ES2227514T3 - Procedimiento de uso de vectores de expresion eurocariotica que comprende un estimulante del virus bk. - Google Patents

Procedimiento de uso de vectores de expresion eurocariotica que comprende un estimulante del virus bk.

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ES2227514T3 ES93201077T ES93201077T ES2227514T3 ES 2227514 T3 ES2227514 T3 ES 2227514T3 ES 93201077 T ES93201077 T ES 93201077T ES 93201077 T ES93201077 T ES 93201077T ES 2227514 T3 ES2227514 T3 ES 2227514T3
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Abstract

UN METODO PARA PRODUCIR UNA PROTEINA QUE ES NATURALMENTE GAMMA CARBOXILATADA, ADECUADAMENTE PLEGADA Y PROCESADA, Y EN EL QUE LA PROTEINA SE CODIFICA EN UN VECTOR DEL DNA RECOMBINANTE TAL QUE LA PROTEINA SE EXPRESA CUANDO UNA CELULA HUESPED AUCARIOTICA CONTENIENDO EL VECTOR SE CULTIVA EN CONDICIONES DE EXPRESION ADECUADAS, QUE COMPRENDE: (A) LA INSERCION DEL VECTOR DENTRO DE UNA CELULA DE RIÑON EMBRIONICO HUMANO, TRANSFORMADO DE ADENOVIRUS; Y (B) EL CULTIVO DE DICHA CELULA HUESPED DE LA FASE A) EN CONDICIONES DE DESARROLLO Y EN MEDIOS QUE CONTIENEN SUFICIENTE VITAMINA K PARA CARBOXILACION.

Description

Procedimiento de uso de vectores de expresión eucariótica que comprende un estimulante del virus BK.
La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de proteína C.
En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de proteína C en una célula hospedadora eucariótica.
Se ha encontrado que resultan aumentos inesperados de la transcripción tras la situación del potenciador de BK inmediatamente cadena arriba (en el lado 5') de la región "CAAT" de un promotor eucariótico que se utiliza en serie con el potenciador de BK para transcribir una secuencia de ADN que codifica una sustancia útil. La región CAAT o "región cadena arriba inmediata" o "secuencia de homología -80" es un elemento cadena arriba que actúa en cis que es una región conservada de nucleótidos observada en promotores cuyas secuencias para actividad transcripcional se han estudiado. La secuencia CAAT media la eficacia de la transcripción y, con pocas excepciones, no puede eliminarse sin reducir la potencia del promotor.
La secuencia potenciadora de BK ejemplificada en la presente memoria se obtiene a partir del virus BK, un papovavirus humano que se aisló por primera vez de la orina de un paciente inmunosuprimido. Se sospecha que el virus BK causa una infección infantil inobservada y que es ubicuo en la población humana. Aunque el virus BK crece óptimamente en células humanas, el virus experimenta un ciclo abortivo en células no de primates, transforma células de roedor in vitro e induce tumores en hámsters. El virus BK es muy similar a SV40, pero las secuencias potenciadoras de los dos papovavirus, SV40 y BK, difieren sustancialmente en la secuencia nucleotídica. La secuencia nucleotídica completa del virus BK 5 (\sim5,2 kb) se ha dado a conocer por Seif et al., 1979, Cell 18:963 y Yang y Wu, 1979, Science 206:456. El virus BK prototípico está disponible en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852-1776, con el número de acceso ATCC VR-837. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del virus BK prototípico en la Figura 1 de los dibujos adjuntos.
Los elementos potenciadores actúan en cis y aumentan el nivel de transcripción de un gen adyacente desde su promotor de un modo que es relativamente independiente de la posición y orientación del elemento potenciador. De hecho, Khoury y Gruss, 1983, Cell 33: 313, afirman que "la notable capacidad de las secuencias potenciadoras de funcionar cadena arriba, dentro o cadena abajo de genes eucarióticos los distingue de los elementos promotores clásicos..." y sugiere que ciertos resultados experimentales indican que "los potenciadores pueden actuar a distancias considerables (quizás >10 kb)".
Se han identificado elementos potenciadores en una serie de virus, incluyendo poliomavirus, papilomavirus, adenovirus, retrovirus, virus de hepatitis, citomegalovirus, herpesvirus, papovavirus tales como virus de simio 40 (SV40) y BK, y en muchos genes no virales, tales como en intrones del gen de inmunoglobulina de ratón. Los elementos potenciadores pueden estar presentes también en una amplia variedad de otros organismos. Las células hospedadoras reaccionan a menudo diferentemente ante diferentes elementos potenciadores. Esta especificidad celular indica que los productos de genes hospedadores interaccionan con el elemento potenciador durante la expresión génica.
Los elementos potenciadores pueden interactuar también con productos de genes virales presentes en la célula hospedadora. Velcich y Ziff, 1983, Cell 40:705; Borrelli et al., 1984, Nature 312:608; y Hen et al., 1985, Science 230:1391, dan a conocer que los productos del gen 30 de la región temprana 1A (E1A) del adenovirus 2 reprimen la activación de la transcripción inducida por potenciadores de SV40, virus de polioma, gen de inmunoglobulina de ratón y E1A de adenovirus 2. En consecuencia, no se esperaba que los vectores de expresión eucariótica que utilizaban potenciadores para aumentar la transcripción de genes recombinantes funcionaran mejor que los vectores sin potenciadores en células hospedadoras que contenían E1A. En fuerte contraste con los procedimientos de la técnica anterior de uso de potenciadores, el presente procedimiento para utilizar el elemento potenciador del virus BK implica utilizar el producto del gen EMA o un producto de un gen inmediato-temprano similar de un virus de ADN grande para maximizar la expresión génica. Por tanto, la presente invención enseña que la capacidad del potenciador de BK de promover la transcripción del ADN aumenta en presencia del producto del gen E1A de cualquier
adenovirus.
El producto del gen E1A (realmente el gen E1A produce dos productos, que se designan colectivamente en la presente memoria como "el producto del gen E1A") es un producto de gen inmediato-temprano de adenovirus, un virus de ADN grande. La presente invención comprende el uso de cualquier producto de gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande que funcione similarmente al producto del gen E1A para aumentar la actividad del potenciador de BK. La proteína ICP4 del herpesvirus simplex, descrita por DeLuca et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1997-2008, la proteína IE del virus de la pseudorrabia, descrita por Feldman et al., 1982 PNAS 79:4952-4956, y la proteína E1B de adenovirus son todas productos de gen inmediato-temprano de virus de ADN grande que tienen funciones similares a las de la proteína E1A. Por lo tanto, el procedimiento de la presente invención incluye el uso de las proteínas ICP4, IE o E1B, en presencia o ausencia de proteína E1A, para aumentar la actividad del potenciador de BK.
El uso del potenciador del virus BK en presencia de un producto de gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande, tal como el producto del gen E1A de adenovirus, aumenta la transcripción y la expresión de genes recombinantes en células hospedadoras eucarióticas. Puede utilizarse una variedad de vectores de expresión que utilizan la secuencia potenciadora BK en serie con un promotor eucariótico, tal como el promotor tardío de adenovirus, para dirigir la expresión de productos útiles en células hospedadoras eucarióticas. Muchos de estos vectores de expresión comprenden un módulo potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus que puede transferirse fácilmente a otros vectores para uso en el presente procedimiento. La versatilidad de los presentes vectores de expresión se demuestra por el alto nivel de expresión dirigida por estos vectores de proteínas diversas tales como cloranfenicol acetiltransferasa, proteína C, activador de plasminógeno de tejido y activador de plasminógeno de tejido modificado.
La presente invención se refiere a un procedimiento para aumentar la actividad del potenciador de BK respecto a un promotor eucariótico adyacente, y se ilustra utilizando el módulo potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus 2. Estos derivados se construyeron mediante tratamiento enzimático que situó el potenciador de BK muy cerca de la región CAAT del promotor tardío de adenovirus 2. Se observaron aumentos drásticos de los niveles de expresión, en comparación con construcciones que carecen de esta situación, cuando se incorporan estas secuencias de potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus modificado a vectores de expresión, y se utilizaron después para dirigir la expresión de productos génicos útiles en células hospedadoras eucarióticas.
Según la presente invención, se proporciona un procedimiento de producción de proteína C en el que la proteína se codifica en un vector de ADN recombinante de tal modo que la proteína se expresa cuando se cultiva una célula hospedadora eucariótica que contiene el vector en condiciones de expresión adecuadas, que comprende:
(a) insertar el vector en una célula renal humana transformada con adenovirus, conteniendo dicho vector ácido nucleico que codifica la proteína C; y
(b) cultivar dicha célula hospedadora de la etapa (a) en condiciones de crecimiento y en medio que contiene suficiente vitamina K para la carboxilación.
La línea celular renal humana transformada con adenovirus utilizada en la presente invención es preferiblemente la línea celular 293. Ésta es obtenible de la ATCC con el número de acceso ATCC CRL 1573.
La actividad de un potenciador de BK puede aumentarse con respecto a un promotor eucariótico disponiendo el potenciador de 0 a 300 nucleótidos cadena arriba del extremo 5' de la región CAAT del promotor eucariótico, sujeto a la limitación de que el promotor no sea el promotor temprano de SV40.
Con los fines de la presente invención, se definen los siguientes términos a continuación.
Antibiótico: una sustancia producida por un microorganismo que, de forma natural o con una modificación química limitada, inhibirá el crecimiento o matará otro microorganismo o célula eucariótica.
Gen que confiere resistencia a antibiótico: un segmento de ADN que codifica una actividad que confiere resistencia a un antibiótico.
ApR: el fenotipo resistente a ampicilina o gen que confiere el mismo.
Clonación: el proceso de incorporar un segmento de ADN a un vector de clonación de ADN recombinante.
CmR: el fenotipo resistente al cloranfenicol o el gen que confiere el mismo.
ep: un segmento de ADN que comprende el promotor temprano de SV40 del gen antígeno T, los sitios de unión a antígeno T y el origen de replicación de SV40.
Promotor eucariótico: cualquier secuencia de ADN que funciona como promotor en células eucarióticas.
HmR: el fenotipo resistente a la higromicina o el gen que confiere el mismo.
IVS: ADN que codifica un intrón, también denominado una secuencia interpuesta.
Virus de ADN grande: un virus que infecta células eucarióticas y tiene un genoma mayor de 10 kb de tamaño, concretamente cualquiera de los poxvirus, adenovirus y herpesvirus.
NeoR: el gen que confiere resistencia a neomicina, que puede utilizarse también para conferir resistencia a G418 en células hospedadoras eucarióticas.
ori: un origen de replicación de plásmido.
pA: una secuencia de ADN que codifica una señal de poliadenilación.
Promotor: una secuencia de ADN que dirige la transcripción de ADN a ARN.
Vector de clonación de ADN recombinante: cualquier agente de replicación o integración autónoma que comprende una molécula de ADN a la que pueden añadirse o se han añadido uno o más segmentos adicionales de ADN.
Vector de expresión de ADN recombinante: cualquier vector de clonación de ADN recombinante que comprende un promotor y un sitio de inserción asociado, en el que puede insertarse y expresarse una molécula de ADN que codifica un producto útil.
Vector de ADN recombinante: cualquier vector de clonación o expresión de ADN recombinante.
Replicón: cualquier secuencia de ADN que controla la replicación de un vector de ADN recombinante.
Fragmento de restricción: cualquier ADN lineal generado por la acción de una o más enzimas de restricción.
ARNr: ácido ribonucleico ribosómico.
Célula hospedadora sensible: una célula hospedadora que no puede crecer en presencia de un antibiótico dado u otro compuesto tóxico sin un segmento de ADN que confiera resistencia al mismo.
Gen estructural: cualquier secuencia de ADN que codifica un polipéptido, incluyendo el ADN que codifica los codones de inicio y paro.
TcR: el fenotipo resistente a tetraciclina o el gen que confiere el mismo.
Transformante: una célula hospedadora receptora que ha experimentado transformación.
Transformación: la introducción de ADN en una célula hospedadora receptora.
ARNt: ácido ribonucleico transferente.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un mapa de sitios de restricción y funciones del virus BK.
La Figura 2 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBKE1.
La Figura 3 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBKneo1.
La Figura 4 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pSV2cat.
La Figura 5 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPcat.
La Figura 6 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBLcat.
La Figura 7 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBKcat.
La Figura 8 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pSBLcat.
La Figura 9 describe la construcción y presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pL133.
La Figura 10 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPC.
La Figura 11 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPC4.
La Figura 12 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pSV2hyg.
La Figura 13 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPChyg1.
La Figura 14 describe la construcción y presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBW32.
La Figura 15 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPChd1.
La Figura 16 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido phd.
La Figura 17 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPCE1A.
La Figura 18 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBLT.
La Figura 19 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBLThyg1.
La Figura 20 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBLTdhfr1.
La Figura 21 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pTPA602.
La Figura 22 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pTPA603.
La Figura 23 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido phdTPA.
La Figura 24 es un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido phdMTPA.
Los expertos en la técnica reconocerán el papel clave del producto del gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande del procedimiento descrito. Los expertos en la técnica reconocerán adicionalmente que muchas líneas celulares establecidas expresan un producto de gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande, y que dichas líneas celulares son especialmente útiles en el presente procedimiento. En un procedimiento descrito, se transforma una célula, que expresa un producto de gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande, con un vector de ADN recombinante que comprende un promotor eucariótico, un potenciador de BK situado para estimular dicho promotor, y una secuencia de ADN que codifica el polipéptido funcional deseado, estando situada la secuencia para expresión desde el promotor, y la célula que contiene el vector se cultiva en condiciones adecuadas para expresión. Otro procedimiento descrito de la presente invención comprende cultivar una célula que no expresa un producto de gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande, sino que se transforma con un vector de expresión de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica el producto de gen inmediato-temprano así como el promotor anteriormente citado, el potenciador y la secuencia de ADN que codifica el polipéptido funcional.
La presente invención se refiere también a un grupo de vectores de expresión que comprende la secuencia potenciadora BK en serie con el promotor tardío de adenovirus-2. Los vectores de expresión de la presente invención se construyeron de modo que las moléculas de ADN que codifican productos útiles pueden insertarse o haberse insertado fácilmente en los vectores en la posición correcta para expresión. Además, la secuencia potenciadora de BK y el promotor eucariótico se han construido para formar un "módulo", que puede aislarse de los vectores de expresión en un fragmento de restricción relativamente pequeño. El módulo puede integrarse fácilmente entre una variedad de vectores de expresión. Los vectores de expresión ejemplificados específicamente en la presente memoria utilizan el promotor de adenovirus 2 o tardío de BK en el módulo potenciador de BK-promotor eucariótico que dirige la transcripción en el procedimiento de la presente invención.
Aunque el virus BK (ATCC VR-837) puede adquirirse o aislarse fácilmente en grandes cantidades como se describe en el ejemplo 1, también es conveniente clonar el ADN viral de BK en un vector de clonación de plásmido y utilizar el vector recombinante como fuente de secuencias de ADN viral de BK. En consecuencia, se digirió el ADN viral de BK con la enzima de restricción EcoRI que, debido a la presencia de un solo sitio EcoRI en el genoma de BK, produjo ADN lineal de BK. Se digirió igualmente el plásmido pUC8 (disponible en Bethesda Research Laboratories (BRL), P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 30 20877) y se linealizó con la enzima de restricción EcoRI, y el ADN del plásmido pUC8 cortado con EcoRI se ligó con el ADN viral de BK cortado con EcoRI para formar los plásmidos pBKE1 y pBKE2, que difieren sólo con respecto a la orientación del ADN viral de BK. Se presenta en la Figura 2 de los dibujos adjuntos un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBKE1. La construcción de los plásmidos pBKE1 y pBKE2 se describe en el ejemplo 2.
Esta invención proporciona adicionalmente compuestos de ADN que comprenden un potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus.
Los expertos en la técnica reconocerán el papel clave del producto de gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande en ambas realizaciones del procedimiento de la presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán adicionalmente que muchas líneas celulares establecidas expresan un producto de gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande y que dichas líneas celulares son especialmente útiles en el presente procedimiento. En una realización del procedimiento, se transforma una célula que expresa un producto de gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande con un vector de ADN recombinante que comprende un promotor eucariótico, un potenciador de BK situado para estimular dicho promotor, y una secuencia de ADN que codifica el polipéptido funcional deseado, estando situada la secuencia para expresión desde el promotor; y la célula que contiene el vector se cultiva en condiciones adecuadas para expresión. Otra realización del procedimiento de la presente invención comprende cultivar una célula que no expresa un producto de gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande, sino que se transforma con un vector de expresión de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica el producto de gen inmediato-temprano así como el promotor, el potenciador y la secuencia de ADN que codifica el polipéptido funcional anteriormente citados.
Un aspecto importante de la presente invención es el nuevo grupo de vectores de expresión que comprenden la secuencia potenciadora de BK en serie con el promotor tardío de adenovirus 2. Los vectores de expresión de la presente invención se construyeron de modo que las moléculas de ADN que codifican productos útiles puedan insertarse o se hayan insertado fácilmente en los vectores en la posición correcta para expresión. Además, la secuencia potenciadora de BK y el promotor eucariótico se han construido para formar un "módulo", que puede aislarse de los vectores de expresión en un fragmento de restricción relativamente pequeño. El módulo puede integrarse fácilmente entre una variedad de vectores de expresión. Los vectores de expresión ejemplificados específicamente en la presente memoria utilizan el promotor de adenovirus 2 o tardío BK en el módulo potenciador de BK-promotor eucariótico que dirige la transcripción en el procedimiento de la presente invención.
Aunque el virus BK (ATCC VR-837) puede adquirirse o aislarse fácilmente en grandes cantidades como se describe en el ejemplo 1, también es conveniente clonar el ADN viral de BK en un vector de clonación de plásmido y utilizar el vector recombinante como fuente de secuencias de ADN viral de BK. En consecuencia, se digirió el ADN viral de BK con la enzima de restricción EcoRI que, debido a la presencia de sólo un sitio EcoRI en el genoma BK, produjo ADN lineal de BK. Se digirió igualmente el plásmido pUC8 (disponible en Bethesda Research Laboratories (BRL), P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 30 20877) y se linealizó con la enzima de restricción EcoRI, y el ADN del plásmido pUC8 cortado con EcoRI se ligó con el ADN viral de BK cortado con EcoRI para formar los plásmidos
pBKE1 y pBKE2, que difieren sólo con respecto a la orientación del ADN viral de BK. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBKE1 en la Figura 2 de los dibujos adjuntos. La construcción de los plásmidos pBKE1 y pBKE2 se describe en el ejemplo 2.
El genoma viral de BK se ha combinado también con una parte del plásmido pdBPV-MMTneo para construir los plásmidos pBKneo1 y pBKneo2. El plásmido pdBPV-MMTneo, de aproximadamente 15 kb de tamaño y disponible en la ATCC con el número de acceso ATCC 37224, comprende el replicón y el gen de \beta-lactamasa del plásmido pBR322, el promotor de metalitioneína de ratón situado para dirigir la expresión de un gen estructural que codifica una enzima que confiere resistencia a neomicina, y aproximadamente 8 kb de ADN de papilomavirus bovino (BPV). El plásmido pdBPV-MMTneo puede digerirse con la enzima de restricción BamHI para generar dos fragmentos: el fragmento de \sim8 kb que comprende el ADN de BPV y un fragmento de \sim7 kb que comprende las demás secuencias descritas anteriormente. El virus BK tiene sólo un sitio de restricción BamHI, y los plásmidos pBKneo1 y pBKneo2 se construyeron ligando el fragmento de restricción BamHI de \sim7 kb del plásmido pdBPV-MMTneo con ADN de virus BK linealizado con BamHI. La construcción de los plásmidos pBKneo1 y pBKneo2, que difieren sólo con respecto a la orientación del ADN del virus BK, se describe en el Ejemplo 3, y se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBKneo1 en la Figura 3 de los dibujos adjuntos.
Los plásmidos pBKE1, PBKE2, pBKneo1 y pBKneo2 comprenden cada uno el genoma completo del virus BK, incluyendo la secuencia potenciadora, y portanto sirven como materiales de partida útiles para los vectores de expresión de la presente invención. Uno de dichos vectores de expresión ilustrativos, el plásmido pBLcat, comprende la secuencia potenciadora de BK en serie con el promotor tardío de adenovirus de tipo 2 situado para dirigir la expresión de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). El plásmido pSV2cat sirve como fuente conveniente del gen CAT y puede obtenerse de la ATCC con el número de acceso ATCC 37155. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pSV2cat en la Figura 4 de los dibujos adjuntos. El ADN de adenovirus humano de tipo 2 está comercialmente disponible y puede obtenerse también de la ATCC con el número de acceso ATCC VR-2.
El plásmido pBLcat ilustrativo se construyó ligando el fragmento de restricción AccI-PvuI de \sim0,32 kb que contiene el promotor tardío de ADN de adenovirus humano de tipo 2 con engarces romos por BclI que se unieron sólo al extremo PvuII del fragmento de restricción AccI-PvuII. El fragmento resultante se ligó después con el fragmento de restricción AccI-StuI de \sim4,51 kb del plásmido pSV2cat proporcionando el plásmido intermedio pLPcat, para el que se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones en la Figura 5 de los dibujos adjuntos. El plásmido pBLcat deseado se construyó a partir del plásmido pLPcat ligando el origen de replicación y el fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim1,28 kb que contiene el potenciador de ADN del virus BK con el fragmento de restricción AccI-StuI de \sim4,81 kb del plásmido pLPcat. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBLcat resultante en la Figura 6 de los dibujos adjuntos. La construcción del plásmido pBLcat se describe adicionalmente en el ejemplo 4.
El plásmido pBKcat es un vector de expresión que ejemplifica adicionalmente la presente invención y utiliza el potenciador de BK y el promotor tardío de BK para dirigir la expresión de la cloranfenicol acetiltransferasa. El plásmido pBKcat se construyó de manera análoga a la descrita para el plásmido pLPcat. Por tanto, se ligó el fragmento de restricción AccI-StuI de \sim4,51 kb del plásmido pSV2cat con el fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim1,28 kb del virus BK de tal modo que el promotor tardío de BK esté en la orientación correcta para dirigir la expresión del gen CAT. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBKcat en la Figura 7 de los dibujos adjuntos.
El plásmido pBLcat es una fuente conveniente de "módulo" potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus de la presente invención. Este módulo es un fragmento de restricción HindIII de \sim870 pb que puede insertarse convenientemente en un vector de expresión eucariótico para aumentar la expresión de un producto codificado por ese vector. Esto se realizó digiriendo el plásmido pSV2cat con la enzima de restricción HindIII e insertando el módulo potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus. El plásmido resultante, designado como plásmido pSBLcat, contiene el origen de replicación de SV40, el promotor temprano de SV40 y el potenciador de SV40, y por lo tanto difiere del plásmido pBLcat en el que se han eliminado estas secuencias.
El plásmido pSBLcat dirige la expresión de CAT a mayores niveles que el plásmido pBLcat, a condición de que no esté presente producto del gen E1A. Esta expresión aumentada en ausencia del producto del gen E1A indica que los dos potenciadores, uno de SV40 y el otro de BK, tienen un efecto potenciador aditivo sobre la transcripción de los promotores cercanos. Sin embargo, en presencia del producto del gen E1A, el plásmido pBLcat dirige la expresión de CAT a mayores niveles que el plásmido pSBLcat, presuntamente debido a que el promotor de SV40 se inhibe por el producto del gen E1A. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido en la Figura 8 de los dibujos adjuntos, y se describe la construcción del plásmido pSBLcat en el Ejemplo 5.
El módulo potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus se ha utilizado también para mejorar la expresión de la proteína C humana. Esto se realizó ligando el módulo con el plásmido pL133. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pL133 en la Figura 9 de los dibujos adjuntos. El plásmido pL133, cuya construcción se da en el ejemplo 6, se digirió con la enzima de restricción HindIII y después se ligó con el fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb del plásmido pBLcat, proporcionando el plásmido pLPC. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPC en la Figura 10 de los dibujos adjuntos, y se describe adicionalmente la construcción del plásmido pLPC en el ejemplo 7.
El plásmido pLPC, como el plásmido pL133, comprende el potenciador, los promotores temprano y tardío, los sitios de unión a antígeno T y el origen de replicación de SV40. Estos elementos están situados cercanos conjuntamente en el ADN de SV40 y son difíciles de individuar. La unión del antígeno T a los sitios de unión de antígeno T, que es necesaria para la replicación de SV40, es conocida por potenciar la transcripción desde el promotor tardío de SV40, y sorprendentemente tiene un efecto similar sobre el promotor tardío de BK. Debido a que el alto nivel de replicación dirigida por el antígeno T de un plásmido que comprende el origen de replicación de SV40 es generalmente letal para la célula hospedadora, ni el plásmido pLPC ni el plásmido pL133 se mantienen establemente en forma de elementos episomiales (extracromosómicos) en presencia del antígeno T de SV40, sino que los dos plásmidos deben integrarse en el ADN cromosómico de la célula hospedadora para mantenerse establemente.
La estructura global de la región potenciadora de BK es bastante similar a la de SV40, porque el potenciador, el origen de replicación, los promotores temprano y tardío de BK y el análogo de BK de los sitios de unión a antígeno T están todos situados cercanos y son difíciles de individuar en el ADN viral de BK. Sin embargo, cuando crece en presencia de antígeno T de BK, un plásmido que comprende el origen de replicación y los sitios de unión a antígeno T de BK no se replica en una extensión que sea letal, y se mantiene establemente en forma de un elemento episomial en la célula hospedadora. Aparentemente debido a las similares relaciones estructura-función entre los antígenos T de BK y SV40 y sus respectivos sitios de unión, la replicación de BK es también estimulada por el antígeno T de SV40. Para construir un derivado del plásmido pLPC que pueda existir en forma de un elemento mantenido establemente en una célula eucariótica transformada, se insertó el genoma de BK completo, en forma de un fragmento de restricción linealizado con EcoRI, en el único sitio de restricción EcoRI del plásmido pLPC. Esta inserción produjo dos plásmidos, designados pLPC4 y pLPC5, que difieren sólo con respecto a la orientación del fragmento EcoRI de BK. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPC4 en la Figura 11 de los dibujos adjuntos, y se describe adicionalmente la construcción de los plásmidos pLPC4 y pLPC5 en el ejemplo 8.
El mantenimiento episomial de un vector de expresión de ADN recombinante no se prefiere siempre frente a la integración en el cromosoma de la célula hospedadora. Sin embargo, debido a la ausencia de un marcador detectable que funcione en células eucarióticas, la identificación de transformantes eucarióticos estables del plásmido pLPC es difícil, a menos que el plásmido pLPC se contransforme con otro plásmido que comprenda un marcador detectable. En consecuencia, el plásmido pLPC se ha modificado para producir plásmidos derivados que sean detectables en células hospedadoras eucarióticas.
Esto se realizó ligando el plásmido pLPC con una parte del plásmido pSV2hyg, un plásmido que comprende un gen que confiere resistencia a higromicina. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pSV2hyg, que puede obtenerse del Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria, IL 61640, con el número de acceso NRRL B-18039, en la Figura 12 de los dibujos adjuntos. Se digirió el plásmido pSV2hyg con la enzima de restricción BamHI, y se aisló el fragmento de restricción BamHI de \sim2,5 kb, que comprende el gen que confiere resistencia a higromicina completo, se trató con la enzima Klenow (el fragmento grande producido tras la escisión con subtilisina de la ADN polimerasa I de E. coli), y después se ligó con el fragmento de restricción NdeI-StuI de \sim5,82 kb tratado con Klenow del plásmido pLPC, proporcionando los plásmidos pLPChyg1 y pLPChyg2. Los plásmidos pLPChyg1 y pLPChyg2 difieren sólo con respecto a la orientación del fragmento que confiere resistencia a higromicina. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPChyg1 en la Figura 13 de los dibujos adjuntos, y se describe el protocolo de construcción de los plásmidos pLPChyg1 y pLPChyg2 en el ejemplo 9.
Se construyeron plásmidos de expresión de proteína C humana similares que contenían el gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) insertando el fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb tratado con Klenow que contiene el gen dhfr en el fragmento de restricción NdeI-StuI de \sim5,82 kb del plásmido pLPC. Los plásmidos resultantes, designados como pLPCdhfr1 y pLPCdhfr2, difieren sólo con respecto a la orientación del gen dhfr. La construcción de estos plásmidos se describe en el ejemplo 11B.
El plásmido pLPChyg1 se modificó adicionalmente para introducir un gen de dihidrofolato reductasa (dhfr). El gen dhfr es un marcador detectable en células dhfr negativas y puede utilizarse para aumentar el número de copias de un segmento de ADN exponiendo la célula hospedadora a niveles crecientes de metotrexato. El gen dhfr puede obtenerse del plásmido pBW32. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBW32 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. El protocolo de construcción del plásmido pBW32 se describe en el ejemplo 10.
Se aisló el fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb del plásmido pBW32 que contiene el gen dhfr, se trató con enzima Klenow y se insertó en plásmido pLPChyg1 parcialmente digerido con EcoRI, proporcionando los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2. El plásmido pLPChyg1 contiene dos sitios de reconocimiento de enzima de restricción EcoRI, uno en el gen que confiere resistencia a higromicina y otro en las secuencias derivadas del plásmido pBR322. Se insertó el fragmento que comprende el gen dhfr en el sitio EcoRI localizado en las secuencias derivadas de pBR322 del plásmido pLPChyg1, proporcionando los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPChd1 en la Figura 15 de los dibujos adjuntos. La construcción de los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2, que difieren sólo con respecto a la orientación del segmento de ADN que contiene el gen dhfr, se describe en el ejemplo 11.
Se modificó el plásmido pLPCHd1 para formar el plásmido phd, un plásmido que contiene tanto el presente módulo potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus como también los genes que confieren resistencia a higromicina y dhfr. Para construir el plásmido phd, se preparó el plásmido pLPChd1 a partir de células hospedadoras E. coli dam^{-}, digeridas con la enzima de restricción BclI y recircularizadas, eliminando así el ADN que codifica la proteína C humana. El plásmido phd contiene un solo sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BclI, que está situado convenientemente para la inserción de cualquier secuencia deseada para expresión a partir del potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus de la presente invención. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido phd en la Figura 16 de los dibujos adjuntos, y se describe el protocolo de construcción del plásmido phd en el ejemplo 12.
Otro vector de expresión que ejemplifica adicionalmente la presente invención y dirige la expresión de la proteína C humana es el plásmido pLPCE1A. El plásmido pLPCE1A contiene el gen E1A de adenovirus humano de tipo 2, cuyo producto génico, como se describe anteriormente, aumenta la actividad del potenciador de BK. Por tanto, la transcripción desde un promotor en serie con el potenciador de BK aumenta en presencia del producto del gen E1A. Se construyó el plásmido pLPCE1A ligando el fragmento de restricción BalI de \sim1,8 kb que contiene el gen E1A de ADN de adenovirus de tipo 2 humano con el fragmento de restricción NdeI-StuI de \sim5,82 kb del plásmido pLPC. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPCE1A en la Figura 7 de los dibujos adjuntos, y se describe el protocolo de construcción del plásmido pLPCE1A en el ejemplo 13.
Una variedad de vectores de expresión de la presente invención utiliza el módulo potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus para dirigir la expresión de activador de plasminógeno en tejido (TPA) o TPA modificado (MTPA). Para construir dichos vectores, se digirió el plásmido pBW32 (Figura 14) con la enzima de restricción BamHI, y el fragmento de \sim5,6 kb resultante se recircularizó, proporcionando el plásmido pBW32del. El plásmido pBW32del, que codifica el TPA modificado y contiene sólo un sitio de restricción HindIII, se digirió con HindIII y se ligó después con el fragmento de restricción HindIII de \sim0,65 kb del plásmido pBa18cat, proporcionando el plásmido pBLT. El plásmido pBa18act comprende un módulo potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus mejorado y se describe en el ejemplo 17. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBLT en la Figura 18 de los dibujos adjuntos, y se describe el protocolo de construcción del plásmido pBLT en el Ejemplo 14.
Se introdujeron marcadores detectables en el plásmido pBLT digerido con BamHI. En una construcción, se insertó el fragmento de restricción BamHI de \sim2,5 kb que contiene el gen de resistencia a higromicina, proporcionando los plásmidos pBLThyg1 y pBLThyg2, y en otra construcción se insertó el fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb que contiene el gen dhfr del plásmido pBW32, proporcionando los plásmidos pBLTdhfr1 y pBLTdhfr2. Los cuatro plásmidos, pBLThyg1, pBLThyg2, pBLTdhfr1 y pBLTdhfr2, difieren sólo con respecto al tipo y/u orientación del marcador detectable. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones de cada uno de los plásmidos pBLThyg1 y pBLThyg2 en las Figuras 19 y 20 respectivamente de los dibujos adjuntos. Se describe el protocolo de construcción de los plásmidos pBLThyg1, pBLThyg2, pBLTdhfr1 y pBLTdhfr2 en el ejemplo 15.
Otros vectores de expresión de la presente invención que dirigen la expresión de TPA o TPA modificado se derivaron del plásmido pTPA103, un intermedio utilizado en la construcción del plásmido pBW32. Se describe el protocolo de construcción del plásmido pTPA103 en el ejemplo 10, y se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pTPA103 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. Para construir estos derivados, se introdujo un sitio de restricción BamHI inmediatamente antes del extremo 5' de la región de codificación de TPA del plásmido pTPA103. Se digirió el plásmido pTPA103 con la enzima de restricción HgaI para aislar el fragmento de restricción HgaI de \sim0,52 kb que comprende el extremo 5' de la región de codificación de TPA. Después de tratamiento con Klenow, se ligó el fragmento HgaI con engarces BamHI, se digirió con la enzima de restricción BamHI y se insertó en el plásmido pBR322 digerido con BamHI, formando los plásmidos pTPA601 y pTPA602. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pTPA602, que difiere del plásmido pTPA601 sólo con respecto a la orientación del fragmento de restricción BamHI insertado, en la Figura 21 de los dibujos adjuntos.
A continuación, se digirió el plásmido pTPA602 con las enzimas de restricción BglII y SalI, y se ligó el fragmento de restricción BglII-SalI de \sim4,2 kb resultante con el fragmento de restricción SalI-BglII de \sim2,05 kb del plásmido pTPA103, formando el plásmido pTPA603. El plásmido pTPA603 contiene así la secuencia de codificación completa de TPA limitada por un sitio de restricción BamHI en ambos extremos. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pTPA603 en la Figura 22 de los dibujos adjuntos. Para construir un plásmido que sea análogo al plásmido pTPA603 pero que codifique una forma modificada de TPA, se digirió el plásmido pTPA603 con las enzimas de restricción BglII y SstI, y se ligó el fragmento BglII-SstI de \sim5,02 kb resultante con el fragmento de restricción BglII-SstI de \sim0,69 kb del plásmido pBLT. Se digirió después el plásmido resultante, designado como pMTPA603, con la enzima de restricción BamHI, y se aisló el fragmento de \sim1,35 kb resultante. Se ligaron individualmente este fragmento y el fragmento BamHI de \sim1,90 kb del plásmido pTPA603 en ligamientos separados con el plásmido phd digerido con BclI (Figura 16), formando los respectivos plásmidos phdMTPA y phdTPA. Se presentan los mapas de sitios de restricción y funciones de los plásmidos phdTPA y phdMTPA en las Figuras 23 y 24 respectivamente de los dibujos adjuntos. La construcción de los plásmidos phdTPA y phdMTPA, empezando por el protocolo de construcción del plásmido pTPA602, se describe en el ejemplo 16.
La presente invención comprende un procedimiento de uso del potenciador de BK en serie con un promotor eucariótico para dirigir la transcripción y expresión de secuencias de ADN en células hospedadoras eucarióticas que expresan un gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande. Los expertos reconocerán que puede utilizarse virtualmente cualquier promotor eucariótico en serie con el potenciador de BK en el presente procedimiento. Por ejemplo, los promotores temprano y tardío de SV40, los promotores temprano y tardío de BK, los promotores temprano y tardío de cualquiera de los poliomavirus o papovavirus, el promotor timidina quinasa del herpesvirus simplex, el promotor de interferón \alpha1, el promotor de metalotioneína de ratón, promotores de retrovirus, el promotor de \beta-globina, promotores de adenovirus, el promotor H2A de erizo de mar, el promotor de conalbúmina, el promotor de ovoalbúmina, el promotor de globina \beta de ratón, el promotor de globina \beta humana y el promotor repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, pueden servir todos como promotor eucariótico en el procedimiento de la presente invención. Además, cualquier secuencia que contiene un sitio de inicio de la transcripción, compuesto por una secuencia de tipo "TATA" con o sin una secuencia "CAAT" cadena arriba, puede servir como promotor en la presente invención. Dichos promotores pueden utilizarse en el presente procedimiento insertando convencionalmente los promotores en vectores de expresión que comprenden el potenciador de BK como se ejemplifica en la presente memoria utilizando el promotor tardío de adenovirus 2, que es el promotor eucariótico preferido para uso en el presente procedimiento.
El potenciador de BK utilizado en los vectores de la presente memoria que ejemplifica la presente invención se aisló a partir de la cepa prototipo del virus BK. Sin embargo, se han aislado y descrito una serie de variantes del virus BK. Gardner et al., 1971, The Lancet 1: 1253 (véase también Gardner, 1973, Brit. Med. J. 1:77-78) describieron el primer aislamiento de un virus BK, y la cepa Gardner se designa por tanto como el prototipo o virus BK de tipo salvaje. La cepa Gardner del virus BK (Figura 1) está disponible en la ATCC con el número de acceso ATCC VR-837. Ni el procedimiento de uso del potenciador de BK en serie con un promotor eucariótico para dirigir la expresión de sustancias útiles, tales como ácidos nucleicos y proteínas, en presencia de un producto de gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande, ni ningún otro procedimiento de la presente invención está limitado a la cepa Gardner o a una variante particular de BK, aunque se prefiere el potenciador de la cepa prototipo. La siguiente tabla enumera un número representativo de variantes de BK que pueden utilizarse en los procedimientos de la presente invención.
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(Tabla pasa a página siguiente)
1
Los expertos entenderán que pueden utilizarse una variedad de células hospedadoras eucarióticas en el presente procedimiento, a condición de que la célula hospedadora exprese un producto de gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande. Debido a que el producto de gen inmediato-temprano puede introducirse en células hospedadoras por cualquier medio, tal como transformación con un plásmido u otro vector, puede utilizarse virtualmente cualquier célula eucariótica en el presente procedimiento. Las células humanas son células hospedadoras preferidas en el procedimiento de la presente invención, porque las células humanas son el hospedador natural del virus BK y pueden contener factores celulares que sirven para estimular el potenciador de BK. Aunque las células renales humanas son especialmente preferidas como células hospedadoras, la línea celular 293 renal humana transformada con adenovirus 5, que expresa el producto del gen E1A, es la más preferida y está disponible en la ATCC con el número de acceso ATCC CRL 1573.
La línea celular 293 es preferida no sólo porque las células 293 expresan el producto del gen E1A, sino también debido a la capacidad de las células 293 de \gamma-carboxilar y procesar apropiadamente de otro modo productos génicos complejos tales como la proteína C. Las células renales normalmente \gamma-carboxilan y procesan de otro modo ciertas proteínas, pero las células 293 están transformadas con adenovirus, lo que generalmente da como resultado una pérdida de funciones especializadas. En consecuencia, la presente invención comprende también una mejora en el procedimiento de producción de una proteína que de modo natural se gamma-carboxila, se pliega y se procesa apropiadamente, en el que dicha proteína se codifica en un vector de ADN recombinante tal que dicha proteína se expresa cuando se cultiva una célula hospedadora eucariótica que contiene dicho vector en condiciones de expresión adecuadas, comprendiendo la mejora: (a) insertar dicho vector en una célula renal humana transformada con adenovirus; y (b) cultivar dicha célula hospedadora de la etapa (a) en condiciones de crecimiento y en un medio que contiene suficiente vitamina K para carboxilación.
Las nuevas construcciones de potenciador de BK-promotor eucariótico descritas en el ejemplo 17 se construyeron utilizando un procedimiento para mejorar la actividad del potenciador de BK con respecto al promotor eucariótico. Dicho procedimiento comprende situar un potenciador de BK de 0 a 300 nucleótidos cadena arriba del extremo 5' de la región CAAT del promotor eucariótico utilizado en serie con el potenciador de BK. Los módulos mejorados producidos mediante este procedimiento comprenden una realización importante de la presente invención. El uso de los módulos mejorados no está limitado a las células hospedadoras que expresan E1A o un producto génico similar, aunque el uso preferido implica la estimulación del módulo mejorado mediante un producto de gen inmediato-temprano de un virus de ADN grande.
Otros productos de genes virales, tales como el producto del gen VA de adenovirus, pueden utilizarse para aumentar la eficacia global del presente procedimiento para utilizar el potenciador de BK para promover la transcripción y expresión de genes recombinantes en células hospedadoras eucarióticas. El producto del gen VA aumenta la eficacia de traducción de moléculas de ARNm que contienen la secuencia líder tripartita de adenovirus (Kaufman, 1985, PNAS, 82:689-693, y Svensson y Akusjarul, 1985, EMBO, 4:957-964). Los vectores de la presente invención pueden modificarse fácilmente para codificar la secuencia líder tripartita entera de adenovirus; sin embargo, como se demuestra en el ejemplo 18, la presente invención comprende el uso del producto del gen VA para aumentar la traducción de un ARNm dado que contiene sólo la primera parte de la secuencia líder tripartita de adenovirus.
La secuencia líder tripartita de adenovirus se describe a continuación:
2
en la que A es riboadenilo, G es riboguanilo, C es ribocitidilo y U es uridilo. Como se utiliza en la presente memoria, la "primera parte" de la secuencia líder tripartita de adenovirus comprende al menos la secuencia:
5'-ACUCUCUUCCGCAUCGCUGUCUGCGAGGGCCAG-3'
Por tanto, la presente invención comprende una mejora en el procedimiento de producción de una sustancia útil en una célula hospedadora eucariótica que se transforma con un vector de ADN recombinante que contiene tanto un promotor eucariótico como una secuencia de ADN que codifica dicha sustancia útil, estando situada dicha secuencia para expresión desde dicho promotor, y en la que dicha célula que contiene dicho vector se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión de dicha sustancia útil, comprendiendo la mejora:
(a) incorporar ADN que codifica la primera parte de la secuencia líder tripartita de un adenovirus a dicho vector de tal modo que, tras la transcripción, el ARNm producido codifica dicho producto útil y, en el extremo 5', contiene dicha primera parte de la secuencia líder tripartita;
(b) proporcionar a dicha célula que contiene el vector de la etapa a) una secuencia de ADN que codifica la expresión de un producto del gen VA de dicho adenovirus; y
(c) cultivar dicha célula de la etapa b) en condiciones adecuadas para la expresión de dicho producto del gen VA y para estimular la traducción de dicho ARNm,
sujeto a la limitación de que dicho ARNm no contiene la secuencia líder tripartita entera de dicho adenovirus.
Los plásmidos que codifican VA se han construido a partir de ADN de adenovirus. Se aisló un fragmento de restricción de \sim1723 pb, definido por un sitio SalI (en el nucleótido 9833) y un sitio HindIII (en el nucleótido 11556), a partir de ADN de adenovirus 2 y se clonó en el plásmido pBR322 digerido con HindIII-SalI, reemplazando así el fragmento SalI-HindIII de \sim622 pb de pBR322, construyendo el plásmido pVA. Se ha construido un plásmido que codifica la resistencia a neomicina aislando un fragmento NruI de \sim1826 pb del plásmido pVA e insertando ese fragmento en el plásmido pSVNeo (disponible en BRL) digerido con BamHI y tratado con Klenow. El plásmido resultante, designado pVA-Neo, puede utilizarse para insertar el gen VA en cualquier línea celular mediante selección de resistencia a neomicina (G418) después de la transformación.
El antígeno T de SV40, el virus BK o cualquier otro poliomavirus puede utilizarse también con los vectores de la presente invención para aumentar la actividad promotora y/o aumentar el número de copias del plásmido mediante la estimulación de la replicación. El antígeno T de SV40 estimula la transcripción por ambos promotores tardíos de adenovirus y BK. Al incluir las secuencias de codificación del antígeno T en los vectores de expresión de la presente invención o mediante la cotransfección de los vectores con un(os) plásmido(s) que portan secuencias que codifican el antígeno T, puede obtenerse la amplificación del número de copias antes de la aplicación de la presión selectiva, como se expone en el Ejemplo 19. Esto permitirá una integración de alto número de copias del vector de expresión.
Por tanto, en la realización preferida de la presente invención, el vector de expresión de ADN recombinante comprende el potenciador de BK de la cepa prototipo situado a menos de 300 nucleótidos cadena arriba del promotor tardío de adenovirus, que está situado a su vez para dirigir la expresión de un gen que codifica al menos la primera parte de la secuencia líder tripartita y una sustancia útil. Este vector preferido se utiliza para transformar células 293 de riñón embriónico humano que se han modificado, antes o después de la transformación con el vector de expresión, para expresar el producto del gen VA de un adenovirus.
Los siguientes ejemplos describen más detalladamente los procedimientos, compuestos y organismos recombinantes de la presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán que los reactivos, equipos y procedimientos particulares descritos en los ejemplos son meramente ilustrativos y no limitan la presente invención.
Ejemplo 1 Preparación de ADN del virus BK
El virus BK se obtiene de la American Type Culture Collection con el número de acceso ATCC VR-837. El virus se suministra en forma liofilizada y se resuspende en sales equilibradas de Hank (Gibco, 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072) a una valoración de aproximadamente 10^{5} unidades formadoras de placa (ufp)/ml. El hospedador de elección para la preparación de ADN del virus BK es células renales humanas primarias (PHEK), que pueden obtenerse en Flow Laboratories, Inc., 7655 Old Springhouse Road, McLean, VA 22101, con el número de catálogo 0-100 o en M.A. Bioproducts con el número de catálogo 70-151.
Se utilizan aproximadamente cinco matraces de poliestireno de 75 mm^{2} que comprenden monocapas confluentes de aproximadamente 10^{6} células PHEK para preparar el virus. Se añade aproximadamente 1 ml del virus BK a una valoración de 10^{5} ufp/ml a cada matraz, que se incuba después a 37ºC durante 1 hora, y después se añade medio de cultivo fresco (medio Eagle modificado por Dulbecco, Gibco, suplementado con suero bovino fetal al 10%), y se incuban las células infectadas a 37ºC durante 10-14 días o hasta que se observa el efecto citopatogénico completo del virus. Este efecto citopatogénico varía de línea celular en línea celular, y de virus a virus, pero habitualmente consiste en que las células se redondean, se agrupan y se desprenden del disco de cultivo.
El virus se libera de las células mediante tres ciclos de congelación-descongelación, y el desecho celular se retira mediante centrifugación a 5000xg. Se precipita el virus en 1 litro de fluido sobrenadante y se recoge mediante la adición de 100 g de PEG-6000, la incubación de la solución durante 24 horas a 4ºC y la centrifugación a 5000xg durante 20 minutos. Se disuelve el sedimento en tampón SSC 0,1x (SSC 1x= NaCl 0,15 M y citrato de sodio 0,015 M, pH= 7) a 1/100 del volumen original. Se deposita la suspensión viral sobre una solución de 15 ml de KBr saturado en un tubo, que se centrifuga a 75.000xg durante 3 horas. Son evidentes dos bandas en la solución de KBr después de la centrifugación. La banda inferior, que contiene el virión completo, se recoge y se desala en una columna Sephadex G-50 utilizando TE (Tris-HCl 10 mM, pH= 7,8 y EDTA 1 mM) como tampón de elución.
Se añade dodecilsulfato de sodio (SDS) a la solución de viriones purificados obtenida de la columna a una concentración de un 1%; se añade pronasa a una concentración de 100 \mug/ml, y se incuba la solución a 37ºC durante 2 horas. Se añade después cloruro de cesio a la solución a una densidad de 1,56 g/ml, y se añade bromuro de etidio a la solución a una concentración final de 100 \mug/ml. Se centrifuga la solución en un rotor Sorval 865 o rotor vertical similar a 260.000xg durante 24 horas. Después de la centrifugación, se aísla la banda de ADN viral y se extrae cinco veces con alcohol isoamílico saturado con Tris-HCl 100 mM, pH 7,8. Se dializa después la solución de ADN del virus BK frente a tampón TE hasta que la relación de absorbancia a 260 nm/280 nm del ADN está entre 1,75 y 1,90. Se precipita el ADN ajustando la concentración de NaCl a 0,15 M, añadiendo dos volúmenes de etanol, incubando la solución a -70ºC durante al menos 2 horas, y centrifugando la solución a 12.000xg durante 10 minutos. El sedimento resultante de ADN del virus BK se suspende en tampón TE a una concentración de 1 mg/ml.
Ejemplo 2 Construcción de los plásmidos pBKE1 y pBKE2
Se disolvió aproximadamente 1 \mug de ADN del virus BK preparado en el ejemplo 1 en 1 \mul de tampón TE en 2 \mul de tampón EcoRI 10x (Tris-HCl 1,0 M, pH 7,5, NaCl 0,5 M, MgCl_{2} 50 mM y BSA 1 mg/ml) y 15 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades; todas las unidades enzimáticas designadas en la presente memoria, a menos que se indique otra cosa, designan las definiciones de unidad de New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915-9990; aunque la fuente real de enzimas pueda haber sido diferente) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas.
Se digirió aproximadamente 1 \mug del plásmido pUC8 (disponible en Pharmacia P-L Biochemicals, 800 Centennial Ave., Piscataway, N.J. 08854) en 1 \mul de tampón TE con EcoRI sustancialmente según el procedimiento utilizado para preparar ADN del virus BK digerido con EcoRI. Se diluyó el ADN del plásmido pUC8 digerido con EcoRI a 100 \mul en tampón TE; se añadieron \sim0,06 unidades de fosfatasa alcalina de ternero a la solución y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 30 minutos. Se ajustó la solución para contener SET 1x (Tris-HCl 5 mM, pH 7,8, EDTA 5 mM y NaCl 150 mM), NaOAc 0,3 M y 0,5% de SDS y se incubó después a 65ºC durante 45 minutos. El tratamiento con fosfatasa evita que el ADN de pUC8 se autolige.
Se extrajeron los ADN del virus BK digerido con EcoRI y del plásmido pUC8 en primer lugar con fenol tamponado y después con cloroformo. Se recogió el ADN ajustando la concentración de NaCl de cada solución de ADN a 0,25 M, añadiendo dos volúmenes de etanol, incubando las mezclas resultantes en un baño de hielo seco-etanol durante 5 minutos, y centrifugando para sedimentar el ADN. Se desecharon los sobrenadantes y se aclararon los sedimentos de ADN con etanol al 70%, se secaron y se resuspendieron en 10 \mul y 30 \mul de tampón TE para las muestras de BK y plásmido pUC8, respectivamente.
Se añadieron aproximadamente 3 \mul de H_{2}O y 1 \mul de tampón ligasa 10x (Tri-HCl 0,5 M, pH 7,8, MgCl_{2} 100 mM, DTT 200 mM, ATP 10 mM y BSA 0,5 mg/ml) a una mezcla de 2 \mul de virus BK digerido con EcoRI y 1 \mul de ADN del plásmido pUC8 digerido con EcoRI. Se añadió 1 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 a la solución de ADN y la reacción resultante se incubó a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó los plásmidos deseados pBKE1 y pBKE2, que difieren sólo con respecto a la orientación del ADN del virus BK insertado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBKE1 en la Figura 2 de los dibujos adjuntos.
Se hizo crecer un cultivo de 50 ml de K12 JM103 de E. coli, disponible en Pharmacia P-L Biochemicals, en caldo L hasta una densidad óptica a 650 nanómetros (DO_{650}) de aproximadamente 0,4 unidades de absorbancia. Se enfrió el cultivo en hielo durante 10 minutos y se recogieron las células mediante centrifugación. Se resuspendió el sedimento celular en 25 ml de MgCl_{2} 100 mM frío y se incubó en hielo durante 25 minutos. Se sedimentaron una vez más las células mediante centrifugación, se resuspendió el sedimento en 2,5 ml de CaCl_{2} 100 mM frío y se incubó durante 30 minutos en hielo. Después de la incubación, las células son competentes para la captación de ADN transformante.
Se mezclaron 200 \mul de esta suspensión celular con el ADN ligado preparado anteriormente y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Al final de este periodo, se dispusieron las células en un baño de agua a 42ºC durante 2 minutos y después se devolvieron al hielo durante 10 minutos adicionales. Se recogieron las células mediante centrifugación, se resuspendieron en 1 ml de caldo L y se incubaron a 37ºC durante 1 hora.
Se sembraron alícuotas de mezcla de células en placas de agar L (caldo L con 15 gramos de agar por litro) que contenían 100 \mug ampicilina/ml, 40 \mug de X-gal/ml y 40 \mug de IPTG/ml. Las placas se incubaron a 37ºC durante una noche. Las colonias que contienen un plásmido sin inserto, tales como K12 JM103/pUC8 de E. coli, aparecen azules en estas placas. Las colonias que contienen un plásmido con un inserto, tales como K12 JM103/pBKE1 de E. coli, son blancas. Se seleccionaron diversas colonias blancas y se examinó mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido la presencia del fragmento de restricción EcoRI de \sim5,2 kb del virus BK. Se obtuvo el ADN de plásmido de células K12 JM103/pBKE1 de E. coli y JM103/pBKE2 de E. coli sustancialmente según el procedimiento para aislar ADN de plásmido que se describe en el siguiente ejemplo, aunque el procedimiento se realiza a escala menor y se omiten las etapas de gradiente de CsCl, cuando se aísla el ADN de plásmido sólo para análisis de enzimas de restricción.
Ejemplo 3 Construcción de los plásmidos pBKneo1 y pBKneo2
Se obtienen células K12 HB101/pdBPV-MMTneo de E. coli en forma liofilizada de la American Type Culture Collection con el número de acceso ATCC 37224. Se siembran las células liofilizadas en placas de agar L que contienen 100 \mug/ml de ampicilina y se incuban a 37ºC para obtener aislamientos de colonias individuales.
Se inoculó 1 litro de caldo L (10 g de triptona, 10 g de NaCl y 5 g de extracto de levadura por litro) que contenía 50 \mug/ml de ampicilina con una colonia de K12 HB101/pdBPV-MMTneo de E. coli y se incubó en un agitador de aire a 37ºC hasta que la DO_{590} fue \sim1 unidad de absorbancia, en cuyo momento se añadieron 150 mg de cloranfenicol al cultivo. Se continuó la incubación durante aproximadamente 16 horas; la adición de cloranfenicol inhibe la síntesis de proteína, e inhibe por tanto la división celular adicional, pero permite continuar la replicación.
Se centrifugó el cultivo en un rotor Sorvall GSA (DuPont Co., Instrument Products, Biomedical Division, Newtown, CN 06470) a 6000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Se desechó el sobrenadante resultante, se lavó el sedimento celular con 40 ml de tampón TES (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 10 mM y EDTA 1 mM), y después se volvió a sedimentar. Se desechó el sobrenadante, se congeló el sedimento celular en un baño de hielo seco-etanol y después se descongeló. Se resuspendió el sedimento celular descongelado en 10 ml de una solución de sacarosa al 25% y EDTA 50 mM. Se añadió aproximadamente 1 ml de una solución de lisozima 5 mg/ml; 3 ml de EDTA 0,25 M, pH 8,0; y 100 \mul de ARNasaA 10 mg/ml a la solución, que se incubó después en hielo durante 15 minutos. Se añadieron 3 ml de solución de lisado (preparada mezclando 3 ml de Triton-X 100 al 10%, 75 ml de EDTA 0,25 M, pH 8,0, 15 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 y 7 ml de agua) a las células tratadas con lisozima, se mezclaron y la solución resultante se incubó en hielo durante otros 15 minutos. Se congelaron las células lisadas en un baño de hielo seco-etanol y después se descongelaron.
Se retiró el desecho celular de la solución mediante centrifugación a 25.000 rpm durante 40 minutos en un rotor SW27 (Beckman, 7360 N, Lincoln Ave., Lincolnwood, IL 60646) y mediante extracción con fenol tamponado. Se añadieron aproximadamente 30,44 g de CsCl y \sim1 ml de una solución de bromuro de etidio 5 mg/ml al extracto celular, y después se ajustó el volumen de la solución a 40 ml con tampón TES. Se decantó la solución en un tubo de ultracentrífuga VTi50 (Beckman), que se selló después y se centrifugó en un rotor VTi50 a 42.000 rpm durante \sim16 horas. Se aisló la banda de plásmido resultante, visualizada con luz ultravioleta, y se dispuso después en un tubo y rotor Ti75 (Beckman) y se centrifugó a 50.000 rpm durante 16 horas. Se realizaron los ajustes de volumen necesarios utilizando TES que contenía CsCl 0,761 mg/ml. Se aisló de nuevo la banda de plásmido, se extrajo con isopropanol saturado con sal para retirar el bromuro de etidio y se diluyó 1:3 con tampón TES. Se añadieron después 2 volúmenes de etanol a la solución, que se incubó después durante una noche a -20ºC. Se sedimentó el ADN de plásmido centrifugando la solución en un rotor SS34 (Sorvall) durante 15 minutos a 10.000 rpm.
Se suspendió \sim1 mg de ADN del plásmido pdBPV-MMTneo obtenido mediante este procedimiento en 1 ml de tampón TE y se almacenó a -20ºC. El procedimiento de aislamiento de plásmido anterior se utiliza generalmente cuando se desean grandes cantidades de ADN de plásmido muy puro. El procedimiento puede modificarse para obtener rápidamente una cantidad menor menos pura de ADN, tal como se necesita cuando se examina en transformantes la presencia de un plásmido dado, utilizando sólo aproximadamente 5 ml de células cultivadas, lisando las células en una cantidad apropiadamente reducida de escala de tampón de lisis, y reemplazando las etapas de centrifugación con extracciones con fenol y cloroformo.
Se digirieron aproximadamente 5 \mug (5 \mul) de ADN del plásmido pdBPV-MMTneo preparado anteriormente y 5 \mug (5 \mul) de ADN del virus BK preparado en el ejemplo 1 cada uno a 37ºC durante 2 horas en una solución que contenía 2 \mul de tampón BamHI 10x (NaCl 1,5 M), Tris-HCl 60 mM, pH 7,9, MgCl_{2} 60 mM y BSA 1 mg/ml), 1 \mul de la enzima de restricción BamHI y 7 \mul de H_{2}O. Se paró la reacción mediante una extracción con un volumen igual de fenol, seguido de dos extracciones con cloroformo. Se precipitó después cada ADN digerido con BamHI, se recogió mediante centrifugación y se resuspendió en 5 \mul de H_{2}O.
Se añadió aproximadamente 1 \mul de tampón ligasa 10 x a una mezcla de plásmido pdBPV-MMTneo digerido con BamHI (1 \mul) y ADN del virus BK digerido con BamHI (1\mul). Después de añadir 1 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 y 6 \mul de H_{2}O a la mezcla de ADN, se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó los plásmidos pBKneo1 y pBKneo2 deseados, que difieren sólo con respecto a la orientación del ADN del virus BK. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBKneo1 en la Figura 3 de los dibujos adjuntos.
Las células K12 HB101 de E. coli están disponibles en forma liofilizada en el Northern Regional Research Laboratory con el número de acceso NRRL B-15626. Se cultivaron células K12 HB101 de E. coli, se hicieron competentes para transformación y se transformaron con el ADN ligado preparado anteriormente sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 2. Se sembraron las células transformadas en placas de agar L que contenían ampicilina 100 \mug/ml. Se identificaron los transformantes K12 HB101/pBKneo1 de E. coli y K12/pBKneo2 de E. coli mediante su fenotipo resistente a ampicilina y mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido.
Ejemplo 4 Construcción del plásmido pBLcat A. Construcción del plásmido intermedio pLPcat
El ADN de virión de adenovirus 2 (Ad2) es una molécula lineal bicatenaria de aproximadamente 35,94 kb de tamaño. El promotor tardío de Ad2 puede aislarse en un fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,316 kb del genoma de Ad2; este fragmento de restricción de \sim0,32 kb corresponde a la secuencia entre las posiciones nucleótidicas 5755 y 6071 del genoma de Ad2. Para aislar el fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb deseado, se digiere en primer lugar el ADN de Ad2 con la enzima de restricción BalI y se aísla el fragmento de restricción BalI de \sim2,4 kb que comprende la secuencia completa del fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb. Después, se digiere el fragmento de restricción BalI de \sim2,4 kb con AccI y PvuII para obtener el fragmento deseado.
Se disuelven aproximadamente 50 \mug de ADN de Ad2 (disponible en BRL) en 80 \mul de H_{2}O y 10 \mul de tampón BalI 10x (Tris-HCl 100 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 120 mM, DTT 100 mM y BSA 1 mg/ml). Se añaden aproximadamente 10 \mul (\sim20 unidades) de la enzima de restricción BalI a la solución de ADN de Ad2, y se incuba la reacción resultante a 37ºC durante 4 horas.
Se carga el ADN digerido con BalI en gel de agarosa y se somete a electroforesis hasta que se separan bien los fragmentos de restricción. La visualización del ADN sometido a electroforesis se consigue tiñendo el gel con una solución diluida (0,5 \mug/ml) de bromuro de etidio y exponiendo el gen teñido a luz ultravioleta (UV) de onda larga. Es un procedimiento para aislar ADN de agarosa el siguiente. Se hace una pequeña ranura en el gel delante del fragmento deseado, y se dispone un trocito de membrana DEAE NA-45 (Schleicher y Schuell) en cada ranura. Tras la posterior electroforesis, el ADN se une no covalentemente a la membrana de DEAE. Después de unirse el fragmento deseado a la membrana de DEAE, se retira la membrana y se aclara con tampón bajo en sales (KCl 100 mM, EDTA 0,1 mM y Tris-HCl 20 mM, pH 8). A continuación, la membrana se sitúa en un tubo pequeño y se sumerge en tampón rico en sales (NaCl 1 M, EDTA 0,1 mM y Tris-HCl 20 mM, pH 8), y después se incuba a 65ºC durante 1 hora para retirar el ADN del papel DEAE. Después de incubación a 65ºC, se recoge el tampón de incubación y se aclara la membrana con tampón rico en sales. Se combina la solución de aclarado rica en sales con el tampón de incubación rico en
sales.
Se ajusta el volumen de la solución de ADN rica en sales de modo que la concentración de NaCl sea 0,25 M, y después se añaden tres volúmenes de etanol absoluto frío a la solución. Se mezcla la solución resultante y se dispone a -70ºC durante 10-20 minutos. Se centrifuga después la solución a 15.000 rpm durante 15 minutos. Después de otra precipitación para retirar la sal residual, se aclara el sedimento de ADN con etanol, se seca, se resuspende en 20 \mul de tampón TE y constituye aproximadamente 3 \mug del fragmento de restricción deseado de Ad2. El fragmento purificado obtenido se disuelve en 10 \mul de tampón TE.
Se añaden aproximadamente 6 \mul de H_{2}O y 2 \mul de tampón AccI 10x (NaCl 60 mM, Tris-HCl 60 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 60 mM, DTT 60 mM y BSA 1 mg/ml) a la solución del fragmento de restricción BalI de \sim2,4 kb de Ad2. Después de la adición de aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción AccI a la solución de ADN, se incuba la reacción a 37ºC durante 2 horas. Después de digestión con AccI, se recoge el ADN mediante precipitación con etanol y se resuspende en 16 \mul de H_{2}O y 2 \mul de tampón PvuII 10x (NaCl 600 mM, Tris-HCl 60 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 60 mM, DTT 60 mM y BSA 1 mg/ml). Después de la adición de aproximadamente 2 \mul (aproximadamente 10 unidades) de la enzima de restricción PvuII a la solución de ADN, se incuba la reacción a 37ºC durante 2 horas.
Se carga el fragmento de restricción BalI de \sim2,5 kb digerido con AccI-PvuII de Ad2 en un gel de poliacrilamida al \sim6% y se somete a electroforesis hasta que el fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb que comprende el promotor tardío de Ad2 se separa de los demás productos de digestión. Se tiñe el gel con bromuro de etidio, se visualiza utilizando luz UV y se corta del gel el segmento de gel que contiene el fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb, se tritura y se empapa durante una noche a temperatura ambiente en \sim250 \mul de tampón de extracción (NH_{4}OAc 500 mM, MgOAc 10 mM, EDTA 1 mM y SDS al 0,1%). La mañana siguiente, se centrifuga la mezcla y se desecha el sedimento. Se precipita el ADN del sobrenadante con etanol; se añaden aproximadamente 2 \mug de ARNt para asegurar la precipitación completa del fragmento deseado. Se obtienen aproximadamente 0,2 \mug del fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb y se suspenden en 7 \mul de H_{2}O.
Se añadieron aproximadamente 0,25 \mug (en 0,5 \mul) de engarces de BclI (5'-CTGATCAG-3', disponible en New England Biolabs), que se habían sometido a quinasa sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 10A siguiente, a la solución del fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb, y después se añadieron 1 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 y 1 \mul de tampón ligasa 10x a la solución de ADN, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche. Los engarces de BclI podían ligarse sólo al extremo PvuII del fragmento de restricción AccI-PvuII. La secuenciación de ADN posterior reveló que cuatro engarces de BclI se unían al extremo PvuII del fragmento de restricción AccI-PvuII. Estos engarces BclI extra pueden retirarse mediante digestión con BclI y religamiento; sin embargo, los engarces extra no se retiraron porque los engarces no interfieren con el funcionamiento apropiado de los vectores que comprenden los engarces extra.
Se obtienen células K12 HB101/pSCV2cat de E. coli en forma liofilizada de la ATCC con el número de acceso ATCC 37155, y se aisló ADN del plásmido pSV2cat de las células sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pSV2cat en la Figura 4 de los dibujos adjuntos. Se obtiene aproximadamente 1 mg de ADN del plásmido pSV2cat y se disuelve en 1 ml de tampón TE. Se añadieron aproximadamente 3 \mug (3 \mul) de ADN del plásmido pSV2cat a 2 \mul de tampón AccI 10x y 16 \mul de H_{2}O, y después se añadieron 3 \mul (aproximadamente 9 unidades) de la enzima de restricción AccI a la solución de ADN de pSV2cat y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se digirió después el ADN del plásmido pSV2cat digerido con AccI con la enzima de restricción StuI añadiendo 3 \mul de tampón StuI 10x (NaCl 1,0 M, Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 100 mM, DTT 60 mM y BSA 1 mg/ml), 5 \mul de H_{2}O y aproximadamente 2 \mul (aproximadamente 10 unidades) de la enzima de restricción StuI. Se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se terminó la reacción extrayendo la mezcla de reacción una vez con fenol, después dos veces con cloroformo. Se obtuvieron aproximadamente 0,5 \mug del fragmento deseado y se disolvieron en 20 \mul de tampón TE.
Se mezclaron aproximadamente 4 \mul de ADN del plásmido pSV2cat digerido con AccI-StuI con aproximadamente 7 \mul del fragmento de restricción AccI-PvuII de \sim0,32 kb (con engarces BclI unidos) de Ad2, y después de la adición de 3 \mul de tampón ligasa 10x, 15 \mul de H_{2}O y 2 \mul (aproximadamente 1000 unidades) de ADN ligasa T4, se incubó la reacción de ligamiento a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido deseado pLPcat, un plásmido que comprende el promotor tardío de Ad2 situado de modo que dirige la transcripción, y por tanto la expresión, del gen cloranfenicol acetiltransferasa. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPcat en la Figura 5 de los dibujos adjuntos.
Se utilizó el ADN ligado para transformar células K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se sembraron las células transformadas sobre agar L que contenía 50 \mug/ml de ampicilina; se utilizó el análisis de enzimas de restricción de ADN del plásmido para identificar los transformantes K12 HB101/pLPcat de E. coli. Se aisló ADN del plásmido pLPcat de los transformantes para uso en posteriores construcciones sustancialmente según el procedimiento de aislamiento de plásmido descrito en el ejemplo 3.
B. Construcción final del plásmido pBLcat
Se añadieron aproximadamente 88 \mug de ADN del plásmido pBKneo1 en 50 \mul de tampón TE a 7,5 \mul de tampón AccI 10x, 30 \mul de H_{2}O y 15 \mul (aproximadamente 75 unidades) de la enzima de restricción AccI, y se incubó la enzima de restricción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se cargó ADN del virus BK digerido con AccI en gel de agarosa, y se separó el fragmento de \sim1,4 kb que contiene el potenciador de BK de los demás productos de digestión. Se aisló después el fragmento de restricción AccI de \sim1,4 kb sustancialmente según el procedimiento descrito en el ejemplo 4A. Se resuspendieron aproximadamente 5 \mug del fragmento en 5 \mul de tampón PvuII 10x, 45 \mul de H_{2}O y 5 \mul (aproximadamente 25 unidades) de la enzima de restricción PvuII, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se aisló después el ADN digerido con PvuII y se preparó para ligamiento sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento AccI-PvuII de \sim1,28 kb deseado y se disolvieron en 5 \mul de tampón TE.
Se disolvió aproximadamente 1 \mug de ADN del plásmido pLPcat en 5 \mul de tampón AccI 10x y 40 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim25 unidades) de enzima de restricción AccI a la solución de ADN del plásmido pLPcat y se incubó la reacción resultante a 37ºC. Se precipitó el ADN del plásmido pLPcat digerido con AccI con etanol y se resuspendió en 5 \mul de tampón StuI 10x, 40 \mul de H_{2}O y 5 \mul (aproximadamente 25 unidades) de enzima de restricción StuI, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó ADN del plásmido pLPcat digerido con AccI-StuI con etanol varias veces para purificar el fragmento de restricción AccI-StuI de \sim4,81 kb que comprende el origen de replicación de E. coli y el promotor tardío de Ad2 del otro producto de digestión, un fragmento de restricción de aproximadamente 16 pb de tamaño. Se obtuvo aproximadamente 1 \mug del fragmento de restricción de \sim4,8 kb deseado y se disolvió en 20 \mul de tampón TE.
Se añadieron los 5 \mul del fragmento de restricción AccI-StuI de \sim4,81 kb del plásmido pLPcat a 5 \mul del fragmento de restricción AccI-PvuI de \sim1,28 kb del virus BK. Después de la adición de 3 \mul de tampón ligasa 10x, 15 \mul de H_{2}O y 2 \mul (aproximadamente 1000 unidades) de ADN ligasa T4 a la mezcla de ADN, se incubó la reacción de ligamiento resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pBLcat deseado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBLcat en la Figura 6 de los dibujos adjuntos.
Se utilizó el ADN ligado para transformar células K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento descrito en el ejemplo 3. Se identificaron los transformantes K12 HB101/pBLcat de E. coli mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido. Se preparó el ADN del plásmido pBLcat para uso en construcciones posteriores sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
Ejemplo 5 Construcción del plásmido pSBLcat
Se disolvieron aproximadamente 100 \mug de ADN del plásmido pBLcat en 10 \mul de tampón HindIII 10x (NaCl 0,5 M, Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, MgCl_{2} 0,1 M y BSA 1 mg/ml) y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (aproximadamente 100 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN del plásmido pBLcat y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se cargó el ADN del plásmido pBLcat digerido con HindIII en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó bien el fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb que comprende el potenciador de BK y el promotor tardío de Ad2 de los demás productos de digestión; después, se aisló el fragmento de \sim0,87 kb y se preparó para ligamiento sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 10 \mug del fragmento deseado y se disolvieron en 50 \mul de tampón TE.
Se disolvió aproximadamente 1 \mug de ADN del plásmido pSV2cat en 1 \mul de tampón TE en 2 \mul de tampón HindIII 10x y 16 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (aproximadamente 10 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 2 horas. Se paró la reacción extrayendo la mezcla de reacción en primer lugar con fenol, después dos veces con cloroformo. Se precipitó el ADN del plásmido pSV2cat digerido con HindIII con etanol y se resuspendió en 100 \mul de tampón TE. Se trató el ADN del plásmido pSV2cat digerido con HindIII con fosfatasa alcalina intestinal de ternero sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2, y después se resuspendió en 10 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 5 \mul del fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb del plásmido pBLcat a los 10 \mul de plásmido pSV2cat digerido con HindIII, y después 3 \mul de tampón ligasa 10x, 2 \mul (aproximadamente 1000 unidades) de ADN ligasa T4 y 13 \mul de H_{2}O a la solución de ADN, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante 2 horas. El ADN ligado constituyó el plásmido pSBLcat deseado. Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina, y se examinó el ADN de plásmido de los transformantes resistentes a ampicilina mediante análisis de enzimas de restricción para identificar los transformantes K12 HB101/pSBLcat de E. coli. El fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb que codifica el potenciador de BK y el promotor tardío de Ad2 podía insertarse en el plásmido pSBLcat digerido con HindIII en una de las dos orientaciones, de las que sólo una proporciona el plásmido pSBLcat. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pSBLcat en la Figura 8 de los dibujos adjuntos.
Ejemplo 6 Construcción del plásmido pL133 A. Construcción del plásmido intermedio pSV2-HPC8
El plásmido pHC7 comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína C humana. Se inoculó 1 litro de caldo L que contenía 15 \mug/ml de tetraciclina con un cultivo de K12 RR1/pHC7 de E. coli (NRRL B-15926), se aisló el ADN del plásmido pHC7 y se purificó sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se obtuvo aproximadamente 1 mg de ADN del plásmido pHC7 mediante este procedimiento, se suspendió en 1 ml de tampón TE y se almacenó a -20ºC. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pHC7 en la Figura 9 de los dibujos adjuntos.
Se mezclaron 50 \mul de ADN del plásmido pHC7 con 5 \mul (\sim5 unidades) de la enzima de restricción BanI, 10 \mul de tampón de reacción BanI 10x (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 60 mM, pH 7,9, MgCl_{2} 60 mM y BSA 1 mg/ml), y 35 \mul de H_{2}O y se incubó hasta que se completó la digestión. Se sometió después a electroforesis el ADN del plásmido pHC7 digerido con BanI en un gel de poliacrilamida al 3,5% (acrilamida:bisacrilamida 29:1), hasta que se separó el fragmento de restricción BanI de \sim1,25 kb de los demás productos de digestión.
Se cortó la región del gel que contenía el fragmento de restricción BanI de \sim1,25 kb del gel, se dispuso en un tubo de ensayo y se degradó a pequeños fragmentos. Se añadió 1 ml de tampón de extracción (NH_{4}OAc 500 mM, MgOAc 10 mM, EDTA 1 mM, SDS al 1% y ARNt 10 mg/ml) al tubo que contenía los fragmentos, y se dispuso el tubo a 37ºC durante una noche. Se utilizó centrifugación para sedimentar el desecho, y se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo. Se lavó el desecho una vez con 200 \mul de tampón de extracción; se combinó el sobrenadante de lavado con el primer sobrenadante de la extracción de una noche. Después de pasar el sobrenadante a través de una capa de lana de vidrio, se añadieron dos volúmenes de etanol y se mezclaron con el sobrenadante. Se dispuso la solución resultante en un baño de hielo seco-etanol durante \sim10 minutos y después se sedimentó el ADN mediante centrifugación.
Se obtuvieron aproximadamente 8 \mug del fragmento de restricción BanI de \sim1,25 kb mediante este procedimiento. Se suspendió el fragmento purificado en 10 \mul de tampón TE y se almacenó a -20ºC. El fragmento de restricción BanI tuvo que modificarse mediante la adición de un engarce para construir el plásmido pSV2-HPC8. Los fragmentos de ADN utilizados en la construcción del engarce se sintetizaron utilizando un sintetizador de ADN Systec 1450A (Systec Inc., 3816 Chandler Drive, Minneapolis, MN) o un sintetizador de ADN ABS 380A (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94494). Son conocidos muchos instrumentos sintetizadores de ADN en la técnica, y pueden utilizarse para preparar los fragmentos. Además, los fragmentos pueden prepararse también convencionalmente sustancialmente según los procedimientos de Itakura et al., 1977, Science, 198:1056 y Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75:5765.
Se sometieron a quinasa 500 pmol de cada cadena sencilla del engarce en 20 \mul de tampón de reacción, que contenía 15 unidades (\sim0,5 \mul) de polinucleótido quinasa T4, 2 \mul de tampón ligasa 10x, 10 \mul de ATP 500 \muM y 7,5 \mul de H_{2}O. Se incubó la reacción de quinasa a 37ºC durante 30 minutos y se terminó la reacción mediante incubación a 100ºC durante 10 minutos. Para asegurar una quinación completa, se enfrió la reacción en hielo, se añadieron 2 \mul de ditiotreitol 0,2 M, 2,5 \mul de ATP 5 mM y 15 unidades de polinucleótido quinasa T4 a la mezcla de reacción y se mezcló, y se incubó la mezcla de reacción otros 30 minutos a 37ºC. Se paró la reacción mediante otra incubación de 10 minutos a 100ºC y después se enfrió en hielo.
Aunque sometidas a quinasa separadamente, las dos cadenas sencillas delengarce de ADN se mezclaron conjuntamente después de la reacción con quinasa. Para reasociar las cadenas, se incubó la mezcla de reacción de quinasa a 100ºC durante 10 minutos en un baño de agua que contenía \sim150 ml de agua. Después de esta incubación, se retiró el baño de agua y se dejó enfriar hasta temperatura ambiente, un proceso que lleva aproximadamente 3 horas. Se incubó después el baño de agua, que seguía conteniendo el tubo de ADN sometido a quinasa, a 4ºC durante una noche. Este proceso reasoció las cadenas sencillas. El engarce construido tenía la siguiente estructura:
3
Se almacenó el engarce a -20ºC hasta su uso.
Se añadieron los \sim8 \mug del fragmento BanI de \sim1,25 kb y se mezclaron con los \sim50 \mul de engarce (\sim500 picomoles), 1 \mul de ADN ligasa T4 (\sim500 unidades), 10 \mul de tampón ligasa 10x y 29 \mul de H_{2}O, y se incubó la reacción de ligamiento resultante a 4ºC durante una noche. Se paró la reacción de ligamiento mediante una incubación de 10 minutos a 65ºC. Se sedimentó el ADN añadiendo NaOAc a una concentración final de 0,3 M, añadiendo 2 volúmenes de etanol, enfriando en un baño de hielo seco-etanol y centrifugando después la solución.
Se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón de reacción ApaI 10x (NaCl 60 mM, Tris-HCl 60 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 60 mM y 2-mercaptoetanol 60 mM), 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción ApaI y 85 \mul de H_{2}O, y se dispuso la reacción a 37ºC durante 2 horas. Se paró después la reacción y se sedimentó el ADN como anteriormente. Se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón de reacción HindIII 10x, 5 \mul (\sim50 unidades) de enzima de restricción HindIII y 85 \mul de H_{2}O, y se dispuso la reacción a 37ºC durante 2 horas. Después de la digestión con HindIII, se cargó la mezcla de reacción en un gel de poliacrilamida al 3,5% y se aisló el fragmento de restricción HindIII-ApaI de \sim1,23 kb deseado sustancialmente según el procedimiento descrito en el ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 5 \mug del fragmento deseado, se suspendieron en 10 \mul de tampón TE y se almacenaron a -20ºC.
Se mezclaron 50 \mul de ADN del plásmido pHC7 con 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción PstI, 10 \mul de tampón de reacción PstI 10x (NaCl 1,0 M, Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 100 mM y BSA 1 mg/ml) y 35 \mul de H_{2}O, y se incubaron a 37ºC durante 2 horas. Se sometió después a electroforesis el ADN del plásmido pHC7 digerido con PstI en un gel de poliacrilamida al 3,5%, y se purificó el fragmento de \sim0,88 kb deseado sustancialmente según el procedimiento descrito anteriormente. Se obtuvieron aproximadamente 5 \mug del fragmento deseado, se suspendieron en 10 \mul de tampón TE y se almacenaron a -20ºC.
Se añadieron los \sim5 \mug del fragmento PstI de \sim0,88 kb y se mezclaron con \sim50 \mul del siguiente engarce, que se construyó en un sintetizador automático de ADN:
4
Se añadieron aproximadamente 1 \mul de ADN ligasa T4 (\sim10 unidades), 10 \mul de tampón ligasa 10x y 29 \mul de H_{2}O a la mezcla de ADN, y se incubó la reacción de ligamiento resultante a 4ºC durante una noche.
Se paró la reacción de ligamiento mediante una incubación de 10 minutos a 65ºC. Después de la precipitación del ADN ligado, se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón de reacción ApaI 10x, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción ApaI y 85 \mul de H_{2}O, y se dispuso la reacción a 37ºC durante 2 horas. Se paró después la reacción y se sedimentó el ADN de nuevo. Se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón de reacción BglII 10x (NaCl 1 M, Tris-HCl 100 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 100 mM, 2-mercaptoetanol 100 mM y BSA 1 mg/ml), 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BglII y 85 \mul de H_{2}O, y se dispuso la reacción a 37ºC durante 2 horas. Después de la digestión con BglII, se cargó la mezcla de reacción en un gel de poliacrilamida al 3,5% y se aisló el fragmento de restricción ApaI-BglII de \sim0,19 kb sustancialmente según el procedimiento descrito anteriormente. Se obtuvo aproximadamente 1 \mug del fragmento deseado, se suspendió en 10 \mul de tampón TE y se almacenó a -20ºC.
Se disolvieron aproximadamente 10 \mug de ADN del plásmido pSV2gpt (ATCC 37145) en 10 \mul de tampón de reacción HindIII 10x, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción HindIII y 85 \mul de H_{2}O, y se dispuso la reacción a 37ºC durante 2 horas. Se preparó después la mezcla de reacción 0,25 M en NaOAc y, después de la adición de dos volúmenes de etanol y la incubación en un baño de hielo seco-etanol, se sedimentó el ADN mediante centrifugación. Se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón BglII 10x, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BglII y 85 \mul de H_{2}O, y se dispuso la reacción a 37ºC durante 2 horas. Después de la digestión con BglII, se cargó la mezcla de reacción en gel de agarosa al 1% y se separaron los fragmentos mediante electroforesis. Se tiñó el gel con bromuro de etidio, se visualizó con luz ultravioleta, se cortó del gel la banda que contenía el fragmento HindIII-BglII de \sim5,1 kb deseado y se dispuso en tubos de diálisis, y se continuó la electroforesis hasta que el ADN salió de la agarosa. Se extrajo con fenol y CHCl_{3} el tampón que contenía el ADN del tubo de diálisis, y después se precipitó el ADN. Se resuspendió el sedimento en 10 \mul de tampón TE y constituyó \sim5 \mug del fragmento de restricción HindIII-BglII de \sim5,1 kb deseado del plásmido pSV2gpt.
Se mezclaron conjuntamente 2 \mul del fragmento de restricción HindIII-ApaI de \sim1,23 kb, 3 \mul del fragmento ApaI-BglII de \sim0,19 kb y 2 \mul del fragmento HindIII-BglII de \sim5,1 kb y se incubaron después con 10 \mul de tampón ligasa 10x, 1 \mul de ADN ligasa T4 (\sim500 unidades) y 82 \mul de H_{2}O a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pSV2-HPC8 deseado; se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido en la Figura 9 de los dibujos adjuntos.
Se hicieron competentes para transformación células K12 RR1 de E. coli (NRRL B-15210) sustancialmente según el procedimiento descrito en el ejemplo 2. Se utilizó el ADN ligado preparado anteriormente para transformar las células, y se sembraron alícuotas de la mezcla de transformación en placas de agar L que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Se incubaron después las placas a 37ºC. Se verificaron los transformantes K12 RR1/pSV2-HPC8 de E. coli mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido.
B. Construcción final del plásmido pL133
Se disolvieron 50 \mul del plásmido pSV2-HPC8 en 10 \mul de tampón de reacción HindIII 10x, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción HindIII y 85 \mul de H_{2}O, y se incubó la reacción a 37ºC durante 2 horas. Después de la digestión con HindIII, se precipitó el ADN y se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón de reacción SalI 10x (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 60 mM, pH 7,9, MgCl_{2} 60 mM, 2-mercaptoetanol 60 mM y BSA 1 mg/ml), 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción SalI y 85 \mul de H_{2}O. Se incubó la mezcla de reacción SalI resultante durante 2 horas a 37ºC. Se cargó el plásmido pSV2-HPC8 digerido con HindIII-Sal en gel de poliacrilamida al 3,5% y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción HindIII-SalI de \sim0,29 kb de los demás productos de reacción. Se aisló el fragmento deseado del gel; se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento y se suspendieron en 10 \mul de tampón TE.
Se disolvieron 50 \mug del plásmido pSV2-HPC8 en 10 \mul de tampón de reacción BglII 10x, 5 \mul (50 unidades) de la enzima de restricción BglII y 85 \mul de H_{2}O, y se incubó la reacción a 37ºC durante 2 horas. Después de la digestión con BglII, precipitó el ADN y se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón de reacción SalI 10x, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción SalI y 85 \mul de H_{2}O. Se incubó la mezcla de reacción SalI resultante durante 2 horas a 37ºC. Se cargó el plásmido pSV2-HPC8 digerido con SalI-BglII en gel de poliacrilamida al 3,5% y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción SalI-BglII de \sim1,15 kb deseado de los demás productos de reacción. Se aisló el fragmento SalI-BglII de \sim1,15 kb del gel, se obtuvieron aproximadamente 8 \mug de fragmento y se suspendieron en 10 \mul de tampón TE.
Se disolvieron aproximadamente 10 \mug de ADN del plásmido pSV2-\beta-globina (NRRL B-15928) en 10 \mul de tampón de reacción HindIII 10x, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción HindIII y 85 \mul de H_{2}O, y se dispuso la reacción a 37ºC durante 2 horas. Se preparó después la mezcla de reacción a 0,25 M de NaOAc y, después de la adición de dos volúmenes de etanol y la incubación en un baño de hielo seco-etanol, se sedimentó el ADN mediante centrifugación. Se disolvió el plásmido pSV2-\beta-globina digerido con HindIII en 10 \mul de tampón BglII 10x, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BglII y 85 \mul de H_{2}O, y se dispuso la reacción a 37ºC durante 2 horas. Después de la digestión con BglII, se cargó la mezcla de reacción en gel de agarosa al 1% y se separaron los fragmentos mediante electroforesis. Se aisló el fragmento de restricción HindIII-BglII de \sim4,2 kb deseado del gel; se obtuvieron aproximadamente 5 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 10 \mul de tampón TE.
Se mezclaron conjuntamente 2 \mul del fragmento HindIII-SalI de \sim0,29 kb del plásmido pSV2-HPC8, 2 \mul del fragmento SalI-BglII de \sim1,15 kb del plásmido pSV2-HPC8 y 2 \mul del fragmento HindIII-BglII de \sim4,2 kb del plásmido pSV2-\beta-globina y se ligaron sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 6A. El ADN ligado constituyó el plásmido pL133 deseado; se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pL133 en la Figura 9 de los dibujos adjuntos. Se construyeron los transformantes K12 RR1/pL133 de E. coli deseados sustancialmente según las enseñanzas del ejemplo 6A, con la excepción de que se utilizó el plásmido pL133, en lugar del plásmido pSV2-HPC8, como ADN transformante.
Ejemplo 7 Construcción del plásmido pLPC
Se disolvieron aproximadamente 20 \mug de ADN del plásmido pBLcat en 10 \mul de tampón HindIII 10x y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim100 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN del plásmido pBLcat y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se cargó ADN del plásmido pBLcat digerido con HindIII en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb, que comprende el potenciador de BK y el promotor tardío de Ad2, de los demás productos de digestión; después, se aisló el fragmento de \sim0,87 kb y se preparó para ligamiento sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento deseado y se disolvieron en 5 \mul de tampón TE.
Se disolvieron aproximadamente 1,5 \mug de ADN del plásmido pL133 en 2 \mul de tampón HindIII 10x y 16 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se diluyó después el ADN a 100 \mul con tampón TE y se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternero sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se extrajo dos veces con fenol el ADN del plásmido pL133 digerido con HindIII y una vez con cloroformo, se precipitó con etanol y se resuspendió en 10 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 5 \mul del fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb del plásmido pBLcat a 1,5 \mul del plásmido pL133 digerido con HindIII, y después se añadieron 1 \mul de tampón ligasa 10x, 1 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 y 1,5 \mul de H_{2}O a la solución de ADN y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pLPC deseado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPC en la Figura 10 de los dibujos adjuntos.
Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina, y se examinó el ADN de plásmido de los transformantes resistentes a ampicilina mediante análisis de enzimas de restricción para identificar los transformantes K12 HB101/pLPC de E. coli. El fragmento de restricción HindIII de \sim0,87 kb que codifica el potenciador de BK y el promotor tardío de Ad2 podían insertarse en el plásmido pSBLcat digerido con HindIII en una de dos orientaciones, de las que sólo una proporciona el plásmido pLPC.
Ejemplo 8 Construcción de los plásmidos pLPC4 y pLPC5
Se disolvieron aproximadamente 1 \mug (1 \mul) de ADN del virus BK preparado en el ejemplo 1 y 1 \mug del plásmido pLPC (1 \mul) en 2 \mul de tampón EcoRI 10x y 14 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se extrajo una vez con fenol tamponado la mezcla digerida con EcoRI de ADN de virus BK y del plásmido pLPC y una vez con cloroformo. Después, se recogió el ADN ajustando la concentración de NaCl a 0,25 M, añadiendo dos volúmenes de etanol, incubando la solución en un baño de hielo seco-etanol durante 2 minutos y centrifugando la solución para sedimentar el ADN. Se desechó el sobrenadante y se aclaró el sedimento de ADN con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en 12 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 13 \mul de H_{2}O y 3 \mul de tampón ligasa 10x a la mezcla digerida con EcoRI de ADN del virus BK y del plásmido pLPC. Se añadieron 2 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 a la solución de ADN y s incubó la reacción resultante a 16ºC durante 2 horas. El ADN ligado constituyó los plásmidos pLPC4 y pLPC5 deseados, que difieren sólo con respecto a la orientación del ADN del virus BK insertado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPC4 en la Figura 11 de los dibujos adjuntos.
El ADN ligado constituyó los plásmidos pLPC4 y pLPC5 deseados, y se utilizó para transformar células competentes K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina 100 \mug/ml. Se identificaron los transformantes K12 HB101/pLPC4 de E. coli y K12 HB101/pLPC5 de E. coli por su fenotipo resistente a ampicilina y mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido.
Ejemplo 9 Construcción de los plásmidos pLPChyg1 y pLPChyg2
Se obtienen células K12 RR1/pSV2hyg de E. coli del Northern Regional Research Laboratory con el número de acceso NRRL B-18039. Se obtiene ADN del plásmido pSV2hyg de las células sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pSV2hyg en la Figura 12 de los dibujos adjuntos.
Se añadieron aproximadamente 10 \mug (en 10 \mul de tampón TE) del plásmido pSV2hyg a 2 \mul de tampón BamHI 10x y 6 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (aproximadamente 20 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se extrajo en primer lugar la reacción con fenol y después se extrajo dos veces con cloroformo. Se cargó el ADN del plásmido pSV2hyg digerido con BamHI en gel de agarosa y se aisló el fragmento de restricción de \sim2,5 kb que contiene el gen de resistencia a higromicina sustancialmente según el procedimiento descrito en el ejemplo 4A.
Se añadieron aproximadamente 5 \mul de tampón Klenow 10x (0,2 mM de cada uno de los cuatro dNTP, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,8, MgCl_{2} 50 mM, 2-mercaptoetanol 0,1 M y BSA 100 \mug/ml) y 35 \mul de H_{2}O a la solución de ADN del plásmido pSV2hyg digerido con BamHI, y después aproximadamente 25 unidades de enzima Klenow (aproximadamente 5 \mul, comercializada por BRL) a la mezcla de ADN, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante 30 minutos. Se extrajo una vez con fenol el ADN del plásmido pSV2hyg digerido con BamHI y tratado con Klenow y otra vez con cloroformo, y después se precipitó con etanol. Se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 5 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 10 \mug (10 \mul) de ADN del plásmido pPLC a 2 \mul de tampón StuI 10x y 6 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción StuI a la solución de ADN, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pLPC digerido con StuI, se recogió mediante centrifugación y se resuspendió en 2 \mul de tampón NdeI 10x (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,1 M, pH 7,8, MgCl_{2} 70 mM, 2-mercaptoetanol 60 mM y BSA 1 mg/ml) y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción NdeI a la solución de ADN digerido con StuI y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas.
Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pLPC digerido con NdeI-StuI, se recogió mediante centrifugación y se resuspendió en 5 \mul de tampón Klenow 10x y 40 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim25 unidades) de enzima Klenow a la solución de ADN y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante 30 minutos. Después de la reacción Klenow, se cargó la mezcla de reacción en gel de agarosa y se aisló del gel el fragmento de restricción NdeI-StuI de \sim5,82 kb. Se obtuvieron aproximadamente 5 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 5 \mul de tampón TE.
Se mezclaron aproximadamente 2 \mul del fragmento de restricción BamHI de \sim2,5 kb tratado con Klenow del plásmido pSV2hyg con aproximadamente 1 \mul del fragmento de restricción NdeI-StuI de \sim5,82 kb tratado con Klenow del plásmido pLPC, y se añadieron aproximadamente 3 \mul de tampón ligasa 10x, 2 \mul de ADN ligasa T4 (\sim1000 unidades), 1 \mul de ARN ligasa T4 (\sim1 unidad) y 14 \mul de H_{2}O a la solución de ADN. Se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó los plásmidos pLPChyg1 y pLPChyg2 deseados, que difieren sólo con respecto a la orientación del fragmento de restricción BamHI de \sim2,5 kb tratado con Klenow del plásmido pSV2hyg. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPChyg1 en la Figura 13 de los dibujos adjuntos. Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se sembraron los transformantes de K12 HB101/pLPChyg1 de E. coli y K12 HB101/pLPChyg2 de E. coli deseados en agar L que contenía ampicilina y se identificaron mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido.
Ejemplo 10 Construcción del plásmido pBW32 A. Construcción del plásmido intermedio pTPA103
El plásmido pTPA102 comprende la región de codificación del activador de plasminógeno en tejido humano (TPA). El plásmido pTPA102 puede aislarse de K12 MM294/pTPA102 de E. coli, una cepa disponible en el Northern Regional Research Laboratory con el número de acceso NRRL B-15834. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pTPA102 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. Se aisló ADN del plásmido pTPA102 de K12 MM294/pTPA102 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2.
Se añadieron aproximadamente 50 \mug de plásmido pTPA102 (en aproximadamente 50 \mul de tampón TE) a 10 \mul de tampón Tth111I 10x (NaCl 0,5 M, Tris- HCl 80 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 80 mM, 2-mercaptoetanol 80 mM y BSA 1 mg/ml) y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción Tth111I a la solución de ADN y se incubó la reacción resultante a 65ºC durante 2 horas. Se cargó la mezcla de reacción en gel de agarosa y se aisló del gel el fragmento de restricción de Tth111I de \sim4,4 kb que comprende la región de codificación de TPA. Los demás productos de digestión, fragmentos de restricción de 3,1 kb y 0,5 kb, se desecharon. Se obtuvieron aproximadamente 10 \mug del fragmento de restricción Tth111I de \sim4,4 kb deseado y se suspendieron en 10 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 5 \mul de tampón Klenow 5x y 30 \mul de H_{2}O a la solución que comprendía el fragmento de restricción Tth111I de \sim4,4 kb y, después de la adición posterior de aproximadamente 5 \mul de enzima Klenow (\sim5 unidades), se incubó la mezcla de reacción a 16ºC durante 30 minutos. Después de la reacción Klenow, se precipitó el ADN con etanol y se resuspendió en 3 \mul de tampón ligasa 10x y 14 \mul de H_{2}O.
Se sometieron a quinasa engarces BamHI (New England Biolabs) que tenían la siguiente secuencia:
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y se prepararon para ligamiento mediante el siguiente procedimiento. Se disolvieron 4 \mul de engarces (\sim2 \mug) en 20,15 \mul de H_{2}O y 5 \mul de tampón quinasa 10x (Tris-HCl 500 mM, pH 7,6 y MgCl_{2} 100 mM), se incubaron a 90ºC durante 2 minutos y después se enfriaron a temperatura ambiente. Se añadieron 5 \mul de \gamma-^{32}P-ATP (\sim20 \muCi), 2,5 \mul de DTT 1 M y 5 \mul de polinucleótido quinasa (\sim10 unidades) a la mezcla, que se incubó después a 37ºC durante 30 minutos. Después, se añadieron 3,35 \mul de ATP 0,01 M y 5 \mul de quinasa, y se continuó la reacción durante otros 30 minutos a 37ºC. El ATP radiactivo ayuda a determinar si los engarces se han ligado al ADN diana.
Se añadieron aproximadamente 10 \mul de engarces BamHI sometidos a quinasa a la solución de fragmento de restricción Tth111I de \sim4,4 kb, y después de la adición de 2 \mul de ADN ligasa T4 (\sim1000 unidades) y 1 \mul de ARN ligasa T4 (\sim2 unidades), se incubó la reacción de ligamiento durante una noche a 4ºC. Se precipitó el ADN ligado con etanol y se resuspendió en 5 \mul de tampón HindIII 10x y 40 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas.
Se precipitó con etanol el ADN digerido con HindIII y se resuspendió el 10 \mul de tampón BamHI 10x y 90 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim100 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Después de la digestión con BamHI, se cargó la mezcla de reacción en gel de agarosa y se aisló del gel el fragmento de restricción BamHI-HindIII de \sim2,0 kb. Se obtuvieron aproximadamente 4 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en aproximadamente 5 \mul de tampón TE.
Para construir el plásmido pTPA103, se insertó el fragmento de restricción BamHI-HindIII de \sim2,0 kb derivado del plásmido pTPA102 en el plásmido pRC digerido con BamHI-HindIII. Se construyó el plásmido pRC insertando un fragmento de restricción EcoRI-ClaI de \sim288 pb que comprende las secuencias promotora y operadora (trpPO) del operón trp de E. coli en el plásmido pKC7 digerido con EcoRI-ClaI. El plásmido pKC7 puede obtenerse de la American Type Culture Collection en K12 N100/pKC7 de E. coli con el número de acceso ATCC 37084. El fragmento de restricción EcoRI- ClaI de \sim288 pb que comprende trpPO puede aislarse del plásmido pTPA102, que puede aislarse de K12 MM294/pTPA102 de E. coli (NRRL B-15834). El ADN del plásmido pKC7 y del plásmido pTPA102 puede obtenerse de las líneas celulares anteriormente citadas sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Este fragmento de restricción EcoRI-ClaI de \sim0,29 kb del plásmido pTPA102 comprende la secuencia activadora de la transcripción y la mayoría de la secuencia activadora de la traducción del gen trp de E. coli y tiene la secuencia descrita a continuación:
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Por tanto, para construir un plásmido pRC, se añadieron aproximadamente 2 \mug del plásmido pKC7 en 10 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón ClaI 10x (NaCl 0,5 M, Tris-HCl 60 mM, pH 7,9, MgCl_{2} 60 mM y BSA 1 mg/ml) y 6 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción ClaI a la solución de ADN del plásmido pKC7 y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pKC7 digerido con ClaI y se resuspendió en 2 \mul de tampón EcoRI 10x y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN del plásmido pKC7 digerido con ClaI y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas.
Se extrajo una vez con fenol el ADN del plásmido pKC7 digerido con EcoRI-ClaI y después dos veces con cloroformo. Se precipitó después el ADN con etanol y se resuspendió en 3 \mul de tampón ligasa 10x y 20 \mul de H_{2}O. Puede obtenerse un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pKC7 de Maniatis et al., "Molecular Cloning" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), página 8.
Se añadieron aproximadamente 20 \mug del plásmido pTPA102 en aproximadamente 20 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón ClaI 10x y 60 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción ClaI a la solución de ADN del plásmido pTPA102, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pTPA102 digerido con ClaI y se resuspendió en 10 \mul de tampón EcoRI 10x y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN del plásmido pTPA102 digerido con ClaI, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas.
Se extrajo una vez con fenol el ADN del plásmido pTPA102 digerido con EcoRI-ClaI, se cargó en gel de poliacrilamida al 7% y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción EcoRI-ClaI de \sim288 pb que comprende trpPO de los demás productos de digestión. Se aisló el fragmento de restricción EcoRI-ClaI de \sim288 pb del gel; se obtuvo aproximadamente 1 \mug del fragmento deseado, se suspendió en 5 \mul de tampón TE y se añadió a la solución de ADN del plásmido pKC7 digerido con EcoRI-ClaI preparado con se describe anteriormente. Se añadieron después 2 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 a la mezcla de ADN, y se incubó la reacción de ligamiento resultante a 16ºC durante 2 horas. El ADN ligado constituyó el ADN del plásmido pRC deseado.
Se utilizó el ADN ligado para transformar células K12 HB101 de E. coli competentes sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina 100 \mug/ml y se examinaron los transformantes resistentes a ampicilina mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido para identificar las colonias K12 HB101/pRC de E. coli. Se obtuvo el ADN del plásmido pRC a partir de transformantes K12 HB101/pRC de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
Se añadieron aproximadamente 2 \mug de ADN del plásmido pRC en 2 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón HindIII 10x y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN del plásmido pRC, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pRC digerido con HindIII y se resuspendió en 2 \mul de tampón BamHI 10x y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pRC digerido con HindII y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas.
Se extrajo una vez con fenol el ADN del plásmido pRC digerido con BamHI-HindIII y después dos veces con cloroformo. Se precipitó el ADN con etanol y se resuspendió en 3 \mul de tampón ligasa 10x y 20 \mul de H_{2}O. Se añadieron después \sim4 \mug (en \sim5 \mul de tampón TE) del fragmento de restricción HindIII-BamHI de \sim2,0 kb del plásmido pTPA102 a la solución de ADN del plásmido pRC digerido con BamHI-HindIII. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 a la mezcla de ADN y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante 2 horas. El ADN ligado constituyó el ADN del plásmido pTPA103 deseado.
Para reducir los transformantes indeseados, se digirió el ADN ligado con la enzima de restricción NcoI, que corta el plásmido pRC pero no el plásmido pTPA103. Por tanto, la digestión del ADN ligado con NcoI reduce los transformantes indeseados, porque el ADN linealizado transforma E. coli a una frecuencia menor que el ADN cerrado circular. Para digerir el ADN ligado, se precipitó en primer lugar el ADN con etanol y después se resuspendió en 2 \mul de tampón NcoI 10x (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 60 mM, pH 7,8, MgCl_{2} 60 mM y BSA 1 mg/ml) y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción NcoI a la solución de ADN y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas.
Se utilizó el ADN ligado y después digerido con NcoI para transformar K12 RV308 de E. coli (NRRL B-15624). Se hicieron competentes células K12 RV308 de E. coli y se transformaron sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se sembró la mezcla de transformación en agar L que contenía ampicilina 100 \mug/ml. Se ensayó en los transformantes resistentes a ampicilina la sensibilidad a kanamicina, porque aunque el plásmido pRC confiere resistencia a kanamicina, el plásmido pTPA103 no lo hace. Se utilizaron después los transformantes sensibles a kanamicina y resistentes a ampicilina para preparar ADN de plásmido, y se examinó el ADN de plásmido mediante análisis de enzimas de restricción para identificar los transformantes K12 RV308/pTPA103 de E. coli. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pTPA103 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. Se aisló ADN del plásmido pTPA103 de células K12 RV308/pTPA103 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
B. Construcción del plásmido intermedio pBW25
Se añadió aproximadamente 1 \mug de ADN del plásmido pTPA103 en 1 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón BglII 10x y 16 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim5 unidades) de la enzima de restricción BglII a la solución de ADN del plásmido pTPA103, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pTPA103 digerido con BglI y se resuspendió en 5 \mul de tampón Klenow 10x y 44 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul de enzima Klenow (\sim1 unidad) a la solución de ADN del plásmido pTPA103 digerido con BglII y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pTPA103 digerido con BglII y se resuspendió en 3 \mul de tampón ligasa 10x y 22 \mul de H_{2}O.
Se añadieron aproximadamente 2 \mul (0,2 \mug) de engarces NdeI no sometidos a quinasa (New England Biolabs) de secuencia:
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a la solución de ADN del plásmido pTPA103 digerido con BglII y tratado con Klenow, junto con 2 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 y 1 \mul (\sim2 unidades) de ARN ligasa T4, y se incubó la reacción de ligamiento resultante a 4ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pTPA103derNdeI, que es sustancialmente similar al plásmido pTPA103 excepto porque el plásmido pTPA103derNdeI tiene una secuencia de reconocimiento de NdeI donde el plásmido pTPA103 tiene una secuencia de reconocimiento de BglII.
Se utilizó el ADN ligado para transformar células K12 RV308 de E. coli competentes sustancialmente según el procedimiento descrito en el ejemplo 2. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina, y se identificaron los transformantes K12 RV308/pTPA103derNdeI de E. coli mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido. Se aisló el ADN del plásmido pTPA103derNdeI de los transformantes para uso en construcciones posteriores sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
Se añadieron aproximadamente 10 \mug de ADN del plásmido pTPA103derNdeI en 10 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón 10x AvaII (NaCl 0,6 M, Tris-HCl 60 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 0,1 M, 2-mercaptoetanol 60 mM y BSA 1 mg/ml) y 6 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción AvaII al ADN, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se cargó el ADN digerido con AvaII en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción de \sim1,4 kb de los demás productos de digestión. Se aisló del gel el fragmento de restricción AvaII de \sim1,4 kb del plásmido pTPA103derNdeI; se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 5 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 5 \mul de tampón Klenow 10x, 35 \mul de H_{2}O y 5 \mul (\sim5 unidades) de enzima Klenow a la solución del fragmento de enzima de restricción AvaII de \sim1,4 kb, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante 30 minutos. Se precipitó con etanol el ADN tratado con Klenow y se resuspendió en 3 \mul de tampón ligasa 10x y 14 \mul de H_{2}O.
Se sometieron a quinasa aproximadamente 2 \mug de engarces HpaI de secuencia:
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sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 10A. Se añadieron aproximadamente 10 \mul de los engarces sometidos a quinasa a la solución del fragmento de restricción AvaII de \sim1,4 kb tratado con Klenow del plásmido pTPA103derNdeI junto con 2 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 y 1 \mul (\sim1 unidad) de ARN ligasa T4, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche.
Se extrajo el ADN ligado una vez con fenol, se extrajo dos veces con cloroformo, se precipitó con etanol y se resuspendió en 2 \mul de tampón EcoRI 10x y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se extrajo una vez con fenol el ADN digerido con EcoRI, se extrajo dos veces con cloroformo, se precipitó con etanol y se resuspendió en 3 \mul de tampón ligasa 10x y 20 \mul de H_{2}O. El fragmento así preparado, que es de aproximadamente 770 pb de tamaño y codifica trpPO y la terminación amino de TPA, tenía un extremo compatible con EcoRI y un extremo romo, y se ligó con el plásmido pUC19 digerido con EcoRI-SmaI para formar el plásmido pUC19TPAFE.
Se disolvieron aproximadamente 2 \mul del plásmido pUC19 (disponible en Bethesda Research Laboratories) en 2 \mul de tampón SmaI 10x (KCl 0,2 M, Tris-HCl 60 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 60 mM, 2-mercaptoetanol 60 mM y BSA 1 mg/ml) y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción SmaI a la solución de ADN y se incubó la reacción resultante a 25ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pUC19 digerido con SmaI, se recogió mediante centrifugación y se resuspendió en 2 \mul de tampón EcoRI 10x y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN del plásmido pUC19 digerido con SmaI y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se extrajo una vez con fenol el ADN del plásmido pUC19 digerido con EcoRI- SmaI, se extrajo dos veces con cloroformo y se resuspendió en 5 \mul de tampón TE.
Se añadió ADN del plásmido pUC19 digerido con EcoRI-SmaI a la solución que contenía el fragmento de restricción EcoRI-extremo romo de \sim770 pb derivado del plásmido pTPA103derNdeI. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 a la mezcla de ADN y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pUC19TPAFE deseado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pUC19TPAFE en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.
El sitio de clonación múltiple del plásmido pUC19, que comprende las secuencias de reconocimiento de EcoRI y SmaI utilizadas en la construcción del plásmido pUC19TPAFE está localizado en la secuencia de codificación del fragmento \alpha de lacZ. La expresión del fragmento \alpha de lacZ en células que contienen la mutación \DeltaM15 lacZ, una mutación en el gen lacZ que codifica la \beta-galactosidasa, permite a dichas células expresar una molécula de \beta-galactosidasa funcional y por tanto permite a dichas células hidrolizar X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido), un compuesto incoloro, a su producto de hidrólisis de color índigo. La inserción de ADN en el sitio de clonación múltiple del plásmido pUC19 interrumpe la secuencia de codificación del fragmento \alpha de lacZ, y las células con la mutación \DeltaM15 lacZ que albergan dicho plásmido son incapaces de hidrolizar X-Gal (se utiliza este mismo principio cuando se clona en el plásmido pUC8; véase el ejemplo 2). El ADN ligado que constituía el plásmido pUC19TPAFE se utilizó para transformar células K12 RR1\DeltaM15 de E. coli (NRRL B-15440) hechas competentes para transformación sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2.
Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina 100 \mug/ml, X-Gal 40 \mug/ml e IPTG 1 mM. Las colonias que no consiguieron exhibir el color índigo se subcultivaron y se utilizaron para preparar ADN de plásmido; los transformantes K12 RR1\DeltaM15/pUC19TPAFE de E. coli se identificaron mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido. Se aisló el ADN del plásmido pUC19TPAFE de células K12 RR1\DeltaM15/
pUC19TPAFE de E. coli para uso en construcciones posteriores sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
Se añadieron aproximadamente 7 \mug del plásmido pUC19TPAFE en 20 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón HpaI 10x (KCl 0,2 M, Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4 y MgCl_{2} 0,1 M) y 70 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 3 \mul (\sim6 unidades) de la enzima de restricción HpaI a la solución de ADN del plásmido pUC19TPAFE y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 20 minutos; el corto periodo de reacción se designó para proporcionar una digestión parcial con HpaI. Se ajustó la reacción a 150 \mul de tampón BamHI 1x (NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 y MgCl_{2} 10 mM; elevar la concentración de sal inactiva la HpaI). Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim16 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN parcialmente digerido con HpaI y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 90 minutos.
Se concentró el ADN del plásmido pUC19TPAFE digerido con BglII y parcialmente con HpaI mediante precipitación con etanol, se cargó en gel de agarosa al 1,5% y se aisló el fragmento de restricción HpaI-BamHI de \sim3,42 kb que comprende el replicón, el gen de \beta-lactamasa y todo el ADN que codifica TPA del plásmido pUCTPAFE del gel cortando el segmento del gel que contenía el fragmento deseado, congelando el segmento y exprimiendo después el líquido del segmento. Se precipitó el ADN del líquido mediante una precipitación con etanol. Se obtuvo aproximadamente 1 \mug del fragmento deseado y se suspendió en 20 \mul de tampón TE.
Se disolvieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pTPA103 en 10 \mul de tampón TE en 10 \mul de tampón ScaI 10x (NaCl 1,0 M, Tris-HCl 60 mM, pH 7,4 y MgCl_{2} 60 mM, DTT 10 mM y BSA 1 mg/ml) y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 3 \mul (\sim18 unidades) de la enzima de restricción ScaI a la solución de ADN del plásmido pTPA103 y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 90 minutos. Se ajustó el volumen de reacción a 150 \mul de tampón BamHI 1x y se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim16 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la mezcla, que se incubó después a 37ºC durante 90 minutos. Se precipitó el ADN con etanol, se recogió mediante centrifugación y se resuspendió en la preparación para electroforesis. Se cargó el ADN del plásmido pTPA103 digerido con ScaI-BamHI en gel de agarosa al 1,5% y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción ScaI-BamHI de \sim1,015 kb de los demás productos de digestión. Se aisló del gel el fragmento de restricción ScaI-BamHI de \sim1,015 kb que comprende el ADN que codifica la terminación carboxi de TPA del plásmido pTPA103; se obtuvieron aproximadamente 0,5 \mug del fragmento deseado y se disolvieron en 20 \mul de H_{2}O destilada en vidrio.
Se añadieron aproximadamente 2 \mul del fragmento de restricción BamHI-HpaI de \sim3,42 kb del plásmido
pUC19TPAFE a 2 \mul del fragmento de restricción ScaI-BamHI de \sim1,015 kb del plásmido pTPA103 junto con 2 \mul de tampón ligasa 10x y 1 \mul (\sim1 unidad Weiss; la ligasa se obtuvo de Promega Biotec, 2800 S. Fish Hatchery Road, Madison, WI 53711) de ADN ligasa T4, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pBW25 deseado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBW25 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.
Se utilizó el ADN ligado para transformar células K12 JM105 de E. coli (disponibles en BRL) que se hicieron competentes para transformación sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2, excepto porque se utilizó CaCl_{2} 50 mM en el procedimiento. Se sembraron las células transformadas en BHI (Difco Laboratories, Detroit, MI) que contenía ampicilina 100 \mug/ml y se identificaron los transformantes K12 JM105/pBW25 de E. coli mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido. La digestión del plásmido pBW25 con la enzima de restricción EcoRI proporciona fragmentos de restricción de \sim3,38 kb y \sim1,08 kb. Se prepara el plásmido pBW25 para uso en construcciones posteriores sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
C. Mutagénesis específica de sitio de la región que codifica TPA y construcción del plásmido pBW28
Se añadieron aproximadamente 5 \mug del plásmido pBW25 en 10 \mul de H_{2}O destilada en vidrio a aproximadamente 10 \mul de tampón de reacción HindIII 10x y 80 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim20 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN del plásmido pBW25 y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 90 minutos. Se añadieron aproximadamente 3 \mul (\sim24 unidades) de la enzima de restricción EcoRI y 10 \mul de Tris-HCl 1 M, pH 7,6 a la solución de ADN de plásmido pBW25 digerido con HindIII, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 90 minutos. Se concentró el ADN del plásmido pBW25 digerido con EcoRI-HindIII mediante precipitación con etanol, se cargó en gel de agarosa al 1,5% y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim810 pb de los demás productos de digestión. Se aislaron del gel aproximadamente 0,5 \mug del fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim810 pb, se preparó para ligamiento y se resuspendió en 20 \mul de H_{2}O destilada con vidrio.
Se añadieron aproximadamente 4,5 \mug de la forma replicativa (FR) de ADN de M13mp8 (disponible en New England Biolabs) en 35 \mul de H_{2}O destilada en vidrio a 10 \mul de tampón HindIII 10x y 55 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim20 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN de M13mp8 y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 1 hora. Se añadieron aproximadamente 3 \mul (\sim24 unidades) de la enzima de restricción EcoRI y aproximadamente 10 \mul de Tris-HCl 1 M, pH 7,6, a la solución de ADN de M13mp8 digerida con HindIII, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 1 hora. Se recogió el ADN de M13mp8 digerido con HindIII-EcoRI mediante precipitación con etanol, se resuspendió en la preparación para electroforesis en gel de agarosa y se aisló el fragmento de restricción grande mediante electroforesis en gel. Se obtuvo aproximadamente 1 \mug del fragmento de restricción EcoRI-HindIII grande de M13mp8 y se suspendió en 20 \mul de H_{2}O destilada en vidrio. Se añadieron aproximadamente 2 \mul del fragmento de restricción grande de M13mp8, 2 \mul de tampón ligasa 10x, 12 \mul de H_{2}O y \sim1 \mul (\sim1 unidad Weiss) de ADN ligasa T4 a 3 \mul del fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim810 pb del plásmido pBW25, y se incubó la reacción de ligamiento resultante a 16ºC durante una noche.
Se hicieron competentes células JM103 de E. coli, disponibles en BRL, y se transfectaron con la mezcla de ligamiento sustancialmente según el procedimiento descrito en el manual de instrucciones "BRL M13 Cloning/Dideoxy Sequencing", excepto porque varió la cantidad de ADN utilizada para la transfección. Se identificaron las placas recombinantes mediante la inactivación por inserción del gen que codifica el fragmento \alpha de \beta-galactosidasa, que da como resultado la pérdida de la capacidad de escindir X-gal a su producto de escisión de color índigo. Con fines de examen, se recogieron seis placas blancas en 2,5 ml de caldo L, a las que se añadieron 0,4 ml de K12 JM103 de E. coli, cultivado en medio madre mínimo para asegurar la retención del episoma F que porta proAB, en fase de crecimiento logarítmico. Se incubaron las soluciones que contienen placa en un agitador de aire a 37ºC durante 8 horas. Se sedimentaron las células de alícuotas de 1,5 ml y se aisló el ADN de FR sustancialmente según el procedimiento de miniexamen alcalino de Birnboim y Doly, 1979, Nuc. Acids Res. 7:1513. Se almacenó a 4ºC el resto de cada cultivo para solución madre. El fago deseado, designado pM8BW26, contenía el fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim810 pb del plásmido pBW25 ligado con el fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim7,2 kb de M13mp8.
Se infectaron aproximadamente 50 ml de JM103 de E. coli en fase logarítmica con pM8BW26 y se incubó en un agitador de aire a 37ºC durante 18 horas. Se sedimentaron las células infectadas mediante centrifugación a baja velocidad y se preparó el ADN de pM8BW26 monocatenario a partir del sobrenadante de cultivo aumentando la escala del procedimiento dado en el manual de instrucciones. Se mutagenizó el pM8BW26 monocatenario sustancialmente según las enseñanzas de Adelman et al., 1983, DNA 2(3):183-193, excepto porque la reacción Klenow se realizó a temperatura ambiente durante 30 minutos, después a 37ºC durante 60 minutos, después a 10ºC durante 18 horas. Además, el tratamiento con S1 se realizó a 20ºC, la concentración de sal del tampón fue la mitad de la recomendada por el fabricante y se utilizó el cebador de secuenciación de M13 (BRL). El cebador oligodesoxirribonucleotídico sintético utilizado para eliminar la secuencia de codificación de los residuos aminoacídicos 87 a 261 de TPA nativo fue
5'-GGGAAGTGCTGTGAAATATCCACCTGCGGCCTGAGA-3'
La mezcla de mutagénesis resultante se utilizó para transfectar K12 JM103 de E. coli sustancialmente según el procedimiento de infección descrito anteriormente. Se identificaron los mutantes deseados mediante análisis de enzimas de restricción de ADN de RF y mediante secuenciación de ADN de Maxam y Gilbert. El mutante deseado, que tenía la secuencia de codificación de los residuos aminoacídicos 87 a 261 del TPA nativo eliminado, se designó pM8BW27.
Para construir el plásmido pBW28, se necesitan una serie de fragmentos de ADN. El primero de estos fragmentos se obtuvo añadiendo \sim20 \mug de ADN de pM8BW27 de RF en 20 \mul de H_{2}O destilada en vidrio a 10 \mul de tampón NdeI 10x y 60 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción NdeI a la mezcla de ADN del plásmido pM8BW27, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pM8BW27 digerido con NdeI, se recogió mediante centrifugación y se resuspendió en 10 \mul de tampón EcoRI 10x y 90 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN del plásmido pM8BW27 digerido con NdeI, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se sometió a electroforesis el ADN del plásmido pM8BW27 digerido con EcoRI-NdeI en gel de agarosa hasta que se separó el fragmento de restricción NdeI-EcoRI de \sim560 pb, que contiene la porción de secuencia de codificación de TPA que comprende el sitio de deleción, de los demás productos de digestión. Se aisló del gel el fragmento de restricción NdeI-EcoRI de \sim560 pb; se obtuvieron aproximadamente 0,5 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 20 \mul de H_{2}O destilada en vidrio.
El segundo fragmento necesario para construir el plásmido pBW28 se sintetizó una cadena por vez en un sintetizador automático de ADN. Las dos cadenas complementarias, que hibridarán para formar un segmento de ADN bicatenario con superposiciones XbaI y NdeI, se someten a quinasa y se reasocian sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 6A. El engarce tiene la siguiente estructura:
9
El tercer fragmento necesario para construir el plásmido pBW28 se preparó añadiendo \sim20 \mug del plásmido
pTPA103 en 20 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón BamHI 10x y 60 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pTPA103, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pTPA103 digerido con BamHI, se recogió mediante centrifugación y se resuspendió en 10 \mul de tampón EcoRI 10x y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN del plásmido pTPA103 digerido con BamHI, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se cargó el ADN del plásmido pTPA103 digerido con BamHI-EcoRI en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción EcoRI-BamHI de \sim689 pb, que comprende la secuencia de codificación de la terminación carboxi de TPA, de los demás productos de digestión. Se aislaron del gel aproximadamente 0,5 \mug del fragmento de \sim689 pb y se resuspendieron después en 10 \mul de H_{2}O destilada en vidrio.
Se aisló el fragmento final necesario para construir el plásmido pBW28 a partir del plásmido pL110. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pL110 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos, y se da a conocer la construcción del plásmido pL110 en el ejemplo 10d, la sección siguiente del presente ejemplo.
Se añadieron aproximadamente 25 \mug del plásmido pL110 en 25 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón XbaI 10x (NaCl 0,5 M, Tris-HCl 60 mM, pH 7,9,MgCl_{2} 60 mM y BSA 1 mg/ml) y 55 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción XbaI a la solución de ADN del plásmido pL110, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pL110 digerido con XbaI, se recogió mediante centrifugación y se resuspendió en 10 \mul de tampón BamHI 10x y 89 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim5 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pL110 digerido con XbaI y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 30 minutos, obteniéndose una digestión parcial de BamHI. Se cargó el ADN del plásmido pL110 digerido con XbaI y parcialmente con BamHI en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó claramente el fragmento XbaI-BamHI de \sim6,0 kb de los demás productos de digestión. Se aisló el fragmento de restricción de \sim6,0 kb del gel; se obtuvieron aproximadamente 0,5 \mug del fragmento de restricción XbaI-BamHI de \sim6,0 kb y se suspendieron en aproximadamente 40 \mul de H_{2}O destilada en vidrio. Este fragmento de restricción XbaI-BamHI de \sim6,0 kb comprende todo el plásmido pL110 excepto el ADN que codifica EK-BGH.
Para construir el plásmido pBW28, se mezclan conjuntamente los siguientes fragmentos: aproximadamente 0,1 \mug (\sim8 \mul) del fragmento de restricción BamHI-XbaI de \sim6,0 kb del plásmido pL110; aproximadamente 0,05 \mug (\sim2 \mul) del fragmento de restricción NdeI-EcoRI de \sim560 pb del plásmido pM8BW27; aproximadamente 0,1 \mug (\sim2 \mul) del fragmento de restricción EcoRI-BamHI de \sim689 pb del plásmido pTPA103; y aproximadamente 0,02 \mug (\sim1 \mul) del engarce sintético XbaI-NdeI de \sim45 pb. Se añaden aproximadamente 2 \mul de tampón ligasa 10x y 1 \mul (\sim1 unidad Weiss) de ADN ligasa T4 a la mezcla de ADN, y se incuba la reacción de ligamiento resultante a 4ºC durante una noche durante 2 horas. El ADN ligado constituyó el plásmido pBW28 deseado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBW28 en la figura 14 de los dibujos adjuntos.
Se utilizó el ADN ligado para transformar células K12 MM294 de E. coli (NRRL B-15625) hechas competentes sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2, excepto porque se utilizó CaCl_{2} 50 mM en el procedimiento. Debido a la presencia del promotor lambda pL y el gen que codifica el represor lambda pL sensible a la temperatura en el plásmido pBW28, el procedimiento de transformación y cultivo de los transformantes varió algo. Las células no se expusieron a temperaturas mayores de 32ºC durante la transformación y posterior cultivo. La siguiente sección de este ejemplo se refiere con más detalle a los procedimientos para tratar plásmidos que codifican el promotor lambda pL y su represor sensible a la temperatura. Se identificaron los transformantes K12 MM294/pBW28 de E. coli mediante su fenotipo resistente a tetraciclina y sensible a ampicilina, y mediante el análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido.
D. Construcción del plásmido pL110
Se construyó el plásmido pL110 utilizando el plásmido pKC283 como material de partida. Se obtienen liofilizados de K12 BE1201/pKC283 de E. coli del NRRL con el número de acceso NRRL B-15830. Se decantan los liofilizados en tubos que contienen 10 ml de caldo L y se incuban durante 2 horas a 32ºC, en cuyo momento los cultivos se hacen de 50 \mug/ml de ampicilina y se incuban después a 32ºC durante una noche. Se cultivaron las células K12 BE1201/pKC283 de E. coli a 32ºC porque el plásmido pKC238 comprende el promotor pL y porque las células K12 BE1201 de E. coli comprenden un gen represor cI sensible a la temperatura integrado en el ADN celular. Cuando se utilizan células que comprenden un gen represor lambda pL de tipo salvaje o células que no comprenden un promotor lambda pL en este procedimiento de aislamiento de plásmido, como se describe en los ejemplos posteriores en la presente memoria, la temperatura de incubación es de 37ºC.
Se dispone una pequeña porción del cultivo de una noche en placas de agar L que contienen ampicilina 50 \mug/ml de manera que se obtenga un solo aislamiento de colonia de K12 BE1201/pKC283 de E. coli. La colonia única obtenida se inoculó en 10 ml de caldo L que contenía ampicilina 50 \mug/ml y se incubó durante una noche a 32ºC con agitación vigorosa. Se inoculó el cultivo de 10 ml de una noche en 500 ml de caldo L y se incubó a 32ºC con agitación vigorosa hasta que el cultivo alcanzó la fase estacionaria. Se preparó después el ADN del plásmido pKC283 a partir de las células sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se obtuvo aproximadamente 1 mg del plásmido pKC283 y se almacenó a 4ºC en tampon TE a una concentración de aproximadamente 1 \mug/ml. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pKC283 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.
Se mezclaron aproximadamente 10 \mul (\sim10 \mug) de ADN del plásmido pKC283 con 20 \mul de tampón de restricción medio en sales 10x (NaCl 500 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 100 mM y DTT 10 mM), 20 \mul de BSA 1 mg/ml, 5 \mul de la enzima de restricción PvuII (\sim25 unidades) y 145 \mul de agua, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se terminaron rutinariamente las reacciones de enzimas de restricción descritas en la presente memoria mediante extracciones con fenol y después cloroformo, seguidas de precipitación del ADN, un lavado con etanol y resuspensión del ADN en tampón TE. Después de terminar la digestión de PvuII como se describe anteriormente, se precipitó el ADN del plásmido pKC283 digerido con PvuII y después se resuspendió en 5 \mul de tampón TE.
Se sometieron a quinasa aproximadamente 600 picomoles (pM) de engarces XhoI (5'-CCTCGAGG-3') en una mezcla que contenía 10 \mul de tampón quinasa 5x (Tris-HCl 300 mM, pH 7,8, MgCl_{2} 50 mM y DTT 25 mM), 5 \mul de ATP 5 mM, 24 \mul de H_{2}O, 0,5 \mul de polinucleótido quinasa T4 (aproximadamente 2,5 unidades como se define por P-L Biochemicals), 5 \mul de BSA 1 mg/ml y 5 \mul de espermidina 10 mM incubando la mezcla a 37ºC durante 30 minutos. Se añadieron aproximadamente 12,5 \mul de los engarces de XhoI sometidos a quinasa a los 5 \mul de ADN del plásmido pKC283 digerido con PvuII, y después 2,5 \mul de tampón ligasa 10x, 2,5 \mul (aproximadamente 2,5 unidades como se define por P-L Biochemicals) de ADN ligasa T4, 2,5 \mul de espermidina 10 mM y 12,5 \mul de agua al ADN. La reacción de ligamiento resultante se incubó a 4ºC durante un noche. Después de la reacción de ligamiento, se ajustó la mezcla de reacción para tener una composición de tampón rica en sales (NaCl 0,1 M, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, MgCl_{2} 10,0 mM y DTT 1 mM). Se añadieron aproximadamente 10 \mul (100 unidades) de la enzima de restricción XhoI a la mezcla, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas.
Se terminó la reacción y se precipitó el ADN digerido con XhoI, se resuspendió y se ligó como se describe anteriormente, excepto porque no se añadieron engarces de XhoI a la mezcla de ligamiento. El ADN ligado constituyó el plásmido pKC283PX deseado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pKC283PX en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.
La célula K12 MO(\lambda^{+}) de E. coli, disponible en el NRRL con el número de acceso NRRL B-15993, comprende el gen represor cI de lambda pL de tipo salvaje, de modo que la transcripción del promotor lambda pL no ocurre en células K12 MO(\lambda^{+}) de E. coli. Se aíslan colonias individuales de K12 MO(\lambda^{+}) de E. coli y se prepara un cultivo de 10 ml durante una noche de las células; no se utiliza ampicilina en el medio de crecimiento. Se utilizaron 50 \mul del cultivo de una noche para inocular 5 ml de caldo L, que contenía también MgSO_{4} 10 mM y MgCl_{2} 10 mM. Se incubó el cultivo a 37ºC durante una noche con agitación vigorosa. La mañana siguiente, se diluyó el cultivo a 200 ml con caldo L que contenía MgSO_{4} 10 mM y MgCl_{2} 10 mM. Se incubó el cultivo diluido a 37ºC con agitación vigorosa hasta que la DO_{590} fue de aproximadamente 0,5, que indicaba una densidad celular de aproximadamente 1 x 10^{8} células/ml. Se enfrió el cultivo durante 10 minutos en un baño de hielo y agua, y se recogieron las células mediante centrifugación a 4000xg durante 10 minutos a 4ºC. Se resuspendió el sedimento celular en 100 ml de NaCl 10 mM frío, y después se volvió a sedimentar inmediatamente mediante centrifugación. Se resuspendió el sedimento celular en 100 ml de CaCl_{2} 30 mM y se incubó en hielo durante 20 minutos.
Se recogieron de nuevo las células mediante centrifugación y se resuspendieron en 10 ml de CaCl_{2} 30 mM. Se añadieron alícuotas de 0,5 ml de las células al ADN ligado preparado anteriormente; el ADN se había hecho 30 mM en CaCl_{2}. Se incubó la mezcla célula-ADN en hielo durante 1 hora, se sometió a shock térmico a 42ºC durante 90 segundos y después se enfrió en hielo durante aproximadamente 2 minutos. Se diluyó la mezcla de célula-ADN en 10 ml de medio LB en matraces de 125 ml y se incubó a 37ºC durante 1 hora. Se sembraron alícuotas de 100 \mul en placas de agar L que contenían ampicilina y se incubaron a 37ºC hasta que aparecieron las colonias.
Se cultivaron individualmente las colonias, y se examinó el ADN de plásmido de las colonias individuales mediante análisis de enzimas de restricción y electroforesis en gel. Se realizó el aislamiento de ADN a menor escala según el procedimiento del ejemplo 3, pero se omitió el gradiente de CsCl hasta que se identificaron los transformantes K12 MO(\lambda^{+})/pKC283PX de E. coli deseados. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pKC283PX en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.
Se disolvieron 10 \mug de ADN del plásmido pKC283PX en 20 \mul de tampón rico en sales 10x, 20 \mul de BSA 1 mg/ml, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción XhoI y 150 \mul de agua, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se paró la reacción, se precipitó el ADN digerido con BglII-XhoI y se resuspendió el ADN en 5 \mul de tampón TE.
Se sintetizó un cebador de ADN con extremos monocatenarios de ADN característicos de la escisión por las enzimas de restricción BglII y XhoI utilizando un sintetizador automático de ADN, y se sometió a quinasa como se describe en el ejemplo 6A. El engarce de ADN tenía la siguiente estructura:
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Se ligaron el engarce y el plásmido pKC283PX digerido con BglII-XhoI sustancialmente según el procedimiento de ligamiento descrito anteriormente. El ADN ligado constituyó el plásmido pKC283-L deseado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pKC283-L en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. Se utilizó el ADN del plásmido pKC283-L para transformar K12 MO(\lambda^{+}) de E. coli, y los transformantes K12 MO(\lambda^{+})/pKC283-L de E. coli resultantes se identificaron mediante su fenotipo resistente a ampicilina y mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido.
Se disolvieron aproximadamente 10 \mul de ADN del plásmido pKC283-L en 20 \mul de tampón rico en sales 10x, 20 \mul de BSA 10 mg/ml, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción XhoI y 55 \mul de H_{2}O, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó después el ADN del plásmido pKC283-L digerido con XhoI y se resuspendió en 2 \mul de tampón de traslado de cortes 10x (Tris-HCl 0,5 M, pH 7,2, MgSO_{4} 0,1 M y DTT 1 mM), 1 \mul de una solución 2 mM de cada uno de los trifosfatos de desoxinucleótidos, 15 \mul de H_{2}O, 1 \mul (\sim6 unidades como se definen por P-L Biochemicals) de Klenow y 1 \mul de BSA 1 mg/ml. La reacción resultante se incubó a 25ºC durante 30 minutos; la reacción se paró incubando la solución a 70ºC durante 5 minutos.
Se sometieron a quinasa engarces BamHI (5'-CGGGATCCCG-3') y se ligaron con ADN del plásmido pKC283-L digerido con XhoI y tratado con Klenow sustancialmente según los procedimientos de ligamiento de engarce descritos anteriormente. Después de la reacción de ligamiento, se digirió el ADN con aproximadamente 100 unidades de BamHI durante aproximadamente 2 horas a 37ºC en tampón rico en sales. Después de la digestión con BamHI, se preparó el ADN para ligamento, se circularizó el fragmento de restricción BamHI de \sim5,9 kb mediante ligamiento y se transformó en K12 MO(\lambda^{+}) de E. coli sustancialmente según el procedimiento descrito anteriormente. Se identificaron los transformantes K12 MO(\lambda^{+})/pKC283-LB de E. coli, y después se preparó ADN del plásmido pKC283-LB a partir de los transformantes sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pKC283-LB en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.
Se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pKC283PX con la enzima de restricción SalI en tampón rico en sales, se trataron con Klenow y se ligaron con engarces EcoRI (5'-GAGGAATTCCTC-3') sustancialmente según los procedimientos descritos anteriormente. Después de la digestión con la enzima de restricción EcoRI, que da como resultado la escisión de \sim2,1 kb de ADN, se circularizó el fragmento de restricción EcoRI de \sim4,0 kb mediante ligamiento, proporcionando el plásmido pKC283PRS. Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 MO(\lambda^{+}) de E. coli y, después de identificar los transformantes K12 MO(\lambda^{+})/pKC283PRS de E. coli, se preparó ADN del plásmido pKC283PRS a partir de los transformantes sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pKC283PRS en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.
Se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pKC283PRS en 200 \mul de tampón rico en sales con aproximadamente 50 unidades de cada una de las enzimas de restricción PstI y SphI. Después de incubar la reacción a 37ºC durante aproximadamente 2 horas, se sometió a electroforesis la mezcla de reacción en gel de agarosa de baja temperatura de gelificación al 0,6% (FMC Corporation, Marine Colloids Division, Rockland, Maine 04841) durante 2-3 horas a \sim130 V y \sim75 mA en tampón Tris-acetato.
Se tiñó el gel con una solución diluida de bromuro de etidio y se cortó del gel en un pequeño segmento la banda de ADN que constituye el fragmento de restricción PstI-SphI de \sim0,85 kb, que se visualizó con luz UV de onda larga. Se determinó el volumen del segmento mediante el peso y la densidad del segmento, y se añadió un volumen igual de Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, al tubo que contenía el segmento. Se fundió después el segmento mediante incubación a 72ºC. Se obtuvo aproximadamente 1 \mug del fragmento de restricción PstI- SphI de \sim0,85 kb del plásmido pKC2892PRS en un volumen de aproximadamente 100 \mul. De manera análoga, se digirió el plásmido pKC238-LB con las enzimas de restricción PstI y SphI, se aisló el fragmento de restricción de \sim3,0 kb resultante mediante electroforesis en gel de agarosa y se preparó para ligamiento.
Se ligó el fragmento de restricción PstI-SphI de \sim0,85 kb del plásmido pKC283PRS con el fragmento de restricción PstI-SphI de \sim3,0 kb del plásmido pKC283-LB. El ADN ligado constituyó el plásmido pL32 deseado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pL32 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. Se transformó el plásmido pL32 en células K12 MO(\lambda^{+}) de E. coli; se preparó ADN del plásmido pL32 a partir de transformantes K12 MO(\lambda^{+})/pL32 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. El análisis del ADN del plásmido pL32 demostró que más de un engarce EcoRI se unía a los extremos SalI del plásmido pKC283PX tratado con Klenow. La presencia de más de un engarce EcoRI no afecta a la utilidad del plásmido pL32 o derivados del plásmido pL32 y puede detectarse por la presencia de un sitio de restricción XhoI, que se genera siempre que se ligan conjuntamente dos engarces EcoRI.
El plásmido pCC101 se describe en Schoner et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5403-5407. Schoner et al. designan al plásmido pCC101 como plásmido pCZ101. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pCC101 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. Para aislar el ADN que codifica EK-BGH, se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pCC101 con 200 \mul de tampón rico en sales que contenía aproximadamente 50 unidades de cada una de las enzimas de restricción XbaI y BamHI. Se separaron los productos de digestión mediante electroforesis en gel de agarosa, se aisló el fragmento de restricción XbaI-BamHI de \sim0,6 kb que codifica EK-BGH a partir del gel y se preparó para ligamiento.
Se digirió también el plásmido pL32 con las enzimas de restricción XbaI y BamHI, se aisló el fragmento de restricción de \sim3,9 kb y se preparó para ligamiento. Se ligó el fragmento de restricción XbaI-BamHI de \sim3,9 kb del plásmido pL32 al fragmento de restricción XbaI-BamHI de \sim0,6 kb del plásmido pCC101, proporcionando el plásmido pL47. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pL47 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. Se transformó el plásmido pL47 en K12 MO(\lambda^{+}) de E. coli y se identificaron los transformantes K12 MO(\lambda^{+})/pL47 de E. coli. Se preparó ADN del plásmido pL47 a partir de los transformantes sustancialmente según los procedimientos del ejemplo 3.
El plásmido pPR12 comprende el gen represor cI857 de pL sensible a la temperatura y el gen que confiere resistencia a tetraciclina del plásmido pBR322. Se da a conocer y se reivindica el plásmido pPR12 en la patente de EE.UU. nº 4.436.815, expedida el 13 de marzo de 1984. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pPR12 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.
Se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pPR12 con aproximadamente 50 unidades de la enzima de restricción EcoRI en 200 \mul de tampón rico en sales a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó el ADN del plásmido pPR12 digerido con EcoRI y se trató después con Klenow sustancialmente según el procedimiento descrito anteriormente. Después de la reacción con Klenow, se recircularizó el ADN del plásmido pPR12 tratado con Klenow y digerido con EcoRI mediante ligamiento, y se utilizó el ADN ligado, que constituyó el plásmido pPR12\DeltaR1 deseado, para transformar K12 RV308 de E. coli (NRRL B-15624); los transformantes se seleccionaron basándose en la resistencia a tetraciclina (10 \mug/ml). Después de identificar los transformantes K12 RV308/pR12\DeltaR1, se preparó ADN del plásmido pPR12\DeltaR1 a partir de los transformantes sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
Se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pPR12\DeltaR1 con aproximadamente 50 unidades de la enzima de restricción AvaI en 200 \mul de tampón medio de sales a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó el ADN del plásmido pPR12\DeltaR1 digerido con AvaI y después se trató con Klenow. Después de la reacción con Klenow, se ligó el ADN de pPR12\DeltaR1 tratado con Klenow y digerido con AvaI con engarces EcoRI (5'-GAGGAATTCCTC-3'), se precipitó, se resuspendió en aproximadamente 200 \mul de tampón rico en sales que contenía aproximadamente 50 unidades de la enzima de restricción EcoRI, y se incubó a 37ºC durante aproximadamente 2 horas. Después de la digestión con EcoRI, se cargó la mezcla de reacción en un gel de agarosa de baja fusión, se purificó del gel el fragmento de restricción EcoRI de \sim5,1 kb y se recircularizó mediante ligamiento, proporcionando el plásmido pPR12AR1 deseado. Se transformó el ADN del plásmido pPR12AR1 en K12 RV308 de E. coli; la selección de los transformantes se basó en la resistencia a tetraciclina. Se preparó ADN del plásmido pPR12AR1 a partir de los transformantes sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pPR12AR1 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.
Se suspendieron aproximadamente 10 \mug de ADN del plásmido pPR12AR1 en aproximadamente 200 ml de tampón rico en sales que contenía aproximadamente 50 unidades de cada una de las enzimas de restricción PstI y EcoRI, y se incubó la reacción de digestión a 37ºC durante aproximadamente 2 horas. Se cargó después la mezcla de reacción en gel de agarosa, se aisló el fragmento de restricción PstI-EcoRI de \sim2,9 kb del plásmido pPR12AR1 y se preparó para ligamiento.
Se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pL47 con las enzimas de restricción PstI y BamHI en 200 \mul de tampón rico en sales a 37ºC durante 2 horas. Se cargó el ADN digerido con PstI-BamHI en gel de agarosa, se aisló el fragmento de restricción PstI-BamHI de \sim2,7 kb que comprendía el origen de replicación y una porción del gen que confiere resistencia a la ampicilina y se preparó para ligamiento. En una reacción separada, se digirieron aproximadamente 10 \mug de ADN del plásmido pL47 con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI en 200 \mul de tampón rico en sales a 37ºC durante 2 horas, y se aisló el fragmento de restricción EcoRI-BamHI de \sim1,03 kb que comprende l secuencia activadora de la transcripción de lambda pL, la secuencia activadora de la traducción de lpp de E. coli y el ADN que codifica EK-BGH, y se preparó para ligamiento.
Se ligaron los fragmentos de restricción PstI-BamHI de \sim2,7 kb y EcoRI-BamHI de \sim1,03 kb del plásmido pL47 con el fragmento de restricción PstI-EcoRI de \sim2,9 kb del plásmido pPR12AR1 para construir el plásmido pL110, y se utilizó el ADN ligado para transformar K12 RV308 de E. coli. Se utilizó la resistencia a tetraciclina como la base para seleccionar transformantes.
Están presentes dos sitios de reconocimiento de la enzima de restricción PstI en la región que codifica EK-BGH que no se describen en los mapas de sitios de restricción y funciones presentados en los dibujos adjuntos. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pL110 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.
E. Construcción final del plásmido pBW32
Se disolvieron aproximadamente 10 \mug de ADN del plásmido pSV2-\beta-globina (NRRL B-15928) en 10 \mul de tampón de reacción HindIII 10x, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción HindIII y 85 \mul de H_{2}O, y se dispuso la reacción a 37ºC durante 2 horas. Se hizo después la mezcla de reacción 0,15 M en LiCl, y después de la adición de 2,5 volúmenes de etanol y la incubación en un baño de hielo seco-etanol, se sedimentó el ADN mediante centrifugación.
Se disolvió el sedimento de ADN en 10 \mul de tampón BglII 10x, 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BglII y 85 \mul de H_{2}O, y se dispuso la reacción a 37ºC durante 2 horas. Después de la reacción con BglII, se cargó la mezcla de reacción en gel de agarosa al 0,85% y se separaron los fragmentos mediante electroforesis. Se visualizó el gel utilizando bromuro de etidio y luz ultravioleta, y se escindió del gel la banda que contenía el fragmento HindIII-BglII de \sim4,2 kb deseado como se describe anteriormente. Se resuspendió el sedimento en 10 \mul de H_{2}O y constituyó \sim5 \mug del fragmento de restricción HindIII-BglII de \sim4,2 kb deseado del plásmido pSV2-\beta-globina. Se aisló el fragmento de restricción HindIII-BamHI de \sim2,0 kb del plásmido pTPA103 que codifica TPA sustancialmente según las enseñanzas anteriores. Se obtuvieron aproximadamente 5 \mug del fragmento de restricción HindIII-BamHI de \sim2,0 kb del plásmido pTPA103, se suspendieron en 10 \mul de H_{2}O y se almacenaron
a -20ºC.
Se mezclaron conjuntamente 2 \mul del fragmento de restricción BglII-HindIII de \sim4,2 kb del plásmido pSV2-\beta-globina y 4 \mul del fragmento de restricción HindIII-BamHI de \sim2,0 kb del plásmido pTPA103, y después se incubaron con 2 \mul de tampón ligasa 10x, 11 \mul de H_{2}O y 1 \mul de ADN ligasa T4 (\sim500 unidades) a 4ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pTPA301 deseado; se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido en la Figura 14 de los dibujos adjuntos. Se utilizó el ADN ligado para transformar células K12 RR1 de E. coli (NRRL B-15210) hechas competentes para transformación sustancialmente según las enseñanzas del ejemplo 3. Se obtuvo el ADN de plásmido de transformantes K12 RR1/pTPA301 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
El plásmido pSV2-dhfr comprende un gen dihidrofolato reductasa (dhfr) útil para la selección de células eucarióticas transformadas y la amplificación de ADN unido covalentemente al gen dhfr. Se mezclaron 10 \mug del plásmido pSV2-dhfr (aislado de K12 HB101/pSV2-dhfr de E. coli, ATCC 37146) con 10 \mul de tampón PvuII 10x, 2 \mul (\sim20 unidades) de la enzima de restricción PvuII y 88 \mul de H_{2}O, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se terminó la reacción mediante extracciones con fenol y cloroformo, y después se precipitó el ADN del plásmido pSV2-dhfr digerido con PvuII y se recogió mediante centrifugación.
Se sometieron a quinasa engarces BamHI (5'-CGGATCCCG-3') y se prepararon para ligamiento mediante el siguiente procedimiento. Se añadieron a 1 \mug de engarce en 5 \mul de H_{2}O: 10 \mul de sales quinasa 5x (Tris-HCl 300 mM, pH 7,8, MgCl_{2} 50 mM y DTT 25 mM), 5 \mul de ATP 5 mM, 5 \mul de BSA (1 mg/ml), 5 \mul de espermidina 10 mM, 19 \mul de H_{2}O y 1 \mul de polinucleótido quinasa (10 unidades/\mul). Se incubó después esta reacción a 37ºC durante 60 minutos y se almacenó a -20ºC. Se mezclaron 5 \mul (\sim5 \mug) del plásmido pSV2-dhfr digerido con PvuII y 12 \mul (\sim0,25 \mug) de engarces BamHI sometidos a quinasa y se incubaron con 11 \mul de H_{2}O, 2 \mul de tampón ligasa 10x y 1 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4 a 16ºC durante una noche.
Se añadieron 10 \mul de tampón de reacción BamHI 10x, 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BamHI y 48 \mul de H_{2}O a la mezcla de reacción de ligamiento, que se incubó después a 37ºC durante 3 horas. Se cargó la reacción en gel de agarosa al 1%, y se aisló del gel el fragmento de \sim1,9 kb deseado, que comprende el gen dhfr. Todas las adiciones de engarce realizadas en estos ejemplos se purificaron rutinariamente en gel de agarosa para reducir la probabilidad de secuencias de engarce múltiples en el vector final. Se suspendieron los \sim3 \mug de fragmento obtenido en 10 \mul de tampón TE.
A continuación, se digirieron aproximadamente 15 \mul (\sim1 \mug) del plásmido pTPA301 con la enzima de restricción BamHI como se mostró anteriormente. Debido a que existe un solo sitio BamHI en el plásmido pTPA301, esta digestión con BamHI genera ADN lineal del plásmido pTPA301. Se precipitó con etanol el plásmido pTPA301 digerido con BamHI, se resuspendió en 94 \mul de H_{2}O y se fosfató utilizando 1 \mul de fosfatasa alcalina intestinal de ternero (Collaborative Research, Inc., 128 Spring Street, Lexington, MA 02173) y 5 \mul de Tris-HCl 1 M, pH 9,0, a 65ºC durante 45 minutos. Se extrajo el ADN con fenol:cloroformo, después se extrajo con cloroformo:alcohol isoamílico, se precipitó con etanol y se resuspendió en 20 \mul de H_{2}O. Se añadieron 10 \mul (\sim0,25 \mug) de plásmido pTPA301 sometido a fosfatasa a 5 ml del fragmento de restricción BamHI que contiene el gen dhfr (\sim1,5 \mug), 3 \mul de tampón ligasa 10x, 3 \mul (\sim1500 unidades) de ADN ligasa T4 y 9 \mul de H_{2}O. Se incubó la reacción de ligamiento a 15ºC durante una noche; el ADN ligado constituyó el ADN del plásmido pTPA303 deseado.
Se utilizó el plásmido pTPA303 para transformar K12 RR1 de E. coli (NRRL B-15210), y se identificaron los transformantes K12 RR1/pTPA303 de E. coli resultantes por su fenotipo resistente a ampicilina y mediante análisis de enzimas de restricción de ADN de plásmido. Se aisló el plásmido pTPA303 de los transformantes sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
Para aislar el fragmento de restricción EcoRI-BglII de \sim2,7 kb que codifica el replicón pBR322 y el gen de \beta-lactamasa del plásmido pTPA301, se digieren aproximadamente 10 \mug del plásmido pTPA301 hasta terminación en 400 \mul de volumen de reacción total con 20 unidades de la enzima de restricción BglII en tampón BglIII 10x a 37ºC. Después de la digestión con BglII, se ajusta la concentración de Tris-HCl a 110 mM, y se añaden 20 unidades de enzima de restricción EcoRI al ADN digerido con BglII. Se carga el ADN digerido con EcoRI-BglII en gel de agarosa y se somete a electroforesis hasta que se separa el fragmento de restricción EcoRI-BglII de \sim2,7 kb de los demás productos de digestión, y después se aísla el fragmento de \sim2,7 kb y se prepara para ligamiento.
Para aislar un fragmento de restricción que comprende el gen dhfr, se digirió doblemente el plásmido pTPA303 con las enzimas de restricción EcoRI-HindIII, y se aisló y recuperó el fragmento de restricción EcoRI-HindIII de \sim2340 pb que comprende el gen dhfr.
Para aislar el fragmento de restricción HindIII-SstI de \sim2 kb del plásmido pTPA303 que comprende la región de codificación de la terminación carboxi de TPA y el promotor de SV40, se digirió doblemente el plásmido pTPA303 con las enzimas de restricción HindII y SstI en tampón HindIII 1x. Se aisló el fragmento de \sim1,7 kb del gel y se preparó para ligamiento.
Para aislar el fragmento de restricción XhoI (compatible para ligamiento con la superposición BglII)-SstI de \sim680 pb del plásmido pBW28 que comprende la región de codificación de la terminación amino del TPA modificado, se digirieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pBW28 con la enzima XhoII hasta terminación en tampón XhoII 1x (Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, MgCl_{2} 0,1 M, Tritón X-110 al 0,1% y BSA 1 mg/ml). Se recuperó el ADN digerido con XhoII mediante precipitación con etanol y posteriormente se digirió hasta terminación con la enzima SstI. Se cargó el ADN digerido con XhoII-SstI en gel de acrilamida, se aisló el fragmento deseado del gel y se preparó para ligamiento.
Se ligaron conjuntamente aproximadamente 0,1 \mug de cada uno de los siguientes fragmentos: el fragmento de restricción EcoRI-BglII de \sim2,7 kb del plásmido pTPA301; el fragmento de restricción EcoRI-HindII de \sim2,34 kb del plásmido pTPA303; el fragmento de restricción SstI-HindIII de \sim1,7 kb del plásmido pTPA303 y el fragmento de restricción SstI-XhoII de \sim0,68 kb del plásmido pBW28, formando el plásmido pBW32. Se utilizó la mezcla de ligamiento para transformar K12 MM294 de E. coli como se muestra en el ejemplo 2, excepto porque se utilizó CaCl_{2} 50 mM en el procedimiento. Se identificaron los transformantes por su fenotipo resistente a ampicilina y mediante análisis de restricción de su ADN de plásmido. Se obtuvo el ADN del plásmido pBW32 de transformantes K12 MM294/pBW32 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBW32 en la Figura 14 de los dibujos adjuntos.
Ejemplo 11 Construcción de los plásmidos pLPChd1, pLPChd2, pLPCdhfr1 y pLPCdhfr2 A. Construcción de los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2
Se añadieron aproximadamente 20 \mug del plásmido pBW32 en 20 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón BamHI 10x y 60 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pBW32, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pBW32 digerido con BamHI, se recogió mediante centrifugación y se resuspendió en 5 \mul de tampón Klenow 10x, 45 \mul de H_{2}O y 2 \mul (\sim100 unidades) de enzima Klenow. Se incubó la reacción a 16ºC durante 30 minutos; después se cargó la mezcla de reacción en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que los productos de digestión se separaron claramente. Se aisló del gel el fragmento de restricción BamHI tratado con Klenow de \sim1,9 kb del plásmido pBW32 que comprende el gen dhfr y se preparó para ligamiento sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 4 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 5 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 200 \mug del plásmido pLPChyg1 en 100 \mul de tampón TE a 15 \mul de tampón EcoRI 10x y 30 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN del plásmido pLPChyg1, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante aproximadamente 10 minutos. Se calculó el corto tiempo de reacción para producir una digestión parcial con EcoRI. El plásmido pLPChyg1 tiene dos sitios de restricción EcoRI, uno de los cuales está en la secuencia de codificación del gen que confiere resistencia a higromicina (HmR), y se deseó insertar el fragmento de restricción que contiene el gen dhfr en el sitio EcoRI del plásmido pLPChyg1 que no es el gen HmR. Se cargó el ADN del plásmido pLPChyg1 parcialmente digerido con EcoRI en gel de agarosa, y se sometió a electroforesis hasta que se separó el ADN del plásmido pLPChyg1 de un corte del ADN del plásmido sin cortes y de los demás productos de digestión. Se aisló el ADN de un corte del gel y se preparó para ligamiento sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del plásmido pLPChyg1 cortado una vez con EcoRI y se suspendieron en 25 \mul de tampón TE. Se añadieron a esta muestra aproximadamente 5 \mul (\sim25 unidades) de enzima Klenow, 5 \mul de tampón Klenow 10x y 40 \mul de H_{2}O, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante 60 minutos. Se extrajo después dos veces con fenol el ADN digerido parcialmente con EcoRI y tratado con Klenow y después una vez con cloroformo, se precipitó con etanol y se resuspendió en 25 \mul de tampón TE.
Se mezclaron conjuntamente aproximadamente 5 \mul del fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb tratado con Klenow y aproximadamente 5 \mul de ADN del plásmido pLPChyg1 cortado una vez con EcoRI, se añadieron 1 \mul de tampón ligasa 10x, 5 \mul de H_{2}O, 1 \mul (\sim500 unidades) de ADN ligasa T4 y 1 \mul (\sim2 unidades) de ARN ligasa T4 a la mezcla de ADN, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2 deseados, que difieren sólo con respecto a la orientación del fragmento de \sim1,9 kb que comprende el gen dhfr.
Se utilizó el ADN ligado para transformar células K12 HB101 de E. coli hechas competentes para transformación sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina 100 \mug/ml y se analizaron los transformantes resistentes a ampicilina mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido para identificar los transformantes K12 HB101/pLPChd1 de E. coli y K12 HB101/pLPChd2 de E. coli. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPChd1 en la Figura 15 de los dibujos adjuntos. Se aislaron los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2 de los transformantes apropiados sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
Los plásmidos pLPChd3 y pLPChd4 son similares en estructura a los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2. Los plásmidos pLPChd3 y pLPChd4 se construyen sustancialmente según el procedimiento utilizado para construir los plásmidos pLPChd1 y pLPChd2, excepto porque se utiliza el plásmido pLPChyg2 como material de partida en el procedimiento en lugar del plásmido pLPChyg1.
B. Construcción de los plásmidos pLPCdhfr1 y pLPCdhfr2
Se añadieron aproximadamente 100 \mug del plásmido pBW32 en 100 \mul de tampón TE a 15 \mul de tampón BamHI 10x y 25 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim25 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pBW32, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se trató el ADN del plásmido pBW32 digerido con BamHI con Klenow sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 11A. Se precipitó el fragmento de extremo romo con etanol, se resuspendió en 10 \mul de tampón TE, se cargó en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb, que comprende el gen dihidrofolato reductasa, de los demás productos de digestión. Se aisló después del gel el fragmento de restricción de \sim1,9 kb y se preparó para ligamiento sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 4A; se obtuvieron aproximadamente 10 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 50 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 5 \mul de ADN del plásmido pLPC digerido con NdeI-StuI, como se prepara en el ejemplo 9, a 5 \mul del fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb tratado con Klenow del plásmido pBW32, 1,5 \mul de tampón ligasa 10x, 1 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4, 1 \mul (\sim2 unidades) de ARN ligasa T4 y 1,5 \mul de H_{2}O. Se incubó la reacción de ligamiento resultante a 16ºC durante una noche; el ADN ligado constituyó los plásmidos pLPCdhfr1 y pLPCdhfr2 deseados, que difieren sólo con respecto a la orientación del fragmento de \sim1,9 kb que contiene el gen dhfr. Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se sembraron las placas transformadas en agar L que contenía ampicilina, y se identificaron los transformantes K12 HB101/pLPCdhfr1 de E. coli y K12 HB101/pLPCdhfr2 resistentes a ampicilina mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido.
Ejemplo 12 Construcción del plásmido phd
Para construir el plásmido phd fue necesario preparar ADN del plásmido pLPChd1, utilizado como material de partida en la construcción el plásmido phd, a partir de células hospedadoras de E. coli que carecen de adenina metilasa tal como la codificado por el gen dam, cuyo producto metila el residuo de adenina en la secuencia 5'-GATC-3'. La K12 GM48 de E. coli (NRRL B-15725) carece de una metilasa dam funcional y por tanto es un hospedador adecuado para utilizar con el fin de preparar ADN del plásmido pLPChd1 para uso como material de partida en la construcción del plásmido phd.
Se cultivaron células K12 GM48 de E. coli, se hicieron competentes para transformación, y se utilizó el plásmido pLPChyg1 para transformar las células K12 GM48 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina, y una vez formaron colonias los transformantes K12 GM48/pLPCHd1 de E. coli, se utilizó una de dichas colonias para preparar ADN del plásmido
pLPChd1 sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3. Se obtuvo aproximadamente 1 mg de ADN del plásmido pLPChd1 y se suspendió en aproximadamente 1 ml de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 2 \mug de ADN del plásmido pLPChd1 en 2 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón BclI 10x (KCl 750 mM, Tris-HCl 60 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 100 mM, DTT 10 mM y 1 mg/ml de BSA) y 14 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción BclII a la solución de ADN del plásmido pLPChd1, y se incubó la reacción resultante a 50ºC durante dos horas. Se paró la reacción extrayendo la mezcla una vez con fenol y dos veces con cloroformo.
Se añadió aproximadamente 1 \mul de ADN del plásmido pLPChd1 digerido con BclI a 1 \mul de tampón ligasa 10x, 8 \mul de H_{2}O y 1 \mul (\sim500 unidades) de ADN ligasa T4. Se incubó la reacción de ligamiento a 16ºC durante una noche, y el ADN ligado constituyó el plásmido phd deseado. El plásmido phd resulta de la deleción de los engarces BclI extra que se unieron durante la construcción del plásmido pLPcat, y de los dos fragmentos de restricción BclI adyacentes de un tamaño total de aproximadamente 1,45 kb del plásmido pLPChd1. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido phd en la Figura 16 de los dibujos adjuntos. El plásmido phd facilita la expresión de cualquier secuencia de ADN del potenciador del virus BK-promotor tardío de adenovirus de la presente invención, porque el ADN a expresar puede insertarse fácilmente en la posición correcta para expresión en el único sitio BclI del plásmido phd.
Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 GM48 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina, y se identificaron los transformantes K12 GM48/phd de E. coli resistentes a ampicilina mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido.
Los plásmidos análogos al plásmido phd pueden construirse sustancialmente según el procedimiento anterior para construir el plásmido phd utilizando cualquiera de los plásmidos pLPChd2, pLPChd3 o pLPChd4 como material de partida en lugar del plásmido pLPChd1. Estos plásmidos análogos difieren del plásmido phd sólo con respecto a la orientación de los genes que confiere resistencia a higromicina y/o dhfr.
Ejemplo 13 Construcción del plásmido pLPCE1A
Para aislar el gen E1A de ADN del adenovirus 2, se disolvieron aproximadamente 20 \mug de ADN del adenovirus 2 (de BRL) en 10 \mul de tampón BalI 10x (Tris-HCl 100 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 120 mM, 2-mercaptoetanol 100 mM y BSA 1 mg/ml) y 80 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (aproximadamente 20 unidades) de la enzima de restricción BalI a la solución de ADN de adenovirus 2, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se cargó el ADN digerido con BalI en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción de \sim1,8 kb que comprende el gen E1A de los demás productos de digestión. Se aisló el fragmento de \sim1,8 kb del gel y se preparó para ligamiento sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 3 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 20 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 5 \mug del plásmido pLPC en 5 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón StuI 10x y 11 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción StuI a la solución del plásmido pLPC, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pLPC digerido con StuI y se resuspendió en 2 \mul de tampón NdeI 10x y 16 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción NdeI a la solución de ADN del plásmido pLPC digerido con StuI, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas.
Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pLPC digerido con NdeI-StuI y se resuspendió en 5 \mul de tampón Klenow 10x y 42 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 3 \mul (\sim6 unidades) de enzima Klenow a la solución de ADN y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 30 minutos. Se cargó después la mezcla de reacción en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó claramente el fragmento de restricción NdeI-StuI de \sim5,82 kb tratado con Klenow de los demás productos de reacción. Se aisló el fragmento del gel y se preparó para ligamiento sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento de restricción NdeI-StuI de \sim5,82 pb tratado con Klenow y se suspendieron en 25 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 9 \mul del fragmento de restricción BalI de \sim1,8 kb del adenovirus 2 que codifica el gen E1A y 3 \mul del fragmento de restricción NdeI-StuI de \sim5,82 kb tratado con Klenow del plásmido pLPC a 2 \mul de tampón ligasa 10x y 4 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 1 \mul (\sim500 unidades) de ADN ligasa T4 y 1 \mul (\sim2 unidades) de ARN ligasa T4 a la solución de ADN, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche.
El ADN ligado constituyó los plásmidos pLPCE1A y pLPCE1A1 deseados, que difieren con respecto a la orientación del gen E1A y posiblemente difieren con respecto al efecto potenciador de la expresión que tiene el potenciador de BK sobre el gen E1A en el plásmido. Debido a que el promotor E1A está situado más cerca del potenciador de BK en el plásmido pLPCE1A que en el plásmido pLPCE1A1, la expresión de E1A puede ser mayor cuando se utiliza el plásmido pLPCE1A en contraposición al plásmido pLPCE1A1. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pLPCE1A en la Figura 17 de los dibujos adjuntos.
Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina, y se examinaron los transformantes resistentes a ampicilina mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido para identificar los transformantes K12 HB101/pLPCE1A de E. coli y K12 HB101/pLPCE1A1 de E. coli. Se obtuvo el ADN de plásmido de los transformantes para uso en experimentos posteriores sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
Ejemplo 14 Construcción del plásmido pBLT
Se añadió aproximadamente 1 \mug de ADN del plásmido pBW32 (Figura 14, ejemplo 10) en 1 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón BamHI 10x y 15 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pBW32, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se paró la reacción extrayendo en primer lugar la mezcla de reacción con fenol y extrayendo después la mezcla de reacción dos veces con cloroformo. Se añadió aproximadamente 1 \mul de ADN del plásmido pBW32 digerido con BamHI a 1 \mul de tampón ligasa 10x y 8 \mul de H_{2}O, y después de añadir aproximadamente 1 \mul (\sim500 unidades) de ADN ligasa T4 a la solución de ADN, se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche.
El ADN ligado constituyó el plásmido pBW32del deseado, que es de aproximadamente 5,6 kb de tamaño y comprende un solo sitio de restricción HindIII. Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se identificaron los transformantes K12 HB101/pBW32 de E. coli deseados mediante su fenotipo resistente a ampicilina y mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido. Se obtuvo ADN del plásmido pBW32del a partir de los transformantes para uso en construcciones posteriores sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
Se añadió aproximadamente 1 \mug del plásmido pBW32del en 1 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón HindIII 10x y 15 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción HindIII a la solución de ADN del plásmido pBW32del, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se diluyó la muestra a 100 \mul con tampón TE y se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternero sustancialmente según el procedimiento descrito en el ejemplo 2. Se extrajo dos veces la reacción con fenol y después una vez con cloroformo. Se precipitó después el ADN del plásmido pBW32del digerido con HindIII con etanol y se precipitó en 10 \mul de H_{2}O.
Se digirió el plásmido pBal8cat (ejemplo 17) con la enzima de restricción HindIII, se aisló el fragmento de restricción HindIII de \sim0,65 kb que comprende el módulo modificado de potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus 2 y se preparó para ligamiento sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 5. Se añadieron aproximadamente 0,1 \mug del fragmento de restricción HindIII de \sim0,65 kb del plásmido pBal8cat en 5 \mul de tampón TE a 3 \mul de la solución del plásmido pBW32del digerido con HindIII. Se añadieron aproximadamente 1 \mul (\sim500 unidades) de ADN ligasa T4 y 1 \mul de tampón ligasa 10x a la mezcla de ADN, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche.
El ADN ligado constituyó el plásmido pBLT deseado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBLT en la Figura 18 de los dibujos adjuntos. Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina, y se identificaron los transformantes K12 HB101/pBLT de E. coli resistentes a ampicilina mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido. Debido a que el fragmento de restricción HindIII de \sim0,65 kb podría insertarse en el plásmido pBW32del digerido con HindIII en cualquiera de dos orientaciones, sólo una de las cuales proporciona el plásmido pBLT, la orientación del fragmento de restricción HindIII de \sim0,65 kb tenía que determinarse para identificar los transformantes K12 HB101/pBLT de E. coli Se preparó ADN del plásmido pBLT a partir de los transformantes para uso en la construcción posterior sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 3.
Ejemplo 15 Construcción de los plásmidos pBLThyg1, pBLThyg2, pBLTdhfr1 y pBLTdhfr2 A. Construcción de los plásmidos pBLThyg1 y pBLThyg2
Se añadieron aproximadamente 4 \mug de ADN del plásmido pBLT en 4 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón BamHI 10x y 12 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pBLT, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se paró la reacción extrayendo la mezcla de reacción en primer lugar con fenol y después con cloroformo. Se precipitó después con etanol el ADN del plásmido pBLT digerido con BamHI y se resuspendió en 2 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pSV2hyg en 10 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón BamHI 10x y 75 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim25 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pSV2hyg, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pSV2hyg digerido con BamHI, se resuspendió en 10 \mul de tampón TE, se cargó en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción BamHI de \sim2,5 kb que comprende el gen que confiere resistencia a higromicina de los demás productos de digestión. Se aisló después del gel el fragmento de restricción de \sim2,5 kb y se preparó para ligamiento sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 4A; se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 10 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 2 \mul de ADN del plásmido pBLT digerido con BamHI y 1 \mul del fragmento de restricción BamHI de \sim2,5 kb del plásmido pSV2hyg a 1 \mul de tampón ligasa 10x, 5 \mul de H_{2}O y 1 \mul (\sim500 unidades) de ADN ligasa T4, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó los plásmidos pBLThyg1 y pBLThyg2 deseados. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBLThyg1 en la Figura 19 de los dibujos adjuntos. Los plásmidos pBLThyg1 y pBLThyg2 difieren sólo con respecto a la orientación del fragmento de restricción BamHI de \sim2,5 kb que codifica el gen que confiere resistencia a higromicina.
Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina, y se identificaron los transformantes K12 HB101/pBLThyg1 de E. coli y K12 H101/pBLThyg2 de E. coli mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido.
B. Construcción de los plásmidos pBLTdhfr1 y pBLTdhfr2
Se añadieron aproximadamente 100 \mug del plásmido pBW32 en 100 \mul de tampón TE a 15 \mul de tampón BamHI 10x y 25 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pBW32, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pBW32 digerido con BamHI, se resuspendió en 10 \mul de tampón TE, se cargó en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb que comprende el gen hidrofolato reductasa de los demás productos de digestión. Se aisló después del gel el fragmento de restricción de \sim1,9 kb y se preparó para ligamiento sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 4A; se obtuvieron aproximadamente 10 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 50 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 2 \mul de ADN del plásmido pBLT digerido con BamHI preparado en el ejemplo 15A y 1 \mul del fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb del plásmido pBW32 a 1 \mul de tampón ligasa 10x, 5 \mul de H_{2}O y 1 \mul (\sim500 unidades) de ADN ligasa T4, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó los plásmidos pBLTdhfr1 y pBLTdhfr2 deseados. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pBLTdhfr1 en la Figura 20 de los dibujos adjuntos. Los plásmidos pBLTdhfr1 y pBLTdhfr2 difieren sólo con respecto a la orientación del fragmento de restricción BamHI de \sim1,9 kb que codifica el gen dhfr.
Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina, y se identificaron los transformantes K12 HB101/pBLTdhfr1 de E. coli y K12 HB101/pBLTdhfr2 de E. coli mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido.
Ejemplo 16 Construcción de los plásmidos phdTPA y phdMTPA A. Construcción del plásmido intermedio pTPA602
Se añadieron aproximadamente 50 \mul del plásmido pTPA103 (ejemplo 10, Figura 14) en 45 \mul de H_{2}O destilada en vidrio a 30 \mul de tampón EcoRI 10x y 225 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim80 unidades) de la enzima de restricción EcoRI a la solución de ADN del plásmido pTPA103, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 90 minutos. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pTPA103 digerido con EcoRI, se resuspendió en 50 \mul de tampón de carga 1x (10% de glicerol y 0,02% de azul de bromofenol), se cargó en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción EcoRI de \sim1,1 kb de los demás productos de reacción. Se aisló del gel el fragmento de restricción EcoRI de \sim1,1 kb que comprende el ADN que codifica la terminación amino de TPA mediante electroforesis del fragmento en una bolsa de diálisis. Se precipitó después el fragmento con etanol y se resuspendió en 160 \mul de H_{2}O.
Se añadieron aproximadamente 40 \mul de tampón HgaI 10x (NaCl 0,5 M, Tris-HCl 60 mM, pH 7,4 y MgCl_{2} 0,1 M), 200 \mul de H_{2}O destilada en vidrio y 20 \mul (aproximadamente 10 unidades) de la enzima de restricción HgaI a la solución del fragmento de restricción EcoRI de \sim1,1 kb, y la reacción resultante se incubó a 37ºC durante 4 horas. Se precipitó con etano el ADN digerido con HgaI y después se sometió a electroforesis en gel de acrilamida al 5%, se aisló el fragmento de restricción de \sim520 pb que codifica la terminación amino del TPA en papel DE81 y se recuperó. Se obtuvieron aproximadamente 5 \mug del fragmento HgaI de \sim520 pb y se suspendieron en 50 \mul de H_{2}O.
Se añadieron aproximadamente 12,5 \mul de tampón Klenow 10x (Tris-HCl 0,5 M, pH 7,4 y MgCl_{2} 0,1 M), 2 \mul de una solución que era 6,25 mM de cada uno de los cuatro trifosfatos de desoxinucleótido, 2 \mul de DTT 0,2 M, 1 \mul de BSA 7 \mug/ml, 57,5 \mul de H_{2}O destilada en vidrio y 2 \mul (\sim10 unidades) de enzima Klenow (Boehringer-Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Dr., P.O. Box 50816, Indianápolis, IN 46250) a la solución del fragmento de restricción HgaI de \sim520 pb, y se incubó la reacción resultante a 20ºC durante 30 minutos. Se incubó el ADN tratado con Klenow a 70ºC durante 15 minutos y se precipitó con etanol.
Se fosforilaron aproximadamente 500 picomoles de engarce BamHI (5'- CGGGATCCCG-3' bicatenario y obtenido de New England Biolabs) utilizandopolinucleótido quinasa en un volumen total de reacción de 25 \mul. Se llevó a cabo la reacción sustancialmente según el procedimiento descrito en el ejemplo 6A. Se añadieron los engarces BamHI sometidos a quinasa a la solución del fragmento de restricción HgaI de \sim520 pb tratado con Klenow junto con 15 \mul de tampón ligasa 10x, 7 \mul (\sim7 unidades Weiss) de ADN ligasa T4 y suficiente H_{2}O destilada para llevar el volumen de reacción a 150 \mul. Se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche.
Se inactivó térmicamente la reacción de ligamiento, se precipitó el ADN con etanol y se resuspendió en 5 \mul de tampón BamHI 10x y 45 \mul de H_{2}O. Se añadió aproximadamente 1 \mul (\sim16 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 90 minutos. Después, se añadieron otras 16 unidades de enzima BamHI a la mezcla de reacción y se incubó la reacción a 37ºC durante otros 90 minutos. Se sometió después la mezcla de reacción a electroforesis en gel de poliacrilamida al 5% y se purificó del gel el fragmento de restricción HgaI de \sim530 pb, ahora con extremos BamHI, sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 6A. Se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento deseado y se suspendieron en 20 \mul de
H_{2}O.
El ADN del plásmido pBR322 desfosforilado digerido con BamHI puede obtenerse de New England Biolabs. Se añadieron aproximadamente 0,1 \mug del plásmido pBR322 desfosforilado digerido con BamHI en 2 \mul de H_{2}O a 1 \mul del fragmento de restricción HgaI de \sim530 pb, con extremos BamHI, del plásmido pTPA103, 14 \mul de H_{2}O y 1 \mul (\sim1 unidad Weiss) de ADN ligasa T4, y se incubó la reacción resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pTPA602 deseado y un plásmido equivalente designado pTPA601, que difiere del plásmido pTPA602 sólo con respecto a la orientación del fragmento de restricción de \sim530 pb insertado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pTPA602 en la Figura 21 de los dibujos adjuntos.
Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 MM294 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2, excepto porque se utilizó CaCl_{2} 50 mM en el procedimiento. Se sembraron células transformadas en agar L que contenía ampicilina, y se identificaron las células K12 MM294/pTPA602 de E. coli y MM294/pTPA601 de E. coli mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido. La presencia del fragmento de restricción BamHI de \sim530 pb indicó que el plásmido era pTPA602 o el plásmido pTPA601.
B. Construcción del plásmido intermedio pTPA603
Se disolvieron aproximadamente 5 \mug del plásmido pTPA602 en 20 \mul de BglII 10x y 180 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 3 \mul (\sim24 unidades) de la enzima de restricción BglII a la solución de ADN del plásmido pTPA602, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 90 minutos. Después, se añadieron \sim13 \mul de tampón BamHI 10x a la mezcla de reacción para llevar la concentración de sal de la mezcla de reacción a la recomendada para la digestión con SalI, y se añadieron 2 \mul (\sim20 unidades) de la enzima de restricción SalI a la reacción. Se incubó la reacción a 37ºC durante otras 2 horas; después se precipitó el ADN con etanol, se resuspendió en 75 \mul de tampón de carga, se cargó en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción BglII-SalI de \sim4,2 kb de los demás productos de digestión. Se escindió la región del gel que contenía el fragmento de restricción BglI-SalI de \sim4,2 kb del gel, se congeló, se empaquetó el fragmento congelado en plástico y se exprimió para retirar el fragmento de \sim4,2 kb. Se precipitó el ADN y se resuspendió en 20 \mul de H_{2}O; se obtuvieron aproximadamente 200 nanogramos del fragmento deseado.
Se disolvieron aproximadamente 12 \mug del plásmido pTPA103 en 15 \mul de tampón BglII 10x y 135 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim16 unidades) de la enzima de restricción BglII a la solución de ADN del plásmido pTPA103 y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 90 minutos. Se añadieron aproximadamente 10 \mul de tampón BamHI 10x a la solución de ADN del plásmido pTPA103 digerido con BglI para llevar la concentración de sal de la mezcla de reacción hasta la necesaria para digestión con SalI. Después, se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim20 unidades) de la enzima de restricción SalI a la solución de ADN del plásmido pTPA103 digerido con BglII, y se incubó la reacción a 37ºC durante otros 90 minutos. Se concentró el ADN del plásmido pTPA103 digerido con BglII-SalI mediante precipitación con etanol, después se cargó en gel de agarosa, y se aisló del gel el fragmento de restricción BglII-SalI de \sim2,05 kb que codifica todo menos la terminación amino de TPA, se precipitó con etanol y se resuspendió en 20 \mul de H_{2}O. Se obtuvieron aproximadamente 2 \mug del fragmento deseado.
Se añadieron aproximadamente 5 \mul del fragmento de restricción BglII-SalI de \sim4,2 kb del plásmido pTPA602 y 2 \mul del fragmento de restricción BglII-SalI de \sim2,05 kb del plásmido pTPA103 a 2 \mul de tampón ligasa 10x, 10 \mul de H_{2}O y 1 \mul (\sim1 unidad Weiss) de ADN ligasa T4, y se incubó la reacción de ligamiento resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pTPA603 deseado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido pTPA603 en la Figura 22 de los dibujos adjuntos.
Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 MM294 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2, excepto porque se utilizó CaCl_{2} 50 mM en el procedimiento. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina, y se identificaron los transformantes K12 MM294/pTPA603 de E. coli resistentes a ampicilina mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido.
C. Construcción del plásmido pMTPA603
Se añadieron aproximadamente 100 \mug del plásmido pBLT (ejemplo 14, Figura 18) en 100 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón SstI 10x (SstI es equivalente a la enzima de restricción SacI) (Tris-HCl 60 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 60 mM, 2-mercaptoetanol 60 mM y BSA 1 mg/ml) y 25 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 10 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción SstI a la solución de ADN del plásmido pBLT y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pBLT digerido con SstI y se resuspendió en 10 \mul de tampón BglII 10x y 85 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BglII a la solución de ADN del plásmido pBLT digerido con SstI y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas.
Se precipitó con etanol ADN del plásmido pBLT digerido con BglII-SstI, se resuspendió el 10 \mul de H_{2}O, se cargó en gel de agarosa, se sometió a electroforesis y se aisló del gel el fragmento de restricción BglII- SstI de \sim690 pb, que contiene la porción de la secuencia de codificación de TPA modificado en la que apareció la deleción para obtener la secuencia de codificación de TPA modificado, del plásmido pBLT sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 4A. Se obtuvieron aproximadamente 5 \mug del fragmento de restricción BglII-SstI de \sim690 pb deseado del plásmido pBLT y se suspendieron en 100 \mul de H_{2}O.
Se añadieron aproximadamente 5 \mug del plásmido pTPA603 (ejemplo 16B, Figura 22) en 5 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón SstI 10x y 95 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción SstI a la solución de ADN del plásmido pTPA603, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pTPA603 digerido con SstI y se resuspendió en 10 \mul de tampón BglII 10x y 85 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BglII a la solución de ADN del plásmido pTPA603 digerido con SstI, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se diluyó el ADN del plásmido pTPA603 digerido con BglII-SstI a 100 \mul en tampón TE y se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternero sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se precipitó con etanol el ADN y se resuspendió en 10 \mul de H_{2}O.
Se añadieron aproximadamente 5 \mul del plásmido pTPA603 digerido con BglII-SstI y 2 \mul del fragmento de restricción BglII-SstI de \sim690 pb del plásmido pBLT a 2 \mul de tampón ligasa 10x, 10 \mul de H_{2}O y 1 \mul (\sim1000 unidades) de ADN ligasa T4, y se incubó la reacción de ligamiento resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido pMTPA603 deseado. El plásmido pMTPA603 es por tanto de estructura análoga al plásmido pTPA603 (Figura 22), excepto porque el plásmido pMTPA603 codifica TPA modificado y el plásmido pTPA603 codifica TPA.
Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se sembraron las células transformadas en agar L que contenía ampicilina, y se identificaron los transformantes K12 HB101/pMTPA603 de E. coli resistentes a ampicilina mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido.
D. Construcción del plásmido phdTPA
Se añadieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pTPA603 (ejemplo 16B, Figura 22) en 10 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón BamHI 10x y 85 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pTPA603 y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pTPA603 digerido con BamHI, se resuspendió en 10 \mul de H_{2}O, se cargó en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción BamHI de \sim1,90 kb que codifica TPA de los demás productos de digestión. Se aisló el fragmento de restricción BamHI de \sim1,90 kb del gel y se resuspendió en 50 \mul de tampón TE; se obtuvieron aproximadamente 4 \mug del fragmento deseado.
Se añadieron aproximadamente 2 \mug del plásmido phd (Ejemplo 2, Figura 16) en 2 \mul de tampón TE a 2 \mul de tampón BclI 10x y 14 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 2 \mul (\sim10 unidades) de la enzima de restricción BclII a la solución de ADN del plásmido phd, y se incubó la reacción resultante a 50ºC durante 2 horas. Se paró la reacción extrayendo la mezcla de reacción en primer lugar con fenol y después dos veces con cloroformo. Se precipitó después con etanol el ADN del plásmido phd digerido con BclI y se resuspendió en 20 \mul de tampón TE.
Se añadieron aproximadamente 1 \mul de plásmido phd digerido con BclI y 2 \mul del fragmento de restricción BamHI de \sim1,90 kb del plásmido pTPA603 a 1 \mul de tampón ligasa 10x, 5 \mul de H_{2}O y 1 \mul (\sim500 unidades) de ADN ligasa T4. Se incubó la reacción de ligamiento resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido phdTPA deseado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido phdTPA en la Figura 23 de los dibujos adjuntos.
Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli (NRRL B-15626) sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se sembró la mezcla de transformación en agar L que contenía ampicilina, y se identificaron las células K12 HB101/phdTPA de E. coli resistentes a ampicilina mediante análisis de enzimas de restricción. El fragmento de restricción BamHI de \sim1,90 kb podía insertarse en el plásmido phd digerido con BclI en cualquiera de dos orientaciones, de las que sólo una dispone la secuencia de codificación de TPA en la posición apropiada para expresarse bajo el control del módulo potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus, y por tanto da como resultado el plásmido phdTPA deseado.
E. Construcción del plásmido phdMTPA
Se añadieron aproximadamente 10 \mug del plásmido pMTPA603 (Ejemplo 16c) en 10 \mul de tampón TE a 10 \mul de tampón BamHI 10x y 85 \mul de H_{2}O. Se añadieron aproximadamente 5 \mul (\sim50 unidades) de la enzima de restricción BamHI a la solución de ADN del plásmido pMTPA603, y se incubó la reacción resultante a 37ºC durante 2 horas. Se precipitó con etanol el ADN del plásmido pMTPA603 digerido con BamHI, se resuspendió en 10 \mul de H_{2}O, se cargó en gel de agarosa y se sometió a electroforesis hasta que se separó el fragmento de restricción BamHI de \sim1,35 kb que codifica el TPA modificado de los demás productos de digestión. Se aisló del gel el fragmento de restricción BamHI de \sim1,35 kb y se resuspendió en 20 \mul de tampón TE; se obtuvieron aproximadamente 4 \mug del fragmento deseado.
Se añadieron aproximadamente 1 \mul del plásmido phd digerido con BclI preparado en el Ejemplo 16D y 2 \mul del fragmento de restricción BamHI de \sim1,35 kb del plásmido pMTPA603 a 1 \mul de tampón ligasa 10x, 5 \mul de H_{2}O y 1 \mul (\sim500 unidades) de ADN ligasa T4. Se incubó la reacción de ligamiento resultante a 16ºC durante una noche. El ADN ligado constituyó el plásmido phdMTPA deseado. Se presenta un mapa de sitios de restricción y funciones del plásmido phdMTPA en la Figura 24 de los dibujos adjuntos.
Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli sustancialmente según el procedimiento del ejemplo 2. Se sembró la mezcla de transformación en agar L que contenía ampicilina, y se identificaron las células K12 HB101/phdMTPA de E. coli resistentes a ampicilina mediante análisis de enzimas de restricción de su ADN de plásmido. El fragmento de restricción BamHI de \sim1,35 kb podía insertarse en el plásmido phd digerido con BclI en cualquiera de dos orientaciones, de la que sólo una dispone la secuencia de codificación de TPA en la posición apropiada para expresarse bajo el control del potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus y por tanto da como resultado el plásmido phdMTPA deseado.
Ejemplo 17 Construcción de un módulo potenciador de BK-promotor tardío de adenovirus mejorado
El efecto potenciador de la transcripción del potenciador de BK puede aumentarse significativamente disponiendo el potenciador de 0 a 300 nucleótidos cadena arriba del extremo 5' de la región CAAT de un promotor eucariótico adyacente. Se describen a continuación la secuencia y los elementos funcionales del presente módulo potenciador de BK-promotor tardío del adenovirus 2, antes de la modificación para conseguir una mayor actividad potenciadora
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(Secuencia pasa a página siguiente)
11 
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en la que A es desoxiadenilo, G es desoxiguanilo, C es desoxicitidilo y T es timidilo.
El potenciador de BK se define por las tres secuencias repetidas indicadas en la secuencia anterior y funciona similarmente, con respecto a una secuencia adyacente, en cualquier orientación. Para llevar el potenciador, más específicamente el extremo 3' de la tercera repetición (que depende de la orientación) del potenciador de BK más cerca del extremo 5' de la región CAAT del promotor tardío del adenovirus 2, se añadieron aproximadamente 82 \mug de ADN del plásmido pBLcat digerido con SstI en 170 \mul de tampón TE a 20 \mul de tampón nucleasa Bal31 5x (Tris-HCl 0,1 M, pH 8,1, NaCl 0,5 M, CaCl_{2} 0,06 M y Na_{2}EDTA 5 mM) y 9 \mul de nucleasa Bal31, que estaba compuesta por 6 \mul (\sim6 unidades) de enzima Bal31 "rápida" y 3 \mul (\sim3 unidades) de "lenta" (comercializadas por International Biotechnologies, Inc., PO Box 1565, New Haven, CT 06506). Se incubó la reacción a 30ºC durante aproximadamente 30 minutos; después, tras añadir aproximadamente 10 \mul de EGTA 0,1 M para parar la reacción, se recogió el ADN digerido con Bal31 mediante precipitación con etanol y centrifugación. Se resuspendió el sedimento de ADN en tampón Klenow 1x y se trató con enzima Klenow sustancialmente según los procedimientos descritos anteriormente en la presente memoria.
Se resuspendió el ADN tratado con Klenow en 10 \mul de tampón TE; se autoligó después aproximadamente 1 \mul del ADN en 10 \mul de tampón ligasa 1x utilizando ADN ligasa T4 y ARN ligasa como se describe anteriormente. Se utilizó el ADN ligado para transformar K12 HB101 de E. coli, y después se sembraron los transformantes en agar L que contenía ampicilina. Se utilizó el análisis de enzimas de restricción para determinar cuáles transformantes contenían plásmidos con un módulo potenciador de BK-promotor tardío del adenovirus 2 de tamaño apropiado, y se utilizó la secuenciación de ADN para confirmar la secuencia nucleotídica del módulo. El procedimiento anterior genera una serie de plásmidos en los que se dispone el potenciador de BK de 0 a 300 nucleótidos cadena arriba de la región CAAT del promotor tardío de adenovirus. Se designó un plásmido resultante del procedimiento anterior como plásmido pBal8cat. Se describe a continuación la secuencia del potenciador de BK-promotor tardío del adenovirus 2 del plásmido pBal8cat
12
en la que A es desoxiadenilo, G es desoxiguanilo, C es desoxicitidilo y T es timidilo.
Los expertos en la técnica reconocerán que el procedimiento anterior produjo una serie de plásmidos distintos, de los cuales el plásmido pBal8cat es ilustrativo. Estos plásmidos, como grupo, representan situar el potenciador de BK a una serie de distancias menores de 300 nucleótidos de la región CAAT del promotor tardío de Ad2, y por tanto comprenden un aspecto importante de la presente invención. Puede utilizarse este procedimiento para mejorar la actividad de un potenciador de BK, que puede conseguirse utilizando el procedimiento anterior u otros conocidos por los expertos en la técnica, con cualquier potenciador de BK y cualquier promotor eucariótico.
Ejemplo 18 Construcción de transformantes células hospedadoras eucarióticas de los vectores de expresión de la presente invención y determinación de los niveles de expresión génica recombinante en estos transformantes
Un aspecto importante de la presente invención se refiere al uso del potenciador de BK para estimular la expresión génica en presencia del producto del gen E1A. Debido a que las células 293 expresan constitutivamente el producto del gen E1A, las células 293 son el hospedador preferido para los vectores de expresión eucarióticos de la presente invención. Las células 293 son células renales humanas transformadas con adenovirus de tipo 5 (obsérvese que puede utilizarse cualquier tipo particular de adenovirus para suministrar el producto del gen E1A en el procedimiento de la presente invención) y están disponibles en la ATCC con el número de acceso CRL 1573. Sin embargo, los vectores de expresión de la presente invención funcionan en una amplia variedad de células hospedadoras, incluso si el producto del gen E1A no está presente. Además, el producto del gen E1A puede introducirse en una línea celular no productora de E1A mediante transformación con un vector de la presente invención que comprende el gen E1A, tal como los plásmidos pLPCE1A y pLPCE1A1, o con ADN de adenovirus completo, o mediante infección con adenovirus.
El procedimiento de transformación descrito a continuación designa las células 293 como la línea celular hospedadora; sin embargo, el procedimiento es generalmente aplicable a la mayoría de las líneas celulares eucarióticas. Se han transformado una serie de líneas celulares con los vectores de la presente invención; algunos de los transformantes reales construidos y la información relacionada se presentan en las Tablas adjuntas a este ejemplo. Debido al gran número de vectores de expresión de la presente invención, el procedimiento de transformación se describe genéricamente, y los transformantes reales construidos se presentan en las Tablas.
Se obtienen células 293 de la ATCC con el número de acceso CRL 1573 en un matraz de 25 mm^{2} que contiene una monocapa confluente de aproximadamente 5,5 x 10^{6} células en medio esencial mínimo de Eagle con suero de caballo inactivado térmicamente al 10%. Se incuba el matraz a 37ºC, se cambia el medio dos veces por semana. Se subcultivan las células retirando el medio, aclarando con solución salina equilibrada de Hank (Gibco), añadiendo tripsina al 0,25% durante 1-2 minutos, aclarando con medio fresco, aspirando y dispensando en matraces nuevos a una relación de subcultivo de 1:5 ó 1:10.
Un día antes de la transformación, se siembran células a 0,7 x 10^{6} células por disco. Se cambia el medio 4 horas antes de la transformación. Se utiliza ADN estéril de plásmido precipitado con etanol disuelto en tampón TE para preparar una solución de ADN-CaCl_{2} 2x que contiene ADN 40 \mug/ml y CaCl_{2} 250 mM. Se prepara HBS 2x que contiene NaCl 280 mM, Hepes 50 mM y fosfato de sodio 1,5 mM, con el pH ajustado a 7,05-7,15. Se añade gota a gota la solución de ADN-CaCl_{2} 2x a un volumen igual de HBS 2x estéril. Se inserta una pipeta de plástico estéril de 1 ml con un taco de algodón en el tubo de mezclado que contiene el HBS 2x, y se introducen burbujas soplando mientras se añade el ADN. Se deja formar el precipitado de fosfato de calcio-ADN sin agitación durante 30- 45 minutos a temperatura ambiente.
Se mezcla después el precipitado mediante pipeteado suave con una pipeta de plástico, y se añade directamente 1 ml (por placa) de precipitado a los 10 ml de medio de cultivo que cubren las células receptores. Después de 4 horas de incubación a 37ºC, se reemplaza el medio por DMEM con suero bovino fetal al 10% y se dejan incubar las células durante 72 horas adicionales antes de proporcionar presión selectiva. Para los transformantes que expresan la proteína C humana recombinante, el medio de crecimiento contenía de 1 a 10 \mug/ml de vitamina K, un cofactor necesario para la \gamma-carboxilación de la proteína. Para plásmidos que no comprenden un marcador detectable que funcione en células eucarióticas, el procedimiento de transformación utiliza una mezcla de plásmidos: el vector de expresión de la presente invención que carece de un marcador detectable y un vector de expresión que comprende un marcador detectable que funciona en células eucarióticas. Esta técnica de contransformación permite la identificación de células que comprenden ambos plásmidos transformantes.
Para células transfectadas con plásmidos que contienen el gen que confiere resistencia a higromicina, se añade higromicina al medio de crecimiento a una concentración final de aproximadamente 200 a 400 \mug/ml. Se incuban después las células a 37ºC durante 2-4 semanas con cambios de medio a intervalos de 3 a 4 días. Las colonias resistentes a higromicina resultantes se transfieren a matraces de cultivo individuales para caracterización. Se realiza la selección de las colonias resistentes a neomicina (se utiliza también G418 en lugar de neomicina) sustancialmente según el procedimiento de selección para células resistentes a higromicina, excepto porque se añade neomicina a una concentración final de 400 \mug/ml en lugar de higromicina. Las células 293 son dhfr positivas, de modo que los transformantes 293 que contienen plásmidos que comprenden el gen dhfr no se seleccionan solamente basándose en el fenotipo positivo de dhfr, que es la capacidad de crecer en medio que carece de hipoxantina y timina. Las líneas celulares que carecen de un gen dhfr funcional y se transforman con plásmidos que contienen dhfr pueden seleccionarse basándose en el fenotipo dhfr+.
El uso del gen dihidrofolato reductasa (dhfr) como marcador detectable para introducir un gen o plásmido en una línea celular deficiente en dhfr, y el uso posterior de metotrexato para amplificar el número de copias del plásmido están bien establecidos en la bibliografía. Aunque el uso de dhfr como marcador detectable y amplificable en células productoras de dhfr no se ha estudiado bien, las evidencias en la bibliografía sugerirían que puede utilizarse el dhfr como marcador detectable en células productoras de dhfr y para amplificación génica. El uso de la presente invención no está limitado por el mercador detectable utilizado. Además, pueden utilizarse marcadores amplificables tales como genes de metalotioneína, genes de adenosina desaminasa o miembros de la familia de resistencia multigénica, ejemplificados por la P-glicoproteína.
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13
TABLA 4 Niveles relativos de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) producidos por plásmidos recombinantes en diversas líneas celulares renales humanas y de mono
14 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{145mm}* Los valores para los niveles
relativos de CAT producidos en cada línea celular se basaron en el
nivel de CAT del plásmido pSV2cat como unidad en esa línea celular.
Los resultados son la media de 2 a 6 determinaciones individuales de
cada punto de datos. ND= no detectado, NT= no ensayado. El plásmido
pSLcat es análogo al plásmido pBLcat, pero tiene el potenciador de
SV40 en lugar del potenciador de BK. Sólo la línea celular 293
produce E1A. Las líneas celulares COS y k816-4
producen antígenos T.\end{minipage} \cr 
 \begin{minipage}[t]{145mm}** Las células k816-4
se prepararon mediante transformación de células renales humanas
primarias con un plásmido, designado pMK16,8-16
(obtenido de Y. Gluzman, Cold Spring Harbor), que contiene un genoma
de SV40 con un defecto en el origen de replicación. Esta línea
celular produce constitutivamente el antígeno T de SV40. La línea
celular k186-4 es esencialmente la misma que la
línea celular SV1, una línea celular renal humana transformada con
SV40, descrita por E.O. Major,  Polyomaviruses and Human
Neurological Diseases   (Alan R. Liss, Inc., NY 1983, Ed. D.
Madden y J.
Sever).\end{minipage} \cr}
TABLA 5 Niveles relativos de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) producidos mediante plásmidos recombinantes en diversas líneas celulares renales humanas y de mono corregidos para las diferencias relativas en el número de copias de plásmido
15 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{145mm}* Los valores para los niveles
relativos de CAT producidos en cada línea celular se corrigieron
dividiendo el nivel de CAT en el lisado celular entre la  cantidad
de ADN de plásmido, como se determina mediante análisis de
hibridación,  en el mismo lisado celular. El valor corregido para el
plásmido pSV2cat en  células 293 se tomó como
unidad.\end{minipage} \cr}

Claims (2)

1. Un procedimiento para producir proteína C en el que la proteína se codifica en un vector de ADN recombinante de tal modo que la proteína se expresa cuando se cultiva una célula hospedadora eucariótica que contiene el vector en condiciones de expresión adecuadas, que comprende:
(a) insertar el vector en una célula renal humana transformada con adenovirus, conteniendo dicho vector el ácido nucleico que codifica la proteína C; y
(b) cultivar dicha célula hospedadora de la etapa (a) en condiciones de crecimiento y en medio que contiene suficiente vitamina K para la carboxilación.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la línea celular renal humana transformada con adenovirus es la línea celular 293.
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