子産物によってエンハンサ−として活性化される要
素、または同様の活性化を行うあらゆるウィルス性遺伝
子産物によって活性化される要素。
HmR:ハイグロマイシン耐性の表現型またはそれを付
与する遺伝子。
与する遺伝子。
IVS:イントロンをコードしているDNAであり、介
在配列とも呼ばれる。
在配列とも呼ばれる。
大きいDNAウィルス:真核細胞に感染し、大きさが〜
1okb以上のゲノムを有するウィルス、即ち、あらゆ
るポックスウィルス類、アゾンウィルス類、およびヘル
ペスウィルス類。
1okb以上のゲノムを有するウィルス、即ち、あらゆ
るポックスウィルス類、アゾンウィルス類、およびヘル
ペスウィルス類。
MLP:アデノウィルスの主後期プロモーターであり、
本明細書ではアデノウィルス後期プロモーター、アデノ
ウイルス−2型後期プロモーターあるいはAd2後期プ
ロモーターと呼ぶこともある。
本明細書ではアデノウィルス後期プロモーター、アデノ
ウイルス−2型後期プロモーターあるいはAd2後期プ
ロモーターと呼ぶこともある。
MLTF結合部位:主後期転写因子(MLTF)が結合
するアデノウィルスDNA中の部位:このMLTFはM
LP活性に必要とされる。
するアデノウィルスDNA中の部位:このMLTFはM
LP活性に必要とされる。
NeoR:ネオマイシン耐性を付与する遺伝子であり、
これを用いて真核宿主細胞にG418耐性を付与するこ
ともできる。
これを用いて真核宿主細胞にG418耐性を付与するこ
ともできる。
ori ニプラスミドの複製起源。
pA:ポリアデニル化シグナルをコードしているDNA
配列。
配列。
ポリーGT要素:本明細書においてnが21である配列
で示されている(G T )n−(CA )nのDNA
配列であるが、rlが21より大きいかまたは小さい長
さの異なる配列を指すこともある。また、化学的に合成
した(G T )n −(CA )n配列または(GT
)n−(CA)n部分を含むヒトゲノムDNAフラグメ
ントを指すこともある。
で示されている(G T )n−(CA )nのDNA
配列であるが、rlが21より大きいかまたは小さい長
さの異なる配列を指すこともある。また、化学的に合成
した(G T )n −(CA )n配列または(GT
)n−(CA)n部分を含むヒトゲノムDNAフラグメ
ントを指すこともある。
プロモーター: DNAをRNAに転写させるDNA配
列。
列。
組換えDNAクローニングベクター:1またはそれ以上
の別のDNAセグメントを付加したか、または付加する
ことができるDNA分子を含有するあらゆる自律的に複
製するか、または組込まれる媒体。
の別のDNAセグメントを付加したか、または付加する
ことができるDNA分子を含有するあらゆる自律的に複
製するか、または組込まれる媒体。
組換えDNA発現ベクター;有用な産物をコードしてい
るDNA配列を挿入して発現させることが可能な、プロ
モーターおよび関連の挿入部位を含有するあらゆる組換
えDNAクローニングベクター 組換えDNAベクター:あらゆる組換えDNAクローニ
ングベクターまたは発現ベクターレプリコン:組換えD
NAベクターの複製を支配しているあらゆるDNA配列
。
るDNA配列を挿入して発現させることが可能な、プロ
モーターおよび関連の挿入部位を含有するあらゆる組換
えDNAクローニングベクター 組換えDNAベクター:あらゆる組換えDNAクローニ
ングベクターまたは発現ベクターレプリコン:組換えD
NAベクターの複製を支配しているあらゆるDNA配列
。
制限フラグメント;lまたはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成したあらゆる線状DNA0rRNA:リポ
ソーム性リボ核酸。
によって生成したあらゆる線状DNA0rRNA:リポ
ソーム性リボ核酸。
感受性宿主細胞:ある抗生物質または他の毒性化合物の
存在下ではそれらに対する耐性を付与するDNAセグメ
ントなしでは増殖することができない宿主細胞。
存在下ではそれらに対する耐性を付与するDNAセグメ
ントなしでは増殖することができない宿主細胞。
構造遺伝子二開始および停止コドンをコードしているD
NAを含む、ポリペプチドをコードしているあらゆるD
NA配列。
NAを含む、ポリペプチドをコードしているあらゆるD
NA配列。
TATニドランス−作用性のウィルスタンパク質として
の活性を有するレトロウィルスHIVの遺伝子産物。
の活性を有するレトロウィルスHIVの遺伝子産物。
TcR:テトラサイクリン耐性の表現型またはそれを付
与する遺伝子。
与する遺伝子。
形質転換体;形質転換を受けた受容宿主細胞。
形質転換・受容宿主細胞へのDNAの導入。
tRNA:転移リボ核酸。
第1図は、BKウィルスの制限部位および機能地図を示
す模式図であり、 第2図は、プラスミドpBKneolの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第3図は、プラスミドpS V 2 catの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、 第4図は、プラスミドpL P (G T )catの
制限部位および機能地図を示す模式図であり、第5図は
、プラスミドpB L (G T )catの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第6図は、プラス
ミドpS B L (G T)catの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、第7図は、プラスミドp
L l 33の制限部位および機能地図を示し、その構
築を示す工程図であり、 第8図は、プラスミドpt、pc(cT)の制限部位お
よび機能地図を示す模式図であり、第9図は、プラスミ
ドpLPC4(GT)の制限部位および機能地図を示す
模式図であり、第10図は、プラスミドpSV2hyg
の制限部位および機能地図を示す模式図であり、 第11図は、プラスミドpL P Chyg l (G
T)の制限部位および機能地図を示す模式図であり、
第12図は、プラスミドpBW32の制限部位および機
能地図を示し、その構築を示す工程図であり、 第13図は、プラスミドpLPchd1(GT)の制限
部位および機能地図を示す模式図であり、第14図は、
プラスミドphd(G T )の制限部位および機能地
図を示す模式図であり、 第15図は、プラスミドpLPCE 1A(GT)の制
限部位および機能地図を示す模式図であり、第16図は
、プラスミドpBLT(GT)の制限部位および機能地
図を示す模式図であり、第17図は、プラスミドpBL
Thyg1(GT)の制限部位および機能地図を示す模
式図であり、第18図は、プラスミドpBLTdhfr
1(GT)の制限部位および機能地図を示す模式図であ
り、第19図は、プラスミドpTPA603の制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第20図は、プラ
スミドphd(G T )T P Aの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、第21図は、プラスミド
phd(G T )M T P Aの制限部位および機
能地図を示す模式図であり、第22図は、プラスミドp
B al 8 cat(G T 6 )の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、第23図は、プラスミ
ドpsV2E1Aの制限部位および機能地図を示す模式
図であり、第24図は、プラスミドpT 6 hd(G
T )の制限部位および機能地図を示す模式図である
。
す模式図であり、 第2図は、プラスミドpBKneolの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第3図は、プラスミドpS V 2 catの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、 第4図は、プラスミドpL P (G T )catの
制限部位および機能地図を示す模式図であり、第5図は
、プラスミドpB L (G T )catの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第6図は、プラス
ミドpS B L (G T)catの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、第7図は、プラスミドp
L l 33の制限部位および機能地図を示し、その構
築を示す工程図であり、 第8図は、プラスミドpt、pc(cT)の制限部位お
よび機能地図を示す模式図であり、第9図は、プラスミ
ドpLPC4(GT)の制限部位および機能地図を示す
模式図であり、第10図は、プラスミドpSV2hyg
の制限部位および機能地図を示す模式図であり、 第11図は、プラスミドpL P Chyg l (G
T)の制限部位および機能地図を示す模式図であり、
第12図は、プラスミドpBW32の制限部位および機
能地図を示し、その構築を示す工程図であり、 第13図は、プラスミドpLPchd1(GT)の制限
部位および機能地図を示す模式図であり、第14図は、
プラスミドphd(G T )の制限部位および機能地
図を示す模式図であり、 第15図は、プラスミドpLPCE 1A(GT)の制
限部位および機能地図を示す模式図であり、第16図は
、プラスミドpBLT(GT)の制限部位および機能地
図を示す模式図であり、第17図は、プラスミドpBL
Thyg1(GT)の制限部位および機能地図を示す模
式図であり、第18図は、プラスミドpBLTdhfr
1(GT)の制限部位および機能地図を示す模式図であ
り、第19図は、プラスミドpTPA603の制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第20図は、プラ
スミドphd(G T )T P Aの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、第21図は、プラスミド
phd(G T )M T P Aの制限部位および機
能地図を示す模式図であり、第22図は、プラスミドp
B al 8 cat(G T 6 )の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、第23図は、プラスミ
ドpsV2E1Aの制限部位および機能地図を示す模式
図であり、第24図は、プラスミドpT 6 hd(G
T )の制限部位および機能地図を示す模式図である
。
これらの図面は本発明の理解を助けるためのものである
。図は記載したプラスミドをほぼ正確に縮尺して描いて
いる。明示されている制限部位以外の制限部位かプラス
ミドに存在していることもある。
。図は記載したプラスミドをほぼ正確に縮尺して描いて
いる。明示されている制限部位以外の制限部位かプラス
ミドに存在していることもある。
(以下、余白)
本発明は、真核性プロモーター、該プロモーターを刺激
するように設置されたポリーGT要素、および該プロモ
ーターから発現されるように設置された有用な物質をコ
ードしているDNA配列を含有する組換えDNAベクタ
ーで真核宿主細胞を形質転換し、該ベクター含有細胞を
該有用物質の発現に適した条件下で培養することにより
、真核宿主細胞において有用な物質を産生させる改良方
法であって、改良が (a)大きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物の発現
をコードしているDNA配列を細胞に付与し、そして (b)工程(a)の細胞を該即時型遺伝子産物の発現お
よび該ポ’J−GT要素活性の刺激に適した条件下で培
養すること、 からなる方法に関する。当業者なら、多数の樹立セルラ
インが大きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物を発現
すること、およびそのようなセルラインが本発明方法に
おいて特に有用であることを認識している。従って、本
発明は、真核性プロモーター、該プロモーターを刺激す
るように設置されたポリ−G T 5素、および該プロ
モーターから発現されるように設置された有用な物質を
コードしているDNA配列を含有する組換えDNAベク
ターで真核宿主細胞を形質転換し、該ベクター含有細胞
を該有用物質の発現に適し、た条件下で培養することに
より、真核宿主細胞において有用な物質を産生させる改
良方法であって、改良か(a)大きいDNAウィルスの
即時型遺伝子産物を発現する真核宿主細胞に該ベクター
を挿入し、そして (b)工程(a)の細胞を該即時型遺伝子産物の発現お
よび該ポリーGT要素活性の刺激に適した条件下で培養
すること、 からなる方法をも包含するものである。
するように設置されたポリーGT要素、および該プロモ
ーターから発現されるように設置された有用な物質をコ
ードしているDNA配列を含有する組換えDNAベクタ
ーで真核宿主細胞を形質転換し、該ベクター含有細胞を
該有用物質の発現に適した条件下で培養することにより
、真核宿主細胞において有用な物質を産生させる改良方
法であって、改良が (a)大きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物の発現
をコードしているDNA配列を細胞に付与し、そして (b)工程(a)の細胞を該即時型遺伝子産物の発現お
よび該ポ’J−GT要素活性の刺激に適した条件下で培
養すること、 からなる方法に関する。当業者なら、多数の樹立セルラ
インが大きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物を発現
すること、およびそのようなセルラインが本発明方法に
おいて特に有用であることを認識している。従って、本
発明は、真核性プロモーター、該プロモーターを刺激す
るように設置されたポリ−G T 5素、および該プロ
モーターから発現されるように設置された有用な物質を
コードしているDNA配列を含有する組換えDNAベク
ターで真核宿主細胞を形質転換し、該ベクター含有細胞
を該有用物質の発現に適し、た条件下で培養することに
より、真核宿主細胞において有用な物質を産生させる改
良方法であって、改良か(a)大きいDNAウィルスの
即時型遺伝子産物を発現する真核宿主細胞に該ベクター
を挿入し、そして (b)工程(a)の細胞を該即時型遺伝子産物の発現お
よび該ポリーGT要素活性の刺激に適した条件下で培養
すること、 からなる方法をも包含するものである。
本発明の重要な態様は、アデノウイルス−2後期プロモ
ーターとともにポリーGT要素を含有する新規な一群の
発現ベクターである。この本発明の発現ベクターは、他
のベクター中の、E1A遺伝子産物によるポリーGT要
素の活性化によって発現を増強するための適切な位置に
、有用な産物をコードしているDNA分子を容易に挿入
するか、または挿入しつるようにして構築した。さらに
、「カセット」が得られるようにポリーGT要素と真核
性プロモーターを組み立てた。このカセットは、発現ベ
クターから比較的小さい制限フラグメントとして単離す
ることができ、多種の発現ベクター間を容易に往復させ
ることができる。このカセットはポリ〜GT要素に加え
てエンハンサ−要素、例えばBKエンハンサ−などを含
んでいてもよい。
ーターとともにポリーGT要素を含有する新規な一群の
発現ベクターである。この本発明の発現ベクターは、他
のベクター中の、E1A遺伝子産物によるポリーGT要
素の活性化によって発現を増強するための適切な位置に
、有用な産物をコードしているDNA分子を容易に挿入
するか、または挿入しつるようにして構築した。さらに
、「カセット」が得られるようにポリーGT要素と真核
性プロモーターを組み立てた。このカセットは、発現ベ
クターから比較的小さい制限フラグメントとして単離す
ることができ、多種の発現ベクター間を容易に往復させ
ることができる。このカセットはポリ〜GT要素に加え
てエンハンサ−要素、例えばBKエンハンサ−などを含
んでいてもよい。
本明細書中に具体的に例示した発現ベクターは、本発明
方法においてE1A遺伝子産物の存在下で転写を行わせ
る、ポリGT−BKエンハンサーー真核性プロモーター
カセットにおいてアデノウイルス−2後期プロモーター
を利用している。
方法においてE1A遺伝子産物の存在下で転写を行わせ
る、ポリGT−BKエンハンサーー真核性プロモーター
カセットにおいてアデノウイルス−2後期プロモーター
を利用している。
ポリーGT要素の構築に用いる1本鎖のDNAフラグメ
ントは、DNAシンセサイザーを用いて化学的に合成し
た。多数のDNA合成装置が当分野で知られており、1
本鎖のフラグメントの合成に用いることができる。次い
で、この1本鎖フラグメントをアニーリングしてポリー
GT要素を得る。ポリーGT要素は(GT)n (C
A)nのDNA配列であり、これを本明細書ではnが2
1である配列として例示しているが、nが21よりも大
きいかまたは小さい長さの異なる配列をも指している。
ントは、DNAシンセサイザーを用いて化学的に合成し
た。多数のDNA合成装置が当分野で知られており、1
本鎖のフラグメントの合成に用いることができる。次い
で、この1本鎖フラグメントをアニーリングしてポリー
GT要素を得る。ポリーGT要素は(GT)n (C
A)nのDNA配列であり、これを本明細書ではnが2
1である配列として例示しているが、nが21よりも大
きいかまたは小さい長さの異なる配列をも指している。
このような配列を化学的に合成してもよいし、また、ヒ
トゲノムのDNAフラグメントであってもよい。原型(
プロトタイプ)のポリーGT要素の配列を実施例1に示
した。この示されているポリGT要素はBamHIおよ
びXbo1部位を有しており、従って種々の発現ベクタ
ーのBamHIまたはXho1部位に都合よく挿入する
ことができる。
トゲノムのDNAフラグメントであってもよい。原型(
プロトタイプ)のポリーGT要素の配列を実施例1に示
した。この示されているポリGT要素はBamHIおよ
びXbo1部位を有しており、従って種々の発現ベクタ
ーのBamHIまたはXho1部位に都合よく挿入する
ことができる。
合成のポリーGT要素が、このポリー〇T要素をあらゆ
る発現ベクター中に容易に挿入することが可能なように
するため、BamHIまたはXhoT以外の制限酵素認
識部位用の配列を含んでいてもよいことは当業者の認め
るところであろう。別法によれば、ポリーGT要素にお
いて利用可能な制限酵素認識部位とは関係なく、このポ
リーGT要素をあらゆる適当な発現ベクター中に平滑末
端ライゲート(連結)によって挿入することもできる。
る発現ベクター中に容易に挿入することが可能なように
するため、BamHIまたはXhoT以外の制限酵素認
識部位用の配列を含んでいてもよいことは当業者の認め
るところであろう。別法によれば、ポリーGT要素にお
いて利用可能な制限酵素認識部位とは関係なく、このポ
リーGT要素をあらゆる適当な発現ベクター中に平滑末
端ライゲート(連結)によって挿入することもできる。
BKウィルスは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(ATCCX^merican Type
Cu1ture Co11ection、 !230
1 Parklawn Drive、 Rockvil
le、 MD 20852)から取得番号ATCCVR
−837のもとでだれでも入手することができるし、購
入することもでき、実施例2記載のようにして、BKウ
ィルス配列の供給源、特にBKエンハンサ−の供給源と
して用いるために、容易かつ大量に単離することができ
る。また、BKウィルス性DNAをプラスミドクローニ
ングベクターにクローンするのに、およびこの組換えベ
クターをBKウィルス性DNA配列の供給源として用い
るのにも都合がよい。従って、BKウィルスゲノムをプ
ラスミドpdBPV−MMTneoの一部と合体させて
プラスミドpBKneolおよびpBKneo2を構築
した。
レクション(ATCCX^merican Type
Cu1ture Co11ection、 !230
1 Parklawn Drive、 Rockvil
le、 MD 20852)から取得番号ATCCVR
−837のもとでだれでも入手することができるし、購
入することもでき、実施例2記載のようにして、BKウ
ィルス配列の供給源、特にBKエンハンサ−の供給源と
して用いるために、容易かつ大量に単離することができ
る。また、BKウィルス性DNAをプラスミドクローニ
ングベクターにクローンするのに、およびこの組換えベ
クターをBKウィルス性DNA配列の供給源として用い
るのにも都合がよい。従って、BKウィルスゲノムをプ
ラスミドpdBPV−MMTneoの一部と合体させて
プラスミドpBKneolおよびpBKneo2を構築
した。
プラスミドpdB P V−MMTneo (大きさが
約15kbであり、ATCCから取得番号ATCC37
224のもとて入手可能)は、プラスミドpB R32
2由来のレプリコンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子、ネ
オマイシン耐性付与酵素をコードしている構造遺伝子を
発現させるように設置されているマウスメタロチオネイ
ンプロモーター、約8kbのウシ乳頭腫ウィルス(BP
V)DNAを含有している。プラスミドpd B P
V ・−M M T neoを制限酵素BamH1で消
化して2つのフラグメント、即ち、BPV DNAを
含有する〜8kbのフラグメントおよびその他の上記配
列を含有する〜7kbのフラグメントを得ることができ
る。BKウィルスはBamHI制限部位を1つだけ有し
ており、BamHIで直線化したBKウィルスDNAに
プラスミドpdB P V −MMT neoの〜7
kb B amHI制限フラグメントをライゲート(連
結)することによってプラスミドI)BKneolおよ
びpBKneo2を構築する。
約15kbであり、ATCCから取得番号ATCC37
224のもとて入手可能)は、プラスミドpB R32
2由来のレプリコンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子、ネ
オマイシン耐性付与酵素をコードしている構造遺伝子を
発現させるように設置されているマウスメタロチオネイ
ンプロモーター、約8kbのウシ乳頭腫ウィルス(BP
V)DNAを含有している。プラスミドpd B P
V ・−M M T neoを制限酵素BamH1で消
化して2つのフラグメント、即ち、BPV DNAを
含有する〜8kbのフラグメントおよびその他の上記配
列を含有する〜7kbのフラグメントを得ることができ
る。BKウィルスはBamHI制限部位を1つだけ有し
ており、BamHIで直線化したBKウィルスDNAに
プラスミドpdB P V −MMT neoの〜7
kb B amHI制限フラグメントをライゲート(連
結)することによってプラスミドI)BKneolおよ
びpBKneo2を構築する。
BKウィルスDNAの配向だけが異なっているプラスミ
ドpBKneolおよびpBKneo2の構築を実施例
2で説明し、プラスミドpBKneolの制限部位およ
び機能地図を添付の第2図に示す。
ドpBKneolおよびpBKneo2の構築を実施例
2で説明し、プラスミドpBKneolの制限部位およ
び機能地図を添付の第2図に示す。
プラスミドpBKneolおよびpBKneo2はエン
ハンサ−配列を含むBKウィルスの全ゲノムを含有して
いるので、BKエンハンサ−をも含有している本明細書
中に記載したポリーGT含有発現ベクターの有用な出発
物質となる。BKエンノ\ンサーを含有していない池の
発現ベクターも本発明において有用である。
ハンサ−配列を含むBKウィルスの全ゲノムを含有して
いるので、BKエンハンサ−をも含有している本明細書
中に記載したポリーGT含有発現ベクターの有用な出発
物質となる。BKエンノ\ンサーを含有していない池の
発現ベクターも本発明において有用である。
発現ベクターの1つであるプラスミドpBLcatは、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素
(CAT)を発現させるように設置されているヒトアデ
ノウィルス2型後Jtl17’ロモーターに直列してB
Kエンハンサ−配列を含有している。
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素
(CAT)を発現させるように設置されているヒトアデ
ノウィルス2型後Jtl17’ロモーターに直列してB
Kエンハンサ−配列を含有している。
プラスミドpS V 2catはCAT遺伝子の都合の
よい供給源として有用であり、ATCCから取得番号A
TCC37155のもとでだれでも入手することができ
る。プラスミドpS V 2 catの制限部位および
機能地図を添付の第3図に示す。ヒトアデノウィルス2
型DNAは市販品から得ることができるし、また、AT
CCから取得番号ATCCVR−2のもとて一般に入手
することもできる。
よい供給源として有用であり、ATCCから取得番号A
TCC37155のもとでだれでも入手することができ
る。プラスミドpS V 2 catの制限部位および
機能地図を添付の第3図に示す。ヒトアデノウィルス2
型DNAは市販品から得ることができるし、また、AT
CCから取得番号ATCCVR−2のもとて一般に入手
することもできる。
BKエンハンサ−を含有していない別の発現ベクターで
あるプラスミドpLPcatはクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼを発現させるように設置され
ているヒトアデノウィルス2型後期プロモーターを含有
している。ポリーGT要素をpLPcatおよびpBL
catの両プラスミドに挿入してプラスミドpL P
(G T )catおよびpBL(GT)catをそれ
ぞれ1111製した。
あるプラスミドpLPcatはクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼを発現させるように設置され
ているヒトアデノウィルス2型後期プロモーターを含有
している。ポリーGT要素をpLPcatおよびpBL
catの両プラスミドに挿入してプラスミドpL P
(G T )catおよびpBL(GT)catをそれ
ぞれ1111製した。
プラスミドpLPcatおよびpBLcatは次のよう
にして構築した。ヒトアゾンウィルス2型DNAの〜0
.32kb後期プロモーター含有Acc[Pvull制
限フラグメントを、平滑末端にしたBclIリンカ−(
Acc I −Pvull制限フラグメントのPvul
l末端にだけ結合する)にライゲートした。
にして構築した。ヒトアゾンウィルス2型DNAの〜0
.32kb後期プロモーター含有Acc[Pvull制
限フラグメントを、平滑末端にしたBclIリンカ−(
Acc I −Pvull制限フラグメントのPvul
l末端にだけ結合する)にライゲートした。
得られたフラグメントをプラスミドpsV2catの〜
4.51kb Acc[−3tul制限フラグメントに
ライゲートしてプラスミドpLPcatを得た。プラス
ミドpBLcatは、BKウィルスDNAの複製起源お
よびエンハンサ−含有の〜1.28kb Acc I−
Pvull制限フラグメントをプラスミドpLPcat
の〜4.8 ] kb Accl−8tul制限フラグ
メントにライゲートすることによって、プラスミドpL
Peatから構築した。ポリーGT要素は次のようにし
てプラスミドpLPcatおよびpBLcatに挿入し
た。Xholリンカ−を有するポリーGT要素を、Xh
ol消化のプラスミドpLPcatまたはpBLcat
にライゲートしてプラスミドpL P (G T )c
atおよびpB L (G T )catをそれぞれ創
製した。プラスミドpLPcatおよびpBLcatの
唯一のXho1部位は、BKエンハンサ−とアデノウィ
ルス後期プロモーターの間に位置している。プラスミド
pLPcat。
4.51kb Acc[−3tul制限フラグメントに
ライゲートしてプラスミドpLPcatを得た。プラス
ミドpBLcatは、BKウィルスDNAの複製起源お
よびエンハンサ−含有の〜1.28kb Acc I−
Pvull制限フラグメントをプラスミドpLPcat
の〜4.8 ] kb Accl−8tul制限フラグ
メントにライゲートすることによって、プラスミドpL
Peatから構築した。ポリーGT要素は次のようにし
てプラスミドpLPcatおよびpBLcatに挿入し
た。Xholリンカ−を有するポリーGT要素を、Xh
ol消化のプラスミドpLPcatまたはpBLcat
にライゲートしてプラスミドpL P (G T )c
atおよびpB L (G T )catをそれぞれ創
製した。プラスミドpLPcatおよびpBLcatの
唯一のXho1部位は、BKエンハンサ−とアデノウィ
ルス後期プロモーターの間に位置している。プラスミド
pLPcat。
pL P (G T )cat、 pB L cat、
およびpBL(GT)catの構築を実施例4および5
でさらに詳しく説明する。プラスミドpL P (G
T )catおよびpBL(GT )catの制限部位
および機能地図をそれぞれ添付の第4図および第5図に
示す。
およびpBL(GT)catの構築を実施例4および5
でさらに詳しく説明する。プラスミドpL P (G
T )catおよびpBL(GT )catの制限部位
および機能地図をそれぞれ添付の第4図および第5図に
示す。
プラスミドpBLcatはBKエンハンサー−アデノウ
ィルス後期プロモーター「カセット」の都合のよい供給
源である。このカセットは〜870bpのHindll
!制限フラグメントであり、これを好都合に真核性発現
ベクター中に押入してこのベクターがコードしている産
物の発現を増大させることができる。プラスミドpB
L (G T )catは、本発明のボIJGT−BK
エンハンサーーアデノウイルス後期プロモーターカセン
トの都合のよい供給源でアル。
ィルス後期プロモーター「カセット」の都合のよい供給
源である。このカセットは〜870bpのHindll
!制限フラグメントであり、これを好都合に真核性発現
ベクター中に押入してこのベクターがコードしている産
物の発現を増大させることができる。プラスミドpB
L (G T )catは、本発明のボIJGT−BK
エンハンサーーアデノウイルス後期プロモーターカセン
トの都合のよい供給源でアル。
このポリーGT@有カセットは〜930bpのHind
l11制限フラグメントであり、これを好都合に真核性
発現ベクター中に挿入して、大きいDNAウィルスの即
時型遺伝子産物、例えばE1A遺伝子産物の存在下に、
このベクターがコードしている有用な遺伝子産物の発現
をさらに増大させることができる。プラスミドpSBL
catおよびpsBf、(GT )catは上記のカセ
ットを用いて:A製することができる。プラスミドpS
B Lcatについては、プラスミドpS V 2c
atを制限酵素Hindlllで消化し、BKエンハン
サー−アテ゛ノウイルス?& 1017”ロモーターカ
セットを挿入することによって行われる。
l11制限フラグメントであり、これを好都合に真核性
発現ベクター中に挿入して、大きいDNAウィルスの即
時型遺伝子産物、例えばE1A遺伝子産物の存在下に、
このベクターがコードしている有用な遺伝子産物の発現
をさらに増大させることができる。プラスミドpSBL
catおよびpsBf、(GT )catは上記のカセ
ットを用いて:A製することができる。プラスミドpS
B Lcatについては、プラスミドpS V 2c
atを制限酵素Hindlllで消化し、BKエンハン
サー−アテ゛ノウイルス?& 1017”ロモーターカ
セットを挿入することによって行われる。
得られたプラスミド(プラスミドpS B Lcatと
命名)は、BKエンハンサ−と、さらにS V 40
?!2製起源、SV40初期プロモーター、およびS■
40エンハンサ−を含aしており、従ってこれらの付加
配列が削除されているプラスミドpBLcatとは異な
っている。直列の5V4Qエンハンサー−BKエンハン
サー−アデノウイルス主後期−j口モーター(S B
Lプロモーター)カセットをプラスミドpS B Lc
atからPvull制限酵素フラグメントとして切り出
すことができ、これをあらゆる組換えDNA発現ベクタ
ー中に都合よく挿入することができる。
命名)は、BKエンハンサ−と、さらにS V 40
?!2製起源、SV40初期プロモーター、およびS■
40エンハンサ−を含aしており、従ってこれらの付加
配列が削除されているプラスミドpBLcatとは異な
っている。直列の5V4Qエンハンサー−BKエンハン
サー−アデノウイルス主後期−j口モーター(S B
Lプロモーター)カセットをプラスミドpS B Lc
atからPvull制限酵素フラグメントとして切り出
すことができ、これをあらゆる組換えDNA発現ベクタ
ー中に都合よく挿入することができる。
プラスミドpS B Lcatは、E1A遺伝子産物が
存在しない限り、プラスミドpBLcatよりも高レベ
ルでCATを発現させる。このE1A遺伝子産物の存在
しないところでの発現の増大は、一方が5V4Q由来で
あり、他方がBK由来である2種類のエンハンサ−があ
る種のセルラインにおいて隣接プロモーターからの転写
に加酸的な増強作用を有していることを示すものである
。即ち、真核性プロモーターの上流の直列のエンハンサ
−配列を、多種多様の哺乳動物細胞における遺伝子の効
率的発現のために用いることができる。E1A遺伝子産
物の存在下では、プラスミドpBLcatの方がプラス
ミドpS B Lcatよりも高レベルでCATを発現
させるが、これはおそらくはS V、4 Qエンハンサ
−がE1A遺伝子産物によって阻害されるからであろう
。従って、E1A遺伝子産物の存在°下では、プラスミ
ドpS B L (G T )catと比較してpB
L (G T )catの方が高レベルのCATを発現
すると予想される。しかしこれとは反対に、HeLa細
胞においては、SV40エンハンサ−はアデノウィルス
2の後期プロモーターからの転写を顕著に刺激したが、
BKエンハンサ−はアゾンウィルス2後期プロモーター
からの転写を最低レベルで刺激したにすぎなかった。H
eLa細胞でのBK活性の基礎レベルは非常に低いので
、E1A遺伝子産物などの大きいDNAウィルスの即時
型遺伝子産物によるBK活性の刺激は最適の発現レベル
にまでは至らない。
存在しない限り、プラスミドpBLcatよりも高レベ
ルでCATを発現させる。このE1A遺伝子産物の存在
しないところでの発現の増大は、一方が5V4Q由来で
あり、他方がBK由来である2種類のエンハンサ−があ
る種のセルラインにおいて隣接プロモーターからの転写
に加酸的な増強作用を有していることを示すものである
。即ち、真核性プロモーターの上流の直列のエンハンサ
−配列を、多種多様の哺乳動物細胞における遺伝子の効
率的発現のために用いることができる。E1A遺伝子産
物の存在下では、プラスミドpBLcatの方がプラス
ミドpS B Lcatよりも高レベルでCATを発現
させるが、これはおそらくはS V、4 Qエンハンサ
−がE1A遺伝子産物によって阻害されるからであろう
。従って、E1A遺伝子産物の存在°下では、プラスミ
ドpS B L (G T )catと比較してpB
L (G T )catの方が高レベルのCATを発現
すると予想される。しかしこれとは反対に、HeLa細
胞においては、SV40エンハンサ−はアデノウィルス
2の後期プロモーターからの転写を顕著に刺激したが、
BKエンハンサ−はアゾンウィルス2後期プロモーター
からの転写を最低レベルで刺激したにすぎなかった。H
eLa細胞でのBK活性の基礎レベルは非常に低いので
、E1A遺伝子産物などの大きいDNAウィルスの即時
型遺伝子産物によるBK活性の刺激は最適の発現レベル
にまでは至らない。
ボ。リーGT要素をBKエンハンサ−とともに挿入して
もHeLa細胞においては発現の増大には何の効果もな
いと考えられる。HeLa細胞におけるこのBKエンハ
ンサ−の低レベルの活性は、BKエンハンサ−と相互作
用するHeLa細胞に存在するリプレッサー活性による
ものと考えられる。このHeLa細胞中のリプレッサー
活性を、さらに高いコピー数のBKエンハンサ−をH’
eLa細胞中に導入することによって滴定することがで
きる。事実、HeLaセルラインにおいては、E1Aが
リプレッサーのレベルを増加させることもある。しかり
、、HeLa細胞では直列の5V4Qエンハンサ−BK
エンハンサ−を用いて最適の発現レベルを得ることがで
きる。従って、この直列のエンハンサ−は、HeLa細
胞におけると同様、ある種の宿主細胞において遭遇する
こともある細胞特異的なネガティブな相互作用を避ける
のに都合がよい。
もHeLa細胞においては発現の増大には何の効果もな
いと考えられる。HeLa細胞におけるこのBKエンハ
ンサ−の低レベルの活性は、BKエンハンサ−と相互作
用するHeLa細胞に存在するリプレッサー活性による
ものと考えられる。このHeLa細胞中のリプレッサー
活性を、さらに高いコピー数のBKエンハンサ−をH’
eLa細胞中に導入することによって滴定することがで
きる。事実、HeLaセルラインにおいては、E1Aが
リプレッサーのレベルを増加させることもある。しかり
、、HeLa細胞では直列の5V4Qエンハンサ−BK
エンハンサ−を用いて最適の発現レベルを得ることがで
きる。従って、この直列のエンハンサ−は、HeLa細
胞におけると同様、ある種の宿主細胞において遭遇する
こともある細胞特異的なネガティブな相互作用を避ける
のに都合がよい。
プラスミドpS B L (G T )catの制限部
位および機能地図を添付の第6図に示し、プラスミドp
SBL catおよびpS B L (G T )ca
tの構築を実施例6で説明する。
位および機能地図を添付の第6図に示し、プラスミドp
SBL catおよびpS B L (G T )ca
tの構築を実施例6で説明する。
BKエンハンサー−アデノウィルス後期プロモーターカ
セットをヒトプロティンCの発現に用いた。ポリGT−
BKエンハンサーーアデノウイルス後期プロモーターカ
セットを本発明で用いてヒトプロティンCの発現を改善
した。上記カセットのどちらかをプラスミドpL133
(米国特許No、4゜775、624 ; 1988年
10月4日発行)中にライゲートすることによって発現
の増加を達成することができる。プラスミドpL 13
3の制限部位および機能地図を添付の第7図に示す。プ
ラスミドpL133(その構築については実施例7に示
す)を制限酵素Hindlllで消化し、プラスミドp
BLcatの〜087 kb H1ndlll制限フラ
グメントにライゲートしてプラスミドpLPCを得た。
セットをヒトプロティンCの発現に用いた。ポリGT−
BKエンハンサーーアデノウイルス後期プロモーターカ
セットを本発明で用いてヒトプロティンCの発現を改善
した。上記カセットのどちらかをプラスミドpL133
(米国特許No、4゜775、624 ; 1988年
10月4日発行)中にライゲートすることによって発現
の増加を達成することができる。プラスミドpL 13
3の制限部位および機能地図を添付の第7図に示す。プ
ラスミドpL133(その構築については実施例7に示
す)を制限酵素Hindlllで消化し、プラスミドp
BLcatの〜087 kb H1ndlll制限フラ
グメントにライゲートしてプラスミドpLPCを得た。
ポリーGT要素をプラスミドpLPCの唯一のXhor
部位に挿入してプラスミドpLPC(GT)を得た。プ
ラスミドpLPC(GT)の制限部位および機能地図を
添付の第8図に示し、プラスミドpLPCおよびpLP
C(GT)の構築を実施例8でさらに詳しく説明する。
部位に挿入してプラスミドpLPC(GT)を得た。プ
ラスミドpLPC(GT)の制限部位および機能地図を
添付の第8図に示し、プラスミドpLPCおよびpLP
C(GT)の構築を実施例8でさらに詳しく説明する。
別法では、pL 133をHi口dll+で消化し、次
にこれをpBL(GT)の〜0 、93 kb H1n
dlllフラグメントとライゲートすることによってプ
ラスミドpLPC(GT)を調製する。
にこれをpBL(GT)の〜0 、93 kb H1n
dlllフラグメントとライゲートすることによってプ
ラスミドpLPC(GT)を調製する。
プラスミドpLPC(GT)およびpLPCは、プラス
ミドpL 133と同様、SV40のエンハンサ−1初
期および後期プロモーター、T−抗原結合部位、および
複製起源を含有している。従って、あらゆる組換え宿主
細胞においてプラスミドpLPCまたはpLPC(GT
)およびこれらの誘導体を用いることは、本明細書に記
載した直列エンハンサ−発現法を例示するものである。
ミドpL 133と同様、SV40のエンハンサ−1初
期および後期プロモーター、T−抗原結合部位、および
複製起源を含有している。従って、あらゆる組換え宿主
細胞においてプラスミドpLPCまたはpLPC(GT
)およびこれらの誘導体を用いることは、本明細書に記
載した直列エンハンサ−発現法を例示するものである。
プラスミドpLPCまたはpLPC(GT)は、プラス
ミドpsBLおよびps B l、(GT)を含む本明
細書中で説明した多数のベクターの有用な出発物質とな
る。
ミドpsBLおよびps B l、(GT)を含む本明
細書中で説明した多数のベクターの有用な出発物質とな
る。
プラスミドpSBLおよびpS B L(GT)は、そ
れぞれプラスミドpLPCおよびpLPC(GT)上の
プロティンCをフードしているDNAを削除することに
よって構築することができる。この削除は、単に、Bc
llによる消化と自己ライゲートによってプラスミドp
LPCまたはpLPC(GT)の1個のBcll制限フ
ラグメントを削除することを必要とするにすぎない。得
られたプラスミドpSBLまたはpSBL(GT)は本
明細書中で説明した直列エンハンサ−法において用いる
のに都合のよい発現ベクターとして有用であるか、これ
は、所望の暗号配列を唯一残存している[3al1部位
に容易に挿入することができるからである。
れぞれプラスミドpLPCおよびpLPC(GT)上の
プロティンCをフードしているDNAを削除することに
よって構築することができる。この削除は、単に、Bc
llによる消化と自己ライゲートによってプラスミドp
LPCまたはpLPC(GT)の1個のBcll制限フ
ラグメントを削除することを必要とするにすぎない。得
られたプラスミドpSBLまたはpSBL(GT)は本
明細書中で説明した直列エンハンサ−法において用いる
のに都合のよい発現ベクターとして有用であるか、これ
は、所望の暗号配列を唯一残存している[3al1部位
に容易に挿入することができるからである。
プラスミドpLPCまたはpLPC(GT)に存在して
いる5V4Qの調節要素は互いに密接して位置しており
、正確に表すのは困難である。T−抗原のT−抗原結合
部位への結合(これは5V4Qの複製に必要である)は
、SV4 Q後期プロモーターからの転写を増強するこ
とが知られている。通常、SV40の複製起源を含有し
ているプラスミドの高レベルのT−抗原誘導の複製は宿
主f、III胞にとって致死性であるので、5V4Q
′F−抗原の存在下では、例えばプラスミドpLPCお
よびpL133はどちらも安定に保持されない。
いる5V4Qの調節要素は互いに密接して位置しており
、正確に表すのは困難である。T−抗原のT−抗原結合
部位への結合(これは5V4Qの複製に必要である)は
、SV4 Q後期プロモーターからの転写を増強するこ
とが知られている。通常、SV40の複製起源を含有し
ているプラスミドの高レベルのT−抗原誘導の複製は宿
主f、III胞にとって致死性であるので、5V4Q
′F−抗原の存在下では、例えばプラスミドpLPCお
よびpL133はどちらも安定に保持されない。
BK調節領域の全体の構造はSV40のものとかなり類
似しており、BKのエンハンサ−113J起源、初期お
よび後期プロモーター、並びにT抗原結合部位のBK類
似体についてはすべて密接して位置しており、それぞれ
の機能領域を曲のものから分離するのは容易ではない。
似しており、BKのエンハンサ−113J起源、初期お
よび後期プロモーター、並びにT抗原結合部位のBK類
似体についてはすべて密接して位置しており、それぞれ
の機能領域を曲のものから分離するのは容易ではない。
しかし、BKT−抗原の存在下で生育させたときには、
BKの複製起源およびT−抗原結合部位を含有している
プラスミドは、必ずしも致死となる量まて′FJ製する
ことがなく、エピソーム性要素として宿主細胞中で安定
に保持されうる。さらに、T−抗原誘導の複製を利用し
て、BK複製起源を含有するベクターのコピー数を増加
させることができ、これにより、選択圧がかけられたと
きにはさらに多くのプラスミドのコピーが宿主細胞の染
色体DNA中に組込まれるようにすることができる。B
KおよびSV40 T−抗原とそれらの各々の結合部位
の間の構造−機能の類似関係から明らかなように、BK
の複製も5V4Q T−抗原によって刺激される。形
質転換された真核細胞において安定に保持される要素と
して存在しうるプラスミドpLPCの誘導体を構築する
ため、完全なりKゲノムを、EcoRIで直線化した制
限フラグメントとしてプラスミドpLPCの単一のE
coRI 制限部位に挿入した。この挿入により2種類
のプラスミド(p 1.。
BKの複製起源およびT−抗原結合部位を含有している
プラスミドは、必ずしも致死となる量まて′FJ製する
ことがなく、エピソーム性要素として宿主細胞中で安定
に保持されうる。さらに、T−抗原誘導の複製を利用し
て、BK複製起源を含有するベクターのコピー数を増加
させることができ、これにより、選択圧がかけられたと
きにはさらに多くのプラスミドのコピーが宿主細胞の染
色体DNA中に組込まれるようにすることができる。B
KおよびSV40 T−抗原とそれらの各々の結合部位
の間の構造−機能の類似関係から明らかなように、BK
の複製も5V4Q T−抗原によって刺激される。形
質転換された真核細胞において安定に保持される要素と
して存在しうるプラスミドpLPCの誘導体を構築する
ため、完全なりKゲノムを、EcoRIで直線化した制
限フラグメントとしてプラスミドpLPCの単一のE
coRI 制限部位に挿入した。この挿入により2種類
のプラスミド(p 1.。
PC4およびpLPC5と命名)が得られたが、これら
はI3にのEcoR1フラグメントの配向が異なってい
るだけである。プラスミドpLPC4およびpLPC5
の構築を実施例9Aでさらに詳しく説明する。実施例9
B記載のようにしてポリーGT要素をプラスミドpLP
C4またはpLPC5の唯一のXho1部位に挿入して
、それぞれプラスミドpLPC4(GT)およびpLP
C5(GT)を創製した。プラスミドpLPC4(GT
)の制限部位および機能地図を添付の第9図に示す。
はI3にのEcoR1フラグメントの配向が異なってい
るだけである。プラスミドpLPC4およびpLPC5
の構築を実施例9Aでさらに詳しく説明する。実施例9
B記載のようにしてポリーGT要素をプラスミドpLP
C4またはpLPC5の唯一のXho1部位に挿入して
、それぞれプラスミドpLPC4(GT)およびpLP
C5(GT)を創製した。プラスミドpLPC4(GT
)の制限部位および機能地図を添付の第9図に示す。
組換えDNA発現ベクターのエビソーム性の保持は、宿
主細胞染色体への組込みより常に好ましいとは限らない
。しかし、真16 In胞において機能する選択マーカ
ーが存在しないことから、プラスミドpLPCまたはp
LPC(GT)が選択マーカーを含有する別のプラスミ
ドと同時形質転換されるのでなければ、プラスミドpL
PCまたはpLPC(GT)の安定な真核性形質転換体
を同定するのは困難である。従って、プラスミドpl、
PCまたはプラスミドpL))C(GT)を修飾して真
核宿主1111胞中で選択されうる誘導体プラスミドを
IJだ。
主細胞染色体への組込みより常に好ましいとは限らない
。しかし、真16 In胞において機能する選択マーカ
ーが存在しないことから、プラスミドpLPCまたはp
LPC(GT)が選択マーカーを含有する別のプラスミ
ドと同時形質転換されるのでなければ、プラスミドpL
PCまたはpLPC(GT)の安定な真核性形質転換体
を同定するのは困難である。従って、プラスミドpl、
PCまたはプラスミドpL))C(GT)を修飾して真
核宿主1111胞中で選択されうる誘導体プラスミドを
IJだ。
プラスミドpt、pcの場合は、このプラスミドをプラ
スミドpSV2hygの一部とライゲートすることによ
って行った。プラスミドpSV2hygはハイグロマイ
シン耐性付与遺伝子を含有するプラスミドである。プラ
スミドpSV2hygは、ノーザン・リージョナル・リ
サーチ・ラボラトリ−(NRRL) (Norther
n Regional Re5earch Labol
atory。
スミドpSV2hygの一部とライゲートすることによ
って行った。プラスミドpSV2hygはハイグロマイ
シン耐性付与遺伝子を含有するプラスミドである。プラ
スミドpSV2hygは、ノーザン・リージョナル・リ
サーチ・ラボラトリ−(NRRL) (Norther
n Regional Re5earch Labol
atory。
Peoria、 IL 61640)から取得番号NR
RL B−18039(1986年2月11日寄託)の
もとで入手することができ、その制限部位および機能地
図を添付の第10図に示した。プラスミドpSV2hy
gを制限酵素BamHIで消化し、完全なハイグロマイ
シン耐性付与遺伝子を含有している〜2.5kbBam
HI制限フラグメントを単離し、フレノウ酵素(大腸菌
DNAポリメラーゼIのスブチリシン切断によって生成
する大きいフラグメント)で処理し、次にフレノウ処理
したプラスミドpLPCの〜5゜82kb Ndel−
3tuI制限フラグメントにライゲートしてプラスミド
pLPchyglおよびpLPChyg 2を得た。プ
ラスミドpLPchyglとpLPChyg2は、ハイ
グロマイシン耐性付与フラグメントの配向だけが異なっ
ている。プラスミドpLp c hyg 1とpLPC
hyg2の構築プロトコールを実施例10Aに記載する
。実施例10B記載のようにして、ポリーGT要素をプ
ラスミドρLPChyglおよびpLPChyg2(7
)唯一17) X ho r部位に挿入して、それぞれ
プラスミドpLPchyg1(GT)およびpLPCh
yg2(GT)を創製した。プラスミドpLPChyg
1(GT)の制限部位および機能地図を添付の第11図
に示す。
RL B−18039(1986年2月11日寄託)の
もとで入手することができ、その制限部位および機能地
図を添付の第10図に示した。プラスミドpSV2hy
gを制限酵素BamHIで消化し、完全なハイグロマイ
シン耐性付与遺伝子を含有している〜2.5kbBam
HI制限フラグメントを単離し、フレノウ酵素(大腸菌
DNAポリメラーゼIのスブチリシン切断によって生成
する大きいフラグメント)で処理し、次にフレノウ処理
したプラスミドpLPCの〜5゜82kb Ndel−
3tuI制限フラグメントにライゲートしてプラスミド
pLPchyglおよびpLPChyg 2を得た。プ
ラスミドpLPchyglとpLPChyg2は、ハイ
グロマイシン耐性付与フラグメントの配向だけが異なっ
ている。プラスミドpLp c hyg 1とpLPC
hyg2の構築プロトコールを実施例10Aに記載する
。実施例10B記載のようにして、ポリーGT要素をプ
ラスミドρLPChyglおよびpLPChyg2(7
)唯一17) X ho r部位に挿入して、それぞれ
プラスミドpLPchyg1(GT)およびpLPCh
yg2(GT)を創製した。プラスミドpLPChyg
1(GT)の制限部位および機能地図を添付の第11図
に示す。
プラスミドpBW32のdhfr遺伝子含有のフレノウ
処理した〜1.9kb BamHr制限フラグメントを
、プラスミドpt、pcの〜5.82kb NdelS
Lul制限フラグメントに挿入することによって、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を含有するプラス
ミドpLPchyglおよびpLPChyg2に類似す
るヒトプロティンC発現プラスミドを構築した。得られ
たプラスミド(pL P Cdhfr lとpLPCd
hfr2と命名)は、dhrr遺伝子の配向だけが異な
っている。ポリーGT要素をプラスミドpLPCdhf
rlおよびpL P Cdhfr2のXho1部位に挿
入してそれぞれプラスミドpL P Cdhfr l
(G T)およびpL P Cdhfr2 (GT)を
創製した。これらプラスミドの構築を実施例12で説明
する。プラスミドpLPchYglをさらに修飾してジ
ヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を導入した。こ
のdhfr遺伝子はdh4r−ネガティブ細胞の選択マ
ーカーであり、これを用い、宿主細胞を量が増加するメ
トトレキセートに暴露することによってDNAセグメン
トのコピー数を増加させることができる。dhfr遺伝
子は、例えばプラスミドpBW32から得ることができ
る(このプラスミドは、日本特許出願No、 2012
25/8B、1987年3月3日公開N o、 483
78/87に開示されている)。この遺伝子の他の供給
源は当業者には明らかであろう(例えば、ATCC37
146、プラスミドpS V 2−dhfr)。プラス
ミドpBW32の制限部位および機能地図を添付の第1
2図に示す。プラスミドpBW32の構築プロトコール
を実施例11で説明する。
処理した〜1.9kb BamHr制限フラグメントを
、プラスミドpt、pcの〜5.82kb NdelS
Lul制限フラグメントに挿入することによって、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を含有するプラス
ミドpLPchyglおよびpLPChyg2に類似す
るヒトプロティンC発現プラスミドを構築した。得られ
たプラスミド(pL P Cdhfr lとpLPCd
hfr2と命名)は、dhrr遺伝子の配向だけが異な
っている。ポリーGT要素をプラスミドpLPCdhf
rlおよびpL P Cdhfr2のXho1部位に挿
入してそれぞれプラスミドpL P Cdhfr l
(G T)およびpL P Cdhfr2 (GT)を
創製した。これらプラスミドの構築を実施例12で説明
する。プラスミドpLPchYglをさらに修飾してジ
ヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を導入した。こ
のdhfr遺伝子はdh4r−ネガティブ細胞の選択マ
ーカーであり、これを用い、宿主細胞を量が増加するメ
トトレキセートに暴露することによってDNAセグメン
トのコピー数を増加させることができる。dhfr遺伝
子は、例えばプラスミドpBW32から得ることができ
る(このプラスミドは、日本特許出願No、 2012
25/8B、1987年3月3日公開N o、 483
78/87に開示されている)。この遺伝子の他の供給
源は当業者には明らかであろう(例えば、ATCC37
146、プラスミドpS V 2−dhfr)。プラス
ミドpBW32の制限部位および機能地図を添付の第1
2図に示す。プラスミドpBW32の構築プロトコール
を実施例11で説明する。
プラスミドpBW32のdhfr遺伝子含有の〜19
kb B amHI制限フラグメントを単離し、フレノ
ウ酵素で処理し、そして部分的にEcoRI消化したプ
ラスミドpLPchyglに挿入してプラスミドpLP
chdlおよびpLPChd2を得た。プラスミドpL
Pchyglは、2つのEcoRI制限酵素認識部位を
含んでいる:即ち、その1つはハイグロマイシン耐性付
与遺伝子の中に、他の1つはプラスミドpBR322由
来の配列の中にある。dhfr遺伝子を含有するフラグ
メントを、プラスミドpLPchyglのpB R32
2由来配列中に位置しているEcoR1部位に挿入して
プラスミドpLPChdlおよびpLPChd2を得た
。プラスミドpt。
kb B amHI制限フラグメントを単離し、フレノ
ウ酵素で処理し、そして部分的にEcoRI消化したプ
ラスミドpLPchyglに挿入してプラスミドpLP
chdlおよびpLPChd2を得た。プラスミドpL
Pchyglは、2つのEcoRI制限酵素認識部位を
含んでいる:即ち、その1つはハイグロマイシン耐性付
与遺伝子の中に、他の1つはプラスミドpBR322由
来の配列の中にある。dhfr遺伝子を含有するフラグ
メントを、プラスミドpLPchyglのpB R32
2由来配列中に位置しているEcoR1部位に挿入して
プラスミドpLPChdlおよびpLPChd2を得た
。プラスミドpt。
P Chd lとpLPChd2はdhrr遺伝子含有
DNAセグメントの配向たけが異なっており、これらプ
ラスミドの構築を実施例12Aで説明する。実施例12
B記載のようにして、ポリーGT要素をプラスミドpL
PchdlおよびpLPChd2の唯一のXho1部位
に挿入して、それぞれプラスミドpLPChd1(GT
)およびpLPChd2(GT)を創製した。プラスミ
ドpL、PChd1(GT)の制限部位および機能地図
を添付の第13図に示す。
DNAセグメントの配向たけが異なっており、これらプ
ラスミドの構築を実施例12Aで説明する。実施例12
B記載のようにして、ポリーGT要素をプラスミドpL
PchdlおよびpLPChd2の唯一のXho1部位
に挿入して、それぞれプラスミドpLPChd1(GT
)およびpLPChd2(GT)を創製した。プラスミ
ドpL、PChd1(GT)の制限部位および機能地図
を添付の第13図に示す。
プラスミドpLPchdlを修飾して、BKエンハンサ
ーーアデノウイルス後後期プロモーター上セント並びに
ハイグロマイシン耐性付与遺伝子およびdhfr遺伝子
の両方を含有するプラスミドphaを得た。プラスミド
phdを構築するため、プラスミドpLPchdlをd
am−大腸菌(E、coli)宿主細胞から調製し、制
限酵素Bclrで消化し、再環化し、こうしてヒトプロ
ティンCをコードしているDNAを削除した。プラスミ
ドphdは1個のBclI制限酵素認識部位を含んでお
り、この部位は本明細書に記載したBKエン/%ンサー
−アデノウィルス後期プロモーターから発現させようと
するあらゆる配列の挿入に都合よく配置されている。プ
ラスミドI)hdの構築プロトコールを実施例13Aで
説明する。プラスミドphdは大腸菌G M 48 (
dam\daI11−)に導入し、ノーザン・リージョ
ナル・リサーチ・ラボラトリ−(NRRL)に寄託され
ている(1989年7月26日)。この形質転換宿主細
胞は取得番号NRRL B−18525のもとて入手
可能である。当業者には既知の常法によりこの宿主から
プラスミドを単離することができる。実施例13Bでさ
らに詳しく説明するように、ポリーGT要素をプラスミ
ドphdのXho1部位に挿入してプラスミドphd(
G T )を得た。プラスミドphd(G T )の唯
一のBa1l制限酵素認識部位は、本発明のBKエンハ
ンサー−ボリGT−アデノウィルス後期プロモーターか
ら発現させようとするあらゆる配列の挿入に都合よく設
置されている。プラスミドphd(GT)の制限部位お
よび機能地図を添付の第14図に示す。
ーーアデノウイルス後後期プロモーター上セント並びに
ハイグロマイシン耐性付与遺伝子およびdhfr遺伝子
の両方を含有するプラスミドphaを得た。プラスミド
phdを構築するため、プラスミドpLPchdlをd
am−大腸菌(E、coli)宿主細胞から調製し、制
限酵素Bclrで消化し、再環化し、こうしてヒトプロ
ティンCをコードしているDNAを削除した。プラスミ
ドphdは1個のBclI制限酵素認識部位を含んでお
り、この部位は本明細書に記載したBKエン/%ンサー
−アデノウィルス後期プロモーターから発現させようと
するあらゆる配列の挿入に都合よく配置されている。プ
ラスミドI)hdの構築プロトコールを実施例13Aで
説明する。プラスミドphdは大腸菌G M 48 (
dam\daI11−)に導入し、ノーザン・リージョ
ナル・リサーチ・ラボラトリ−(NRRL)に寄託され
ている(1989年7月26日)。この形質転換宿主細
胞は取得番号NRRL B−18525のもとて入手
可能である。当業者には既知の常法によりこの宿主から
プラスミドを単離することができる。実施例13Bでさ
らに詳しく説明するように、ポリーGT要素をプラスミ
ドphdのXho1部位に挿入してプラスミドphd(
G T )を得た。プラスミドphd(G T )の唯
一のBa1l制限酵素認識部位は、本発明のBKエンハ
ンサー−ボリGT−アデノウィルス後期プロモーターか
ら発現させようとするあらゆる配列の挿入に都合よく設
置されている。プラスミドphd(GT)の制限部位お
よび機能地図を添付の第14図に示す。
ヒトプロティンCを発現させる他の発現ベクターはプラ
スミドpLPcE1AおよびpLPcE1A(GT)で
ある。プラスミドpLPcElΔおよびpLPcE1A
(GT)は、ヒトアデノウィルス2型のE1A遺伝子を
含有しており、この遺伝子の産物は、前記のように、B
Kエンハンサ−の活性を増強し、そして本明細書で説明
したように、ポリーGT要素のエンハンサ−活性を活性
化する。
スミドpLPcE1AおよびpLPcE1A(GT)で
ある。プラスミドpLPcElΔおよびpLPcE1A
(GT)は、ヒトアデノウィルス2型のE1A遺伝子を
含有しており、この遺伝子の産物は、前記のように、B
Kエンハンサ−の活性を増強し、そして本明細書で説明
したように、ポリーGT要素のエンハンサ−活性を活性
化する。
即ち、BKエンハンサ−およびポリ−GTと直列のプロ
モーターからの転写はE1A遺伝子産物の存在下で増大
する。プラスミドpLPcE1Aは、ヒトアデノウィル
ス2型DNAのE I A遺伝子a有の〜1.8kbB
all制限フラグメントを、プラスミドpLPCの〜5
.82kb Ndel−Stul制限フラグメントとラ
イゲートすることによって構築した。プラスミドpLP
cE1Aの構築プロトコールを実施例14Aで説明する
。実施例14Bでさらに説明するように、ポリーGT要
素をプラスミドpLPcE1Aの唯一のXho1部位に
挿入してプラスミドpLPCE 1A(GT)を得た。
モーターからの転写はE1A遺伝子産物の存在下で増大
する。プラスミドpLPcE1Aは、ヒトアデノウィル
ス2型DNAのE I A遺伝子a有の〜1.8kbB
all制限フラグメントを、プラスミドpLPCの〜5
.82kb Ndel−Stul制限フラグメントとラ
イゲートすることによって構築した。プラスミドpLP
cE1Aの構築プロトコールを実施例14Aで説明する
。実施例14Bでさらに説明するように、ポリーGT要
素をプラスミドpLPcE1Aの唯一のXho1部位に
挿入してプラスミドpLPCE 1A(GT)を得た。
プラスミドpLPCE 1A(GT)の制限部位および
機能地図を添付の第15図に示す。
機能地図を添付の第15図に示す。
本発明の多種の発現ベクターはポリGT−BKエンハン
サーーアデノウイルス後期フロモーターカセントまたは
BKエンハンサー−アデノウィルス後期プロモーターカ
セットを利用して組織プラスミノーゲン活性化因子(’
T’PA)または修飾TPA(MTPA)を発現させる
。TPAまたはMTPAのベクターを構築するため、プ
ラスミドpBW32(第12図)を制限酵素BamHI
で消化し、得られた〜5.6kbのフラグメントを再環
化してプラスミドpBW32delを得た。修飾型T
)) Aをコードし、Hindlll制限部位を1つた
け含んでいるプラスミドpB W 32 delをHi
ndlllで消化し、次いでプラスミドpBal3ca
tの〜0.65kbのHindII+制限フラグメント
にライゲートしてプラスミドpBLTを得た。プラスミ
ドpBal8catは、改良型のBKエンハンサーーア
デノウイルス後期プロモーターカセットを含有しており
、これを実施例18で説明する。ポリー〇T要素をプラ
スミドpBLTの唯一のBam81部位に挿入してプラ
スミドpBLT(GT)を得た。プラスミドpBLT(
GT)の制限部位および機能地図を添付の第16図に示
し、プラスミドpBL′rおよびpBLT(GT)の構
築プロトフールを実施例15で説明する。
サーーアデノウイルス後期フロモーターカセントまたは
BKエンハンサー−アデノウィルス後期プロモーターカ
セットを利用して組織プラスミノーゲン活性化因子(’
T’PA)または修飾TPA(MTPA)を発現させる
。TPAまたはMTPAのベクターを構築するため、プ
ラスミドpBW32(第12図)を制限酵素BamHI
で消化し、得られた〜5.6kbのフラグメントを再環
化してプラスミドpBW32delを得た。修飾型T
)) Aをコードし、Hindlll制限部位を1つた
け含んでいるプラスミドpB W 32 delをHi
ndlllで消化し、次いでプラスミドpBal3ca
tの〜0.65kbのHindII+制限フラグメント
にライゲートしてプラスミドpBLTを得た。プラスミ
ドpBal8catは、改良型のBKエンハンサーーア
デノウイルス後期プロモーターカセットを含有しており
、これを実施例18で説明する。ポリー〇T要素をプラ
スミドpBLTの唯一のBam81部位に挿入してプラ
スミドpBLT(GT)を得た。プラスミドpBLT(
GT)の制限部位および機能地図を添付の第16図に示
し、プラスミドpBL′rおよびpBLT(GT)の構
築プロトフールを実施例15で説明する。
選択マーカーをBamf(I消化のプラスミドpBLT
またはpB L T (G ”[”)に導入してもよい
。例えばプラスミドpBLTを用いて、ある溝築におい
ては、プラスミドpS V 2 hygのハイグロマイ
シン耐性遺伝子含有の〜2.5kb Bam)T I制
限フラグメントを挿入してプラスミドpB L Thy
g 1およびpBLThyg2を得、別の溝築において
は、プラスミドpBW32のdhfr遺伝子含有の〜1
.9kbBamHI制限フラグメントを挿入してプラス
ミドpB +−Tdhfr lおよびpBLTdMr2
を得た。この4種類のプラスミドpBLThygl、p
BLThyg2、pB L Tdhrr l 、および
pB L、 Tdhfr2は、選択マーカーの種類およ
び/または配向が異なっているだけである。プラスミド
pBLThygl pBLThyg 2、pB L r
ahrr lおよびpB L Tdhfr2、並びにこ
れらのポリーGT含有誘導体であるpBLThyg1(
GT)、pBLThyg2(GT)、pB L Tdh
fr1(GT)およびpB L Tdhfr2 (G
T)の構築プロトコールを実施例16に示す。プラスミ
ドpBLThyg1(GT)およびpBLTdhrr1
(GT)の制限部位および機能地図をそれぞれ添付の第
17図および第18図に示す。
またはpB L T (G ”[”)に導入してもよい
。例えばプラスミドpBLTを用いて、ある溝築におい
ては、プラスミドpS V 2 hygのハイグロマイ
シン耐性遺伝子含有の〜2.5kb Bam)T I制
限フラグメントを挿入してプラスミドpB L Thy
g 1およびpBLThyg2を得、別の溝築において
は、プラスミドpBW32のdhfr遺伝子含有の〜1
.9kbBamHI制限フラグメントを挿入してプラス
ミドpB +−Tdhfr lおよびpBLTdMr2
を得た。この4種類のプラスミドpBLThygl、p
BLThyg2、pB L Tdhrr l 、および
pB L、 Tdhfr2は、選択マーカーの種類およ
び/または配向が異なっているだけである。プラスミド
pBLThygl pBLThyg 2、pB L r
ahrr lおよびpB L Tdhfr2、並びにこ
れらのポリーGT含有誘導体であるpBLThyg1(
GT)、pBLThyg2(GT)、pB L Tdh
fr1(GT)およびpB L Tdhfr2 (G
T)の構築プロトコールを実施例16に示す。プラスミ
ドpBLThyg1(GT)およびpBLTdhrr1
(GT)の制限部位および機能地図をそれぞれ添付の第
17図および第18図に示す。
TPAまたは修飾TPAを発現させる本明細書記載の他
の発現ベクターは、プラスミドpBW32の構築におい
て用いる中間体のプラスミドpTPΔ103から誘導し
た。プラスミドpTPA103の構築プロトフールを実
施例11で説明し、プラスミドpTPA103の制限部
位および機能地図を添付の第19図に示す。これらの誘
導体を構築するため、プラスミドpTPAI03のTP
A暗号領域の5′末端の直前にBam)[1制限部位を
導入した。プラスミドpTPA103を制限酵素II
ga Tで消化して、TPA暗号領域の5゛末端を含有
する〜0.52kbHgal制限フラグメントを単離し
た。フレノウで処理した後、このHga[をBamH[
リンカ−にライゲートし、制限酵素BamHIで消化し
、BamHI消化したプラスミドpB R322に挿入
してプラスミドp′rPA601およσpTPA602
を得た。
の発現ベクターは、プラスミドpBW32の構築におい
て用いる中間体のプラスミドpTPΔ103から誘導し
た。プラスミドpTPA103の構築プロトフールを実
施例11で説明し、プラスミドpTPA103の制限部
位および機能地図を添付の第19図に示す。これらの誘
導体を構築するため、プラスミドpTPAI03のTP
A暗号領域の5′末端の直前にBam)[1制限部位を
導入した。プラスミドpTPA103を制限酵素II
ga Tで消化して、TPA暗号領域の5゛末端を含有
する〜0.52kbHgal制限フラグメントを単離し
た。フレノウで処理した後、このHga[をBamH[
リンカ−にライゲートし、制限酵素BamHIで消化し
、BamHI消化したプラスミドpB R322に挿入
してプラスミドp′rPA601およσpTPA602
を得た。
次いで、プラスミドpTP A 602を制限酵素Bg
l11およびSal[で消化し、得られた〜4.2kb
のBglll −S al I制限フラグメントをプラ
スミドpTPA103の〜2.05kb 5ail
−Bgll!制限フラグメントにライゲートしてプラス
ミドpTPA603を得た。従って、プラスミドpTP
A603は、両末端をBamH1制限部位で囲まれたT
PAの完全な暗号配列を含有している。プラスミドpT
PA603の制限部位および機能地図を添付の第19図
に示す。プラスミドpTP A 603に類似している
が、修飾型のTPAをコードしているプラスミドを構築
するため、プラスミドpTP A 603を制限酵素B
gl11および5stlで消化し、得られた〜5.02
kbのBglll −S st 1フラグメントをプラ
スミドpBLTの〜0.69kbBglll −S s
t I制限フラグメントにライゲートした。次いで、得
られたプラスミド(pMTPA603と命名)を制限酵
素BamHIで消化し、得られた〜1.35kbのフラ
グメントを単離した。このフラグメントおよびプラスミ
ドpTP A 603の〜1.90 kb BamHI
制限フラグメントを、別のライゲート反応でBcl[消
化のプラスミドphd (第14図)に個々にライゲー
トして、それぞれプラスミドphdMT P Aおよび
phdT P Aを得た。プラスミドpha”r P
AおよびphdMT P A、並びにこれらのポリーG
T含有誘導体phdTPA(GT)およびphdMTP
A(GT)の構築を、プラスミドpTPA602の構築
プロトコールから始め、これを実施例17で説明する。
l11およびSal[で消化し、得られた〜4.2kb
のBglll −S al I制限フラグメントをプラ
スミドpTPA103の〜2.05kb 5ail
−Bgll!制限フラグメントにライゲートしてプラス
ミドpTPA603を得た。従って、プラスミドpTP
A603は、両末端をBamH1制限部位で囲まれたT
PAの完全な暗号配列を含有している。プラスミドpT
PA603の制限部位および機能地図を添付の第19図
に示す。プラスミドpTP A 603に類似している
が、修飾型のTPAをコードしているプラスミドを構築
するため、プラスミドpTP A 603を制限酵素B
gl11および5stlで消化し、得られた〜5.02
kbのBglll −S st 1フラグメントをプラ
スミドpBLTの〜0.69kbBglll −S s
t I制限フラグメントにライゲートした。次いで、得
られたプラスミド(pMTPA603と命名)を制限酵
素BamHIで消化し、得られた〜1.35kbのフラ
グメントを単離した。このフラグメントおよびプラスミ
ドpTP A 603の〜1.90 kb BamHI
制限フラグメントを、別のライゲート反応でBcl[消
化のプラスミドphd (第14図)に個々にライゲー
トして、それぞれプラスミドphdMT P Aおよび
phdT P Aを得た。プラスミドpha”r P
AおよびphdMT P A、並びにこれらのポリーG
T含有誘導体phdTPA(GT)およびphdMTP
A(GT)の構築を、プラスミドpTPA602の構築
プロトコールから始め、これを実施例17で説明する。
プラスミドphd(G T )T P Aおよびphd
(G T )MT P Aの制限部位および機能地図を
それぞれ添付の第20図および第21図に示す。
(G T )MT P Aの制限部位および機能地図を
それぞれ添付の第20図および第21図に示す。
本発明は、真核性プロモーターと直列でBKエンハンサ
−とともにポリーGT要素を用いて、大きいDNAウィ
ルスの即時型遺伝子を発現する真核宿主細胞においてD
NA配列を転写および発現させる方法を包含するもので
ある。当業者なら、本方法において実質的にあらゆる真
核性プロモーターをポリーGT要素およびBKエンハン
サ−と直列して用いることができることを認めるであろ
う。例えば、SV40初期および後期プロモータ、BK
初期および後期プロモーター、あらゆるポリオーマウィ
ルスまたはパボバウイルスの初期および後期プロモータ
ー ヘルペスウィルス族のプロモーター、インターフェ
ロンα1プロモータ−、マウスメタロチオネインプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーター、β−グロビン
プロモーター、アデノウィルスのプロモーター、ポック
スウィルスのプロモーター、ウニH2Aプロモーター、
コンアルブミンプロモーター、卵アルブミンプロモータ
ー、マウスβ−グロビンプロモーター、およびヒトβ−
グロビンプロモーターはすべて本発明方法における真核
性プロモーターとして有用である。さらに、転写を開始
させるのに用いることができるあらゆる配列、例えば上
流の「CCΔATI配列を含むかまたは含まないrTA
TΔ」様の配列からなる転写開始部位を含有する配列が
本発明におけるプロモーターとして有用である。
−とともにポリーGT要素を用いて、大きいDNAウィ
ルスの即時型遺伝子を発現する真核宿主細胞においてD
NA配列を転写および発現させる方法を包含するもので
ある。当業者なら、本方法において実質的にあらゆる真
核性プロモーターをポリーGT要素およびBKエンハン
サ−と直列して用いることができることを認めるであろ
う。例えば、SV40初期および後期プロモータ、BK
初期および後期プロモーター、あらゆるポリオーマウィ
ルスまたはパボバウイルスの初期および後期プロモータ
ー ヘルペスウィルス族のプロモーター、インターフェ
ロンα1プロモータ−、マウスメタロチオネインプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーター、β−グロビン
プロモーター、アデノウィルスのプロモーター、ポック
スウィルスのプロモーター、ウニH2Aプロモーター、
コンアルブミンプロモーター、卵アルブミンプロモータ
ー、マウスβ−グロビンプロモーター、およびヒトβ−
グロビンプロモーターはすべて本発明方法における真核
性プロモーターとして有用である。さらに、転写を開始
させるのに用いることができるあらゆる配列、例えば上
流の「CCΔATI配列を含むかまたは含まないrTA
TΔ」様の配列からなる転写開始部位を含有する配列が
本発明におけるプロモーターとして有用である。
このようなプロモーターを、本方法において用いるに好
ましい真核性プロモーターであるアデノウイルス−2後
期プロモーターを用いて本明細書中に例示したような、
BKエンハンサ−とともにボ1)−GT要素を含有する
発現ベクター中に、常法により挿入することによってこ
れらのプロモーターを本発明方法において用いることが
できる。
ましい真核性プロモーターであるアデノウイルス−2後
期プロモーターを用いて本明細書中に例示したような、
BKエンハンサ−とともにボ1)−GT要素を含有する
発現ベクター中に、常法により挿入することによってこ
れらのプロモーターを本発明方法において用いることが
できる。
本明細書に記載したベクターで用いるBKエンハンサ−
は原型株のBKウィルス(ATCCVR837)から単
離した。しかし、多数のBKウィルス変異体が単離され
、開示されている。ガードナーら[Gardner e
t at、、 1971. Lancet l : 1
253; Gardner、 1973. Br1t、
Med、J、 I : 77−78]はBKウィルス
の最初の単離を報告し、従ってガードナー味が原型の、
または野生型のBKウィルスと呼ばれている。BKウィ
ルスのガードナー味(第1図)はATCCから取得番号
ATCCVR−837のもとて人手できる。実際のとこ
ろ、本明細書に記載されたベクターの構築に使用するた
めにATCCVR−837を入手したときに、13にの
変異株がウィルス集団中に存在していることが観察され
た。他者もこの現象を観察している[即ら、チュケら(
Chuke et al、、 1986. J、Vi
rology 60(3)+ 960)]。真核性プロ
モーターに直列させてBKエンハンサ−とともにポリー
〇T要素を用いて大きいDNAウィルスの即時型遺伝子
産物の存在下で核酸およびタンパク質などの有用な物質
を発現させる方法に限らず、本発明の他のあらゆる方法
も、BKエンハンサ−の供給源としてはガードナー味ま
たは特定のBK変異株に限定されるものではないが、原
型株から単離した変異エンノ・ンサー(実施例18)が
好ましい。次の表は本明細書で説明した方法において使
用することができるBK変異株の多数の代表例を挙げる
ものである。さらに、BK様のウィルス(サル媒介物1
2)がBKエンノ−ンサーに相同なエンノ\ンサー要素
を含有しており、本明細書記載の方法に用いることがで
きる。このサル媒介物12のエンハンサ−要素はカニン
ガムら[Cunningham et al、、 1
985. JJirol、 54 : 483−4
921が開示しており、本発明にとってはBKエンハン
サ−変異体である。
は原型株のBKウィルス(ATCCVR837)から単
離した。しかし、多数のBKウィルス変異体が単離され
、開示されている。ガードナーら[Gardner e
t at、、 1971. Lancet l : 1
253; Gardner、 1973. Br1t、
Med、J、 I : 77−78]はBKウィルス
の最初の単離を報告し、従ってガードナー味が原型の、
または野生型のBKウィルスと呼ばれている。BKウィ
ルスのガードナー味(第1図)はATCCから取得番号
ATCCVR−837のもとて人手できる。実際のとこ
ろ、本明細書に記載されたベクターの構築に使用するた
めにATCCVR−837を入手したときに、13にの
変異株がウィルス集団中に存在していることが観察され
た。他者もこの現象を観察している[即ら、チュケら(
Chuke et al、、 1986. J、Vi
rology 60(3)+ 960)]。真核性プロ
モーターに直列させてBKエンハンサ−とともにポリー
〇T要素を用いて大きいDNAウィルスの即時型遺伝子
産物の存在下で核酸およびタンパク質などの有用な物質
を発現させる方法に限らず、本発明の他のあらゆる方法
も、BKエンハンサ−の供給源としてはガードナー味ま
たは特定のBK変異株に限定されるものではないが、原
型株から単離した変異エンノ・ンサー(実施例18)が
好ましい。次の表は本明細書で説明した方法において使
用することができるBK変異株の多数の代表例を挙げる
ものである。さらに、BK様のウィルス(サル媒介物1
2)がBKエンノ−ンサーに相同なエンノ\ンサー要素
を含有しており、本明細書記載の方法に用いることがで
きる。このサル媒介物12のエンハンサ−要素はカニン
ガムら[Cunningham et al、、 1
985. JJirol、 54 : 483−4
921が開示しており、本発明にとってはBKエンハン
サ−変異体である。
(以下、余白)
BKV(DUN)
BK(GS)
および
B K (MM)
BK(JL)
第1表
BKV(DUN)はウィルス
エンハンサ−コアの側面t
ぐの0、γm、u、のところに
〜40bpの欠失を含んでい
る
これらの変異体ハコン)、ロ
ー小領域における転位およ
び重複を含む多数の塩基の
相違を有し、相違の一部は
エンハンサ−中に生じてい
る
制限エンドヌクレアーセ
パターンに小さな相違
Viral Oncology。
1980、 (Raven Press。
N、 Y、 、 ed、 G、 Klein)。
pp、 489−540
Pater et at、 、 1979゜J Vir
ol、32:220−225:5eif et al、
、 1979゜Ce1l 18 : 963−977 Yang et al、 、 1979Nuc、^ci
ds Res、 7゜ 651−668 ・Pater et al、 、 +979. Virotogy131:4
26−436 Pauw et al、 、 1978゜Arcb、
Virol、 57:35株の名称 B K(RF) および BK(MG) m522 第一1表(続き) 説明(野生型に対する) これらの変異体は2種類の 相補性欠損分子からなり、 その両者は感染性に必要と され、原型のBKウィルス とはヌクレオチド配列が広 範囲に異なっている 増殖中の自然突然変異によ って、おそら(は2組の短 い方の37bpの繰返しの存 在および3つのエンハンサ 一繰返しの内の2つの削除 により、宿主範囲および 形質転換能の相違が導か れている 参考文献 Pater et al、、 1980゜J、Viro
l、36二480−487°Pater et al、
、 1981、 J、 Virol、 39:968
−972 ; Pater et al、 、 198
3、 Virol、 131:426Watanabe
et al、 、 1982、 J、 Virol、
42:97g−985; Watanabe et al、 、 1984 J、
Virol、 51:l−6tr530 r531 tr532 KV9 BKウィルス R 第1表(続き) pm522配列から派生する WaLanabe et
al、 、 19短いセグメントの一層の重 84.
J、 Virol、 51:l−6複を有し、pm5
22エンハ ンサー領域を含有する組換 えBKウィルスの増殖中の 自然突然変異 原型(wt) B Kウィルスの調 製物から単離されたBKウ ィルスの生存性の変異株; 不完全なエンハンサ−繰返 しとエンハンサ−の後期側 に至る配列の宙複を含んで いる Chuke et at、、 1911t6゜J、 V
irol、 60:960−971エンハンサ−領域中
に挿入 Pagnani et aL 、 19と転位
を含むヒト腫瘍から 86. J、 Virol、 5
9:500単離されたBKウィルス変 −505 異株;このウィルスは変化 した形質転換表現型を有し ている 当業者なら、宿主細胞が大きいDNAウィルスの即時型
遺伝子産物を発現する限り、多種の真核宿主細胞を本発
明方法において用いることができることを認めるであろ
う。即時型の遺伝子産物はプラスミドあるいは他のベク
ターによる形質転換なとの多数の方法によって宿主細胞
中に導入することができるので、実質的にはあらゆる真
核細胞を本発明方法において用いることができる。特に
、本発明のGTエンハンサ−系を活性化するE1A遺伝
子産物を、(1)ボ1J−GT要素、真核性プロモータ
ー、および発現させようとする構造遺伝子とともに、C
1A遺伝子をコードしている1個のプラスミド、例えば
プラスミドpLPcE1Δ(GT)を真核宿主細胞に導
入すること;(2)E1Aをコードしている1個のプラ
スミド、例えばプラスミドpsV2E1Aと、ポリーG
T要素、真核性プロモーター、および発現させようとす
る構造遺伝子をコードしている1個のプラスミド、例え
ばプラスミドpBL(GT)catの2種類のプラスミ
ドを真核宿主細胞の同時形質転換によって導入すること
;または(3)293あるいはAV12などのE1A発
現セルラインを用い、ポリーGT、真核性プロモーター
、および発現させようとする構造遺伝子をコードしてい
る1個のプラスミドを導入すること、を含む種々の方法
で付与してよいことは当業者の認めるところであろう。
ol、32:220−225:5eif et al、
、 1979゜Ce1l 18 : 963−977 Yang et al、 、 1979Nuc、^ci
ds Res、 7゜ 651−668 ・Pater et al、 、 +979. Virotogy131:4
26−436 Pauw et al、 、 1978゜Arcb、
Virol、 57:35株の名称 B K(RF) および BK(MG) m522 第一1表(続き) 説明(野生型に対する) これらの変異体は2種類の 相補性欠損分子からなり、 その両者は感染性に必要と され、原型のBKウィルス とはヌクレオチド配列が広 範囲に異なっている 増殖中の自然突然変異によ って、おそら(は2組の短 い方の37bpの繰返しの存 在および3つのエンハンサ 一繰返しの内の2つの削除 により、宿主範囲および 形質転換能の相違が導か れている 参考文献 Pater et al、、 1980゜J、Viro
l、36二480−487°Pater et al、
、 1981、 J、 Virol、 39:968
−972 ; Pater et al、 、 198
3、 Virol、 131:426Watanabe
et al、 、 1982、 J、 Virol、
42:97g−985; Watanabe et al、 、 1984 J、
Virol、 51:l−6tr530 r531 tr532 KV9 BKウィルス R 第1表(続き) pm522配列から派生する WaLanabe et
al、 、 19短いセグメントの一層の重 84.
J、 Virol、 51:l−6複を有し、pm5
22エンハ ンサー領域を含有する組換 えBKウィルスの増殖中の 自然突然変異 原型(wt) B Kウィルスの調 製物から単離されたBKウ ィルスの生存性の変異株; 不完全なエンハンサ−繰返 しとエンハンサ−の後期側 に至る配列の宙複を含んで いる Chuke et at、、 1911t6゜J、 V
irol、 60:960−971エンハンサ−領域中
に挿入 Pagnani et aL 、 19と転位
を含むヒト腫瘍から 86. J、 Virol、 5
9:500単離されたBKウィルス変 −505 異株;このウィルスは変化 した形質転換表現型を有し ている 当業者なら、宿主細胞が大きいDNAウィルスの即時型
遺伝子産物を発現する限り、多種の真核宿主細胞を本発
明方法において用いることができることを認めるであろ
う。即時型の遺伝子産物はプラスミドあるいは他のベク
ターによる形質転換なとの多数の方法によって宿主細胞
中に導入することができるので、実質的にはあらゆる真
核細胞を本発明方法において用いることができる。特に
、本発明のGTエンハンサ−系を活性化するE1A遺伝
子産物を、(1)ボ1J−GT要素、真核性プロモータ
ー、および発現させようとする構造遺伝子とともに、C
1A遺伝子をコードしている1個のプラスミド、例えば
プラスミドpLPcE1Δ(GT)を真核宿主細胞に導
入すること;(2)E1Aをコードしている1個のプラ
スミド、例えばプラスミドpsV2E1Aと、ポリーG
T要素、真核性プロモーター、および発現させようとす
る構造遺伝子をコードしている1個のプラスミド、例え
ばプラスミドpBL(GT)catの2種類のプラスミ
ドを真核宿主細胞の同時形質転換によって導入すること
;または(3)293あるいはAV12などのE1A発
現セルラインを用い、ポリーGT、真核性プロモーター
、および発現させようとする構造遺伝子をコードしてい
る1個のプラスミドを導入すること、を含む種々の方法
で付与してよいことは当業者の認めるところであろう。
ヒト細胞は本発明方法において好ましい宿主細胞である
。ヒト腎細胞が宿主細胞として特に好ましく、E1A遺
伝子産物を発現するアデノウイルス−5形質転換したヒ
ト胚腎セルライン293が最も好ましく、これをATC
Cから取得番号ATCCCRL−15753のもとで入
手することができる。
。ヒト腎細胞が宿主細胞として特に好ましく、E1A遺
伝子産物を発現するアデノウイルス−5形質転換したヒ
ト胚腎セルライン293が最も好ましく、これをATC
Cから取得番号ATCCCRL−15753のもとで入
手することができる。
293セルラインは、293細胞がE1A遺伝子産物を
発現するためだけでなく、293細胞がγ−カルボキシ
ル化し、ほかにプロティンCなどのコンプレックス遺伝
子産物を適切にプロセッシングするその能力から好まし
い。「γ−カルホキシル化」とはカルボキシル基がγ−
炭素のところでグルタミン酸残基に付加される反応を指
し、γ−カルボキシル化されたタンパク質とはいくつか
のアミノ酸残基がγ−カルボキシルを受けたタンパク質
である。通常、腎細胞はある種のタンパク質をγ−カル
ボキシル化し、ほかにプロセッシングするが、293細
胞はアデノウィルスで形質転換され、これによって通常
特別の機能が失われることになる。従って、本発明は、
天然にγ−カルボキシル化され、適切に折り畳まれ、そ
してプロセッシングされているタンパク質を産生させる
改良方法をも包含するものである;ここで、該タンパク
質はアデノウィルス後期プロモーターとともにBKエン
ハンサ−およびポリーGT要素を含有する組換えDNA
ベクターにコードされている。293セルラインの29
3N3S誘導体も本発明で用いるのに適しており、グラ
ハム[Graham、 1987゜J、 Gen、 V
irol、 68 : 937コの記載のようにして懸
濁培養で増殖させることができる。
発現するためだけでなく、293細胞がγ−カルボキシ
ル化し、ほかにプロティンCなどのコンプレックス遺伝
子産物を適切にプロセッシングするその能力から好まし
い。「γ−カルホキシル化」とはカルボキシル基がγ−
炭素のところでグルタミン酸残基に付加される反応を指
し、γ−カルボキシル化されたタンパク質とはいくつか
のアミノ酸残基がγ−カルボキシルを受けたタンパク質
である。通常、腎細胞はある種のタンパク質をγ−カル
ボキシル化し、ほかにプロセッシングするが、293細
胞はアデノウィルスで形質転換され、これによって通常
特別の機能が失われることになる。従って、本発明は、
天然にγ−カルボキシル化され、適切に折り畳まれ、そ
してプロセッシングされているタンパク質を産生させる
改良方法をも包含するものである;ここで、該タンパク
質はアデノウィルス後期プロモーターとともにBKエン
ハンサ−およびポリーGT要素を含有する組換えDNA
ベクターにコードされている。293セルラインの29
3N3S誘導体も本発明で用いるのに適しており、グラ
ハム[Graham、 1987゜J、 Gen、 V
irol、 68 : 937コの記載のようにして懸
濁培養で増殖させることができる。
γ−カルボキシル化されたタンパク質を産生させるこの
方法は、アデノウィルス形質転換されたヒト胚腎細胞に
限定されるものではない。このγ−カルボキシル化され
たタンパク質を産生させる方法はすべてのアデノウィル
ス形質転換された宿主細胞に広く適用することかできる
。また当業者なら、この方法は、始めに真核細胞をγ−
カルボキシル化タンパク質のための発現ベクターで形質
転換し、次いで得られた形質転換体をアゾンウィルスで
形質転換することによって行うことができることを認め
るであろう。ハロルド・ギンズバーク’[1Iarol
d Ginsberg、 The Adenoviru
ses、 1984+Plenum Press、
New York]は、多数のアデノウィルスおよびア
デノウィルス形質転換した宿主細胞を得る方法を記載し
ている。組換えDNA発現ベクターにコードされている
γ−カルボキシル化タンパク質を発現させる目的のため
に特に好ましいアデノウィルス形質転換された宿主細胞
は、シリアン(Syrian)ハムスターセルラインA
V12−664(以下、AV12と記す)である。この
AVI2セルラインは、アデノウィルス12型をシリア
ンハムスターの首筋に注射し、得られた腫瘍から細胞を
単離することによって作成された。AVI2セルライン
はγ−カルボキフル化されたタンパク質を産生させる目
的のためには好ましい宿主である。γ−カルボキシル化
されるタンパク質の例には、因子■、因子■、因子■、
プロティンC、プロティンS1プロテインZ1およびプ
ロトロンビンが含まれるが、これらに限定はされない。
方法は、アデノウィルス形質転換されたヒト胚腎細胞に
限定されるものではない。このγ−カルボキシル化され
たタンパク質を産生させる方法はすべてのアデノウィル
ス形質転換された宿主細胞に広く適用することかできる
。また当業者なら、この方法は、始めに真核細胞をγ−
カルボキシル化タンパク質のための発現ベクターで形質
転換し、次いで得られた形質転換体をアゾンウィルスで
形質転換することによって行うことができることを認め
るであろう。ハロルド・ギンズバーク’[1Iarol
d Ginsberg、 The Adenoviru
ses、 1984+Plenum Press、
New York]は、多数のアデノウィルスおよびア
デノウィルス形質転換した宿主細胞を得る方法を記載し
ている。組換えDNA発現ベクターにコードされている
γ−カルボキシル化タンパク質を発現させる目的のため
に特に好ましいアデノウィルス形質転換された宿主細胞
は、シリアン(Syrian)ハムスターセルラインA
V12−664(以下、AV12と記す)である。この
AVI2セルラインは、アデノウィルス12型をシリア
ンハムスターの首筋に注射し、得られた腫瘍から細胞を
単離することによって作成された。AVI2セルライン
はγ−カルボキフル化されたタンパク質を産生させる目
的のためには好ましい宿主である。γ−カルボキシル化
されるタンパク質の例には、因子■、因子■、因子■、
プロティンC、プロティンS1プロテインZ1およびプ
ロトロンビンが含まれるが、これらに限定はされない。
実施例18および19に記載されている新規なポリGT
−BKエンハンサーー真核性プロモーター構築物は、真
核性プロモーターとともにポリーGT要素およびBKエ
ンハンサ−を用いる改良発現法を用いて構築した。この
方法は、E1A遺伝子産物の存在下で真核性プロモータ
ーに関して5′または3°にポリーGT要素を設置し、
BKエンハンサ−と直列で用いられる真核性プロモータ
ーのCCAAT領域またはCCAAT領域等価域の5°
末端の上流の0〜300ヌクレオチド以内にBKエンハ
ンサ−を設置することからなる。
−BKエンハンサーー真核性プロモーター構築物は、真
核性プロモーターとともにポリーGT要素およびBKエ
ンハンサ−を用いる改良発現法を用いて構築した。この
方法は、E1A遺伝子産物の存在下で真核性プロモータ
ーに関して5′または3°にポリーGT要素を設置し、
BKエンハンサ−と直列で用いられる真核性プロモータ
ーのCCAAT領域またはCCAAT領域等価域の5°
末端の上流の0〜300ヌクレオチド以内にBKエンハ
ンサ−を設置することからなる。
他のウィルス遺伝子産物、例えばアゾ7ウイルスのVA
遺伝子産物は、アデノウィルスの3部構成リーダーを含
有しているmRNA分子の翻訳効率を増強する[カウフ
マン(Kaufman、 1985. Proc。
遺伝子産物は、アデノウィルスの3部構成リーダーを含
有しているmRNA分子の翻訳効率を増強する[カウフ
マン(Kaufman、 1985. Proc。
Natl、 Acad、 Sci、 US^82 :
689−693) ;スベンソンおよびアクジャラル(
Svensson and Akusjarul、
1985、 EMBO4: 957−964)]。本発
明のベクターを修飾してアデノウィルスの完全な3部構
成リーダーをコードさせるのは容易である;このVA遺
伝子産物を用いてアデノウィルスの3部構成リーダーの
第1の部分だけを含有するあるmRNAの翻訳を増強し
てもよい。
689−693) ;スベンソンおよびアクジャラル(
Svensson and Akusjarul、
1985、 EMBO4: 957−964)]。本発
明のベクターを修飾してアデノウィルスの完全な3部構
成リーダーをコードさせるのは容易である;このVA遺
伝子産物を用いてアデノウィルスの3部構成リーダーの
第1の部分だけを含有するあるmRNAの翻訳を増強し
てもよい。
アデノウィルスの3部構成リーダーの配列を以下に示す
: *−−−−−−−−−−−−−−一第1の部分−−−−
−−−−−−−−−−*5’ −ACUC:UCUUC
CCCAUCGCIJGUCUGCGAGGGCCAG
CUGUUGGG*−−−−−−−−−−−−−−−−
−一第2の部分−一−−−−−−−−−−CUCGCG
GUUGAGGACAAACUCUUCGCGGUCU
tlUCCAGDACUCUU−−−一−−−〜−−−
−−−−−−−−−−−−−−−**−−−−−−−−
−GG A tlcGGA AACCCG LICGG
CC[ICCGA A CG IJAcUccGccA
ccGAcG−−一−−−−−−−−−−−−−第3の
部分−−−一一−−−−GACCUGAGCGAGUC
CGCAUCGACCGGAUCGGAAAACCUf
JCGAG−一−−−−−−−−−−−〜−−−−−−
−−−−−−*AAAGGCGIJCUAACCAGU
CACAGUCGCA−3’[配列中、Aはリボアデニ
ルであり、Gはリボグアニルであり、Cはリホシチンル
であり、そしてUはウリジルであるコ。アデノウィルス
DNA中にフードされているように、3部構成のリーダ
ーは大きいイントロンによって遮断されている。これら
イントロンまたはイントロンの一部の存在は発現レベル
に悪影響を及ぼさない。本明細書中に記載したプラスミ
ドp4−14およびp2−5はアデノウィルスの3部構
成リーダーを含有しており、後記の実施例24でさらに
詳しく説明する。プラスミドp4−14 (GT)およ
びp2−5 (G T)はさらにポリ〜GT要素を含有
している。
: *−−−−−−−−−−−−−−一第1の部分−−−−
−−−−−−−−−−*5’ −ACUC:UCUUC
CCCAUCGCIJGUCUGCGAGGGCCAG
CUGUUGGG*−−−−−−−−−−−−−−−−
−一第2の部分−一−−−−−−−−−−CUCGCG
GUUGAGGACAAACUCUUCGCGGUCU
tlUCCAGDACUCUU−−−一−−−〜−−−
−−−−−−−−−−−−−−−**−−−−−−−−
−GG A tlcGGA AACCCG LICGG
CC[ICCGA A CG IJAcUccGccA
ccGAcG−−一−−−−−−−−−−−−−第3の
部分−−−一一−−−−GACCUGAGCGAGUC
CGCAUCGACCGGAUCGGAAAACCUf
JCGAG−一−−−−−−−−−−−〜−−−−−−
−−−−−−*AAAGGCGIJCUAACCAGU
CACAGUCGCA−3’[配列中、Aはリボアデニ
ルであり、Gはリボグアニルであり、Cはリホシチンル
であり、そしてUはウリジルであるコ。アデノウィルス
DNA中にフードされているように、3部構成のリーダ
ーは大きいイントロンによって遮断されている。これら
イントロンまたはイントロンの一部の存在は発現レベル
に悪影響を及ぼさない。本明細書中に記載したプラスミ
ドp4−14およびp2−5はアデノウィルスの3部構
成リーダーを含有しており、後記の実施例24でさらに
詳しく説明する。プラスミドp4−14 (GT)およ
びp2−5 (G T)はさらにポリ〜GT要素を含有
している。
本発明の多数の例示ベクター、例えばプラスミドp B
L (G T )catおよびpt、pc(cT)な
どは、アデノウィルスの3部構成リーダーの第1の部分
だけを含有している。本明細書においては、アデノウィ
ルスの3部構成リーダーの「第1の部分」は、mRNA
に転写されたときには、少なくとも以下の配列を含有し
ている: 5’−ACUCUCUUCCGCAUCGCUGUCU
GCGAGGGCCAG−3’。
L (G T )catおよびpt、pc(cT)な
どは、アデノウィルスの3部構成リーダーの第1の部分
だけを含有している。本明細書においては、アデノウィ
ルスの3部構成リーダーの「第1の部分」は、mRNA
に転写されたときには、少なくとも以下の配列を含有し
ている: 5’−ACUCUCUUCCGCAUCGCUGUCU
GCGAGGGCCAG−3’。
即ち、本発明は、真核性プロモーターおよび該プロモー
ターから発現されるように設置された有用な物質をコー
ドしているDNA配列の両方を含有する組換えDNAベ
クターで真核宿主細胞を形質転換し、該組換えDNAベ
クター含有細胞を該有用物質の発現に適した条件下で培
養することにより、真核宿主細胞において有用な物質を
産生させる方法の改良法であって、改良が (a)ポリーGT要素をベクターに導入し;(b)アデ
ノウィルスの3部構成リーダーの第1の部分をコードし
ているDNAを工程(a)のベクターに導入して、転写
されたときには生成したmRNAか有用産物をコードし
ており、その5′末端には3部構成リーダーの第1の部
分を含んでいるようにし; (c)工程(b)のベクターを含有している細胞に、V
A遺伝子産物の発現をコードしている第1のDNA配列
およびアデノウィルスのE1A遺伝子産物の配列をコー
ドしている第2のDNA配列を付与し;そして (d)工程(c)の細胞を、(i)V A遺伝子産物の
発現およびmRNAの翻訳の刺激、および(ii)E1
A遺伝子産物の発現およびポリーGT要素のエンノーン
サー活性の刺激に適した条件下で培養すること(但シ、
mRNAはアデノウィルスの完全な3部構成リーダーを
含有していないものとする)からなる方法を包含する。
ターから発現されるように設置された有用な物質をコー
ドしているDNA配列の両方を含有する組換えDNAベ
クターで真核宿主細胞を形質転換し、該組換えDNAベ
クター含有細胞を該有用物質の発現に適した条件下で培
養することにより、真核宿主細胞において有用な物質を
産生させる方法の改良法であって、改良が (a)ポリーGT要素をベクターに導入し;(b)アデ
ノウィルスの3部構成リーダーの第1の部分をコードし
ているDNAを工程(a)のベクターに導入して、転写
されたときには生成したmRNAか有用産物をコードし
ており、その5′末端には3部構成リーダーの第1の部
分を含んでいるようにし; (c)工程(b)のベクターを含有している細胞に、V
A遺伝子産物の発現をコードしている第1のDNA配列
およびアデノウィルスのE1A遺伝子産物の配列をコー
ドしている第2のDNA配列を付与し;そして (d)工程(c)の細胞を、(i)V A遺伝子産物の
発現およびmRNAの翻訳の刺激、および(ii)E1
A遺伝子産物の発現およびポリーGT要素のエンノーン
サー活性の刺激に適した条件下で培養すること(但シ、
mRNAはアデノウィルスの完全な3部構成リーダーを
含有していないものとする)からなる方法を包含する。
VAをコードしているプラスミドはアデノウィルスDN
Aから構築した。ヌクレオチド9833の5a11部位
とヌクレオチド11556のHind111部位で範囲
を定められている〜1723bpの制限フラグメントを
、アデノウイルス−2DNAから月1離し、H1ndl
ll −S al [消化のプラスミドpB R322
にクローンしてpB R322の〜622 bp S
al I −H1ndlllフラグメントを置き換え、
プラスミドpVAを構築した。プラスミドpVAから〜
1826bpのNrulフラグメントを単離し、このフ
ラグメントをフレノウ処理したBamHr消化のプラス
ミドpS V Nneo(B RLから人手可能)に挿
入することによって、ネオマイシン耐性とVAをコード
しているプラスミドを構築した。得られたプラスミド(
pV A−neoと命名)を用い、形質転換後のネオマ
イシン(G418)耐性の選択により、あらゆるセルラ
インにVA遺伝子を挿入することができる。
Aから構築した。ヌクレオチド9833の5a11部位
とヌクレオチド11556のHind111部位で範囲
を定められている〜1723bpの制限フラグメントを
、アデノウイルス−2DNAから月1離し、H1ndl
ll −S al [消化のプラスミドpB R322
にクローンしてpB R322の〜622 bp S
al I −H1ndlllフラグメントを置き換え、
プラスミドpVAを構築した。プラスミドpVAから〜
1826bpのNrulフラグメントを単離し、このフ
ラグメントをフレノウ処理したBamHr消化のプラス
ミドpS V Nneo(B RLから人手可能)に挿
入することによって、ネオマイシン耐性とVAをコード
しているプラスミドを構築した。得られたプラスミド(
pV A−neoと命名)を用い、形質転換後のネオマ
イシン(G418)耐性の選択により、あらゆるセルラ
インにVA遺伝子を挿入することができる。
しかし、アデノウィルスのVA遺伝子産物は、VAをコ
ードしているベクターで宿主細胞を形質転換した後の最
初の数日間においては、アデノウィルスの3部構成リー
ダーの第1の部分または完全な3部構成リーダーのいず
れかを含有している組換え遺伝子の発現に、その最大の
ポジティブな作用を発揮することができる。この最初の
数日間の後の宿主細胞中でのV’A遺伝子細胞の発現は
最適発現レベルを与えないこともある。
ードしているベクターで宿主細胞を形質転換した後の最
初の数日間においては、アデノウィルスの3部構成リー
ダーの第1の部分または完全な3部構成リーダーのいず
れかを含有している組換え遺伝子の発現に、その最大の
ポジティブな作用を発揮することができる。この最初の
数日間の後の宿主細胞中でのV’A遺伝子細胞の発現は
最適発現レベルを与えないこともある。
また、5V4Q、BKウィルス、あるいは池のあらゆる
ポリオーマウィルスのT抗原を本明細書中に記載したベ
クターとともに用いて、プロモーター活性を増強し、そ
して/または複製の刺激によりプラスミドのコピー数を
増大させることができる。5V4QのT抗原はアデノウ
ィルスおよびBKの後期プロモーターの両者からの転写
を刺激する。5V4QのT抗原はポリーC,T要素をト
ランスー活性化しないようである。しかし、本発明の発
現ベクター上にT抗原の暗号配列を含ませることによっ
て、またはT抗原の暗号配列を有するプラスミドと本ベ
クターとの同時トランスフェクションによって、実施例
22に示したように、選択圧をかける前にコピー数の増
幅を得ることができる。これは、発現ベクターの高コピ
ー数の組込みを可能にする。
ポリオーマウィルスのT抗原を本明細書中に記載したベ
クターとともに用いて、プロモーター活性を増強し、そ
して/または複製の刺激によりプラスミドのコピー数を
増大させることができる。5V4QのT抗原はアデノウ
ィルスおよびBKの後期プロモーターの両者からの転写
を刺激する。5V4QのT抗原はポリーC,T要素をト
ランスー活性化しないようである。しかし、本発明の発
現ベクター上にT抗原の暗号配列を含ませることによっ
て、またはT抗原の暗号配列を有するプラスミドと本ベ
クターとの同時トランスフェクションによって、実施例
22に示したように、選択圧をかける前にコピー数の増
幅を得ることができる。これは、発現ベクターの高コピ
ー数の組込みを可能にする。
上述のように、本発明の好ましい態様では、組換えDN
A発現ベクターは、ポリーGT要素、アデノウィルス後
期プロモーター(これ自体は、3部構成リーダーの少な
くとも第1の部分および有用な物質をコードしている遺
伝子を発現させるように設置されている)の上流の30
0ヌクレオチド以内に設置された原型株から単離したB
Kエンハンサ−を含有している。この好ましいベクター
を用いて、E1A遺伝子産物を継続的に発現するヒト胚
腎293細胞(発現ベクターによる形質転換の前後のど
ちらかに修飾してアデノウィルスのVA遺伝子産物を発
現させた)を形質転換する。
A発現ベクターは、ポリーGT要素、アデノウィルス後
期プロモーター(これ自体は、3部構成リーダーの少な
くとも第1の部分および有用な物質をコードしている遺
伝子を発現させるように設置されている)の上流の30
0ヌクレオチド以内に設置された原型株から単離したB
Kエンハンサ−を含有している。この好ましいベクター
を用いて、E1A遺伝子産物を継続的に発現するヒト胚
腎293細胞(発現ベクターによる形質転換の前後のど
ちらかに修飾してアデノウィルスのVA遺伝子産物を発
現させた)を形質転換する。
しかし、安定な形質転換体のためには、VA遺伝子産物
の存在は望ましくないこともある。
の存在は望ましくないこともある。
以下に実施例を挙げて本発明の方法、化合物、および絹
換え微生物をさらに詳しく説明する。当業者なら、実施
例に記載した特定の試薬、装置、および方法がfllな
る例示にすぎず、本発明を限定するものではないことを
認めるであろう。
換え微生物をさらに詳しく説明する。当業者なら、実施
例に記載した特定の試薬、装置、および方法がfllな
る例示にすぎず、本発明を限定するものではないことを
認めるであろう。
実施例1 ポリー〇T要素の調製
シスチック(Systec)1450A DNA合成機
[シスチック・インコーボレーテソト(3ystec、
Inc、 。
[シスチック・インコーボレーテソト(3ystec、
Inc、 。
3816 Chandler Drive、 Minn
eapolis、 MN 55401)]またはAB3
380A DNA合成機[アプライド・バイオシステ
ムズ・インコーボレーテノド(Applied Bio
systems、 Inc、、 850 Lincol
n CentreDrive、 Foster C1t
y、 CA 94404)提供]を用いて、ポリーGT
要素の構築に用いる一本鎖D N Aフラグメントを化
学的に合成した。当技術分野において多くのDNA合成
装置が知られており、これを用いてこのフラグメントを
作成することができる。
eapolis、 MN 55401)]またはAB3
380A DNA合成機[アプライド・バイオシステ
ムズ・インコーボレーテノド(Applied Bio
systems、 Inc、、 850 Lincol
n CentreDrive、 Foster C1t
y、 CA 94404)提供]を用いて、ポリーGT
要素の構築に用いる一本鎖D N Aフラグメントを化
学的に合成した。当技術分野において多くのDNA合成
装置が知られており、これを用いてこのフラグメントを
作成することができる。
また、このフラグメントは、イタクラ等[1takur
aet al。、 !977、5cience、 1
98:1056]およびクリ−等[Crea eL a
l、+ 1978. Proc、 ?laL、^cad
、 Sci。
aet al。、 !977、5cience、 1
98:1056]およびクリ−等[Crea eL a
l、+ 1978. Proc、 ?laL、^cad
、 Sci。
USA、 75:5785]の方法に実質的に従って調
製することらできる。
製することらできる。
以下のように一本鎖を合成した1麦、−本鎖ボリーGT
要素(各500ナノグラム)をアニーリングした。すな
わち、エツペンドルフ試験管中で鎖1(16μQ)と鎖
2(11μσ)とを?捏合し、tOX TM緩柚i液
[0,5M)リス−HCf!(pH7,6)、OIM
MgC9tl(3μQ)を加えた。この試験管を熱湯浴
に2分間放置し、次いで室温で、次ぎに4°Cティン牛
ユベートしてゆっくり冷却した。このti作により一本
鎖がアニーリングして二本鎖のポリーGT要素を生成し
た。このインキュベー/−Jン彼、試料(30μe)を
凍結乾燥し、次いて、ガラス蒸留したH 、O[dH、
O](7u&)l−4%濁した。構築されたポリーGT
要素は、以下の構造を有していた: 旦1がIX 五9ΩRニ ジ■田工 上記に示したとおり、このポリー〇T要素は、(GT)
n−(CA)、、セグメント(n−21)[このセグメ
ントの両側には、制限酵素: BamHI (G↓GΔ
TCC)、Xhol(C↓T CG A G )および
EcoRl (C4AATTG)の認識部位であるDN
A配列がある]を含むように構築された。したがって、
このポリーG′F要素を、種々の発現ベクターのBam
81部位またはXho1部位に容易に挿入することがで
き、以下の多くの実施例に記載されているようなポリー
〇T含有の発現ベクター誘導体を得ることかできる。ま
た、発現ベクターのすべての制限部位に平滑末端ライゲ
ーションによってポリーGT要素を挿入することができ
る。
要素(各500ナノグラム)をアニーリングした。すな
わち、エツペンドルフ試験管中で鎖1(16μQ)と鎖
2(11μσ)とを?捏合し、tOX TM緩柚i液
[0,5M)リス−HCf!(pH7,6)、OIM
MgC9tl(3μQ)を加えた。この試験管を熱湯浴
に2分間放置し、次いで室温で、次ぎに4°Cティン牛
ユベートしてゆっくり冷却した。このti作により一本
鎖がアニーリングして二本鎖のポリーGT要素を生成し
た。このインキュベー/−Jン彼、試料(30μe)を
凍結乾燥し、次いて、ガラス蒸留したH 、O[dH、
O](7u&)l−4%濁した。構築されたポリーGT
要素は、以下の構造を有していた: 旦1がIX 五9ΩRニ ジ■田工 上記に示したとおり、このポリー〇T要素は、(GT)
n−(CA)、、セグメント(n−21)[このセグメ
ントの両側には、制限酵素: BamHI (G↓GΔ
TCC)、Xhol(C↓T CG A G )および
EcoRl (C4AATTG)の認識部位であるDN
A配列がある]を含むように構築された。したがって、
このポリーG′F要素を、種々の発現ベクターのBam
81部位またはXho1部位に容易に挿入することがで
き、以下の多くの実施例に記載されているようなポリー
〇T含有の発現ベクター誘導体を得ることかできる。ま
た、発現ベクターのすべての制限部位に平滑末端ライゲ
ーションによってポリーGT要素を挿入することができ
る。
害頼週λBKウィルスDNAの調装
BKウィルスを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(ATCC)から取得番号ATCCVR−8
37のもとで人手する。このウィルスは凍結乾燥品とし
て得られ、これをバンク(flank)のバランス塩[
ギブコ(Gibco、 31755taley Roa
dGrand 1sland、 NY 14072)
コに再懸濁して約10’プラーク生成単位(pfu)/
12の力価にする。BKウィルスDNA調製用に選択し
た宿主は1次(プライマリ−)ヒト胎児腎(P HE
K)細胞であり、この細胞はフロラ・ラボラトリーズ社
(Plow Lab。
レクション(ATCC)から取得番号ATCCVR−8
37のもとで人手する。このウィルスは凍結乾燥品とし
て得られ、これをバンク(flank)のバランス塩[
ギブコ(Gibco、 31755taley Roa
dGrand 1sland、 NY 14072)
コに再懸濁して約10’プラーク生成単位(pfu)/
12の力価にする。BKウィルスDNA調製用に選択し
た宿主は1次(プライマリ−)ヒト胎児腎(P HE
K)細胞であり、この細胞はフロラ・ラボラトリーズ社
(Plow Lab。
raLories、 Inc、、 765501d S
pringhouse RoacL McLean、V
A 22101)からカタログ番号0−100のもとで
、またはM、A、バイオプロダクツ(M、^、Biop
roducts)からカタログ番号70−151のもと
で入手することができる。
pringhouse RoacL McLean、V
A 22101)からカタログ番号0−100のもとで
、またはM、A、バイオプロダクツ(M、^、Biop
roducts)からカタログ番号70−151のもと
で入手することができる。
全面単層の約108のPHEK細胞を含有する75次1
ポリスチレンフラスコ約5個を用いてウィルスを調製す
る。力価105pfu/mQのBKウィルス(約i y
a>を各フラスコに加え、これを37℃で1時間インキ
ュベートし、次いで新鮮な培養培地[10%ウシ胎児血
清を追加したダルベツコの改良イーグル培地(Dulb
ecco’ s Modiried Eagle’ s
Med i un、 G i bco) ]を加え、感
染細胞を37°CでlO〜14日間またはウィルスの完
全な細胞変性効果が認められるまでインキュベートする
。この細胞変性効果はセルラインの種類およびウィルス
の種類によって変わるが、通常、細胞か丸くなり、凝集
し、そして培養盤から剥がれることからなる。
ポリスチレンフラスコ約5個を用いてウィルスを調製す
る。力価105pfu/mQのBKウィルス(約i y
a>を各フラスコに加え、これを37℃で1時間インキ
ュベートし、次いで新鮮な培養培地[10%ウシ胎児血
清を追加したダルベツコの改良イーグル培地(Dulb
ecco’ s Modiried Eagle’ s
Med i un、 G i bco) ]を加え、感
染細胞を37°CでlO〜14日間またはウィルスの完
全な細胞変性効果が認められるまでインキュベートする
。この細胞変性効果はセルラインの種類およびウィルス
の種類によって変わるが、通常、細胞か丸くなり、凝集
し、そして培養盤から剥がれることからなる。
凍結−解凍を3回繰り返すことによってこの細胞からウ
ィルスを放出させ、5000Xgで遠心して細胞破片を
除去する。PEG−6000(1009)を加え、この
溶液を4°Cで24時間インキュベートし、そして50
00Xgで20分間遠心して、上清液(11り中のウィ
ルスを沈澱させ、集める。このペレットを、最初の容積
の1/100となるよう0.lX5SC緩衝液[IX
5SC=0゜15MNaC(および0..015Mクエ
ン酸ナトリウム(pH7)]に溶解する。このウィルス
懸濁液を、試験管中の飽和KBr溶液(15Rのに層状
に加え、これを75,000Xgで3時間遠心する。遠
心後、このKBr溶液中に2つのバンドが現れる。完全
なピリオンを含有する低い方のバンドを集め、TE[1
0mMト’JスーHC(2(pH7,8)、および1m
MEDTA]を溶離緩衝液として用いてセファデックス
(Sephadexll)G −50カラム[シグマ−
ケミカル社(Sigma Chemical Co、+
P、O,Box 14508St、Louis、 M
O6317g)コで脱塩する。
ィルスを放出させ、5000Xgで遠心して細胞破片を
除去する。PEG−6000(1009)を加え、この
溶液を4°Cで24時間インキュベートし、そして50
00Xgで20分間遠心して、上清液(11り中のウィ
ルスを沈澱させ、集める。このペレットを、最初の容積
の1/100となるよう0.lX5SC緩衝液[IX
5SC=0゜15MNaC(および0..015Mクエ
ン酸ナトリウム(pH7)]に溶解する。このウィルス
懸濁液を、試験管中の飽和KBr溶液(15Rのに層状
に加え、これを75,000Xgで3時間遠心する。遠
心後、このKBr溶液中に2つのバンドが現れる。完全
なピリオンを含有する低い方のバンドを集め、TE[1
0mMト’JスーHC(2(pH7,8)、および1m
MEDTA]を溶離緩衝液として用いてセファデックス
(Sephadexll)G −50カラム[シグマ−
ケミカル社(Sigma Chemical Co、+
P、O,Box 14508St、Louis、 M
O6317g)コで脱塩する。
このカラムから得た精製ピリオン溶液に、ドデシル硫酸
ナトリウム(SDS)を1%濃度となるように加え、プ
ロナーゼを100μ9/Rσ濃度となるように加え、そ
してこの溶液を37°Cで2時間インキュベートする。
ナトリウム(SDS)を1%濃度となるように加え、プ
ロナーゼを100μ9/Rσ濃度となるように加え、そ
してこの溶液を37°Cで2時間インキュベートする。
次いで、この溶液に塩化セシウムを1.569/y+2
密度となるように加え、臭化エチジウムを最終濃度10
0μ9/x(lとなるように加える。この溶液を、ソー
パル(Sorvall ; DuPontlnst、P
roducts、Biomedical Divisi
on、 Newton。
密度となるように加え、臭化エチジウムを最終濃度10
0μ9/x(lとなるように加える。この溶液を、ソー
パル(Sorvall ; DuPontlnst、P
roducts、Biomedical Divisi
on、 Newton。
CT 06470) 8650−ターまたは同様の垂直
ローター中、260,000Xgで24時間遠心する。
ローター中、260,000Xgで24時間遠心する。
遠心後、ウィルスDNAのバンドを単[,100mM)
リス−HC12(pH7,8)で飽和したイソアミルア
ルコールで5回抽出する。次いでこのBKウィルスDN
Aの溶液を、DNAの260nm/280nm吸収比が
1、γ5と1.90の間に入るまで、TE緩衝液に対し
て透析する。NaCQ濃度を0゜15Mに調整し、2倍
量のエタノールを加え、この溶液を一70℃で少なくと
も2時間インキュベートシ、そしてこの溶1夜を12.
OOOXgで10分間遠心することによってDNAを沈
澱させる。
リス−HC12(pH7,8)で飽和したイソアミルア
ルコールで5回抽出する。次いでこのBKウィルスDN
Aの溶液を、DNAの260nm/280nm吸収比が
1、γ5と1.90の間に入るまで、TE緩衝液に対し
て透析する。NaCQ濃度を0゜15Mに調整し、2倍
量のエタノールを加え、この溶液を一70℃で少なくと
も2時間インキュベートシ、そしてこの溶1夜を12.
OOOXgで10分間遠心することによってDNAを沈
澱させる。
得うれたBKウィルスDNAのペレットを、In97M
(lの濃度でTE緩衝液に懸濁させる。
(lの濃度でTE緩衝液に懸濁させる。
実施例3 プラスミドpB K neolおよびpBK
ne。
ne。
2の構築
大腸菌に12 HBIOI/pdBPV−MMTneo
細胞を、ATCCから取得番号ATCC37224のも
と、凍結乾燥品として入手する。この凍結乾燥細胞を、
lOOμ9/yQアンピシリン含有のし一寒天(112
あたり寒天159を有するしブロス)プレートで平板培
養し、37℃でインキュベートして単一のコロニー単離
体を得る。
細胞を、ATCCから取得番号ATCC37224のも
と、凍結乾燥品として入手する。この凍結乾燥細胞を、
lOOμ9/yQアンピシリン含有のし一寒天(112
あたり寒天159を有するしブロス)プレートで平板培
養し、37℃でインキュベートして単一のコロニー単離
体を得る。
50μ9/xQのアンピシリンを含有するしブロス[I
Qあたりトリプトン10g、NaCCl0g、および酵
母抽出物5gコ(Iρ)に大腸菌KI2 HDIO1/
pdBPV−MMTneoのコロニーを接種し、空気振
盪型中、37°Cで、0.D、、、。が〜1吸収単位に
なるまでインキュベートし、この時点でクロラムフェニ
コール(150R9)を培養物に加えた。
Qあたりトリプトン10g、NaCCl0g、および酵
母抽出物5gコ(Iρ)に大腸菌KI2 HDIO1/
pdBPV−MMTneoのコロニーを接種し、空気振
盪型中、37°Cで、0.D、、、。が〜1吸収単位に
なるまでインキュベートし、この時点でクロラムフェニ
コール(150R9)を培養物に加えた。
インキュベートを約16時間続けた。クロラムフェニコ
ールの添加によりタンパク質の合成が阻害され、従って
細胞分裂が阻害されるが、プラスミドの複製は継続して
起こり得る。
ールの添加によりタンパク質の合成が阻害され、従って
細胞分裂が阻害されるが、プラスミドの複製は継続して
起こり得る。
この培養物をGSAO−ター(ソーパル)中、4°C1
6000rpnで5分間遠心した。得られた上清を廃棄
し、細胞ペレットをT E S tB街液[10mMト
リス−HC12(pH7,5)、lOmMNacσ、お
よびl+nMEDTAコ(40iR)で洗浄し、次いで
再ペレット化した。上清を廃棄し、細胞ペレットをドラ
イアイス−エタノール浴中で凍結し、次いで解凍した。
6000rpnで5分間遠心した。得られた上清を廃棄
し、細胞ペレットをT E S tB街液[10mMト
リス−HC12(pH7,5)、lOmMNacσ、お
よびl+nMEDTAコ(40iR)で洗浄し、次いで
再ペレット化した。上清を廃棄し、細胞ペレットをドラ
イアイス−エタノール浴中で凍結し、次いで解凍した。
解凍した細胞ペレットを25%スクロースおよび50Q
IMEDTAの溶液(IOIR)に再懸濁させた。この
溶液に、5巧/村リゾチーム溶液(約I M(1’)、
0.25M EDTA(pH8,0)(3酎)および1
0m9/zQ RNA5e A(100u(りを加え、
次いで、水上で15分間インキュベートした。溶菌液[
10%トリトン−X100(3j112)、0.25M
EDTA(pH8,0)(75xC)、IMI−リ
ス−HC&(pH8,0)(15x(1”)、オヨびd
H,0(7ズQ)を混合して、調製した](33IC)
を、リゾチーム処理した細胞に加え、混合し、得られた
溶液を水上でさらに15分間インキュベートした。溶菌
細胞をドライアイス−エタノール浴中で凍結し、次いで
解凍した。
IMEDTAの溶液(IOIR)に再懸濁させた。この
溶液に、5巧/村リゾチーム溶液(約I M(1’)、
0.25M EDTA(pH8,0)(3酎)および1
0m9/zQ RNA5e A(100u(りを加え、
次いで、水上で15分間インキュベートした。溶菌液[
10%トリトン−X100(3j112)、0.25M
EDTA(pH8,0)(75xC)、IMI−リ
ス−HC&(pH8,0)(15x(1”)、オヨびd
H,0(7ズQ)を混合して、調製した](33IC)
を、リゾチーム処理した細胞に加え、混合し、得られた
溶液を水上でさらに15分間インキュベートした。溶菌
細胞をドライアイス−エタノール浴中で凍結し、次いで
解凍した。
5W28.10−ター[ベックマン(Beckman、
5cientific Instrument Di
vision、 Campus Drive aL J
amboree Blvd、、 Irvine、 CA
92713)]中、25000 rpmで40分間遠
心し、緩衝化フェノールで抽出して、この溶液から細胞
破片を除去した。
5cientific Instrument Di
vision、 Campus Drive aL J
amboree Blvd、、 Irvine、 CA
92713)]中、25000 rpmで40分間遠
心し、緩衝化フェノールで抽出して、この溶液から細胞
破片を除去した。
この細胞抽出液にCsCa(約30.44y)および5
19/峠臭化エチジウム溶液(〜l M(1)を加え、
次いで、溶液の容量をTBS緩衝液で4.OyQに調整
した。この溶液をVTi50超遠心管(ベックマン)に
デカントし、次いで、密封し、VTi50ローター中、
42.OOOrpmで〜16時間遠心した。
19/峠臭化エチジウム溶液(〜l M(1)を加え、
次いで、溶液の容量をTBS緩衝液で4.OyQに調整
した。この溶液をVTi50超遠心管(ベックマン)に
デカントし、次いで、密封し、VTi50ローター中、
42.OOOrpmで〜16時間遠心した。
得られたプラスミドバンドを紫外光で可視化し、これを
単離し、次いでTi75管およびローター(ベックマン
)中に置き、50. OOOrpmで16時間遠心した
。0、γ6197xQ C5C(lを含有するTESを
用いて必要な容量に調整した。プラスミドバンドを再度
単離し、塩−飽和インプロパノールで抽出して臭化エチ
ジウムを除去し、TBS緩衝液で1:3に希釈した。次
いで、この溶液にエタノール2倍量および3M酢酸ナト
リウム1倍量を加え、−20℃で一夜インキユベートし
た。この溶液を、5s340−ター(ソーパル)中、1
0゜00 Orpmで15分間遠心してプラスミドDN
Aをペレット化した。
単離し、次いでTi75管およびローター(ベックマン
)中に置き、50. OOOrpmで16時間遠心した
。0、γ6197xQ C5C(lを含有するTESを
用いて必要な容量に調整した。プラスミドバンドを再度
単離し、塩−飽和インプロパノールで抽出して臭化エチ
ジウムを除去し、TBS緩衝液で1:3に希釈した。次
いで、この溶液にエタノール2倍量および3M酢酸ナト
リウム1倍量を加え、−20℃で一夜インキユベートし
た。この溶液を、5s340−ター(ソーパル)中、1
0゜00 Orpmで15分間遠心してプラスミドDN
Aをペレット化した。
この方法によって得られたプラスミドpdBPV−MM
T neo D N A (〜l g9)を、TE緩
衝液(IR(1>に懸濁させ、−20’Cで保存した。
T neo D N A (〜l g9)を、TE緩
衝液(IR(1>に懸濁させ、−20’Cで保存した。
前記プラスミド単離方法は、非常に精製されたプラスミ
ドDNAが多量に必要である場合に一般に用いられる。
ドDNAが多量に必要である場合に一般に用いられる。
この方法を若干変え、培養細胞を約53112だけを用
い、適当に量を減らした溶菌緩衝液中で細胞を溶解し、
そして遠心分離工程をフェノールおよびクロロホルム抽
出に変えることによって、あるプラスミドの存在につい
て形質転換体をスクリーニングする際に必要であるよう
な比較的少量の比較的純度の低いDNAを迅速に得るこ
とができる。
い、適当に量を減らした溶菌緩衝液中で細胞を溶解し、
そして遠心分離工程をフェノールおよびクロロホルム抽
出に変えることによって、あるプラスミドの存在につい
て形質転換体をスクリーニングする際に必要であるよう
な比較的少量の比較的純度の低いDNAを迅速に得るこ
とができる。
上記で調製したプラスミドpdBPV−MMTne。
DNA(約5μ9;5μa)および実施例2で調製した
BKウィルスDNA(5μり;5μg)を、各々、lQ
XBamHIi街液[1,5M NaC(!、60M
トリス−HC((pH7,9)、60 mM MgC(
lffi、およびl m9/x(l B S A](2
μi2)、制限酵素BamHI[約20単位;酵素の実
際の供給源は異なっていることもあるが、特記しない限
り、本明細書における酵素単位の全ては、ニュー・イン
グランド・バイオラブズ(New England B
iolabs、 32 Tozer Road。
BKウィルスDNA(5μり;5μg)を、各々、lQ
XBamHIi街液[1,5M NaC(!、60M
トリス−HC((pH7,9)、60 mM MgC(
lffi、およびl m9/x(l B S A](2
μi2)、制限酵素BamHI[約20単位;酵素の実
際の供給源は異なっていることもあるが、特記しない限
り、本明細書における酵素単位の全ては、ニュー・イン
グランド・バイオラブズ(New England B
iolabs、 32 Tozer Road。
Bever!y、 MA 01915)の単位の定義を
指す](1μの、およびdH,O(7μのを含有する溶
液中、37°Cで2時間消化した。同量のフェノールで
抽出し、次いでクロロホルムで2回抽出して、この反応
を止めた。次いで、各BamHI消化DNAを沈澱させ
、遠心分離によって集め、dH,o(5μQ)に懸濁さ
せた。
指す](1μの、およびdH,O(7μのを含有する溶
液中、37°Cで2時間消化した。同量のフェノールで
抽出し、次いでクロロホルムで2回抽出して、この反応
を止めた。次いで、各BamHI消化DNAを沈澱させ
、遠心分離によって集め、dH,o(5μQ)に懸濁さ
せた。
Bam)(l消化プラスミドバンド P V−MMTn
eo(1μのとBamHI消化BKウィルスDNA(1
μのとの混合物にIOXリガーゼ緩衝液(約1μg)を
加えた。このDNA混合物にT4 DNAリガーゼ(
1uQ、 ; 〜1000単位)およびdHto (6
u(りヲ加工た後、得られた反応液を16°Cで一夜イ
ンキユベートシた。ライゲートしたDNAは、目的のプ
ラスミドpBKneolおよびpB K neo2 (
これらは、BKウィルスDNAの配向だけが異なってい
る)からなっていた。プラスミドpBKneolの制限
部位および機能地図を添付の第2図に示す。
eo(1μのとBamHI消化BKウィルスDNA(1
μのとの混合物にIOXリガーゼ緩衝液(約1μg)を
加えた。このDNA混合物にT4 DNAリガーゼ(
1uQ、 ; 〜1000単位)およびdHto (6
u(りヲ加工た後、得られた反応液を16°Cで一夜イ
ンキユベートシた。ライゲートしたDNAは、目的のプ
ラスミドpBKneolおよびpB K neo2 (
これらは、BKウィルスDNAの配向だけが異なってい
る)からなっていた。プラスミドpBKneolの制限
部位および機能地図を添付の第2図に示す。
大腸菌に12 HBIOI細胞は、取得番号NRRL
B −15626(1983年9月28日寄託)のも
と、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラ1−(
NRRL)から凍結乾燥品として入手することができる
。以下のように、この大腸菌に12HBIOI細胞を培
養し、形質転換のためにコンピテントにし、上記で調製
したライゲート化DNAで形質転換した。Lブロス中、
大腸菌に12HB101の培養物(50m12)を、6
50ナノメーターでの光学密度(0,D、、、。)が約
0.4吸収単位になるように増殖した。培養物を水上で
10分間冷却し、遠心分離によって細胞を集めた。細胞
ペレットを冷100mM MgCff!(2511のに
再懸濁し、水上で25分間インキュベートした。遠心分
離によって細胞をもう1回ペレ・ット化し、このベレッ
トを冷100mM CaCQ2C2,5xQ)に再懸濁
し、水上で30分間インキュベートした。インキュベー
ション後、形質転換DNAの取り込みのために細胞をコ
ンピテントにする。
B −15626(1983年9月28日寄託)のも
と、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラ1−(
NRRL)から凍結乾燥品として入手することができる
。以下のように、この大腸菌に12HBIOI細胞を培
養し、形質転換のためにコンピテントにし、上記で調製
したライゲート化DNAで形質転換した。Lブロス中、
大腸菌に12HB101の培養物(50m12)を、6
50ナノメーターでの光学密度(0,D、、、。)が約
0.4吸収単位になるように増殖した。培養物を水上で
10分間冷却し、遠心分離によって細胞を集めた。細胞
ペレットを冷100mM MgCff!(2511のに
再懸濁し、水上で25分間インキュベートした。遠心分
離によって細胞をもう1回ペレ・ット化し、このベレッ
トを冷100mM CaCQ2C2,5xQ)に再懸濁
し、水上で30分間インキュベートした。インキュベー
ション後、形質転換DNAの取り込みのために細胞をコ
ンピテントにする。
この細胞懸濁液(200μg)と、上記で調製したライ
ゲート化DNAとを混合し、氷上で30分間インキュベ
ートした。この後、水浴中、42°Cで2分間、細胞を
放置し、次いで、水上にさらにlO分間戻した。この細
胞を遠心分離によって集め、Lブロス(l iQ)に再
懸濁し、37°Cで1時間インキュベートした。この細
胞混合物の試料を、100μ9/x(lアンピシリン含
有のL寒天プレートで平板培養した。このプレートを3
7°Cで一夜インキユベートした。大腸菌に12 [
(BIOI/pBKneo1および大腸菌に’ 12
/ pB K neo2形質転換体を、そのアンピシリ
ン耐性表現型およびそのプラスミドDNAの制限酵素分
析によって同定した。
ゲート化DNAとを混合し、氷上で30分間インキュベ
ートした。この後、水浴中、42°Cで2分間、細胞を
放置し、次いで、水上にさらにlO分間戻した。この細
胞を遠心分離によって集め、Lブロス(l iQ)に再
懸濁し、37°Cで1時間インキュベートした。この細
胞混合物の試料を、100μ9/x(lアンピシリン含
有のL寒天プレートで平板培養した。このプレートを3
7°Cで一夜インキユベートした。大腸菌に12 [
(BIOI/pBKneo1および大腸菌に’ 12
/ pB K neo2形質転換体を、そのアンピシリ
ン耐性表現型およびそのプラスミドDNAの制限酵素分
析によって同定した。
上記のようにして、大腸菌に12 HBIOI/pBK
neolおよび大腸菌K l 2 /pB K neo
2細胞からプラスミドDNAを得た。
neolおよび大腸菌K l 2 /pB K neo
2細胞からプラスミドDNAを得た。
(以下、余白)
実施例4 プラスミドpLPcatおよびpLP(GT
)catの構築 A、プラスミドpLPcatの構築 アデノウィルス2 (Ad2 )のピリオンDNAは、
約35.94kbの大きさの、2本鎖の直線状分子であ
る。このAd2の後期プロモーターは、Ad2ゲノムの
〜0.316kb Accl −Pvull制限フラグ
メントとして単離することができ、この〜0゜32kb
制限フラグメントは、Ad2ゲノムのヌクレオチド位置
5755と6071の間の配列に対応している。所望の
〜0.32kb Accl −Pvull制限フラグメ
ントを単離するため、始めにAd2DNAを制限酵素B
a1lで消化し、〜0.32kbAce I −Pvu
ll制限フラグメントの完全な配列を含有する〜2.4
kbBal[制限フラグメントを単離する。次いで、こ
の〜2.4kbBall制限フラグメントをAcclお
よびPvullで消化して所望のフラグメントを得る。
)catの構築 A、プラスミドpLPcatの構築 アデノウィルス2 (Ad2 )のピリオンDNAは、
約35.94kbの大きさの、2本鎖の直線状分子であ
る。このAd2の後期プロモーターは、Ad2ゲノムの
〜0.316kb Accl −Pvull制限フラグ
メントとして単離することができ、この〜0゜32kb
制限フラグメントは、Ad2ゲノムのヌクレオチド位置
5755と6071の間の配列に対応している。所望の
〜0.32kb Accl −Pvull制限フラグメ
ントを単離するため、始めにAd2DNAを制限酵素B
a1lで消化し、〜0.32kbAce I −Pvu
ll制限フラグメントの完全な配列を含有する〜2.4
kbBal[制限フラグメントを単離する。次いで、こ
の〜2.4kbBall制限フラグメントをAcclお
よびPvullで消化して所望のフラグメントを得る。
Ad2 DNA(BRLから入手可能)(約50μg
)を、dH,0(80d)およびIOX Ba1l緩衝
液C10C10Oリス−HC(1(pH7,6):12
0mMMgCL; loomM DTT;および1 m
9/ y(1BSA](10μ(1’)に溶解する。こ
のAl1 DNAの溶液に制限酵素Ba1l(10μ
Q;約20単位)を加え、得られた反応液を37°Cで
4時間インキュベートする。
)を、dH,0(80d)およびIOX Ba1l緩衝
液C10C10Oリス−HC(1(pH7,6):12
0mMMgCL; loomM DTT;および1 m
9/ y(1BSA](10μ(1’)に溶解する。こ
のAl1 DNAの溶液に制限酵素Ba1l(10μ
Q;約20単位)を加え、得られた反応液を37°Cで
4時間インキュベートする。
制限フラグメントが十分に分離するまで、Bal■消化
DNAを1%アガロースゲルt 気泳動i’:かける。
DNAを1%アガロースゲルt 気泳動i’:かける。
電気泳動したDNAの可視化は、臭化エチジウムの希釈
溶液(0,5μ9/*&)中でゲルを染色し、染色した
ゲルに長波長紫外(UV)光をあてることによって行う
。以下のように、アガロースからDNAを単離する。所
望のフラグメントを含有するゲルの細片(UV光によっ
て可視化した)をゲルから切り出し、エッベンドルフ試
験管に入れる。
溶液(0,5μ9/*&)中でゲルを染色し、染色した
ゲルに長波長紫外(UV)光をあてることによって行う
。以下のように、アガロースからDNAを単離する。所
望のフラグメントを含有するゲルの細片(UV光によっ
て可視化した)をゲルから切り出し、エッベンドルフ試
験管に入れる。
ゲル細片を含む試験管をまず一70’Cで放置するかま
たは氷上に置いてゲルを凍結させ、次いで、室温で放置
して解凍し、再度凍結および解凍した。
たは氷上に置いてゲルを凍結させ、次いで、室温で放置
して解凍し、再度凍結および解凍した。
これらの凍結−解凍を2回繰り返した後、試験管の液体
を集め、イソアミルアルコールで3 回連続抽出し、次
にエタノール沈澱してDNAフラグメントを液体から取
り出した。得られた精製フラグメントをTE緩衝液(1
0μg)に溶解する。
を集め、イソアミルアルコールで3 回連続抽出し、次
にエタノール沈澱してDNAフラグメントを液体から取
り出した。得られた精製フラグメントをTE緩衝液(1
0μg)に溶解する。
dI4to(約6μ&)およびIOX Accl緩衝液
[60mM NaCf2; 60+nM トリス−HC
&(pH7,5)6QmM MgCQt: 60mM
DTT、およびlay/rttQ B S A](2μ
12)を、Al1の〜2.4kbBa11制限フラグメ
ントの溶液に加える。このDNA溶液に制限酵素Acc
l(2μg;約10単位)を加えた後、反応液を37°
Cで2時間インキュベートする。このAccl消化後、
DNAをエタノール沈澱ニヨッテ集め、dHxo(16
μ(りおよび1OXPvull緩衝液[600a+M
NaCff; 60mM トリス−HCQ (pH7,
5); 60mM MgCL; 60mMDTT;およ
び1 m9/a(l B S Aコ(2uC)中に再懸
濁する。このDNA溶液に制限酵素PVIIII(約2
μQ;約10単位)を加えた後、反応液を37°Cで2
時間インキュベートする。
[60mM NaCf2; 60+nM トリス−HC
&(pH7,5)6QmM MgCQt: 60mM
DTT、およびlay/rttQ B S A](2μ
12)を、Al1の〜2.4kbBa11制限フラグメ
ントの溶液に加える。このDNA溶液に制限酵素Acc
l(2μg;約10単位)を加えた後、反応液を37°
Cで2時間インキュベートする。このAccl消化後、
DNAをエタノール沈澱ニヨッテ集め、dHxo(16
μ(りおよび1OXPvull緩衝液[600a+M
NaCff; 60mM トリス−HCQ (pH7,
5); 60mM MgCL; 60mMDTT;およ
び1 m9/a(l B S Aコ(2uC)中に再懸
濁する。このDNA溶液に制限酵素PVIIII(約2
μQ;約10単位)を加えた後、反応液を37°Cで2
時間インキュベートする。
Al1の後期プロモーターを含有する〜0.32kb
Ace I −Pvull制限フラグメントが他の消化
産物から分離するまで、Accl −Pvull消化し
たAl1の〜2.4kbBall制限フラグメントを〜
6%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。
Ace I −Pvull制限フラグメントが他の消化
産物から分離するまで、Accl −Pvull消化し
たAl1の〜2.4kbBall制限フラグメントを〜
6%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。
このゲルを臭化エチジウムで染色し、UV光を用いて観
察し、〜0.32kb Acc[−Pvull制限フラ
グメントを含有するゲルセグメントをゲルから切り出し
、つぶし、抽出緩衝液[500mM酢酸アンモニウム:
LOn+M酢酸マグネシウム;1mMEDTA 、およ
び0.1%SDS](250μの中に、室温で一夜浸漬
する。翌朝、この混合物を遠心し、ベレットを除去する
。上清中のDNAを工9/−ルで沈澱させ、tRNA(
約2μQ)を加えて所望のフラグメントの沈澱を完全な
ものにする。〜0゜32kb Accl−Pvull制
限フラグメント(約02μa)が得られ、これをdH,
o(7μのに懸濁させる。
察し、〜0.32kb Acc[−Pvull制限フラ
グメントを含有するゲルセグメントをゲルから切り出し
、つぶし、抽出緩衝液[500mM酢酸アンモニウム:
LOn+M酢酸マグネシウム;1mMEDTA 、およ
び0.1%SDS](250μの中に、室温で一夜浸漬
する。翌朝、この混合物を遠心し、ベレットを除去する
。上清中のDNAを工9/−ルで沈澱させ、tRNA(
約2μQ)を加えて所望のフラグメントの沈澱を完全な
ものにする。〜0゜32kb Accl−Pvull制
限フラグメント(約02μa)が得られ、これをdH,
o(7μのに懸濁させる。
実質的に下記実施例11Aに記載の方法に従ってキナー
ゼ処理しておいたBa1lリンカ−[5’ −CTGA
TCAG−3’ 、二ニー・イングランド・バイオラブ
ズから入手可能1(約0.25μy;0.5μσ中)を
、〜0.32kb Accl−Pvull制限フラグメ
ントの溶液に加え、次いでこのDNA溶液にTJ D
NAリガーゼ(1μQ;約1000単位)およびIOX
リガーゼ緩衝液[0,5M)リス−HC(+(pH7,
8)100mM MgCf2e; 200mM DTT
; IQmMATP;および0.5mg/lQ B
S A](1μ(りを加え、得られた反応液を16°C
で一夜インキユベートした。このBa1Iリンカ−は、
Δeel−Pvull制限フラグメントのPvull末
端にだけライゲートすることができた。後に行ったDN
A配列決定により、Δccl−Pvull制限フラグメ
ントのPvull末端には4個のBa1lリンカ−が結
合していることがわかった。これら余分のBcll!/
ンカーをBcll消化および再ライゲートによって除去
することができるが、余分のリンカ−はこれらリンカ−
を含有するベクターの正しい機能を妨害しないので、こ
れら余分のBa1lリンカ−を除去しなかった。
ゼ処理しておいたBa1lリンカ−[5’ −CTGA
TCAG−3’ 、二ニー・イングランド・バイオラブ
ズから入手可能1(約0.25μy;0.5μσ中)を
、〜0.32kb Accl−Pvull制限フラグメ
ントの溶液に加え、次いでこのDNA溶液にTJ D
NAリガーゼ(1μQ;約1000単位)およびIOX
リガーゼ緩衝液[0,5M)リス−HC(+(pH7,
8)100mM MgCf2e; 200mM DTT
; IQmMATP;および0.5mg/lQ B
S A](1μ(りを加え、得られた反応液を16°C
で一夜インキユベートした。このBa1Iリンカ−は、
Δeel−Pvull制限フラグメントのPvull末
端にだけライゲートすることができた。後に行ったDN
A配列決定により、Δccl−Pvull制限フラグメ
ントのPvull末端には4個のBa1lリンカ−が結
合していることがわかった。これら余分のBcll!/
ンカーをBcll消化および再ライゲートによって除去
することができるが、余分のリンカ−はこれらリンカ−
を含有するベクターの正しい機能を妨害しないので、こ
れら余分のBa1lリンカ−を除去しなかった。
大腸菌K12 HBIOI/pSV2cat細胞をAT
CCから取得番号ATCC37155のもと凍結乾燥品
として入手し、実質的に実施例3の方法に従ってこの細
胞からプラスミドpS V 2catD N Aを単離
した。プラスミドpsV2catの制限部位および機能
地図を添付の第3図に示す。プラスミドpsV2cat
DNA(約1 mg)が得られ、これをTE緩衝液(
1a12)に溶解する。プラスミドpsV2cat D
NA(約3μ9;3μff)を1QXAccI緩衝液(
2μのおよびdtr、o(i6μg)に加え、次いで制
限酵素Accl(3μe;約9単位)をpS v 2c
atDNAの溶液に加え、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。次に、10XStul緩衝液
[1,OM NaCg: 100mMトリスHC(lc
pH8,0>: l 00mM MgC(!t: 60
mMDTT;およびIQ/yff B S A](3μ
12)、dH,O(5μ&)、および制限酵素5tul
(約2u(1:約10単位)を加えることにより、この
Accl消化したプラスミドpsV2cat DNAを
制限酵素5tulで消化した。得られた反応液を37℃
で2時間インキュベートした。この反応混合物をフェノ
ールで1回、次いでクロロホルムで2回抽出することに
よって反応を停止させた。所望のフラグメント(約0.
5μQ)が得られ、これをTE緩衝液(20pのに溶解
した。
CCから取得番号ATCC37155のもと凍結乾燥品
として入手し、実質的に実施例3の方法に従ってこの細
胞からプラスミドpS V 2catD N Aを単離
した。プラスミドpsV2catの制限部位および機能
地図を添付の第3図に示す。プラスミドpsV2cat
DNA(約1 mg)が得られ、これをTE緩衝液(
1a12)に溶解する。プラスミドpsV2cat D
NA(約3μ9;3μff)を1QXAccI緩衝液(
2μのおよびdtr、o(i6μg)に加え、次いで制
限酵素Accl(3μe;約9単位)をpS v 2c
atDNAの溶液に加え、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。次に、10XStul緩衝液
[1,OM NaCg: 100mMトリスHC(lc
pH8,0>: l 00mM MgC(!t: 60
mMDTT;およびIQ/yff B S A](3μ
12)、dH,O(5μ&)、および制限酵素5tul
(約2u(1:約10単位)を加えることにより、この
Accl消化したプラスミドpsV2cat DNAを
制限酵素5tulで消化した。得られた反応液を37℃
で2時間インキュベートした。この反応混合物をフェノ
ールで1回、次いでクロロホルムで2回抽出することに
よって反応を停止させた。所望のフラグメント(約0.
5μQ)が得られ、これをTE緩衝液(20pのに溶解
した。
Accl−Stuf消化したプラスミドpsV2cat
DNA(約4μ12)を、Δd2の〜0.32kbAc
cl−Pvull(Bcl Iリンカ−が結合している
)制限フラグメント(約7μQ)と混合し、lOxリガ
ーゼ緩衝液(3μの、dH,0(15μQ)、およびT
4 DNAリガーゼ(2μQ;約1000単位)を加
えた後、このライゲーション反応液を16°Cで一夜イ
ンキユベートした。このライゲートしたDNAは所望の
プラスミドpLPcat、すなわち、Ad2の後期プロ
モーター(クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子を転写させるように配置されており、従っ
てこれを発現させる)を含有するプラスミドからなって
いた。
DNA(約4μ12)を、Δd2の〜0.32kbAc
cl−Pvull(Bcl Iリンカ−が結合している
)制限フラグメント(約7μQ)と混合し、lOxリガ
ーゼ緩衝液(3μの、dH,0(15μQ)、およびT
4 DNAリガーゼ(2μQ;約1000単位)を加
えた後、このライゲーション反応液を16°Cで一夜イ
ンキユベートした。このライゲートしたDNAは所望の
プラスミドpLPcat、すなわち、Ad2の後期プロ
モーター(クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子を転写させるように配置されており、従っ
てこれを発現させる)を含有するプラスミドからなって
いた。
実質的に実施例3の方法に従い、このライゲート化DN
Aを用いて大腸菌K12 HBIOI細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を、50μ9/酎アンピシリン含有の
し一寒天で平板培養した。プラスミドDNAの制限酵素
分析によって大腸菌に12 HB I O1/pL P
eat形質転換体を同定した。実質的に実施例3に記載
のプラスミド単離法に従って、後の構築に用いるために
プラスミドpLPcat DNAを形質転換体から単離
した。
Aを用いて大腸菌K12 HBIOI細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を、50μ9/酎アンピシリン含有の
し一寒天で平板培養した。プラスミドDNAの制限酵素
分析によって大腸菌に12 HB I O1/pL P
eat形質転換体を同定した。実質的に実施例3に記載
のプラスミド単離法に従って、後の構築に用いるために
プラスミドpLPcat DNAを形質転換体から単離
した。
B、プラスミドpLP(GT)catの構築■、プラス
ミドpLPcatからの構築dH,0(30I15)中
の実施例1で調製したポリーGT要素(約1μ9)を、
IOXコア(Core)緩衝液[50IIIMトリスー
HC12(pH8,0);l OmM MgCQ*:お
よび50n+M NaC12!](15μ&)およびd
Hlo(95μQ〉に加える。このポリーGT要素の溶
液に制限酵素Xhol (I 0tt(1:約100単
位)を加え、得られた反応液を37℃で3時間インキュ
ベートする。Xhol消化後、エタノール沈澱によって
DNAを集め、dti、o(7μm2)に再懸濁する。
ミドpLPcatからの構築dH,0(30I15)中
の実施例1で調製したポリーGT要素(約1μ9)を、
IOXコア(Core)緩衝液[50IIIMトリスー
HC12(pH8,0);l OmM MgCQ*:お
よび50n+M NaC12!](15μ&)およびd
Hlo(95μQ〉に加える。このポリーGT要素の溶
液に制限酵素Xhol (I 0tt(1:約100単
位)を加え、得られた反応液を37℃で3時間インキュ
ベートする。Xhol消化後、エタノール沈澱によって
DNAを集め、dti、o(7μm2)に再懸濁する。
TE緩?lI液(loμj)中のプラスミドpLPca
tDNA(約5μ9)を10Xコア緩衝液(10μQ)
およびdHlo(75μ12)に溶解する。Xhol(
5u(1:約60単位)をDNA溶液に加え、得られた
反応液を37°Cで2時間インキュベートする。この反
応混合液を、まずフェノール:クロロホルムで、次いで
クロロホルム:イソアミルアルコールで抽出して反応を
停止する。Xhor消化プラスミドpLPcatDNA
をエタノールで沈澱させ、TE緩衝液(100gのに再
懸濁した。以下のように、ウシ腸アルカリホスファター
ゼでXhol消化プラスミドρLPcatDNAを処理
する。Xho!消化プラスミドpLPcat DNAを
TE緩衝液でlOOμQに希釈し、この溶液にウシ腸ア
ルカリホスファターゼ[コラボレイティブ・リサーチ・
インコーホレーテッド(Collaborative
Re5earch、 Inc、、 128Sprin
g 5treet、 Lexington、 MA 0
2173](約0.06単位)を加え、得られた反応液
を37°Cで30分間インキュベートした。IX S
ET[5mMトリス−HC12(pH7,8); 5+
nM EDTA ;およびl 5mM Na(J!]、
0.3M酢酸ナトリウム、および0.5%SDSを含有
するように溶液を調整し、65°Cで45分間インキュ
ベートした。ホスファターゼ処理によって、pLPca
t DNAが自己ライゲートするのを防止する。DNA
をエタノール沈澱によって集め、次いでlOmM)リス
−HC12(pH8,0)緩衝液(10μQ)に再懸濁
した。
tDNA(約5μ9)を10Xコア緩衝液(10μQ)
およびdHlo(75μ12)に溶解する。Xhol(
5u(1:約60単位)をDNA溶液に加え、得られた
反応液を37°Cで2時間インキュベートする。この反
応混合液を、まずフェノール:クロロホルムで、次いで
クロロホルム:イソアミルアルコールで抽出して反応を
停止する。Xhor消化プラスミドpLPcatDNA
をエタノールで沈澱させ、TE緩衝液(100gのに再
懸濁した。以下のように、ウシ腸アルカリホスファター
ゼでXhol消化プラスミドρLPcatDNAを処理
する。Xho!消化プラスミドpLPcat DNAを
TE緩衝液でlOOμQに希釈し、この溶液にウシ腸ア
ルカリホスファターゼ[コラボレイティブ・リサーチ・
インコーホレーテッド(Collaborative
Re5earch、 Inc、、 128Sprin
g 5treet、 Lexington、 MA 0
2173](約0.06単位)を加え、得られた反応液
を37°Cで30分間インキュベートした。IX S
ET[5mMトリス−HC12(pH7,8); 5+
nM EDTA ;およびl 5mM Na(J!]、
0.3M酢酸ナトリウム、および0.5%SDSを含有
するように溶液を調整し、65°Cで45分間インキュ
ベートした。ホスファターゼ処理によって、pLPca
t DNAが自己ライゲートするのを防止する。DNA
をエタノール沈澱によって集め、次いでlOmM)リス
−HC12(pH8,0)緩衝液(10μQ)に再懸濁
した。
10Xリガーゼ緩衝液[0,5Mトリス−HC((pH
7,8); 100mM Mg(1!−: 200mM
DTT ; 10mM ATP ;および0.5a+
y/y(B SA](約1μのを、Xhol消化したホ
スファターゼ処理プラスミドpLPcat DNA(1
μ;約50n9)とXhor消化したポリーGT要素(
7μぐ:約100 ny)との混合物に加える。T4
DNAリガーゼ(1μQ;約1000単位)をDNA
溶液に加え、得られた反応液を16°Cで一夜インキコ
ベートする。
7,8); 100mM Mg(1!−: 200mM
DTT ; 10mM ATP ;および0.5a+
y/y(B SA](約1μのを、Xhol消化したホ
スファターゼ処理プラスミドpLPcat DNA(1
μ;約50n9)とXhor消化したポリーGT要素(
7μぐ:約100 ny)との混合物に加える。T4
DNAリガーゼ(1μQ;約1000単位)をDNA
溶液に加え、得られた反応液を16°Cで一夜インキコ
ベートする。
ライゲートしたDNAは、目的のプラスミド単離法 (
G T )catからなっている。プラスミドpLP(
GT)catの制限部位および機能地図を添付の第4図
に示す。
G T )catからなっている。プラスミドpLP(
GT)catの制限部位および機能地図を添付の第4図
に示す。
実質的に実施例3の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌K12 HBIOI細胞を形質転換する
。50μ9/好アンピシリン含有のし一寒天で形質転換
細胞を平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析を
用いて大腸菌K12HB 101/pL P(GT)c
at形質転換体を同定する。実質的に実施例3に記載の
プラスミド単離法に従って、後の構築のためにプラスミ
ドpLP(GT)cat DNAを形質転換体から単離
する。
を用いて大腸菌K12 HBIOI細胞を形質転換する
。50μ9/好アンピシリン含有のし一寒天で形質転換
細胞を平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析を
用いて大腸菌K12HB 101/pL P(GT)c
at形質転換体を同定する。実質的に実施例3に記載の
プラスミド単離法に従って、後の構築のためにプラスミ
ドpLP(GT)cat DNAを形質転換体から単離
する。
2、プラスミドpBL(GT)catからの構築別法と
して、以下の方法に従って、プラスミドpBL(GT)
cat DNA(下記実施例5に記載)かう始め、BK
エンハンサ−を含有するフラグメントを欠失させてプラ
スミドI) L P (G T )catを調製した。
して、以下の方法に従って、プラスミドpBL(GT)
cat DNA(下記実施例5に記載)かう始め、BK
エンハンサ−を含有するフラグメントを欠失させてプラ
スミドI) L P (G T )catを調製した。
トリス緩衝液[10mMトリス−HCf2(pf48.
0)](10μe)中の実施例5Bで調製したプラスミ
ドpBL(GT)cat DNA(約9 、51t9)
を、10X高塩緩衝液(10μQ)およびdH,0(6
9μのに加えた。制限酵素Mstll(約9μQ;約1
8単位)および制限酵素Bgl11(2μQ;約20単
位)をDNA溶液に加え、得られた反応液を37℃で2
時間インキコベートした。次に、上記のように、反応を
停止させ、DNAを抽出し、沈澱させた。DNA沈澱物
をdH,0(45μg)に溶解した。
0)](10μe)中の実施例5Bで調製したプラスミ
ドpBL(GT)cat DNA(約9 、51t9)
を、10X高塩緩衝液(10μQ)およびdH,0(6
9μのに加えた。制限酵素Mstll(約9μQ;約1
8単位)および制限酵素Bgl11(2μQ;約20単
位)をDNA溶液に加え、得られた反応液を37℃で2
時間インキコベートした。次に、上記のように、反応を
停止させ、DNAを抽出し、沈澱させた。DNA沈澱物
をdH,0(45μg)に溶解した。
実質的に実施例10の方法に従って、Mstll/Bg
ll+消化プラスミドpBL(GT)cat DNA(
45μのに10xクレ/つ緩衝液(5μQ)およびフレ
ノウ酵素[B RLによって市販されている](1μジ
;約5単位)を加え、インキユベートした。フレノウ処
理したMstll/ Bglll消化プラスミドpBL
(GT)cat DNAをフェノール;クロロホルムで
1回、クロロホルム:イソアミルアルコールで1回抽出
し、次いで、エタノールで沈澱させ、最後にトリス緩衝
液(10μm2)に再懸濁させた。
ll+消化プラスミドpBL(GT)cat DNA(
45μのに10xクレ/つ緩衝液(5μQ)およびフレ
ノウ酵素[B RLによって市販されている](1μジ
;約5単位)を加え、インキユベートした。フレノウ処
理したMstll/ Bglll消化プラスミドpBL
(GT)cat DNAをフェノール;クロロホルムで
1回、クロロホルム:イソアミルアルコールで1回抽出
し、次いで、エタノールで沈澱させ、最後にトリス緩衝
液(10μm2)に再懸濁させた。
フレノウ処理したMstll/ Bglll消化プラス
ミドpBL(GT)cat DNA(約1 uQ ;約
0 、5 Mg)に、10Xリガーゼ緩衝液(1μQ)
、dH,0(7μQ)およびT4DNAリガーゼ(lu
(!:約100単位)を加えた。得られた反応液を16
°Cで一夜インキコベートすると、ライゲートしたDN
Aは、目的のプラスミドp L P(GT)catの別
法による構築物(この構築物はプラスミドpB L (
G T )cat△Bgl+1 / M s t I
Iと称する)からなっていた。pBL(GT)catか
らの〜480bp Bglll/Mstl175グメン
トの欠失によってBKエンハンサ−が除去されるが、こ
れを実施例5AにおいてプラスミドpLPcatにライ
ゲートしてプラスミドpBLcatを創製する。
ミドpBL(GT)cat DNA(約1 uQ ;約
0 、5 Mg)に、10Xリガーゼ緩衝液(1μQ)
、dH,0(7μQ)およびT4DNAリガーゼ(lu
(!:約100単位)を加えた。得られた反応液を16
°Cで一夜インキコベートすると、ライゲートしたDN
Aは、目的のプラスミドp L P(GT)catの別
法による構築物(この構築物はプラスミドpB L (
G T )cat△Bgl+1 / M s t I
Iと称する)からなっていた。pBL(GT)catか
らの〜480bp Bglll/Mstl175グメン
トの欠失によってBKエンハンサ−が除去されるが、こ
れを実施例5AにおいてプラスミドpLPcatにライ
ゲートしてプラスミドpBLcatを創製する。
実施例5 プラスミドpBLcatおよびpBL(GT
)catの構築 A、プラスミドpBLcaLの構築 10XのAcc!緩衝液(7,5μの、dl−1,0(
30μ12)、および制限酵素Accl(15u12;
約75単位)に、TE緩衝液(50μの中のプラスミド
pBKne。
)catの構築 A、プラスミドpBLcaLの構築 10XのAcc!緩衝液(7,5μの、dl−1,0(
30μ12)、および制限酵素Accl(15u12;
約75単位)に、TE緩衝液(50μの中のプラスミド
pBKne。
IDNA(約88μg)を加え、得られた反応液を37
℃で2時間インキコベートした。Accl消化したBK
ウィルスDNAをアガロースゲルにかけ、BKエンハン
サ−を含有する〜1.4kbフラグメントを他の消化産
物から分離した。次いで、実施例4A記載の方法に実質
的に従って、〜1.4kbAcc!制限フラグメントを
単離した。このフラグメント(約5μ9)を、IQX
Pvull緩衝1(5μ0、dH,0(45u(1)
、および制限酵素Pvul!(5μ&;約25単位)中
に再懸濁し、得られた反応液を37℃で2時間インキュ
ベートした。次いで、実質的に実施例4Aの方法に従っ
て、Pvullf’l化したDNAをライゲーション用
に単離し、調製した。
℃で2時間インキコベートした。Accl消化したBK
ウィルスDNAをアガロースゲルにかけ、BKエンハン
サ−を含有する〜1.4kbフラグメントを他の消化産
物から分離した。次いで、実施例4A記載の方法に実質
的に従って、〜1.4kbAcc!制限フラグメントを
単離した。このフラグメント(約5μ9)を、IQX
Pvull緩衝1(5μ0、dH,0(45u(1)
、および制限酵素Pvul!(5μ&;約25単位)中
に再懸濁し、得られた反応液を37℃で2時間インキュ
ベートした。次いで、実質的に実施例4Aの方法に従っ
て、Pvullf’l化したDNAをライゲーション用
に単離し、調製した。
所望の〜1.28kb AccI−Pvullフラグメ
ントが約2μ9得られ、これをTE緩衝液(5μQ)に
溶解した。
ントが約2μ9得られ、これをTE緩衝液(5μQ)に
溶解した。
プラスミドpLPcat DNA(約1μg)を、10
XのAccl緩衝液(5uc)およびdH、O(40a
Q)に溶解した。制限酵素Accl(5μQ;約25単
位)をプラスミドpLPcat DNAの溶液に加え、
得られた反応液を37℃でインキュベートした。Acc
I消化したプラスミドpLPcatDNAをエタノール
テ沈澱させ、1QXstul緩衝液(5μC)、d H
x O(40μ12)、および制限酵素5tul(5μ
12;約25単位)中に再懸濁し、得られた反応液を3
7°Cで2時間インキュベートした。Accl −3t
uI消化したプラスミドPLPcat DNAをエタノ
ールで数回沈澱させて、他の消化産物(大きさが約16
bpの制限フラグメント)を含まない、大腸菌の複製起
源およびAd2後期プロモーターを含有する〜4.81
kb Accl −3tu[制限フラグメントを精うl
した。所望の〜4.81kb制限フラグメントが約1μ
9得られ、これをT E r& i!Jiiffl (
20μのに溶解した。
XのAccl緩衝液(5uc)およびdH、O(40a
Q)に溶解した。制限酵素Accl(5μQ;約25単
位)をプラスミドpLPcat DNAの溶液に加え、
得られた反応液を37℃でインキュベートした。Acc
I消化したプラスミドpLPcatDNAをエタノール
テ沈澱させ、1QXstul緩衝液(5μC)、d H
x O(40μ12)、および制限酵素5tul(5μ
12;約25単位)中に再懸濁し、得られた反応液を3
7°Cで2時間インキュベートした。Accl −3t
uI消化したプラスミドPLPcat DNAをエタノ
ールで数回沈澱させて、他の消化産物(大きさが約16
bpの制限フラグメント)を含まない、大腸菌の複製起
源およびAd2後期プロモーターを含有する〜4.81
kb Accl −3tu[制限フラグメントを精うl
した。所望の〜4.81kb制限フラグメントが約1μ
9得られ、これをT E r& i!Jiiffl (
20μのに溶解した。
プラスミドpLPcatの〜4.81kb Accl−
3tuI制限フラグメント(5μa>を、BKウィルス
の〜1.28kb Accl−Pvull制限フラグメ
ント(5pのに加えた。このDNA混合物に、10Xリ
ガーゼ1麦衝1夜(3μQ)、dH,0(15μσ)、
およびT4DNAリガーセ(2μQ;約1000単位)
を加えた後、得られたライゲーション反応液を16℃で
一夜インキユベートした。このライゲートしたDNAは
所望のプラスミドpBLcatからなっていた。
3tuI制限フラグメント(5μa>を、BKウィルス
の〜1.28kb Accl−Pvull制限フラグメ
ント(5pのに加えた。このDNA混合物に、10Xリ
ガーゼ1麦衝1夜(3μQ)、dH,0(15μσ)、
およびT4DNAリガーセ(2μQ;約1000単位)
を加えた後、得られたライゲーション反応液を16℃で
一夜インキユベートした。このライゲートしたDNAは
所望のプラスミドpBLcatからなっていた。
実施例3記載の方法に実質的に従い、このライゲート化
DNAを用いて大腸菌K12 HBIO1細胞を形質転
換した。プラスミドDNAの制限酵素分析によって、大
腸菌K12HB101./pBLcat形質転換体を同
定した。実質的に実施例3の方法に従って、後の構築に
用いるためにプラスミド1)BLcat DNAを調製
した。
DNAを用いて大腸菌K12 HBIO1細胞を形質転
換した。プラスミドDNAの制限酵素分析によって、大
腸菌K12HB101./pBLcat形質転換体を同
定した。実質的に実施例3の方法に従って、後の構築に
用いるためにプラスミド1)BLcat DNAを調製
した。
B、プラスミドpB L (G T )catの構築実
質的に実施例4B、lの方法に従って、dH。
質的に実施例4B、lの方法に従って、dH。
0(30μの中の実施例1で調製したポリーGT要素(
約lμg)をXholで消化した。実質的に実施例4B
、1の方法に従って、TE緩衝液(10μg)中のプラ
スミドpBLcat DNA(約23μg)をXh。
約lμg)をXholで消化した。実質的に実施例4B
、1の方法に従って、TE緩衝液(10μg)中のプラ
スミドpBLcat DNA(約23μg)をXh。
■で消化し、ホスファターゼ処理した。実質的に実施例
4B、1の方法に従って、Xhol消化したホスファタ
ーゼ処理プラスミドpBLcat DNAとXhol消
化ポリ−GT要素をライゲートした。
4B、1の方法に従って、Xhol消化したホスファタ
ーゼ処理プラスミドpBLcat DNAとXhol消
化ポリ−GT要素をライゲートした。
ライゲートしたDNAは目的のプラスミドpBL(GT
)catからなっていた。プラスミドpBL(GT)
catの制限部位および機能地図を添付の第5図に示す
。
)catからなっていた。プラスミドpBL(GT)
catの制限部位および機能地図を添付の第5図に示す
。
実質的に実施例3の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて、大腸菌に12 HBIOI細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を、50μ9/II(1アンピシリン
含有のし寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵
素分析を用いて、大腸菌に12 HB 101/pB
L(GT)cat形質転換体を同定した。実質的に実施
例3に記載のプラスミドの1i’i(4方法に従って、
形質転換体からプラスミドpBL(GT)cat DN
Aを単離した。
を用いて、大腸菌に12 HBIOI細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を、50μ9/II(1アンピシリン
含有のし寒天で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵
素分析を用いて、大腸菌に12 HB 101/pB
L(GT)cat形質転換体を同定した。実質的に実施
例3に記載のプラスミドの1i’i(4方法に従って、
形質転換体からプラスミドpBL(GT)cat DN
Aを単離した。
Ij裡M6 プラスミドpS B Lcatおよびp
s B L(G T )catの構築 A、プラスミドpS B Leatの1M築プラスミド
pBLcat DNA(約lOOμ9)を、10 X
H1ndlll緩衝液[0,5M NaC12; 0.
IM)’) ス−HCR(pH8,0); O,IM
MgC122;および1M9/酎BSAコ(10At
(りおよびdH,0(80μQ)に溶解した。制限酵素
)iindlll(約10μe約100単位)をプラス
ミドpBL、cat DNA溶液に加え、得られた反応
液を37°Cで2時間インキュベートした。BKエンハ
ンサ−およびAd2の後期プロモーターを含む〜0.8
7 kb Hindlll制限フラグメントが他の消化
産物から充分に分離されるまで)(indlll消化プ
ラスミドpBLcat DNAを1%アガロースゲル電
気泳動にかけ、次いで、実質的に実施例4Aの方法に従
って、〜0.87kbフラグメントを単離し、ライゲー
ション用に調製した。目的のフラグメントか約10u9
得られ、TE緩衝樹液0μgに溶解した。
s B L(G T )catの構築 A、プラスミドpS B Leatの1M築プラスミド
pBLcat DNA(約lOOμ9)を、10 X
H1ndlll緩衝液[0,5M NaC12; 0.
IM)’) ス−HCR(pH8,0); O,IM
MgC122;および1M9/酎BSAコ(10At
(りおよびdH,0(80μQ)に溶解した。制限酵素
)iindlll(約10μe約100単位)をプラス
ミドpBL、cat DNA溶液に加え、得られた反応
液を37°Cで2時間インキュベートした。BKエンハ
ンサ−およびAd2の後期プロモーターを含む〜0.8
7 kb Hindlll制限フラグメントが他の消化
産物から充分に分離されるまで)(indlll消化プ
ラスミドpBLcat DNAを1%アガロースゲル電
気泳動にかけ、次いで、実質的に実施例4Aの方法に従
って、〜0.87kbフラグメントを単離し、ライゲー
ション用に調製した。目的のフラグメントか約10u9
得られ、TE緩衝樹液0μgに溶解した。
TE緩衝1ffl(lμ12)中のプラスミドpSV2
catDNA(約1μg)を、l OX H1ndll
l緩衝液(2u(りおよびdH、o (16μQ)に溶
解した。制限酵素Hindlll(lμf!;約10単
位)をD N A溶液に加え、得られた反応液を37°
Cで2時間インキュベートした。反応混合物を、まずフ
ェノールで、次にクロロホルムで2回抽出することによ
って、反応を停止させた。Hindlllii′1化の
プラスミドpS V 2catDNAをエタノールで沈
澱させ、T E u ?!+液(100μg)に再懸濁
させた。実質的に実施例4Bの方法に従って、Hind
lll消化プラスミドpsv2catDNAを、ウシ腸
アルカリホスファターゼで処理し、TE緩衝液(10μ
g)に再懸濁させた。
catDNA(約1μg)を、l OX H1ndll
l緩衝液(2u(りおよびdH、o (16μQ)に溶
解した。制限酵素Hindlll(lμf!;約10単
位)をD N A溶液に加え、得られた反応液を37°
Cで2時間インキュベートした。反応混合物を、まずフ
ェノールで、次にクロロホルムで2回抽出することによ
って、反応を停止させた。Hindlllii′1化の
プラスミドpS V 2catDNAをエタノールで沈
澱させ、T E u ?!+液(100μg)に再懸濁
させた。実質的に実施例4Bの方法に従って、Hind
lll消化プラスミドpsv2catDNAを、ウシ腸
アルカリホスファターゼで処理し、TE緩衝液(10μ
g)に再懸濁させた。
プラスミドpBLcatの〜0.87kb Hindl
ll制限フラグメント(約5μe)をHindltl消
化のプラスミドpS V 2 cat(10μ0に加え
、次いで10 X !Jガーゼ緩衝液(3μQ、)、T
4 DNAリガーゼ(2μQ;約1000単位)、お
よびdHto (13uQ)を、DNA溶液に加え、得
られた反応液を16°Cて2時間インキュベートした。
ll制限フラグメント(約5μe)をHindltl消
化のプラスミドpS V 2 cat(10μ0に加え
、次いで10 X !Jガーゼ緩衝液(3μQ、)、T
4 DNAリガーゼ(2μQ;約1000単位)、お
よびdHto (13uQ)を、DNA溶液に加え、得
られた反応液を16°Cて2時間インキュベートした。
ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドpsBLc
atからなっていた。
atからなっていた。
実質的に実施例3の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて、大腸菌に12HB101を形質転換した。形
質転換細胞を、アンピシリン含有の■、−寒天において
平板培養し、アンピシリン耐性形質転換体のプラスミド
DNAを制限酵素分析によって試験して大腸菌K 12
HB 101/pSBLcat形質転換体を同定した
。BKエンハンサ−およびΔd2の後期プロモーターを
コードしている〜0.87kb Hindlll制限フ
ラグメントは、Hindlll消化プラスミドpsBL
catに、2つの配向のうちのどちらかで挿入されてい
る(どちらか一方だけがプラスミドpS B Lcat
を生じる)。
を用いて、大腸菌に12HB101を形質転換した。形
質転換細胞を、アンピシリン含有の■、−寒天において
平板培養し、アンピシリン耐性形質転換体のプラスミド
DNAを制限酵素分析によって試験して大腸菌K 12
HB 101/pSBLcat形質転換体を同定した
。BKエンハンサ−およびΔd2の後期プロモーターを
コードしている〜0.87kb Hindlll制限フ
ラグメントは、Hindlll消化プラスミドpsBL
catに、2つの配向のうちのどちらかで挿入されてい
る(どちらか一方だけがプラスミドpS B Lcat
を生じる)。
B、プラスミドpS B L (G T )catの構
築実質的に実施例4B川の方法に従って、BKエンハン
サ−とAd2の後期プロモーターの間にある、プラスミ
ドpS B Lcatの唯一のXho1部位にポリーG
T要素を挿入する。Xhol消化のポリーGT要素およ
びXhol消化のプラスミドpSBLcatDNへをラ
イゲートする。ライゲートしたDN Aは、目的のプラ
スミドpS B L (G T )catからなってい
る。プラスミドpS B L (G T )catの制
限部位および機能地図を添付の第6図に示す。
築実質的に実施例4B川の方法に従って、BKエンハン
サ−とAd2の後期プロモーターの間にある、プラスミ
ドpS B Lcatの唯一のXho1部位にポリーG
T要素を挿入する。Xhol消化のポリーGT要素およ
びXhol消化のプラスミドpSBLcatDNへをラ
イゲートする。ライゲートしたDN Aは、目的のプラ
スミドpS B L (G T )catからなってい
る。プラスミドpS B L (G T )catの制
限部位および機能地図を添付の第6図に示す。
実施例7 プラスミドpL133の構築A、中間体プラ
スミドpsV2−HPC8の構築プラスミドpHC7は
ヒトプロティンCをコードしているDNA配列を含有し
ている。15μg/Xgテトラサイクリン含有のしブロ
ス(lのに大腸菌に12 RRI/pHC7(NRRL
B−15926,1985年1月29日寄託)の培養
物を接種し、実質的に実施例3の方法に従ってプラスミ
ドpHC7DNAを単離し、精製した。この操作により
約1y9のプラスミドp)IC7DNAが得られ、これ
をTE緩衝液(IIρ)に懸濁し1、−20’Cで保存
した。プラスミドpHC7の制限部位および機能地図を
添付の第7図に示す。
スミドpsV2−HPC8の構築プラスミドpHC7は
ヒトプロティンCをコードしているDNA配列を含有し
ている。15μg/Xgテトラサイクリン含有のしブロ
ス(lのに大腸菌に12 RRI/pHC7(NRRL
B−15926,1985年1月29日寄託)の培養
物を接種し、実質的に実施例3の方法に従ってプラスミ
ドpHC7DNAを単離し、精製した。この操作により
約1y9のプラスミドp)IC7DNAが得られ、これ
をTE緩衝液(IIρ)に懸濁し1、−20’Cで保存
した。プラスミドpHC7の制限部位および機能地図を
添付の第7図に示す。
ブーtスミFpHC7DNA(50μf2)を、制限酵
素Ban1(5μに約50単位)、IOXのBan1反
応緩衝液[1,5M Na1J!; 60mMhリスー
HC&(pH7,9): 60mM MgCf22;お
よびl巧/肩QBSAコ(10μI2)およびdH,o
(35μのと混合し、消化が完結するまでインキュベー
トした。次いで、〜1.25kb Ban■制限フラグ
メントが他の消化産物から分離するまで、このBan1
?tn化したプラスミドpHC7DNAを3.5%ポリ
アクリルアミドゲル(アクリルアミド:ビスアクリルア
ミド−29: l)電気泳動にかけた。
素Ban1(5μに約50単位)、IOXのBan1反
応緩衝液[1,5M Na1J!; 60mMhリスー
HC&(pH7,9): 60mM MgCf22;お
よびl巧/肩QBSAコ(10μI2)およびdH,o
(35μのと混合し、消化が完結するまでインキュベー
トした。次いで、〜1.25kb Ban■制限フラグ
メントが他の消化産物から分離するまで、このBan1
?tn化したプラスミドpHC7DNAを3.5%ポリ
アクリルアミドゲル(アクリルアミド:ビスアクリルア
ミド−29: l)電気泳動にかけた。
コノ〜i、 25kb Ban1 制限フラグメントを
含有するゲル部分をゲルから切り出し、試験管に入れ、
小さいフラグメントに破砕した。このフラグメントを含
有する試験管に抽出緩衝液[500mM酢酸アンモニウ
ム:10mM0mM酢酸マグネ/ラム EDTA ;
J%SDS、およびfozg/x(!tRNA](l肩
Q)を加え、試験管を37°Cに一夜1♀った。遠心し
て残骸をペレット化し、上清を新しい試験管に移した。
含有するゲル部分をゲルから切り出し、試験管に入れ、
小さいフラグメントに破砕した。このフラグメントを含
有する試験管に抽出緩衝液[500mM酢酸アンモニウ
ム:10mM0mM酢酸マグネ/ラム EDTA ;
J%SDS、およびfozg/x(!tRNA](l肩
Q)を加え、試験管を37°Cに一夜1♀った。遠心し
て残骸をペレット化し、上清を新しい試験管に移した。
残骸を抽出緩衝液(200μQ)で1回洗浄し、洗浄液
の上清を、最初の、夜抽出物からの上清といっしょにし
た。この上cRをガラスウールのプラグに通した後、2
倍量のエタノールを加え、混合した。得られた溶液を〜
lO分間ドライアイスーエタノール浴に入れ、次いで遠
心してDNAをペレット化した。
の上清を、最初の、夜抽出物からの上清といっしょにし
た。この上cRをガラスウールのプラグに通した後、2
倍量のエタノールを加え、混合した。得られた溶液を〜
lO分間ドライアイスーエタノール浴に入れ、次いで遠
心してDNAをペレット化した。
この操作により約8μ9の〜1.25kbBanl制限
フラグメントが得られた。この精製フラグメントをTE
緩衝液(loμ6)に懸濁し、−20°Cで保存した。
フラグメントが得られた。この精製フラグメントをTE
緩衝液(loμ6)に懸濁し、−20°Cで保存した。
プラスミドpSV2−HPCBを構築するためには、リ
ンカ−の付加によってBan1制限フラグメントを修飾
しなければならなかった。実質的に実施例1記載の方法
に従ってリンカ−の構築に用いるDNAフラグメントを
合成した。
ンカ−の付加によってBan1制限フラグメントを修飾
しなければならなかった。実質的に実施例1記載の方法
に従ってリンカ−の構築に用いるDNAフラグメントを
合成した。
T4ポリヌクレオチドキナーゼ(約0.5μa;15単
位)、IOX リガーゼ緩衝液(2μl!>、500
μMATP(IQμの、およびdt−t、o(7,5μ
m2)を含む反応緩衝液(20μQ)中で、合成した1
本鎖リンカ−のそれぞれ500ピコモル(pM)をキナ
ーゼ処理した。このキナーゼ反応液を37°Cで30分
間インキユベートシ、次いで100℃で10分間インキ
ュベートして反応を止めた。キナーゼ化を完全にするた
め、反応液を水上で冷却し、反応混合物に0.2M D
DT(2μQ)、5mMATP(2,5μI2)、およ
びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(15単位)を加えて
lし、この反応混合物を37°Cでさらに30分間イン
キュベートした。100°Cでさらに10分間インキュ
ベートすることによって反応を止め、次いで水上で冷却
した。
位)、IOX リガーゼ緩衝液(2μl!>、500
μMATP(IQμの、およびdt−t、o(7,5μ
m2)を含む反応緩衝液(20μQ)中で、合成した1
本鎖リンカ−のそれぞれ500ピコモル(pM)をキナ
ーゼ処理した。このキナーゼ反応液を37°Cで30分
間インキユベートシ、次いで100℃で10分間インキ
ュベートして反応を止めた。キナーゼ化を完全にするた
め、反応液を水上で冷却し、反応混合物に0.2M D
DT(2μQ)、5mMATP(2,5μI2)、およ
びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(15単位)を加えて
lし、この反応混合物を37°Cでさらに30分間イン
キュベートした。100°Cでさらに10分間インキュ
ベートすることによって反応を止め、次いで水上で冷却
した。
キナーゼ処理は別々に行ったが、キナーゼ反応後、2種
類の1本鎖DNAリンカ−を混合した。
類の1本鎖DNAリンカ−を混合した。
これらの鎖をアニールするため、キナーゼ反応混合物を
、約150ff12の水を入れた水浴中、100℃で1
0分間インキュベートした。インキュベーション後、水
浴の加熱を止め、室温まで冷却した。
、約150ff12の水を入れた水浴中、100℃で1
0分間インキュベートした。インキュベーション後、水
浴の加熱を止め、室温まで冷却した。
この過程に約3時間かかった。次いで、キナーゼ処理し
たDNAの試験管を入れたまま水浴を4°Cで一夜イン
キユベートした。この操作により1本鎖がアニールされ
た。作成したリンカ−は以下の構造を有していた: このリンカ−を使用時まで一20℃で保存した。
たDNAの試験管を入れたまま水浴を4°Cで一夜イン
キユベートした。この操作により1本鎖がアニールされ
た。作成したリンカ−は以下の構造を有していた: このリンカ−を使用時まで一20℃で保存した。
〜1.25kb Ban1フラグメント(約8 μy)
を、リンカ−(〜50μe;約500pM)、T4
DNAリガーゼ(lμQ;約500単位)、IOXリガ
ーゼ綬衝液樹液0μQ)、およびdH,o(29μg)
に加えて混合し、得られたライゲージジン反応液を4°
Cで一夜インキユベートした。65°Cで10分間イン
キュベートすることによってライゲーション反応を止め
た。最終濃度が0.3Mとなるように酢酸ナトリウムを
加え、2倍量のエタノールを加え、ドライアイス−エタ
ノール浴で冷却し、そしてこの溶液を遠心することによ
ってDNAをペレット化した。
を、リンカ−(〜50μe;約500pM)、T4
DNAリガーゼ(lμQ;約500単位)、IOXリガ
ーゼ綬衝液樹液0μQ)、およびdH,o(29μg)
に加えて混合し、得られたライゲージジン反応液を4°
Cで一夜インキユベートした。65°Cで10分間イン
キュベートすることによってライゲーション反応を止め
た。最終濃度が0.3Mとなるように酢酸ナトリウムを
加え、2倍量のエタノールを加え、ドライアイス−エタ
ノール浴で冷却し、そしてこの溶液を遠心することによ
ってDNAをペレット化した。
このDNAペレットを、IOXのApa1反応緩衝液[
60mM NaCf2; 60+nM トリス−HC&
(pH7,4); 60ff+M MgCL;および6
0 mM(7) 2−メルカプトエタノール](10μ
m2)、制御a酵x A pal(5μC;約50単位
)およびdHto(85μm2)に溶解し、反応液を3
7°Cで2時間保った。次いで上記のようにして反応を
止め、DNAをペレット化した。このDNAぺL/ ノ
ドを、IOXのHind[l1反応緩衝液(lou&)
、制限酵素H1ndlll(5μ& :約50中位)お
よびdH,o(85μのに溶解し、反応液を37°Cで
2時間保った。Hindlll消化後、実質的に実施例
4Aに記載の方法に従って、反応混合物を3.5%ポリ
アクリルアミドゲルにかけ、目的の〜1.23kb H
ind!II−Apar制限フラグメントを単離した。
60mM NaCf2; 60+nM トリス−HC&
(pH7,4); 60ff+M MgCL;および6
0 mM(7) 2−メルカプトエタノール](10μ
m2)、制御a酵x A pal(5μC;約50単位
)およびdHto(85μm2)に溶解し、反応液を3
7°Cで2時間保った。次いで上記のようにして反応を
止め、DNAをペレット化した。このDNAぺL/ ノ
ドを、IOXのHind[l1反応緩衝液(lou&)
、制限酵素H1ndlll(5μ& :約50中位)お
よびdH,o(85μのに溶解し、反応液を37°Cで
2時間保った。Hindlll消化後、実質的に実施例
4Aに記載の方法に従って、反応混合物を3.5%ポリ
アクリルアミドゲルにかけ、目的の〜1.23kb H
ind!II−Apar制限フラグメントを単離した。
目的のフラグメントが約5μ9得られ、これをTE緩衝
液(10μQ)に懸濁し、20°Cで保存した。
液(10μQ)に懸濁し、20°Cで保存した。
プラスミドpi−1c7 DNA(50μQ)を、制
限酵素Pstl(5u12;約50単位)、IOX P
st1反応緩衝液[1,OM NaCQ; l 00m
M トリス−HCC(pH7−5) ; l OOmM
MgCQt ;およびlay/肩ffBsA](10
μQ)およびdH,o(35μρ)と混合し、37°C
で2時間インキユヘートした。次いで、実質的に上記記
載の方法に従って、Pstl消化したプラスミドpHC
7DNAを、3,5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけ、目的の〜0.88kbフラグメントを精製した
。目的のフラグメントが約5μ9得られ、これをTE
fib ?h液(10μQ)に懸濁し、−20°Cで保
存した。
限酵素Pstl(5u12;約50単位)、IOX P
st1反応緩衝液[1,OM NaCQ; l 00m
M トリス−HCC(pH7−5) ; l OOmM
MgCQt ;およびlay/肩ffBsA](10
μQ)およびdH,o(35μρ)と混合し、37°C
で2時間インキユヘートした。次いで、実質的に上記記
載の方法に従って、Pstl消化したプラスミドpHC
7DNAを、3,5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけ、目的の〜0.88kbフラグメントを精製した
。目的のフラグメントが約5μ9得られ、これをTE
fib ?h液(10μQ)に懸濁し、−20°Cで保
存した。
この〜0.88 kb Pst Iフラグメント(約5
uy)を、実施例1に記載の自動DNA合成機で作成
した以下のリンカ−(約50μQ)に加えて混合した:
このDNA混合物に、T4 DNAリガーゼ(約lμ
q;約10単位)、IOXのりガーゼ緩衝液(10μの
、およびdH,0(29μg)を加え、得られたライゲ
ーション反応液を4°Cで一夜インキユベートした。
uy)を、実施例1に記載の自動DNA合成機で作成
した以下のリンカ−(約50μQ)に加えて混合した:
このDNA混合物に、T4 DNAリガーゼ(約lμ
q;約10単位)、IOXのりガーゼ緩衝液(10μの
、およびdH,0(29μg)を加え、得られたライゲ
ーション反応液を4°Cで一夜インキユベートした。
このライゲーション反応を、65°Cで10分間インキ
ュベートすることによって止めた。ライゲート化たDN
Aを沈澱させた後、DNAベレットをIOXのApa1
反応緩衝液(10μの、制限酵素Apa!(5μ(2;
約50単位)およびdH、O(85μ(りに溶解し、反
応液を37°Cで2時間保った。次いでもう一度反応を
止め、DNAをペレット化した。
ュベートすることによって止めた。ライゲート化たDN
Aを沈澱させた後、DNAベレットをIOXのApa1
反応緩衝液(10μの、制限酵素Apa!(5μ(2;
約50単位)およびdH、O(85μ(りに溶解し、反
応液を37°Cで2時間保った。次いでもう一度反応を
止め、DNAをペレット化した。
このDNAベレットを、IOXのBgll+反応緩衝液
[IM NaCf!: 100mM トリフ、 −HC
f2(pH74): I 00mM MgC(h: l
00mM 2−メルカブトエタ/−ル;および11
19/酎BSA](10μQ)、ff(1限fi?iB
glll(5u(! ;約50単位)およびdH,○(
85μQ)に溶解し、反応液を37°Cで2時間保った
。8gl11消化の後、実質的に上記の方法に従って、
反応混合物を3.5%ポリアクリルアミドケルにかけ、
目的の〜O,I 9kb Apal −8glll制限
フラグメントを単離した。目的のフラグメントが約1μ
7得られ、これをTE緩衝液(10μI2)に懸濁し、
−20°Cで保存した。
[IM NaCf!: 100mM トリフ、 −HC
f2(pH74): I 00mM MgC(h: l
00mM 2−メルカブトエタ/−ル;および11
19/酎BSA](10μQ)、ff(1限fi?iB
glll(5u(! ;約50単位)およびdH,○(
85μQ)に溶解し、反応液を37°Cで2時間保った
。8gl11消化の後、実質的に上記の方法に従って、
反応混合物を3.5%ポリアクリルアミドケルにかけ、
目的の〜O,I 9kb Apal −8glll制限
フラグメントを単離した。目的のフラグメントが約1μ
7得られ、これをTE緩衝液(10μI2)に懸濁し、
−20°Cで保存した。
公的に入手可能なプラスミドpSV2gptDNA(A
TCC37145)(約lOμLi)を、loXHin
dlll反応緩衝液(10μ12)、制限酵素Hind
lll(5u(!;約50単位)およびdHto(85
μ(りに溶解し、反応液を37℃で2時間作った。次い
でこの反応混合物を、酢酸ナトリウムが0.25Mとな
るようにし、2倍量のエタノールを加えてドライアイス
−エタノール浴でインキュベートした後、遠心してDN
Aをペレット化した。このDNAベレットを、IOX
8glll緩衝液(10μの、制限酵素Bg111(5
μ&;約50単位)およびdH,0(85μQ)と混合
し、反応液を37℃で2時間保った。
TCC37145)(約lOμLi)を、loXHin
dlll反応緩衝液(10μ12)、制限酵素Hind
lll(5u(!;約50単位)およびdHto(85
μ(りに溶解し、反応液を37℃で2時間作った。次い
でこの反応混合物を、酢酸ナトリウムが0.25Mとな
るようにし、2倍量のエタノールを加えてドライアイス
−エタノール浴でインキュベートした後、遠心してDN
Aをペレット化した。このDNAベレットを、IOX
8glll緩衝液(10μの、制限酵素Bg111(5
μ&;約50単位)およびdH,0(85μQ)と混合
し、反応液を37℃で2時間保った。
Bg+lIitM化の後、反応混合物を1%のアガロー
スゲルにかけ、電気泳動してフラグメントを分離した。
スゲルにかけ、電気泳動してフラグメントを分離した。
ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で見える
ようにし、目的の〜5. lkb HindlllBg
l11フラグメントを含有するバンドをゲルから切り出
し、これを透析管に入れ、DNAがアガロースから溶出
してしまうまで電気泳動を続けた。
ようにし、目的の〜5. lkb HindlllBg
l11フラグメントを含有するバンドをゲルから切り出
し、これを透析管に入れ、DNAがアガロースから溶出
してしまうまで電気泳動を続けた。
透析管からのDNA含有緩衝液をフェノールおよびクロ
ロホルムで抽出し、次いでDNAをエタノール沈澱させ
た。このベレットは目的のプラスミドpSV2gptの
〜5. lkb Hindlll−8glll制限フラ
グメント(約5u9)からなり、これをTE緩衝液(1
0μm2)に再懸濁した。
ロホルムで抽出し、次いでDNAをエタノール沈澱させ
た。このベレットは目的のプラスミドpSV2gptの
〜5. lkb Hindlll−8glll制限フラ
グメント(約5u9)からなり、これをTE緩衝液(1
0μm2)に再懸濁した。
〜1.23kb Hindlll−Apalルミl制限
フラグメントの、〜0. l 9kb Apal−8g
lllフラグメント(3μi2)、および〜5. lk
b Hindlll−8glllフラグメント(2μg
)を混合し、次いで、lOxリガーゼ緩衝液(10μの
、T4 DNAリガーゼ(1μQ;約500単位)、
およびdH,0(82μのとともに16°Cで一夜イン
キユベートした。このライゲートしたDNAは目的のプ
ラスミドルS v 20 P C8からなっていた。こ
のプラスミドの制限部位および機能地図を添付の第7図
に示す。
フラグメントの、〜0. l 9kb Apal−8g
lllフラグメント(3μi2)、および〜5. lk
b Hindlll−8glllフラグメント(2μg
)を混合し、次いで、lOxリガーゼ緩衝液(10μの
、T4 DNAリガーゼ(1μQ;約500単位)、
およびdH,0(82μのとともに16°Cで一夜イン
キユベートした。このライゲートしたDNAは目的のプ
ラスミドルS v 20 P C8からなっていた。こ
のプラスミドの制限部位および機能地図を添付の第7図
に示す。
大腸菌K12 RRI(NRRL B−15210
,1982年10月190寄託)細胞を、実質的に実施
例3に記載の方法に従い、形質転換用にコンピテントに
した。上記調製のライゲート化DNAを用いてこの細胞
を形質転換した。形質転換混合物の一部を、100μ9
/x(lアンピシリン含有のL−寒天プレートで平板培
養した。次いで、このプレートを37°Cでインキュベ
ートした。プラスミドDNAの制限酵素分析によって大
腸菌K12RR1/pSV2−HPC3形質転換体を確
認した。
,1982年10月190寄託)細胞を、実質的に実施
例3に記載の方法に従い、形質転換用にコンピテントに
した。上記調製のライゲート化DNAを用いてこの細胞
を形質転換した。形質転換混合物の一部を、100μ9
/x(lアンピシリン含有のL−寒天プレートで平板培
養した。次いで、このプレートを37°Cでインキュベ
ートした。プラスミドDNAの制限酵素分析によって大
腸菌K12RR1/pSV2−HPC3形質転換体を確
認した。
B、プラスミドpL133の最終的な構築プラスミドp
SV2−HPC8(50μ9)を、10xのHindl
l1反応緩衝液(10u(1’)、制限酵素H1ndl
l!(511Q :約50単位)およびdH,O(85
μのに溶解し、反応液を37℃で2時間インキュベート
した。Hindlll#化の後、DNAを沈澱させ、そ
のDNAペレットをIOX 5μl1反応緩衝液[1,
5M NaCQ; 60mM トリス−HC&(pH7
,9); 60mM MgCC,; 60mM 2−
メルカプトエタノール:および1λ9/RQ B S
A](10μf2)、制限酵素5all(5μff:約
50単位)およびdH,0(85μg)に溶解した。得
られた5μl1反応混合物を37°Cで2時間インキュ
ベートした。次に、目的の〜0.29 kb H1nd
lll −S at I制限フラグメントが他の反応生
成物から分離するまで、このH1ndlll −S a
l I消化したプラスミドpSV2−HPC8を3.5
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。実質的に
上記入に記載の方法に従って、目的のフラグメントをゲ
ルから分離した。このフラグメントが約2ug得られ、
これをTE緩衝液(10μ12)に懸濁した。
SV2−HPC8(50μ9)を、10xのHindl
l1反応緩衝液(10u(1’)、制限酵素H1ndl
l!(511Q :約50単位)およびdH,O(85
μのに溶解し、反応液を37℃で2時間インキュベート
した。Hindlll#化の後、DNAを沈澱させ、そ
のDNAペレットをIOX 5μl1反応緩衝液[1,
5M NaCQ; 60mM トリス−HC&(pH7
,9); 60mM MgCC,; 60mM 2−
メルカプトエタノール:および1λ9/RQ B S
A](10μf2)、制限酵素5all(5μff:約
50単位)およびdH,0(85μg)に溶解した。得
られた5μl1反応混合物を37°Cで2時間インキュ
ベートした。次に、目的の〜0.29 kb H1nd
lll −S at I制限フラグメントが他の反応生
成物から分離するまで、このH1ndlll −S a
l I消化したプラスミドpSV2−HPC8を3.5
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。実質的に
上記入に記載の方法に従って、目的のフラグメントをゲ
ルから分離した。このフラグメントが約2ug得られ、
これをTE緩衝液(10μ12)に懸濁した。
ブラフ、ミl’psV2−HPC8(50μ9)を、1
0X Bgll1反応緩衝液(tOμの、制限酵素Bg
111(5μC;約50単位)、およびdH*o(85
μのに溶解し、反応液を37°Cで2時間インキュベー
トした。Bgll+消化の後、DNAを沈澱させ、その
DNAペレットをIQX 5μff反応緩衝液(10μ
Q)、制限酵素(5μQ;約50単位)、およびdH2
0(85μQ)に溶解した。得られたS al1反応反
応物を37°Cで2時間インキュベートした。目的の〜
1. l 5kb Salt−8glll制限フラグメ
ントが他の反応生成物から分離するまで、このSall
−Bgll+消化プラスミドpSV2−HPCBを3.
5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。実質的
に上記Aに記載の方法に従って、〜1.15kb Sa
ll−8glll制限フラグメントをゲルから分離して
約8μ嘗のフラグメントを得、これをTE緩衛液(10
μg)に懸濁させた。
0X Bgll1反応緩衝液(tOμの、制限酵素Bg
111(5μC;約50単位)、およびdH*o(85
μのに溶解し、反応液を37°Cで2時間インキュベー
トした。Bgll+消化の後、DNAを沈澱させ、その
DNAペレットをIQX 5μff反応緩衝液(10μ
Q)、制限酵素(5μQ;約50単位)、およびdH2
0(85μQ)に溶解した。得られたS al1反応反
応物を37°Cで2時間インキュベートした。目的の〜
1. l 5kb Salt−8glll制限フラグメ
ントが他の反応生成物から分離するまで、このSall
−Bgll+消化プラスミドpSV2−HPCBを3.
5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。実質的
に上記Aに記載の方法に従って、〜1.15kb Sa
ll−8glll制限フラグメントをゲルから分離して
約8μ嘗のフラグメントを得、これをTE緩衛液(10
μg)に懸濁させた。
プラスミドpsv2−β−グロビンD N A (NR
RL B−15928,1985年1月29日寄託)
(約10μ9)を、IOXのHindll1反応緩衝液
(10uff)、制限酵素H1ndlll(5μ(2;
約50単位)およびd Ht O(85d) ニ溶解し
、反応液を37°Cテ2時間保った。次いでこの反応混
合物を、酢酸ナトリウムが0.25Mとなるようにし、
2倍量のエタノールを加えてドライアイス−エタノール
浴でインキュベートした後、遠心してDNAをベレット
化した。このHindllr消化したプラスミドpSV
2−9−グoビアDNAを、IOX Bglll緩i
i&(10μ(り、制限酵素Bg+1l(5u12;約
50単位)およびdH,o(85μg)と混合し、反応
液を37℃で2時間保った。Bg目1消化の後、反応混
合物を1%のアガロースゲルにかけ、電気泳動によって
フラグメントを分離した。実質的に実施例4Aに記載の
方法に従って、目的の〜4.2kbHind111−B
glll制限フラグメントをゲルから分離して約5μ9
の目的フラグメントを得、これをTE緩衝液(10μの
に懸濁させた。
RL B−15928,1985年1月29日寄託)
(約10μ9)を、IOXのHindll1反応緩衝液
(10uff)、制限酵素H1ndlll(5μ(2;
約50単位)およびd Ht O(85d) ニ溶解し
、反応液を37°Cテ2時間保った。次いでこの反応混
合物を、酢酸ナトリウムが0.25Mとなるようにし、
2倍量のエタノールを加えてドライアイス−エタノール
浴でインキュベートした後、遠心してDNAをベレット
化した。このHindllr消化したプラスミドpSV
2−9−グoビアDNAを、IOX Bglll緩i
i&(10μ(り、制限酵素Bg+1l(5u12;約
50単位)およびdH,o(85μg)と混合し、反応
液を37℃で2時間保った。Bg目1消化の後、反応混
合物を1%のアガロースゲルにかけ、電気泳動によって
フラグメントを分離した。実質的に実施例4Aに記載の
方法に従って、目的の〜4.2kbHind111−B
glll制限フラグメントをゲルから分離して約5μ9
の目的フラグメントを得、これをTE緩衝液(10μの
に懸濁させた。
”jラスミ)’pSV2−HPC8(7)〜0.29k
bH1ndfll −S al Iフラグメント(2μ
ρ)、プラスミドpsV2−HPC8の〜1.15kb
5all’−8glllフラグメント(2μQ)、
およびプラスミドI)SV2−β−グロビンの〜4.2
kb Hindlll−8glllフラグメント(2μ
l)を混合し、実質的に上記Aの方法に従ってライゲー
トした。このライゲートしたDNAは目的のプラスミド
pL133からなっていた。このプラスミドpL133
の制限部位および機能地図を添付の第7図に示す。形質
転換するDNAとして、プラスミドpSV2−HPCB
のかわりにプラスミドpL133を用いること以外は、
実質的にへの教示に従って、目的の大腸菌KI2 R
RI/pL133形質転換体を作成した。
bH1ndfll −S al Iフラグメント(2μ
ρ)、プラスミドpsV2−HPC8の〜1.15kb
5all’−8glllフラグメント(2μQ)、
およびプラスミドI)SV2−β−グロビンの〜4.2
kb Hindlll−8glllフラグメント(2μ
l)を混合し、実質的に上記Aの方法に従ってライゲー
トした。このライゲートしたDNAは目的のプラスミド
pL133からなっていた。このプラスミドpL133
の制限部位および機能地図を添付の第7図に示す。形質
転換するDNAとして、プラスミドpSV2−HPCB
のかわりにプラスミドpL133を用いること以外は、
実質的にへの教示に従って、目的の大腸菌KI2 R
RI/pL133形質転換体を作成した。
実施例8プラスミドpLPCおよびpLPC(GT)の
構築 A、プラスミドpLPCの構築 実施例5Aで調製したプラスミドpBLcatDNA(
約20uy)を、l OX H1ndlll緩衝液(1
0μQ)およびdx−i2o(80μI2)に溶解した
。このプラスミドpBLcat DNA溶液に制限酵素
Hindlll(約10μρ;約100単位)を加え、
得られた反応液を37°Cで2時間インキュベートした
。次いで、BKエンハンサ−およびAd2後期プロ(−
一夕−を含有する〜0.87 kb H1ndlll制
限フラグメントが曲の消化産物から分離するまで、この
HindII肖化したプラスミドpBLcat DNA
を1%アガロースゲル電気泳動にかけ、次いで、実質的
に実施例4Aの方法に従って、〜0.87kbフラグメ
ントを単離し、ライゲーション用に調製した。
構築 A、プラスミドpLPCの構築 実施例5Aで調製したプラスミドpBLcatDNA(
約20uy)を、l OX H1ndlll緩衝液(1
0μQ)およびdx−i2o(80μI2)に溶解した
。このプラスミドpBLcat DNA溶液に制限酵素
Hindlll(約10μρ;約100単位)を加え、
得られた反応液を37°Cで2時間インキュベートした
。次いで、BKエンハンサ−およびAd2後期プロ(−
一夕−を含有する〜0.87 kb H1ndlll制
限フラグメントが曲の消化産物から分離するまで、この
HindII肖化したプラスミドpBLcat DNA
を1%アガロースゲル電気泳動にかけ、次いで、実質的
に実施例4Aの方法に従って、〜0.87kbフラグメ
ントを単離し、ライゲーション用に調製した。
目的のフラグメントが約2u9得られ、これをTE緩衝
液(5μQ)に溶解した。
液(5μQ)に溶解した。
実施例7で調製したプラスミドpL133DNA(約1
.5μg)を、10 X H1ndll!緩衝液(21
)およびdt−(、○(16μQ)に溶解した。このD
NA溶液に制限酵素)1indlll(約1μに約10
単位)を加え、得られた反応液を37°Cで2時間イン
キユベートシた。次いで、このDNAをTE緩衝液で1
00μQまで希釈し、実質的に実施例3記載の方法に従
って、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。この
Hindllli肖化のプラスミドpL133DNAを
フェノールで2回、クロロホルムで1回抽出し、エタ/
−ルで沈澱させ、TE緩衝液(10μQ)に再懸濁した
。
.5μg)を、10 X H1ndll!緩衝液(21
)およびdt−(、○(16μQ)に溶解した。このD
NA溶液に制限酵素)1indlll(約1μに約10
単位)を加え、得られた反応液を37°Cで2時間イン
キユベートシた。次いで、このDNAをTE緩衝液で1
00μQまで希釈し、実質的に実施例3記載の方法に従
って、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。この
Hindllli肖化のプラスミドpL133DNAを
フェノールで2回、クロロホルムで1回抽出し、エタ/
−ルで沈澱させ、TE緩衝液(10μQ)に再懸濁した
。
プラスミドpBLcatの〜0.87kb Hindl
ll制限フラグメント(約5μg)を、Hindll!
消化したプラスミドpL133(1,5μのに加え、次
いでこのDNA溶液に、IOXリガーセ緩面液(1μの
、T4DNAIIガーセ(1μC;約1000単位)、
およびdH,o(1,5μQ)を加え、得られた反応液
を16°Cで一夜インキユベートした。このライケート
したDNAは目的のプラスミドpLPCからなっていた
。
ll制限フラグメント(約5μg)を、Hindll!
消化したプラスミドpL133(1,5μのに加え、次
いでこのDNA溶液に、IOXリガーセ緩面液(1μの
、T4DNAIIガーセ(1μC;約1000単位)、
およびdH,o(1,5μQ)を加え、得られた反応液
を16°Cで一夜インキユベートした。このライケート
したDNAは目的のプラスミドpLPCからなっていた
。
このライゲート化DNAを用い、実質的に実施例3の方
法に従って大腸菌K12 )(Blotを形質転換した
。形質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平板培
養し、制限酵素分析によってアンビンリン耐性形質転換
体のプラスミドDNAを試験して、大腸菌K ] 2
HB 101/pt、pc形質転換体を同定した。B
Kエンハンサ−およびAd2後期プロモーターをコード
している〜0,87 kb H1ndlll制限フラグ
メントは、Hindll!消化したプラスミドpL13
3中に、2つの配向のうちのどちらかで挿入されている
(どちらか一方だけがプラスミドpLPCを生じる)。
法に従って大腸菌K12 )(Blotを形質転換した
。形質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平板培
養し、制限酵素分析によってアンビンリン耐性形質転換
体のプラスミドDNAを試験して、大腸菌K ] 2
HB 101/pt、pc形質転換体を同定した。B
Kエンハンサ−およびAd2後期プロモーターをコード
している〜0,87 kb H1ndlll制限フラグ
メントは、Hindll!消化したプラスミドpL13
3中に、2つの配向のうちのどちらかで挿入されている
(どちらか一方だけがプラスミドpLPCを生じる)。
目的のプラスミドpLPC(GT)を得るために、構築
においてプラスミドpBLcatの〜0.87kbHi
ndlllフラグメントの代わりにプラスミドpBL
(G T )catの〜0.93 kb H1ndl[
Iフラグメントを用いる以外は、上記Aと同様の方法で
プラスミドpLPC(GT)を調製した。BKエンハン
サ−、ポリーGT要素およびAd2後期プロモーターを
コードしている〜0 、93 kb H1ndlll制
限フラグメントは、Hindlll消化プラスミドpL
133中に、2つの配向のうちどちらかで挿入すること
かできる[どちらか一方だけがプラスミドpLPC(G
T)を生じる]。プラスミドpLPC(GT)の制限部
位および機能地図を添付の第8図に示す。
においてプラスミドpBLcatの〜0.87kbHi
ndlllフラグメントの代わりにプラスミドpBL
(G T )catの〜0.93 kb H1ndl[
Iフラグメントを用いる以外は、上記Aと同様の方法で
プラスミドpLPC(GT)を調製した。BKエンハン
サ−、ポリーGT要素およびAd2後期プロモーターを
コードしている〜0 、93 kb H1ndlll制
限フラグメントは、Hindlll消化プラスミドpL
133中に、2つの配向のうちどちらかで挿入すること
かできる[どちらか一方だけがプラスミドpLPC(G
T)を生じる]。プラスミドpLPC(GT)の制限部
位および機能地図を添付の第8図に示す。
プラスミドpi、pcおよびpLPC(GT)の唯一の
相違点は、プラスミドpLPC(GT)にポリー〇T要
素が存在していることである。
相違点は、プラスミドpLPC(GT)にポリー〇T要
素が存在していることである。
別法によれば、実質的に実施例4B、1の方法ニ従って
、BKエンハンサ−とAd2後期プロモーターの間にあ
る、プラスミドpLPCの唯一のXho1部位にポリー
GT要素を挿入することによってプラスミドpLPC(
GT)を調製する。
、BKエンハンサ−とAd2後期プロモーターの間にあ
る、プラスミドpLPCの唯一のXho1部位にポリー
GT要素を挿入することによってプラスミドpLPC(
GT)を調製する。
衷奥形プラスミドpLPC4、pLPC5、pt、 l
:) C4,(、G T)およびpLPC5(GT)の
構築A、プラスミドpt、pc4およびpLPC5の構
築実施例2で調製したBKウィルスDNA(約1μ9.
1μm2)および実施例8Aで調製したプラスミドpL
PC(Jμl Lμのを、l0XEcoRI緩衝液[1
,0Mト+7スーHC((pH7,5); 0.5MN
aC12 : 50mM MgC(2:およびI m9
/ x(l B SA](2μI2)およびcu]、0
(14μQ)に溶解した。制限酵素EcoRl (2μ
ρ;約10単位)をDNA溶液に加え、得られた反応液
を37°Cで2時間インキュベートした。EcoR[c
白化した、BKウィルスとプラスミドpLPCDNAの
混合物を緩衝化フェノールで1回、およびクロロホルム
で1回抽出シた。次いで、NaC(lンa度を0.25
Mに調整し、2漬けのフェノールを加え、この溶液をド
ライアイス−エタノール浴で2分間インキュベートし、
この溶液を遠心してDNAをペレット化することによっ
てD N Aを集めた。上清を廃棄し、DNAペレット
を70%エタノールで洗浄し、乾燥し、TE緩衝液12
μQに再懸濁した。
:) C4,(、G T)およびpLPC5(GT)の
構築A、プラスミドpt、pc4およびpLPC5の構
築実施例2で調製したBKウィルスDNA(約1μ9.
1μm2)および実施例8Aで調製したプラスミドpL
PC(Jμl Lμのを、l0XEcoRI緩衝液[1
,0Mト+7スーHC((pH7,5); 0.5MN
aC12 : 50mM MgC(2:およびI m9
/ x(l B SA](2μI2)およびcu]、0
(14μQ)に溶解した。制限酵素EcoRl (2μ
ρ;約10単位)をDNA溶液に加え、得られた反応液
を37°Cで2時間インキュベートした。EcoR[c
白化した、BKウィルスとプラスミドpLPCDNAの
混合物を緩衝化フェノールで1回、およびクロロホルム
で1回抽出シた。次いで、NaC(lンa度を0.25
Mに調整し、2漬けのフェノールを加え、この溶液をド
ライアイス−エタノール浴で2分間インキュベートし、
この溶液を遠心してDNAをペレット化することによっ
てD N Aを集めた。上清を廃棄し、DNAペレット
を70%エタノールで洗浄し、乾燥し、TE緩衝液12
μQに再懸濁した。
dH,0(約13μm2)およびIOXリガーゼ緩衝液
(3uQ)を、EcoRI消化した、BKウィルスとプ
ラスミドpLPCDNAの混合物に加えた。T4DNA
リガーゼ(2μg;約100単位)をDNA溶液に加え
、得られた反応液を16°Cで2時間インキュベートし
た。ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドpLP
C4およびpLPC5(挿入されたBKウィルスDNA
の配向だけが異なる)からなっていた。
(3uQ)を、EcoRI消化した、BKウィルスとプ
ラスミドpLPCDNAの混合物に加えた。T4DNA
リガーゼ(2μg;約100単位)をDNA溶液に加え
、得られた反応液を16°Cで2時間インキュベートし
た。ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドpLP
C4およびpLPC5(挿入されたBKウィルスDNA
の配向だけが異なる)からなっていた。
ライゲートしたDNAは、目的のpLPC4およびpL
、PO2からなっており、実質的に実施例3の方法に従
って、これを用いて大腸菌K12HBIOIコンピテン
ト細胞を形質転換した。形質転換細胞をlOOμ9/峠
アンピシリン含有のL−寒天で平板培養した。大腸菌に
12 HBIQ1/pL P C4オヨヒ大腸mK12
HBIOI/pLPC5形質転換体を、そのアンピシ
リン耐性表現型およびそのプラスミドDNAの制限酵素
分析によって同定した。
、PO2からなっており、実質的に実施例3の方法に従
って、これを用いて大腸菌K12HBIOIコンピテン
ト細胞を形質転換した。形質転換細胞をlOOμ9/峠
アンピシリン含有のL−寒天で平板培養した。大腸菌に
12 HBIQ1/pL P C4オヨヒ大腸mK12
HBIOI/pLPC5形質転換体を、そのアンピシ
リン耐性表現型およびそのプラスミドDNAの制限酵素
分析によって同定した。
B、プラスミドpt、pc4(c”r)およびpLPC
5(GT)の構築 プラスミドpLPCの代わりに、実施例8Bで調製した
プラスミドpLPC(GT)を構築に用いる以外は、p
LPC4およびpLPC5に関する上記へと同じ方法で
プラスミドpLPC4(GT)およびpLPC5(GT
)を調製する。別に、実質的に実施例4B、1の方法に
従って、各々、プラスミドpL、PC4およびpLPC
5の唯一のXho1部位にポリーGT要素を挿入するこ
とによって、プラスミドpLPC4(GT)およびpL
P、C3(GT)を調製する。プラスミドpLPC4(
GT)の制限部位および機能地図を添付の第9図に示す
。
5(GT)の構築 プラスミドpLPCの代わりに、実施例8Bで調製した
プラスミドpLPC(GT)を構築に用いる以外は、p
LPC4およびpLPC5に関する上記へと同じ方法で
プラスミドpLPC4(GT)およびpLPC5(GT
)を調製する。別に、実質的に実施例4B、1の方法に
従って、各々、プラスミドpL、PC4およびpLPC
5の唯一のXho1部位にポリーGT要素を挿入するこ
とによって、プラスミドpLPC4(GT)およびpL
P、C3(GT)を調製する。プラスミドpLPC4(
GT)の制限部位および機能地図を添付の第9図に示す
。
(以下、余白)
実施例10 プラスミドpL P Chyg 1、pt
、pchyg 2、pLPchyg1(GT)およびp
LPCbyg2(GT)の構築 A、プラスミドpLPcbyglおよびpLPChyg
2q通困 大腸菌K 12 RR1/pS V 2hyg細胞を
、NRRLから取得番号NRRL B−18039のも
とで入手する。実質的に実施例3の方法に従って、この
細胞からプラスミドpSV2hygDNAを得る。プラ
スミドpS V 2 hygの制限部位および機能地図
を添付の第10図に示す。
、pchyg 2、pLPchyg1(GT)およびp
LPCbyg2(GT)の構築 A、プラスミドpLPcbyglおよびpLPChyg
2q通困 大腸菌K 12 RR1/pS V 2hyg細胞を
、NRRLから取得番号NRRL B−18039のも
とで入手する。実質的に実施例3の方法に従って、この
細胞からプラスミドpSV2hygDNAを得る。プラ
スミドpS V 2 hygの制限部位および機能地図
を添付の第10図に示す。
プラスミドpS V 2 hyg(約10μ9; TE
緩衝液10μσ中)を10X10XBa緩衝液(2μ+
2)およびdH!O(6μQ)に加えた。このDNA溶
液に制限酵素Ba5HI(2μ(2:約20単位)を加
え、得られた反応液を37°Cで2時間インキュベート
した。この反応液を始めにフェノールで抽出し、次いで
クロロホルムで2回抽出した。実質的に実施例4Aに記
載の方法に従って、このBaa+HI消化したプラスミ
ドpSV2hyg DNAを1%アガロースゲルにかけ
、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する〜2.5kb
の制限フラグメントを単離した。
緩衝液10μσ中)を10X10XBa緩衝液(2μ+
2)およびdH!O(6μQ)に加えた。このDNA溶
液に制限酵素Ba5HI(2μ(2:約20単位)を加
え、得られた反応液を37°Cで2時間インキュベート
した。この反応液を始めにフェノールで抽出し、次いで
クロロホルムで2回抽出した。実質的に実施例4Aに記
載の方法に従って、このBaa+HI消化したプラスミ
ドpSV2hyg DNAを1%アガロースゲルにかけ
、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する〜2.5kb
の制限フラグメントを単離した。
10Xクレノウ緩衝液[4種類のdNTPそれぞれが0
.2mM: 0.5M ト’) ス−HC12(pH7
,8):50mM MgOム;O,1M2−メルカプト
エタノール;および100μ9/肩12BsA](約5
μQ)およびdHt O(35uのを、BamHI消化
したプラスミドpSV2hygDNAの溶液に加え、次
にこのDNA7i!合物にフレノウ酵素(BRLから市
販)(約25単位;約5μQ)を加え、得られた反応液
を16℃で30分間インキコベートした。このフレノウ
処理してBamHI消化したプラスミドpsV2hyg
DNΔをフェノールで1回、クロロホルムで1回抽出し
、次いでエタノールで沈澱させた。目的のフラグメント
が約2μ9得られ、これをTEi衝液樹液μg)に懸濁
させた。
.2mM: 0.5M ト’) ス−HC12(pH7
,8):50mM MgOム;O,1M2−メルカプト
エタノール;および100μ9/肩12BsA](約5
μQ)およびdHt O(35uのを、BamHI消化
したプラスミドpSV2hygDNAの溶液に加え、次
にこのDNA7i!合物にフレノウ酵素(BRLから市
販)(約25単位;約5μQ)を加え、得られた反応液
を16℃で30分間インキコベートした。このフレノウ
処理してBamHI消化したプラスミドpsV2hyg
DNΔをフェノールで1回、クロロホルムで1回抽出し
、次いでエタノールで沈澱させた。目的のフラグメント
が約2μ9得られ、これをTEi衝液樹液μg)に懸濁
させた。
プラスミドpLPCDNA(約lOμ9:10μのを、
IOX 5tul緩衝液(2u12)およびdHto(
6μg)に加えた。このDNA溶液に、制限酵素S t
ulく2μ12:約10単位)を加え、得られた反応液
を37℃で2時間インキュベートした。この5tul消
化したプラスミドpLPCDNAをエタノールで沈澱さ
せ、遠心して集め、lOxのNdeI緩衝液[1,5M
NaCQ: 0.1M)リス−HC12(PH7゜8
); 70mM MgCQ−; 60mM 2−メルカ
プトエタノール;および1次9IRQ B S Al(
2μQ)およびaH,0(16u12)に再懸濁した。
IOX 5tul緩衝液(2u12)およびdHto(
6μg)に加えた。このDNA溶液に、制限酵素S t
ulく2μ12:約10単位)を加え、得られた反応液
を37℃で2時間インキュベートした。この5tul消
化したプラスミドpLPCDNAをエタノールで沈澱さ
せ、遠心して集め、lOxのNdeI緩衝液[1,5M
NaCQ: 0.1M)リス−HC12(PH7゜8
); 70mM MgCQ−; 60mM 2−メルカ
プトエタノール;および1次9IRQ B S Al(
2μQ)およびaH,0(16u12)に再懸濁した。
この5tul消化したDNAの溶液に、制限酵素Nde
l(2μ12;約10単位)を加え、得られた反応液を
37℃で2時間インキスペードした。
l(2μ12;約10単位)を加え、得られた反応液を
37℃で2時間インキスペードした。
Ndel−3jul消化したプラスミドpLPCDNA
をエタノールで沈澱させ、遠心して集め、1QX(D9
L//’7緩衝液(5uff)およびciH,o(40
μm2)に再懸濁した。このDNA溶液にフレノウ酵素
(5μe:約25単位)を加え、得られた反応液を16
℃で30分間インキュベートした。フレノウ反応の後、
反応混合物を1%アガロースゲルにかけ、〜5.82k
b Ndel−3tul制限フラグメントをゲルから単
離した。目的のフラグメントが約5μ2得られ、これを
TE緩衝液(5μm2)に懸濁させた。
をエタノールで沈澱させ、遠心して集め、1QX(D9
L//’7緩衝液(5uff)およびciH,o(40
μm2)に再懸濁した。このDNA溶液にフレノウ酵素
(5μe:約25単位)を加え、得られた反応液を16
℃で30分間インキュベートした。フレノウ反応の後、
反応混合物を1%アガロースゲルにかけ、〜5.82k
b Ndel−3tul制限フラグメントをゲルから単
離した。目的のフラグメントが約5μ2得られ、これを
TE緩衝液(5μm2)に懸濁させた。
プラスミドpS V 2 hygの〜2.5kbのフレ
ノウ処理したBamf(I制限フラグメント(約2μQ
)を、プラスミドpLPCの〜5.82kbのフレ/つ
処理したNdel−3tul制限フラグメント(約1μ
Q)と混合し、このDNA溶液に、10Xリガーゼ緩衝
液(約3μQ)、T4 DNAリガーゼ(2μQ;約
1000単位)、T4 RNΔNd−ゼ(1μQ;約
1単位)、およびdHto (14uQ)を加えた。得
られた反応液を16℃で一夜インキユベートした。この
ライゲートしたDNAは目的のプラスミドpLPChy
glおよびpLPChyg2からなり、それらはプラス
ミドpSV2hygの〜2.5kbのフレノウ処理した
Bamt(I制限フラグメントの配向だけが異なってい
た。このライゲート化DNAを用い、実質的に実施例3
の方法に従って、大腸[11K 12HBIQIを形質
転換した。目的の大腸菌に12HB 101/pL P
Chyglおよび大腸菌K12HB 101/pL P
Chyg2形質転換体を、アンピシリン含有のし一寒天
で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析によっ
て同定した。
ノウ処理したBamf(I制限フラグメント(約2μQ
)を、プラスミドpLPCの〜5.82kbのフレ/つ
処理したNdel−3tul制限フラグメント(約1μ
Q)と混合し、このDNA溶液に、10Xリガーゼ緩衝
液(約3μQ)、T4 DNAリガーゼ(2μQ;約
1000単位)、T4 RNΔNd−ゼ(1μQ;約
1単位)、およびdHto (14uQ)を加えた。得
られた反応液を16℃で一夜インキユベートした。この
ライゲートしたDNAは目的のプラスミドpLPChy
glおよびpLPChyg2からなり、それらはプラス
ミドpSV2hygの〜2.5kbのフレノウ処理した
Bamt(I制限フラグメントの配向だけが異なってい
た。このライゲート化DNAを用い、実質的に実施例3
の方法に従って、大腸[11K 12HBIQIを形質
転換した。目的の大腸菌に12HB 101/pL P
Chyglおよび大腸菌K12HB 101/pL P
Chyg2形質転換体を、アンピシリン含有のし一寒天
で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析によっ
て同定した。
実質的に実施例4B、1の方法に従って、BKエンハン
サ−とAd2後期プロモーターとの間にある、プラスミ
ドpLPchyglまたはpLPChyg2の唯一のX
hor部位にポリーGT要素を挿入する。Xhol消化
したポリーGT要素とXholL、た消化プラスミドp
LPchyglまたはpLPChyg2DNAをライゲ
ートする。このライゲートしたDNAは各々目的のプラ
スミドpL P Chyg 1. (GT)およびpL
PChyg2(GT)からなる。プラスミドpL P
Chyg 1 (G T)の制限部位および機能地図を
添付の第11図に示す。
サ−とAd2後期プロモーターとの間にある、プラスミ
ドpLPchyglまたはpLPChyg2の唯一のX
hor部位にポリーGT要素を挿入する。Xhol消化
したポリーGT要素とXholL、た消化プラスミドp
LPchyglまたはpLPChyg2DNAをライゲ
ートする。このライゲートしたDNAは各々目的のプラ
スミドpL P Chyg 1. (GT)およびpL
PChyg2(GT)からなる。プラスミドpL P
Chyg 1 (G T)の制限部位および機能地図を
添付の第11図に示す。
実施例11 プラスミドpBW32の構築A、中間体プ
ラスミドpTPA103の構築プラスミドpTPA10
2はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)の
暗号配列を含有している。プラスミドpTPA102は
大腸菌に12 MM294/pTP、AlO2[この菌
株はNRRLから取得番号NRRL B−15834(
1984年8月10日寄託)のもとて入手可能である]
から単離することができる。プラスミドpTPA102
の制限部位および機能地図を添付の第12図に示す。プ
ラスミドI)TPA102 DNAを、実質的に実施
例3の方法に従って、大腸菌K12MM294/pTP
A102から単離する。
ラスミドpTPA103の構築プラスミドpTPA10
2はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)の
暗号配列を含有している。プラスミドpTPA102は
大腸菌に12 MM294/pTP、AlO2[この菌
株はNRRLから取得番号NRRL B−15834(
1984年8月10日寄託)のもとて入手可能である]
から単離することができる。プラスミドpTPA102
の制限部位および機能地図を添付の第12図に示す。プ
ラスミドI)TPA102 DNAを、実質的に実施
例3の方法に従って、大腸菌K12MM294/pTP
A102から単離する。
プラスミドpTPA102(約50μ9: TE緩衝液
約50u(l中)を、10 Xノrtht1ul衝1f
fl[0゜5M NaCQ: 80mMトリス−HcQ
cpH7,4);80mM MgC&−; 80mM
2−メルカプトエタノール;およびl R9/村BSA
](10μQ)およびdH、O(80u(りに加えた。
約50u(l中)を、10 Xノrtht1ul衝1f
fl[0゜5M NaCQ: 80mMトリス−HcQ
cpH7,4);80mM MgC&−; 80mM
2−メルカプトエタノール;およびl R9/村BSA
](10μQ)およびdH、O(80u(りに加えた。
このDNA溶液に制限酵素T thlllI(10μQ
:約50単位)を加え、得られた反応液を65°Cで2
時間インキュベートした。
:約50単位)を加え、得られた反応液を65°Cで2
時間インキュベートした。
この反応混合物を1%アガロースゲルにかけ、]゛PA
暗号配列を含有する〜4 、4 kb T thlll
l制限フラグメントをゲルから単離した。その他の消化
産物、即ち3.1kbおよび0.5kb制限フラグメン
トは廃棄した。目的の〜4 、4 kb T thil
l+制限フラグメントが約10μ9得られ、これをTE
緩衝液(10μm2)に懸濁させた。
暗号配列を含有する〜4 、4 kb T thlll
l制限フラグメントをゲルから単離した。その他の消化
産物、即ち3.1kbおよび0.5kb制限フラグメン
トは廃棄した。目的の〜4 、4 kb T thil
l+制限フラグメントが約10μ9得られ、これをTE
緩衝液(10μm2)に懸濁させた。
〜4.4 kb ′rthllll制限フラグメントを
含む溶液にIOXのフレノウ緩衝液(約5μI2)オよ
びdH7O(30μのを加え、さらにフレノウ酵素(5
μQ;約5単位)を加えた後、この反応混合物を16°
Cで30分間インキュベートした。フレノウ反応の後、
DNAをエタノールで沈澱させ、IOXのりガーゼ緩衝
液(3μm2)およびdHto(14μのに再懸濁させ
た。
含む溶液にIOXのフレノウ緩衝液(約5μI2)オよ
びdH7O(30μのを加え、さらにフレノウ酵素(5
μQ;約5単位)を加えた後、この反応混合物を16°
Cで30分間インキュベートした。フレノウ反応の後、
DNAをエタノールで沈澱させ、IOXのりガーゼ緩衝
液(3μm2)およびdHto(14μのに再懸濁させ
た。
配列;
で示されるBamHIリンカ−(二ニー・イングランド
・バイオラブズ)を以下の方法によってキナーゼ処理し
、ライゲーション用に調製した。りンカー(4μ(2:
約2μ9)を、dH,o(20,15μ12)およびI
OX キナーゼ緩衝液[500…MトリスーHCQ(p
H7,6)および100 mM MgCC*] (5u
のに溶解し、90°Cで2分間インキニベートシ、次い
で室温まで冷却した。この混合物に、γ−32pΔTP
(5μff;約20 mc i)、IM DTT(2,
5mQ)およびポリヌクレオチドキナーゼ(5μe;約
lO単位)を加え、得られた反応液を37°Cで30分
間インキュベートした。次いで、loxMATP(約3
.35μ(1’)およびキナーゼ(5μのを加え、反応
液を37°Cでさらに30分間保った。この放射活性A
TPは、リンカ−が標的DNAにライゲートしたかどう
かを決定するのに役立つ。
・バイオラブズ)を以下の方法によってキナーゼ処理し
、ライゲーション用に調製した。りンカー(4μ(2:
約2μ9)を、dH,o(20,15μ12)およびI
OX キナーゼ緩衝液[500…MトリスーHCQ(p
H7,6)および100 mM MgCC*] (5u
のに溶解し、90°Cで2分間インキニベートシ、次い
で室温まで冷却した。この混合物に、γ−32pΔTP
(5μff;約20 mc i)、IM DTT(2,
5mQ)およびポリヌクレオチドキナーゼ(5μe;約
lO単位)を加え、得られた反応液を37°Cで30分
間インキュベートした。次いで、loxMATP(約3
.35μ(1’)およびキナーゼ(5μのを加え、反応
液を37°Cでさらに30分間保った。この放射活性A
TPは、リンカ−が標的DNAにライゲートしたかどう
かを決定するのに役立つ。
キナーゼ処理したBamHIリンカ−(約10μのを〜
4 、4 kb Tthlll+制限フラグメントの溶
液に加え、さらにT4 RNAリガーゼ(2μQ;約
2単位)を加えた後、このライゲーション反応液を40
0で一夜インキユベートした。このライゲートしたDN
Aをエタノールで沈澱させ、lOXのHindll+緩
衝液(5μのおよびdH,0(40μ12)f:再懸濁
させた。このDNA溶液に制限酵素Hindlll(5
μC;約50単位)を加え、得られた反応液を3700
で2時間インキュベートした。
4 、4 kb Tthlll+制限フラグメントの溶
液に加え、さらにT4 RNAリガーゼ(2μQ;約
2単位)を加えた後、このライゲーション反応液を40
0で一夜インキユベートした。このライゲートしたDN
Aをエタノールで沈澱させ、lOXのHindll+緩
衝液(5μのおよびdH,0(40μ12)f:再懸濁
させた。このDNA溶液に制限酵素Hindlll(5
μC;約50単位)を加え、得られた反応液を3700
で2時間インキュベートした。
このHindlll消化したDNAをエタノールで沈澱
させ、lOX10XBa緩衝液(約10μのおよびdH
,0(90μCt>に再懸濁させた。このDNA溶液に
制限酵素BamHI(1011(1:約100単位)を
加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベート
した。BamHI消化の後、反応混合物を1%アガロー
スゲルにかけ、実質的に実施例4Aの方法に従って、〜
2.OkbのB amHI −H1ndl II制限フ
ラグメントをゲルから単離した。目的のフラグメントが
約4μ9得られ、これをTEfJ衝液(樹液μQ)に懸
濁させた。
させ、lOX10XBa緩衝液(約10μのおよびdH
,0(90μCt>に再懸濁させた。このDNA溶液に
制限酵素BamHI(1011(1:約100単位)を
加え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベート
した。BamHI消化の後、反応混合物を1%アガロー
スゲルにかけ、実質的に実施例4Aの方法に従って、〜
2.OkbのB amHI −H1ndl II制限フ
ラグメントをゲルから単離した。目的のフラグメントが
約4μ9得られ、これをTEfJ衝液(樹液μQ)に懸
濁させた。
プラスミドpTPA103を構築するために、プラスミ
ドpTPA102由来の〜2.OkbBamHI −H
1ndll!制限フラグメントを、Ba1HI−[(i
ndlll消化したプラスミドpRCに挿入した。
ドpTPA102由来の〜2.OkbBamHI −H
1ndll!制限フラグメントを、Ba1HI−[(i
ndlll消化したプラスミドpRCに挿入した。
プラスミドpRCは、大腸菌Lrpオペロンのプロモー
ターおよびオペレーター(trpPO)配列を含有する
〜288bp EcoRI −CIaI制限フラグメン
トを、EcoRl−C1al消化したプラスミドpKC
7に挿入することによって構築した。プラスミドpKC
7は、大腸菌に12 N100/pKC7として、AT
CCから取得番号ATCC37084のもとで入手する
ことができる。trpPOを含有する〜288bp E
coRl−C1al制限フラグメントはプラスミドpT
PA102にのプラスミドは大腸菌K12 MM294
/pTPA102(NRRL B−15834)から
単離することができる]から単離することができる。プ
ラスミドpKC7およびプラスミドp’r P A 1
02DNAは、実質的に実施例3の方法に従って、上記
セルラインから得ることができる。プラスミドpTPA
102の〜0.29kb EcoRI −Clal制限
フラグメントは、大腸菌trp遺伝子の翻訳活性化配列
の大部分および転写活性化配列を含有し、以下の配列を
有している: +00 すなわち、プラスミドpRCを構築するために、TE緩
衝液(10μの中のプラスミドpKC7(約2t1g)
を、1QXclal緩衝液[0,5M NaCC60m
Mhリス−HCC(pH7,9): 60mM MgC
b:および1IIy/nρBSAI(2μρ)およびd
H。
ターおよびオペレーター(trpPO)配列を含有する
〜288bp EcoRI −CIaI制限フラグメン
トを、EcoRl−C1al消化したプラスミドpKC
7に挿入することによって構築した。プラスミドpKC
7は、大腸菌に12 N100/pKC7として、AT
CCから取得番号ATCC37084のもとで入手する
ことができる。trpPOを含有する〜288bp E
coRl−C1al制限フラグメントはプラスミドpT
PA102にのプラスミドは大腸菌K12 MM294
/pTPA102(NRRL B−15834)から
単離することができる]から単離することができる。プ
ラスミドpKC7およびプラスミドp’r P A 1
02DNAは、実質的に実施例3の方法に従って、上記
セルラインから得ることができる。プラスミドpTPA
102の〜0.29kb EcoRI −Clal制限
フラグメントは、大腸菌trp遺伝子の翻訳活性化配列
の大部分および転写活性化配列を含有し、以下の配列を
有している: +00 すなわち、プラスミドpRCを構築するために、TE緩
衝液(10μの中のプラスミドpKC7(約2t1g)
を、1QXclal緩衝液[0,5M NaCC60m
Mhリス−HCC(pH7,9): 60mM MgC
b:および1IIy/nρBSAI(2μρ)およびd
H。
0(6μのに加えた。このプラスミドpKC7DNAの
溶液に制限酵素Cla[(2μQ;約10単位)を加え
、得られた反応液を37°Cて2時間インキュベートし
た。このC1aI消化したプラスミドpKC7D N
Aをエタノールで沈澱させ、10XEcoRI緩衝1(
t(2μ12)およびdH,o(16μのに再懸濁させ
た。pKC7DNAに制限酵素EcoR[(2μQ;約
lO単位)を加え、得られた反応液を37°Cで2時間
インキュベートした。
溶液に制限酵素Cla[(2μQ;約10単位)を加え
、得られた反応液を37°Cて2時間インキュベートし
た。このC1aI消化したプラスミドpKC7D N
Aをエタノールで沈澱させ、10XEcoRI緩衝1(
t(2μ12)およびdH,o(16μのに再懸濁させ
た。pKC7DNAに制限酵素EcoR[(2μQ;約
lO単位)を加え、得られた反応液を37°Cで2時間
インキュベートした。
このEcoRl−C1al消化したプラスミドpKC7
DNAを、フェノールで1回、次いでクロロホルムで2
回抽出した。次いで、DNAをエタノールで沈澱させ、
10Xリガーゼ緩衝液(3μ12)およびdH,0(2
0μQ)に再懸濁した。C1al消化したプラスミドp
KC7のプラスミド溶液の制限部位および機能地図は、
マニアティス等[ManiaLis et al、]の
Mo1ecular Cloning(Cold Sp
ring 1iarbor Laboratory、
19g2)8頁から入手することができる。
DNAを、フェノールで1回、次いでクロロホルムで2
回抽出した。次いで、DNAをエタノールで沈澱させ、
10Xリガーゼ緩衝液(3μ12)およびdH,0(2
0μQ)に再懸濁した。C1al消化したプラスミドp
KC7のプラスミド溶液の制限部位および機能地図は、
マニアティス等[ManiaLis et al、]の
Mo1ecular Cloning(Cold Sp
ring 1iarbor Laboratory、
19g2)8頁から入手することができる。
TE緩衝液(約20μQ)中のプラスミドpTI)八1
02(約20μ9)を、1QXc1al緩衝液(10μ
のおよびdH,0(60μQ)に加えた。このプラスミ
ドpTPA102 DNAの溶液に、制限酵素C1a
I(log&:約50単位)を加え、得られた反応液を
37°Cで2時間インキュベートした。このC1al消
化したプラスミドpTPA102 DNAをエタノー
ルで沈澱させ、l OX EcoR,I緩衝1夜(1
0u□およびdHto (80〕1ff)ニ再懸l蜀シ
タ。
02(約20μ9)を、1QXc1al緩衝液(10μ
のおよびdH,0(60μQ)に加えた。このプラスミ
ドpTPA102 DNAの溶液に、制限酵素C1a
I(log&:約50単位)を加え、得られた反応液を
37°Cで2時間インキュベートした。このC1al消
化したプラスミドpTPA102 DNAをエタノー
ルで沈澱させ、l OX EcoR,I緩衝1夜(1
0u□およびdHto (80〕1ff)ニ再懸l蜀シ
タ。
このC1al消化したプラスミドpTPA102DNA
の溶液に制限酵素EcoRI (10uQ :約50単
位)を加え、得られた反応液を37°Cで2時間インキ
ュベートした。
の溶液に制限酵素EcoRI (10uQ :約50単
位)を加え、得られた反応液を37°Cで2時間インキ
ュベートした。
このEcoRl−C1al消化したプラスミドpTPΔ
102 DNAをフェノールで1回抽出し、trpPo
を含有する〜288bp EcoRl −C1al制限
フラグメントが他の消化産物から分離するまで、7%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。この〜288
bp EcoRI −C1af制限フラグメントをゲル
から単離した。目的のフラグメントが約1μ9得られ、
これをTE緩衝液(5μg)に懸濁させ、上記のように
して調製したE coRI−ClaI消化のプラスミド
ρKC7DNAの溶液に加えた。次いでこのDNA混合
物に、T4DNAすif−セ(2μQ;約1000単位
)を加え、得られたライゲーション反応液を16°Cで
2時間インキュベートした。このライデー1− したD
NAは目的のプラスミドpRCDNAからなっていた。
102 DNAをフェノールで1回抽出し、trpPo
を含有する〜288bp EcoRl −C1al制限
フラグメントが他の消化産物から分離するまで、7%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。この〜288
bp EcoRI −C1af制限フラグメントをゲル
から単離した。目的のフラグメントが約1μ9得られ、
これをTE緩衝液(5μg)に懸濁させ、上記のように
して調製したE coRI−ClaI消化のプラスミド
ρKC7DNAの溶液に加えた。次いでこのDNA混合
物に、T4DNAすif−セ(2μQ;約1000単位
)を加え、得られたライゲーション反応液を16°Cで
2時間インキュベートした。このライデー1− したD
NAは目的のプラスミドpRCDNAからなっていた。
このライゲート化DNAを用い、実質的に実施例3の方
法に従って、大腸菌に12 HBIOIコンピテント
細胞を形質転換した。形質転換細胞を100μg、/v
+2アンピシリン含有のし一寒天で平板培養し、プラス
ミドDNAの制限酵素分析によってアンピシリン耐性形
質転換体をスクリーニングシテ目的ノ大腸f’aK 1
2 HB 101/pRcコ0ニーを同定しfコ。実質
的に実施例3の方法に従って、大腸菌に12 HBIO
I/pRC形質転換体からプラスミドpRCDNAを得
た。
法に従って、大腸菌に12 HBIOIコンピテント
細胞を形質転換した。形質転換細胞を100μg、/v
+2アンピシリン含有のし一寒天で平板培養し、プラス
ミドDNAの制限酵素分析によってアンピシリン耐性形
質転換体をスクリーニングシテ目的ノ大腸f’aK 1
2 HB 101/pRcコ0ニーを同定しfコ。実質
的に実施例3の方法に従って、大腸菌に12 HBIO
I/pRC形質転換体からプラスミドpRCDNAを得
た。
TE緩衝液(2μQ)中のプラスミドpRC,DNA(
約2ug)を、10 X Hfnd[Il緩衝液(2μ
σ)およびdH*o(16μm2)に加えた。このプラ
スミドpRCDNAの溶液に、制限酵素H1ndll!
(2μ(! :約10単位)を加え、得られた反応液を
37°Cで2時間インキュベートした。このHindl
ll消化したプラスミドpRCDNAをエタノールで沈
澱させ、lQXBamHI緩衝液(2u12)およびd
H,o(16μQ)に再懸濁した。このHindlll
消化したプラスミドpRCDNAの溶液に制限酵素Ba
mHI(2μa;約10単位)を加え、得られた反応液
を37°Cで2時間インキュベートした。
約2ug)を、10 X Hfnd[Il緩衝液(2μ
σ)およびdH*o(16μm2)に加えた。このプラ
スミドpRCDNAの溶液に、制限酵素H1ndll!
(2μ(! :約10単位)を加え、得られた反応液を
37°Cで2時間インキュベートした。このHindl
ll消化したプラスミドpRCDNAをエタノールで沈
澱させ、lQXBamHI緩衝液(2u12)およびd
H,o(16μQ)に再懸濁した。このHindlll
消化したプラスミドpRCDNAの溶液に制限酵素Ba
mHI(2μa;約10単位)を加え、得られた反応液
を37°Cで2時間インキュベートした。
このBamH[−H1ndlll消化のプラスミドpR
CDNAをフェノールで1回、次いでクロロホルムで2
回抽出した。このDNAをエタノールで沈澱させ、IO
Xリガーゼ緩衝液(3μQ)およびd H* O(20
u12)に再懸濁した。このBamHr−Hindll
l消化したプラスミドpRCDNAの溶液に、プラスミ
ドpTPA102の〜2. Okb HindlllB
affl)11制限フラグメント(約4μCTE緩衝液
約5μQ中)を加えた。このDNAU合物に、T4
DNΔリガーゼ(2μ&:約2000単位)を加え、得
られた反応液を16°Cで2時間インキュベートした。
CDNAをフェノールで1回、次いでクロロホルムで2
回抽出した。このDNAをエタノールで沈澱させ、IO
Xリガーゼ緩衝液(3μQ)およびd H* O(20
u12)に再懸濁した。このBamHr−Hindll
l消化したプラスミドpRCDNAの溶液に、プラスミ
ドpTPA102の〜2. Okb HindlllB
affl)11制限フラグメント(約4μCTE緩衝液
約5μQ中)を加えた。このDNAU合物に、T4
DNΔリガーゼ(2μ&:約2000単位)を加え、得
られた反応液を16°Cで2時間インキュベートした。
このライゲートしたDNAは目的のプラスミドpTPA
103 DNAからなっていた。
103 DNAからなっていた。
目的ではない形質転換体を減少させるため、このライゲ
ート化DNAを制限酵素NcoI(この酵素はプラスミ
ドpRCを切断するがプラスミドpTPΔ103は切断
しない)で消化した。即ち、直線化したDNAは閉環し
た環状DNAに比べて大腸菌を形質転換することが少な
いので、Ncolによってライゲート化DNAを消化す
ると目的ではない形質転換体が減少する。ライゲート化
DNAを消化するため、始めにDNAをエタノールで沈
澱させ、次いでlOXのNcol緩衝液[1,5MNa
CQ: 60+++M トリス−HC12(pH7,8
); 60mM MgC(b:および119/L(l
B S A ](2u(DおよびdH,o(16μのに
再懸濁した。このDNA溶液に制限酵素Ncol(2μ
a:約10単位)を加え、得られた反応液を37°Cで
2時間インキュベートした。
ート化DNAを制限酵素NcoI(この酵素はプラスミ
ドpRCを切断するがプラスミドpTPΔ103は切断
しない)で消化した。即ち、直線化したDNAは閉環し
た環状DNAに比べて大腸菌を形質転換することが少な
いので、Ncolによってライゲート化DNAを消化す
ると目的ではない形質転換体が減少する。ライゲート化
DNAを消化するため、始めにDNAをエタノールで沈
澱させ、次いでlOXのNcol緩衝液[1,5MNa
CQ: 60+++M トリス−HC12(pH7,8
); 60mM MgC(b:および119/L(l
B S A ](2u(DおよびdH,o(16μのに
再懸濁した。このDNA溶液に制限酵素Ncol(2μ
a:約10単位)を加え、得られた反応液を37°Cで
2時間インキュベートした。
ライゲート化、次いでNcoI消化したこのDNAを用
いて大腸菌に12 RV308(NRRLB−156
24,1983年9月28日寄託)を形質転換した。実
質的に実施例3の方法に従って、大腸菌K12 RV
308細胞をコンピテントにし、そして形質転換した。
いて大腸菌に12 RV308(NRRLB−156
24,1983年9月28日寄託)を形質転換した。実
質的に実施例3の方法に従って、大腸菌K12 RV
308細胞をコンピテントにし、そして形質転換した。
形質転換混合物を100μg/蛙アンピシリン含有のし
一寒天で平板培養した。
一寒天で平板培養した。
プラスミドpRCはカナマイシン耐性を与えるがプラス
ミドpTPA103は与えないので、アンピシリン耐性
形質転換体をカナマイシン感受性について試験した。次
いでアンピシリン耐性かつカナマイシン感受性の形質転
換体を用いてプラスミドDNAを調製し、このプラスミ
ドDNAを制限酵素分析をすることによって大腸菌に1
2RV308/pTPA103形質転換体を同定した。
ミドpTPA103は与えないので、アンピシリン耐性
形質転換体をカナマイシン感受性について試験した。次
いでアンピシリン耐性かつカナマイシン感受性の形質転
換体を用いてプラスミドDNAを調製し、このプラスミ
ドDNAを制限酵素分析をすることによって大腸菌に1
2RV308/pTPA103形質転換体を同定した。
プラスミドpTPA103の制限部位および機能地図を
添付の第12図に示す。実質的に実施例3の方法に従っ
て、大腸菌K12 RV308/pTPA103細胞
からプラスミドpTPA103 DNAを単離した。
添付の第12図に示す。実質的に実施例3の方法に従っ
て、大腸菌K12 RV308/pTPA103細胞
からプラスミドpTPA103 DNAを単離した。
B、中間体プラスミドpBW25の構築TE緩衝液(1
u12)中のプラスミドpTPA103 DNA(約
lμg)を、LOX 8glll緩衝液(2μg)およ
びdtrto(isμg)に加えた。このプラスミドp
TPA103 DNAの溶液に、制御!a酵素Bg1
11(1μg;約5単位)を加え、得られた反応液を3
7°Cで2時間インキュベートした。このBa1ll消
化したプラスミドpTPA103 DNAをエタノー
ルで沈澱させ、IOXクレノウ緩衝液(5μσ)および
dH,0(44μのに再懸濁した。このBgll+消化
したプラスミドpTPA103 DNAの溶液に、フ
レ/つ酵素(Iμσ;約1単位)を加え、得られた反応
液を16°Cで2時間インキュベートした。このフレノ
ウ処理してBgl11消化したプラスミドpTPA10
3 DNAをエタノールテ沈澱すセ、10Xリガーゼ
緩衝1夜(3μのおよびdH,o(22μQ)に再懸濁
した。
u12)中のプラスミドpTPA103 DNA(約
lμg)を、LOX 8glll緩衝液(2μg)およ
びdtrto(isμg)に加えた。このプラスミドp
TPA103 DNAの溶液に、制御!a酵素Bg1
11(1μg;約5単位)を加え、得られた反応液を3
7°Cで2時間インキュベートした。このBa1ll消
化したプラスミドpTPA103 DNAをエタノー
ルで沈澱させ、IOXクレノウ緩衝液(5μσ)および
dH,0(44μのに再懸濁した。このBgll+消化
したプラスミドpTPA103 DNAの溶液に、フ
レ/つ酵素(Iμσ;約1単位)を加え、得られた反応
液を16°Cで2時間インキュベートした。このフレノ
ウ処理してBgl11消化したプラスミドpTPA10
3 DNAをエタノールテ沈澱すセ、10Xリガーゼ
緩衝1夜(3μのおよびdH,o(22μQ)に再懸濁
した。
このフレノウ処理して8g111tr4化したプラスミ
ドpTPA103 DNAの溶液に、配列・で示され
るキナーゼ処理していないNdelリンカ−にュー・イ
ングランド・バイオラブズ)(約2μQ:0.2μ9)
を、T4 DNAリガーゼ(2μQ;約1000単位
)およびT4 RNAリガーゼく1頭約2単位)とと
もに加え、得られたライゲート反応液を4℃で一夜イン
キユベートした。ライゲートしたDNAはプラスミドp
T P A l 03derNdeIからなっていた(
このプラスミドは、pTPAl 03 derNde
Iが、プラスミドpTPA103がBglll認識配列
を有しているところにNdel認識配列を有しているこ
と以外は、実質的にプラスミドpTPA103と同じで
ある)。
ドpTPA103 DNAの溶液に、配列・で示され
るキナーゼ処理していないNdelリンカ−にュー・イ
ングランド・バイオラブズ)(約2μQ:0.2μ9)
を、T4 DNAリガーゼ(2μQ;約1000単位
)およびT4 RNAリガーゼく1頭約2単位)とと
もに加え、得られたライゲート反応液を4℃で一夜イン
キユベートした。ライゲートしたDNAはプラスミドp
T P A l 03derNdeIからなっていた(
このプラスミドは、pTPAl 03 derNde
Iが、プラスミドpTPA103がBglll認識配列
を有しているところにNdel認識配列を有しているこ
と以外は、実質的にプラスミドpTPA103と同じで
ある)。
このライゲートしたDNAを用い、実質的に実施例3に
記載の方法に従って、大腸菌K12 R■308コン
ピテント細胞を形質転換した。この形質転換細胞をアン
ピシリン含有のし一寒天で平板培養し、プラスミドDN
Aの制限酵素分析によって、大腸菌に12 RV30
8/pTPA103derNdel形質転換体を同定し
た。後の構築に用いるため、プラスミドpTPA103
derNdel DNAを、実質的に実施例3の方法
に従って、形質転換体から単離した。
記載の方法に従って、大腸菌K12 R■308コン
ピテント細胞を形質転換した。この形質転換細胞をアン
ピシリン含有のし一寒天で平板培養し、プラスミドDN
Aの制限酵素分析によって、大腸菌に12 RV30
8/pTPA103derNdel形質転換体を同定し
た。後の構築に用いるため、プラスミドpTPA103
derNdel DNAを、実質的に実施例3の方法
に従って、形質転換体から単離した。
TE緩衝液(10μQ)中のプラスミドpTPA103
derNdel DNA(約10μ9)を、IOXの
AValll衝液[0,樹液 NaCQ: 60mMh
リスーHCf2(pH8,0); O,IM MgC1
!−; 60mM 2−メルカプトエタノール;および
1所/x(!BSA](2μQ)およびdH,O(6μ
Q)に加えた。このDNAに、制限酵素A val!(
2u(1;約10単位)を加え、得られた反応液を37
°Cで2時間インキユベートシた。〜1.4kb制限フ
ラグメントが他の消化産物から分離するまで、このAV
al1M化したDNAを1%アガロースゲル電気泳動に
かけた。次いでこのプラスミドpT PA 103de
rNdeIの〜1 、4 kb AVail制限フラグ
メントをゲルから単離し、目的のフラグメント(約2μ
g)を得、これをTE緩衝液(5μg)に懸濁した。
derNdel DNA(約10μ9)を、IOXの
AValll衝液[0,樹液 NaCQ: 60mMh
リスーHCf2(pH8,0); O,IM MgC1
!−; 60mM 2−メルカプトエタノール;および
1所/x(!BSA](2μQ)およびdH,O(6μ
Q)に加えた。このDNAに、制限酵素A val!(
2u(1;約10単位)を加え、得られた反応液を37
°Cで2時間インキユベートシた。〜1.4kb制限フ
ラグメントが他の消化産物から分離するまで、このAV
al1M化したDNAを1%アガロースゲル電気泳動に
かけた。次いでこのプラスミドpT PA 103de
rNdeIの〜1 、4 kb AVail制限フラグ
メントをゲルから単離し、目的のフラグメント(約2μ
g)を得、これをTE緩衝液(5μg)に懸濁した。
この〜1 、4 kb AVai!制限フラグメントの
溶液に、IOXクレノウ緩衝液(5μQ)、dH,0(
35μm2)、およびフレノウ酵素(5μe;約5単位
)を加え、得られた反応液を16°Cで30分間インキ
ュベートした。このフレノウ処理したDNAをエタノー
ルで沈澱させ、IOXリガーゼ緩衝液(3μのおよびd
Hto(i4μQ)に再懸濁した。
溶液に、IOXクレノウ緩衝液(5μQ)、dH,0(
35μm2)、およびフレノウ酵素(5μe;約5単位
)を加え、得られた反応液を16°Cで30分間インキ
ュベートした。このフレノウ処理したDNAをエタノー
ルで沈澱させ、IOXリガーゼ緩衝液(3μのおよびd
Hto(i4μQ)に再懸濁した。
実質的に上記Aの方法に従って、配列:で示されるHp
aTリンカ−(約2μQ)をキナーゼ処理した。フレノ
ウ処理した、プラスミドpTPA103 derNde
Iの〜1.4 kb AVail制限フラグメントの
溶液に、このキナーゼ処理したリンカ−(約10u&)
を、T4DNA!Jガーゼ(2μff;約1000単位
)およびT4 RNAリガーゼ(lμQ;約1単位)
とともに加え、得られた反応液を16℃で一夜インキユ
ベートした。
aTリンカ−(約2μQ)をキナーゼ処理した。フレノ
ウ処理した、プラスミドpTPA103 derNde
Iの〜1.4 kb AVail制限フラグメントの
溶液に、このキナーゼ処理したリンカ−(約10u&)
を、T4DNA!Jガーゼ(2μff;約1000単位
)およびT4 RNAリガーゼ(lμQ;約1単位)
とともに加え、得られた反応液を16℃で一夜インキユ
ベートした。
このライゲート化DNAをフェノールで1回、クロロホ
ルムで2回抽出し、エタノールで沈澱させ、l OX
E coRI fa第1夜(2μI2)およびdH、O
(16μQ)に再懸濁した。このDNA溶液に、制限酵
素EcoRl (2μ12;約10単位)を加え、得ら
れた反応液を37°Cで2時間インキュベートした。こ
のEcoRI消化したDNAをフェノールで1回、クロ
ロホルムで2回抽出し、エタノールで沈、殿させ、IO
X リガーゼ緩衝液(3μQ)およびdH、O(20
μg)に再懸濁した。このようにして調製した、〜77
0bpの大きさの、trpPOおよびTPAのアミノ末
端をフードしているフラグメントは、EcoRI適合末
端を1つおよび平滑末端を1つ有しており、これを、以
下のとおり、EcoRI −3maI消化したプラスミ
ドpUc19にライゲートしてプラスミドpUc19T
PAFEを得た。
ルムで2回抽出し、エタノールで沈澱させ、l OX
E coRI fa第1夜(2μI2)およびdH、O
(16μQ)に再懸濁した。このDNA溶液に、制限酵
素EcoRl (2μ12;約10単位)を加え、得ら
れた反応液を37°Cで2時間インキュベートした。こ
のEcoRI消化したDNAをフェノールで1回、クロ
ロホルムで2回抽出し、エタノールで沈、殿させ、IO
X リガーゼ緩衝液(3μQ)およびdH、O(20
μg)に再懸濁した。このようにして調製した、〜77
0bpの大きさの、trpPOおよびTPAのアミノ末
端をフードしているフラグメントは、EcoRI適合末
端を1つおよび平滑末端を1つ有しており、これを、以
下のとおり、EcoRI −3maI消化したプラスミ
ドpUc19にライゲートしてプラスミドpUc19T
PAFEを得た。
プラスミドpUc19[BRLから入手可能](約2μ
9)を、IOXのS ma I緩衝液[0,2M KC
に60mMトリス−HC(!(pH8,0); 60m
M MgCL: 60mM 2−メルカプトエタノール
;および1m9/*Q BSA](2u□およびdH!
O(16μQ)に溶解した。このDNAm液に、制限
酵素S ma 1(2μI2:約lO単位)を加え、得
られた反応液を25°Cで2時間インキュベートした。
9)を、IOXのS ma I緩衝液[0,2M KC
に60mMトリス−HC(!(pH8,0); 60m
M MgCL: 60mM 2−メルカプトエタノール
;および1m9/*Q BSA](2u□およびdH!
O(16μQ)に溶解した。このDNAm液に、制限
酵素S ma 1(2μI2:約lO単位)を加え、得
られた反応液を25°Cで2時間インキュベートした。
このSmaI?m化したプラスミドpUc19 DN
Aをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、1QXEc
oRI緩衝液(2μのおよびdH,o(1(3μQ)に
再懸濁した。
Aをエタノールで沈澱させ、遠心して集め、1QXEc
oRI緩衝液(2μのおよびdH,o(1(3μQ)に
再懸濁した。
このSmal消化したプラスミドpUc19 DNA
の溶液に、制限酵素EcoRI (2u!2 :約10
単位)を加え、得られた反応液を37°Cで2時間イン
キュベートした。このEcoRI−3mar消化したプ
ラスミドpUc19 DNAをフェノールで1回、ク
ロロホルムで2回抽出し、TE緩衝液(51)に再懸濁
した。
の溶液に、制限酵素EcoRI (2u!2 :約10
単位)を加え、得られた反応液を37°Cで2時間イン
キュベートした。このEcoRI−3mar消化したプ
ラスミドpUc19 DNAをフェノールで1回、ク
ロロホルムで2回抽出し、TE緩衝液(51)に再懸濁
した。
EcoRI−SmaI消化したプラスミドpUc19
DNAを、プラスミドpT P A 103 der
NdeI由来の〜770bp EcoRI−平滑末端制
限フラグメントを含有する溶液に加えた。このDNA混
合物ニ、T4 DNAリガーゼ(2μ(!;約100
0単位)を加え、得られた反応液を16°Cで一夜イン
キニベートした。このライゲートしたDNAは目的のプ
ラスミドpUc19TI)八FEからなっていた。プラ
スミドpUcI9TPAFEの制限部位および機能地図
を添付の第12図に示す。
DNAを、プラスミドpT P A 103 der
NdeI由来の〜770bp EcoRI−平滑末端制
限フラグメントを含有する溶液に加えた。このDNA混
合物ニ、T4 DNAリガーゼ(2μ(!;約100
0単位)を加え、得られた反応液を16°Cで一夜イン
キニベートした。このライゲートしたDNAは目的のプ
ラスミドpUc19TI)八FEからなっていた。プラ
スミドpUcI9TPAFEの制限部位および機能地図
を添付の第12図に示す。
プラスミドpUc19TPAFEの構築に用いるEco
R[およびS ma l認識配列を含有する、プラスミ
ドpUc19の多重クローニング部位は、1acZ α
フラグメントの暗号配列内に位置している。IacZ
6M15突然変異(βガラクトシターセをコードしてい
る1acZ遺伝子における突然変異)を含有する細胞に
おいてこのlac Z αフラグメントを発現させる
と、これらの細胞は機能的なβガラクト/ダーゼ分子を
発現し、従ってこれらの細胞は、IPTG(イソプロピ
ルチオガラクトシド)の存在下てX−ガル(5−ブロモ
−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラ
ノ/ド;無色の化合物)をそのインジゴ色の加水分解産
物に加水分解する。プラスミドpUc19の多重クロー
ニング部位にDNAを挿入すると、IacZ αフラグ
メントの暗号配列が乱され、1acZΔM15突然変異
を有する(そのようなプラスミドを有する)細胞はX−
ガルを加水分解することができない(なぜなら、コロニ
ーは白色であり、インジゴではないからである)。プラ
スミドpUC19TPAFEを構成するこのライゲート
化DNAを用い、実質的に実施例3の方法に従って、形
質転換用にコンピテントにした大腸菌K12 RR1Δ
M15(NRRL B−15440,1983年5月
27日寄託)細胞を形質転換した。
R[およびS ma l認識配列を含有する、プラスミ
ドpUc19の多重クローニング部位は、1acZ α
フラグメントの暗号配列内に位置している。IacZ
6M15突然変異(βガラクトシターセをコードしてい
る1acZ遺伝子における突然変異)を含有する細胞に
おいてこのlac Z αフラグメントを発現させる
と、これらの細胞は機能的なβガラクト/ダーゼ分子を
発現し、従ってこれらの細胞は、IPTG(イソプロピ
ルチオガラクトシド)の存在下てX−ガル(5−ブロモ
−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラ
ノ/ド;無色の化合物)をそのインジゴ色の加水分解産
物に加水分解する。プラスミドpUc19の多重クロー
ニング部位にDNAを挿入すると、IacZ αフラグ
メントの暗号配列が乱され、1acZΔM15突然変異
を有する(そのようなプラスミドを有する)細胞はX−
ガルを加水分解することができない(なぜなら、コロニ
ーは白色であり、インジゴではないからである)。プラ
スミドpUC19TPAFEを構成するこのライゲート
化DNAを用い、実質的に実施例3の方法に従って、形
質転換用にコンピテントにした大腸菌K12 RR1Δ
M15(NRRL B−15440,1983年5月
27日寄託)細胞を形質転換した。
形質転換細胞を、■00μ9/z(lアンピシリン、4
0μ9/JIQ X−ガル、および1mMIPTGを含
有するし一寒天で平板培養した。インジゴ色を呈しない
コロニーを継代培養し、これを用いてプラスミドDNA
を調製し、プラスミドDNAの制限酵素分析によって大
腸菌に12 RR1ΔM15/pUc19TPAFE形
質転換体を同定した。
0μ9/JIQ X−ガル、および1mMIPTGを含
有するし一寒天で平板培養した。インジゴ色を呈しない
コロニーを継代培養し、これを用いてプラスミドDNA
を調製し、プラスミドDNAの制限酵素分析によって大
腸菌に12 RR1ΔM15/pUc19TPAFE形
質転換体を同定した。
後の構築にもちいるため、プラスミドpUc19TPA
FE DNAを、実質的に実施例3の方法に従って、大
腸菌に12 RRIΔM15/pUC19TPAFE
細胞から単離した。
FE DNAを、実質的に実施例3の方法に従って、大
腸菌に12 RRIΔM15/pUC19TPAFE
細胞から単離した。
TE緩衝液(20μり)中のプラスミドpUc19TP
AFE(約7 u9)を、IQX Hpal緩衝液[0
2M KC(!; o、IM ト1) スーHC&(p
H7,4);および0 、 I M MgCff−](
]、 OuQ>およびdF(、o(70μのに加えた。
AFE(約7 u9)を、IQX Hpal緩衝液[0
2M KC(!; o、IM ト1) スーHC&(p
H7,4);および0 、 I M MgCff−](
]、 OuQ>およびdF(、o(70μのに加えた。
このプラスミドpUc19TPΔFE DNAの溶液
に、制限酵素Hpal(3ue;約6単位)を加え、得
られた反応液を37°Cで20分間インキュベートした
(この短い反応時間は部分的にHpa[消化するために
設定した)。この反応液を、lXBamH1緩衝液[1
50mM Na(J!:10mM)リス−〇Cり(pH
=8.0):および10mM MgCσ、;塩濃度を高
くするとHpalが不活性化する](150μm2)に
調整した。このHpal(部分的)消化したDNAの溶
液に、制限酵素BamHI(1μQ;約16単位)を加
え、この得られた反応液を37℃で90分間インキュベ
ートした。
に、制限酵素Hpal(3ue;約6単位)を加え、得
られた反応液を37°Cで20分間インキュベートした
(この短い反応時間は部分的にHpa[消化するために
設定した)。この反応液を、lXBamH1緩衝液[1
50mM Na(J!:10mM)リス−〇Cり(pH
=8.0):および10mM MgCσ、;塩濃度を高
くするとHpalが不活性化する](150μm2)に
調整した。このHpal(部分的)消化したDNAの溶
液に、制限酵素BamHI(1μQ;約16単位)を加
え、この得られた反応液を37℃で90分間インキュベ
ートした。
このBamHI −HpaI (部分的)消化プラスミ
ドpUc19TPAFE DNAをエタノール沈澱で
濃縮し、1.5%アガロースゲルにかけ、実質的に実M
tt+例4Aの方法に従って、プラスミドpUCATP
AFEのレプリコン、βラクタマーゼ遺伝子、およびT
PAコード化DNAのすべてを含有する〜3.42kb
Hpal −BamHI制限フラグメントをゲルから
単離した。目的のフラグメントか約1μ9得られ、これ
をTE緩衝液(20μのに懸濁した。
ドpUc19TPAFE DNAをエタノール沈澱で
濃縮し、1.5%アガロースゲルにかけ、実質的に実M
tt+例4Aの方法に従って、プラスミドpUCATP
AFEのレプリコン、βラクタマーゼ遺伝子、およびT
PAコード化DNAのすべてを含有する〜3.42kb
Hpal −BamHI制限フラグメントをゲルから
単離した。目的のフラグメントか約1μ9得られ、これ
をTE緩衝液(20μのに懸濁した。
TE緩衝液(10μの中のプラスミドpTPA103(
約10u9)を、1QXscal緩衝1ffl[1,O
M NaC12; 60mM トリス−HC&(pH7
,4);60mM MgCIIL : l OmM D
TT ;およびIn/aQ B S A](10μ0お
よびdH,O(80uf2)ニ溶解した。このプラスミ
ドpTPA103 DNAの溶液に、制限酵素5ca
l(3μQ;約18単位)を加え、得られた反応液を3
7°Cで90分間インキュベートした。この反応液の容
積を、IXのBamHI緩衝液で150μQに調整し、
この混合物に制限酵素BamHI (1μ12 :約1
6単位)を加え、次いで、37°Cで90分間インキュ
ベートした。このDNAをエタノールで沈澱させ、遠心
して集め、電気泳動用の調製物に再懸濁した。このS
ca I B an+H1消化したプラスミドpTP
A103 DNAを、〜1.O15kb 5eal
−BamHI制限フラグメントが他の消化産物から分離
するまで、1.5%アガロースゲル電気泳動にかけた。
約10u9)を、1QXscal緩衝1ffl[1,O
M NaC12; 60mM トリス−HC&(pH7
,4);60mM MgCIIL : l OmM D
TT ;およびIn/aQ B S A](10μ0お
よびdH,O(80uf2)ニ溶解した。このプラスミ
ドpTPA103 DNAの溶液に、制限酵素5ca
l(3μQ;約18単位)を加え、得られた反応液を3
7°Cで90分間インキュベートした。この反応液の容
積を、IXのBamHI緩衝液で150μQに調整し、
この混合物に制限酵素BamHI (1μ12 :約1
6単位)を加え、次いで、37°Cで90分間インキュ
ベートした。このDNAをエタノールで沈澱させ、遠心
して集め、電気泳動用の調製物に再懸濁した。このS
ca I B an+H1消化したプラスミドpTP
A103 DNAを、〜1.O15kb 5eal
−BamHI制限フラグメントが他の消化産物から分離
するまで、1.5%アガロースゲル電気泳動にかけた。
上記のように、プラスミドpTPA103のTPAカル
ボキシ末端フード化DNAを含有する〜1. Ol 5
kb Seal−BamHI制限フラグメントをゲルか
ら単離し、目的のフラグメントが約0.5μg得られ、
これをdH,0(20μρンに溶解した。
ボキシ末端フード化DNAを含有する〜1. Ol 5
kb Seal−BamHI制限フラグメントをゲルか
ら単離し、目的のフラグメントが約0.5μg得られ、
これをdH,0(20μρンに溶解した。
プラスミドpTPA103の〜1.015kbScal
−BamHI制限フラグメント(2μぐ)に、プラス
ミ FpUC19’FPAFEの〜3.42kb B
amHl−HpaI制限フラグメント(約2μのを、1
0X T4 DNAリガーゼ緩衝液(2μのおよびT
4DNAリガーゼ(1μの[約1バイス(Weiss)
単位;このリガーゼはプロメガ・バイオチック(Pro
megaBiotec、 2800 S、 Fish
Hatchery Road、Madison。
−BamHI制限フラグメント(2μぐ)に、プラス
ミ FpUC19’FPAFEの〜3.42kb B
amHl−HpaI制限フラグメント(約2μのを、1
0X T4 DNAリガーゼ緩衝液(2μのおよびT
4DNAリガーゼ(1μの[約1バイス(Weiss)
単位;このリガーゼはプロメガ・バイオチック(Pro
megaBiotec、 2800 S、 Fish
Hatchery Road、Madison。
Wl 53711)から入手したJとともに加え、得ら
れた反応液を16°Cで一夜インキユベートした。この
ライゲートしたDNAは目的のプラスミドpBW25か
らなっていた。このプラスミドpBW25の制限部位お
よび機能地図を添付の第14図に示す。
れた反応液を16°Cで一夜インキユベートした。この
ライゲートしたDNAは目的のプラスミドpBW25か
らなっていた。このプラスミドpBW25の制限部位お
よび機能地図を添付の第14図に示す。
50 mM CaC12!を用いること以外は実質的に
実施例3の方法に従い、このライゲート化DNAを用い
て形質転換用にコンピテントにしておいた大腸菌に12
JM105(BRLから入手できる)を形質転換し
た。形質転換細胞をl OOu9/ mQアンピンリン
含有のプレイン−ハート インフュージョン寒天(BH
I)[デイフッ・ラボラトリーズ(Difc。
実施例3の方法に従い、このライゲート化DNAを用い
て形質転換用にコンピテントにしておいた大腸菌に12
JM105(BRLから入手できる)を形質転換し
た。形質転換細胞をl OOu9/ mQアンピンリン
含有のプレイン−ハート インフュージョン寒天(BH
I)[デイフッ・ラボラトリーズ(Difc。
Laboratories、 Detroit、 Ml
)]で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析に
よって大腸菌に12 JM105/pBW25形質転
換体を同定した。
)]で平板培養し、プラスミドDNAの制限酵素分析に
よって大腸菌に12 JM105/pBW25形質転
換体を同定した。
プラスミドpBW25を制限酵素EcoRIで消化する
と、〜3.38kbおよび〜1.08kbの制限フラグ
メントが得られる。後の構築に用いるため、実質的に実
施例3の方法に従って、プラスミドpBW25を調製し
た。
と、〜3.38kbおよび〜1.08kbの制限フラグ
メントが得られる。後の構築に用いるため、実質的に実
施例3の方法に従って、プラスミドpBW25を調製し
た。
dHt O(l Od’)中のプラスミドpBW25(
約5μり)を、10X Hindll1反応緩衝液(1
0μi2)およびdH,o(80μQ)に加えた。この
プラスミドpBW25 DNAの溶液に、制限酵素H1
ndll!(1μa;約20単位)を加え、得られた反
応液を37℃で90分間インキュベートした。このHi
ndlll消化したプラスミドpBW25 DNAの
溶液に、制限酵素EcoRI (3μ(:約24単位)
およびIM)IJスーHC(!(pH7,601Oμ(
りを加え、得られた反応液を37°Cで90分間インキ
ュベートした。このEcoRI −H1ndlll消化
したプラスミドpBW25 DNAをエタノール沈澱
で濃縮し、〜810bp EcoRJ−Hindlll
制限フラグメントが池の消化産物から分離するまで、1
.5%アカロースケル電気泳動にかけた。実質的に実施
例4Δの方法に従って、〜810bp EcoRI −
H1ndII+制限フラグメント(約0.5μg)をゲ
ルから単離し、ライゲーション用に調製し、これをdH
,0(20μQ、)に再懸濁した。
約5μり)を、10X Hindll1反応緩衝液(1
0μi2)およびdH,o(80μQ)に加えた。この
プラスミドpBW25 DNAの溶液に、制限酵素H1
ndll!(1μa;約20単位)を加え、得られた反
応液を37℃で90分間インキュベートした。このHi
ndlll消化したプラスミドpBW25 DNAの
溶液に、制限酵素EcoRI (3μ(:約24単位)
およびIM)IJスーHC(!(pH7,601Oμ(
りを加え、得られた反応液を37°Cで90分間インキ
ュベートした。このEcoRI −H1ndlll消化
したプラスミドpBW25 DNAをエタノール沈澱
で濃縮し、〜810bp EcoRJ−Hindlll
制限フラグメントが池の消化産物から分離するまで、1
.5%アカロースケル電気泳動にかけた。実質的に実施
例4Δの方法に従って、〜810bp EcoRI −
H1ndII+制限フラグメント(約0.5μg)をゲ
ルから単離し、ライゲーション用に調製し、これをdH
,0(20μQ、)に再懸濁した。
dH,○(35μの中の複製型(RF)のM13mp8
DNAにュー・イングランド・バイオチックかラ入手で
きル)(約4 、5 μ!?)を、IOXのHindl
ll緩衝液(10μQ)およびdHtO(55μQ)に
加えた。
DNAにュー・イングランド・バイオチックかラ入手で
きル)(約4 、5 μ!?)を、IOXのHindl
ll緩衝液(10μQ)およびdHtO(55μQ)に
加えた。
このM13mp8 DNAの溶液に、制限酵素分析1
1t(1u12;約20単位)を加え、得られた反応液
を37℃で1時間インキニベートした。このHindl
l+消化したM13信p8 DNAの溶液に、制限酵
素EcoRI (3μ12 :約24単位)および1M
トリス−HCg(pH7,6)(10μのを加え、得ら
れた反応液を37°Cで1時間インキニベートした。上
記に従って、この旧ndlll −EcoRI消化した
M13mp8 DNAをエタノール沈澱で集め、アガ
ロースゲル電気泳動用の調製物に再懸濁し、大きい制限
フラグメントをゲル電気泳動によって単離した。M13
mp8の大きいE coRI −H1ndlll制限フ
ラグメント(約1μ9)が得られ、これをdti 、0
(20μQ)に懸濁した。M13mp8の大きいEco
Rl−Hindlll制限フラグメント(約2 μ(2
)、l0XT4 DNAリガーゼ緩衝液(2μQ)、
dHtO(12μQ)、およびT4 DNAリガーゼ
(1μQ:約1バイス単位)を、プラスミドpBW25
の〜810bp EcoRI−ト1indlll制限フ
ラグメント(3μのに加え、得られたライゲーション反
応液を16°Cで一夜インキユベートした。
1t(1u12;約20単位)を加え、得られた反応液
を37℃で1時間インキニベートした。このHindl
l+消化したM13信p8 DNAの溶液に、制限酵
素EcoRI (3μ12 :約24単位)および1M
トリス−HCg(pH7,6)(10μのを加え、得ら
れた反応液を37°Cで1時間インキニベートした。上
記に従って、この旧ndlll −EcoRI消化した
M13mp8 DNAをエタノール沈澱で集め、アガ
ロースゲル電気泳動用の調製物に再懸濁し、大きい制限
フラグメントをゲル電気泳動によって単離した。M13
mp8の大きいE coRI −H1ndlll制限フ
ラグメント(約1μ9)が得られ、これをdti 、0
(20μQ)に懸濁した。M13mp8の大きいEco
Rl−Hindlll制限フラグメント(約2 μ(2
)、l0XT4 DNAリガーゼ緩衝液(2μQ)、
dHtO(12μQ)、およびT4 DNAリガーゼ
(1μQ:約1バイス単位)を、プラスミドpBW25
の〜810bp EcoRI−ト1indlll制限フ
ラグメント(3μのに加え、得られたライゲーション反
応液を16°Cで一夜インキユベートした。
トランスフェクションに用いるDNAの量を変えること
以外は、実質的にBR[、、M13 クローニンク/
゛ジデオキジシークエンシング・インストラクション”
? ニュアル(BRL M13 Cloning/’
Dideoxy’sequencing In5tru
ction Manual)記載の方法に従って、大腸
菌JM103細胞(BRLから人手可能)をコンピテン
トにし、ライゲーション混合物でトランスフェクション
した。挿入によるβガラクトシダーゼαフラグメントを
コードしている遺伝子の不活性化(これにより、X−ガ
ルをそのインジゴ色の切断産物に切断する能力が失われ
る)によって組換え体プラークを同定した。
以外は、実質的にBR[、、M13 クローニンク/
゛ジデオキジシークエンシング・インストラクション”
? ニュアル(BRL M13 Cloning/’
Dideoxy’sequencing In5tru
ction Manual)記載の方法に従って、大腸
菌JM103細胞(BRLから人手可能)をコンピテン
トにし、ライゲーション混合物でトランスフェクション
した。挿入によるβガラクトシダーゼαフラグメントを
コードしている遺伝子の不活性化(これにより、X−ガ
ルをそのインジゴ色の切断産物に切断する能力が失われ
る)によって組換え体プラークを同定した。
スクリーニングするため、白いプラーク6個を、各々、
Lブロス(2,5JIのに入れ、これに、最小培地スト
ックで培養してproA Bを有するFエビソームの保
持を確実なものにした、大腸菌K12JM103(0,
43112)を、対数増殖期において加えた。このプラ
ークを含有する細胞懸濁液(2,5肩のを、空気振盪器
中、37°Cで8時間インキコベートした。この溶液(
1,5ffiのから得た細胞をベレット化し、実質的に
バーンボイムおよびドーリ4 [Birnboim a
nd Doly、 Nuc、 Ac1ds Res、
、 7:1513(1979)]のアルカリ・ミニスク
リーン法に従って、RF DNAを単離した。各培養
物の残りは4℃で保存した。目的の71−ジ(MP8B
W26と命名した)は、M13mp8の〜7.2kb
EcoRIHir+dlll制限フラグメントにライゲ
ートしたプラスミドpBW25の〜810bp Eco
RI −H1ndll!制限フラグメントを含有してい
た。
Lブロス(2,5JIのに入れ、これに、最小培地スト
ックで培養してproA Bを有するFエビソームの保
持を確実なものにした、大腸菌K12JM103(0,
43112)を、対数増殖期において加えた。このプラ
ークを含有する細胞懸濁液(2,5肩のを、空気振盪器
中、37°Cで8時間インキコベートした。この溶液(
1,5ffiのから得た細胞をベレット化し、実質的に
バーンボイムおよびドーリ4 [Birnboim a
nd Doly、 Nuc、 Ac1ds Res、
、 7:1513(1979)]のアルカリ・ミニスク
リーン法に従って、RF DNAを単離した。各培養
物の残りは4℃で保存した。目的の71−ジ(MP8B
W26と命名した)は、M13mp8の〜7.2kb
EcoRIHir+dlll制限フラグメントにライゲ
ートしたプラスミドpBW25の〜810bp Eco
RI −H1ndll!制限フラグメントを含有してい
た。
対数期の大腸菌JM103(約50512)をMP8B
W26で感染させ、空気振盪器中、37°Cで18時間
インキュベートした。低速遠心することによって感染細
胞をベレット化し、上記インストラクション・マニュア
ルの方法をスケールアップすることによって培養物上清
から1本鎖MP3BW26 DNAを調製した。フレ
ノウ反応を、室温で30分間、次いで37°Cで60分
間、次いで10’cで18時間行うこと以外は、実質的
にアデルマン等[Adelman et al、、DN
A 2(3):183−193(1983)]の教示に
従って、1本鎖MP8BW26を突然変異誘発にかけた
。さらに、S1処理を20°Cで行ない、緩衝液の塩濃
度を製造元推奨の半分にし、そしてM13配列決定(シ
ーフェンシング)ブライマー(B RL)を用いた。天
然TPAのアミノ酸残基87から261に対応する暗号
配列を削除するために用いた合成オリゴデオキシリボヌ
クレオチド・プライマーは以下の配列で示される5’
−GGGAAGTGCTGTGAAATATCCACC
TGCGGCCTGAG^−3得られた突然変異誘発混
合物を用い、実質的に上記の感染方法に従って、大腸菌
K12JM103をトランスフェクションした。RF
DNAの制限酵素分析、およびマクサムおよびギルバ
ート(Maxam and G11bert)のDNA
配列決定によって目的の突然変異体を同定した。天然T
PAのアミノ酸残基87から261に対応する暗号配列
が削除された目的の突然変異体をMP8BW27と命名
した。
W26で感染させ、空気振盪器中、37°Cで18時間
インキュベートした。低速遠心することによって感染細
胞をベレット化し、上記インストラクション・マニュア
ルの方法をスケールアップすることによって培養物上清
から1本鎖MP3BW26 DNAを調製した。フレ
ノウ反応を、室温で30分間、次いで37°Cで60分
間、次いで10’cで18時間行うこと以外は、実質的
にアデルマン等[Adelman et al、、DN
A 2(3):183−193(1983)]の教示に
従って、1本鎖MP8BW26を突然変異誘発にかけた
。さらに、S1処理を20°Cで行ない、緩衝液の塩濃
度を製造元推奨の半分にし、そしてM13配列決定(シ
ーフェンシング)ブライマー(B RL)を用いた。天
然TPAのアミノ酸残基87から261に対応する暗号
配列を削除するために用いた合成オリゴデオキシリボヌ
クレオチド・プライマーは以下の配列で示される5’
−GGGAAGTGCTGTGAAATATCCACC
TGCGGCCTGAG^−3得られた突然変異誘発混
合物を用い、実質的に上記の感染方法に従って、大腸菌
K12JM103をトランスフェクションした。RF
DNAの制限酵素分析、およびマクサムおよびギルバ
ート(Maxam and G11bert)のDNA
配列決定によって目的の突然変異体を同定した。天然T
PAのアミノ酸残基87から261に対応する暗号配列
が削除された目的の突然変異体をMP8BW27と命名
した。
プラスミドI)BW28を構築するためには、多種のD
NAフラグメントが必要である。それらフラグメントの
第1のものを以下のようにして得た。
NAフラグメントが必要である。それらフラグメントの
第1のものを以下のようにして得た。
dH,o(20μの中のRF MP8BW27 DN
A(約20μ9)を、1OXNdel緩衝液(loμc
)およびdH,○(60μQ)に加えた。このプラスミ
ドMP8BW27 DNAの混合物に、制限酵素Nd
eI(10μQ;約50単位)を加え、得られた反応液
を37℃で2時間インキュベートした。このNdel消
化したMP8BW27 DNAをエタノールで沈澱さ
せ、遠心して集め、]、 ox EcoR1緩衝液(
10μQ)およびaH,o(90μQ)に再懸濁した。
A(約20μ9)を、1OXNdel緩衝液(loμc
)およびdH,○(60μQ)に加えた。このプラスミ
ドMP8BW27 DNAの混合物に、制限酵素Nd
eI(10μQ;約50単位)を加え、得られた反応液
を37℃で2時間インキュベートした。このNdel消
化したMP8BW27 DNAをエタノールで沈澱さ
せ、遠心して集め、]、 ox EcoR1緩衝液(
10μQ)およびaH,o(90μQ)に再懸濁した。
このNdel消化したプラスミドMP8BW27 D
N A (D溶i(Iニ、制限酵素EcoRI(10
u12:〜50単位)を加え、得られた反応液を37°
Cで2時間インキュベートした。欠失部位を含むTPA
暗号配列の一部を含有する〜560bp Ndel−E
coRI制限フラグメントが他の消化産物から分離する
まで、このEcoRI−Ndel消化したMP8BW2
7 DNAをアガロースゲル電気泳動にかけた。上記
にしたがって、この〜560 bpNdcl −Eco
R[制限フラグメントをゲルから単離し、目的のフラグ
メント(約0.5uy)を得、これをdt−+、o(2
0μi2)に再懸濁した。
N A (D溶i(Iニ、制限酵素EcoRI(10
u12:〜50単位)を加え、得られた反応液を37°
Cで2時間インキュベートした。欠失部位を含むTPA
暗号配列の一部を含有する〜560bp Ndel−E
coRI制限フラグメントが他の消化産物から分離する
まで、このEcoRI−Ndel消化したMP8BW2
7 DNAをアガロースゲル電気泳動にかけた。上記
にしたがって、この〜560 bpNdcl −Eco
R[制限フラグメントをゲルから単離し、目的のフラグ
メント(約0.5uy)を得、これをdt−+、o(2
0μi2)に再懸濁した。
プラスミドpBW28の構築に必要な第2のフラグメン
トは、実質的に実施例1の方法に従って、鎖1本ずつ自
動DNA合成機で合成する。実質的に実施例7Aの方法
に従って、2本の相捕的な鎖(これらの鎖は、ハイブリ
ダイズしてXba[およびNdelの重なり部分を有す
る2本鎖DNAセグメントを形成する)をキナーセ処理
し、アニーリングする。このリンカ−は以下の構造を有
している de 1 プラスミドpBW28の構築に必要な第3のフラグメン
トは以下のようにして調製した。TE緩衝液(20μの
中のプラスミドpTPA103(約20μ9)を、10
XBa+mHI緩衝液(lOμQ)およびdHtO(6
0μ&)に加えた。このプラスミドpTPA103 D
NAの溶液に、制限酵素BamHI(10μa;約50
単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間インキ
ュベートした。このBamHI消化のプラスミドpTP
A103 DNAをエタノールで沈澱させ、遠心して
集め、10 X EcoRI緩衝液(10μQ)および
dHtO(80μQ)に再懸濁した。このBamHI消
化したプラスミドp’r P AIQ3 DNAの溶液
に、制限酵素EcoRI(10μQ;約50単位)を加
え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。TPAのカルボキシ末端の暗号配列を含有する〜6
89bpEc。
トは、実質的に実施例1の方法に従って、鎖1本ずつ自
動DNA合成機で合成する。実質的に実施例7Aの方法
に従って、2本の相捕的な鎖(これらの鎖は、ハイブリ
ダイズしてXba[およびNdelの重なり部分を有す
る2本鎖DNAセグメントを形成する)をキナーセ処理
し、アニーリングする。このリンカ−は以下の構造を有
している de 1 プラスミドpBW28の構築に必要な第3のフラグメン
トは以下のようにして調製した。TE緩衝液(20μの
中のプラスミドpTPA103(約20μ9)を、10
XBa+mHI緩衝液(lOμQ)およびdHtO(6
0μ&)に加えた。このプラスミドpTPA103 D
NAの溶液に、制限酵素BamHI(10μa;約50
単位)を加え、得られた反応液を37℃で2時間インキ
ュベートした。このBamHI消化のプラスミドpTP
A103 DNAをエタノールで沈澱させ、遠心して
集め、10 X EcoRI緩衝液(10μQ)および
dHtO(80μQ)に再懸濁した。このBamHI消
化したプラスミドp’r P AIQ3 DNAの溶液
に、制限酵素EcoRI(10μQ;約50単位)を加
え、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートし
た。TPAのカルボキシ末端の暗号配列を含有する〜6
89bpEc。
R[−BamHI制限フラグメントが他の消化産物から
分離するまで、このBanHI −EcoRI消化した
プラスミドpTPA103 DNAを1.5%アガロ
ースゲル電気泳動にかけた。上記のように、この〜68
9bpフラグメント(約0.5μ9)をゲルから単離し
、次いでdH,0(toμg)に再懸濁した。
分離するまで、このBanHI −EcoRI消化した
プラスミドpTPA103 DNAを1.5%アガロ
ースゲル電気泳動にかけた。上記のように、この〜68
9bpフラグメント(約0.5μ9)をゲルから単離し
、次いでdH,0(toμg)に再懸濁した。
プラスミドpBW28の構築に必要な最後のフラグメン
トはプラスミドpL110[欧州特許出願節86306
452.3号(1987年4月8日にEP A O21
7529のもと公開された)に記載のプラスミド]から
単離した。プラスミドpL110の制限部位および機能
地図は添付の第12図に示されており、プラスミドpL
]loの構築は本実施例の下記りに記載されている。
トはプラスミドpL110[欧州特許出願節86306
452.3号(1987年4月8日にEP A O21
7529のもと公開された)に記載のプラスミド]から
単離した。プラスミドpL110の制限部位および機能
地図は添付の第12図に示されており、プラスミドpL
]loの構築は本実施例の下記りに記載されている。
TE緩衝液(25μQ)中のプラスミドp[,110(
約2Flj)を、1QXXbal緩衝液[0,5MNa
CQ: 60mM I−リス=FIC&(pH7,9
)+ 60 mM MgCh ;および1119/JI
f2 BSA3(IM)およびdH1○(55μのに加
えた。このプラスミドpL110DNAの溶液に、制限
酵素Xbal(10μC;約50単位)を加え、得られ
た反応液を37°Cで2時間インキュベートした。この
X ba l fiil化したプラスミドpL110D
NAをエタノールで沈設させ、遠心して集め、10 X
BamH!緩衝液(10μQ)およびa+4.0(
89μQ)に再懸濁した。
約2Flj)を、1QXXbal緩衝液[0,5MNa
CQ: 60mM I−リス=FIC&(pH7,9
)+ 60 mM MgCh ;および1119/JI
f2 BSA3(IM)およびdH1○(55μのに加
えた。このプラスミドpL110DNAの溶液に、制限
酵素Xbal(10μC;約50単位)を加え、得られ
た反応液を37°Cで2時間インキュベートした。この
X ba l fiil化したプラスミドpL110D
NAをエタノールで沈設させ、遠心して集め、10 X
BamH!緩衝液(10μQ)およびa+4.0(
89μQ)に再懸濁した。
このXbal消化したプラスミドpLIIODNAの溶
液に、制限酵素BamHI(lμQ;約5単位)を加え
、得られた反応、1kを37°Cで30分間インキュベ
ートして、BamH1部分消化物を得た。〜6゜Okb
XbaT −BamHIフラグメントが池の消化産物
から明確に分離するまで、このXbal −Bam81
部分消化したプラスミドpL110DNAを1%アガロ
ースゲル電気泳動にかけた。上記に従って、この〜6.
Okb制限フラグメントをゲルから単離し、約0.5μ
yの〜6.Okb Xbal −BamHI制限フラグ
メントを得、これをdH、O(約40μe)に!PJ、
濁した。この〜6.Okb XbaI −BamHI制
限フラグメントは、EK−BGHをコードしているDN
Aを除き、プラスミドpL110のすべてを含有してい
る。
液に、制限酵素BamHI(lμQ;約5単位)を加え
、得られた反応、1kを37°Cで30分間インキュベ
ートして、BamH1部分消化物を得た。〜6゜Okb
XbaT −BamHIフラグメントが池の消化産物
から明確に分離するまで、このXbal −Bam81
部分消化したプラスミドpL110DNAを1%アガロ
ースゲル電気泳動にかけた。上記に従って、この〜6.
Okb制限フラグメントをゲルから単離し、約0.5μ
yの〜6.Okb Xbal −BamHI制限フラグ
メントを得、これをdH、O(約40μe)に!PJ、
濁した。この〜6.Okb XbaI −BamHI制
限フラグメントは、EK−BGHをコードしているDN
Aを除き、プラスミドpL110のすべてを含有してい
る。
プラスミドpBW28を構築するため、次のフラグメン
ト、即ち、(1)プラスミドpL110の〜6、 Ok
b BamHI−Xba[制限フラグメント(約0.1
μ9;8μQ)、(2)MP 8 BW27の〜560
bp Ndel −E’coRI制限フラグメント(約
0.05μ9;2μの、(3)プラスミドpTPA10
3の〜689bp EcoRI −BamHI制限フラ
グメント(約0.1μ9;2μQ)、および(4)〜4
5 bp X ba 1Nde1合成リンカー(約0.
02μ9;lμのを混合する。このDNA混合物に、I
OX T4 DNAリガーゼ緩衝液(2μのおよびT
4 DNAリガ=ゼ(1μe;約1バイス単位)を加
え、得られたライゲーション反応液を4℃で一夜インキ
ユベートする。ライゲートしたDNAは目的のプラスミ
ドpBW28からなっている。プラスミドpBW28の
制限部位および機能地図を添付の第12図に示す。
ト、即ち、(1)プラスミドpL110の〜6、 Ok
b BamHI−Xba[制限フラグメント(約0.1
μ9;8μQ)、(2)MP 8 BW27の〜560
bp Ndel −E’coRI制限フラグメント(約
0.05μ9;2μの、(3)プラスミドpTPA10
3の〜689bp EcoRI −BamHI制限フラ
グメント(約0.1μ9;2μQ)、および(4)〜4
5 bp X ba 1Nde1合成リンカー(約0.
02μ9;lμのを混合する。このDNA混合物に、I
OX T4 DNAリガーゼ緩衝液(2μのおよびT
4 DNAリガ=ゼ(1μe;約1バイス単位)を加
え、得られたライゲーション反応液を4℃で一夜インキ
ユベートする。ライゲートしたDNAは目的のプラスミ
ドpBW28からなっている。プラスミドpBW28の
制限部位および機能地図を添付の第12図に示す。
このライゲート化DNAを用い、5QmMCaCQ、を
用いること以外は実質的に実施例3の方法に従って、コ
ンピテントにしておいた大腸1K12 MM294(N
RRL B−15625,1983年9月28日寄託
)を形質転換した。プラスミドpBW28上にラムダp
t、プロモーターおよび感温性ラムダpLリプレッサー
をコードしている遺伝子が存在しているため、形質転換
方法および形質転換体の培養方法を若干変えた。形質転
換および次いで行う培養において、細胞を32°C以上
の温度にしなかった。ラムダpLプロモーターおよびそ
の感温性リプレッサーをコードするプラスミドを操作す
る方法を、本実施例のDにおいてさらに詳述する。目的
の大腸菌K 12 MM294/pBW28形質転換体
を、そのテトラサイクリン耐性かつアンピシリン感受性
の表現型およびそのプラスミドDNAの制限酵素分析に
よって同定した。
用いること以外は実質的に実施例3の方法に従って、コ
ンピテントにしておいた大腸1K12 MM294(N
RRL B−15625,1983年9月28日寄託
)を形質転換した。プラスミドpBW28上にラムダp
t、プロモーターおよび感温性ラムダpLリプレッサー
をコードしている遺伝子が存在しているため、形質転換
方法および形質転換体の培養方法を若干変えた。形質転
換および次いで行う培養において、細胞を32°C以上
の温度にしなかった。ラムダpLプロモーターおよびそ
の感温性リプレッサーをコードするプラスミドを操作す
る方法を、本実施例のDにおいてさらに詳述する。目的
の大腸菌K 12 MM294/pBW28形質転換体
を、そのテトラサイクリン耐性かつアンピシリン感受性
の表現型およびそのプラスミドDNAの制限酵素分析に
よって同定した。
(以下、余白)
D、プラスミドpL110の構築
プラスミドpKC283を出発物質として用いてプラス
ミドpL 110を構築した。大腸菌K12 BE
1201/pKC283の凍結乾燥品を、取得番号NR
RL B−15830(1984年8月3日寄託)の
もと、NRRLから人手した。この凍結乾燥品をLブロ
ス< t o II(2)の入った試験管内にデカンテ
ーションし、32℃で2時間インキュベートした。この
時点で培養物を50μ9/mQアンピシリンとし、次い
で、32°Cで一夜インキコベートした。プラスミドp
KC283はpLプロモーターを含んでおり、かつ大腸
菌に12 BE1201細胞は細胞性DNAに組込ま
れた温度感受性のCIリプレッサー遺伝子を含有してい
るので、大腸菌K12 BE1201/pKC283
細胞を32°Cで培養した。本明細書中、後の実施例に
記すように、このプラスミドの単離工程に野生型のラム
ダpLリプレッサー遺伝子を含む細胞、あるいはラムダ
pLプロモーターを含まない細胞を用いる場合には、イ
ンキュベーション温度を37°Cとした。
ミドpL 110を構築した。大腸菌K12 BE
1201/pKC283の凍結乾燥品を、取得番号NR
RL B−15830(1984年8月3日寄託)の
もと、NRRLから人手した。この凍結乾燥品をLブロ
ス< t o II(2)の入った試験管内にデカンテ
ーションし、32℃で2時間インキュベートした。この
時点で培養物を50μ9/mQアンピシリンとし、次い
で、32°Cで一夜インキコベートした。プラスミドp
KC283はpLプロモーターを含んでおり、かつ大腸
菌に12 BE1201細胞は細胞性DNAに組込ま
れた温度感受性のCIリプレッサー遺伝子を含有してい
るので、大腸菌K12 BE1201/pKC283
細胞を32°Cで培養した。本明細書中、後の実施例に
記すように、このプラスミドの単離工程に野生型のラム
ダpLリプレッサー遺伝子を含む細胞、あるいはラムダ
pLプロモーターを含まない細胞を用いる場合には、イ
ンキュベーション温度を37°Cとした。
一夜培養物の少量をとり、大腸菌に12 BE120
1/pKC283の単一のコロニー単離体が得られる様
な方法で、50μy/mQアンピシリンa有のし一寒天
プレートに蒔いた。得られた単一のコロニーを50Mg
/ypQアンピシリン含有のしブロス(10xQ>に接
種し、激しく振盪しながら32℃で一夜インキユベート
した。このlow(の−夜培養物をLブロス(5005
1(りに接種し、培養物が定常相に達するまで激しく振
盪しながら32℃でインキュベートした。次いで、実質
的に実施例3の方法に従って、この細胞からプラスミド
pKC283DNAを調製した。約lawのプラスミド
pKC283が得られ、これをTE緩衝液中、約1μ9
/ x(lの濃度で、4°Cで保存した。プラスミドp
KC283の制限部位および機能地図を添付の第12図
に示す。
1/pKC283の単一のコロニー単離体が得られる様
な方法で、50μy/mQアンピシリンa有のし一寒天
プレートに蒔いた。得られた単一のコロニーを50Mg
/ypQアンピシリン含有のしブロス(10xQ>に接
種し、激しく振盪しながら32℃で一夜インキユベート
した。このlow(の−夜培養物をLブロス(5005
1(りに接種し、培養物が定常相に達するまで激しく振
盪しながら32℃でインキュベートした。次いで、実質
的に実施例3の方法に従って、この細胞からプラスミド
pKC283DNAを調製した。約lawのプラスミド
pKC283が得られ、これをTE緩衝液中、約1μ9
/ x(lの濃度で、4°Cで保存した。プラスミドp
KC283の制限部位および機能地図を添付の第12図
に示す。
プラスミドpKC283DNA(10μQ、約10μ9
)を、10Xの中−塩制限緩衝1ffl[500mMN
aCff; 100mM トリx−HC&(pH7,
5);100 mM MgC(12;および10mM
DTII(20uρ)、1IIy/+ρB SΔ(20
μR)、制限酵素Pvu11(5μQ、約25単位)お
よびd[−1,0(145μg)と混合し、得られた反
応液を37°Cで2時間インキュベートした。本明細書
中に記載の制限酵素反応は、常法により、フェノール、
次いてクロロホルムで抽出することによって停止させ、
続いてD N Aを沈澱させ、エタノール洗浄し、そし
てDNAをTE緩111液に再懸濁させる。上記のよう
にしてPvu11消化を停止させた後、Pvull消化
プラスミドpKC283DNAを沈澱させ、次いで、T
E緩衝液(5μQ)に再懸濁した。
)を、10Xの中−塩制限緩衝1ffl[500mMN
aCff; 100mM トリx−HC&(pH7,
5);100 mM MgC(12;および10mM
DTII(20uρ)、1IIy/+ρB SΔ(20
μR)、制限酵素Pvu11(5μQ、約25単位)お
よびd[−1,0(145μg)と混合し、得られた反
応液を37°Cで2時間インキュベートした。本明細書
中に記載の制限酵素反応は、常法により、フェノール、
次いてクロロホルムで抽出することによって停止させ、
続いてD N Aを沈澱させ、エタノール洗浄し、そし
てDNAをTE緩111液に再懸濁させる。上記のよう
にしてPvu11消化を停止させた後、Pvull消化
プラスミドpKC283DNAを沈澱させ、次いで、T
E緩衝液(5μQ)に再懸濁した。
Xholリンカ−(5’−CCTCGAGG−3“)[
約600ピコモル(pM)]を、5xキナーセ緩ff1
i&[300mMトリス−H(1!(pi−+ 7.8
) : 50+nM Mg、CQ、 ;および25mM
DTT](l Ouの、5mMATP(5μQ)、d
H,○(24頭)、T4ポリヌクレオチドキナーゼ[0
,5μQ: P−Lバイオケミカルズ(P−L Bio
chemicals)の定義で約2.5単位]、La9
/m(1BSA(5μg)、およびIOo+Mスペルミ
ジン(5μρ)を含む混合物中、混合物を37°Cで3
0分間インキュベートすることによってキナーゼ処理し
た。このキナーゼ処理したXhoリンカ−(約12.5
μff)をPvull−消化プラスミドpKC283
DNA(5μQ)に加え、次いで、このDNAに、10
X IJガーゼ緩衝液(2,FM2)、T4 DNAリ
ガーゼ[2,5μQ:約2.5単位(P−Lバイオケミ
カルズの定義)]、lOnMスペルミジン(2,5μの
およびcutto(12,5μρ)を加えた。得られた
ライゲーション反応液を4℃で一夜インキユベートした
。
約600ピコモル(pM)]を、5xキナーセ緩ff1
i&[300mMトリス−H(1!(pi−+ 7.8
) : 50+nM Mg、CQ、 ;および25mM
DTT](l Ouの、5mMATP(5μQ)、d
H,○(24頭)、T4ポリヌクレオチドキナーゼ[0
,5μQ: P−Lバイオケミカルズ(P−L Bio
chemicals)の定義で約2.5単位]、La9
/m(1BSA(5μg)、およびIOo+Mスペルミ
ジン(5μρ)を含む混合物中、混合物を37°Cで3
0分間インキュベートすることによってキナーゼ処理し
た。このキナーゼ処理したXhoリンカ−(約12.5
μff)をPvull−消化プラスミドpKC283
DNA(5μQ)に加え、次いで、このDNAに、10
X IJガーゼ緩衝液(2,FM2)、T4 DNAリ
ガーゼ[2,5μQ:約2.5単位(P−Lバイオケミ
カルズの定義)]、lOnMスペルミジン(2,5μの
およびcutto(12,5μρ)を加えた。得られた
ライゲーション反応液を4℃で一夜インキユベートした
。
ライゲーション反応の後、反応混合物の組成を高塩緩衝
液[0,IM NaCQ: 0.05M トリス−HC
f2(+)H7,5); 10mM MgC&ffi:
および1mMDTT]の組成に調節した。この混合物に
制限酵素Xhol(約10μC;100単位)を加え、
得られた反応液を37°Cで2時間インキュベートした
。
液[0,IM NaCQ: 0.05M トリス−HC
f2(+)H7,5); 10mM MgC&ffi:
および1mMDTT]の組成に調節した。この混合物に
制限酵素Xhol(約10μC;100単位)を加え、
得られた反応液を37°Cで2時間インキュベートした
。
ライゲーション混合物にXholリンカ−を加えないと
いうこと以外は上記と同様にして、反応を停止させ、X
hol消化DNAを沈澱させ、再懸濁し、ライゲートさ
せた。ライゲートしたDNAは所望のプラスミドpKC
283PXからなっていた。プラスミドpKC283P
Xの制限部位および機能地図を添付の第12図に示す。
いうこと以外は上記と同様にして、反応を停止させ、X
hol消化DNAを沈澱させ、再懸濁し、ライゲートさ
せた。ライゲートしたDNAは所望のプラスミドpKC
283PXからなっていた。プラスミドpKC283P
Xの制限部位および機能地図を添付の第12図に示す。
大腸菌に12M0(λ゛)は、NRRLから、取得番号
NRRL B−15993(1984年8月14日寄
託)のもと入手することができる。この大腸菌に12M
0(λ゛)は野生型のラムダpLclリプレッサー遺伝
子を含有しているので、ラムダpLプロモーターからの
転写は、この大腸菌K12M0(λ゛)細胞内では起こ
らない。大腸菌に12M0(λ゛)の単一コロニーを単
離し、そしてこの細胞の一夜培養物(l O*C)を調
製する(増51へ培地にアンピシリンを用いない)。−
夜培i物(50μのを10 mM MgS O、および
l QmM MgCσ、含有の17ブロス(5RI2)
に接種した。この培養物を、激しく振盪しなから37℃
で一夜インキユベートした。翌朝、培養物をl OmM
Mg5O,および10mM MgC(lz含ffのL
ブロスで200RQに希釈した。この希釈培養物を激し
い振−は下において、OD、ssoが約0.5(約lX
l0”細胞/IQの細胞密度を示す)に達するまで、3
7°Cでインキュベートした。氷−水浴中で10分間、
培養物を冷却し、次に4℃、4000X9で10分間遠
心して細胞を集めた。この細胞ペレットを冷10mMN
acl(100mのに再懸濁した後、直ちに遠心して再
ペレ、ト化した。この細胞ペレットを30mMCaC1
2!(100*Q>に再懸濁し、水上で20分間インキ
ュベートした。
NRRL B−15993(1984年8月14日寄
託)のもと入手することができる。この大腸菌に12M
0(λ゛)は野生型のラムダpLclリプレッサー遺伝
子を含有しているので、ラムダpLプロモーターからの
転写は、この大腸菌K12M0(λ゛)細胞内では起こ
らない。大腸菌に12M0(λ゛)の単一コロニーを単
離し、そしてこの細胞の一夜培養物(l O*C)を調
製する(増51へ培地にアンピシリンを用いない)。−
夜培i物(50μのを10 mM MgS O、および
l QmM MgCσ、含有の17ブロス(5RI2)
に接種した。この培養物を、激しく振盪しなから37℃
で一夜インキユベートした。翌朝、培養物をl OmM
Mg5O,および10mM MgC(lz含ffのL
ブロスで200RQに希釈した。この希釈培養物を激し
い振−は下において、OD、ssoが約0.5(約lX
l0”細胞/IQの細胞密度を示す)に達するまで、3
7°Cでインキュベートした。氷−水浴中で10分間、
培養物を冷却し、次に4℃、4000X9で10分間遠
心して細胞を集めた。この細胞ペレットを冷10mMN
acl(100mのに再懸濁した後、直ちに遠心して再
ペレ、ト化した。この細胞ペレットを30mMCaC1
2!(100*Q>に再懸濁し、水上で20分間インキ
ュベートした。
遠心して細胞を再び集め、30mM CaCe、(10
mの中に再懸濁した。細胞(0,5+yのを上記で調製
したライゲート化DNAに加えたくこのDNAは30m
M CaCQeに調製しておいた)。この細胞−DNA
混合物を水上で1時間インキュベートし、42°Cで9
0秒間熱シヨツクを加えた後、氷上で約2分間冷却した
。この細胞−DNA混合物を1251R12のフラスコ
中のLブ’ ス(10zN)+=希釈し、37℃で1時
間インキュベートした。この100μaずつをアンピシ
リン含有のし一寒天プレートで平板培養し、コロニーが
現われるまで37℃でインキュベートした。
mの中に再懸濁した。細胞(0,5+yのを上記で調製
したライゲート化DNAに加えたくこのDNAは30m
M CaCQeに調製しておいた)。この細胞−DNA
混合物を水上で1時間インキュベートし、42°Cで9
0秒間熱シヨツクを加えた後、氷上で約2分間冷却した
。この細胞−DNA混合物を1251R12のフラスコ
中のLブ’ ス(10zN)+=希釈し、37℃で1時
間インキュベートした。この100μaずつをアンピシ
リン含有のし一寒天プレートで平板培養し、コロニーが
現われるまで37℃でインキュベートした。
コロニーを個々に培養し、各コロニーのプラスミドDN
Aを制限酵素分析とゲル電気泳動によって調べた。プラ
スミドDNAの単離は、実質的に実施例3の方法に従い
、小さいスケールで行なったが、所望の大腸菌に12
M○(λ’)/pKC283PX形質転換体が同定され
るまではC5CQ勾配の工程を削除した。プラスミドp
KC283PXの制限部位および機能地図を添付の第1
2図に示す。
Aを制限酵素分析とゲル電気泳動によって調べた。プラ
スミドDNAの単離は、実質的に実施例3の方法に従い
、小さいスケールで行なったが、所望の大腸菌に12
M○(λ’)/pKC283PX形質転換体が同定され
るまではC5CQ勾配の工程を削除した。プラスミドp
KC283PXの制限部位および機能地図を添付の第1
2図に示す。
プラスミドpKC283PX DNA(10μ9)を、
10Xの高−塩緩樹液(20μの、1 o/ a(l
BSA(20μQ)、制限酵素Bgll+(5μQ;約
50単位)、制限酵素Xhol(5u(!;約50単位
)およびd Ht O(150itQ’)に溶解し、得
られた反応液を37°Cで2時間インキュベートした。
10Xの高−塩緩樹液(20μの、1 o/ a(l
BSA(20μQ)、制限酵素Bgll+(5μQ;約
50単位)、制限酵素Xhol(5u(!;約50単位
)およびd Ht O(150itQ’)に溶解し、得
られた反応液を37°Cで2時間インキュベートした。
反応を止め、Bglll−Xhol消化DNAを沈澱さ
せた後、DNAをTE緩衝液(5μのに再懸濁した。
せた後、DNAをTE緩衝液(5μのに再懸濁した。
実施例1に記載のように自動DNA合成機を用いて、B
glllおよびXhor制限酵素切断の特徴を有する1
本鎖DNA末端のDNAリンカ−を合成し、実施例7A
に記載のようにキナーゼ処理した。
glllおよびXhor制限酵素切断の特徴を有する1
本鎖DNA末端のDNAリンカ−を合成し、実施例7A
に記載のようにキナーゼ処理した。
このDNAリンカ−は次の構造を有している:こめリン
カ−とBglll−XhoI消化プラスミドpKC28
3PXとを実質的に上記のライゲージコン方法に従って
ライゲートさせた。ライゲートしたDNAは所望のプラ
スミドpKC283Lをからなっていた。プラスミドp
KC283−Lの制限部位および機能地図を添付の第1
2図に示す。
カ−とBglll−XhoI消化プラスミドpKC28
3PXとを実質的に上記のライゲージコン方法に従って
ライゲートさせた。ライゲートしたDNAは所望のプラ
スミドpKC283Lをからなっていた。プラスミドp
KC283−Lの制限部位および機能地図を添付の第1
2図に示す。
プラスミドpKC283−L DNAを用いて大腸菌に
12M0(λ°)を形質転換し、得られた大腸菌K 1
2M0(λ”)/pKC283−L形質転換体を、その
アンピシリン耐性の表現型およびそのプラスミドDNA
の制限酵素分析によって同定した。
12M0(λ°)を形質転換し、得られた大腸菌K 1
2M0(λ”)/pKC283−L形質転換体を、その
アンピシリン耐性の表現型およびそのプラスミドDNA
の制限酵素分析によって同定した。
プラスミドpKC283−L DNA(約10μg)
を、lOxの高−塩緩樹液(20μ12)、lx9/x
ff BSA(20μ0、制限酵素Xhol(5μ+2
;約50単位)、およびdHto (155u(りニ溶
解シ、得うした反応液を37°Cで2時間インキュベー
トした。
を、lOxの高−塩緩樹液(20μ12)、lx9/x
ff BSA(20μ0、制限酵素Xhol(5μ+2
;約50単位)、およびdHto (155u(りニ溶
解シ、得うした反応液を37°Cで2時間インキュベー
トした。
次いで、XhoI消化プラスミドpKC283−LDN
Aを沈澱させ、そしてIOXのニック−トランスレーシ
ョン緩衝液[0,5M1−リス−HC12(pH7,2
): O,IM Mg5O,;および1mMDTT](
2μQ)、デオキシヌクレオチドトリホスフェート各2
IIIMずツヲ含む溶液(lu□、dHto (15μ
+り、フレノウ酵素[1μQ;約6単位(P−Lバイオ
ケミカルズの定義)]、および1197RQ BSA(
1uC)中に再懸濁した。得られた反応液を25°Cで
30分間インキュベートし、この反応液を70°Cで5
分間インキュベートすることにより反応を止めた。
Aを沈澱させ、そしてIOXのニック−トランスレーシ
ョン緩衝液[0,5M1−リス−HC12(pH7,2
): O,IM Mg5O,;および1mMDTT](
2μQ)、デオキシヌクレオチドトリホスフェート各2
IIIMずツヲ含む溶液(lu□、dHto (15μ
+り、フレノウ酵素[1μQ;約6単位(P−Lバイオ
ケミカルズの定義)]、および1197RQ BSA(
1uC)中に再懸濁した。得られた反応液を25°Cで
30分間インキュベートし、この反応液を70°Cで5
分間インキュベートすることにより反応を止めた。
BamHIリンカ−(5’−CGGGATCCCG−3
°)をキナーゼ処理し、Xhol消化してフレノウ処理
したプラスミドpKC283−L DNAに、実質的に
上記のリンカ−のライゲーション方法に従ってライゲー
トさせた。ライゲーション反応の後、このDNAを、高
−塩緩衝液中、37°Cで約2時間、BamHl(約1
00単位)で消化した。このBamHr消化の後、DN
Aをライゲーション用に調製し、実質的に上記の方法に
従い、〜5.9kb BamHI制限フラグメントをラ
イゲーションによって環化し、大腸菌に12M0(λ°
)に形質転換した。大腸菌に12M0(λ”)/pKC
283−LB形質転換体を同定し、次いで、実質的に実
施例3の方法に従って、この形質転換体からプラスミド
pKC28:3−LB DNAを調製した。プラスミ
ドpKC283−LBの制限部位および機能地図を添付
の第12図に示す。
°)をキナーゼ処理し、Xhol消化してフレノウ処理
したプラスミドpKC283−L DNAに、実質的に
上記のリンカ−のライゲーション方法に従ってライゲー
トさせた。ライゲーション反応の後、このDNAを、高
−塩緩衝液中、37°Cで約2時間、BamHl(約1
00単位)で消化した。このBamHr消化の後、DN
Aをライゲーション用に調製し、実質的に上記の方法に
従い、〜5.9kb BamHI制限フラグメントをラ
イゲーションによって環化し、大腸菌に12M0(λ°
)に形質転換した。大腸菌に12M0(λ”)/pKC
283−LB形質転換体を同定し、次いで、実質的に実
施例3の方法に従って、この形質転換体からプラスミド
pKC28:3−LB DNAを調製した。プラスミ
ドpKC283−LBの制限部位および機能地図を添付
の第12図に示す。
実質的に上記の方法に従い、プラスミドpKC283P
X(約lOμg)を高−塩緩衝液中で制限酵素5alI
により消化し、フレノウ酵素処理し、EcoRIリンカ
−(5°−GAGGAATTCCTC−3’ )とライ
ゲートさせた。制限酵素EcoRIで消化することによ
り〜2.lkbのDNAを除去した後、ライゲーション
して〜4.Okb EcoRI制限フラグメントを環化
し、プラスミドpKC283PR3を得た。このライゲ
ート化DNAを用いて大腸菌K l 2M0(λ°)を
形質転換し、大腸菌に12M0(λ゛)/pKC283
PRS形質転換体を同定した後、実質的に実施例3の方
法に従って、この形質転換体からプラスミドpKC28
3PR3DNAを調製した。プラスミドpKC283P
R8の制限部位および機能地図を添付の第12図に示す
。
X(約lOμg)を高−塩緩衝液中で制限酵素5alI
により消化し、フレノウ酵素処理し、EcoRIリンカ
−(5°−GAGGAATTCCTC−3’ )とライ
ゲートさせた。制限酵素EcoRIで消化することによ
り〜2.lkbのDNAを除去した後、ライゲーション
して〜4.Okb EcoRI制限フラグメントを環化
し、プラスミドpKC283PR3を得た。このライゲ
ート化DNAを用いて大腸菌K l 2M0(λ°)を
形質転換し、大腸菌に12M0(λ゛)/pKC283
PRS形質転換体を同定した後、実質的に実施例3の方
法に従って、この形質転換体からプラスミドpKC28
3PR3DNAを調製した。プラスミドpKC283P
R8の制限部位および機能地図を添付の第12図に示す
。
プラスミドpKC283PR3(約10μ9)を、高−
塩緩樹液(20Ou□中、制限酵素Pstlおよび5p
hl(それぞれ約50単位)で消化した。反応液を37
°Cで約2時間インキュベートした後、反応混合物を、
0.6%低−融解温度アガロース[FMCフーポレイン
ヨン(FMCCorporation、 Marine
Colloids Division、 Rockla
nd、 Maine 04841)]ゲルにより電気泳
動した。
塩緩樹液(20Ou□中、制限酵素Pstlおよび5p
hl(それぞれ約50単位)で消化した。反応液を37
°Cで約2時間インキュベートした後、反応混合物を、
0.6%低−融解温度アガロース[FMCフーポレイン
ヨン(FMCCorporation、 Marine
Colloids Division、 Rockla
nd、 Maine 04841)]ゲルにより電気泳
動した。
ゲルを臭化エチジウムの希溶液で染色し、〜085kb
PsL[−3ph[制限フラグメントを含有するDN
Aバンドを長波長のUV光で観察し、これを小さなセグ
メントとしてゲルから切り取った。
PsL[−3ph[制限フラグメントを含有するDN
Aバンドを長波長のUV光で観察し、これを小さなセグ
メントとしてゲルから切り取った。
このゲルセグメントの容積をセグメントのff1ffi
と密度から求め、ゲルセグメントを入れた試験管に等容
ff1(7)10a+MF’JスーHCQ(pH7,6
)を加えた。次いで、このゲルセグメントを72℃でイ
ンキュベーションして溶融した。2回フェノール抽出し
、エタノール沈澱させた後、プラスミドpKC283P
RSの〜0.85kb Pstl−3phl制限フラグ
メント(約1μ9)を約lOOμQ容量中に得た。同様
にして、プラスミドpKC283−LBを制限酵素Ps
tlとSph[で消化し、アガロースゲル電気泳動によ
って〜3.Okb制限フラグメントを単離し、ライゲー
ジコン用に調製した。
と密度から求め、ゲルセグメントを入れた試験管に等容
ff1(7)10a+MF’JスーHCQ(pH7,6
)を加えた。次いで、このゲルセグメントを72℃でイ
ンキュベーションして溶融した。2回フェノール抽出し
、エタノール沈澱させた後、プラスミドpKC283P
RSの〜0.85kb Pstl−3phl制限フラグ
メント(約1μ9)を約lOOμQ容量中に得た。同様
にして、プラスミドpKC283−LBを制限酵素Ps
tlとSph[で消化し、アガロースゲル電気泳動によ
って〜3.Okb制限フラグメントを単離し、ライゲー
ジコン用に調製した。
プラスミドpKC283PR3の〜0.85kbPst
r−3phl制限フラグメントをプラスミドpKC28
3−LBの〜3.Okb Pstl −3phl制限フ
ラグメントにライゲートした。このライゲート化たDN
Aは所望のプラスミドpL 32からなっていた。プラ
スミドpL32の制限部位および機能地図を添付の第1
2図に示す。プラスミドpL32を大腸菌に12M0(
λ°)細胞に形質転換し、実質的に実施例3の方法に従
い、大腸菌に12M0(λ”)/pL32形質転換体か
らプラスミドpL32 DNAを調製した。プラスミド
1)L32 DNAの分析の結果、プラスミドpKC2
83PXのフレノウ処理した5all末端には1以上の
EcoR[リンカ−が結合していることが分った。1以
上のEcoR1リンカ−の存在はプラスミドpL32ま
たはプラスミドpL32誘導体の有用性には何ら影響を
及ぼさず、またそのことは、2個のEcoR1リンカ−
が−緒にライゲートした場合には必ず生成するXhoI
制限部位の存在によって検出することができる。
r−3phl制限フラグメントをプラスミドpKC28
3−LBの〜3.Okb Pstl −3phl制限フ
ラグメントにライゲートした。このライゲート化たDN
Aは所望のプラスミドpL 32からなっていた。プラ
スミドpL32の制限部位および機能地図を添付の第1
2図に示す。プラスミドpL32を大腸菌に12M0(
λ°)細胞に形質転換し、実質的に実施例3の方法に従
い、大腸菌に12M0(λ”)/pL32形質転換体か
らプラスミドpL32 DNAを調製した。プラスミド
1)L32 DNAの分析の結果、プラスミドpKC2
83PXのフレノウ処理した5all末端には1以上の
EcoR[リンカ−が結合していることが分った。1以
上のEcoR1リンカ−の存在はプラスミドpL32ま
たはプラスミドpL32誘導体の有用性には何ら影響を
及ぼさず、またそのことは、2個のEcoR1リンカ−
が−緒にライゲートした場合には必ず生成するXhoI
制限部位の存在によって検出することができる。
プラスミドpcclo1は、米国特許筒4、γ45.0
69号(1988年571x7日発行)の実施例3に記
載されている(引用して本明細書に記載する)。プラス
ミドpcc101の制限部位および機能地図を添付の第
12図に示す。E K−B G I(−暗号化DNAを
単離するために、プラスミド川01(約10μ9)を、
制限酵素Xba[およびBamHI(それぞれ約50単
位)を含む高−塩緩衝il&(200μQ)中で消化し
た。消化産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、E
K−B G Hをコードしている〜0.6kbXbal
−Ba第1−11制限フラグメントをゲルから単離し
てライゲーションに備えた。
69号(1988年571x7日発行)の実施例3に記
載されている(引用して本明細書に記載する)。プラス
ミドpcc101の制限部位および機能地図を添付の第
12図に示す。E K−B G I(−暗号化DNAを
単離するために、プラスミド川01(約10μ9)を、
制限酵素Xba[およびBamHI(それぞれ約50単
位)を含む高−塩緩衝il&(200μQ)中で消化し
た。消化産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、E
K−B G Hをコードしている〜0.6kbXbal
−Ba第1−11制限フラグメントをゲルから単離し
てライゲーションに備えた。
プラスミドpL32も制限酵素Xba[およびBamH
Iで消化し、〜3.9kb制限フラグメントを単順し、
ライゲーション用に備えた。プラスミドpL32の〜3
.9kb Xbal −BamH[制限フラグメントを
プラスミドpcc101の〜0.6kbXbal −B
amHI制限フラグメントにライゲートして、プラスミ
ドpL47を得た。プラスミドpL47の制限部位およ
び機能地図を添付の第12図に示す。プラスミドpL4
7を大腸菌K12M0(λ°)に形質転換し、大腸菌K
I2MO(λ゛)/pL47形質転換体を同定した。実
質的に実施例3の方法に従って形質転換体からプラスミ
ドpL47 DNAを調製した。
Iで消化し、〜3.9kb制限フラグメントを単順し、
ライゲーション用に備えた。プラスミドpL32の〜3
.9kb Xbal −BamH[制限フラグメントを
プラスミドpcc101の〜0.6kbXbal −B
amHI制限フラグメントにライゲートして、プラスミ
ドpL47を得た。プラスミドpL47の制限部位およ
び機能地図を添付の第12図に示す。プラスミドpL4
7を大腸菌K12M0(λ°)に形質転換し、大腸菌K
I2MO(λ゛)/pL47形質転換体を同定した。実
質的に実施例3の方法に従って形質転換体からプラスミ
ドpL47 DNAを調製した。
プラスミドpPR12は、温度感受性pLリプレッサー
遺伝子c[857とプラスミドpB R322のテトラ
サイクリン耐性付与遺伝子を含有している。
遺伝子c[857とプラスミドpB R322のテトラ
サイクリン耐性付与遺伝子を含有している。
プラスミドpPR12は米国特許第4.436.815
(1984年3月13日発行)に開示され、特許請求さ
れている。プラスミドpPR12の制限部位および機能
地図を添付の第12図に示す。
(1984年3月13日発行)に開示され、特許請求さ
れている。プラスミドpPR12の制限部位および機能
地図を添付の第12図に示す。
プラスミドpPR12(約10μのを、高−基紙樹液(
200μの中、制限酵素EcoRI(約50単位)によ
り、37℃で2時間消化した。このEc。
200μの中、制限酵素EcoRI(約50単位)によ
り、37℃で2時間消化した。このEc。
R1消化プラスミドpPR12DNAを、実質的ニ上記
の方法に従って沈澱させ、次いでフレ7つ酵素で処理し
た。フレノウ反応の後、EcoR1消化してフレノウ処
理したプラスミドpPR12DNAをライゲーションし
て再環化した。実質的に実施例3の方法に従い、所望の
プラスミドpPR12△R1を構成しているライゲート
化DNAを用いて大腸菌K12 RV308を形質転
換した。
の方法に従って沈澱させ、次いでフレ7つ酵素で処理し
た。フレノウ反応の後、EcoR1消化してフレノウ処
理したプラスミドpPR12DNAをライゲーションし
て再環化した。実質的に実施例3の方法に従い、所望の
プラスミドpPR12△R1を構成しているライゲート
化DNAを用いて大腸菌K12 RV308を形質転
換した。
形質転換体は、テトラサイクリン(lOu9/IRI2
)耐性に基づいて選択を行った。大腸菌に12 RV3
08/pPR12△R1形質転換体を同定した後、実質
的に実施例3の方法に従い、プラスミドpPR12△R
IDNAを形質転換体から調製した。
)耐性に基づいて選択を行った。大腸菌に12 RV3
08/pPR12△R1形質転換体を同定した後、実質
的に実施例3の方法に従い、プラスミドpPR12△R
IDNAを形質転換体から調製した。
プラスミドpPR12△R1(約lOμ9)を、中−基
紙樹液(200uC)中、制限酵素AVal(約50単
位)により37℃で2時間消化した。AVal消化プラ
スミドpPR12△RI DNAを沈澱させ、フレノ
ウ酵素で処理した。フレノウ反応の後、このΔval?
f’l化してフレノウ処理したプラスミドpPR12△
RIDNAとEcoRIリンカ−(5′GAGGAAT
TCCTC−3’ )をライゲートし、沈澱させ、約5
0単位の制限酵素EcoRIを含む高−基紙樹液(約2
00μQ)に再懸濁し、37°Cで約2時間インキュベ
ートした。このEcoRI消化の後、実質的に上記の方
法に従って、反応混合物を0.6%低溶融アガロースゲ
ルにかけ、〜5.lkbのEcoRI制限フラグメント
をゲルから精製し、ライゲーションにより再環化し、所
望のプラスミドpPR12ΔR1を得た。実質的に実施
例3の方法に従い、プラスミドpPR12ARI D
NAを用いて大腸菌K12 RV308を形質転換した
。形質転換体の選択はテトラサイクリン耐性に基づいた
。
紙樹液(200uC)中、制限酵素AVal(約50単
位)により37℃で2時間消化した。AVal消化プラ
スミドpPR12△RI DNAを沈澱させ、フレノ
ウ酵素で処理した。フレノウ反応の後、このΔval?
f’l化してフレノウ処理したプラスミドpPR12△
RIDNAとEcoRIリンカ−(5′GAGGAAT
TCCTC−3’ )をライゲートし、沈澱させ、約5
0単位の制限酵素EcoRIを含む高−基紙樹液(約2
00μQ)に再懸濁し、37°Cで約2時間インキュベ
ートした。このEcoRI消化の後、実質的に上記の方
法に従って、反応混合物を0.6%低溶融アガロースゲ
ルにかけ、〜5.lkbのEcoRI制限フラグメント
をゲルから精製し、ライゲーションにより再環化し、所
望のプラスミドpPR12ΔR1を得た。実質的に実施
例3の方法に従い、プラスミドpPR12ARI D
NAを用いて大腸菌K12 RV308を形質転換した
。形質転換体の選択はテトラサイクリン耐性に基づいた
。
実質的に実施例1の方法に従って、形質転換体からプラ
スミドpPR12ARI DNAを調製した。
スミドpPR12ARI DNAを調製した。
プラスミドpPR12AR1の制限部位および機能地図
を添付の第12図に示す。
を添付の第12図に示す。
プラスミドpPR12ARI DNA(約10μ9)
を、制限酵素PsLIおよびEcoRI(それぞれ約5
0単位)を含む高−基紙樹液(約200 rttQ)に
懸濁し、この消化反応液を37°Cで約2時間インキュ
ベートした。次いで、実質的に実施例3の方法に従い、
この反応混合物を1%アガロースゲルにかけ、プラスミ
ドpPR12ΔR1の〜2.9kbPstl−EcoR
I制限フラグメントを単離し、ライゲーション用に調製
した。
を、制限酵素PsLIおよびEcoRI(それぞれ約5
0単位)を含む高−基紙樹液(約200 rttQ)に
懸濁し、この消化反応液を37°Cで約2時間インキュ
ベートした。次いで、実質的に実施例3の方法に従い、
この反応混合物を1%アガロースゲルにかけ、プラスミ
ドpPR12ΔR1の〜2.9kbPstl−EcoR
I制限フラグメントを単離し、ライゲーション用に調製
した。
プラスミドpL 47 (約10μ9)を、高−基紙樹
液(200μf))中、制限酵素PstlおよびBam
Hlにより37°Cで2時間消化した。このPstl
−Bam)−[[消化DNAを、実質的に実施例3の方
法に従って1%アガロースゲルにかけ、複製起源および
アンピシリン耐性付与遺伝子の一部を含有する〜2、γ
kbのPst I −BamHI制限フラグメントを単
離し、ライゲーション用に調製した。別の反応系で、プ
ラスミドpL47 DNA(約10μg)を、高−基
紙樹液(200祿)中、制限酵素EcoRIおよびBa
mHlにより37℃で2時間消化し、うムダpL転写活
性化配列、大腸菌1ppfH訳活性化配列とEK−BG
H−暗号化DNAを含有する〜1゜03kbのEcoR
I −BamHI制限フラグメントを単離し、ライゲー
ション用に調製した。
液(200μf))中、制限酵素PstlおよびBam
Hlにより37°Cで2時間消化した。このPstl
−Bam)−[[消化DNAを、実質的に実施例3の方
法に従って1%アガロースゲルにかけ、複製起源および
アンピシリン耐性付与遺伝子の一部を含有する〜2、γ
kbのPst I −BamHI制限フラグメントを単
離し、ライゲーション用に調製した。別の反応系で、プ
ラスミドpL47 DNA(約10μg)を、高−基
紙樹液(200祿)中、制限酵素EcoRIおよびBa
mHlにより37℃で2時間消化し、うムダpL転写活
性化配列、大腸菌1ppfH訳活性化配列とEK−BG
H−暗号化DNAを含有する〜1゜03kbのEcoR
I −BamHI制限フラグメントを単離し、ライゲー
ション用に調製した。
プラスミドpL47の〜2、γkb Pstl −Ba
mHI制限フラグメントおよび〜1.03kb Eco
RI BamHi制限フラグメントを、プラスミドp
PR12AR1の〜2.9kb Pstl −EcoR
I制限フラグメントにライゲートしてプラスミドpL
110を構築し、このライゲート化DNAを用いて大腸
菌に12 RV308を形質転換した。
mHI制限フラグメントおよび〜1.03kb Eco
RI BamHi制限フラグメントを、プラスミドp
PR12AR1の〜2.9kb Pstl −EcoR
I制限フラグメントにライゲートしてプラスミドpL
110を構築し、このライゲート化DNAを用いて大腸
菌に12 RV308を形質転換した。
形質転換体の選択はテトラサイタリン耐性に基づいた。
EK−BGM暗号化領域には、添付図面に示した制限部
位および機能地図には表わされていない2つのPstl
制限酵素認識部位が存在する。プラスミドpL110の
制限部位および機能地図を添付の第12図に示す。
位および機能地図には表わされていない2つのPstl
制限酵素認識部位が存在する。プラスミドpL110の
制限部位および機能地図を添付の第12図に示す。
E、プラスミドpBW32の最終的な構築プラスミドp
S v 2−β−グロビンDNA(NRRL B−1
5928)(約10μg)を、1QXl+ind+11
反応緩衝液(10μ&)、制限酵素Hindlll(5
μQ;約50単位)、およびdH20(85μのに溶解
し、この反応液を37°Cで2時間保った。次いでこの
反応混合物を0.15M LiCf2とし、2.5倍量
のエタノール加え、ドライアイス−エタン−ル浴でイン
キュベートした後、遠心してDNAをベレット化した。
S v 2−β−グロビンDNA(NRRL B−1
5928)(約10μg)を、1QXl+ind+11
反応緩衝液(10μ&)、制限酵素Hindlll(5
μQ;約50単位)、およびdH20(85μのに溶解
し、この反応液を37°Cで2時間保った。次いでこの
反応混合物を0.15M LiCf2とし、2.5倍量
のエタノール加え、ドライアイス−エタン−ル浴でイン
キュベートした後、遠心してDNAをベレット化した。
このDNAベレットを、tOXの8glll緩衝液(1
0μの、制限酵素Bgul(5μQ;〜50単位)、お
よびdH,0(85μのに溶解し、この反応液を2時間
37°Cに(Vっだ。このBgll+消化の後、反応混
合物を0.85%アガロースゲルにかけ、電気泳動によ
ってフラグメントを分離した。前記と同様にして、臭化
エチジウムおよび紫外光を用いてゲルを可視化し、目的
の〜4 、2 kb H1ndlll −Bgi11フ
ラグメントを含有するバンドをゲルから切り出し、実質
的に実施例4Aの方法に従って精製した。ベレットをa
H,o(tOμQ)に再懸濁した。
0μの、制限酵素Bgul(5μQ;〜50単位)、お
よびdH,0(85μのに溶解し、この反応液を2時間
37°Cに(Vっだ。このBgll+消化の後、反応混
合物を0.85%アガロースゲルにかけ、電気泳動によ
ってフラグメントを分離した。前記と同様にして、臭化
エチジウムおよび紫外光を用いてゲルを可視化し、目的
の〜4 、2 kb H1ndlll −Bgi11フ
ラグメントを含有するバンドをゲルから切り出し、実質
的に実施例4Aの方法に従って精製した。ベレットをa
H,o(tOμQ)に再懸濁した。
このベレットは目的のプラスミドpS v 2−β−グ
ロビンの〜4.2kb Hind!II−8glll制
限フラグメント(〜5μ9)からなっていた。実質的に
上記教示に従って、TPAをコードしているプラスミド
pTPA103の〜2.Okb Hindlll−Ba
mH■制限フラグメントをプラスミドpTPA103か
ら単離した。プラスミドPTPA103の〜2゜Okb
H1ndlll −B amHI制限フラグメント(
約5μ9)が得られ、これをdH,0(IQμのに懸濁
し、20°Cで保存した。
ロビンの〜4.2kb Hind!II−8glll制
限フラグメント(〜5μ9)からなっていた。実質的に
上記教示に従って、TPAをコードしているプラスミド
pTPA103の〜2.Okb Hindlll−Ba
mH■制限フラグメントをプラスミドpTPA103か
ら単離した。プラスミドPTPA103の〜2゜Okb
H1ndlll −B amHI制限フラグメント(
約5μ9)が得られ、これをdH,0(IQμのに懸濁
し、20°Cで保存した。
プラスミドpS v 2−β−グロビンの〜4.2kb
Bglll −H1ndlll制限フラグメント(2μ
Q)およびプラスミドpTpΔ103の〜2.Okb
Hindlll−BamHIフラグメント(4μQ)を
混合し、次いでIOXリガーゼ緩衝液(2μI2)、d
H,o(11μg)、およびT4 DNAリガーゼ(
1μ12:約500単位)とともに4°Cで一夜インキ
ユベートした。ライゲートしたDNAは目的のプラスミ
ドpTPA301からなっていた。このプラスミドの制
限部位および機能地図を添付の第12図に示す。実質的
に実施例3の教示に従い、このライゲート化DNAを用
いて、形質転換用にコンピテントにした大腸菌に12
RR1細胞(NRRL B15210)を形質転換した
。実質的に実施例3の方法に従って、大腸菌K l 2
RR1/pTPA301形質転換体からプラスミド
DNAを得た。
Bglll −H1ndlll制限フラグメント(2μ
Q)およびプラスミドpTpΔ103の〜2.Okb
Hindlll−BamHIフラグメント(4μQ)を
混合し、次いでIOXリガーゼ緩衝液(2μI2)、d
H,o(11μg)、およびT4 DNAリガーゼ(
1μ12:約500単位)とともに4°Cで一夜インキ
ユベートした。ライゲートしたDNAは目的のプラスミ
ドpTPA301からなっていた。このプラスミドの制
限部位および機能地図を添付の第12図に示す。実質的
に実施例3の教示に従い、このライゲート化DNAを用
いて、形質転換用にコンピテントにした大腸菌に12
RR1細胞(NRRL B15210)を形質転換した
。実質的に実施例3の方法に従って、大腸菌K l 2
RR1/pTPA301形質転換体からプラスミド
DNAを得た。
プラスミドpS V 2−dhfrは、ジヒドロ葉酸1
元酵素(dhfr)遺伝子に共有結合したDNAの増幅
および形質転換した真核生物細胞の選択に有用であるd
hfr遺伝子を含有している。プラスミドpSV 2−
dhfr[公的に入手可能な大腸菌K12HB101/
pSV2−dhrr(ATCC37146)から単離し
た](10μg)を、IOX Pvull緩衝液(l
Oμ12)、Pvull制限酵素<2μQ:約2011
1位)、およびdl−1tO(88μQ)と混合し、得
られた反応液を37°Cで2時間インキュベートした。
元酵素(dhfr)遺伝子に共有結合したDNAの増幅
および形質転換した真核生物細胞の選択に有用であるd
hfr遺伝子を含有している。プラスミドpSV 2−
dhfr[公的に入手可能な大腸菌K12HB101/
pSV2−dhrr(ATCC37146)から単離し
た](10μg)を、IOX Pvull緩衝液(l
Oμ12)、Pvull制限酵素<2μQ:約2011
1位)、およびdl−1tO(88μQ)と混合し、得
られた反応液を37°Cで2時間インキュベートした。
フェノールおよびクロロホルム抽出によって反応を止め
、次いでこのPvulli肖化しtコプラスミドpS
V 2−dhfrDNAを沈澱させ、遠心して集めた。
、次いでこのPvulli肖化しtコプラスミドpS
V 2−dhfrDNAを沈澱させ、遠心して集めた。
以下の方法により、BamHIリンカ−(5−CGGA
TCCCG−3°)をキナーセ処理しライゲーション川
に調製シタ。dHto (5uQ)中のリンカ−(1μ
g)ニ、5Xキナーゼ緩衝液(10μの、5mMATP
(5uQ)、B S A (1u/x(1,5ui、1
0mMスペルミジ7 (5μc)、dH−0(19μ(
り、およびr 4 ホIJ ヌクレオチドキナーゼ(約
10単位、lμQ)を加えた。
TCCCG−3°)をキナーセ処理しライゲーション川
に調製シタ。dHto (5uQ)中のリンカ−(1μ
g)ニ、5Xキナーゼ緩衝液(10μの、5mMATP
(5uQ)、B S A (1u/x(1,5ui、1
0mMスペルミジ7 (5μc)、dH−0(19μ(
り、およびr 4 ホIJ ヌクレオチドキナーゼ(約
10単位、lμQ)を加えた。
次いでこの反応液を37°Cで60分間インキュベート
し、−20’Cで保存した。Pvull消化したプラス
ミドpS V 2−dhfr(517g:約5μ9)お
よびキナーゼ処理したBamHIリンカ−(12u&;
約0゜25μのを混合し、dH、O(11u12)、1
0 X IJガーゼ緩衝液(2μQ)およびT4 D
NAリガーゼ(1μg:約1000単位)とともに16
°Cで一夜インキユベートした。
し、−20’Cで保存した。Pvull消化したプラス
ミドpS V 2−dhfr(517g:約5μ9)お
よびキナーゼ処理したBamHIリンカ−(12u&;
約0゜25μのを混合し、dH、O(11u12)、1
0 X IJガーゼ緩衝液(2μQ)およびT4 D
NAリガーゼ(1μg:約1000単位)とともに16
°Cで一夜インキユベートした。
このライゲーション反応混合物に、10XのBamHI
反応緩衝液(10uQ)、BamHI制限酵素(10u
Q:約50単位)、およびd Ht O(48uQ)
ヲ加え、次いで、この溶液を37℃で3時間インキュベ
ートした。実質的に実施例4Aの方法に従って、この反
応液を1%アガロースゲルにかけ、dhrr遺伝子を含
有する目的の〜1.9kbフラグメントをゲルから単離
した。これらの実施例で行なったリンカ−付加のすべて
は、常法によりアガロースゲルで精製することによって
最終ベクターにおける多重リンカ−配列の可能性を減少
させた。フラグメント約3μ9が得られ、これをTE緩
衝液(10μQ)に懸濁した。
反応緩衝液(10uQ)、BamHI制限酵素(10u
Q:約50単位)、およびd Ht O(48uQ)
ヲ加え、次いで、この溶液を37℃で3時間インキュベ
ートした。実質的に実施例4Aの方法に従って、この反
応液を1%アガロースゲルにかけ、dhrr遺伝子を含
有する目的の〜1.9kbフラグメントをゲルから単離
した。これらの実施例で行なったリンカ−付加のすべて
は、常法によりアガロースゲルで精製することによって
最終ベクターにおける多重リンカ−配列の可能性を減少
させた。フラグメント約3μ9が得られ、これをTE緩
衝液(10μQ)に懸濁した。
次に、プラスミドpTPA301(約15μI2:約l
μg)を、上記のようにしてBaaHI制限酵素で消化
した。プラスミドpTPA301にはBamH【部位が
1つしか存在しないので、このBaIIIHI消化によ
り直線状のプラスミドpTPA301 DNAが生成
する。このBamHI消化したプラスミドpTPA30
1をエタ/−ルで沈澱させ、dH。
μg)を、上記のようにしてBaaHI制限酵素で消化
した。プラスミドpTPA301にはBamH【部位が
1つしか存在しないので、このBaIIIHI消化によ
り直線状のプラスミドpTPA301 DNAが生成
する。このBamHI消化したプラスミドpTPA30
1をエタ/−ルで沈澱させ、dH。
0(94μ12)に再懸濁し、ウシ腸アルカリホスファ
ターゼ(1μのおよび1Mトリス−HCf2(pH9,
0)(5μQ)を用いて65°Cで45分間ホスファタ
ーゼ処理した。このDNAをフェノール:クロロホルム
で抽出し、次いでクロロホルム:イソアミルアルコール
で抽出し、エタノール沈澱し、dH,o(20μQ)に
再懸濁した。ホスファターゼ処理したプ5スミl’pT
PA301(l Oμ(1:約0.25u9)を、Ba
mHI dhfr遺伝子を含有する制限フラグメント
(5μQ1約1.5μ9)、IOXリガーゼ緩衝液(3
μQ)、′r4DNAIJガーゼ(3μ12:約150
0単位)、およびdH,O(9μI2)に加えた。この
ライゲーション反応液を15°Cで一夜インキユベート
した。このライゲート化DNAは目的のプラスミドpT
PA303 DNAからなっていた。
ターゼ(1μのおよび1Mトリス−HCf2(pH9,
0)(5μQ)を用いて65°Cで45分間ホスファタ
ーゼ処理した。このDNAをフェノール:クロロホルム
で抽出し、次いでクロロホルム:イソアミルアルコール
で抽出し、エタノール沈澱し、dH,o(20μQ)に
再懸濁した。ホスファターゼ処理したプ5スミl’pT
PA301(l Oμ(1:約0.25u9)を、Ba
mHI dhfr遺伝子を含有する制限フラグメント
(5μQ1約1.5μ9)、IOXリガーゼ緩衝液(3
μQ)、′r4DNAIJガーゼ(3μ12:約150
0単位)、およびdH,O(9μI2)に加えた。この
ライゲーション反応液を15°Cで一夜インキユベート
した。このライゲート化DNAは目的のプラスミドpT
PA303 DNAからなっていた。
プラスミドp’r P A 303を用いて大腸菌K1
2 RRI(NRRL B−15210)を形質転
換し、得られた大腸菌に12 RRI/pTPA30
3形質転換体を、そのアンピシリン耐性の表現型および
そのプラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した
。実質的に実施例3の方法に従って、プラスミドp”r
P A 303を形質転換体から単離した。
2 RRI(NRRL B−15210)を形質転
換し、得られた大腸菌に12 RRI/pTPA30
3形質転換体を、そのアンピシリン耐性の表現型および
そのプラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した
。実質的に実施例3の方法に従って、プラスミドp”r
P A 303を形質転換体から単離した。
pBR322レプリコンおよびプラスミドpTPA30
1由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子をコードしている〜2
、γkb EcoRI −8glll制限フラグメント
を単離するため、プラスミドpTP A 301(約1
0μg)を、全反応液容量(400μQ)中、37°C
で、I X 8glll緩衝液中の8gl11制限酵素
(20単位)で完全に消化した。このBgll+消化の
後、トリス−HCf2濃度をllomMに調整し、37
℃で、8gl11消化したDNAにEcoRI制限酵素
(20単位)を加えた。EcoRI消化の後、〜2、γ
kbEcoRI −8glll制限フラグメントが他の
消化産物から分離するまで、このE coRI −B
g111消化したDNAを1%アガロースゲル電気泳動
にかけ、次いで〜2、γkbフラグメントを単離し、ラ
イゲージジン用に調製した。
1由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子をコードしている〜2
、γkb EcoRI −8glll制限フラグメント
を単離するため、プラスミドpTP A 301(約1
0μg)を、全反応液容量(400μQ)中、37°C
で、I X 8glll緩衝液中の8gl11制限酵素
(20単位)で完全に消化した。このBgll+消化の
後、トリス−HCf2濃度をllomMに調整し、37
℃で、8gl11消化したDNAにEcoRI制限酵素
(20単位)を加えた。EcoRI消化の後、〜2、γ
kbEcoRI −8glll制限フラグメントが他の
消化産物から分離するまで、このE coRI −B
g111消化したDNAを1%アガロースゲル電気泳動
にかけ、次いで〜2、γkbフラグメントを単離し、ラ
イゲージジン用に調製した。
dhfr遺伝子を含有する制限フラグメントを単離する
ため、プラスミドpTP A 303をHindlll
およびEcoRI制限酵素で2重に消化し、dhfr遺
伝子を含有する”−2340bp E coRI −H
1ndlll制限フラグメントを単離し、回収した。
ため、プラスミドpTP A 303をHindlll
およびEcoRI制限酵素で2重に消化し、dhfr遺
伝子を含有する”−2340bp E coRI −H
1ndlll制限フラグメントを単離し、回収した。
TPAのカルボキシ末端暗号領域およびSV40プロモ
ーターを含有するプラスミドpTPA303の〜2.O
kb H4nd!ll−3stl制限フラグメントを単
離するため、プラスミドpTPA303を、I X H
1ndlil緩衝液中、H4ndlllおよび5stI
制限酵素で2重に消化した。〜1、γkbフラグメント
をゲルから単離し、ライゲーション用に調製した。
ーターを含有するプラスミドpTPA303の〜2.O
kb H4nd!ll−3stl制限フラグメントを単
離するため、プラスミドpTPA303を、I X H
1ndlil緩衝液中、H4ndlllおよび5stI
制限酵素で2重に消化した。〜1、γkbフラグメント
をゲルから単離し、ライゲーション用に調製した。
改良型TPAのアミン末端暗号領域を含有するプラスミ
ドpBW28の〜680bp Xholl(ライゲーシ
ョンに対しては8g111重なり部分と適合しうる)
−S st I制限フラグメントを単離するため、プラ
スミドpBW28(約10μ?)を、1XXholl緩
衝液[0,1Mトリス−HCg(pH8,0) ; 0
. IM MgCQt ; 0 、1%トリト:/X−
100;および1即/*QBSA]中、Xholl酵素
で完全に消化した。このXholl消化したDNAをエ
タノール沈澱で回収し、次いで5stl酵素で完全に消
化した。
ドpBW28の〜680bp Xholl(ライゲーシ
ョンに対しては8g111重なり部分と適合しうる)
−S st I制限フラグメントを単離するため、プラ
スミドpBW28(約10μ?)を、1XXholl緩
衝液[0,1Mトリス−HCg(pH8,0) ; 0
. IM MgCQt ; 0 、1%トリト:/X−
100;および1即/*QBSA]中、Xholl酵素
で完全に消化した。このXholl消化したDNAをエ
タノール沈澱で回収し、次いで5stl酵素で完全に消
化した。
実質的に実施例4Aの方法に従って、このXhollS
st[消化したDNAをアクリルアミドゲルにかけ、目
的のフラグメントをゲルから単離し、ライゲーション用
に調製した。
st[消化したDNAをアクリルアミドゲルにかけ、目
的のフラグメントをゲルから単離し、ライゲーション用
に調製した。
上記のフラグメント、即ち(1)プラスミドpTPA3
01の〜2、γ kb EcoRr −8glll制限
フラグメント、(2)プラスミドpTPA303の〜2
34 kb E coRI −H1ndlll制限フラ
グメント、(3)プラスミドpTPA303の〜1、γ
kbSstlHindlll制限フラグメント、および
(4)プラスミドpI3W28の〜0゜68kb 5s
tl −Xhol!制限フラグメント(それぞれ約0.
1重g)を−緒にライゲートし、プラスミドpBW32
を得た。このライゲーション混合物を用い、5重mM
CaCC2を用いること以外は実施例3の教示のように
して、大腸菌K12MM294を形質転換した。形質転
換体をそのアンピシリン耐性の表現型およびそのプラス
ミドDNAの制限分析によって同定した。
01の〜2、γ kb EcoRr −8glll制限
フラグメント、(2)プラスミドpTPA303の〜2
34 kb E coRI −H1ndlll制限フラ
グメント、(3)プラスミドpTPA303の〜1、γ
kbSstlHindlll制限フラグメント、および
(4)プラスミドpI3W28の〜0゜68kb 5s
tl −Xhol!制限フラグメント(それぞれ約0.
1重g)を−緒にライゲートし、プラスミドpBW32
を得た。このライゲーション混合物を用い、5重mM
CaCC2を用いること以外は実施例3の教示のように
して、大腸菌K12MM294を形質転換した。形質転
換体をそのアンピシリン耐性の表現型およびそのプラス
ミドDNAの制限分析によって同定した。
実質的に実施例3の方法に従って、大腸菌K12MM2
94/pBW32形質転換体からプラスミドpBW32
DNAを得た。このプラスミドpBW32の制限部
位および機能地図を添付の第12図に示す。
94/pBW32形質転換体からプラスミドpBW32
DNAを得た。このプラスミドpBW32の制限部
位および機能地図を添付の第12図に示す。
実施例12 プラスミドpLPchdl、pt、pch
d2、pLpcbd1(GT)、pL P Chd2
(G T)、pLPcdhfrl、pL P Cdhf
r2、pL P Cdh4r 1 (GT)およびpL
PCdhfr2(GT)の構築A、プラスミドpLPc
hdlおよびpLPChd2の構築 TE緩衝液(20μQ)中のプラスミドpBW32(実
施例11)(約20u9)を、1010XBa[緩衝液
(loμN)およびdHto(60μ+りに加えた。コ
ノプラスミドpBW32 DNAの溶液に、制限酵素
BamHI(10μ12;約50単位)を加え、得られ
た反応液を37°Cで2時間インキュベートした。この
BamHI消化したプラスミドpBW32 DNAをエ
タノールで沈澱させ、遠心して集め、IOXクレノウ緩
衝液(5μQ)、dHto(45u□およびフレノウ酵
素(2μQ;約lOO単位)に再懸濁した。
d2、pLpcbd1(GT)、pL P Chd2
(G T)、pLPcdhfrl、pL P Cdhf
r2、pL P Cdh4r 1 (GT)およびpL
PCdhfr2(GT)の構築A、プラスミドpLPc
hdlおよびpLPChd2の構築 TE緩衝液(20μQ)中のプラスミドpBW32(実
施例11)(約20u9)を、1010XBa[緩衝液
(loμN)およびdHto(60μ+りに加えた。コ
ノプラスミドpBW32 DNAの溶液に、制限酵素
BamHI(10μ12;約50単位)を加え、得られ
た反応液を37°Cで2時間インキュベートした。この
BamHI消化したプラスミドpBW32 DNAをエ
タノールで沈澱させ、遠心して集め、IOXクレノウ緩
衝液(5μQ)、dHto(45u□およびフレノウ酵
素(2μQ;約lOO単位)に再懸濁した。
この反応液を16°Cで30分間インキュベートし、次
いで消化産物が明確に分離するまでこの反応混合物を1
%アガロースゲル電気泳動にかけた。実質的に実施例4
Aの方法に従って、dhfr遺伝子を含有する、プラス
ミドpBW32の〜1.9kbクレノウ処理したBam
HI制限フラグメントをゲルから単離し、ライゲーショ
ン用に調製した。目的のフラグメントが約4μ9得られ
、これをTE緩rJi液(5μa)に懸濁した。
いで消化産物が明確に分離するまでこの反応混合物を1
%アガロースゲル電気泳動にかけた。実質的に実施例4
Aの方法に従って、dhfr遺伝子を含有する、プラス
ミドpBW32の〜1.9kbクレノウ処理したBam
HI制限フラグメントをゲルから単離し、ライゲーショ
ン用に調製した。目的のフラグメントが約4μ9得られ
、これをTE緩rJi液(5μa)に懸濁した。
TE緩衝液(100μQ)中のプラスミドpLPChy
gl(実施例10)(約200μ9)を、10XEc。
gl(実施例10)(約200μ9)を、10XEc。
R1緩衝液(15μ12)およびdH,0(30μQ)
に加えた。このプラスミドpLPchygl DNA
の溶液に、制限酵素EcoRI’(約5μ(!;約50
単位)を加え、得られた反応液を37°Cで約10分間
インキコベートした。この短い反応時間は、部分的なE
c。
に加えた。このプラスミドpLPchygl DNA
の溶液に、制限酵素EcoRI’(約5μ(!;約50
単位)を加え、得られた反応液を37°Cで約10分間
インキコベートした。この短い反応時間は、部分的なE
c。
RI消化物が得られるように算出したものである。
プラスミドpLpchygtはEcoRI制限部位を2
箇所有しており、そのうちの1箇所は、ハイグロマイシ
ン耐性付与(HmR)遺伝子の暗号配列内に存在してい
る。このI−1mR遺伝子内ではないプラスミドpLP
chyglのEcoR1部位に、プラスミドpBW32
由来の〜1 、9 kb dhfr遺伝子含有制限フラ
グメントを挿入することが望ましい。1箇所だけ切断し
たプラスミドpLPchygl DNAが未切断プラ
スミドD N Aおよびその他の消化産物から分離する
まで、この部分的にEcoRI消化したプラスミドpL
Pchygl DNAをアガロースゲル電気泳動にか
けた。実質的に実施例4Aの方法に従って、この1箇所
だけ切断したDNAをゲルから単離し、ライゲーション
用に調製した。
箇所有しており、そのうちの1箇所は、ハイグロマイシ
ン耐性付与(HmR)遺伝子の暗号配列内に存在してい
る。このI−1mR遺伝子内ではないプラスミドpLP
chyglのEcoR1部位に、プラスミドpBW32
由来の〜1 、9 kb dhfr遺伝子含有制限フラ
グメントを挿入することが望ましい。1箇所だけ切断し
たプラスミドpLPchygl DNAが未切断プラ
スミドD N Aおよびその他の消化産物から分離する
まで、この部分的にEcoRI消化したプラスミドpL
Pchygl DNAをアガロースゲル電気泳動にか
けた。実質的に実施例4Aの方法に従って、この1箇所
だけ切断したDNAをゲルから単離し、ライゲーション
用に調製した。
1箇所だけEcoRI切断したプラスミドpt、pch
yglが約2μQ得られ、これをTE緩衝液(25μm
2)に懸濁した。この試料に、フレノウ酵素(5μQ;
約25単位)、IOX フレノウ緩衝液(5μe)、お
よびdH20(4Qμのを加え、得られた反応液を16
°Cで60分間インキニベートした。このフレノウ処理
してEcoR1部分的消化したプラスミドpLPchy
gl DNAを、フェノールで2回、次いでクロロホ
ルムで1回抽出し、エタノールで沈澱させ、TE緩衝液
(25μQ)に再懸濁した。
yglが約2μQ得られ、これをTE緩衝液(25μm
2)に懸濁した。この試料に、フレノウ酵素(5μQ;
約25単位)、IOX フレノウ緩衝液(5μe)、お
よびdH20(4Qμのを加え、得られた反応液を16
°Cで60分間インキニベートした。このフレノウ処理
してEcoR1部分的消化したプラスミドpLPchy
gl DNAを、フェノールで2回、次いでクロロホ
ルムで1回抽出し、エタノールで沈澱させ、TE緩衝液
(25μQ)に再懸濁した。
プラスミドpBW32の〜1.9kbのフレノウ処理し
たBamHI制限フラグメント(約5μQ)、および1
箇所だけEcoRI切断したプラスミドpLPChyg
l D N A (約5μのを混合し、このDNA
混合物に、10 X !Jガーゼ緩衝液(1u(1>、
dH,0(5uO)、T4DNAIJガーゼ(1ttQ
:約500単位)、およびT4 RNAリガーゼ(
lμQ:約2単位)を加え、得られた反応液を16°C
で一夜インキユベートした。このライゲート化DNAは
目的のプラスミドpLPchdlおよびpLPChd2
(これらは、dhfr遺伝子を含有している〜l 、
9 kbフラグメントの配向だけが異なっている)から
なっていた。
たBamHI制限フラグメント(約5μQ)、および1
箇所だけEcoRI切断したプラスミドpLPChyg
l D N A (約5μのを混合し、このDNA
混合物に、10 X !Jガーゼ緩衝液(1u(1>、
dH,0(5uO)、T4DNAIJガーゼ(1ttQ
:約500単位)、およびT4 RNAリガーゼ(
lμQ:約2単位)を加え、得られた反応液を16°C
で一夜インキユベートした。このライゲート化DNAは
目的のプラスミドpLPchdlおよびpLPChd2
(これらは、dhfr遺伝子を含有している〜l 、
9 kbフラグメントの配向だけが異なっている)から
なっていた。
このライゲート化DNAを用い、実質的に実施例3の方
法に従って、形質転換用にコンピテントにしておいた大
腸菌に12 HBIOI細胞を形質転換した。形質転換
細胞をlOOμ9/πgアンピシリン含有のし一寒天で
平板培養し、アンピンリン耐性の形質転換体をプラスミ
ドDNAの制限酵素分析によって分析して、大腸菌K1
2 HBI01/pLPchdlおよび大腸菌K12
HBIO1/pLPChd2形質転換体を同定した。プ
ラスミドpLPchdlおよびプラスミドpLPChd
2 DNAを、実質的に実施例3の方法に従って、適
切な形質転換体から単離した。
法に従って、形質転換用にコンピテントにしておいた大
腸菌に12 HBIOI細胞を形質転換した。形質転換
細胞をlOOμ9/πgアンピシリン含有のし一寒天で
平板培養し、アンピンリン耐性の形質転換体をプラスミ
ドDNAの制限酵素分析によって分析して、大腸菌K1
2 HBI01/pLPchdlおよび大腸菌K12
HBIO1/pLPChd2形質転換体を同定した。プ
ラスミドpLPchdlおよびプラスミドpLPChd
2 DNAを、実質的に実施例3の方法に従って、適
切な形質転換体から単離した。
プラスミドpLPChd3およびpLPChd4はプラ
スミドpLPchdlおよびpLPChd2と同様な構
造である。プラスミドpLPChd3およびpLPCh
d4は、プラスミドpLPchyglの代わりに出発物
質としてプラスミドpLPChyg2を用いる以外は、
プラスミドpLPchdlおよびpLPCh、d2を構
築するために用いる方法に実質的に従って構築される。
スミドpLPchdlおよびpLPChd2と同様な構
造である。プラスミドpLPChd3およびpLPCh
d4は、プラスミドpLPchyglの代わりに出発物
質としてプラスミドpLPChyg2を用いる以外は、
プラスミドpLPchdlおよびpLPCh、d2を構
築するために用いる方法に実質的に従って構築される。
(GT)の構築
実質的に実施例4B、1の方法に従って、ブラスミ ド
pL PChdl、pL PChd2、pLPChd3
またはpLPChd4中のBKエンハンサ−とAd2後
期プロモーターの間にある唯一のXho1部位にポリー
GT要素を挿入する。XhoI消化したポリGT要素お
よびXhol消化したプラスミドpLPChdl、pL
PChd2、pLPChd3またはpLPChd4
DNAをライゲートする。このライゲート化たDNAは
、各々、目的のプラスミドpLPChd1(GT)、p
LPChd2(GT)、pLPChd3(GT)および
pt、PChd4(GT)からなっている。プラスミド
pLPchd1(GT)の制限部位および機能地図を添
付の第13図に示す。
pL PChdl、pL PChd2、pLPChd3
またはpLPChd4中のBKエンハンサ−とAd2後
期プロモーターの間にある唯一のXho1部位にポリー
GT要素を挿入する。XhoI消化したポリGT要素お
よびXhol消化したプラスミドpLPChdl、pL
PChd2、pLPChd3またはpLPChd4
DNAをライゲートする。このライゲート化たDNAは
、各々、目的のプラスミドpLPChd1(GT)、p
LPChd2(GT)、pLPChd3(GT)および
pt、PChd4(GT)からなっている。プラスミド
pLPchd1(GT)の制限部位および機能地図を添
付の第13図に示す。
C,pLPcdhfrlおよびpt、 P Cdhfr
2の構築TE緩衝液(looμ12)中のプラスミドp
BW32(約100u9)を、10X10XBa緩衝液
(15μQ)およびdH!0(25μe)に加えた。こ
のプラスミドpBW32 DNAの溶液に制限酵素B
amHI(10μQ;約25単位)を加え、得られた反
応液を37℃で2時間インキュベートした。実質的に実
施例10Aの方法に従って、BamHI消化したプラス
ミドpBW32 DN’Aをフレノウ酵素で処理した
。末端平滑化フラグメントをエタノールで沈澱させ、T
E緩衝液(10μ+2)中で再懸濁させ、dhfr遺伝
子を含有する〜1.9 kb BamHI制限フラグメ
ントが他の消化産物から分離するまで1%アガロースゲ
ル電気泳動にかけた。次いで、実質的に実施例4Aの方
法に従って、〜1 、9 kb制限フラグメントをゲル
から単離し、ライゲーション用に調製した。目的のフラ
グメントが約10μ9得られ、これをTE緩衝液(50
μm2)に懸濁させた。
2の構築TE緩衝液(looμ12)中のプラスミドp
BW32(約100u9)を、10X10XBa緩衝液
(15μQ)およびdH!0(25μe)に加えた。こ
のプラスミドpBW32 DNAの溶液に制限酵素B
amHI(10μQ;約25単位)を加え、得られた反
応液を37℃で2時間インキュベートした。実質的に実
施例10Aの方法に従って、BamHI消化したプラス
ミドpBW32 DN’Aをフレノウ酵素で処理した
。末端平滑化フラグメントをエタノールで沈澱させ、T
E緩衝液(10μ+2)中で再懸濁させ、dhfr遺伝
子を含有する〜1.9 kb BamHI制限フラグメ
ントが他の消化産物から分離するまで1%アガロースゲ
ル電気泳動にかけた。次いで、実質的に実施例4Aの方
法に従って、〜1 、9 kb制限フラグメントをゲル
から単離し、ライゲーション用に調製した。目的のフラ
グメントが約10μ9得られ、これをTE緩衝液(50
μm2)に懸濁させた。
実施例10で調製したNde−3Lul消化プラスミド
pLPCDNA(約5 uQ>を、プラスミドpBW3
2のフレノウ処理した〜1.9 kb BamH[制限
フラグメント(5μ12)、IOXリガーゼ緩衝液(1
5μの、T4 DNAリガーゼ(1μQ;約1000
単位)、T4 RNAリガーゼ(1μQ;約2単位)
、およびdHlo(1,5μのに加えた。得られたライ
ゲーション反応液を16°Cで一夜インキコベートした
。ライゲート化DNAは目的のプラスミドpL P C
dhfr 1およびpLPcdhfr2(これらは、d
hfr遺伝子を含有している〜l 、 9 kbフラグ
メントの配向だけが異なっている)からなっていた。
pLPCDNA(約5 uQ>を、プラスミドpBW3
2のフレノウ処理した〜1.9 kb BamH[制限
フラグメント(5μ12)、IOXリガーゼ緩衝液(1
5μの、T4 DNAリガーゼ(1μQ;約1000
単位)、T4 RNAリガーゼ(1μQ;約2単位)
、およびdHlo(1,5μのに加えた。得られたライ
ゲーション反応液を16°Cで一夜インキコベートした
。ライゲート化DNAは目的のプラスミドpL P C
dhfr 1およびpLPcdhfr2(これらは、d
hfr遺伝子を含有している〜l 、 9 kbフラグ
メントの配向だけが異なっている)からなっていた。
実質的に実施例3の方法に従って、このライゲート化D
NAを用いて、大腸菌K12 HBIOIを形質転換
した。形質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平
板培養し、このプラスミドDNAの制限酵素分析によっ
て、アンピシリン耐性大腸菌K 12 HB 101/
pLPcdhfrlおよび大腸菌に12 HB101/
pLPcdhfr2形質転換体を同定した。
NAを用いて、大腸菌K12 HBIOIを形質転換
した。形質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平
板培養し、このプラスミドDNAの制限酵素分析によっ
て、アンピシリン耐性大腸菌K 12 HB 101/
pLPcdhfrlおよび大腸菌に12 HB101/
pLPcdhfr2形質転換体を同定した。
D、プラスミドpL、 P Cdhfr 1 (G T
)およびpLP実質的に実施例4B、lの方法に従って
、BKエンハンサ−とAd2後期プロモーターとの間に
ある、pL P Cdhfr 1またはpL P Cd
hfr2の唯一のXho1部位にポIJ−GT要素を挿
入する。X1101消化したポリーGT要素とX ho
! ?n化したプラスミドpL P Cdhfr l
またはpL P Cdhfr D N l\とをライゲ
ートすると、このライケート化DNAは、各/J、[1
的ノプラスミドpLPcdht’r1(GT)およびp
LPCdhfr2(GT)からなっている。
)およびpLP実質的に実施例4B、lの方法に従って
、BKエンハンサ−とAd2後期プロモーターとの間に
ある、pL P Cdhfr 1またはpL P Cd
hfr2の唯一のXho1部位にポIJ−GT要素を挿
入する。X1101消化したポリーGT要素とX ho
! ?n化したプラスミドpL P Cdhfr l
またはpL P Cdhfr D N l\とをライゲ
ートすると、このライケート化DNAは、各/J、[1
的ノプラスミドpLPcdht’r1(GT)およびp
LPCdhfr2(GT)からなっている。
(以下、余白)
実施例13 プラスミドphdおよびphd(G T
)の構築 A、プラスミドphdの構築 プラスミドphc+を構築するためには、アデニンメチ
ラーゼ(たとえばこれをdam遺伝子がコードしており
、その遺伝子産物は配列: 5’−GATC−3’中の
アデニン残基をメチル化する)を欠く大腸菌宿主細胞か
ら、プラスミドpLPchdl DNA(実施例12
)(これをプラスミドphd構築の出発原料として用い
る)を調製することが必要であった。大腸菌に120M
48(NRRL B−15725,1983年11月
23日寄託)は機能的なdamメチラーゼを欠いており
、従って、プラスミドphd構築の出発原料として用い
るプラスミドpLPchdl DNAを調製する目的
で使用するのに適した宿主である。
)の構築 A、プラスミドphdの構築 プラスミドphc+を構築するためには、アデニンメチ
ラーゼ(たとえばこれをdam遺伝子がコードしており
、その遺伝子産物は配列: 5’−GATC−3’中の
アデニン残基をメチル化する)を欠く大腸菌宿主細胞か
ら、プラスミドpLPchdl DNA(実施例12
)(これをプラスミドphd構築の出発原料として用い
る)を調製することが必要であった。大腸菌に120M
48(NRRL B−15725,1983年11月
23日寄託)は機能的なdamメチラーゼを欠いており
、従って、プラスミドphd構築の出発原料として用い
るプラスミドpLPchdl DNAを調製する目的
で使用するのに適した宿主である。
実質的に実施例3の方法に従って、大腸菌に100M4
8細胞を培養し、形質転換用にコンピテントにし、プラ
スミドpLPchdlを用いてこの大腸菌に100M4
8細胞を形質転換した。
8細胞を培養し、形質転換用にコンピテントにし、プラ
スミドpLPchdlを用いてこの大腸菌に100M4
8細胞を形質転換した。
実質的に実施例3の方法に従って、この形質転換細胞を
アンピシリン含有のL−寒天で平板培養し、アンピシリ
ン耐性の大腸菌K 12 0M48/pLP Chd
1形質転換体がコロニーを形成したら、そのコロニーの
1つを用いてプラスミドpLPChdl DNAを調
製した。約11のプラスミドpLPChdl DNA
が得られ、これをTE緩1iii夜(約l肩Q)に懸濁
した。
アンピシリン含有のL−寒天で平板培養し、アンピシリ
ン耐性の大腸菌K 12 0M48/pLP Chd
1形質転換体がコロニーを形成したら、そのコロニーの
1つを用いてプラスミドpLPChdl DNAを調
製した。約11のプラスミドpLPChdl DNA
が得られ、これをTE緩1iii夜(約l肩Q)に懸濁
した。
TE緩衝液(2μQ)中のプラスミドPLPChdlD
NA(約2μ9)を、IQX Bcll緩衝液[75
0IIIMKC12;60mM トリス−HCr2(p
H7,4)100mM Mg(Jjz ; l OmM
D TT ;および1ri9/yxQ B S A]
(2μ0およびal(、○(14μのに加えた。このプ
ラスミドpLPchdl DNへの溶液に、制限At
素B cl I (2u(1;約10単位)を0口え、
得られた反応液を50’Cて2時間インキユヘートした
。このl見合物をフェノールで1回、クロロホルムで2
回抽出することによって反応を止めた。
NA(約2μ9)を、IQX Bcll緩衝液[75
0IIIMKC12;60mM トリス−HCr2(p
H7,4)100mM Mg(Jjz ; l OmM
D TT ;および1ri9/yxQ B S A]
(2μ0およびal(、○(14μのに加えた。このプ
ラスミドpLPchdl DNへの溶液に、制限At
素B cl I (2u(1;約10単位)を0口え、
得られた反応液を50’Cて2時間インキユヘートした
。このl見合物をフェノールで1回、クロロホルムで2
回抽出することによって反応を止めた。
Bcllt肖化したプラスミドpLPchdl DN
A(約I Alfりを、IOX T4 DNAリガー
セ緩i!ji液(1uQ)、dH,O(8μ&)、およ
びT4DNAIJガ−ゼ(l uQ ;約500単位)
に加えた。このライゲージコン反LJをl 6°Cで一
夜インキユベートした。このライゲート化DNAは目的
のプラスミドphdからなっていた。プラスミドphd
は、プラスミドpLPchdlから全大きさが約1.4
5kbの2個の近接Ba1l制限フラグメントおよびプ
ラスミドpLPcat構築の際に結合した余分のBa1
lリンカ−を欠失することによって得られる。発現させ
ようとするDNAを、プラスミドphdの唯一のBa1
1部位に、発現のための正しい位置で、容易に挿入する
ことができるので、プラスミドphdは、本発明のBK
ウィルスエンハンサー−アデノウィルス後期プロモータ
ーからのすべてのDNA配列の発現を容易にする。
A(約I Alfりを、IOX T4 DNAリガー
セ緩i!ji液(1uQ)、dH,O(8μ&)、およ
びT4DNAIJガ−ゼ(l uQ ;約500単位)
に加えた。このライゲージコン反LJをl 6°Cで一
夜インキユベートした。このライゲート化DNAは目的
のプラスミドphdからなっていた。プラスミドphd
は、プラスミドpLPchdlから全大きさが約1.4
5kbの2個の近接Ba1l制限フラグメントおよびプ
ラスミドpLPcat構築の際に結合した余分のBa1
lリンカ−を欠失することによって得られる。発現させ
ようとするDNAを、プラスミドphdの唯一のBa1
1部位に、発現のための正しい位置で、容易に挿入する
ことができるので、プラスミドphdは、本発明のBK
ウィルスエンハンサー−アデノウィルス後期プロモータ
ーからのすべてのDNA配列の発現を容易にする。
このライゲート化DNAを用い、実質的に実施例3の方
法に従って、大腸菌に100M48を形質転換した。形
質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平板培養し
、プラスミドDNAの制限酵素分析によってアンピシリ
ン耐性の大腸菌に12 GM48/Phd形質転換体を
同定した。
法に従って、大腸菌に100M48を形質転換した。形
質転換細胞をアンピシリン含有のし一寒天で平板培養し
、プラスミドDNAの制限酵素分析によってアンピシリ
ン耐性の大腸菌に12 GM48/Phd形質転換体を
同定した。
プラスミドpLPchdlの代わりに出発原料としてプ
ラスミドpLPChd2、pLPChd3、またはpL
PChd4を用いて前述のプラスミドphdを構築する
方法に実質的に従って、プラスミドphc+に類似のプ
ラスミドを構築することができる。これらの類似のプラ
スミドとプラスミドphdはハイグロマイシン耐性付与
および/またはdhfr遺伝子の配向だけが異なってい
る。
ラスミドpLPChd2、pLPChd3、またはpL
PChd4を用いて前述のプラスミドphdを構築する
方法に実質的に従って、プラスミドphc+に類似のプ
ラスミドを構築することができる。これらの類似のプラ
スミドとプラスミドphdはハイグロマイシン耐性付与
および/またはdhfr遺伝子の配向だけが異なってい
る。
B、プラスミドphd(GT)の構築
1、プラスミドphdを用いる構築
実質的に実施例4B、1の方法に従って、BKエンハン
サ−とAd2後期プロモーターの間にあるphdの唯一
のXho1部位にポリーGT要素を挿入する。Xhol
消化したポリーGT要素とXhol消化したプラスミド
phdDNAとをライゲートした。このライゲート化D
NAは目的のプラスミドphd(G T )からなって
いる。プラスミドphd(GT)の制限部位および機能
地図を添付の第14図に示す。発現させようとするDN
Aを、プラスミドphd(G T )の唯一のBa11
部位に、発現のための正しい位置で容易に挿入すること
ができるので、プラスミドphd(G T )は、本発
明のポリーGT−BKウイルスエンハンサーーアデノウ
ィルス後期プロモーターからのすべてのDNA配列の発
現を容易にする。E1A遺伝子産物のような大きいDN
Aウィルスの即時型遺伝子産物の存在下、プラスミドp
hd(G T )は挿入されたDNA配列の全てに対し
て改良された発現ベクターを与える。
サ−とAd2後期プロモーターの間にあるphdの唯一
のXho1部位にポリーGT要素を挿入する。Xhol
消化したポリーGT要素とXhol消化したプラスミド
phdDNAとをライゲートした。このライゲート化D
NAは目的のプラスミドphd(G T )からなって
いる。プラスミドphd(GT)の制限部位および機能
地図を添付の第14図に示す。発現させようとするDN
Aを、プラスミドphd(G T )の唯一のBa11
部位に、発現のための正しい位置で容易に挿入すること
ができるので、プラスミドphd(G T )は、本発
明のポリーGT−BKウイルスエンハンサーーアデノウ
ィルス後期プロモーターからのすべてのDNA配列の発
現を容易にする。E1A遺伝子産物のような大きいDN
Aウィルスの即時型遺伝子産物の存在下、プラスミドp
hd(G T )は挿入されたDNA配列の全てに対し
て改良された発現ベクターを与える。
実質的に上記への方法に従って、ライゲート化DNAを
用いて大腸菌に100M48を形質転換し、大腸菌K
120M48/phd(GT)形質転換体を選択する。
用いて大腸菌に100M48を形質転換し、大腸菌K
120M48/phd(GT)形質転換体を選択する。
2、プラスミドpLPchd1(GT)、pLPChd
2(GT)、pLPChd3(GT)またはpLPCh
d4(GT)を用いる構築 別法によれば、プラスミドpLPChdl pLPCh
d2、pLPChd3またはpLPChd4の代わりに
プラスミドpLPChd1 (GT)、pLPChd2
(GT)、pLPChd3(GT)またはpt、 P
Chd4 (GT)(実施例12Bに記載)を出発原料
として用いる以外は、実質的に本実施例の上記Aの方法
に従って、プラスミドphd(G T )を調製する。
2(GT)、pLPChd3(GT)またはpLPCh
d4(GT)を用いる構築 別法によれば、プラスミドpLPChdl pLPCh
d2、pLPChd3またはpLPChd4の代わりに
プラスミドpLPChd1 (GT)、pLPChd2
(GT)、pLPChd3(GT)またはpt、 P
Chd4 (GT)(実施例12Bに記載)を出発原料
として用いる以外は、実質的に本実施例の上記Aの方法
に従って、プラスミドphd(G T )を調製する。
実施例14 プラスミドpLPcE1Aおよびpt、
pc E I A(GT)の構築A、プラスミドpLP
cE1Aの構築 アデノウィルス2DNAのE1A遺伝子を単離するため
に、アデノウィルス2DNA(BRLから人手)(約2
0u9)を、IQX Ba1l緩衝液[1100III
トリス−HC(2(pH7,6); 120mM Mg
C12=; 100mM 2−メルカプトエタノール;
お、[l’io/xcBsAコ(10μのオヨびdH,
o(80μのに溶解した。アデノウィルス2DNA溶液
に制限酵素Ba1l(l 0p(1;約20単位)を加
え、得られた溶液を37℃で2時間インキュベートした
。
pc E I A(GT)の構築A、プラスミドpLP
cE1Aの構築 アデノウィルス2DNAのE1A遺伝子を単離するため
に、アデノウィルス2DNA(BRLから人手)(約2
0u9)を、IQX Ba1l緩衝液[1100III
トリス−HC(2(pH7,6); 120mM Mg
C12=; 100mM 2−メルカプトエタノール;
お、[l’io/xcBsAコ(10μのオヨびdH,
o(80μのに溶解した。アデノウィルス2DNA溶液
に制限酵素Ba1l(l 0p(1;約20単位)を加
え、得られた溶液を37℃で2時間インキュベートした
。
E1A遺伝子を含有する〜1.8kb制限フラグメント
が他の消化産物から分離するまで、Ba1l消化DNA
を1%アガロースゲル電気泳動にかけた。
が他の消化産物から分離するまで、Ba1l消化DNA
を1%アガロースゲル電気泳動にかけた。
実質的に実施例4Aの方法に従って、このゲルから〜1
.8kbフラグメントを単離し、ライゲージコン用に調
製した。目的のフラグメントが約3μ9得られ、これを
TE緩衝液(20μのに懸濁した。
.8kbフラグメントを単離し、ライゲージコン用に調
製した。目的のフラグメントが約3μ9得られ、これを
TE緩衝液(20μのに懸濁した。
TE緩衝液(5μC)中のプラスミドpLPCDNA(
約5μg)を、1QXstul緩衝1ffl(2μQ)
およびaH,o(11μ12)に加えた。このプラスミ
ドpLPCDNA溶液に制限酵素S tut(2ttQ
:約10単位)を加え、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。S tul消化プラスミドp
LPCDNAをエタノールで沈澱させ、l0XNdel
緩衝液(2μのおよびdH,0(16μg)に再懸濁し
た。
約5μg)を、1QXstul緩衝1ffl(2μQ)
およびaH,o(11μ12)に加えた。このプラスミ
ドpLPCDNA溶液に制限酵素S tut(2ttQ
:約10単位)を加え、得られた反応液を37℃で2
時間インキュベートした。S tul消化プラスミドp
LPCDNAをエタノールで沈澱させ、l0XNdel
緩衝液(2μのおよびdH,0(16μg)に再懸濁し
た。
このS tul消化プラスミドpt、pc DNAの
溶液に制限酵素Ndel(2μg;約10単位)を加え
、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートした
。
溶液に制限酵素Ndel(2μg;約10単位)を加え
、得られた反応液を37℃で2時間インキュベートした
。
N del −S Lul?肖化プ白化ミドpLPCD
NAをエタノールで沈澱させ、IOXクレノウ緩衝液(
5μ12)およびH,0(42μ12)に懸濁させた。
NAをエタノールで沈澱させ、IOXクレノウ緩衝液(
5μ12)およびH,0(42μ12)に懸濁させた。
DNA溶液にフレノウ酵素(3μe;約6単位)を加え
、得られた反応液を37℃で30分間インキュベートし
た。次いで、〜5.82kbのフレノウ処理Ndel−
3tul制限フラグメントが他の反応生成物から明確に
分離されるまで、反応混合物を1%アガロースゲル電気
泳動にかけた。実質的に実施例4Aの方法に従って、ゲ
ルからフラグメントを単離し、ライゲーション用に調製
した。プラスミドpLPCの〜5.8:2tbクレノウ
処理Ndel−3tul制限フラグメントが約2μ9得
られ、これをTE緩衝液(25μのに懸濁した。
、得られた反応液を37℃で30分間インキュベートし
た。次いで、〜5.82kbのフレノウ処理Ndel−
3tul制限フラグメントが他の反応生成物から明確に
分離されるまで、反応混合物を1%アガロースゲル電気
泳動にかけた。実質的に実施例4Aの方法に従って、ゲ
ルからフラグメントを単離し、ライゲーション用に調製
した。プラスミドpLPCの〜5.8:2tbクレノウ
処理Ndel−3tul制限フラグメントが約2μ9得
られ、これをTE緩衝液(25μのに懸濁した。
El、AjR伝子をコードするアデノウィルス2の〜1
.8kb Ba1l制限フラグメント(約9μのおよび
プラスミドpt、pcの〜5.82kbクレ/つ処理N
del −S tut制限フラグメント(3μのを、I
OXリガーゼ緩衝液く2μQ)およびdH,O(4μQ
)に加えた。T4 DNAリガーセ(1μQ:約50
0単位)およびT4 RNAリガーゼ(lμρ;約2
単位)をDNA溶液に加え、得られた反応液を16℃で
一夜インキユベートした。
.8kb Ba1l制限フラグメント(約9μのおよび
プラスミドpt、pcの〜5.82kbクレ/つ処理N
del −S tut制限フラグメント(3μのを、I
OXリガーゼ緩衝液く2μQ)およびdH,O(4μQ
)に加えた。T4 DNAリガーセ(1μQ:約50
0単位)およびT4 RNAリガーゼ(lμρ;約2
単位)をDNA溶液に加え、得られた反応液を16℃で
一夜インキユベートした。
ライゲートしたDNAは目的のプラスミドpLPCE1
AおよびpLPcE1Al(これらは、E1A遺伝子の
配向が異なっており、そしておそらくはBKエンハンサ
−がプラスミドのE1A遺伝子に有している発現促進効
果が異なっている)からなっていた。プラスミドpLP
cE1A1と比較するとプラスミドpLPcE1Aの方
がE1AプロモーターがBKエンハンサ−に近接して設
置されているため、プラスミドpLPcE1Aを用いる
と、プラスミドpLPcE1Alに比べEI八へ現が高
くなる。
AおよびpLPcE1Al(これらは、E1A遺伝子の
配向が異なっており、そしておそらくはBKエンハンサ
−がプラスミドのE1A遺伝子に有している発現促進効
果が異なっている)からなっていた。プラスミドpLP
cE1A1と比較するとプラスミドpLPcE1Aの方
がE1AプロモーターがBKエンハンサ−に近接して設
置されているため、プラスミドpLPcE1Aを用いる
と、プラスミドpLPcE1Alに比べEI八へ現が高
くなる。
実質的に実施例3の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌に12 HBIOIを形質転換した。
を用いて大腸菌に12 HBIOIを形質転換した。
形質転換細胞を、アンピシリン含有のし一寒天で平板培
養し、アンピシリン耐性形質転換体をそのプラスミドD
NAの制限酵素分析によってスクリーニングし、大腸[
lK12HB101/pLPcE1Aおよび大腸菌に1
2 HBI01/pLPcElΔ1形質転換体を同定し
た。
養し、アンピシリン耐性形質転換体をそのプラスミドD
NAの制限酵素分析によってスクリーニングし、大腸[
lK12HB101/pLPcE1Aおよび大腸菌に1
2 HBI01/pLPcElΔ1形質転換体を同定し
た。
実質的に実施例3の方法に従って、後の試験に用いるた
めに形質転換体からプラスミドDNAを得た。
めに形質転換体からプラスミドDNAを得た。
実質的に実施例4B川の方法に従って、BKエンハンサ
−およびAd2後期プロモーターの間にあるプラスミド
pLPcE1AまたはpL、PCE1AIの唯一のXh
o1部位にポリーGT要素を挿入する。Xhol消化ポ
リ−GT要素およびXhol消化プラスミドpLPCE
1AまたはpLPcE1AI DNAをライゲートす
る。このライゲートしたDNAは、各々、目的のプラス
ミドpLPCE1A(GT)およびpLPCE 1A
1(GT)からなっている。プラスミドpLPCE 1
A(GT)の制限部位および機能地図を添付の第15図
に示す。
−およびAd2後期プロモーターの間にあるプラスミド
pLPcE1AまたはpL、PCE1AIの唯一のXh
o1部位にポリーGT要素を挿入する。Xhol消化ポ
リ−GT要素およびXhol消化プラスミドpLPCE
1AまたはpLPcE1AI DNAをライゲートす
る。このライゲートしたDNAは、各々、目的のプラス
ミドpLPCE1A(GT)およびpLPCE 1A
1(GT)からなっている。プラスミドpLPCE 1
A(GT)の制限部位および機能地図を添付の第15図
に示す。
実施P月5 プラスミドpBLTおよびpBLT(GT
)の構築 A、プラスミドpBLTの構築 TE緩衝液(1μQ)中のプラスミドpBW32 D
NA(第12図、実施例11)(約1μ9)を、IOX
BamH1緩衝液(2μI2)およびdHto(15μ
のに加えた。プラスミドpBW32 DNA溶液に制
限酵素BamHI(約2μρ;約lO単位)を加え、得
られた反応液を37°Cで2時間インキュベートした。
)の構築 A、プラスミドpBLTの構築 TE緩衝液(1μQ)中のプラスミドpBW32 D
NA(第12図、実施例11)(約1μ9)を、IOX
BamH1緩衝液(2μI2)およびdHto(15μ
のに加えた。プラスミドpBW32 DNA溶液に制
限酵素BamHI(約2μρ;約lO単位)を加え、得
られた反応液を37°Cで2時間インキュベートした。
まず反応混合物をフェノールで抽出し、次いで反応混合
物をクロロホルムで2回抽出することによって反応を止
めた。BamHI消化プラスミドpBW32 DNA
(約1μのを、IOXリガーゼ緩衝液(1μQ)および
dHto (18a12)ニ加え、DNA溶MI−T4
DNAリガーゼ(約1μQ;約500単位)を加え
た後、得られた反応液を16°Cで一夜インキニベート
した。
物をクロロホルムで2回抽出することによって反応を止
めた。BamHI消化プラスミドpBW32 DNA
(約1μのを、IOXリガーゼ緩衝液(1μQ)および
dHto (18a12)ニ加え、DNA溶MI−T4
DNAリガーゼ(約1μQ;約500単位)を加え
た後、得られた反応液を16°Cで一夜インキニベート
した。
ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドpBW32
del(約5.6kbの大きさであり、1つのHind
lll制限部位を有している)からなっていた。
del(約5.6kbの大きさであり、1つのHind
lll制限部位を有している)からなっていた。
実質的に実施例3の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌に12 HBIOIを形質転換した。
を用いて大腸菌に12 HBIOIを形質転換した。
目的の大腸菌K 12 HB 101/pBW32cf
el形質転換体を、そのアンピシリン耐性表現型および
そのプラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した
。実質的に実施例3の方法に従って、後の構築に用いる
ために形質転換体からプラスミドpBW32del D
NAを得た。
el形質転換体を、そのアンピシリン耐性表現型および
そのプラスミドDNAの制限酵素分析によって同定した
。実質的に実施例3の方法に従って、後の構築に用いる
ために形質転換体からプラスミドpBW32del D
NAを得た。
TE緩衝液(1tt12)中のプラスミドpBW32d
el(約1 u9)を、10 X H1ndlll緩衝
液(2μ&)およびdHt O(15uQ)に加えた。
el(約1 u9)を、10 X H1ndlll緩衝
液(2μ&)およびdHt O(15uQ)に加えた。
制限酵素Hindlll(21712;約10単位)を
、プラスミドpBW32del DNA溶液に加え、得
られた反応液を37°Cで2時間インキュベートした。
、プラスミドpBW32del DNA溶液に加え、得
られた反応液を37°Cで2時間インキュベートした。
実質的に実施例4Bに記載の方法に従って、試料をTE
緩衝液(100μので希釈し、ウシ腸アルカリホスファ
ターゼで処理した。反応液をフェノールで2回、次いで
クロロホルムで1回抽出した。次いで、Hindlll
消化プラスミドpBW32del DNAをエタノール
で沈澱させ、dH!0(10μm2)に再懸濁した。
緩衝液(100μので希釈し、ウシ腸アルカリホスファ
ターゼで処理した。反応液をフェノールで2回、次いで
クロロホルムで1回抽出した。次いで、Hindlll
消化プラスミドpBW32del DNAをエタノール
で沈澱させ、dH!0(10μm2)に再懸濁した。
実質的に実施例6Aの方法に従って、プラスミドpB
al8 cat(実施例18)を制限酵素Hindll
lで消化し、修飾したBKエンハンサー−アブ/ウィル
ス2後期プロモーターカセットを含有する〜0゜65
kb H1ndlll制限フラグメントを単離し、ライ
ゲージジン用に調製した。TE緩衝液(5uの中のプラ
スミドpB al 8 catの〜0.65 kb H
1ndlll制限フラグメント(約0.1μg)をHi
ndlll消化プラスミドpBW32delの溶液(3
μ+2)に加えた。DNA混合物にT4 DNAリガ
ーゼ(!μσ;約500単位)およびIOXリガーゼ緩
衝液(1μm2)を加え、得られた反応液を16°Cで
一夜インキユベートした。
al8 cat(実施例18)を制限酵素Hindll
lで消化し、修飾したBKエンハンサー−アブ/ウィル
ス2後期プロモーターカセットを含有する〜0゜65
kb H1ndlll制限フラグメントを単離し、ライ
ゲージジン用に調製した。TE緩衝液(5uの中のプラ
スミドpB al 8 catの〜0.65 kb H
1ndlll制限フラグメント(約0.1μg)をHi
ndlll消化プラスミドpBW32delの溶液(3
μ+2)に加えた。DNA混合物にT4 DNAリガ
ーゼ(!μσ;約500単位)およびIOXリガーゼ緩
衝液(1μm2)を加え、得られた反応液を16°Cで
一夜インキユベートした。
ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドpBLTか
らなっていた。実質的に実施例3の方法に従って、この
ライゲート化DNAを用いて、大腸菌に12 HBIO
Iを形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有の
し寒天で平板培養し、アンピシリン耐性大腸菌に12
HBIOI/pBLT形質転換体を、そのプラスミド
DNAの制限酵素分析によって同定した。〜0.65k
bHindlll制限フラグメントは、Hindlll
消化プラスミドpBW32delに、2つの配向のうち
どちらかで挿入することができ(どちらか一方だけがプ
ラスミドpBLTを生じる)、〜0.65kb Hin
dlII制限フラグメントの配向を決定して大腸菌に1
2 HBIOI/pBLT形質転換体を同定した。
らなっていた。実質的に実施例3の方法に従って、この
ライゲート化DNAを用いて、大腸菌に12 HBIO
Iを形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有の
し寒天で平板培養し、アンピシリン耐性大腸菌に12
HBIOI/pBLT形質転換体を、そのプラスミド
DNAの制限酵素分析によって同定した。〜0.65k
bHindlll制限フラグメントは、Hindlll
消化プラスミドpBW32delに、2つの配向のうち
どちらかで挿入することができ(どちらか一方だけがプ
ラスミドpBLTを生じる)、〜0.65kb Hin
dlII制限フラグメントの配向を決定して大腸菌に1
2 HBIOI/pBLT形質転換体を同定した。
実質的に実施例3の方法に従って後の構築に用いるため
に形質転換体からプラスミドpBLT DNAを調製し
た。
に形質転換体からプラスミドpBLT DNAを調製し
た。
B、プラスミドpBLT(GT)の構築実質的に実施例
19の方法に従って、BKエンハンサ−およびAd2後
期プロモーターの間にあるプラスミドpBLTの唯一の
BamH1部位にポリGT要素を挿入する。ポリーGT
要素およびBamH1?肖化プラスミドpBLT D
NAをライゲートする。ライゲートしたDNAは、目的
のプラスミドpBLT(GT)からなっている。プラス
ミドpBLT(C;T)の制限部位および機能地図を添
付の第16図に示す。
19の方法に従って、BKエンハンサ−およびAd2後
期プロモーターの間にあるプラスミドpBLTの唯一の
BamH1部位にポリGT要素を挿入する。ポリーGT
要素およびBamH1?肖化プラスミドpBLT D
NAをライゲートする。ライゲートしたDNAは、目的
のプラスミドpBLT(GT)からなっている。プラス
ミドpBLT(C;T)の制限部位および機能地図を添
付の第16図に示す。
実施例16 プラスミドpBLThygl、pBLTh
yg 2、pB L T hygl(G T )、pB
LThyg2(GT)、pB L Tdhfr 1、p
BLTdh4r2、pB L Tdhrr 1 (GT
)およびpBLTdhfr2(GT)の構築A、プラス
ミドpB L Thyg 1およびpBLThyg2の
横築 TE緩衝液(4μの中のプラスミドpBLT DNA(
実施例15AX約4μ9)を、lOX10XBa緩循i
i(!< (2μQ)およびdH20(12μのに加
えた。プラスミドpBLT DNA溶液に制限酵素B
amH1(2μQ;約10単位)を加え、得られた反応
液を37°Cで2時間インキュベートした。反応混合物
をまずフェノールで、次いでクロロホルムで抽出するこ
とによって反応を停止させた。次いで、BamH1消化
プラスミドpBLT DNAをエタノールで沈澱させ、
TE緩衝液(2メlQ)に再懸濁した。
yg 2、pB L T hygl(G T )、pB
LThyg2(GT)、pB L Tdhfr 1、p
BLTdh4r2、pB L Tdhrr 1 (GT
)およびpBLTdhfr2(GT)の構築A、プラス
ミドpB L Thyg 1およびpBLThyg2の
横築 TE緩衝液(4μの中のプラスミドpBLT DNA(
実施例15AX約4μ9)を、lOX10XBa緩循i
i(!< (2μQ)およびdH20(12μのに加
えた。プラスミドpBLT DNA溶液に制限酵素B
amH1(2μQ;約10単位)を加え、得られた反応
液を37°Cで2時間インキュベートした。反応混合物
をまずフェノールで、次いでクロロホルムで抽出するこ
とによって反応を停止させた。次いで、BamH1消化
プラスミドpBLT DNAをエタノールで沈澱させ、
TE緩衝液(2メlQ)に再懸濁した。
TE緩衝液(10μρ)中のプラスミドpS V 2
hyg(約10μg)を、IOX BanHI緩衝液(
10μ0およびdHto (75uQ)に加えた。制限
酵素BamH1(5μQ:約25単位)を、プラスミド
pSV2hygDNA溶液に加え、得られた反応液を3
7°Cで2時間インキュベートした。BamHI消化プ
ラスミドpSV2hygDNAをエタノールで沈澱させ
、TE緩衝液(10μ12)に再懸濁し、ハイグロマイ
シン耐性付与遺伝子を含有する〜2.5kb BamH
1制限フラグメントが他の消化産物から分離するまで、
1%アガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的
に実施例4Aの方法に従って、〜2.5kb制限フラグ
メントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した
。目的のフラグメントが約2μ9得られ、TE緩神il
夜(10μのに)騒濁した。
hyg(約10μg)を、IOX BanHI緩衝液(
10μ0およびdHto (75uQ)に加えた。制限
酵素BamH1(5μQ:約25単位)を、プラスミド
pSV2hygDNA溶液に加え、得られた反応液を3
7°Cで2時間インキュベートした。BamHI消化プ
ラスミドpSV2hygDNAをエタノールで沈澱させ
、TE緩衝液(10μ12)に再懸濁し、ハイグロマイ
シン耐性付与遺伝子を含有する〜2.5kb BamH
1制限フラグメントが他の消化産物から分離するまで、
1%アガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的
に実施例4Aの方法に従って、〜2.5kb制限フラグ
メントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した
。目的のフラグメントが約2μ9得られ、TE緩神il
夜(10μのに)騒濁した。
BamHI消化プラスミドpBLT DNA(約2
tt+2)およびプラスミドpSV2hygの〜2.5
kb BamH1制限フラグメント(1μのを、IOX
リガーゼ緩衝液(l u(D、dH,○(5μ(りおよ
びT4DNAリガーゼ(lμQ;約500単位)に加え
、得られた反応液を16°Cで一夜インキユベートした
。ライゲート化たDNAは、目的のプラスミドpBLT
hyglおよびpB L Thyg2からなっていた。
tt+2)およびプラスミドpSV2hygの〜2.5
kb BamH1制限フラグメント(1μのを、IOX
リガーゼ緩衝液(l u(D、dH,○(5μ(りおよ
びT4DNAリガーゼ(lμQ;約500単位)に加え
、得られた反応液を16°Cで一夜インキユベートした
。ライゲート化たDNAは、目的のプラスミドpBLT
hyglおよびpB L Thyg2からなっていた。
プラスミドpBLThyglおよびpBLThYg2は
、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子をコードしている〜
25kbBamH+制限フラグメントの配向が異なるた
けである。
、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子をコードしている〜
25kbBamH+制限フラグメントの配向が異なるた
けである。
実質的に実施例3の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌に12HBIO1を形質転換した。形質
転換細胞をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し、ア
ンピシリン耐性大腸菌に12 HB 101/pBLT
hyglおよび大腸菌に12 HB 101/pB L
Thyg2形質転換体を、そのプラスミドDNAの制
限酵素分析によって同定した。
を用いて大腸菌に12HBIO1を形質転換した。形質
転換細胞をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し、ア
ンピシリン耐性大腸菌に12 HB 101/pBLT
hyglおよび大腸菌に12 HB 101/pB L
Thyg2形質転換体を、そのプラスミドDNAの制
限酵素分析によって同定した。
BamHIでプラスミドを部分消化した後、LPAとハ
イグロマイシンシストロンの間にあるプラスミドpBL
ThyglまたはpBLThyg2のBamHI部位に
ボ1−GT要素を挿入する。部分消化は、実質的に実施
例11Cに記載のBamHt部分消化に関する一般的な
方法に従って行う。ポリーGT要素および部分的にBa
mH1消化した直線状のプラスミドpBL’rhygt
またはpBLThyg2 DNAをライゲートする。
イグロマイシンシストロンの間にあるプラスミドpBL
ThyglまたはpBLThyg2のBamHI部位に
ボ1−GT要素を挿入する。部分消化は、実質的に実施
例11Cに記載のBamHt部分消化に関する一般的な
方法に従って行う。ポリーGT要素および部分的にBa
mH1消化した直線状のプラスミドpBL’rhygt
またはpBLThyg2 DNAをライゲートする。
ライゲートしたDNAは、各々、目的のプラスミドpB
L Thyg l (G T)およびpBLThyg
2(GT)からなっている。プラスミドpBLThyg
1(GT)の制限部位および機能地図を添付の第17図
に示す。
L Thyg l (G T)およびpBLThyg
2(GT)からなっている。プラスミドpBLThyg
1(GT)の制限部位および機能地図を添付の第17図
に示す。
C,プラスミドpB L Tdhfr 1およびpB
L Tdhfr2の構築 TE緩衝液(100μQ)中のプラスミドpBW32(
実施例11)(約100μ9)を、IOX BamH
I緩衝′に!i、(15μQ)およびdHa○(25μ
Q)に加えた。
L Tdhfr2の構築 TE緩衝液(100μQ)中のプラスミドpBW32(
実施例11)(約100μ9)を、IOX BamH
I緩衝′に!i、(15μQ)およびdHa○(25μ
Q)に加えた。
このプラスミドpBW32 DNA溶液にIll限酵素
Bam1月(10μρ;約50単位)を加え、得られた
反応液を37°Cで2時間インキュベートした。Bam
)It消化プラスミドpBW32 DNAをエタノー
ルで沈澱させ、TE緩衝液(10μQ)に再懸濁し、d
hfr遺伝子を含有する〜1.9 kb BamHI制
限フラグメントが池の消化産物から分離するまで1%ア
ガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的に実施
例4Aの方法に従って、〜1. 、9 kb制限フラグ
メントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した
。目的のフラグメントか約10μ?得られ、これをTE
緩衝液(50μQ)に懸濁した。
Bam1月(10μρ;約50単位)を加え、得られた
反応液を37°Cで2時間インキュベートした。Bam
)It消化プラスミドpBW32 DNAをエタノー
ルで沈澱させ、TE緩衝液(10μQ)に再懸濁し、d
hfr遺伝子を含有する〜1.9 kb BamHI制
限フラグメントが池の消化産物から分離するまで1%ア
ガロースゲル電気泳動にかけた。次いで、実質的に実施
例4Aの方法に従って、〜1. 、9 kb制限フラグ
メントをゲルから単離し、ライゲーション用に調製した
。目的のフラグメントか約10μ?得られ、これをTE
緩衝液(50μQ)に懸濁した。
本実施例のAで得られたBamHl消化プラスミドpB
LT DNA(約2μのおよびプラスミドpBW32
の〜1.9kb BamHl制限フラグメント(1μ0
をtOXリガーゼ緩衝液(1μの、dH,O(5μのお
よびT4 DNAリガーゼ(lμQ;約500単位)
に加え、得られた反応液を16°Cて−夜インキュベー
トした。ライゲートしたDNAは、目的のブラスミt’
pB L Tdhrr 1およびpB L Tdhfr
2からなっていた。プラスミドpBLTdMrlおよび
pBLTdhfr2は、dhfr遺伝子をフードしてい
る〜1゜9kbBamHI制限フラグメントの配向が異
なるだけである。
LT DNA(約2μのおよびプラスミドpBW32
の〜1.9kb BamHl制限フラグメント(1μ0
をtOXリガーゼ緩衝液(1μの、dH,O(5μのお
よびT4 DNAリガーゼ(lμQ;約500単位)
に加え、得られた反応液を16°Cて−夜インキュベー
トした。ライゲートしたDNAは、目的のブラスミt’
pB L Tdhrr 1およびpB L Tdhfr
2からなっていた。プラスミドpBLTdMrlおよび
pBLTdhfr2は、dhfr遺伝子をフードしてい
る〜1゜9kbBamHI制限フラグメントの配向が異
なるだけである。
実質的に実施例3の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌に12 HBIOIを形質転換した。形
質転換細胞をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し、
アンピシリン耐性大腸菌に12 HB 101/pB
LTdhfrlおよび大腸菌に12 HB 101/
pBLTdMr2形質転換体を、そのプラスミドDNA
の制限酵素分析によって同定した。
を用いて大腸菌に12 HBIOIを形質転換した。形
質転換細胞をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し、
アンピシリン耐性大腸菌に12 HB 101/pB
LTdhfrlおよび大腸菌に12 HB 101/
pBLTdMr2形質転換体を、そのプラスミドDNA
の制限酵素分析によって同定した。
実質的に実施例16Bの方法に従って、プラスミドpB
L Tdhfr 1またはpBLTdMr2のBam
H1部位にポリーGT要素を挿入する。ポリーGT要素
および部分的にBamHI消化した直線状のプラスミド
pB L Tdhfr lまたはpBLTdhfr2
DNAをライゲートする。ライゲートしたDNAは、
各々、プラスミドpB L Tdhfr l (GT)
およびpBLTdhfr2(GT)からなっている。プ
ラスミドpBLTdhfr1(GT)の制限部位オヨヒ
機能地図を添付の第18図に示す。
L Tdhfr 1またはpBLTdMr2のBam
H1部位にポリーGT要素を挿入する。ポリーGT要素
および部分的にBamHI消化した直線状のプラスミド
pB L Tdhfr lまたはpBLTdhfr2
DNAをライゲートする。ライゲートしたDNAは、
各々、プラスミドpB L Tdhfr l (GT)
およびpBLTdhfr2(GT)からなっている。プ
ラスミドpBLTdhfr1(GT)の制限部位オヨヒ
機能地図を添付の第18図に示す。
実施例17 プラスミドphdT P A 、 phd
(G T )T P A、 phdMT P Aおよび
Phd(G T )M T Pへの構築 A、中間体プラスミドpTPA602の構築dH3O(
45μ12)中のプラスミドpTPA103(実施例1
1、第12図)(約50μg)を10XEcoRI緩衝
液(30μI2)オヨびdH、O(225μ&)ニ加え
た。制限酵素EcoRI(10uQ :約80単位)を
プラスミドpTPA103 DNA溶液に加え、得ら
れた反応液を37°Cで90分間インキュベートした。
(G T )T P A、 phdMT P Aおよび
Phd(G T )M T Pへの構築 A、中間体プラスミドpTPA602の構築dH3O(
45μ12)中のプラスミドpTPA103(実施例1
1、第12図)(約50μg)を10XEcoRI緩衝
液(30μI2)オヨびdH、O(225μ&)ニ加え
た。制限酵素EcoRI(10uQ :約80単位)を
プラスミドpTPA103 DNA溶液に加え、得ら
れた反応液を37°Cで90分間インキュベートした。
EcoR1消化プラスミドpTPA103 DNAを
エタノールで沈澱し、IXローディング緩衝M[10%
グリセロールおよび0.02%ブロモフェノールブルー
](50μのに再懸濁し、〜1.1kbEcoRI制限
フラグメントが他の反応生成物から分離するまで1%ア
ガロースゲル電気泳動にかけた。TPAのアミノ末端を
コードしているDNAを含有する〜1.lkb Eco
RI制限フラグメントを、透析バッグに電気泳動させる
ことによってゲルから単離した。次いで、フラグメント
をエタノールで沈澱させ、dH*o(160μm2)に
再懸濁した。
エタノールで沈澱し、IXローディング緩衝M[10%
グリセロールおよび0.02%ブロモフェノールブルー
](50μのに再懸濁し、〜1.1kbEcoRI制限
フラグメントが他の反応生成物から分離するまで1%ア
ガロースゲル電気泳動にかけた。TPAのアミノ末端を
コードしているDNAを含有する〜1.lkb Eco
RI制限フラグメントを、透析バッグに電気泳動させる
ことによってゲルから単離した。次いで、フラグメント
をエタノールで沈澱させ、dH*o(160μm2)に
再懸濁した。
lQXHgal緩衝液[0,5M NaC(!; 60
@MトリスーH(J!(pH7,4):およびO、l
M MgCQtコ(約40μの、d Ht O(200
u12)、および制限酵素Hgal(20uQ :約1
0単位)を、1.1kb EcoRI制限フラグメント
の溶液に加え、得られた反応液を37°Cで4時間イン
キュベートした。Hgal消化DNAをエタノールで沈
澱し、次いで、5%アクリルアミドゲル電気泳動にかけ
、TPAのアミノ末端をコードする〜520bp制限フ
ラグメントをDE81紙によって分離し、回収した。〜
520bpHgalフラグメントが約5μ2得られ、こ
れをdHto (50uQ>に懸濁した。
@MトリスーH(J!(pH7,4):およびO、l
M MgCQtコ(約40μの、d Ht O(200
u12)、および制限酵素Hgal(20uQ :約1
0単位)を、1.1kb EcoRI制限フラグメント
の溶液に加え、得られた反応液を37°Cで4時間イン
キュベートした。Hgal消化DNAをエタノールで沈
澱し、次いで、5%アクリルアミドゲル電気泳動にかけ
、TPAのアミノ末端をコードする〜520bp制限フ
ラグメントをDE81紙によって分離し、回収した。〜
520bpHgalフラグメントが約5μ2得られ、こ
れをdHto (50uQ>に懸濁した。
10xクレノウ緩衝液[0,5M ) 177.−HC
12(pH7,4);および0 、1 M MgC12
t](約12.5μ12)、4種類のデオキシヌクレオ
チドトリホスファターゼが各々6.25n+Mである溶
液(2μQ)、02M DTT(2μI2)、7μg/
1t128 S A (1μm2)、dH。
12(pH7,4);および0 、1 M MgC12
t](約12.5μ12)、4種類のデオキシヌクレオ
チドトリホスファターゼが各々6.25n+Mである溶
液(2μQ)、02M DTT(2μI2)、7μg/
1t128 S A (1μm2)、dH。
0(57,5μI2)、およびフレノウ酵素[ベーリン
ガーーマンヘイム・バイオケミカルズ(Boehr i
ngerMannheim Biochemicals
、 7941 Castleway Dr、、 PO,
Box 50816.1ndianapolis、 I
N 46250)](2u12:約10単位)を、〜5
20bp Hgal制限フラグメントの溶液に加え、得
られた反応液を20°Cで30分間インキュベートした
。フレノウ処理したDNAを70°Cで15分間インキ
ュベートし、エタノールで沈澱させた。
ガーーマンヘイム・バイオケミカルズ(Boehr i
ngerMannheim Biochemicals
、 7941 Castleway Dr、、 PO,
Box 50816.1ndianapolis、 I
N 46250)](2u12:約10単位)を、〜5
20bp Hgal制限フラグメントの溶液に加え、得
られた反応液を20°Cで30分間インキュベートした
。フレノウ処理したDNAを70°Cで15分間インキ
ュベートし、エタノールで沈澱させた。
BamHIリンカ−[5’−CGGGATCCCG−3
’、二本鎖、二ニー・イングランド・バイラブズから入
手した](約500pM)を、ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いて全反応液量25μσ中でリン酸化した。実質
的に実施例7Aに記載の方法に従って、この反応を行っ
た。キナーゼ処理したBamHIリンカ−を、フレノウ
処理した〜520bp Hgal制限フラグメントの溶
液に、IOXリガーゼ緩衝液(15μQ)、T4 D
NAリガーゼ(7μQ;約7バイス単位)および全反応
液量を150μQにするのに十分な量のdH,0と一緒
に加えた。得られた反応液を16℃で一夜インキュベー
トシた。
’、二本鎖、二ニー・イングランド・バイラブズから入
手した](約500pM)を、ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いて全反応液量25μσ中でリン酸化した。実質
的に実施例7Aに記載の方法に従って、この反応を行っ
た。キナーゼ処理したBamHIリンカ−を、フレノウ
処理した〜520bp Hgal制限フラグメントの溶
液に、IOXリガーゼ緩衝液(15μQ)、T4 D
NAリガーゼ(7μQ;約7バイス単位)および全反応
液量を150μQにするのに十分な量のdH,0と一緒
に加えた。得られた反応液を16℃で一夜インキュベー
トシた。
このライゲーション反応液を熱不活性し、DNAをエタ
ノールで沈澱させ、lQXBa第1刊緩衝液(5μ0お
よびd)1.0(45μQ)に懸濁した。制限酵素Ba
mHI(1μC+約16単位)をDNA溶液に加え、得
られた反応液を37°Cで90分間インキュベートした
。反応混合物にさらにBamH1酵素(16単位)を加
え、反応液を37°Cでさらに90分間インキュベート
した。次いで、反応混合液を5%ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、実質的に実施例7Aの方法に従って
、BamHI末端を有する〜530bp Hgal制限
フラグメントをゲルから精製した。目的のフラグメント
が約2μ9得られ、aH,o(20μQ)に懸濁した。
ノールで沈澱させ、lQXBa第1刊緩衝液(5μ0お
よびd)1.0(45μQ)に懸濁した。制限酵素Ba
mHI(1μC+約16単位)をDNA溶液に加え、得
られた反応液を37°Cで90分間インキュベートした
。反応混合物にさらにBamH1酵素(16単位)を加
え、反応液を37°Cでさらに90分間インキュベート
した。次いで、反応混合液を5%ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、実質的に実施例7Aの方法に従って
、BamHI末端を有する〜530bp Hgal制限
フラグメントをゲルから精製した。目的のフラグメント
が約2μ9得られ、aH,o(20μQ)に懸濁した。
BamHI消化した脱リン酸プラスミドpB R322
DNAは、ニュー・イングランド・パイラブズから入手
できる。dHto(2μσ)中のBamHI消化した脱
リン酸プラスミドpBR322(約0.1ug)を、プ
ラスミドp”rpΔ103のBamH1末端を有する〜
530bp Hgal制限フラグメント(1μQ)、a
Hto (14μQ)およびT4 DNAリガーゼ(
1μg;約1バイス単位)に加え、得られた反応液を1
6°Cで一夜インキコベートした。ライゲートしたDN
Aは、目的のプラスミドpTPA602およびpTPA
601と命名した等価なプラスミド(〜530bp制限
フラグメントの配向だけがプラスミドpTP A 60
2と異なる)からなっていた。
DNAは、ニュー・イングランド・パイラブズから入手
できる。dHto(2μσ)中のBamHI消化した脱
リン酸プラスミドpBR322(約0.1ug)を、プ
ラスミドp”rpΔ103のBamH1末端を有する〜
530bp Hgal制限フラグメント(1μQ)、a
Hto (14μQ)およびT4 DNAリガーゼ(
1μg;約1バイス単位)に加え、得られた反応液を1
6°Cで一夜インキコベートした。ライゲートしたDN
Aは、目的のプラスミドpTPA602およびpTPA
601と命名した等価なプラスミド(〜530bp制限
フラグメントの配向だけがプラスミドpTP A 60
2と異なる)からなっていた。
50 mM CaC122を用いる以外は、実質的に実
施例3の方法に従って、ライゲート化DNAを用いて大
腸菌に12MM294を形質転換した。
施例3の方法に従って、ライゲート化DNAを用いて大
腸菌に12MM294を形質転換した。
形質転換細胞をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し
、アンピシリン耐性大腸菌に12MM294/pTPA
602および大腸菌K 12 MM 294/pTPA
601細胞を、そのプラスミドDNAの制限酵素分析に
よって同定した。〜530bpBaTIIHI制限フラ
グメントの存在によって、プラスミドがプラスミドpT
PA602またはpTPA601であることが示された
。
、アンピシリン耐性大腸菌に12MM294/pTPA
602および大腸菌K 12 MM 294/pTPA
601細胞を、そのプラスミドDNAの制限酵素分析に
よって同定した。〜530bpBaTIIHI制限フラ
グメントの存在によって、プラスミドがプラスミドpT
PA602またはpTPA601であることが示された
。
B、中間体プラスミドpTP A 603の構築プラス
ミドpTPA602(約5μりをIOX Bgi11緩
衝液(20μのおよびauto(180μのに溶解した
。制限酵素Bglll(3μQ;約24単位)をプラス
ミドpTPA602 DNA溶液に加え、得られた反
応液を37℃で90分間インキュベートした。次いで、
反応混合物にIOX BamHI緩衝液(約13μa
)を加えて反応混合物の塩濃度を5alt消化用に望ま
しい濃度にし、制限酵素5all(2μQ;約20単位
)を反応液1こ加えた。反応液を37°Cでさらに2時
間インキコベートし、次いで、DNAをエタノールで沈
澱させ、ローディング緩衝液(75μ12)に懸濁させ
、〜4.2kb Bglll−3alI制限フラグメン
トが他の消化産物から分離するまで1%アガロースゲル
電気泳動にかけた。〜4゜2kb Bglll−5al
t制限フラグメントを含有するゲル部分をゲルから切り
取り、凍結し、この凍結セグメントをプラスチックで包
み、圧搾して〜4゜2kbフラグメントを取り出した。
ミドpTPA602(約5μりをIOX Bgi11緩
衝液(20μのおよびauto(180μのに溶解した
。制限酵素Bglll(3μQ;約24単位)をプラス
ミドpTPA602 DNA溶液に加え、得られた反
応液を37℃で90分間インキュベートした。次いで、
反応混合物にIOX BamHI緩衝液(約13μa
)を加えて反応混合物の塩濃度を5alt消化用に望ま
しい濃度にし、制限酵素5all(2μQ;約20単位
)を反応液1こ加えた。反応液を37°Cでさらに2時
間インキコベートし、次いで、DNAをエタノールで沈
澱させ、ローディング緩衝液(75μ12)に懸濁させ
、〜4.2kb Bglll−3alI制限フラグメン
トが他の消化産物から分離するまで1%アガロースゲル
電気泳動にかけた。〜4゜2kb Bglll−5al
t制限フラグメントを含有するゲル部分をゲルから切り
取り、凍結し、この凍結セグメントをプラスチックで包
み、圧搾して〜4゜2kbフラグメントを取り出した。
DNAを沈澱させ、H,0(20μQ)に再懸濁させ、
目的のフラグメントを約20On9得た。
目的のフラグメントを約20On9得た。
ブラスミ)’pTPA103(約12u9)を10XB
g111faffi液(15u&)およびdH,O(1
35μのに溶解した。制限酵素Bgll+(2μQ;約
16単位)をプラスミドpTPA103 DNA溶液
に加え、得られた反応液を37°Cで90分間インキュ
ベートした。IQX BamHI緩衝液(約10μ(
りをBgl[l消化プラスミドpTPA103 DN
Aの溶液に加え、反応混合物の塩濃度を5ail消化用
の濃度にした。制限酵素5all(約2μQ:約20単
位)を、Bgl11消化プラスミドpTpΔ103
DNへの溶液に加え、反応液を37°Cでさらに90分
間インキュベートした。Bglll −S all消化
のプラスミドpTPA103 DNAをエタ/−ル沈
澱によって濃縮し、次いで、1%アカロースゲル電気泳
動にかけ、TPAのアミノ末端以外のすべてをコードす
−る〜2.05kb Bglll−5ail制限フラグ
メントをゲルから単離し、エタノールで沈澱させ、d)
(,0(20μρ)に再懸濁した。目的のフラグメント
が約2μ9得られた。
g111faffi液(15u&)およびdH,O(1
35μのに溶解した。制限酵素Bgll+(2μQ;約
16単位)をプラスミドpTPA103 DNA溶液
に加え、得られた反応液を37°Cで90分間インキュ
ベートした。IQX BamHI緩衝液(約10μ(
りをBgl[l消化プラスミドpTPA103 DN
Aの溶液に加え、反応混合物の塩濃度を5ail消化用
の濃度にした。制限酵素5all(約2μQ:約20単
位)を、Bgl11消化プラスミドpTpΔ103
DNへの溶液に加え、反応液を37°Cでさらに90分
間インキュベートした。Bglll −S all消化
のプラスミドpTPA103 DNAをエタ/−ル沈
澱によって濃縮し、次いで、1%アカロースゲル電気泳
動にかけ、TPAのアミノ末端以外のすべてをコードす
−る〜2.05kb Bglll−5ail制限フラグ
メントをゲルから単離し、エタノールで沈澱させ、d)
(,0(20μρ)に再懸濁した。目的のフラグメント
が約2μ9得られた。
プラスミドpTP A 602の〜4.2kb Bgl
llS all制限フラグメント(約5μのおよびプラ
スミ ドpTPA103の〜2.05 kb Bgl
ll −S all制限フラグメント(2μρ)を、1
.OXリガーゼ緩衝l夜(2uQ’)、dHto(lo
μのおよびT4DNA!Jガーゼ(1μa:約1バイス
単位)に加え、得られたライゲーション反応液を16°
Cで一族インキユベートした。ライゲートしたDNAは
、目的のプラスミドpTP A 603からなっていた
。プラスミドpTPA603の制限部位および機能地図
を添付の第19図に示す。
llS all制限フラグメント(約5μのおよびプラ
スミ ドpTPA103の〜2.05 kb Bgl
ll −S all制限フラグメント(2μρ)を、1
.OXリガーゼ緩衝l夜(2uQ’)、dHto(lo
μのおよびT4DNA!Jガーゼ(1μa:約1バイス
単位)に加え、得られたライゲーション反応液を16°
Cで一族インキユベートした。ライゲートしたDNAは
、目的のプラスミドpTP A 603からなっていた
。プラスミドpTPA603の制限部位および機能地図
を添付の第19図に示す。
50 mM CaCQtを用いた以外は、実質的に実施
例3の方法に従って、ライゲート化DNAを用いて大腸
菌に12MM294を形質転換した。
例3の方法に従って、ライゲート化DNAを用いて大腸
菌に12MM294を形質転換した。
形質転換細胞をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し
、アンピシリン耐性大腸菌に12MM294/pTPA
603形質転換体を、そのプラスミドDNAの制限酵素
分析によって同定した。
、アンピシリン耐性大腸菌に12MM294/pTPA
603形質転換体を、そのプラスミドDNAの制限酵素
分析によって同定した。
C,プラスミドpMTPA603の溝築TE緩衝液(1
00μ(1’)中のプラスミドpBLT(実施例15)
(約100 μy)を、10 X S 5tl(S
stlは制限酵素5aclと等価である)緩衝液[60
mM)リス−HC(!(+))(7,4); 60mM
MgC(、; 60mM 2−メルカプトエタノール
、および1 xg/ m(1BSA](toμC)およ
びdHto(25μυに加えた。
00μ(1’)中のプラスミドpBLT(実施例15)
(約100 μy)を、10 X S 5tl(S
stlは制限酵素5aclと等価である)緩衝液[60
mM)リス−HC(!(+))(7,4); 60mM
MgC(、; 60mM 2−メルカプトエタノール
、および1 xg/ m(1BSA](toμC)およ
びdHto(25μυに加えた。
制限酵素5stl(10μa;約50単位)をプラスミ
ドpBLTDNΔ溶液に加え、得られた反応液を37°
Cで2時間インキュベートした。SstliM化プラス
ミドpBLT DNAをエタノールで沈澱させ、IO
X Ba1ll緩衝液(10μのむよびdH,0(85
μQ)に再懸濁させた。制限酵素Bgll(5μQ:約
50単位)を5stl消化プラスミドpBLT DNA
溶液に加え、得られた反応液を37°Cで2時間インキ
ュベートした。
ドpBLTDNΔ溶液に加え、得られた反応液を37°
Cで2時間インキュベートした。SstliM化プラス
ミドpBLT DNAをエタノールで沈澱させ、IO
X Ba1ll緩衝液(10μのむよびdH,0(85
μQ)に再懸濁させた。制限酵素Bgll(5μQ:約
50単位)を5stl消化プラスミドpBLT DNA
溶液に加え、得られた反応液を37°Cで2時間インキ
ュベートした。
実質的に実施例4Aの方法に従って、Bgll−3st
l消化プラスミドpBLT DNAをエタノールで沈
澱させ、dH’、O(10μC)に再懸濁し、15%ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、プラスミドpBLTの〜
690bp Bgl!l−3stl制限フラグメント[
修飾TPAの暗号配列を得るための削除が為されている
修飾TPA暗号配列の部分を含有するコをゲルから単離
した。目的の、プラスミドpBLTの〜690bp B
glll−3stl制限フラグメントが約5μ9得られ
、これをdH,o(100μQ)に懸濁した。
l消化プラスミドpBLT DNAをエタノールで沈
澱させ、dH’、O(10μC)に再懸濁し、15%ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、プラスミドpBLTの〜
690bp Bgl!l−3stl制限フラグメント[
修飾TPAの暗号配列を得るための削除が為されている
修飾TPA暗号配列の部分を含有するコをゲルから単離
した。目的の、プラスミドpBLTの〜690bp B
glll−3stl制限フラグメントが約5μ9得られ
、これをdH,o(100μQ)に懸濁した。
TE緩衝液(5バ)中のプラスミドp’r P A 6
03(本実施例のB、第19図)(約5μg)をl0X
Sstl緩衝液(l Oμ+2)およびdH,o(95
μのに加えた。制限酵素5stl(約5μσ、約50単
位)をプラスミドpTPA603 DNAの溶液に加
え、得られた反応液を37°Cで2時間インキュベート
した。Sst!消化プラスミドpTP、A603 D
NAをエタノールで沈澱し、IOX Bgll+緩衝
液(10μQ)およびdHto(85μQ)に再懸濁し
た。制限酵素Bg111(5μm2;約50単位)をS
st1M化プラスミドpTPA603 DNA溶液に
加え、得られた反応液を37°Cで2時間インキュベー
トした。
03(本実施例のB、第19図)(約5μg)をl0X
Sstl緩衝液(l Oμ+2)およびdH,o(95
μのに加えた。制限酵素5stl(約5μσ、約50単
位)をプラスミドpTPA603 DNAの溶液に加
え、得られた反応液を37°Cで2時間インキュベート
した。Sst!消化プラスミドpTP、A603 D
NAをエタノールで沈澱し、IOX Bgll+緩衝
液(10μQ)およびdHto(85μQ)に再懸濁し
た。制限酵素Bg111(5μm2;約50単位)をS
st1M化プラスミドpTPA603 DNA溶液に
加え、得られた反応液を37°Cで2時間インキュベー
トした。
実質的に実施例4Bの方法に従って、Bglll−Ss
tl肖化のプラスミドpT P A 603 DNA
をTE緩衝液で100μρに希釈し、ウシ腸アルカリホ
スファターセで処理した。次いで、DNAをエタノール
で沈澱させ、aHzo(10uρ)に再懸濁した。
tl肖化のプラスミドpT P A 603 DNA
をTE緩衝液で100μρに希釈し、ウシ腸アルカリホ
スファターセで処理した。次いで、DNAをエタノール
で沈澱させ、aHzo(10uρ)に再懸濁した。
Bglll −S stl消化プラスミドp′FPA6
03(約5μのおよびプラスミドpBLTの〜690b
pBg111−3stl制限フラグメント(2μ(りを
、IOXリガーセgB衝液樹液μI2)、dH,0(1
0Il&)、およびT4DNAリカーゼ(1μQ:約1
000単位)に加え、得られたライゲーション反応液を
16°Cで一族インキユベートした。ライゲートしたD
NAは目的のプラスミドpMTPA603からなってい
た。プラスミドpMTPA603はプラスミドpTPA
603(第19図)の構造に類似しているが、ブラフ、
ミhpM′rPA603が修飾TPAをコードし、プラ
スミドpTPA603がTPAをコードしていることが
異なっている。
03(約5μのおよびプラスミドpBLTの〜690b
pBg111−3stl制限フラグメント(2μ(りを
、IOXリガーセgB衝液樹液μI2)、dH,0(1
0Il&)、およびT4DNAリカーゼ(1μQ:約1
000単位)に加え、得られたライゲーション反応液を
16°Cで一族インキユベートした。ライゲートしたD
NAは目的のプラスミドpMTPA603からなってい
た。プラスミドpMTPA603はプラスミドpTPA
603(第19図)の構造に類似しているが、ブラフ、
ミhpM′rPA603が修飾TPAをコードし、プラ
スミドpTPA603がTPAをコードしていることが
異なっている。
実施例3の方法に従って、ライゲート化DNAを用いて
大腸菌K12HBIO1を形質転換した。形質転換細胞
をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し、アンピシリ
ン耐性大腸菌に12HB 101./pMTPA603
形質転換体を、そのプラスミドDNAの制限酵素分析に
よって同定した。
大腸菌K12HBIO1を形質転換した。形質転換細胞
をアンピシリン含有のし寒天で平板培養し、アンピシリ
ン耐性大腸菌に12HB 101./pMTPA603
形質転換体を、そのプラスミドDNAの制限酵素分析に
よって同定した。
D、プラスミドphd′FP Aの構築TE緩衝液(1
0μ12)中のプラスミドp’r P A 503[本
実施例のB、第19図](約ioμg)を、1010X
Ba!緩衝液(10μのおよびdH,○(85μのに加
えた。制限酵素Bam)II(5μg、約50単位)を
プラスミドpTPA603 DNA溶液に加え、得ら
れた反応液を37°Cで2時間インキユベートシた。B
amHI消化プラスミドpTPA603DNAをエタノ
ールテ沈澱させ、dHto (10uQ)に再懸濁させ
、TPAをコードする〜1.90kbBamHI制限フ
ラグメントを他の消化産物から分離するまで1%アガロ
ースゲル電気泳動にかけた。
0μ12)中のプラスミドp’r P A 503[本
実施例のB、第19図](約ioμg)を、1010X
Ba!緩衝液(10μのおよびdH,○(85μのに加
えた。制限酵素Bam)II(5μg、約50単位)を
プラスミドpTPA603 DNA溶液に加え、得ら
れた反応液を37°Cで2時間インキユベートシた。B
amHI消化プラスミドpTPA603DNAをエタノ
ールテ沈澱させ、dHto (10uQ)に再懸濁させ
、TPAをコードする〜1.90kbBamHI制限フ
ラグメントを他の消化産物から分離するまで1%アガロ
ースゲル電気泳動にかけた。
〜1.90kb BamHl制限フラグメントをゲルか
ら単離し、TE緩衝液(50μのに再懸濁し、目的のフ
ラグメントを約4μ9得た。
ら単離し、TE緩衝液(50μのに再懸濁し、目的のフ
ラグメントを約4μ9得た。
10X Ba1l緩衝液(2μC)およびdHto(1
4μのにTE緩衝液(2μQ)中のプラスミドphd
(実施例13)(約2μ9)を加えた。制限酵素Bcl
l(2μ&:約10単位)をプラスミドphd D N
A 溶液ニ加え、得られた反応液を50°Cで2時間
インキュベートした。反応混合物をまずエタノールで、
次いでクロロホルムで2回抽出することによって反応を
止めた。次いで、Ba1l消化プラスミドphdDNΔ
をエタノールで沈澱させ、TE緩衝液(20μQ)中に
再懸濁させた。
4μのにTE緩衝液(2μQ)中のプラスミドphd
(実施例13)(約2μ9)を加えた。制限酵素Bcl
l(2μ&:約10単位)をプラスミドphd D N
A 溶液ニ加え、得られた反応液を50°Cで2時間
インキュベートした。反応混合物をまずエタノールで、
次いでクロロホルムで2回抽出することによって反応を
止めた。次いで、Ba1l消化プラスミドphdDNΔ
をエタノールで沈澱させ、TE緩衝液(20μQ)中に
再懸濁させた。
Bcl!消化プラスミドphd(約1μのおよびプラス
ミドp’r P A 603の〜1.90kb Bam
HI制限フラグメント(2μ12)を、IOXリガーセ
緩衝液(1μの、dH,O(5μ0、およびT4DNA
IJガーゼ(1μQ;約500単位)に加えた。得られ
たライゲーンヨン反応液を16°Cで一夜インキユベー
トした。ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドp
hdT P Aからなっていた。
ミドp’r P A 603の〜1.90kb Bam
HI制限フラグメント(2μ12)を、IOXリガーセ
緩衝液(1μの、dH,O(5μ0、およびT4DNA
IJガーゼ(1μQ;約500単位)に加えた。得られ
たライゲーンヨン反応液を16°Cで一夜インキユベー
トした。ライゲートしたDNAは、目的のプラスミドp
hdT P Aからなっていた。
実質的に実施例3の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌に12 HBIOI(NRRL B−
15626)を形質転換した。形質転換混合物をアンピ
シリン含有のし寒天で平板培養し、アンピシリン耐性大
腸菌K l 2 HB 101/phdTPA細胞を
制限酵素分析によって同定した。〜1、90kb Ba
mHl制限フラグメントは、プラスミドphd中に、2
つの配向のうちどちらかで挿入することができ、その一
方においてのみ、BKエンハンサーーアデノウィルス後
期プロモーターカセットのコントロール下で発現され得
る適切な位置にTPA暗号配列が配置されており、これ
が目的のプラスミドphdT P Aとなる。
を用いて大腸菌に12 HBIOI(NRRL B−
15626)を形質転換した。形質転換混合物をアンピ
シリン含有のし寒天で平板培養し、アンピシリン耐性大
腸菌K l 2 HB 101/phdTPA細胞を
制限酵素分析によって同定した。〜1、90kb Ba
mHl制限フラグメントは、プラスミドphd中に、2
つの配向のうちどちらかで挿入することができ、その一
方においてのみ、BKエンハンサーーアデノウィルス後
期プロモーターカセットのコントロール下で発現され得
る適切な位置にTPA暗号配列が配置されており、これ
が目的のプラスミドphdT P Aとなる。
E、プラスミドphd(G T )T P Aの構築実
質的に実施例4B。■の方法に従って、BKエンハンサ
−とAd2後期プロモーターの間にあるプラスミドph
dT P A (本実施例のD)の唯一のXho1部位
にポリーGT要素を挿入する。Xhol消化ポリ−GT
要素およびXhol消化プラスミドphdTPA D
NAをライゲートする。ライゲートしたDNAは、目的
のプラスミドphd(G T )T P Aからなって
いる。プラスミドphd(G T )T P Aの制限
部位および機能地図を添付の第20図に示す。
質的に実施例4B。■の方法に従って、BKエンハンサ
−とAd2後期プロモーターの間にあるプラスミドph
dT P A (本実施例のD)の唯一のXho1部位
にポリーGT要素を挿入する。Xhol消化ポリ−GT
要素およびXhol消化プラスミドphdTPA D
NAをライゲートする。ライゲートしたDNAは、目的
のプラスミドphd(G T )T P Aからなって
いる。プラスミドphd(G T )T P Aの制限
部位および機能地図を添付の第20図に示す。
F、プラスミドhdMTPAの構築
TE緩衝液(loμ+り中のプラスミドpMTPA60
3[本実施例のC](約10uy)を10X10XBa
緩衝液(10μQ)およびdH,0(85μllりに加
えた。制限酵素BamHI(5μQ;約50単位)をプ
ラスミドpMTPA603 DNA溶液に加え、得ら
れた反応液を37℃で2時間インキュベートした。
3[本実施例のC](約10uy)を10X10XBa
緩衝液(10μQ)およびdH,0(85μllりに加
えた。制限酵素BamHI(5μQ;約50単位)をプ
ラスミドpMTPA603 DNA溶液に加え、得ら
れた反応液を37℃で2時間インキュベートした。
Ba耐11消化プラスミドpMTPA603 DNA
をエタノールで沈澱させ、dH,0(10μQ)に再懸
濁し、修飾TPAをコードする”−1,35kb Ba
mH+制限フラグメントが他の消化産物から分離するま
で1%アガロースゲル電気泳動にかけた。
をエタノールで沈澱させ、dH,0(10μQ)に再懸
濁し、修飾TPAをコードする”−1,35kb Ba
mH+制限フラグメントが他の消化産物から分離するま
で1%アガロースゲル電気泳動にかけた。
1、35 kb BamHl制限フラグメントをゲルか
ら単離し、これをTE緩衝液(20μa)に再懸濁し、
目的のフラグメン七を約4μ9得た。
ら単離し、これをTE緩衝液(20μa)に再懸濁し、
目的のフラグメン七を約4μ9得た。
B all消化プラスミドphd[本実施例のD](約
1μm2)およびプラスミドpMTPΔ603の〜13
5kbBamHI制限フラグメント(2μρ)をIOX
リガーゼ緩衝液(1μQ)、dH,o(5μのおよびT
4DNAリガーゼ(lμa;約500単位)に加えた。
1μm2)およびプラスミドpMTPΔ603の〜13
5kbBamHI制限フラグメント(2μρ)をIOX
リガーゼ緩衝液(1μQ)、dH,o(5μのおよびT
4DNAリガーゼ(lμa;約500単位)に加えた。
得られたライゲーション反応液を16°Cで一夜インキ
ユベートした。ライゲートしたDNAは目的のプラスミ
ドphdM T P Aからなっていた。
ユベートした。ライゲートしたDNAは目的のプラスミ
ドphdM T P Aからなっていた。
実質的に実施例3の方法に従って、ライゲート化DNA
を用いて大腸菌K12l−1BIOIを形質転換した。
を用いて大腸菌K12l−1BIOIを形質転換した。
形質転換混合物をアンピシリン含有のし寒天で平板培養
し、アンピシリン耐性大腸菌K 12 HB 101
/phdMTPA細胞をそのプラスミドDNAの制限酵
素分析によって同定した。
し、アンピシリン耐性大腸菌K 12 HB 101
/phdMTPA細胞をそのプラスミドDNAの制限酵
素分析によって同定した。
〜1.35kb BamH1制限フラグメントは、Bc
ll消化プラスミドphd中に、2つの配向のどちらか
で挿入することができ、その一方だけがBKエンハンサ
ーーアデノウィルス後期プロモーターのコントロール下
で発現し得る適切な位置にTPA暗号配列を配置してお
り、これが目的のプラスミドphdMT P Aとなる
。
ll消化プラスミドphd中に、2つの配向のどちらか
で挿入することができ、その一方だけがBKエンハンサ
ーーアデノウィルス後期プロモーターのコントロール下
で発現し得る適切な位置にTPA暗号配列を配置してお
り、これが目的のプラスミドphdMT P Aとなる
。
G、プラスミドphd(G T )M T P Aの構
築実施例4B、1の方法に従って、BKエンハンサ−お
よびAd2後期プロモーターの間にあるプラスミドph
dMTPA[本実施例のF3の唯一のxh01部位にポ
リーGT要素を挿入した。Xhol消化ノポリーGT要
素とXhol消化のプラスミドphdMTPA DN
Aをライケートする。ライゲートしたDNAは、目的の
プラスミドphd(G T )M T PAからなって
いた。プラスミドphd(G T )M T PAの制
限部位および機能地図を添付の第21図に示す。
築実施例4B、1の方法に従って、BKエンハンサ−お
よびAd2後期プロモーターの間にあるプラスミドph
dMTPA[本実施例のF3の唯一のxh01部位にポ
リーGT要素を挿入した。Xhol消化ノポリーGT要
素とXhol消化のプラスミドphdMTPA DN
Aをライケートする。ライゲートしたDNAは、目的の
プラスミドphd(G T )M T PAからなって
いた。プラスミドphd(G T )M T PAの制
限部位および機能地図を添付の第21図に示す。
実施例18改良されたエンハンサーープロモーターカセ
ットの構築 近接の真核性プロモーターのCCAAT領域またはCC
AAT領域等価域の5゛末端の上流のO〜300ヌクレ
オチドのところにエンハンサ−を設置することによって
、BKエンハンサ−の転写促進効果を有意に増強するこ
とができる。実施例19に記載のように、大きいDNA
ウィルスの即時型遺伝子産物(例えば、E1A遺伝子産
物)の存在下、BKエンハンサー−Ad2後JO17’
ロモーターカセットの上流または下流にポリー〇T要素
を設置することによって転写の促進をさらに増強するこ
とができる。さらに大きい促進活性を達成するための修
飾を行う前の、本BKエンハンサーーアデノウィルス2
後期ブローターカセットの配列および機能的要素は以下
のとおりである;AAGCCTCCACACCC?I’
ACTA CTTGAGAGAA AGGGTGG
AGGGACAAAGGCCATGGTTCTGCGC
CAGGCTGT CCrCGAGCGGS≦tx GAGACGAAGG CTCGCGTCCA G
GCCAGCACG AAGGAGGCTAAGTG
GGAGGG GTAGCGGTCG TTGTC
CACTA GGGGGTCCACGCGTI’CG
TCCTCACTCTCTT CCGCATCGCT
GTCrGCGAGG(式中、Aはデオキシアデニ
ル、Gはデオキシグアニル、Cはチオキシシチジル、T
はチミジルを表す)。
ットの構築 近接の真核性プロモーターのCCAAT領域またはCC
AAT領域等価域の5゛末端の上流のO〜300ヌクレ
オチドのところにエンハンサ−を設置することによって
、BKエンハンサ−の転写促進効果を有意に増強するこ
とができる。実施例19に記載のように、大きいDNA
ウィルスの即時型遺伝子産物(例えば、E1A遺伝子産
物)の存在下、BKエンハンサー−Ad2後JO17’
ロモーターカセットの上流または下流にポリー〇T要素
を設置することによって転写の促進をさらに増強するこ
とができる。さらに大きい促進活性を達成するための修
飾を行う前の、本BKエンハンサーーアデノウィルス2
後期ブローターカセットの配列および機能的要素は以下
のとおりである;AAGCCTCCACACCC?I’
ACTA CTTGAGAGAA AGGGTGG
AGGGACAAAGGCCATGGTTCTGCGC
CAGGCTGT CCrCGAGCGGS≦tx GAGACGAAGG CTCGCGTCCA G
GCCAGCACG AAGGAGGCTAAGTG
GGAGGG GTAGCGGTCG TTGTC
CACTA GGGGGTCCACGCGTI’CG
TCCTCACTCTCTT CCGCATCGCT
GTCrGCGAGG(式中、Aはデオキシアデニ
ル、Gはデオキシグアニル、Cはチオキシシチジル、T
はチミジルを表す)。
この図から、BKエン/%ンサーはA T CCから■
R−837の下で人手可能なりKウィルスのプロトタイ
プ株を起源とすると予測される。しかしながら、ATC
CVR−837はBKエンI\ンサー変異体の混合物で
ある。本明細書記載のプラスミドpBal8catおよ
び他のBKエンハンサ−含有プラスミドは記載のBKプ
ロトタイプエンノ\ンサーではなく、プロトタイプ株か
ら単離されたBKエンハンサ−変異体を含有している。
R−837の下で人手可能なりKウィルスのプロトタイ
プ株を起源とすると予測される。しかしながら、ATC
CVR−837はBKエンI\ンサー変異体の混合物で
ある。本明細書記載のプラスミドpBal8catおよ
び他のBKエンハンサ−含有プラスミドは記載のBKプ
ロトタイプエンノ\ンサーではなく、プロトタイプ株か
ら単離されたBKエンハンサ−変異体を含有している。
上記のプロトタイブエンノ・ンサーの配列式の243位
から467位に対応する変異体エンノ・ンサーの配列が
プロトタイプpBal8catおよび他のプラスミド類
に見い出され、下記式で示される: しかしながら、上記のごとく、本発明方法および本発明
化合物には任意のBK二ンノ1ンサー変異体を用いるこ
とができる。
から467位に対応する変異体エンノ・ンサーの配列が
プロトタイプpBal8catおよび他のプラスミド類
に見い出され、下記式で示される: しかしながら、上記のごとく、本発明方法および本発明
化合物には任意のBK二ンノ1ンサー変異体を用いるこ
とができる。
プロトタイプBKエンハンサ−は上記式で示されるよう
に、3つの反復される配列であって、いずれの方向にあ
っても隣接する配列に関して同様に機能するものと定義
される。エンノ\ンサー、具体的には、BKエンハンサ
−の第3リピート(反復)の3′末端(これは方向性に
依存する)を、アデノウイルス−2のCCAAT領域の
5°末端に近付けるために、TE緩衝液(170μQ)
中の5stff消化プラスミドpB IcatDNA(
実施例5)(約82μg)を5xBa131ヌクレアー
ゼ緩衝液(0,1M Tris−HC12.pH8,L
0.5M NaCt!、0.06M CaCQ、、お
よび5 mM N a * E D T A )(20
μe)およびBa131ヌクレアーゼ(9μの、これは
6μ12(約6単位)の°°早い”Ba131酵素と3
rtQ(約3単位)の″遅い”Ba131酵素からなる
[インターナショナル・バイオチクノロシーズ(I n
ternational Biotechnologi
es+ Inc、 ) P、O,BOX 9558.2
75 Winchester AVe、+ Nev H
aven、CT 06506から市場化されている]に
加えた。反応混合物を30℃で約3分間インキュベート
し、1.QM EDTA(約10μC)を加えて反応を
停止させた後、Ba131−消化DNAをエタノール沈
殿と遠心によって収集した。DNAベレットをI×クレ
ノウ緩衝液に再懸濁し、本明細書に既述の方法と実質上
、同様にしてフレ/つ酵素で処理した。
に、3つの反復される配列であって、いずれの方向にあ
っても隣接する配列に関して同様に機能するものと定義
される。エンノ\ンサー、具体的には、BKエンハンサ
−の第3リピート(反復)の3′末端(これは方向性に
依存する)を、アデノウイルス−2のCCAAT領域の
5°末端に近付けるために、TE緩衝液(170μQ)
中の5stff消化プラスミドpB IcatDNA(
実施例5)(約82μg)を5xBa131ヌクレアー
ゼ緩衝液(0,1M Tris−HC12.pH8,L
0.5M NaCt!、0.06M CaCQ、、お
よび5 mM N a * E D T A )(20
μe)およびBa131ヌクレアーゼ(9μの、これは
6μ12(約6単位)の°°早い”Ba131酵素と3
rtQ(約3単位)の″遅い”Ba131酵素からなる
[インターナショナル・バイオチクノロシーズ(I n
ternational Biotechnologi
es+ Inc、 ) P、O,BOX 9558.2
75 Winchester AVe、+ Nev H
aven、CT 06506から市場化されている]に
加えた。反応混合物を30℃で約3分間インキュベート
し、1.QM EDTA(約10μC)を加えて反応を
停止させた後、Ba131−消化DNAをエタノール沈
殿と遠心によって収集した。DNAベレットをI×クレ
ノウ緩衝液に再懸濁し、本明細書に既述の方法と実質上
、同様にしてフレ/つ酵素で処理した。
フレノウ−処理DNAをTE緩衝液(Jou(J)に再
懸濁し、次いで、DNA(約1μQ)を既述のごとく、
I×リガーゼ緩衝液(Jouff)中、T4.DNAお
よびRNAリガーゼを用いて自己結合させた。
懸濁し、次いで、DNA(約1μQ)を既述のごとく、
I×リガーゼ緩衝液(Jouff)中、T4.DNAお
よびRNAリガーゼを用いて自己結合させた。
結合したDNAを用いて大腸菌に12HB101を形質
転換体し、次いで、得られた形質転換体をアンピシリン
含有し一寒天上で平板培養した。
転換体し、次いで、得られた形質転換体をアンピシリン
含有し一寒天上で平板培養した。
どの形質転換体が適切な大きさのBKエンハンサー−ア
デノウイルス2後期プロモーターカセットを含有してい
るかを決定するために制限酵素分析を行った。前記の工
程によって、アデノウィルス後期プロモーターのCCA
AT領域の上流O〜300ヌクレオチドの間にBKエン
ノ1ンサーか位置している多数のプラスミドが生成した
。この工程で得られた1つのプラスミドをプラスミドp
Bal8catと命名した。プラスミドpBal8ca
tはNRRLから受託番号NRRL B−18267
の下で入手可能である(寄託日: 1987年12月1
日)。プラスミドpBal8catは上記のごとく、約
100bpづつの2個のリピート(繰返し)配列を含ん
だBKエンハンサ−変異体を含有している。この変異体
エンハンサ−は、第2リピートの3′末端をアデノウィ
ルス後期プロモーターのCCA T領域の1〜300ヌ
クレオチドの間に設置することによって、本発明方法に
用いることができる。
デノウイルス2後期プロモーターカセットを含有してい
るかを決定するために制限酵素分析を行った。前記の工
程によって、アデノウィルス後期プロモーターのCCA
AT領域の上流O〜300ヌクレオチドの間にBKエン
ノ1ンサーか位置している多数のプラスミドが生成した
。この工程で得られた1つのプラスミドをプラスミドp
Bal8catと命名した。プラスミドpBal8ca
tはNRRLから受託番号NRRL B−18267
の下で入手可能である(寄託日: 1987年12月1
日)。プラスミドpBal8catは上記のごとく、約
100bpづつの2個のリピート(繰返し)配列を含ん
だBKエンハンサ−変異体を含有している。この変異体
エンハンサ−は、第2リピートの3′末端をアデノウィ
ルス後期プロモーターのCCA T領域の1〜300ヌ
クレオチドの間に設置することによって、本発明方法に
用いることができる。
当業者ならば、上記工程で多くの別のプラスミドが得ら
れ、プラスミドpBal8catがその例示のプラスミ
ドであることを認識するであろう。これらのプラスミド
は、Ad2後期プロモーターのCCAATtJIbJi
から300ヌクレオチド以内の様々な位置にBKエンハ
ンサ7が存在している1群のプラスミドである。上記の
工程または他の当業者既知の工程によって達成可能な、
このBKエンハンサ−活性の改善法は任意のBKエンノ
−ンサーおよび任意の真核性プロモーターを用いて達成
することができる。
れ、プラスミドpBal8catがその例示のプラスミ
ドであることを認識するであろう。これらのプラスミド
は、Ad2後期プロモーターのCCAATtJIbJi
から300ヌクレオチド以内の様々な位置にBKエンハ
ンサ7が存在している1群のプラスミドである。上記の
工程または他の当業者既知の工程によって達成可能な、
このBKエンハンサ−活性の改善法は任意のBKエンノ
−ンサーおよび任意の真核性プロモーターを用いて達成
することができる。
実施例19 改善されたポリGT−エンノ\ンサープロ
モーターーカセットの構築 上記実施例18記載の、プラスミドpBal8catで
例示される種々のプラスミド各々にポリー〇T要素(エ
レメント)を挿入することができる。この1群のポリー
GT含有プラスミドはAd2後期プロモーターのCCA
AT領域から300ヌクレオチド以内の様々な距離のと
ころにBKエンノ\ンサーが配された発現ベクター内の
、CAT遺伝子の3°または5゛側にいずれかの方向で
ポリーGT要素が配置されており、本発明の重要な聾様
を構成している。ポリ−GTのプラスミドpB at
8 catへの挿入は以下のようにして行われた。TE
緩衝液(1μf2)中のpB al8 catD N
A (実施例18)(約1μ9)をIOX:Iア(Co
re)緩衝液(2μ(りおよび水(16u12)に溶か
した。制限酵素BamH’ (lμ12、約10単位)
をDNA溶液に加え、得られた反応混合物を37°Cで
2時間インキュベートした。このインキュベーションに
次いで、1合物を70°Cで10分間、熱−活性化した
。
モーターーカセットの構築 上記実施例18記載の、プラスミドpBal8catで
例示される種々のプラスミド各々にポリー〇T要素(エ
レメント)を挿入することができる。この1群のポリー
GT含有プラスミドはAd2後期プロモーターのCCA
AT領域から300ヌクレオチド以内の様々な距離のと
ころにBKエンノ\ンサーが配された発現ベクター内の
、CAT遺伝子の3°または5゛側にいずれかの方向で
ポリーGT要素が配置されており、本発明の重要な聾様
を構成している。ポリ−GTのプラスミドpB at
8 catへの挿入は以下のようにして行われた。TE
緩衝液(1μf2)中のpB al8 catD N
A (実施例18)(約1μ9)をIOX:Iア(Co
re)緩衝液(2μ(りおよび水(16u12)に溶か
した。制限酵素BamH’ (lμ12、約10単位)
をDNA溶液に加え、得られた反応混合物を37°Cで
2時間インキュベートした。このインキュベーションに
次いで、1合物を70°Cで10分間、熱−活性化した
。
I3amHI3μpBal8catDNA(1μm2、
約50ng)と実施例1で調製したポリーGT合成断片
(7μQ、約500 ng)の混合物に10xリガーゼ
緩衝液(1μm2)を加えた。このDNA溶液にT4D
NAリガーゼ(1μe、約400単位)を加え、得られ
た反応混合物を16°Cで一夜インキユベートした。
約50ng)と実施例1で調製したポリーGT合成断片
(7μQ、約500 ng)の混合物に10xリガーゼ
緩衝液(1μm2)を加えた。このDNA溶液にT4D
NAリガーゼ(1μe、約400単位)を加え、得られ
た反応混合物を16°Cで一夜インキユベートした。
結合したDNAは、挿入ポリ−GT要素のCAT暗号配
列に関する方向性のみが異なる、所望のプラスミドpB
al 8 cat(G T 6 )(センス)および
pBal8 cat(G T 9 )(アンチセンス)
をそれぞれ構成していた。E1A遺伝子のような大きい
DNAウィルスの即時型遺伝子産物の存在下におけるポ
リーGT要素のエンハンサ−活性は、それが挿入された
プラスミド発現ベクター内でのポリーGT要素の方向に
よって左右されない。従って、例えば、プラスミドpB
al8 cat(G T 6 )およびプラスミドp
B al 8 cat(G T 9 )はE1Aの存在
下、同)に有効なCAT遺伝子産物のための発現ベクタ
ーであり得る。プラスミドpB al 8 cat(G
T 6 )の制限部位および機能地図を添付の第22
図に示す。
列に関する方向性のみが異なる、所望のプラスミドpB
al 8 cat(G T 6 )(センス)および
pBal8 cat(G T 9 )(アンチセンス)
をそれぞれ構成していた。E1A遺伝子のような大きい
DNAウィルスの即時型遺伝子産物の存在下におけるポ
リーGT要素のエンハンサ−活性は、それが挿入された
プラスミド発現ベクター内でのポリーGT要素の方向に
よって左右されない。従って、例えば、プラスミドpB
al8 cat(G T 6 )およびプラスミドp
B al 8 cat(G T 9 )はE1Aの存在
下、同)に有効なCAT遺伝子産物のための発現ベクタ
ーであり得る。プラスミドpB al 8 cat(G
T 6 )の制限部位および機能地図を添付の第22
図に示す。
大腸菌K12 HBIOI細胞(NRRLB15626
)を培養して形質転換コンピテントとし、実質上、実施
例3記載の方法に従い、上で調製した結合DNAにより
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン(100μ
g/112)含有し一寒天プレート上で平板培養した。
)を培養して形質転換コンピテントとし、実質上、実施
例3記載の方法に従い、上で調製した結合DNAにより
形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン(100μ
g/112)含有し一寒天プレート上で平板培養した。
大腸菌K12 HBl 01/pBal8cat(GT
6)および大腸菌K12 HB 101/pBal8
cat(GT9)形質転換体をアンピシリン耐性表現型
およびそのプラスミドDNAの制限酵素分析によって同
定した。実質上、実施例3記載の方法に従ってプラスミ
ドpB al 8 cat(GT6)DNAおよびpB
al 8 cat(G T 9 )D NAを調製し
た。
6)および大腸菌K12 HB 101/pBal8
cat(GT9)形質転換体をアンピシリン耐性表現型
およびそのプラスミドDNAの制限酵素分析によって同
定した。実質上、実施例3記載の方法に従ってプラスミ
ドpB al 8 cat(GT6)DNAおよびpB
al 8 cat(G T 9 )D NAを調製し
た。
実1m例20 プラスミドpsV2E1Aの構築大腸
菌に12 HBIOI/psV2cat細胞を凍結乾燥
品の形でATCCから受託番号ATCC37]55の下
で入手し、実質上、実施例3記載の方法に従って細胞か
らプラスミドpS V 2 catDNAを単離する。
菌に12 HBIOI/psV2cat細胞を凍結乾燥
品の形でATCCから受託番号ATCC37]55の下
で入手し、実質上、実施例3記載の方法に従って細胞か
らプラスミドpS V 2 catDNAを単離する。
プラスミドpS V 2 catの制限部位および機能
地図を添付の第3図に示す。プラスミドpSV2cat
DNA(約1μ9.1 μ0を10xフア(Core)
緩衝液(2AIQ)およびdH,○(14μのに加え、
次いで、このpSV2catDNA溶液に制限酵素5t
ul(1,5μc、約15単位)および制限酵素Eco
RI(1,5μ(、約15単位)を加え、得られた反応
混合物を37°Cで2時間インキコベートした。70°
Cで10分間、熱不活化して反応を停止させた。熱不活
化の後、DNA混合物にdH,0(25Q)を加え、t
OXクレ/つ緩衝液(約5μQ)およびフレノウ酵素(
2μa、約10単位)を加え、得られた反応混合物を1
6°Cで1時間インキユベートシた。次いで、フレノウ
処理、5tul/Ec。
地図を添付の第3図に示す。プラスミドpSV2cat
DNA(約1μ9.1 μ0を10xフア(Core)
緩衝液(2AIQ)およびdH,○(14μのに加え、
次いで、このpSV2catDNA溶液に制限酵素5t
ul(1,5μc、約15単位)および制限酵素Eco
RI(1,5μ(、約15単位)を加え、得られた反応
混合物を37°Cで2時間インキコベートした。70°
Cで10分間、熱不活化して反応を停止させた。熱不活
化の後、DNA混合物にdH,0(25Q)を加え、t
OXクレ/つ緩衝液(約5μQ)およびフレノウ酵素(
2μa、約10単位)を加え、得られた反応混合物を1
6°Cで1時間インキユベートシた。次いで、フレノウ
処理、5tul/Ec。
R1消化プラスミドpsV2catDNAをエタノール
:クロロホルムで2回、次いでクロロホルム:イソアミ
ルアルコールで1回抽出し、エタノール沈澱させた後、
トリス緩衝液(20μg)に再懸濁した。
:クロロホルムで2回、次いでクロロホルム:イソアミ
ルアルコールで1回抽出し、エタノール沈澱させた後、
トリス緩衝液(20μg)に再懸濁した。
実質上、実施例12A記載の方法に従ってアデノウイル
ス−2DNAのE1A遺伝子を含有する断片を単離した
。E1A遺伝子を含有する〜18kbBall断片を単
離し、この断片(約9μQ、約500 ng)をdH2
0(l u(1)および10xリガーゼ緩衝液2.5μ
gと一緒に、上記のフレノウ処理した5Lul/Eco
RI消化プラスミドルS V 2catDNA(loμ
(、約100 ng)に加えた。このDNA溶液にT4
DNAリガーゼ(2,5μQ1約1250単位)を加え
、得られた反応混合物を16°Cで一夜インキユベート
した。結合したDNAは、pSV2E1Aを構成してい
た。プラスミドpS v 2E1Aの制限部位および機
能地図を添付の第23図に示す。
ス−2DNAのE1A遺伝子を含有する断片を単離した
。E1A遺伝子を含有する〜18kbBall断片を単
離し、この断片(約9μQ、約500 ng)をdH2
0(l u(1)および10xリガーゼ緩衝液2.5μ
gと一緒に、上記のフレノウ処理した5Lul/Eco
RI消化プラスミドルS V 2catDNA(loμ
(、約100 ng)に加えた。このDNA溶液にT4
DNAリガーゼ(2,5μQ1約1250単位)を加え
、得られた反応混合物を16°Cで一夜インキユベート
した。結合したDNAは、pSV2E1Aを構成してい
た。プラスミドpS v 2E1Aの制限部位および機
能地図を添付の第23図に示す。
ブー7スミ)’pSV2E 1Aはポ!j−GT要素、
真核性プロモーター、および形質転換された宿主細胞内
で発現されるべき組換え遺伝子を含有する任意の他のプ
ラスミド類との同時形質転換実験におけるE1A遺伝子
供給源として本発明にとって有用である。そのようなプ
ラスミドには、pLP(GT)cat、pB L(GT
)cat、 pS B L(GT)cat、 pLPC
(GT)、pLPC4(GT)、pLPC5(GT)、
pLPChyg1(GT)、pl−PChyg2(GT
)、pt。
真核性プロモーター、および形質転換された宿主細胞内
で発現されるべき組換え遺伝子を含有する任意の他のプ
ラスミド類との同時形質転換実験におけるE1A遺伝子
供給源として本発明にとって有用である。そのようなプ
ラスミドには、pLP(GT)cat、pB L(GT
)cat、 pS B L(GT)cat、 pLPC
(GT)、pLPC4(GT)、pLPC5(GT)、
pLPChyg1(GT)、pl−PChyg2(GT
)、pt。
PCdhfr1(GT)、pLPCdhfr2(GT)
、pLPChd1(GT)、pLPChd2(GT)、
pLPChd3(GT)、pLPChd4(GT)、p
BLT(GT)、pBLThyg1(GT)、pB L
Thyg2 (G T)、pBLTdhrr1(GT
)、pBLTdMr2(GT)、phdTPA(GT)
、 phdMTPA(GT)、 pB al 8 ca
t(GT6)、pB al 8 cat(G T 9
)、p4−14 (GT)、p2−5(GT)およびp
T 6 hd(G T )が含まれる。
、pLPChd1(GT)、pLPChd2(GT)、
pLPChd3(GT)、pLPChd4(GT)、p
BLT(GT)、pBLThyg1(GT)、pB L
Thyg2 (G T)、pBLTdhrr1(GT
)、pBLTdMr2(GT)、phdTPA(GT)
、 phdMTPA(GT)、 pB al 8 ca
t(GT6)、pB al 8 cat(G T 9
)、p4−14 (GT)、p2−5(GT)およびp
T 6 hd(G T )が含まれる。
別法として、E1A遺伝子は、ポリーGT要素、真核性
プロモーターおよび形質転換細胞内で発現されるべき組
換え遺伝子と一緒に、例えば実施例14Bに記載のプラ
スミドpLPcE1Aのような単一のプラスミドに担持
させて供給してもよい。
プロモーターおよび形質転換細胞内で発現されるべき組
換え遺伝子と一緒に、例えば実施例14Bに記載のプラ
スミドpLPcE1Aのような単一のプラスミドに担持
させて供給してもよい。
実施例21 プラスミドpT6hdおよびpT6hd(
GT)の構築 A、TPA暗号領域の部位特異的突然変異誘発およびプ
ラスミドpT6hdの構築 TPA暗号領域の部位特異的突然変異誘発およびプラス
ミドp76hdの構築は以下のようにして行われる。d
H,○(10μQ)中のプラスミドp’rpA103(
実施例17、約5μ9)を1QxHindIII緩衝液
(約lOμQ)およびdH,0(80μI2)に加える
。このプラスミドpTPA103DNA溶液に制限酵素
H1ndI[r (1uQ、約20単位)を加え、得ら
れた反応混合物を37°Cで90分間インキュベートす
る。このHindlI[消化プラスミドpTPAIQ3
DNA溶液に制限酵素5stl(1μ&、約20単位)
とIM Tris−HCC(pH7,6)(l Oμ0
を加え、得られた反応混合物を37℃で90分間インキ
ュベートする。HindI[l−3stl消化プラスミ
ドpTPA103DNAをエタノール沈澱によっテ濃縮
し、1.5%アガロースゲル電気泳動にかけ、〜1.4
kb HindI[l−3stl制限断片が他の消化産
物から分離するまで泳動する。実質上、実施例4A記載
の方法に従って〜l 、 4 bp H1ndlI[5
stl制限断片をゲルから単離し、ライゲーシジン用に
調製し、dH,○(20μのに再懸濁する。
GT)の構築 A、TPA暗号領域の部位特異的突然変異誘発およびプ
ラスミドpT6hdの構築 TPA暗号領域の部位特異的突然変異誘発およびプラス
ミドp76hdの構築は以下のようにして行われる。d
H,○(10μQ)中のプラスミドp’rpA103(
実施例17、約5μ9)を1QxHindIII緩衝液
(約lOμQ)およびdH,0(80μI2)に加える
。このプラスミドpTPA103DNA溶液に制限酵素
H1ndI[r (1uQ、約20単位)を加え、得ら
れた反応混合物を37°Cで90分間インキュベートす
る。このHindlI[消化プラスミドpTPAIQ3
DNA溶液に制限酵素5stl(1μ&、約20単位)
とIM Tris−HCC(pH7,6)(l Oμ0
を加え、得られた反応混合物を37℃で90分間インキ
ュベートする。HindI[l−3stl消化プラスミ
ドpTPA103DNAをエタノール沈澱によっテ濃縮
し、1.5%アガロースゲル電気泳動にかけ、〜1.4
kb HindI[l−3stl制限断片が他の消化産
物から分離するまで泳動する。実質上、実施例4A記載
の方法に従って〜l 、 4 bp H1ndlI[5
stl制限断片をゲルから単離し、ライゲーシジン用に
調製し、dH,○(20μのに再懸濁する。
dll to (35uの中の複製型(RF)M 13
mpl 8D N A (New England B
iolabsから入手可能)(約458g)を10 x
H1ndI[[緩衝1ffl(10μC)およびdH
。
mpl 8D N A (New England B
iolabsから入手可能)(約458g)を10 x
H1ndI[[緩衝1ffl(10μC)およびdH
。
0(55uのに加える。このMl 3mpl 8DNA
溶液に制限酵素旧ndIrl(lμe、約20単位)を
加え、得られた反応混合物を37°Cで1時間インキュ
ベートする。HindIn消化M13mp18DNA溶
液に制限酵素5sLI(1u(!、約20単位)および
IMTris−HCff(p)17.6)(10μQ)
を加え、得られた反応混合物を37°Cで1時間インキ
ュベートする。Hindol−3str消化M13mp
18DN八をエタノール沈澱によって収集し、アガロー
スゲル電気泳動用の標本として再懸濁し、上記のごとく
ゲル電気泳動にかけて大きい制限断片を単離する。M1
3a+p18の大きいHindlII−3stl制限断
片(約1u□を得、dH、O(20t、t12)ニ懸濁
する。
溶液に制限酵素旧ndIrl(lμe、約20単位)を
加え、得られた反応混合物を37°Cで1時間インキュ
ベートする。HindIn消化M13mp18DNA溶
液に制限酵素5sLI(1u(!、約20単位)および
IMTris−HCff(p)17.6)(10μQ)
を加え、得られた反応混合物を37°Cで1時間インキ
ュベートする。Hindol−3str消化M13mp
18DN八をエタノール沈澱によって収集し、アガロー
スゲル電気泳動用の標本として再懸濁し、上記のごとく
ゲル電気泳動にかけて大きい制限断片を単離する。M1
3a+p18の大きいHindlII−3stl制限断
片(約1u□を得、dH、O(20t、t12)ニ懸濁
する。
プラスミドpTPA103の〜1.4kb [(ind
[1−5stl制限断片(3uQ)にM13mp18の
大きいHindI[I −S st I制限断片(約2
u(1’)、10xT4DNAリガーゼ緩衝液(2μQ
)、dH3O(12μの、およびT4 DNAリガーゼ
(〜1μQ、約IWeiss単位)を加え、得られた反
応混合物を16°Cで一夜インキユベートする。
[1−5stl制限断片(3uQ)にM13mp18の
大きいHindI[I −S st I制限断片(約2
u(1’)、10xT4DNAリガーゼ緩衝液(2μQ
)、dH3O(12μの、およびT4 DNAリガーゼ
(〜1μQ、約IWeiss単位)を加え、得られた反
応混合物を16°Cで一夜インキユベートする。
大腸菌JM103細胞(B RLから入手可能)をコン
ピテント細胞にし、トランスフェクションあたりのDN
A使用量を変化させる外は、実質上、BRL M13
クローニング/° ジデオキシ シーフェンシング・イ
ンストラクション・マニュアルに記載の方法に従い、ラ
イゲー7−iン混合物を用いてトランスフェクションす
る。組換えプラークを、挿入によるβ−ガラクトシダー
ゼのα断片をコードする遺伝子の不活化、これはX −
galを開裂してインジゴ色の開裂産物に変換する能力
の喪失を招く、に基づいて同定する。スクリーニングの
ために、幾つかの白色プラークをLブロス(2゜5 R
rD中にとり、proA Bを担持するFエビソームを
確実に保持するために最少培地ストックで培養されてい
る対数増殖期の大腸m K12 JMIO3(0,4
y12)を加える。プラーク含有細胞懸濁液(2,5x
e)を空気振盪機により、37℃で8時間インキュベー
トする。1.5Jl(!づつ、細胞をペレット化し、実
質上、BirnboimとDolyのアルカリ性ミニス
クリーン法(1979年、Nuc、 Ac1ds Re
s、 7:1513)記載の方法にしたがってRF
DNAを単離する。各培養物の残余は4℃でストックと
して保存する。所望のMP18BW47と命名されたフ
ァージはM13a+p18の〜7.2kb EcoR[
−H1ndII+制限断片に結合したプラスミドpBW
25の〜1.4kb Hind[ll−3stf制限断
片を含有している。
ピテント細胞にし、トランスフェクションあたりのDN
A使用量を変化させる外は、実質上、BRL M13
クローニング/° ジデオキシ シーフェンシング・イ
ンストラクション・マニュアルに記載の方法に従い、ラ
イゲー7−iン混合物を用いてトランスフェクションす
る。組換えプラークを、挿入によるβ−ガラクトシダー
ゼのα断片をコードする遺伝子の不活化、これはX −
galを開裂してインジゴ色の開裂産物に変換する能力
の喪失を招く、に基づいて同定する。スクリーニングの
ために、幾つかの白色プラークをLブロス(2゜5 R
rD中にとり、proA Bを担持するFエビソームを
確実に保持するために最少培地ストックで培養されてい
る対数増殖期の大腸m K12 JMIO3(0,4
y12)を加える。プラーク含有細胞懸濁液(2,5x
e)を空気振盪機により、37℃で8時間インキュベー
トする。1.5Jl(!づつ、細胞をペレット化し、実
質上、BirnboimとDolyのアルカリ性ミニス
クリーン法(1979年、Nuc、 Ac1ds Re
s、 7:1513)記載の方法にしたがってRF
DNAを単離する。各培養物の残余は4℃でストックと
して保存する。所望のMP18BW47と命名されたフ
ァージはM13a+p18の〜7.2kb EcoR[
−H1ndII+制限断片に結合したプラスミドpBW
25の〜1.4kb Hind[ll−3stf制限断
片を含有している。
対数増殖期の大腸菌に12 JM103(約50If
I2)をMP18BW47に感染させ、空気振盪機中で
37℃において18時間インキュベートする。感染細胞
を低速遠心によってペレット化し、インストラクション
・マニュアル記載の方法を大規模にして培養上清から1
本鎖MP18BW47DNAを調製する。フレノウ反応
を、室温で30分間、次いで37°Cで60分間、さら
に10℃で18時間行う外は、実質上、アデルマンらの
方法[^delIIlan、 1983+ DNA2
(3) : 183−193]に従って1本鎖MP18
BW47に突然変異を誘発する。さらに、sl処理を2
0°Cで行い、緩衝液の塩濃度ヲ業者の指示の1/2と
し、M13シークエンジングプライマー(BRL)を用
いる。天然のTPAのアミノ酸残基4から175までの
暗号配列を欠失するために用いるオリゴデオキシリボヌ
クレオチド・ブライマーは、以下の配列式で示される。
I2)をMP18BW47に感染させ、空気振盪機中で
37℃において18時間インキュベートする。感染細胞
を低速遠心によってペレット化し、インストラクション
・マニュアル記載の方法を大規模にして培養上清から1
本鎖MP18BW47DNAを調製する。フレノウ反応
を、室温で30分間、次いで37°Cで60分間、さら
に10℃で18時間行う外は、実質上、アデルマンらの
方法[^delIIlan、 1983+ DNA2
(3) : 183−193]に従って1本鎖MP18
BW47に突然変異を誘発する。さらに、sl処理を2
0°Cで行い、緩衝液の塩濃度ヲ業者の指示の1/2と
し、M13シークエンジングプライマー(BRL)を用
いる。天然のTPAのアミノ酸残基4から175までの
暗号配列を欠失するために用いるオリゴデオキシリボヌ
クレオチド・ブライマーは、以下の配列式で示される。
5°−GGAGCCAGATCTTACCAAGGAA
ACAGTGACTGCTAC−3得られた突然変異混
合物を用い、実質上、上記の感染法に従って大腸菌に1
2 JM103をトランスフェクションする。RFD
NAの制限Ql 素分析およびマキサムおよびギルバー
トのDNA配列決定法によって所望の突然変異体を同定
する。
ACAGTGACTGCTAC−3得られた突然変異混
合物を用い、実質上、上記の感染法に従って大腸菌に1
2 JM103をトランスフェクションする。RFD
NAの制限Ql 素分析およびマキサムおよびギルバー
トのDNA配列決定法によって所望の突然変異体を同定
する。
天然のTPAのアミノ酸残基4〜175をコードする配
列が削除された暗号配列を有する所望の突然変異体をM
P18BW52と命名する。
列が削除された暗号配列を有する所望の突然変異体をM
P18BW52と命名する。
制限酵素消化、断片の単離およびライゲーションはすべ
て、実質上、実施例4記載の方法に従って行われた。プ
ラスミドp76hdは下記のごとくにして構築された。
て、実質上、実施例4記載の方法に従って行われた。プ
ラスミドp76hdは下記のごとくにして構築された。
まず、プラスミドpTPA603(実施例17、第19
図)から〜1 、9 kbB a第1(l断片を得た。
図)から〜1 、9 kbB a第1(l断片を得た。
次いで、プラスミドpAc373[ミャモトら(M i
yamoto)、1985、Mo1.cell Bio
l、 5:2860−28651をBamHI消化に
付し、プラスミドpTPA603の〜1.9 kbB
amHl断片と結合させてプラスミドpLlooを得た
。次いで、プラスミドpL100DNAを制限酵素Bg
l■および5stlで消化し〜1.2kb Bgllr
−5stl断片を単離した。
yamoto)、1985、Mo1.cell Bio
l、 5:2860−28651をBamHI消化に
付し、プラスミドpTPA603の〜1.9 kbB
amHl断片と結合させてプラスミドpLlooを得た
。次いで、プラスミドpL100DNAを制限酵素Bg
l■および5stlで消化し〜1.2kb Bgllr
−5stl断片を単離した。
上で得たMPl 8BW52DNAを制限酵素Bgln
および5stlで消化し、〜718bp断片を単離した
。MP18BW52の〜718bpBgllI −3s
tl断片とプラスミドpL100の〜1.2kbBgl
II−3stl断片とを結合させて中間体プラスミドp
L 229を得た。次いで、プラスミドpL229DN
Aを制限酵素BaaHIで消化し、〜1.4kbBam
HI断片を単離した。プラスミドphd (実施例13
)をBa1lで消化し、プラスミドpL229の〜1.
4 kbBas+HE断片と結合させて所望のプラスミ
ドp76hdを創製した。
および5stlで消化し、〜718bp断片を単離した
。MP18BW52の〜718bpBgllI −3s
tl断片とプラスミドpL100の〜1.2kbBgl
II−3stl断片とを結合させて中間体プラスミドp
L 229を得た。次いで、プラスミドpL229DN
Aを制限酵素BaaHIで消化し、〜1.4kbBam
HI断片を単離した。プラスミドphd (実施例13
)をBa1lで消化し、プラスミドpL229の〜1.
4 kbBas+HE断片と結合させて所望のプラスミ
ドp76hdを創製した。
B、 p76hd(GT)の構築
実質上、実施例4B、1.記載の方法に従い、プラスミ
ドp76 hdのBKエンハンサ−とAd2後期プロモ
ーターとの間の唯一のXho[部位にポリーGT要素を
挿入した。Xhol消化ポリ−GT要素およびXhol
消化プラスミドpT6hdを結合させると、結合したD
NA構築物は所望のプラスミドI)T 6 hd(c
T )を構成していた。プラスミドpT6 hd(G
T )の制限部位および機能地図を添付の第24図に示
す。
ドp76 hdのBKエンハンサ−とAd2後期プロモ
ーターとの間の唯一のXho[部位にポリーGT要素を
挿入した。Xhol消化ポリ−GT要素およびXhol
消化プラスミドpT6hdを結合させると、結合したD
NA構築物は所望のプラスミドI)T 6 hd(c
T )を構成していた。プラスミドpT6 hd(G
T )の制限部位および機能地図を添付の第24図に示
す。
別法によれば、プラスミドpL229(上記A3に記載
)の〜1.4 kb BaIId(l断片とBcl[消
化プラスミドphd(GT)(実施例13、第14図)
とを結合させてプラスミドp’[’ 6 hd(G T
)を作成することによっても、プラスミドp”r 6
hd(G T ’)を構築することができる。
)の〜1.4 kb BaIId(l断片とBcl[消
化プラスミドphd(GT)(実施例13、第14図)
とを結合させてプラスミドp’[’ 6 hd(G T
)を作成することによっても、プラスミドp”r 6
hd(G T ’)を構築することができる。
実施例22 幾つかの発現ベクターの真核性宿主細胞形
質転換体の構築 本明細書記載の発現ベクターの重要な態様は、これら発
現ベクター中のポリーGT要素およびBKエンハンサ−
を用いて、E1A遺伝子産物の存在下に遺伝子発現を刺
激することに関連する。293細胞はE1A遺伝子産物
を構成的(継続的)に発現するので、293細胞は本発
明の真核性発現ベクターの好ましい宿主である。293
細胞は5型アデノウイルスによって形質転換されたヒト
胚性腎細胞であり(本発明においては、E1A遺伝子の
供給源としてどのような型のアデノウィルスを用いても
よいことに注意されたい)A T CCから受託番号R
L1573の下で何人も入手可能である。本明細書記載
の発現ベクターの多くは、たとえE1A遺伝子が存在し
なくとも広範な宿主細胞内で機能する。しかしながら、
E1A遺伝子(または同様に作用する大きいDNAウィ
ルスの即時型遺伝子産物)は、本発明のポIJ−GT含
イf発現ベクターからの遺伝子発現を促進するためのポ
リG′F要素の活性化に必要である。非E I A産生
セルラインを、プラスミドpSV2E 1A、pLPC
E 1AおよびpLPcE1Al等のE1A遺伝子含有
ベクター、または剪断したアデノウィルスDNAで形質
転換するか、あるいはアデノウィルスに感染させること
により、E1A遺伝子産物を該セルラインに導入するこ
とができる。
質転換体の構築 本明細書記載の発現ベクターの重要な態様は、これら発
現ベクター中のポリーGT要素およびBKエンハンサ−
を用いて、E1A遺伝子産物の存在下に遺伝子発現を刺
激することに関連する。293細胞はE1A遺伝子産物
を構成的(継続的)に発現するので、293細胞は本発
明の真核性発現ベクターの好ましい宿主である。293
細胞は5型アデノウイルスによって形質転換されたヒト
胚性腎細胞であり(本発明においては、E1A遺伝子の
供給源としてどのような型のアデノウィルスを用いても
よいことに注意されたい)A T CCから受託番号R
L1573の下で何人も入手可能である。本明細書記載
の発現ベクターの多くは、たとえE1A遺伝子が存在し
なくとも広範な宿主細胞内で機能する。しかしながら、
E1A遺伝子(または同様に作用する大きいDNAウィ
ルスの即時型遺伝子産物)は、本発明のポIJ−GT含
イf発現ベクターからの遺伝子発現を促進するためのポ
リG′F要素の活性化に必要である。非E I A産生
セルラインを、プラスミドpSV2E 1A、pLPC
E 1AおよびpLPcE1Al等のE1A遺伝子含有
ベクター、または剪断したアデノウィルスDNAで形質
転換するか、あるいはアデノウィルスに感染させること
により、E1A遺伝子産物を該セルラインに導入するこ
とができる。
下記の形質転換工程は宿主細胞として293細胞に関し
て述べられているが、これは大多数の真核性セルライン
に一般的に適用することができる。
て述べられているが、これは大多数の真核性セルライン
に一般的に適用することができる。
本明細書記載のベクターを用いて様々なセルラインを形
質転換することができる。本明細書には多数の発現ベク
ターが記載されているので、形質転換法を一般的に記述
する。
質転換することができる。本明細書には多数の発現ベク
ターが記載されているので、形質転換法を一般的に記述
する。
293細胞は、ATCCから受託番号CRL 1573
の下、25mm’フラスコ中、10%熱不活化ウマ血清
を含有するイーグル(Eagle″S)の最少必須培地
中で全面成長した約5.5xlO”個の細胞の単一・層
として入手する。フラスコを37°Cてインキュベート
し、培地を週2回交換する。培地を捨て、バンク(Ha
nk’ s)の均衡塩類溶液(HB S )(Gibc
o)で洗浄し、0.25%トリプシンを1−2分間加え
、新鮮な培地で洗浄し、吸引し、継代培径比l:5また
はl:lOで新しいフラスコに分けることにより細胞を
継代培養する。
の下、25mm’フラスコ中、10%熱不活化ウマ血清
を含有するイーグル(Eagle″S)の最少必須培地
中で全面成長した約5.5xlO”個の細胞の単一・層
として入手する。フラスコを37°Cてインキュベート
し、培地を週2回交換する。培地を捨て、バンク(Ha
nk’ s)の均衡塩類溶液(HB S )(Gibc
o)で洗浄し、0.25%トリプシンを1−2分間加え
、新鮮な培地で洗浄し、吸引し、継代培径比l:5また
はl:lOで新しいフラスコに分けることにより細胞を
継代培養する。
トランスフェクションの1日前に細胞を皿あたり0、γ
xlO’細胞で撒く。トランスフェクションの4時間前
に培地を交換する。TE緩i!i ′t&、に溶かした
、滅菌してエタノール沈澱させたプラスミドDNAを用
いて40μ9/xQD N Aと250mMCaCQ、
を含有する2XDNΔ−CaCQlを調製する。2XH
BSは280mM NaCg、50mM HEPES、
および1.5mM リン酸ナトリウムを含有させ、p
Hを7.05−7.15に調節して調製する。2XDN
A CaC(2を溶液を等容量の滅菌2 x HB
Sに滴下する。2x HB S含有混合管中に綿栓を付
けたLx(lの滅菌プラスチックピペットを挿入し、D
NA添加の間を通して気泡を吹き込む。撹拌せずに、室
温で30−45分間をかけ、リン酸カルシウム−DNA
沈澱を形成させる。
xlO’細胞で撒く。トランスフェクションの4時間前
に培地を交換する。TE緩i!i ′t&、に溶かした
、滅菌してエタノール沈澱させたプラスミドDNAを用
いて40μ9/xQD N Aと250mMCaCQ、
を含有する2XDNΔ−CaCQlを調製する。2XH
BSは280mM NaCg、50mM HEPES、
および1.5mM リン酸ナトリウムを含有させ、p
Hを7.05−7.15に調節して調製する。2XDN
A CaC(2を溶液を等容量の滅菌2 x HB
Sに滴下する。2x HB S含有混合管中に綿栓を付
けたLx(lの滅菌プラスチックピペットを挿入し、D
NA添加の間を通して気泡を吹き込む。撹拌せずに、室
温で30−45分間をかけ、リン酸カルシウム−DNA
沈澱を形成させる。
次いで、静かにプラスチックピペットで撹拌して沈澱を
混合し、沈rlffiLmc(プレートあたり)を直接
、受容体細胞を覆っている増殖培地10x&に加える。
混合し、沈rlffiLmc(プレートあたり)を直接
、受容体細胞を覆っている増殖培地10x&に加える。
37℃で4時間インキュベートした後、培地をlO%ウ
シ胎児血清を含有するDMEMで置換し、さらに72時
間細胞をインキコベートした後、選択圧をかける。組換
えヒトプロティンCを発現する形質転換体を得るために
、増殖培地にタンパク質のγカルボ牛シル化に必要な1
〜10μ2/肩Qビタミンにを含有させる。プラスミド
が真核性細胞内で機能する選択マーカーを含有していな
い場合には形質転換工程にプラスミド混合物による同時
形質転換を用いる・本明細書記載の選択マーカー不含の
発現ベクターと、真核性細胞内で機能する選択マーカー
を含有する発現ベクターとの混合物。この同時形質転換
法により、形質転換プラスミドの両方を含有する細胞を
同定することができる。
シ胎児血清を含有するDMEMで置換し、さらに72時
間細胞をインキコベートした後、選択圧をかける。組換
えヒトプロティンCを発現する形質転換体を得るために
、増殖培地にタンパク質のγカルボ牛シル化に必要な1
〜10μ2/肩Qビタミンにを含有させる。プラスミド
が真核性細胞内で機能する選択マーカーを含有していな
い場合には形質転換工程にプラスミド混合物による同時
形質転換を用いる・本明細書記載の選択マーカー不含の
発現ベクターと、真核性細胞内で機能する選択マーカー
を含有する発現ベクターとの混合物。この同時形質転換
法により、形質転換プラスミドの両方を含有する細胞を
同定することができる。
ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含伺するプラスミド
でトランスフェクションされた細胞については、増殖培
地にハイグロマイシンを終濃度約200〜400μ97
x(lとなるように加える。次いで、培地を3〜4日間
隔で交換しながら細胞を37°Cで2−4週間インキュ
ベートする。得られたハイグロマイシン耐性コロニーを
それぞれ別個の培養フラスコに入れ、0性化する。ネオ
マイシン耐性コロニーの選択(2Aオマイシンの代わり
に6418を用いてもよい)は、ハイグロマイシンでな
く、0418を終濃度400μ9/肩Qで加える外は、
実質上、ハイグロマイシン耐性細胞の選択法にしたがっ
て行う。293細胞はdhfr陽性であるので、dhf
r遺伝子含有プラスミドを有する293形質転換体は、
ヒボキサンチンおよびチミン不含の培地で増殖する能力
であるdhfr−陽性表現型のみに基づいて選択するこ
とはできない。機能的なdhfr遺伝子を欠失しており
、dhrrfi有プラスミドで形質転換されたセルライ
ンはdhrr陽性表現型に基づいて選択される。
でトランスフェクションされた細胞については、増殖培
地にハイグロマイシンを終濃度約200〜400μ97
x(lとなるように加える。次いで、培地を3〜4日間
隔で交換しながら細胞を37°Cで2−4週間インキュ
ベートする。得られたハイグロマイシン耐性コロニーを
それぞれ別個の培養フラスコに入れ、0性化する。ネオ
マイシン耐性コロニーの選択(2Aオマイシンの代わり
に6418を用いてもよい)は、ハイグロマイシンでな
く、0418を終濃度400μ9/肩Qで加える外は、
実質上、ハイグロマイシン耐性細胞の選択法にしたがっ
て行う。293細胞はdhfr陽性であるので、dhf
r遺伝子含有プラスミドを有する293形質転換体は、
ヒボキサンチンおよびチミン不含の培地で増殖する能力
であるdhfr−陽性表現型のみに基づいて選択するこ
とはできない。機能的なdhfr遺伝子を欠失しており
、dhrrfi有プラスミドで形質転換されたセルライ
ンはdhrr陽性表現型に基づいて選択される。
dbfr欠失セルラインに遺伝子またはプラスミドを導
入するための選択マーカーとしてdhfr遺伝子を用い
、次いでメトトレキセートを用いてプラスミドのコピー
数を増大する方法は十分に確立され文献に記載されてい
る。dh[’r産生細胞における選択可能かつ増幅可能
なマーカーとしてのdMrの使用はあまり研究されてい
ないが、文献にはdhrrをdhfr産生細胞に、選択
マーカーとして、また遺伝子増幅のために用い得ること
が示唆されている。
入するための選択マーカーとしてdhfr遺伝子を用い
、次いでメトトレキセートを用いてプラスミドのコピー
数を増大する方法は十分に確立され文献に記載されてい
る。dh[’r産生細胞における選択可能かつ増幅可能
なマーカーとしてのdMrの使用はあまり研究されてい
ないが、文献にはdhrrをdhfr産生細胞に、選択
マーカーとして、また遺伝子増幅のために用い得ること
が示唆されている。
本発明の用途は用いる選択マーカーによって限定される
ことはない。さらに、メタロチオネイン遺伝子、アデノ
シンデアミナーゼ遺伝子、またはP−グリコプロティン
に例示されるマルチ遺伝子耐性ファミリー(多耐性遺伝
子ファミリー)などの増幅可能なマーカーを用いること
ができる。293細胞中では、ハイグロマイシンBi4
性付与遺伝子のような選択マーカーを含有するベクター
で形質転換し、次いでメトトレキセートを用いて増幅す
ると便利であるが、これは293細胞中の不ズミdhf
r含有プラスミドの直接選択の場合には用いることがで
きない。
ことはない。さらに、メタロチオネイン遺伝子、アデノ
シンデアミナーゼ遺伝子、またはP−グリコプロティン
に例示されるマルチ遺伝子耐性ファミリー(多耐性遺伝
子ファミリー)などの増幅可能なマーカーを用いること
ができる。293細胞中では、ハイグロマイシンBi4
性付与遺伝子のような選択マーカーを含有するベクター
で形質転換し、次いでメトトレキセートを用いて増幅す
ると便利であるが、これは293細胞中の不ズミdhf
r含有プラスミドの直接選択の場合には用いることがで
きない。
聚施例23 AV12真核性宿主細胞形質転換体
実質上、実施例22で293細胞について述べたと同様
にしてAV12セルライン(ATCCCRL 952
5)を形質転換することができる。
にしてAV12セルライン(ATCCCRL 952
5)を形質転換することができる。
しかしながら、293細胞と異なり、AV12細胞は、
ネズミdhfr遺伝子を含有するベクターを用いて形質
転換した場合には、メトトレキセート(200500n
m)で直接選択することができる。
ネズミdhfr遺伝子を含有するベクターを用いて形質
転換した場合には、メトトレキセート(200500n
m)で直接選択することができる。
アデノウィルスで形質転換された細胞が、活性化された
ヒトプロティンCのようなγ−カルボキシル化タンパク
質を産生ずることの利点は、そのような細胞が完全にγ
−カルボキシル化された活性なヒトプロティンC産生ず
るという点である。形質転換体を、ハイグロマイシンB
またはメトトレキセートで選択する;そのような形質転
換体はヒトプロティンCを約2〜4μ9/mQ産生ずる
ことができる。メトトレキセートにより、プロティンC
濃度を約50μ97R(lまで上昇させることができる
。
ヒトプロティンCのようなγ−カルボキシル化タンパク
質を産生ずることの利点は、そのような細胞が完全にγ
−カルボキシル化された活性なヒトプロティンC産生ず
るという点である。形質転換体を、ハイグロマイシンB
またはメトトレキセートで選択する;そのような形質転
換体はヒトプロティンCを約2〜4μ9/mQ産生ずる
ことができる。メトトレキセートにより、プロティンC
濃度を約50μ97R(lまで上昇させることができる
。
プロティンCを活性化することができ、その活性はグリ
ンネルら(Grinnell、 1987 、Bio
/Technol。
ンネルら(Grinnell、 1987 、Bio
/Technol。
gy、 5:1189)の方法によって測定することが
できる。
できる。
アデノウイルス−形質転換宿主細胞、例えばAV12に
より産生される組換えプロティンCの活性は、少なくと
もヒト血中のそれと同一活性である。アデノウィルスで
形質転換されていない宿主細胞においては、産生された
組換えプロティンCの抗凝固活性はヒト血液−誘導プロ
チインCの活性の60%を越えることはなかった。
より産生される組換えプロティンCの活性は、少なくと
もヒト血中のそれと同一活性である。アデノウィルスで
形質転換されていない宿主細胞においては、産生された
組換えプロティンCの抗凝固活性はヒト血液−誘導プロ
チインCの活性の60%を越えることはなかった。
実施例24 アデノウィルスの3部構成リーダーをコー
ドするプラスミド類、プラスミドp414、p2−5、
p4−14(GT)およびp2−5 (GT)の構築 プラスミドp4−14 (GT)およびp2−5 (G
T)はいずれもヒトプロティンCを真核性宿主細胞内で
高レベルに発現させるために、修飾されたポリGT−B
Kエンハンサーアデノウィルス後期プロモーター系およ
びアデノウィルスの3部構成リーダー(TPL)を使用
している。プラスミドp4−14およびp2−5は、そ
れぞれプラスミドp4−14 (GT)およびp2−5
(GT)と同一であるが、ポリGT要素を欠いている。
ドするプラスミド類、プラスミドp414、p2−5、
p4−14(GT)およびp2−5 (GT)の構築 プラスミドp4−14 (GT)およびp2−5 (G
T)はいずれもヒトプロティンCを真核性宿主細胞内で
高レベルに発現させるために、修飾されたポリGT−B
Kエンハンサーアデノウィルス後期プロモーター系およ
びアデノウィルスの3部構成リーダー(TPL)を使用
している。プラスミドp4−14およびp2−5は、そ
れぞれプラスミドp4−14 (GT)およびp2−5
(GT)と同一であるが、ポリGT要素を欠いている。
アデノウィルスの3部構成リーダー(TPL)をコード
するDNAをアデノウィルスから単離した。制限酵素切
断部位の後方の括弧内の数字はアデノウィルスのマツプ
単位を表す。
するDNAをアデノウィルスから単離した。制限酵素切
断部位の後方の括弧内の数字はアデノウィルスのマツプ
単位を表す。
プラスミドpUc13(BRLから市販品を人手可能)
を制限酵素5phlおよびBa@)(Iで消化した後、
2型アデノウイルスのTPLをコードする〜7.2kb
Sph[(5135) BclI(12,30f)制
限断片と結合させてプラスミドpTP L 4を得た。
を制限酵素5phlおよびBa@)(Iで消化した後、
2型アデノウイルスのTPLをコードする〜7.2kb
Sph[(5135) BclI(12,30f)制
限断片と結合させてプラスミドpTP L 4を得た。
プラスミドpTP L 4を制限酵素5aul(761
6)およびBglI[(8904)で消化してTPLを
コードするDNAからイントロンの1部を除去し、フレ
ノウ酵素で処理して再結合し、プラスミドpDTPLを
得た。次いでプラスミドpvTPLを制限酵素Xhol
で消化し、TPLをコードする〜2.62kb Xho
I断片(アデノウィルスの5799および9689Xh
o1部位)を単離し、ライゲーションに備えた。
6)およびBglI[(8904)で消化してTPLを
コードするDNAからイントロンの1部を除去し、フレ
ノウ酵素で処理して再結合し、プラスミドpDTPLを
得た。次いでプラスミドpvTPLを制限酵素Xhol
で消化し、TPLをコードする〜2.62kb Xho
I断片(アデノウィルスの5799および9689Xh
o1部位)を単離し、ライゲーションに備えた。
プラスミドpBLcatを制限酵素f3clrで消化し
た。下記の配列: を有するリンカ−を合成し、実質上、実施例1記載の方
法に従ってアニーリングし、このリンカ−をBcll消
化プラスミドpBLcatと結合させ、次いでXhoI
消化に付した。次いで、結合したリンカ−を伴うXho
l消化プラスミドpBLcatDNAを結合させ、プラ
スミドpB△L catを得た。この構築によりプラス
ミドpBLcat上のアデノウィルス後期プロモーター
がリンカ−配列で置き換えられた。プラスミドpB△L
catを制限酵素Xholで消化し、プラスミドp△
TPLの〜2.62kbXho1制限断片と結合させ、
TPLをコードする断片が、CAT遺伝子の発現のため
にBKエンハンサ−、アデノウィルス主後期プロモータ
ー、およびTPLが一直線上に正しく位置するように配
されたプラスミドpB△L−TPI、を得た。
た。下記の配列: を有するリンカ−を合成し、実質上、実施例1記載の方
法に従ってアニーリングし、このリンカ−をBcll消
化プラスミドpBLcatと結合させ、次いでXhoI
消化に付した。次いで、結合したリンカ−を伴うXho
l消化プラスミドpBLcatDNAを結合させ、プラ
スミドpB△L catを得た。この構築によりプラス
ミドpBLcat上のアデノウィルス後期プロモーター
がリンカ−配列で置き換えられた。プラスミドpB△L
catを制限酵素Xholで消化し、プラスミドp△
TPLの〜2.62kbXho1制限断片と結合させ、
TPLをコードする断片が、CAT遺伝子の発現のため
にBKエンハンサ−、アデノウィルス主後期プロモータ
ー、およびTPLが一直線上に正しく位置するように配
されたプラスミドpB△L−TPI、を得た。
次いで、これらの断片、(1)dhfr遺伝子をフード
する、プラスミドpLPchdlのAatII−Bal
l制限断片、(2)プロティンCをコードする、プラス
ミドpLPchdlのBall制限断片、(3)TPL
をフードする、プラスミドpB△L−TPLのPvun
−Ball制限断片、および(4)B Kエンハンf−
−Ad2MLP−をコードするプラスミドpB at
8 catのPvuIr−Aat[I制限断片を結合さ
せてプラスミドp2−5を構築した。このように、プラ
スミドp2−5は選択可能かつ増幅可能なマーカーとし
てのdhfr遺伝子およびヒトプロティンCを発現させ
る正しい位置にBKエンハンサ−Ad2MLP、および
A d 2 T P Lを含有しティる。
する、プラスミドpLPchdlのAatII−Bal
l制限断片、(2)プロティンCをコードする、プラス
ミドpLPchdlのBall制限断片、(3)TPL
をフードする、プラスミドpB△L−TPLのPvun
−Ball制限断片、および(4)B Kエンハンf−
−Ad2MLP−をコードするプラスミドpB at
8 catのPvuIr−Aat[I制限断片を結合さ
せてプラスミドp2−5を構築した。このように、プラ
スミドp2−5は選択可能かつ増幅可能なマーカーとし
てのdhfr遺伝子およびヒトプロティンCを発現させ
る正しい位置にBKエンハンサ−Ad2MLP、および
A d 2 T P Lを含有しティる。
プラスミドp4−14はプラスミドp2−5と類似する
が、pBal3 T P Lと称する中間体プラスミド
を経て構築される。プラスミドpBal87PLは、上
記バラグラフに記載のプラスミドp2−5の構築に用い
た断片1.3および4を結合させて構築された。次いで
、プラスミドpBal8TPLを制限酵素Xholで消
化し、フレ/つ酵素処理によりX ho I末端を平滑
末端化した後、ヒトプロティンCをコードする、フレノ
ウ処理したプラスミドpLPchdlのBall制限断
片と結合させ、プラスミドp4−14を得た。このよう
に、プロティンCをコードするDNAが、プラスミドp
2−5ではプラスミドpB△L −T P L由来のD
NAのBclr部位に挿入されているのに対して、プラ
スミドp4−14ではプラスミドpB△L−TPL由来
の断片のXho1部位に挿入されているという点におい
てのみこれらは相異する。
が、pBal3 T P Lと称する中間体プラスミド
を経て構築される。プラスミドpBal87PLは、上
記バラグラフに記載のプラスミドp2−5の構築に用い
た断片1.3および4を結合させて構築された。次いで
、プラスミドpBal8TPLを制限酵素Xholで消
化し、フレ/つ酵素処理によりX ho I末端を平滑
末端化した後、ヒトプロティンCをコードする、フレノ
ウ処理したプラスミドpLPchdlのBall制限断
片と結合させ、プラスミドp4−14を得た。このよう
に、プロティンCをコードするDNAが、プラスミドp
2−5ではプラスミドpB△L −T P L由来のD
NAのBclr部位に挿入されているのに対して、プラ
スミドp4−14ではプラスミドpB△L−TPL由来
の断片のXho1部位に挿入されているという点におい
てのみこれらは相異する。
プラスミドp4−14およびp2−5はヒトプロティン
Cを高レベルに発現させる。AV12細胞においては、
プラスミドp4−14およびp2−5を200 500
t+mのメトトレキセートを用いて直接、選択すること
ができる。AV l 2/p4−14形質転換体は、増
幅前に、A V l 2/pL P Cdhfr形質転
換体よりも5−6倍高くヒトプロティンCを発現する。
Cを高レベルに発現させる。AV12細胞においては、
プラスミドp4−14およびp2−5を200 500
t+mのメトトレキセートを用いて直接、選択すること
ができる。AV l 2/p4−14形質転換体は、増
幅前に、A V l 2/pL P Cdhfr形質転
換体よりも5−6倍高くヒトプロティンCを発現する。
メトトレキセートによる増幅によってさらに細胞のヒト
プロティンC産生量は増加する。このように、プラスミ
ドp4.−14およびp2−5はアデノウィルスのBa
18プロモーターとTPLとを用いてより高レベルの発
現を達成したことを例示するものである。
プロティンC産生量は増加する。このように、プラスミ
ドp4.−14およびp2−5はアデノウィルスのBa
18プロモーターとTPLとを用いてより高レベルの発
現を達成したことを例示するものである。
E1A遺伝子産物の存在下でのより高度の発現は、以下
のようにしてプラスミドp4−14またはp2−5にポ
リーGT要素を挿入することにより達成し得る。ポリー
GT要素を、プラスミドp4−14のプロティンC暗号
配列の3°末端における唯一のBc11部位(Bc11
部位はBam81部位と一致)に挿入し、プラスミドp
4−14 (GT)を得る。プラスミドp2−5のT
P LとプロティンC暗号配列との連結部位にある唯一
のXho[部位にポリーGT要素を挿入してプラスミド
p25(GT)を得る。
のようにしてプラスミドp4−14またはp2−5にポ
リーGT要素を挿入することにより達成し得る。ポリー
GT要素を、プラスミドp4−14のプロティンC暗号
配列の3°末端における唯一のBc11部位(Bc11
部位はBam81部位と一致)に挿入し、プラスミドp
4−14 (GT)を得る。プラスミドp2−5のT
P LとプロティンC暗号配列との連結部位にある唯一
のXho[部位にポリーGT要素を挿入してプラスミド
p25(GT)を得る。
実施例25 数個のポリー〇T発現ベクターによる真核
性宿主細胞トランスフェクシントにおける組換え遺伝子
発現レベルの測定 本発明のポリ−G T i有発現ベクターで様々な真核
性宿主細胞をトランスフエタンヨンした。これらのトラ
ンスフェクシントの幾つかについて、これらの組換えポ
リ−G T 含有発現ベクターにコードされている構造
遺伝子の発現レベルを測定し、ポリーGT要素を含有し
ない対応する発現ベクターからの発現レベルと比較した
。数回の実験で、3種の異なるセルラインを、実質上、
実施例21記載の方法に従い、プラスミドpL Pca
t、 pL P (GT)cat、 pB Lcat、
pB L(GT)cat、 pBal3cat。
性宿主細胞トランスフェクシントにおける組換え遺伝子
発現レベルの測定 本発明のポリ−G T i有発現ベクターで様々な真核
性宿主細胞をトランスフエタンヨンした。これらのトラ
ンスフェクシントの幾つかについて、これらの組換えポ
リ−G T 含有発現ベクターにコードされている構造
遺伝子の発現レベルを測定し、ポリーGT要素を含有し
ない対応する発現ベクターからの発現レベルと比較した
。数回の実験で、3種の異なるセルラインを、実質上、
実施例21記載の方法に従い、プラスミドpL Pca
t、 pL P (GT)cat、 pB Lcat、
pB L(GT)cat、 pBal3cat。
およびpB al 8 cat(G T 6 )でトラ
ンスフェクションした。上に列挙したプラスミドはそれ
ぞれ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラ
ーゼ(CAT)の遺伝子−暗号配列を含有している。
ンスフェクションした。上に列挙したプラスミドはそれ
ぞれ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラ
ーゼ(CAT)の遺伝子−暗号配列を含有している。
CAT活性の相対レベルはゴーマンら(G orman
。
。
1982、 Mo1.Ce11.Biol、、 2:1
044−1051)記載の方法で測定された。1−5回
の別々の実験で得た結果の平均値として、各プラスミド
によるCAT活性レベルを下記第2表に示す。実験間で
の相対的CAT活性の変化は10〜15%にすぎなかっ
た。
044−1051)記載の方法で測定された。1−5回
の別々の実験で得た結果の平均値として、各プラスミド
によるCAT活性レベルを下記第2表に示す。実験間で
の相対的CAT活性の変化は10〜15%にすぎなかっ
た。
m2fi[々のヒトおよびサル腎セルラインにおいて組
換えプラスミドにより産生されたクロラムフェニコール
・アセチルトランスフェラーゼ(CAT)の相対レベル セルライン中のCA T t[]対レしル*プラスミド
293** MK
2** C05−IJ*ATCCCRL15
73 ATCCCC12 ATCCCRL1650
pLPcat 1 1
1pLP(GT)cat 4 4
N TpBLcat 66
28 8pBL(GT)cat 20
8 21 8pBal8cat
479 20 NTpB a18cat
(GT6) 958 N T l 1
*各セルラインによって産生されるCATの相対的レベ
ルはプラスミドpLPcatによってそのセルラインに
より産生されるCATを単位とする値である。NT=試
験せず。293セルラインのみかE1Aを産生する(M
K2およびCO3−1はE1A陰性である)。CO3−
1セルラインのみがT抗原を産生ずる(293およびM
K2はT抗原陰性である)。
換えプラスミドにより産生されたクロラムフェニコール
・アセチルトランスフェラーゼ(CAT)の相対レベル セルライン中のCA T t[]対レしル*プラスミド
293** MK
2** C05−IJ*ATCCCRL15
73 ATCCCC12 ATCCCRL1650
pLPcat 1 1
1pLP(GT)cat 4 4
N TpBLcat 66
28 8pBL(GT)cat 20
8 21 8pBal8cat
479 20 NTpB a18cat
(GT6) 958 N T l 1
*各セルラインによって産生されるCATの相対的レベ
ルはプラスミドpLPcatによってそのセルラインに
より産生されるCATを単位とする値である。NT=試
験せず。293セルラインのみかE1Aを産生する(M
K2およびCO3−1はE1A陰性である)。CO3−
1セルラインのみがT抗原を産生ずる(293およびM
K2はT抗原陰性である)。
**一般に入手可能。
プラスミドpL P (G T )catはポリGT要
素含有、エンハンサ−不含、Ad2後期プロモーター含
有の例示発現ベクターであり、他方、プラスミドpB
L (G T )catはポリGT要素、BKエンハン
サ−およびAd2後期プロモーター含有の例示発現ベク
ターである。プラスミドpB a18 cat(G T
6 )はCAT遺伝子の3゛側にポIJGT要素と一
緒に修飾されたエンハンサーープロモーター領域を含有
することを除き、プラスミドpB L (G T )c
atと同様である。ポリGT要素の効果を調べるために
、第2表に記載のプラスミド発現ベクターを用いて様々
なセルラインをトランスフェクションし、上記のごと<
CAT活性を測定した。第2表はMK2上2セルライン
中ポリGT要素がAd2後期プロモーターと一緒に刺激
作用またはエンハンサ−補作用を有していないことを示
しており、プラスミドpLPcatおよびpLP(GT
)からのCAT産生量はほぼ同じであった。しかしなが
ら、E1Aの存在下での、293(E 1A”)セルラ
イン中のプラスミドpLPcatおよびpL P (G
T )catによる結果から分かるように、ポリGT
要素を含有するpL P (G T )catではプラ
スミドpLPcatに比較して、CAT活性の4倍増が
観察された。これはポリGT要素に対するE1Aのトラ
ンス−活性化を示すものである。
素含有、エンハンサ−不含、Ad2後期プロモーター含
有の例示発現ベクターであり、他方、プラスミドpB
L (G T )catはポリGT要素、BKエンハン
サ−およびAd2後期プロモーター含有の例示発現ベク
ターである。プラスミドpB a18 cat(G T
6 )はCAT遺伝子の3゛側にポIJGT要素と一
緒に修飾されたエンハンサーープロモーター領域を含有
することを除き、プラスミドpB L (G T )c
atと同様である。ポリGT要素の効果を調べるために
、第2表に記載のプラスミド発現ベクターを用いて様々
なセルラインをトランスフェクションし、上記のごと<
CAT活性を測定した。第2表はMK2上2セルライン
中ポリGT要素がAd2後期プロモーターと一緒に刺激
作用またはエンハンサ−補作用を有していないことを示
しており、プラスミドpLPcatおよびpLP(GT
)からのCAT産生量はほぼ同じであった。しかしなが
ら、E1Aの存在下での、293(E 1A”)セルラ
イン中のプラスミドpLPcatおよびpL P (G
T )catによる結果から分かるように、ポリGT
要素を含有するpL P (G T )catではプラ
スミドpLPcatに比較して、CAT活性の4倍増が
観察された。これはポリGT要素に対するE1Aのトラ
ンス−活性化を示すものである。
プラスミドpB L (G T )catおよびpBL
catを用いて293細胞をトランスフェクションした
場合にも、ポリGT要素に対するE1Aのトランス活性
化が示された。プラスミドpBLcaLに比較して、プ
ラスミドpB L (G T )catではCAT活性
が約4倍増大していた。プラスミドpB L (G T
)catはE1Aの存在下、ポリGT要素とBKエン
ハンサ−との結合エンハンサ−活性により、プラスミド
pLPcatの200倍以上の活性を示した。MK2セ
ルラインおよびT抗原産生CO3−1セルラインを用い
ると、プラスミドpB L (G T )catおよび
pBLcatからの発現レベルはほぼ同一であり、ここ
でもポリGT要素のトランス活性化にはE1Aが必要で
あることが示され、さらに、ポリGT要素がT抗原によ
ってはトランス活性化されないことが示された。
catを用いて293細胞をトランスフェクションした
場合にも、ポリGT要素に対するE1Aのトランス活性
化が示された。プラスミドpBLcaLに比較して、プ
ラスミドpB L (G T )catではCAT活性
が約4倍増大していた。プラスミドpB L (G T
)catはE1Aの存在下、ポリGT要素とBKエン
ハンサ−との結合エンハンサ−活性により、プラスミド
pLPcatの200倍以上の活性を示した。MK2セ
ルラインおよびT抗原産生CO3−1セルラインを用い
ると、プラスミドpB L (G T )catおよび
pBLcatからの発現レベルはほぼ同一であり、ここ
でもポリGT要素のトランス活性化にはE1Aが必要で
あることが示され、さらに、ポリGT要素がT抗原によ
ってはトランス活性化されないことが示された。
最高レベルの発現はプラスミドpB a18 cat(
GT6)によって達成され、それはプラスミドpLPc
atによるCATレベルに対して、相対的に1000倍
近い増大を示した。プラスミドpBal8cat(GT
6)は本発明の改善された発現ベクターを例示するもの
であり、それはE1Aで活性化されたポリGT要素と改
良されたBKエンハンサーープロモーター領域とを含有
している。
GT6)によって達成され、それはプラスミドpLPc
atによるCATレベルに対して、相対的に1000倍
近い増大を示した。プラスミドpBal8cat(GT
6)は本発明の改善された発現ベクターを例示するもの
であり、それはE1Aで活性化されたポリGT要素と改
良されたBKエンハンサーープロモーター領域とを含有
している。
第1図は、BKウィルスの制限部位および機能地図を示
す模式図であり、 第2図は、プラスミドpBKneolの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第3図は、プラスミドpS V 2 catの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、 第4図は、プラスミドpL P (G T )catの
制限部位および機能地図を示す模式図であり、第5図は
、プラスミドpB L (G T )catの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第6図は、プラス
ミドpS B L (G T )catの制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、第7図は、プラスミド
pL 133の構築を示す工程図であり、 第8図は、プラスミドpLPC(GT)の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、第9図は、プラスミド
pLPC4(GT)の制限部位および機能地図を示す模
式図であり、第10図は、プラスミドpS V 2hy
gの制限部位および機能地図を示す模式図であり、 第11図は、プラスミドpLPchyg1(GT)の制
限部位および機能地図を示す模式図であり、第12図は
、プラスミドpBW32の構築を示す工程図であり、 第13図は、プラスミドpLPchd1(GT)の制限
部位および機能地図を示す模式図であり、第14図は、
プラスミドphd(G T ’)の制限部位および機能
地図を示す模式図であり、 第15図は、プラスミドpLPcE1A(GT)の制限
部位および機能地図を示す模式図であり、第16図は、
プラスミドpBLT(GT)の制限部位および機能地図
を示す模式図であり、第17図は、プラスミドpBLT
hyg1(GT)の制限部位および機能地図を示す模式
図であり、第18図は、プラスミドpB L Tdhr
r l (G T)の制限部位および機能地図を示す模
式図であり、第19図は、プラスミドpTPA603の
制限部位および機能地図を示す模式図であり、第20図
は、プラスミドphd(G T )T P Aの制限部
位および機能地図を示す模式図であり、第21図は、プ
ラスミドphd(G T )M T P Aの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第22図は、プラ
スミドpB al 8 cat(G T 6 )の制限
部位および機能地図を示す模式図であり、第23図は、
プラスミドI)SV2E1Aの制限部位および機能地図
を示す模式図であり、第24図は、プラスミドpT6
hd(G T )の制限部位および機能地図を示す模式
図である。 特許出願人イーライ・リリー・アンド・カンパニー代理
人 弁理士 青 山 葆 はか1名FIG、1 FIG、2 FIG、3 StuI FIG、5 FIG、4 FIG、6 FIG、8 FIG、9 FIG、IO BamHI coRI FI G、 I l FIG、13 FIG、+4 FIG、j5 FIG、l7 FIG、16 FIG、1B FIG、j9 FIG、21 FIG、20 glII StuI/BamHI FIG、22 tuI S)Tul c11 FIG、23 δtuI/Bal工 FIG、24
す模式図であり、 第2図は、プラスミドpBKneolの制限部位および
機能地図を示す模式図であり、 第3図は、プラスミドpS V 2 catの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、 第4図は、プラスミドpL P (G T )catの
制限部位および機能地図を示す模式図であり、第5図は
、プラスミドpB L (G T )catの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第6図は、プラス
ミドpS B L (G T )catの制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、第7図は、プラスミド
pL 133の構築を示す工程図であり、 第8図は、プラスミドpLPC(GT)の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、第9図は、プラスミド
pLPC4(GT)の制限部位および機能地図を示す模
式図であり、第10図は、プラスミドpS V 2hy
gの制限部位および機能地図を示す模式図であり、 第11図は、プラスミドpLPchyg1(GT)の制
限部位および機能地図を示す模式図であり、第12図は
、プラスミドpBW32の構築を示す工程図であり、 第13図は、プラスミドpLPchd1(GT)の制限
部位および機能地図を示す模式図であり、第14図は、
プラスミドphd(G T ’)の制限部位および機能
地図を示す模式図であり、 第15図は、プラスミドpLPcE1A(GT)の制限
部位および機能地図を示す模式図であり、第16図は、
プラスミドpBLT(GT)の制限部位および機能地図
を示す模式図であり、第17図は、プラスミドpBLT
hyg1(GT)の制限部位および機能地図を示す模式
図であり、第18図は、プラスミドpB L Tdhr
r l (G T)の制限部位および機能地図を示す模
式図であり、第19図は、プラスミドpTPA603の
制限部位および機能地図を示す模式図であり、第20図
は、プラスミドphd(G T )T P Aの制限部
位および機能地図を示す模式図であり、第21図は、プ
ラスミドphd(G T )M T P Aの制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第22図は、プラ
スミドpB al 8 cat(G T 6 )の制限
部位および機能地図を示す模式図であり、第23図は、
プラスミドI)SV2E1Aの制限部位および機能地図
を示す模式図であり、第24図は、プラスミドpT6
hd(G T )の制限部位および機能地図を示す模式
図である。 特許出願人イーライ・リリー・アンド・カンパニー代理
人 弁理士 青 山 葆 はか1名FIG、1 FIG、2 FIG、3 StuI FIG、5 FIG、4 FIG、6 FIG、8 FIG、9 FIG、IO BamHI coRI FI G、 I l FIG、13 FIG、+4 FIG、j5 FIG、l7 FIG、16 FIG、1B FIG、j9 FIG、21 FIG、20 glII StuI/BamHI FIG、22 tuI S)Tul c11 FIG、23 δtuI/Bal工 FIG、24
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、真核性プロモーター、該プロモーターを刺激するよ
うに設置されたポリ−GT要素、および該プロモーター
から発現されるように設置された有用な物質をコードし
ているDNA配列を含有する組換えDNAベクターで真
核宿主細胞を形質転換し、該ベクター含有細胞を該有用
物質の発現に適した条件下で培養することにより、真核
宿主細胞において有用な物質を産生させる改良方法であ
って、 (a)大きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物の発現
をコードしているDNA配列を細胞に付与し、そして (b)工程(a)の細胞を該遺伝子産物の発現および該
ポリーGT要素活性の刺激に適した条件下で培養するこ
と、 からなる方法。 2、大きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物がアデノ
ウィルスE1Aタンパク質、アデノウィルスE1Bタン
パク質、仮性狂犬病ウィルスIEタンパク質、または単
純疱疹ウィルスICP4タンパク質である請求項1記載
の方法。 3、大きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物がアデノ
ウィルスE1Aタンパク質である請求項1または請求項
2記載の方法。 4、有用な物質がヒトプロテインCである請求項1〜3
のいずれかに記載の方法。 5、工程(b)で培養される真核宿主細胞がアデノウィ
ルス形質転換された宿主細胞である請求項1〜4のいず
れかに記載の方法。 6、真核宿主細胞が293またはAV12細胞である請
求項5記載の方法。 7、真核性プロモーターがSV40初期プロモーター、
SV40後期プロモーター、BK初期プロモーター、B
K後期プロモーター、ポリオーマウィルス初期プロモー
ター、パポバウイルス初期プロモーター、ポリオーマウ
ィルス後期プロモーター、パポバウイルス後期プロモー
ター、ヘルペスウィルスプロモーター、インターフェロ
ンa1プロモーター、マウスメタロチオネインプロモー
ター、レトロウイルスプロモーター、β−グロビンプロ
モーター、ポックスウィルスプロモーター、アデノウィ
ルスプロモーター、アデノウイルス−2後期プロモータ
ー、ウニH2Aプロモーター、コンアルブミンプロモー
ター、卵アルブミンプロモーター、マウスβ−グロビン
プロモーター、ヒトβ−グロビンプロモーター、および
ラウス肉腫ウィルス長末端繰返しプロモーターである請
求項1〜6のいずれかに記載の方法。 8、プラスミドpLP(GT)cat、pBP(GT)
cat、pSBL(GT)cat、pLPC(GT)、
pLPC4(GT)、pLPC5(GT)、pLPCh
yg1(GT)、pLPChyg2(GT)、pLPC
dhfr1(GT)、pLPCdhfr2(GT)、p
LPChd1(GT)、pLPChd2(GT)、pL
PChd3(GT)、pLPChd4(GT)、pBL
T(GT)、pBLThyg1(GT)、pBLThy
g2(GT)、pBLTdhfr1(GT)、pBLT
dhfr2(GT)、phdTPA(GT)、phdM
TPA(GT)、pBal8cat(CT6)、pBa
l8cat(GT9)、p4−14(GT)、p2−5
(GT)、pT6hd(GT)、pLPCE1A(GT
)、pLPCE1A1(GT)。 9、大きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物の存在下
でアデノウイルス−2後期プロモーターからの転写を刺
激するように設置されているポリ−GT要素を含有する
プラスミド。 10、アデノウイルス−2後期プロモーターからの転写
を刺激するように設置されているBKエンハンサーをさ
らに含有する請求項9記載のプラスミド。 11、プラスミドphd(GT)。 12、大きいDNAウィルスの即時型遺伝子産物の存在
下で、アデノウイルス−2後期プロモーターからの、タ
ンパク質をコードしているDNA配列の転写を刺激する
ように設置されているポリ−GT要素を含有する請求項
9記載のプラスミド。 13、タンパク質がクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼである請求項12記載のプラスミド。 14、pLP(GT)catである請求項13記載のプ
ラスミド。 15、アデノウイルス−2後期プロモーターからの転写
を刺激するように設置されているBKエンハンサーをさ
らに含有する請求項13記載のプラスミド。 16、プラスミドpBL(GT)cat、pBal8c
at(GT6)、またはpBal8cat(GT9)で
ある請求項15記載のプラスミド。 17、タンパク質がヒトプロテインCである請求項12
記載のプラスミド。 18、タンパク質が組織プラスミノーゲン活性化因子で
ある請求項12記載のプラスミド。 19、プラスミドphdTPA(GT)。 20、タンパク質が修飾型の組織プラスミノーゲン活性
化因子である請求項12記載のプラスミド。 21、プラスミドphdMTPA(GT)またはpT6
hd(GT)。 22、タンパク質がα−インターフェロン、β−インタ
ーフェロン、またはγ−インターフェロンである請求項
12記載のプラスミド。 23、アデノウイルス−2後期プロモーターとタンパク
質をコードしているDNA配列の間に、アデノウィルス
の3部構成のリーダーをコードしているDNAをさらに
含有している請求項12記載のプラスミド。 24、プラスミドp4−14(GT)またはp2−5(
GT)。 25、請求項8〜24のいずれかに記載のプラスミドで
形質転換した真核宿主細胞。 26、293またはAV12細胞である請求項25記載
の真核宿主細胞。 27、293/pLPC(GT)、293/pLPC4
(GT)、293/pLPChyg1(GT)、293
/pLPCdhfr1(GT)、293/pLPChd
1(GT)、293/p4−14(GT)、293/p
T6hd(GT)、AV12/pLPC(GT)、AV
12/pLPC4(GT)、AV12/pLPChyg
1(GT)、AV12/pLPCdhfr1(GT)、
AV12/pLPChd1(GT)、AV12/p4−
14(GT)、AV12/pT6hd(GT)である請
求項26記載の真核宿主細胞。 28、天然にγ−カルボキシル化され、適切に折り畳ま
れ、そしてプロセッシングされているタンパク質を産生
させる改良方法であって、該タンパク質が組換えDNA
ベクターにコードされており、該ベクターを含有する真
核宿主細胞が適切な発現条件下で培養されるときには該
タンパク質が発現されるものであり、改良が (a)ポリ−GT要素を組換えDNAベクターに挿入し
、 (b)E1A遺伝子産物を発現するアデノウィルス形質
転換した宿主細胞中に工程(a)のベクターを挿入し、 (c)カルボキシル化のための十分量のビタミンにを含
む培地中および増殖条件下で工程(b)の宿主細胞を培
養すること、 からなる方法。 29、アデノウィルス形質転換した宿主細胞がヒト胚腎
293またはAV12細胞である請求項28記載の方法
。 30、γ−カルボキシル化されるタンパク質がヒトプロ
テインCである請求項29記載の方法。 31、真核宿主細胞中でタンパク質を産生させる方法で
あって、 (a)(1)ポリ−GT要素、 (2)第1のエンハンサー、 (3)第1のエンハンサーとは別の第2のエンハンサー
、 (4)真核性プロモーター、および (5)タンパク質をコードしており、該プロモーターか
ら発現されるように設置されて いるDNA配列、 を含有する組換えDNAベクタ−で宿主細胞を形質転換
し;そして (b)工程(a)で形質転換した宿主細胞を遺伝子発現
が可能な条件下で培養すること、 からなる方法。 32、第1のエンハンサーがSV40エンハンサーであ
り、第2のエンハンサーがBKエンハンサーである請求
項31記載の方法。 33、タンパク質がヒトプロテインCである請求項31
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US25520388A | 1988-10-07 | 1988-10-07 | |
US255203 | 1988-10-07 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02171198A true JPH02171198A (ja) | 1990-07-02 |
JP3004660B2 JP3004660B2 (ja) | 2000-01-31 |
Family
ID=22967292
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1262833A Expired - Fee Related JP3004660B2 (ja) | 1988-10-07 | 1989-10-06 | 真核性発現の改良 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5506118A (ja) |
EP (1) | EP0363127B1 (ja) |
JP (1) | JP3004660B2 (ja) |
AT (1) | ATE126275T1 (ja) |
CA (1) | CA1332049C (ja) |
DE (1) | DE68923753T2 (ja) |
DK (1) | DK488289A (ja) |
ES (1) | ES2078243T3 (ja) |
GR (1) | GR3017101T3 (ja) |
IL (1) | IL91888A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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WO2006137597A1 (ja) | 2005-06-24 | 2006-12-28 | Teijin Pharma Limited | 新規生理物質nesfatinとその関連物質、およびそれらの用途 |
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IL97312A (en) | 1990-02-23 | 1999-01-26 | Lilly Co Eli | A method of generating a polypeptide in an eukaryotic vector AND recombinant surrogate cell containing an enhanced transcriptional control unit based on the primary late adenovirus coefficient |
US5242688A (en) * | 1990-12-24 | 1993-09-07 | Eli Lilly And Company | Method of treating thromboembolic disorders by administration of diglycosylated t-pa variants |
US5733720A (en) * | 1992-06-18 | 1998-03-31 | Washington University | Genetically engineered cell lines for detecting infectious herpesvirus and methods therefor |
US5958676A (en) * | 1992-06-18 | 1999-09-28 | Washington University | Genetically engineered cell lines for detecting infectious herpesvirus and methods therefor |
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DE4410188A1 (de) * | 1994-03-24 | 1995-09-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Gentherapeutisches Verfahren unter Verwendung von antibiotikaresistenzgenfreien DNA-Vektoren |
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---|---|---|---|---|
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JPH0789930B2 (ja) * | 1984-03-08 | 1995-10-04 | 大正製薬株式会社 | ウイルス性転写促進配列 |
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