CN107208142B - 包含细小病毒病毒体的组合物中的dna杂质 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含细小病毒载体的组合物中的核酸杂质。特别地，本发明显示DNA杂质不是随机包封在细小病毒病毒体内。本发明因此涉及用于鉴定和定量包含细小病毒载体的组合物中的核酸杂质的方法。最后，本发明涉及确定包含细小病毒载体的组合物是否被视为临床上纯的方法。
Description
技术领域
本发明涉及病毒学和基因治疗领域。特别地，本发明涉及用于鉴定和/或定量组合物中过多出现的核酸杂质的方法。
背景技术
基于腺相关病毒(AAV)的重组载体已用于许多临床试验中，并且对人类基因治疗有很大的希望。负责rAAV广泛成功的原则特征是其建立持续转基因表达与良好安全特征组合的能力。临床级rAAV的制备尤其集中于将DNA杂质最小化，所述DNA杂质潜在地可能编码有损载体安全性的致癌基因、抗生素标记物或免疫原性肽(Wright等人，2008,GeneTher.15,840-848)。
虽然rAAV的上游和下游加工两者均已取得了巨大的进步，以确保最终产品的纯度，但完全消除不需要的DNA似乎并不可行。细胞或辅助载体DNA的包装看起来是AAV生物学的副产物，并且像这样固有地与预期转基因DNA的包壳联系。一旦无关DNA被包壳到预先形成的衣壳中，粒子就变得与仅含有预期表达盒的衣壳无法区分，并且实际上不可能分离它们。
因此，为了支持临床开发并理解与rAAV载体中不需要的DNA存在相关的风险，需要在反映所使用的rAAV的生物分布谱的一系列细胞系中评估来自这些遗传元件的蛋白质表达的潜力，以排除非有意的蛋白质表达的理论可能性，可以导致不良效应，例如潜在有损载体安全性和/或功效的细胞重排、致肿瘤性或不需要的免疫应答。
迄今为止，文献中已报道了污染rAAV制剂的DNA杂质的存在和浓度(Blouin等人，2004,J.Gene Med.6Suppl 1,S223-S228；Nony等人，2003,J.Virol.77,776-781；Chadeuf等人，2005,Mol.Ther.12,744-753；Wright等人，2008，同上)。这些杂质的身份追溯到辅助质粒或宿主细胞DNA(Wright等人，2008，同上)。仅有限数目的研究解决了源自这种共包装的残留DNA的推定蛋白质表达的问题。Wright和同事在用rAAV感染人肝细胞或小鼠后通过RT-qPCR分析了cap、amp(r)和两个腺病毒基因E2A和E4的表达，并且未发现可检测的转录(Hauck等人，2009,Mol Ther.17(1)144-152)。相反，Miller等人已使用互补测定发现了DNA杂质驱动cap基因的表达(Halbert等人，2011,Gene Ther.18(4):411-417)。
用于分析生物制药学病毒体制剂中的DNA杂质的目前选择方法是qPCR。使用该方法确定特定DNA杂质的存在和量。重要的是，本领域技术人员因此预先地选择待检测的DNA杂质，即在进行qPCR之前，因为本领域普遍认为DNA杂质被随机地包装到病毒体内。这种(预选择的)DNA杂质可以例如包含宿主细胞DNA、Rep、Cap或质粒核苷酸序列。例如，如由Thorne等人(2009，Hum.Gene Ther 20：707-714)所示，使用两个靶监测宿主细胞DNA杂质：作为基于HeLa的生产系统的安全性评估的相关序列的人乳头状瘤病毒(HPV)E6/E7转化基因，以及作为敏感的一般标记物的核糖体RNA(rRNA)的高度表达的高拷贝基因。根据Thorne等人(同上)，最流行的共包装的序列衍生自包装质粒，包括AAV rep和cap以及细菌和哺乳动物细胞选择标记物基因。此外，Ye等人(2011，Gene Ther.18,135-144)公开了来自HSV包装质粒的DNA序列在哺乳动物细胞系中的rAAV生产期间随机包装。根据Ye等人，AAV病毒体包含来自整个HSV基因组的随机片段。另外，Chadeuf等人(同上)显示在较小的DNA质粒的情况下，完整的质粒和病毒ITR被包封到病毒体内，包括选择标记物基因。因此，看起来无需检测特定的核苷酸序列，因为DNA杂质似乎被随机包装到细小病毒病毒体内。
与将DNA杂质随机包装到病毒体内的一般教导相反，本发明显示一些DNA杂质实际上是过多出现的。因此，目前使用的用于检测生物制药学组合物中的DNA杂质的方法可以导致组合物中存在的DNA杂质的严重低估。药物组合物中的DNA杂质的这种低估可以导致施用临床上不够纯的组合物，导致对于患者潜在的安全健康风险。
因此，在本领域中需要用于鉴定和定量生物组合物例如生物制药学制剂中过多出现的DNA杂质的手段和方法。本发明的目的是提供这种手段和方法。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及用于鉴定和定量包含细小病毒载体的组合物中过多出现的核酸杂质的方法，并且其中所述方法包括以下步骤：
a)对组合物进行核酸测序以获得核苷酸序列的随机读段；
b)将来自步骤a)的随机读段与用于产生组合物的方法中使用的生物组分的核苷酸序列进行比较，通过随机读段和生物组分的核苷酸序列之间的匹配鉴定核酸杂质；
c)确定每细小病毒载体的平均读段数目；和
d)确定过多出现的核酸杂质的每核苷酸读段数目，其中当读段分布不是随机的，并且过多出现的杂质包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或50倍生物组分的平均读段数目时，或者当核酸杂质的每核苷酸读段数目为每细小病毒载体的平均读段数目的至少0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0或10％时，核酸杂质被鉴定为过多出现的杂质。
在一个优选实施方案中，步骤(a)中的核酸测序包括高通量测序。
在一个优选实施方案中，细小病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。
在一个优选实施方案中，生物组分的核苷酸序列选自以下的核苷酸序列组成的组：宿主细胞核苷酸序列、质粒核苷酸序列、除重组细小病毒载体外的载体核苷酸序列和辅助病毒核苷酸序列，其中优选地，载体是杆状病毒载体。
在一个优选实施方案中，辅助病毒是重组腺病毒和/或重组单纯疱疹病毒。
在一个优选实施方案中，生物组分的核苷酸序列包含编码Rep、Cap和/或转基因的核苷酸序列，其中优选地，生物组分包含编码转基因的核苷酸序列，其中更优选地，生物学组分包含编码转基因的核苷酸序列，所述转基因侧翼为至少一个细小病毒ITR，并且其中最优选地，生物组分包含编码转基因的核苷酸序列，所述转基因在每侧上侧翼为至少一个细小病毒ITR。
在一个优选实施方案中，过多出现的核酸杂质在第二组合物或进一步的组合物中进行定量。
在第二个方面，本发明涉及用于定量包含细小病毒载体的组合物中的核酸杂质的方法，其中所述方法包括确定核酸杂质的相对丰度的步骤，当ITR序列在用于产生组合物的方法中使用的生物组分中存在时，所述核酸杂质包含定位紧邻细小病毒ITR序列1-8000bp、1-5000bp、1-3000bp、1-1000bp、1-500bp、1-250bp或1-100bp之间的核苷酸序列，并且其中所述生物组分包含侧翼为细小病毒ITR序列的至少一个拷贝的转基因。
在一个优选实施方案中，生物组分选自由宿主细胞、质粒、除重组细小病毒载体外的载体和辅助病毒组成的组，其中优选地，载体是杆状病毒载体。
在一个优选实施方案中，细小病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。
在一个优选实施方案中，当ITR序列在用于产生组合物的方法中使用的生物组分中存在时，核酸杂质的核苷酸序列在细小病毒ITR序列的每一侧上紧邻定位。
在一个优选的实施方案中，与细小病毒载体的核苷酸序列和/或参考序列组合物相比确定相对丰度。
在一个优选实施方案中，相对丰度通过以下确定：
a)如上定义的核酸杂质的每核酸的平均读段数目；和
i)参考序列的每核酸的平均读段数目；和/或
ii)组合物中的每细小病毒载体的平均读段数目；
其中读段数目通过如上定义的方法确定；和/或
b)扩增如上文定义的核酸杂质；和
i)参考序列；和/或
ii)细小病毒载体的核苷酸序列。
在一个优选实施方案中，通过Q-PCR和/或通过高通量测序来确定相对丰度。
在一个优选实施方案中，该方法进一步包括寡核苷酸引物与如上定义的核酸杂质或其互补体选择性杂交的步骤。
在一个优选实施方案中，寡核苷酸引物与包含杆状病毒序列或其互补体的部分的核酸杂质选择性杂交。
在第三个方面，本发明涉及确定包含细小病毒载体的组合物是否被视为临床上纯的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)定量如上定义的细小病毒载体组合物中的核酸杂质；和
ii)如果通过核酸杂质的相对丰度确定，存在的如上定义的核酸杂质比参考序列和/或转基因少至少10、100、250、1000倍，则确定该组合物为临床上纯的。
在一个优选实施方案中，包含细小病毒载体的组合物是药物组合物。可替代地，或与另一个优选实施方案组合，在本发明的一个优选实施方案中，包含细小病毒载体的组合物包含包装有细小病毒载体的细小病毒衣壳。可替代地，或与另一个优选实施方案组合，在本发明的一个优选实施方案中，包含细小病毒载体的组合物不包含从哺乳动物获得或可获得的样品，其中哺乳动物优选为非人灵长类动物。
具体实施方式
本发明涉及DNA杂质不随机包装到细小病毒病毒体内的发现。相反，在病毒体组合物中存在过多出现的核酸杂质。因此，在第一个方面，本发明涉及用于鉴定组合物中的核酸杂质的方法。优选地，组合物包含细小病毒载体。该方法优选包括以下步骤：a)对组合物进行核酸测序以获得核苷酸序列的随机读段；b)将来自步骤a)的随机读段与用于产生组合物的方法中使用的生物组分的核苷酸序列进行比较，通过随机读段和生物组分的核苷酸序列之间的匹配鉴定核酸杂质。为了定量鉴定的核酸杂质，该方法进一步优选包括以下步骤：c)确定每细小病毒载体的平均读段数目；和d)确定所鉴定的核酸杂质的每核苷酸读段数目，其中当读段分布不是随机的，并且过多出现的杂质具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或50倍生物组分的平均读段数目时，或者当核酸杂质的每核苷酸读段数目为每细小病毒载体的平均读段数目的至少0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0或10％时，核酸杂质被鉴定为过多出现的杂质。
本发明的方法因此涉及鉴定和定量组合物中的核酸杂质。核酸杂质可以是DNA杂质和/或RNA杂质，优选地核酸杂质是DNA杂质。
术语“核酸杂质”应理解为包括不预期包装到细小病毒病毒体内的任何核酸序列，例如，用于产生组合物的方法中使用的生物组分的核苷酸序列。特别地，在每一侧上侧翼没有一个细小病毒ITR的序列可以构成核酸杂质。
“细小病毒载体”在本文中指包含一个或多个目的多核苷酸序列(例如编码目的产物的基因的表达构建体，即“转基因”)的重组核酸分子，所述多核苷酸序列侧翼为至少一个(且通常为两个)细小病毒反向末端重复序列(ITR)。
“读段的随机分布”在本文中定义为在用于产生组合物的方法中使用的生物组分的核苷酸序列长度上均等地对齐的读段分布。特别地，读段的随机分布定义为在用于产生组合物的方法中使用的一种生物组分的核苷酸序列长度上均等对齐的读段分布。更优选地，读段的随机分布在本文中定义为在选自以下的核苷酸序列的核苷酸序列长度上均等对齐的读段分布：宿主细胞核苷酸序列、质粒核苷酸序列、除重组细小病毒载体外的载体核苷酸序列和辅助病毒核苷酸序列，其中优选地，载体是杆状病毒载体。因此，最优选地，读段的随机分布在本发明中定义为在杆状病毒载体的核苷酸序列的长度上均等对齐的读段分布。
均等对齐在本文中定义为与相同核苷酸序列的任何其他区域相比，读段与核苷酸序列的特定区域对齐的概率均等。优选地，在均等对齐中，与核苷酸对齐的读段数目不偏离与该核苷酸序列对齐的平均读段数目超过0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、15或20％。
“读段的非随机分布”在本文中定义为在用于产生组合物的方法中使用的生物组分的核苷酸序列长度上不均等对齐的读段分布。特别地，读段的非随机分布定义为在用于产生组合物的方法中使用的一种生物组分的核苷酸序列长度上不均等对齐的读段分布。更优选地，读段的非随机分布在本文中定义为在选自以下的核苷酸序列的核苷酸序列长度上不均等对齐的读段分布：宿主细胞核苷酸序列、质粒核苷酸序列、除重组细小病毒载体外的载体核苷酸序列和辅助病毒核苷酸序列，其中优选地，载体是杆状病毒载体。因此，最优选地，读段的非随机分布在本发明中定义为在杆状病毒载体的核苷酸序列长度上不均等对齐的读段分布，即意味着与杆状病毒载体的其他区域相比，更多的读段与杆状病毒的特定区域对齐。
优选地，组合物是包含(重组)细小病毒病毒体的组合物，其包含(至少)包装有重组细小病毒载体的细小病毒衣壳或由(至少)包装有重组细小病毒载体的细小病毒衣壳组成。组合物及其组成成分进一步优选如本文下文所定义的。
在本发明的一个优选实施方案中，该方法用于鉴定和/或定量包装到细小病毒病毒体内，即包封在病毒体内的核酸杂质。特别地，根据本发明的核酸杂质在包含细小病毒病毒体的组合物的核酸酶处理(例如RNA酶或DNA酶处理)后不降解。
组合物
在一个优选实施方案中，组合物中包含细小病毒载体。优选地，组合物是药物组合物。药物组合物进一步优选包含药学可接受的载体。任何合适的药学可接受的载体或赋形剂都可以用于本发明的组合物中(参见例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Alfonso R.Gennaro(编辑)Mack Publishing Company，1997年4月)。
优选的药物形式将与无菌盐水、右旋糖溶液或缓冲溶液、或者其他药学可接受的无菌流体组合。可替代地，可以使用固体载体，例如微载体珠。
可替代地，或与另一个优选实施方案组合，在本发明的一个优选实施方案中，包含细小病毒载体的组合物不包含从哺乳动物获得或可获得的样品，例如肝脏或肌肉样品。在一个甚至更优选的实施方案中，组合物不包含从非人灵长类动物获得或可获得的样品。在一个更优选的实施方案中，组合物不包含来自哺乳动物，例如来自非人灵长类动物的肌肉或肝脏的基因组DNA。
核酸测序
在根据本发明的方法中，鉴定和定量组合物中过多出现的核酸杂质。用于鉴定和定量过多出现的核酸杂质的方法包括但不限于桑格测序(Sanger sequencing)或高通量测序。
在第一个实施方案中，可以将细小病毒载体DNA克隆到质粒内，随后为常规桑格测序。桑格测序在本文中定义为DNA测序的方法，其基于在体外DNA复制期间通过DNA聚合酶选择性掺入链终止双脱氧核苷酸。根据本发明的桑格测序包括所谓的链终止子桑格测序和/或染料-终止子桑格测序。优选地，桑格测序是染料-终止子桑格测序。染料-终止子测序利用链终止子ddNTP的标记。特别地，在染料-终止子测序中，四种双脱氧核苷酸链终止子各自用荧光染料标记，所述荧光染料各自发射不同波长的光，这允许在单次反应中的测序。其他DNA测序方法可能同样适用，如纳米孔DNA测序、隧穿电流DNA测序、通过杂交的测序、用质谱法的测序、微流体桑格测序、基于显微镜检查的技术和RNAP测序。
在本发明的一个优选实施方案中，核酸测序包括高通量测序。高通量测序(也称为下一代测序或深度测序)指非基于桑格的高通量DNA测序技术。数千、数百万或甚至数十亿条DNA链可以平行测序，得到基本上更多的通量，并且最小化对基因组的桑格测序中常用的片段克隆方法的需要。
在根据本发明的优选方法中，高通量测序包括Heliscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序、离子洪流测序(离子半导体)、454测序(焦磷酸测序，Roche 454LifeSciencesTM，Branford，CT)、Solexa(通过合成测序，Illumina，Inc，San Diego，CA)和/或SOLiD测序(通过连接测序，ABI，Applied Biosystems，Indianapolis，IN)。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，核酸测序包括SOLiD、Solexa和/或454测序。在一个最优选的实施方案中，核酸测序包括Solexa/Illumina或454测序。
根据本发明的方法并不限于目前已知的高通量测序方法。特别地，应当理解，在一段时间内将开发新型高通量测序方法，其同样适用于本发明的方法。特别地，可以在根据本发明的方法中使用被分类为高通量测序方法的任何测序方法，即在单次运行中生成数千、数百万或数十亿个读段的任何方法。
在根据本发明的优选方法中，通过对包含细小病毒载体的组合物进行核酸测序来获得随机读段。(测序)“读段”或“计数”在本文中定义为在核酸测序方法期间产生的各个碱基串。不同的高通量测序方法可以生成不同数目的读段/运行(反应)和不同长度的读段。例如，Illumina生成多达30亿个读段/运行，并且读段具有50–300bp的平均长度。另一方面，454测序生成约100万个读段/运行，其中读段具有约700bp的平均长度。读段数目(每次运行的读段数目)和读段长度(每读段的碱基数目)可以根据测序运行而变，并且读段长度以及每次运行的读段数目预期在不同高通量测序方法的进一步发展后增加。
鉴定过多出现的核酸杂质
在本发明的一个实施方案中，将如上所述获得的随机读段与用于产生组合物的方法中使用的生物组分的核苷酸序列进行比较，其中随机读段与来自生物组分的核苷酸序列的比较导致过多出现的核酸杂质的鉴定。生物组分的该核苷酸序列可以是可疑或不可疑来源的核苷酸序列。
核苷酸序列的可疑来源可以选自以下的核苷酸序列组成的组：宿主细胞核苷酸序列、质粒核苷酸序列、载体核苷酸序列和辅助病毒核苷酸序列。优选地，其中所述辅助病毒是腺病毒和/或单纯疱疹病毒和/或其中所述载体是杆状病毒载体。在一个优选实施方案中，核苷酸序列的可疑来源是杆状病毒载体。在根据本发明的方法中，随机读段因此与核苷酸序列的可疑来源对齐或比较，其导致过多出现的核酸杂质的鉴定。
可替代地或与前述实施方案组合，核苷酸序列的来源是核苷酸序列的不可疑来源，即核苷酸序列的来源不是预定的。核苷酸序列的不可疑来源可以通过根据本发明的方法获得的随机读段的重新组装来检索，并且将这些组装的核苷酸序列与核苷酸序列数据库进行比较。这样的核苷酸序列数据库可以是私人或可公开获得的核苷酸序列数据库。可公开获得的核苷酸序列数据库的实例包括但不限于UCSC Genome Bioinformatics、GenBank、DDBJ、ENA等。将组装的序列与私人或可公开获得的数据库中的序列进行比较可以导致核酸杂质的鉴定。
在本发明的优选方法中，用于产生组合物的方法中使用的生物组分的核苷酸序列是核苷酸序列的可疑来源。特别地，在一个优选实施方案中，生物组分的核苷酸序列选自以下核苷酸序列组成的组：宿主细胞核苷酸序列、质粒核苷酸序列、除重组细小病毒载体外的载体核苷酸序列和辅助病毒核苷酸序列。特别地，生物组分的核苷酸序列不包含细小病毒载体的核苷酸序列。
根据本发明的宿主细胞可以是用于产生组合物的方法中使用的任何细胞。宿主细胞可以选自：植物细胞、细菌细胞、酵母细胞和动物细胞。优选地，宿主细胞是动物细胞，并且更优选地，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞或昆虫宿主细胞。在本发明的一个最优选的实施方案中，宿主细胞是昆虫宿主细胞。用于产生组合物的方法中使用的宿主细胞的核苷酸序列包含基因组DNA和/或线粒体DNA。优选地，宿主细胞的核苷酸序列包含基因组DNA。基因组DNA可以包含选自以下的基因组成的组中的基因：转基因、编码Rep的基因、编码Cap的基因和编码具有用于产生组合物的辅助功能的蛋白质或RNA的基因。编码具有用于产生组合物的辅助功能的蛋白质或RNA的这种基因可以衍生自动物病毒如腺病毒和/或单纯疱疹病毒、或昆虫病毒如杆状病毒。可替代地或组合地，基因组DNA可以包含ITR序列。在一个优选实施方案中，宿主细胞的基因组DNA包含侧翼为至少一个ITR的转基因，并且优选地，转基因在每一侧上侧翼为ITR。
根据本发明的质粒可以是用于产生组合物的方法中使用的任何质粒。质粒优选包含选自以下基因组成的组中的基因：抗性基因、转基因、编码Rep的基因、编码Cap的基因和编码具有用于产生组合物的辅助功能的蛋白质或RNA的基因。可替代地或组合地，质粒可以包含ITR序列。在一个优选实施方案中，质粒包含侧翼为至少一个ITR的转基因，并且优选地，转基因在每一侧上侧翼为ITR。
根据本发明的载体可以是用于产生组合物的方法中使用的任何载体。载体可以选自：质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。在本发明的一个优选实施方案中，载体是病毒载体。在最优选的实施方案中，载体是杆状病毒载体。用于产生组合物的方法中使用的杆状病毒载体可以包含选自以下的基因组成的组中的基因：转基因、编码Rep的基因、编码Cap的基因和编码具有用于产生组合物的辅助功能的蛋白质的基因。可替代地或组合地，杆状病毒载体可以包含ITR序列。在一个优选实施方案中，杆状病毒载体包含侧翼为至少一个ITR的转基因，并且优选地，转基因在每一侧上侧翼为ITR。
根据本发明的辅助病毒可以是用于产生组合物的方法中使用的任何病毒。在一个优选实施方案中，辅助病毒用于生产细小病毒病毒体的方法中。在一个进一步优选的实施方案中，辅助病毒用于产生重组腺相关病毒体(rAAV)的方法中。在更优选的实施方案中，辅助病毒是腺病毒和/或单纯疱疹病毒。在一个最优选的实施方案中，辅助病毒是重组腺病毒和/或重组单纯疱疹病毒。在一个进一步的实施方案中，辅助病毒包含选自以下的基因组成的组中的基因：转基因、编码Rep的基因、编码Cap的基因和编码具有用于产生组合物的辅助功能的蛋白质的基因。可替代地或组合地，辅助病毒可以包含ITR序列。在一个优选实施方案中，辅助病毒包含侧翼为至少一个ITR的转基因，并且优选地，转基因在每一侧上侧翼为ITR。
在一个优选实施方案中，用于产生组合物的方法中使用的生物组分的核苷酸序列来自杆状病毒载体。在一个最优选的实施方案中，来自生物组分的核苷酸序列来自包含转基因的杆状病毒载体，所述转基因侧翼为至少一个ITR，并且优选地，转基因侧翼为两个ITR。
与上述组合或可替代地，生物组分的核苷酸序列包含编码Rep、Cap和/或转基因的核苷酸序列，其中优选地，生物组分包含编码转基因的核苷酸序列，其中更优选地，生物组分包含编码转基因的核苷酸序列，所述转基因侧翼为至少一个细小病毒ITR，并且其中最优选地，生物组分包含编码转基因的核苷酸序列，所述转基因在每一侧上侧翼为至少一个细小病毒ITR。
使用核酸测序定量过多出现的核酸杂质
本发明公开了用于鉴定和定量组合物中过多出现的核酸杂质的方法，其中该方法包括对组合物进行核酸测序以获得核苷酸序列的随机读段的步骤。可以如上所述鉴定核酸杂质。随后可以通过确定组合物中过多出现的核酸杂质的每核酸的读段数目来定量所鉴定的核酸杂质。
每核酸的读段数目在本文中定义为与核苷酸序列的特定核酸对齐的读段。因此，组合物中核酸杂质的每核酸的读段数目被理解为与核酸杂质的核酸特异性对齐的读段数目。
与核苷酸序列的特定核酸对齐的读段数目转换成其中该特定核酸存在于组合物中的频率。因此，与特定核酸对齐的大量读段被理解为在组合物中丰富的核酸。可替代地，如果仅几个读段与特定核酸对齐，则应理解该核酸的存在在组合物中是罕见的。
根据本发明的方法，当读段分布不是随机的时，并且过多出现的杂质包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或50倍生物组分的平均读段数目时，或者当核酸杂质的每核酸的读段数目为细小病毒载体的每核酸的平均读段数目的至少0.0005、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0或10％时，核酸杂质是过多出现的。
每细小病毒载体的平均读段数目在本文中定义为与细小病毒载体对齐的总读段数目除以细小病毒载体的总核苷酸数目。优选地，当确定每细小病毒载体的平均读段数目时，不考虑细小病毒载体的25、50、75、100、200、300、400或500个最上游核苷酸的读段和核苷酸和/或细小病毒载体的25、50、75、100、200、300、400或500个最下游核苷酸的读段和核苷酸。这些读段可能不代表每细小病毒载体的平均读段数目，因为在对齐细小病毒载体的最上游和/或最下游核苷酸(即在载体的末端处)的读段数目中存在人为降低。
生物组分的平均读段数目在本文中定义为与生物组分对齐的读段总数目除以生物组分的总核苷酸数目。生物组分可以包含用于产生组合物的方法中使用的一种生物组分。更优选地，生物组分选自以下核苷酸序列组成的组：宿主细胞核苷酸序列、质粒核苷酸序列、除重组细小病毒载体外的载体核苷酸序列和辅助病毒核苷酸序列，其中优选地，载体是杆状病毒载体。最优选地，生物组分是杆状病毒载体。
在本发明的一个实施方案中，细小病毒载体的核苷酸数目可以包含细小病毒载体的完整核苷酸序列，例如，包括ITR序列、启动子序列、转基因序列、以及左侧ITR和右侧ITR之间的任何其他序列。在一个更优选的实施方案中，选择细小病毒载体的核苷酸序列的部分，以确定细小病毒载体的平均读段数目。细小病毒载体的这种部分可以包含ITR核苷酸序列、启动子序列和/或转基因序列。在一个最优选的实施方案中，选择转基因的序列以确定细小病毒载体的每核酸的平均读段数目，即与转基因对齐的读段数目除以转基因的核苷酸序列的核苷酸数目。
在本发明的另一个实施方案中，过多出现的核酸杂质在第二组合物或进一步的组合物中进行定量。在鉴定和定量第一组合物中过多出现的核酸杂质后，随后可以在进一步的组合物中定量过多出现的核酸杂质。第二组合物或进一步的组合物中过多出现的核酸杂质的定量可以如上所述确定。可替代地，可以通过适合于确定核酸杂质的量的任何其他方法来确定第二组合物或进一步的组合物中过多出现的核酸杂质的定量。用于定量特异性DNA片段的方法是本领域众所周知的，并且同样适用于定量在第二组合物或进一步的组合物中过多出现的核酸杂质。这些方法包括但不限于高通量测序、Q-PCR、有限循环PCR、杂交测定、微阵列和琼脂糖电泳。
细小病毒病毒体
在本发明的一个优选实施方案中，组合物包含细小病毒载体。特别地，在根据本发明的优选方法中，细小病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。细小病毒科的病毒是小DNA动物病毒。细小病毒科可以分为两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)和感染昆虫的浓核病毒亚科(Densovirinae)。细小病毒亚科的成员在本文中被称为细小病毒，包并且括依赖病毒属(Dependovirus)。从其属的名称可以推断，依赖病毒的成员是独特的，因为它们通常需要与辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒的共感染，用于细胞培养中的生产性感染。依赖病毒属包括通常感染人的AAV(例如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类动物(例如血清型1和4)，以及感染其他温血动物的相关病毒(例如牛、犬、马和绵羊腺相关病毒)。关于细小病毒和细小病毒科的其他成员的进一步信息在Kenneth I.Berns,"Parvoviridae:The Viruses and Their Replication,"Chapter 69in Fields Virology(第3版，1996)中描述。
所有已知AAV血清型的基因组组构都非常相似。AAV的基因组是长度小于约5,000个核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。反向末端重复(ITR)侧接非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列。VP蛋白(VP1、-2和-3)形成衣壳。末端145nt是自互补的，并且被组构成使得可以形成构成T形发夹的能量稳定的分子内双链体。这些发夹结构充当病毒DNA复制的起点，用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中的野生型(wt)AAV感染后，Rep基因(即Rep78和Rep52)分别由P5启动子和P19启动子表达，并且两种Rep蛋白都具有在病毒基因组的复制中的功能。Rep ORF中的剪接事件导致实际上四种Rep蛋白(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已显示哺乳动物细胞中编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接的mRNA对于AAV载体生产是足够的。另外在昆虫细胞中，Rep78和Rep52蛋白对于AAV载体生产也是足够的。
“细小病毒或AAV载体”(或“rAAV载体”)在本文中指包含一个或多个目的多核苷酸序列(例如编码目的产物的基因的表达构建体，即“转基因”)的核酸分子，所述多核苷酸序列侧翼为至少一个细小病毒或AAV反向末端重复序列(ITR)。当存在于表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中时，可以将这样的rAAV载体复制并包装到感染性病毒体内。细小病毒或AAV载体优选是重组核酸分子，即在自然界中不存在并且通过组合序列元件组成的核酸分子，所述组合序列元件不以该组合和/或顺序天然存在。
当将rAAV载体掺入更大的核酸构建体(例如在染色体或另一种载体，例如用于克隆或转染的质粒或杆状病毒中)内时，则rAAV载体通常被称为“原载体(pro-vector)”，其可以在AAV包装功能和必要的辅助功能的存在下通过复制和包壳进行“拯救”。
优选地，目的基因产物在任一侧上侧翼为AAV ITR。任何AAV ITR都可以用于本发明的方法中，包括来自AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9和/或AAVrh10的ITR。AAV2的ITR是最优选的。用于本发明的优选核酸构建体中的优选ITR序列的实例在SEQ ID NO：1(左侧或上游ITR)和SEQ ID NO：2(右侧或下游ITR)中给出。
AAV能够感染许多哺乳动物细胞。参见例如Tratschin等人(1985,Mol.CellBiol.5:3251-3260)和Grimm等人(1999,Hum.Gene Ther.10:2445-2450)。然而，人滑膜成纤维细胞的AAV转导比类似的鼠细胞中明显更有效，Jennings等人，Arthritis Res，3:1(2001)，并且AAV的细胞向性在血清型中不同。参见，例如讨论AAV向性修改的方法的Goncalves,2005,Virol J.2(1):43。
用于本发明方法中的rAAV载体可以在哺乳动物细胞或昆虫细胞中产生。两种方法在本领域中均得到描述。例如Grimm等人(2003Molecular Therapy 7(6):839-850)公开了以无辅助病毒和光学可控的方式产生AAV载体的策略，其基于仅将两种质粒转染到293T细胞内。他们公开了用于生产包含AAV2Rep蛋白、AAV2ITR和AAV5衣壳蛋白的混合AAV载体的方法。本参考文献全文包括在本文中。进一步信息也可以在Blits等人(2010)(Journal ofNeuroscience methods 185(2):257-263)中找到。
术语“混合型(hybrid)”和“假型的(pseudotyped)”在本文中可互换使用，并且用于指示其Rep蛋白、ITR和/或衣壳蛋白具有不同血清型的载体。例如，ITR和Rep蛋白是AAV2的，并且衣壳蛋白是AAV5的。术语“嵌合的”在本文中用于描述单个基因，例如衣壳，由衍生自不同血清型的至少两个序列组成。
AAV生产方法
根据本发明的组合物中的rAAV载体可以使用用于rAAV的经典生产方法来产生。这种经典生产方法是基于靶/生产细胞的瞬时转染方案(Merten等人，Gene Ther,2006,,12:S51–S61)。这是一种反式互补和瞬时转染方法，其需要下述遗传元件：(i)rAAV基因组的序列。rAAV基因组的序列可以克隆到质粒(所谓的病毒载体质粒)内。该病毒载体质粒通常包含至少一个ITR和用于表达转基因的表达盒；(ii)编码rep和cap的序列，和(iii)由天然辅助病毒如腺病毒和/或单纯疱疹病毒编码的所需辅助功能。
例如，可以根据下述方法在哺乳动物细胞中产生rAAV，但不限于所述方法：载体基因组含有侧翼为衍生自AAV血清型2的两个反向末端重复(ITR)的转基因表达盒。病毒载体基因组的总长度可以不超过4.7kB的野生型基因组大小，以便维持有效的包装效率。单个衣壳由比例为1:1:10的VP1(62kDa)、VP2(73kDa)或VP3(87kDa)的60个病毒蛋白组成。AAV载体的制造过程基于将两种质粒Ca(PO4)2转染到滚瓶(850cm2表面积)中的人胚肾生产细胞(HEK293)内，随后为通过过滤和层析技术纯化包壳的载体基因组。第一质粒是病毒载体质粒，并且含有侧翼为AAV2ITR的表达构建体。第二质粒是包装质粒，并且编码所需血清型的AAV rep 2型和cap 5型基因以及腺病毒早期辅助基因E2A、VA、E4(pDP5；SEQ ID NO:3中公开的核苷酸序列)。生产细胞系的基因组包括腺病毒E1以提供辅助功能。在含有10％胎牛血清(FCS)的Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)中与两种质粒共转染后，将细胞在无血清的Dulbecco's modified Eagle's Eagle培养基(DMEM)中温育3天以允许载体生产发生。滚瓶中的载体生产平均导致每个细胞3x103个载体基因组或每个滚瓶4x1011个载体基因组(通过qPCR定量)的得率。随后，通过含有Triton-X-100的缓冲液裂解细胞培养物，并且通过低速离心去除细胞碎片。澄清的本体通过AVB Sepharose亲和层析纯化，并且通过使用400kDa中空纤维模块(例如来自Spectrum Laboratories)的浓缩和渗滤配制到PBS/5％蔗糖内。
可替代地，根据本发明的组合物中的rAAV可以以主要是转染不依赖性方法产生。这种方法可以基于在诱导后产生rAAV的包装/生产细胞系的使用，或杆状病毒/昆虫细胞系统的使用。
包装细胞可以容纳所有必需的AAV遗传元件的部分，例如AAV辅助序列rep和cap。来自包装细胞系的rAAV生产的后续诱导可以通过含有rAAV序列的质粒(病毒载体质粒)的转染进行，随后引入编码所需辅助功能的序列，例如用(复制缺陷型)腺病毒或单纯疱疹病毒的感染。生产细胞系可以是完整的反式互补系统，其容纳整合到其基因组内的所有必需的AAV衍生组分，即AAV辅助序列(rep-cap)连同病毒载体序列。rAAV生产的诱导可以在引入编码所需辅助功能的序列后发生。
另一方面，包含至少一个ITR和用于表达转基因的表达盒的rAAV基因组的序列可以嵌入辅助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒的基因组中，分别生成rAAV/Ad-混合系统(Thorne等人，2009；Hum.Gene Ther.20；707-714)或rAAV/HSV-混合系统(Clement等人，2009；Hum.Gene ther.20；796-806.；Ye等人，2014；Hum.Gene Ther.15；1-6)。
可替代地，用于本发明的方法中的AAV载体可以在昆虫细胞中产生，如先前已通过Urabe等人描述(Journal of Virology 2006 80(4):1874-1885)。在该系统中，rAAV基因组的序列可以克隆到重组杆状病毒内。
包含细小病毒载体的组合物中的DNA杂质可以衍生自用于产生组合物的方法中使用的任何生物组分。组合物可以根据如上概述的任何方法产生。
优选地，在根据本发明的方法中，生物组分的核苷酸序列选自下述核苷酸序列组成的组：宿主细胞核苷酸序列、质粒核苷酸序列、载体核苷酸序列和辅助病毒核苷酸序列。在一个优选实施方案中，生物组分包含下述遗传元件中的至少一种：(i)rAAV基因组的序列，优选包含至少一个ITR和用于表达转基因的表达盒；(ii)编码rep和/或cap的序列，和/或(iii)编码所需辅助功能的序列，其由辅助病毒如腺病毒和/或单纯疱疹病毒天然编码。更优选地，生物组分包含至少一个ITR和用于表达转基因的表达盒。
在根据本发明的优选方法中，载体是杆状病毒载体。杆状病毒科(Baculoviridae)是大的有包膜DNA病毒家族。杆状病毒优先感染节肢动物，其中绝大多数允许物种落入鳞翅目(Lepidoptera)内。允许体外杆状病毒繁殖的几种连续细胞系如Sf9、Sf21或High Five是商购可得的，并且可以用于产生根据本发明的组合物。
衍生自苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)的重组杆状病毒是生物技术中最常用的，特别是用于生产重组蛋白或病毒样颗粒(VLP即缺乏病毒核酸的壳)。
基于杆状病毒表达载体系统(BEVS)的生产的主要优点可以总结如下：(i)非常强的启动子(多角体蛋白(polyhedrine)或p10)的存在使得能够生产大量的异源蛋白质而没有基因大小限制；(ii)昆虫细胞具有进行主要的翻译后修饰的能力，从而允许生产生物活性蛋白质；和(iii)杆状病毒技术可以容易地实施，放大可容易地实现，细胞生长悬浮，并且各种无血清培养基是商购可得的。
组装病毒颗粒是比表达单一蛋白质更复杂的过程。然而，已显示使用BEVS可以成功地生产基于HBV、B19细小病毒、轮状病毒、人乳头瘤病毒的VLP。此外，杆状病毒表达载体系统可以用于生产rAAV(Merten等人，同上，Urabe等人，2002)。
因此，在本发明的方法中，可以使用杆状病毒表达载体系统在哺乳动物细胞或昆虫细胞中产生细小病毒病毒体。优选地，使用杆状病毒表达载体系统在昆虫细胞中产生细小病毒病毒体。
在本发明的一个优选实施方案中，杆状病毒载体包含编码Rep、Cap和/或转基因的核苷酸序列，其中优选地，杆状病毒载体包含编码转基因的核苷酸序列，其中更优选地，杆状病毒载体包含编码转基因的核苷酸序列，所述转基因侧翼为至少一个细小病毒ITR，并且其中最优选地，杆状病毒载体包含编码转基因的核苷酸序列，所述转基因在每一侧上侧翼为至少一个细小病毒ITR。
另外，先前公开的Rep以及VP1、VP2和VP3序列中的修饰也可以用于本发明，例如国际公开WO 2007/046703、WO 2007/148971、WO 2009/014445、WO 2009/104964和/或WO2011/112089中公开的实例。
可以用于产生rAAV载体的本发明方法中的AAV ITR和Rep序列可以衍生自任何AAV血清型的基因组。一般地，AAV血清型在氨基酸和核酸水平上具有基因组序列的显著同源性。这提供了一组相同的遗传功能，以产生基本上物理和功能等价的病毒体。对于各种AAV血清型的基因组序列和基因组相似性的概述，参见例如GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chiorini等人(1997,J.Vir.71:6823-33)；Srivastava等人(1983,J.Vir.45:555-64)；Chiorini等人(1999,J.Vir.73:1309-1319)；Rutledge等人(1998,J.Vir.72:309-319)；和Wu等人(2000,J.Vir.74:8635-47)。rAAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12可以用作在本发明的上下文中使用的AAV核苷酸序列的来源。rAAV血清型1、2、3、4和5是AAV核苷酸序列的优选来源。优选地，在本发明的上下文中的AAV ITR序列衍生自AAV1、AAV2和/或AAV5。更优选地，在本发明的方法中的ITR序列是AAV2ITR。同样地，Rep(Rep78/68和Rep52/40)编码序列优选衍生自AAV1、AAV2和/或AAV5，更优选衍生自AAV2
AAV Rep和ITR序列在大部分血清型中是特别保守的。各种AAV血清型的Rep78蛋白为例如超过89％相同，并且AAV2、AAV3A、AAV3B、和AAV6之间在基因组水平上的总核苷酸序列相同性为大约82％(Bantel-Schaal等人，1999，J.Virol.，73(2):939-947)。此外，许多AAV血清型的Rep序列和ITR已知在哺乳动物细胞中产生AAV颗粒方面有效地交叉互补(即，功能性地替代)来自其他血清型的相应序列。US2003148506报道了AAV Rep和ITR序列在昆虫细胞中也有效地交叉互补其他AAV Rep和ITR序列。
AAV VP蛋白质已知确定AAV病毒体的细胞向性。VP蛋白编码序列在不同的AAV血清型中显著地不如Rep蛋白和基因那样保守。在一个优选实施方案中，rAAV载体包含VP1蛋白。Rep和ITR序列交叉互补其他血清型的相应序列的能力，允许产生包含一种血清型(例如AAV5)的衣壳蛋白和另一种AAV血清型(例如AAV2)的Rep和/或ITR序列的假型rAAV颗粒。这种假型rAAV颗粒是本发明方法的部分。在本文中，假型rAAV颗粒可以被称为“x/y”类型，其中“x”指示ITR的来源，并且“y”指示衣壳的血清型，例如2/5rAAV颗粒具有来自AAV2的ITR和来自AAV5的衣壳。
经修改的“AAV”序列也可以用于本发明的上下文中，例如用于在昆虫细胞中产生rAAV载体。此类经修改的序列例如包括与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9的ITR、Rep、或VP具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或更高的核苷酸和/或氨基酸序列相同性的序列(例如，具有约75至约99％核苷酸序列相同性的序列)，可以用于替换野生型AAV的ITR、Rep、或VP序列。
可以根据需要修饰ITR、Rep和Cap序列，以获得rAAV或假型rAAV载体在细胞如昆虫细胞中的有效产生。例如，可以修改Rep序列的起始密码子，可以修饰或消除VP剪接位点，和/或可以修饰VP1起始密码子，以改善(昆虫)细胞中的rAAV载体产生，如例如WO 2007/046703、WO 2007/148971和/或WO 2009/014445中公开的。本发明中还包括的是嵌合AAV衣壳，其中例如AAV5的VP1部分或完全替换为衍生自AAV2的VP1，并且VP2和3衍生自AAV5(Urabe等人，2006；WO2000/028004)。如由Russell(2000,J.Gen.Virol.81:2573-2604)综述的或，如US20080008690以及通过Zaldumbide和Hoeben(Gene Therapy 2008:239-246)描述的，修饰优选的腺病毒载体以减少宿主应答。
优选地，包含在根据本发明的基因治疗载体内的AAV Rep蛋白是AAV血清型2Rep蛋白。甚至更优选地，具有SEQ ID NO:4的核酸序列和/或根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的Rep78蛋白用于本发明中，并且具有SEQ ID NO:6的核酸序列的Rep52蛋白用于本发明中。
定量过多出现的核酸杂质
可替代地或与如上所述的任何实施方案组合，本发明进一步涉及过多出现的核酸杂质的定量。特别地，本发明涉及特异性DNA杂质在包含细小病毒载体的组合物中过多出现的发现。这些DNA杂质包含在细小病毒病毒体的生产过程期间紧侧接细小病毒核苷酸序列的ITR的核苷酸序列。因此，例如，在细小病毒病毒体中，左侧细小病毒ITR上游的序列和/或右侧细小病毒ITR下游的序列是过多出现的。
因此，在另一个方面，本发明涉及用于定量包含细小病毒载体的组合物中的核酸杂质的方法，其中所述方法包括确定核酸杂质的相对丰度的步骤，当ITR序列在用于产生组合物的方法中使用的生物组分中存在时，所述核酸杂质包含定位紧邻细小病毒ITR序列1-8000bp、1-5000bp、1-3000bp、1-1000bp、1-500bp、1-250bp或1-100bp之间的核苷酸序列，并且其中所述生物组分包含侧翼为细小病毒ITR序列的至少一个拷贝的转基因。在另一个实施方案中，本发明涉及用于定量包含细小病毒载体的组合物中的核酸杂质的方法，其中所述方法由确定核酸杂质的相对丰度的步骤组成，当ITR序列在用于产生组合物的方法中使用的生物组分中存在时，所述核酸杂质包含定位紧邻细小病毒ITR序列1-8000bp、1-5000bp、1-3000bp、1-1000bp、1-500bp、1-250bp或1-100bp之间的核苷酸序列，并且其中所述生物组分包含侧翼为细小病毒ITR序列的至少一个拷贝的转基因。
如上所述，在细小病毒病毒体的生产过程期间，细小病毒序列可以存在于宿主细胞、质粒、载体和/或辅助病毒中，其中优选地，载体是杆状病毒载体。细小病毒序列可以包含ITR的至少一个拷贝和用于表达转基因的表达盒。过多出现的DNA杂质可以包含紧侧接一个或多个细小病毒ITR的任何序列，例如基因组序列、质粒序列、载体序列或辅助病毒的序列。DNA杂质的类型因此依赖于在细小病毒病毒体的生产期间侧接ITR的序列。例如，如果在杆状病毒载体中存在包含ITR的至少一个拷贝和优选转基因的细小病毒序列，则紧侧接一个或多个ITR的杆状病毒序列在包含细小病毒载体的组合物中是过多出现的。
在本发明的一个实施方案中，核酸杂质在包含细小病毒载体的组合物中进行定量。用于定量核酸杂质的方法可以包括本领域已知的用于定量核酸的任何方法。这些方法包括但不限于高通量测序、Q-PCR、有限循环PCR、杂交测定、微阵列和琼脂糖电泳。
在一个进一步的实施方案中，生物组分如上所述定义。特别地，生物组分选自由宿主细胞、质粒、除重组细小病毒载体外的载体和辅助病毒组成的组。优选地，生物组分包含细小病毒序列，其中优选地，细小病毒序列包含至少一个ITR和编码转基因的核苷酸序列。最优选地，生物组分包含编码转基因的核苷酸序列，所述转基因在每一侧上侧翼为至少一个细小病毒ITR。
在最优选的实施方案中，生物组分是载体，并且其中载体是杆状病毒载体。杆状病毒载体优选包含细小病毒序列。该细小病毒序列优选包含至少一个ITR和编码转基因的核苷酸序列。最优选地，杆状病毒载体包含编码转基因的核苷酸序列，所述转基因在每一侧上侧翼为至少一个细小病毒ITR。
在根据本发明的方法中，核酸杂质包含核苷酸序列，当存在于用于产生组合物的方法中使用的生物组分中时，所述核苷酸序列定位在紧邻细小病毒ITR序列1-10000bp、1-9000bp 1-8000bp、1-7000bp、1-6000bp1-5000bp、1-4000bp、1-3000bp、1-2000bp 1-1000bp、1-800bp、1-600bp、1-500bp、1-400bp、1-250bp或1-100bp之间。DNA杂质的长度可以取决于其他随机包装的DNA杂质的存在和/或转基因的大小，因为存在细小病毒病毒体的最大包装能力。然而，已知细小病毒病毒体可以掺入比其自身基因组长度更长的DNA序列(Grieger等人，J Virol.200579(15):9933-44)。
在本发明的一个优选实施方案中，细小病毒载体是如上所述的重组腺相关病毒(rAAV)载体。此外，可以使用如先前描述的任何生产方法来产生rAAV病毒体。
在另一个实施方案中，当ITR序列存在于用于产生组合物的方法中使用的生物组分中时，核酸杂质的核苷酸序列在细小病毒ITR序列的每一侧上紧邻定位。存在于生物组分中的细小病毒序列可以包含在转基因的每一侧上侧翼为至少一个ITR的转基因。在这种情况下，核酸杂质可以包含存在于ITR的一侧上的核苷酸序列，即仅紧邻左侧ITR或仅紧邻右侧ITR。可替代地，核酸杂质的核苷酸序列可以包含存在于ITR两侧上的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，当ITR序列存在于用于产生组合物的方法中使用的生物组分中时，核酸杂质包含定位紧邻细小病毒ITR序列的核苷酸序列。“紧邻”在本文中如下定义：在转基因上游的ITR的情况下，“紧邻”意指在ITR上游至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40或50bp终止的任何核苷酸序列。在ITR位于转基因下游的情况下，紧邻”意指在ITR下游至少0、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40或50bp开始的任何核苷酸序列。
相对丰度
在本发明的一个实施方案中，该方法包括确定核酸杂质的相对丰度的步骤。相对丰度在本文中定义为与相同或另一组合物中的第二核酸分子(的部分)的存在相比，第一核酸分子(的部分)的存在。在相对丰度在两种或更多种组合物之间确定的情况下，第二核酸分子可以包含与第一核酸分子相同的核苷酸序列或另一核苷酸序列。在相对丰度在一种组合物中确定的情况下，第一第二核酸分子包含至少部分不同的核苷酸序列。
在本发明的方法中，核酸杂质和第二核酸分子之间的相对丰度优选在相同的组合物中确定，尽管核酸杂质的相对丰度在不同的组合物中确定也是本发明的一个实施方案。在本发明的优选方法中，相对丰度与组合物中的细小病毒载体和/或参考序列的核苷酸序列相比进行确定。优选地，转基因和/或参考序列存在于与核酸杂质相同的组合物中。
细小病毒载体的核苷酸序列可以包含细小病毒载体的任何序列，例如完整的细小病毒载体，或转基因的核苷酸序列(的部分)、启动子或ITR。然而，细小病毒载体的任何其他核苷酸序列都可以同样适用于本发明的方法中。
参考序列可以是任何合适的核苷酸序列(的部分)。优选地，参考序列是看家基因的序列(的部分)、生物组分的核苷酸序列和/或参考序列是用于掺料(spike)组合物的核酸的序列。
在参考序列是生物组分的序列的情况下，该序列并非紧侧接细小病毒ITR，并且参考序列优选衍生自用于产生组合物的方法中使用的宿主细胞、质粒或载体。优选地，参考序列衍生自包含转基因和至少一个ITR的相同生物学组分。更优选地，参考序列包括来自杆状病毒载体的序列，所述杆状病毒载体用于产生组合物的方法中，其包含转基因和至少一个ITR，并且所述参考杆状病毒序列并非紧侧接细小病毒ITR。
在参考序列是用于掺料组合物的核酸的情况下，预期在该组合物的生产之后该核酸不存在，但在稍后的时间点添加，但在确定核酸杂质的相对丰度之前。用于掺料组合物的核酸分子可以是任何合适的核酸分子，例如至少10、30、50、100、150、200、500、1000个或更多个碱基对的小直链或环状RNA或DNA分子。此类核酸分子可以包含编码区和/或非编码区。
在本发明的一个进一步的实施方案中，相对丰度通过以下确定：
a)如上定义的核酸杂质的每核酸的平均读段数目；和
i)参考序列的每核酸的平均读段数目；和/或
ii)组合物中的每细小病毒载体的平均读段数目；
其中读段数目通过如上概述的任何方法确定；和/或
b)扩增如上文定义的核酸杂质；和
i)参考序列；和/或
ii)细小病毒载体的核苷酸序列。
在一个优选实施方案中，平均读段数目如上所示定义。另外，细小病毒载体可以涉及细小病毒载体的任何序列，例如完整的细小病毒载体，或仅转基因的核苷酸序列(的部分)、启动子或ITR。此外，细小病毒载体的任何其他核苷酸序列可以同样适用于本发明的方法中。
在一个进一步的实施方案中，核酸杂质的相对丰度可以通过适合于确定如上所述的核酸分子的数量的任何方法来确定。更优选地，通过Q-PCR和/或通过高通量测序来确定相对丰度。导致核酸定量的任何Q-PCR方法或高通量测序方法都适用于本发明的方法中。Q-PCR方法(实时聚合酶链反应)是本领域众所周知的，并且该技术可以使用非特异性荧光染料或杂交探针。在本发明的一个优选实施方案中，用特异性杂交探针进行Q-PCR。
优选地，该方法进一步包括寡核苷酸引物与如上定义的核酸杂质的选择性杂交的步骤。
寡核苷酸引物与核酸杂质的选择性杂交被理解为意指寡核苷酸与核酸杂质形成生产性或正双链体。这种生产性或正双链体的形成被理解为寡核苷酸和核酸杂质之间的双链体形成，其在Q-PCR测定中通过扩增子的形成可以检测到。实际上，这意味着寡核苷酸引物的末端将与核酸杂质形成双链体，使得寡核苷酸可以通过聚合酶延伸或连接到相邻碱基配对的多核苷酸或寡核苷酸分子。如本文使用的，‘扩增子’涉及起因于扩增程序如PCR程序的具有确定的大小和序列的双链核酸片段。扩增子的大小由寡核苷酸引物与之结合的核酸双链体的两条链上的位点决定。如美国专利号4,683,195中说明的，在少量的扩增循环之后，产物核酸的片段成为扩增程序的普遍产物。另外，序列是对于核酸杂质‘特异性的’或‘选择性的’，只要它在给定实验情况中使用的条件下与靶序列有效地杂交，但不与并非如上定义的核酸杂质的任何序列杂交。
在一个优选实施方案中，寡核苷酸引物与包含杆状病毒序列或其互补体的部分的核酸杂质选择性杂交。术语第一序列的‘互补体’或‘互补序列’在本文中被理解为意指可以通过匹配碱基对与第一序列形成双链结构或双链体的第二序列，例如G-T-A-C的互补序列是C-A-T-G。
因此优选核酸杂质衍生自用于产生组合物的方法中使用的杆状病毒载体。特别地，优选这种杆状病毒载体包含侧翼为至少一个细小病毒ITR的转基因。在一个优选实施方案中，寡核苷酸引物与核酸杂质选择性杂交，其中核酸杂质包含杆状病毒衍生的核苷酸序列，当细小病毒ITR序列存在于杆状病毒载体中时，所述核苷酸序列定位紧邻细小病毒ITR序列1-10000bp、1-9000bp 1-8000bp、1-7000bp、1-6000bp 1-5000bp、1-4000bp、1-3000bp、1-2000bp 1-1000bp、1-800bp、1-600bp、1-500bp、1-400bp、1-250bp或1-100bp之间。
临床应用
包含细小病毒载体的组合物不应含有高度的核酸杂质，尤其是如果该组合物要用于医学治疗中。特别地，这种核酸杂质可以在通常已经脆弱的患者中引起不良反应，这可能导致严重的并发症。本发明涉及DNA杂质不随机包封在细小病毒病毒体内的发现。相反，在细小病毒病毒体的生产期间侧接ITR的序列是过多出现的。在另一个方面，本发明因此涉及确定包含细小病毒载体的组合物是否被视为临床上纯的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)根据如上概述的任何方法定量包含细小病毒载体的组合物中的核酸杂质；和
ii)如果通过核酸杂质的相对丰度确定，存在的如上定义的核酸杂质比参考序列和/或转基因少至少10、100、250、1000倍，则确定该组合物为临床上纯的。
临床上纯的在本文定义为药物高品质产品，其是对动物的施用视为安全的组合物，优选药物高品质产品是对哺乳动物的施用视为安全的产品，最优选地，组合物对人类的施用视为安全的。
在本发明的一个优选实施方案中，存在的如上定义的核酸杂质比转基因或参考序列少至少10、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、10.000或100.000倍。核酸杂质和转基因或参考序列的存在可以通过用于定量特定DNA序列的任何常规方法来定量。
临床上纯的在本文中进一步理解为包含细小病毒载体的组合物被视为对于临床治疗足够纯。特别地，根据本发明的临床上纯的组合物包含通过人用药品注册技术规定国际协调会议(International Conference on Harmonisation of TechnicalRequirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)(ICH)质量和安全指南要求的低度DNA杂质。优选地，DNA杂质的水平低于在患者中引起任何不良反应的水平。
在本文及其权利要求中，动词“包含”及其变体以其非限制的含义来使用，意指包括跟随该词的项目，但不排除未具体提及的项目。另外，通过不定冠词“一个”或“一种”提到元件并不排除存在超过一个元件的可能性，除非上下文清楚地要求有且只有一个该元件。因此，不定冠词“一个”或“一种”通常意指“至少一个/种”。
本说明书中引用的所有专利和文献参考均整体引入本文作为参考。
提供以下实施例仅用于举例说明的目的，而不是要以任何方式限制本发明的范围。
参考文献
1.Fujita,R.,Matsuyama,T.,Yamagishi,J.,Sahara,K.,Asano,S.和Bando,H.(2006)Expression of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirusgenes in mammalian cells and upregulation of the host beta-actin gene,J.Virol.80,2390-2395.
2.Liu,C.Y.,Wang,C.H.,Wang,J.C.和Chao,Y.C.(2007)Stimulation ofbaculovirus transcriptome expression in mammalian cells by baculoviraltranscriptional activators,J.Gen.Virol.88,2176-2184.
3.Laakkonen,J.P.,Kaikkonen,M.U.,Ronkainen,P.H.,Ihalainen,T.O.,Niskanen,E.A.,Hakkinen,M.,Salminen,M.,Kulomaa,M.S.,Yla-Herttuala,S.,Airenne,K.J.和Vihinen-Ranta,M.(2008)Baculovirus-mediated immediate-early geneexpression and nuclear reorganization in human cells,Cell Microbiol.10,667-681.
4.Blouin,V.,Brument,N.,Toublanc,E.,Raimbaud,I.,Moullier,P.和Salvetti,A.(2004)Improving rAAV production and purification:towards the definition ofa scaleable process,J.Gene Med.6Suppl 1,S223-S228
5.Nony,P.,Chadeuf,G.,Tessier,J.,Moullier,P.和Salvetti,A.(2003)Evidence for packaging of rep-cap sequences into adeno-associated virus(AAV)type 2capsids in the absence of inverted terminal repeats:a model forgeneration of rep-positive AAV particles,J.Virol.77,776-781.
6.Chadeuf,G.,Ciron,C.,Moullier,P.和Salvetti,A.(2005)Evidence forencapsidation of prokaryotic sequences during recombinant adeno-associatedvirus production and their in vivo persistence after vector delivery,Mol.Ther.12,744-753.
7.Wright,J.F.(2008)Manufacturing and characterizing AAV-based vectorsfor use in clinical studies,Gene Ther.15,840-848.
8.Arsalan Haseeb Zaidi,Patrick J.Bakkes,Jacek Lubelski,HerfitaAgustiandari,Oscar P.Kuipers和Arnold J.M.Driessen(2008)The ABC-Type MultidrugResistance Transporter LmrCD Is Responsible for an Extrusion-Based Mechanismof Bile Acid Resistance in Lactococcus lactis Journal of Bacteriology,7357–7366
9.Jean-Marie Rouillard,Michael Zuker和Erdogan Gulari(2003)OligoArray2.0:Design of oligonucleotide probes for DNA microarrays using athermodynamic approach,Nucleic Acids Research,Vol.31,No.12 3057-3062
10.Van Hijum SA.,de la Nava GJ,Trelles O.,Kok J.,Kuipers OP.,(2003)MicroPreP:a cDNA microarray data pre-processing framework.ApplBioinformatics,2(4):241-4
11.P.Baldi和A.D.Long,(2001)A Bayesian Framework for the Analysis ofMicroarray Expression Data:Regularized t-Test and Statistical Inferences ofGene Changes,Bioinformatics,17,6,509-519.
12.Krappa,R.,Roncarati,R.,Knebel-Morsdorf,D.,(1995)Expression ofPE38and IE2,Viral members of the C3HC4finger family,during baculovirusinfection:PE38and IE2localize to distint nuclear regions,J Virol,5287-5293.
13.Gerhard Schwarz,Stefan Annette Block,FriedrichG.Felsenstein和Gerhard Wenzel(2004)Determination of detection andquantification limits for SNP allele frequency estimation in DNA pools usingreal time PCR Nucleic Acids Research,Vol.32,No.3e24
14.Yaffe David,Saxel Ora,(1977)Serial passaging and differentiationof myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle,Nature 270,725-727
15.Manno,CS,Pierce,GF,Arruda,VR,Glader,B,Ragni,M,Rasko,J等人(2006).
Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-factor IX andlimitations
imposed by the host immune response.Nat Med 12:342–347.
16.Mingozzi,F,Maus,MV,Hui,DJ,Sabatino,DE,Murphy,SL,Rasko,JE等人(2007).
CD8+T-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans.NatMed 13:
419–422.
17.Christine L.Halbert*,Michael J.Metzger*,Siu-Ling Lam和A.DustyMiller(2011)Capsid-expressing DNA in AAV vectors and its elimination by useof an oversize capsid gene for vector production.Gene Ther.18(4):411-417
18.Bernd Hauck,Samuel L Murphy,Peter H Smith,Guang Qu,Xingge Liu,OlgaZelenaia,Federico Mingozzi,Jürg M Sommer,Katherine A High和J Fraser Wright(2009)Undetectable Transcription of cap in a Clinical AAV Vector:Implicationsfor Preformed Capsid in Immune Responses.Mol Ther.17(1)144-152
附图说明
图1.AAV1-转基因(上图)和杆状病毒DNA(中图和下图)对DNA酶I(DNAse I)的抗性。通过Q-PCR检测DNA的量，使用三个不同的引物组，不用或用DNA酶处理。对于每个引物组，测试两个分批。A)和B)引物组59/60，C)和D)引物组180/181，E)和F)引物组340/341。
图2.杆状病毒质粒Bac.VD的序列图。指示了使用的引物组和ITR。
图3.如不同引物组检测到的基因组拷贝的相对量。在轴上指示了扩增子的位置。扩增子5214-5284代表AAV-转基因盒的CMV启动子。扩增子73555-73604由引物组340/341靶向，并且定位离AAV-转基因盒最远。每个点代表一个测量。
图4.通过深度测序分析包含转基因的rAAV。将获得的读段与转基因(A)、cap盒(B)或rep盒(c)对齐。
图5.通过深度测序分析rAAV。将获得的读段与杆状病毒基因组对齐。描述的是杆状病毒主链的每核苷酸的读段分布。核苷酸1是右ITR，如图2所示。
图6.使用Q-PCR或者用Illumina或Roche 454的深度测序，测试了五个不同分批的rAAV载体的DNA杂质。
实施例
实施例1：制造的rAAV载体中的DNA杂质
1.1材料与方法
为了研究残留的DNA是否被包装在AAV1颗粒中，测试残留的DNA是否是DNA酶抗性的。用Benzonase(9U/mL)处理样品，并且使用Q-PCR分析DNA的量。
从样品中分离DNA，随后为使用三个不同的引物组(59/60、180/181、340/341)的Q-PCR。为了研究杆状病毒DNA的DNA酶抗性，对于某些样品，DNA酶步骤被省略(指示为不含DNA酶)。使用PLA分析来分析数据，并且对于每个样品，确定由不同引物组扩增的DNA量的比率。
使用具有靶向AAV1转基因载体的CMV启动子的引物组59/90的Q-PCR测定AAV1DNA的量。使用具有杆状病毒特异性引物的Q-PCR进行残留杆状病毒DNA的定量。使用两个不同的引物组进行实验；引物组180/181靶向接近AAV转基因盒的杆状病毒DNA的ORF 1629，并且引物组340/341靶向杆状病毒的hr3序列，检测定位远离AAV1-转基因盒的杆状病毒DNA。对于这些实验，包括两个标准：质粒标准系(pVD)和克隆VD的纯化的杆状病毒DNA。
为了使用引物组180/181确定杆状病毒DNA的量，具有引物组180/181的pVD用作标准。用OD测定确定pVD的浓度。为了使用引物组340/341确定杆状病毒DNA的量，具有引物组340/341的BacVD用作标准。使用引物组180/181以pVD作为标准，通过Q-PCR测定标准系的BacVD量。
使用下式计算DNA的量(gc/mL)：
[DNA]＝S·D·C
其中：
S＝测量的平均数量(gc)
D＝病毒DNA的稀释因子(500倍或1000倍)
C＝从10μl样品到1mL样品计算的校正因子(100)
为了计算以μg/mL表示的DNA量，将式扩展为：
其中：
X＝从g到μg的转化因子(106)
A＝阿伏伽德罗常数(6.022x1023)
Mw＝DNA的摩尔重量。杆状病毒基因组由135kbp的双链DNA组成。每bp的平均摩尔重量为649Da。作为杆状病毒DNA的Mw(在使用引物组180/181或340/341确定后)，使用135000.649＝8.76x107Da的Mw。
AAV1基因组由3630bp的单链DNA组成。为了计算AAV1DNA的量，使用3630bp·340Da＝1.23x106Da的Mw。
1.2结果
使用两个不同的引物组通过Q-PCR测定杆状病毒DNA的量。引物组180/181检测接近AAV转基因盒的ORF 1629中的序列，而引物组340/341的序列定位远离盒。表1中的结果显示两个引物组对于杆状病毒DNA的gc/mL量得到非常不同的值(引物组180/181平均起来比通过引物组340/341获得的值高20倍)。
表1.预期rAAV基因组和污染DAN的浓度
使用Q-PCR校正Bac.VD标准的浓度，因此可以排除该差异是标准相关的。因此，这些数据指示接近ITR的杆状病毒DNA(用引物组180/181检测到的)的存在远远超过远离ITR的DNA(由引物组340/341检测到的)。
实施例2：使用Q-PCR测定核酸杂质
2,1材料与方法
为了进一步研究样品中存在杆状病毒基因组的哪些部分以及不同序列量中的可能差异，进行了使用不同引物组的Q-PCR(参见图2)。对于每个引物组，实验中包括标准系。使用引物组59/60测定转基因拷贝的量。随后，确定与转基因拷贝相比的基因组拷贝的相对量。因为已知AAV颗粒可以掺入比其自身基因组的长度更长的DNA序列(Grieger等人，2005，Allocca等人，2008)，在侧接转基因盒的ORF的起点和末端以及ITR上下游10kb处选择引物。
2.2结果
使用引物组340/341来确定杆状病毒DNA的量，扩增定位接近杆状病毒的hr3序列的扩增子73555-73604。假设用这些引物确定的基因组拷贝的量代表整个杆状病毒基因组。然而，使用靶向更接近AAV-转基因盒的序列的不同引物组的类似实验显示，当扩增子定位更接近含有ITR的AAV-转基因盒时，发现更高数目的基因组拷贝(图3)。因为已知AAV可以包装更大的DNA序列(高达8.9kb，甚至可能更高(Allocca等人，2008))，所以我们预期这些序列被包装在颗粒内。这意味着存在两种残留杆状病毒DNA序列；1)随机序列，如我们用引物组340/341确定的，其仅以转基因的基因组拷贝量的0.1％发现，和2)在距离转基因盒10kb内(在AAV包装限度范围内)的杆状病毒序列，其以转基因基因组拷贝量的1至2.5％之间发现。这两个序列均可能包装在AAV1颗粒内或与衣壳相关联。
实施例3：使用下一代测序确定核酸杂质
3.1材料与方法
为了研究制造的rAAV载体中DNA杂质的程度和起源，通过深度测序分析了四个不同分批的rAAV载体。使用Nucleospin提取II试剂盒(Macherey Nagel，Düren，德国)从这些rAAV载体中分离DNA。
该DNA用于制备深度测序文库。
为了产生分开的测序特征，进行原位杂交。通过初始材料的有限稀释来实现聚簇。DNA片段被解链，并且单链被捕获在流动池内部，所述流动池被引物的齿状草坪(denslawn)覆盖。随后的局部扩增(桥式PCR)导致形成每平方微米大约1000个相同分子的簇。碱基掺入通过加入引物、聚合酶和四种荧光标记的脱氧核苷酸三磷酸开始。dNTP充当可逆终止子，即每个循环中每个分子只加入单个碱基。测量簇荧光以鉴定已掺入的碱基。绿色激光鉴定碱基G和T的掺入，并且读段激光器鉴定碱基A和C。两个不同的滤光器分别用于区分G/T和A/C。在信号检测之后，去除荧光体和核苷酸的末端修饰(Dohm,J.C.,Lottaz,C.,Borodina,T.和Himmelbauer,H.(2008),Nucleic Acids Res.36,e105；Shendure,J.和Ji,H.(2008),Nat.Biotechnol.26,1135-1145；Rothberg,J.M.和Leamon,J.H.(2008),Nat.Biotechnol.26,1117-1124；Kahvejian,A.,Quackenbush,J.和Thompson,J.F.(2008),Nat.Biotechnol.26,1125-1133)。该方法可以特别用于确定何种类型的序列作为杂质存在以及特定序列群体之间的比例为何。分析通过ServiceXS(Leiden)进行。
标准的下一代测序实验导致>20,000,000个短读段，其需要与参考序列对齐或从头组装以便产生重叠群。此处，在对总内容物测序时，读段与许多参考序列对齐。这些参考序列表示已知存在于rAAV载体制剂中的DNA分子。这包括预期的基因组和生产相关的DNA杂质。对齐由CLC_bio对准器进行。在实验中以其读段每个碱基的频率提供了关于与其他测量序列相比其相对发生的信息。对于每个参考序列检索每个核苷酸的读段(图4)。一般公认当参考序列的核苷酸读段超过8-12次时，序列信息具有高置信水平(Schuster,S.C.(2008),Nat.Methods 5,16-18)。
3.2结果
总DNA测序用于分析不同AAV分批的DNA组成。分析由Baseclear(Leiden，荷兰)基于Ilumina GAI-II的单个读段测序程序进行。借助于CLC_bio生物信息学软件分析了所得到的质量修改的原始序列数据。将读段参考组装到代表rAAV载体制剂中潜在存在的DNA分子的参考序列上，即杆状病毒主链、cap特异性、rep特异性和转基因特异性DNA。预期大多数>99.7％的所生成的～20,000,000个读段组装为预期的DNA转基因盒和已知的生产相关DNA杂质。未组装为任何所提及的参考序列的所有其他序列(低于0.3％)可以表示测序误差、接头多聚化、低质量读段和其他DNA序列。
对于转基因盒、cap盒、rep盒和杆状病毒基因组检索每个核苷酸的计数，并且针对核苷酸数目标绘(参见图4和图5)。每个核苷酸的读段频率的分布在不同分批制剂之间高度一致。此外，显而易见的是，杆状病毒基因组的分布不是随机的。侧接ITR的基因组区段是明显过多出现的(图5)。
我们已使用从测序实验检索的读段的平均分布作为用于计算rAAV制剂中发现的各种DNA序列的相对发生的输入(表2)。
表2 5个不同rAAV批次中平均读段分布(S)
| 批次#1 | 批次#2 | 批次#3 | 批次#4 | 批次#5 | |
| 转基因盒 | 569837 | 588620 | 600677 | 589597 | 544717 |
| 杆状病毒 | 1184 | 1449 | 1236 | 1316 | 1087 |
| Cap盒 | 60 | 47 | 43 | 102 | 46 |
| Rep盒 | 460 | 676 | 596 | 691 | 562 |
表2显示了每个给定序列检索的平均频率(S)。这些频率相对于样品中的主要DNA，即表3中的转基因盒呈现。给定杂质的百分比根据下文给出的式相对于转基因盒计算，并且考虑到大小校正因子。
Xbac＝Sbac/S转基因*Cbac*100％
其中：
Xbac-杆状病毒相对于转基因盒的DNA杂质的百分比
Sbac-对于杆状病毒主链检索的的平均计数
S转基因-对于转基因盒检索的平均计数
Cbac-分子长度校正因子，其中Cbac＝杆状病毒主链长度(nt)/转基因盒长度(nt)
表3与转基因盒相比，各种DNA杂质的相对丰度。不同分子的平均计算距离(S)相对于计算分布转基因(S转基因)呈现
| S转基因/S转基因 | Sbac/S转基因 | Scap/S转基因 | Srep/S转基因 | |
| 批次#1 | 1 | 2.077E-03 | 1.048E-04 | 8.073E-04 |
| 批次#2 | 1 | 2.462E-03 | 8.068E-05 | 1.148E-03 |
| 批次#3 | 1 | 2.057E-03 | 7.207E-05 | 9.918E-04 |
| 批次#4 | 1 | 2.232E-03 | 1.727E-04 | 1.173E-03 |
| 批次#5 | 1 | 1.996E-03 | 8.467E-05 | 1.031E-03 |
表4相对于lpl盒，各种AAV批次中存在的各种杂质的百分数(基于文中所述的公式)
实施例4：DNA杂质的非随机分布
4.1材料与方法
下一步是确定杆状病毒获得的DNA杂质的确切来源。为此，不同分批的rAAV载体在如上所述的Illumina平台上进行深度测序。读段与杆状病毒基因组的对齐提供了检查深度测序文库中的每个(杆状病毒衍生的)核苷酸频率的手段。另外，通过将映射到杆状病毒基因组的总读段数目除以核苷酸数目来计算平均频率。
4.2结果
图5描述了深度测序后读段与杆状病毒基因组的对齐。如果DNA杂质随机衍生自杆状病毒基因组，则应该观察到相对均等的分布，其中每个核苷酸约有1200个读段。在杆状病毒基因组的中间确实可见均等分布。然而，在杆状病毒基因组的开始和结束处，观察到读段数目中的强烈增加。这指示这些区域在rAAV中作为DNA杂质过多出现。
实施例5：使用Q-PCR或深度测序的质量控制评价
5.1材料与方法
为了研究不同NGS方法，即Solexa和454Roche的定量能力，将所获得的NGS读段分布与使用qPCR跨越杆状病毒基因组的各种靶的测量进行比较(图6)。QPCR靶代表区域：高度过多出现的(180/181)，匹配平均分布(426/427，428/429；1018/1019；1020/1021；1024/1025)和出现不足的(340/341)。后一个区域用作所有其他测量的校准器。
5.2结果
研究了三种不同的技术来测试rAAV载体中DNA杂质的水平。如图6所示，三种技术彼此良好关联，并且因此可以并行地用于检测rAAV载体中的DNA杂质。
如图6所示，NGS分析清楚地证实，用于定量PCR的DNA扩增子的随机选择可以导致载体制剂中特定DNA杂质的不准确测量。假设所研究的DNA分子(其有时长136000bp，例如杆状病毒主链)的所有部分都以相同的频率分布，基于扩增子测量计算给定DNA杂质的存在。此处呈现的分析清楚地指示，长DNA分子的各个区段例如杆状病毒基因组可能由于不同DNA序列的不均等包装而以不同频率污染载体制剂。
表5实验中所用的Q-PCR引物
序列表
<110> 优尼科IP有限公司
<120> 包含细小病毒病毒体的组合物中的DNA杂质
<130> p6042305pct
<160> 34
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 145
<212> DNA
<213> adeno-associated virus 2
<220>
<221> misc_feature
<223> upstream ITR
<400> 1
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 2
<211> 183
<212> DNA
<213> adeno-associated virus 2
<220>
<221> misc_feature
<223> downstream ITR
<400> 2
gcgcggtacc ccatggagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct 60
cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg 120
gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca agatatccca tggggtaccg 180
cgc 183
<210> 3
<211> 2203
<212> DNA
<213> adeno-associated virus 5
<220>
<221> misc_feature
<223> pDP5
<400> 3
atgtcttttg ttgatcaccc tccagattgg ttggaagaag ttggtgaagg tcttcgcgag 60
tttttgggcc ttgaagcggg cccaccgaaa ccaaaaccca atcagcagca tcaagatcaa 120
gcccgtggtc ttgtgctgcc tggttataac tatctcggac ccggaaacgg tctcgatcga 180
ggagagcctg tcaacagggc agacgaggtc gcgcgagagc acgacatctc gtacaacgag 240
cagcttgagg cgggagacaa cccctacctc aagtacaacc acgcggacgc cgagtttcag 300
gagaagctcg ccgacgacac atccttcggg ggaaacctcg gaaaggcagt ctttcaggcc 360
aagaaaaggg ttctcgaacc ttttggcctg gttgaagagg gtgctaagac ggcccctacc 420
ggaaagcgga tagacgacca ctttccaaaa agaaagaagg ctcggaccga agaggactcc 480
aagccttcca cctcgtcaga cgccgaagct ggacccagcg gatcccagca gctgcaaatc 540
ccagcccaac cagcctcaag tttgggagct gatacaatgt ctgcgggagg tggcggccca 600
ttgggcgaca ataaccaagg tgccgatgga gtgggcaatg cctcgggaga ttggcattgc 660
gattccacgt ggatggggga cagagtcgtc accaagtcca cccgaacctg ggtgctgccc 720
agctacaaca accaccagta ccgagagatc aaaagcggct ccgtcgacgg aagcaacgcc 780
aacgcctact ttggatacag caccccctgg gggtactttg actttaaccg cttccacagc 840
cactggagcc cccgagactg gcaaagactc atcaacaact actggggctt cagaccccgg 900
tccctcagag tcaaaatctt caacattcaa gtcaaagagg tcacggtgca ggactccacc 960
accaccatcg ccaacaacct cacctccacc gtccaagtgt ttacggacga cgactaccag 1020
ctgccctacg tcgtcggcaa cgggaccgag ggatgcctgc cggccttccc tccgcaggtc 1080
tttacgctgc cgcagtacgg ttacgcgacg ctgaaccgcg acaacacaga aaatcccacc 1140
gagaggagca gcttcttctg cctagagtac tttcccagca agatgctgag aacgggcaac 1200
aactttgagt ttacctacaa ctttgaggag gtgcccttcc actccagctt cgctcccagt 1260
cagaacctgt tcaagctggc caacccgctg gtggaccagt acttgtaccg cttcgtgagc 1320
acaaataaca ctggcggagt ccagttcaac aagaacctgg ccgggagata cgccaacacc 1380
tacaaaaact ggttcccggg gcccatgggc cgaacccagg gctggaacct gggctccggg 1440
gtcaaccgcg ccagtgtcag cgccttcgcc acgaccaata ggatggagct cgagggcgcg 1500
agttaccagg tgcccccgca gccgaacggc atgaccaaca acctccaggg cagcaacacc 1560
tatgccctgg agaacactat gatcttcaac agccagccgg cgaacccggg caccaccgcc 1620
acgtacctcg agggcaacat gctcatcacc agcgagagcg agacgcagcc ggtgaaccgc 1680
gtggcgtaca acgtcggcgg gcagatggcc accaacaacc agagctccac cactgccccc 1740
gcgaccggca cgtacaacct ccaggaaatc gtgcccggca gcgtgtggat ggagagggac 1800
gtgtacctcc aaggacccat ctgggccaag atcccagaga cgggggcgca ctttcacccc 1860
tctccggcca tgggcggatt cggactcaaa cacccaccgc ccatgatgct catcaagaac 1920
acgcctgtgc ccggaaatat caccagcttc tcggacgtgc ccgtcagcag cttcatcacc 1980
cagtacagca ccgggcaggt caccgtggag atggagtggg agctcaagaa ggaaaactcc 2040
aagaggtgga acccagagat ccagtacaca aacaactaca acgaccccca gtttgtggac 2100
tttgccccgg acagcaccgg ggaatacaga accaccagac ctatcggaac ccgatacctt 2160
acccgacccc tttaacccat tcatgtcgca taccctcaat aaa 2203
<210> 4
<211> 1876
<212> DNA
<213> adeno-associated virus 2
<220>
<221> CDS
<222> (11)..(1876)
<400> 4
cgcagccgcc atg ccg ggg ttt tac gag att gtg att aag gtc ccc agc 49
Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser
1 5 10
gac ctt gac gag cat ctg ccc ggc att tct gac agc ttt gtg aac tgg 97
Asp Leu Asp Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp
15 20 25
gtg gcc gag aag gaa tgg gag ttg ccg cca gat tct gac atg gat ctg 145
Val Ala Glu Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu
30 35 40 45
aat ctg att gag cag gca ccc ctg acc gtg gcc gag aag ctg cag cgc 193
Asn Leu Ile Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg
50 55 60
gac ttt ctg acg gaa tgg cgc cgt gtg agt aag gcc ccg gag gcc ctt 241
Asp Phe Leu Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu
65 70 75
ttc ttt gtg caa ttt gag aag gga gag agc tac ttc cac atg cac gtg 289
Phe Phe Val Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val
80 85 90
ctc gtg gaa acc acc ggg gtg aaa tcc atg gtt ttg gga cgt ttc ctg 337
Leu Val Glu Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu
95 100 105
agt cag att cgc gaa aaa ctg att cag aga att tac cgc ggg atc gag 385
Ser Gln Ile Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu
110 115 120 125
ccg act ttg cca aac tgg ttc gcg gtc aca aag acc aga aat ggc gcc 433
Pro Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala
130 135 140
gga ggc ggg aac aag gtg gtg gat gag tgc tac atc ccc aat tac ttg 481
Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu
145 150 155
ctc ccc aaa acc cag cct gag ctc cag tgg gcg tgg act aat atg gaa 529
Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu
160 165 170
cag tat tta agc gcc tgt ttg aat ctc acg gag cgt aaa cgg ttg gtg 577
Gln Tyr Leu Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val
175 180 185
gcg cag cat ctg acg cac gtg tcg cag acg cag gag cag aac aaa gag 625
Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu
190 195 200 205
aat cag aat ccc aat tct gat gcg ccg gtg atc aga tca aaa act tca 673
Asn Gln Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser
210 215 220
gcc agg tac atg gag ctg gtc ggg tgg ctc gtg gac aag ggg att acc 721
Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr
225 230 235
tcg gag aag cag tgg atc cag gag gac cag gcc tca tac atc tcc ttc 769
Ser Glu Lys Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe
240 245 250
aat gcg gcc tcc aac tcg cgg tcc caa atc aag gct gcc ttg gac aat 817
Asn Ala Ala Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn
255 260 265
gcg gga aag att atg agc ctg act aaa acc gcc ccc gac tac ctg gtg 865
Ala Gly Lys Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val
270 275 280 285
ggc cag cag ccc gtg gag gac att tcc agc aat cgg att tat aaa att 913
Gly Gln Gln Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile
290 295 300
ttg gaa cta aac ggg tac gat ccc caa tat gcg gct tcc gtc ttt ctg 961
Leu Glu Leu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu
305 310 315
gga tgg gcc acg aaa aag ttc ggc aag agg aac acc atc tgg ctg ttt 1009
Gly Trp Ala Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe
320 325 330
ggg cct gca act acc ggg aag acc aac atc gcg gag gcc ata gcc cac 1057
Gly Pro Ala Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His
335 340 345
act gtg ccc ttc tac ggg tgc gta aac tgg acc aat gag aac ttt ccc 1105
Thr Val Pro Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro
350 355 360 365
ttc aac gac tgt gtc gac aag atg gtg atc tgg tgg gag gag ggg aag 1153
Phe Asn Asp Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys
370 375 380
atg acc gcc aag gtc gtg gag tcg gcc aaa gcc att ctc gga gga agc 1201
Met Thr Ala Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser
385 390 395
aag gtg cgc gtg gac cag aaa tgc aag tcc tcg gcc cag ata gac ccg 1249
Lys Val Arg Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro
400 405 410
act ccc gtg atc gtc acc tcc aac acc aac atg tgc gcc gtg att gac 1297
Thr Pro Val Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp
415 420 425
ggg aac tca acg acc ttc gaa cac cag cag ccg ttg caa gac cgg atg 1345
Gly Asn Ser Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met
430 435 440 445
ttc aaa ttt gaa ctc acc cgc cgt ctg gat cat gac ttt ggg aag gtc 1393
Phe Lys Phe Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val
450 455 460
acc aag cag gaa gtc aaa gac ttt ttc cgg tgg gca aag gat cac gtg 1441
Thr Lys Gln Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val
465 470 475
gtt gag gtg gag cat gaa ttc tac gtc aaa aag ggt gga gcc aag aaa 1489
Val Glu Val Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys
480 485 490
aga ccc gcc ccc agt gac gca gat ata agt gag ccc aaa cgg gtg cgc 1537
Arg Pro Ala Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg
495 500 505
gag tca gtt gcg cag cca tcg acg tca gac gcg gaa gct tcg atc aac 1585
Glu Ser Val Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn
510 515 520 525
tac gca gac agg tac caa aac aaa tgt tct cgt cac gtg ggc atg aat 1633
Tyr Ala Asp Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn
530 535 540
ctg atg ctg ttt ccc tgc aga caa tgc gag aga atg aat cag aat tca 1681
Leu Met Leu Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser
545 550 555
aat atc tgc ttc act cac gga cag aaa gac tgt tta gag tgc ttt ccc 1729
Asn Ile Cys Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro
560 565 570
gtg tca gaa tct caa ccc gtt tct gtc gtc aaa aag gcg tat cag aaa 1777
Val Ser Glu Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys
575 580 585
ctg tgc tac att cat cat atc atg gga aag gtg cca gac gct tgc act 1825
Leu Cys Tyr Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr
590 595 600 605
gcc tgc gat ctg gtc aat gtg gat ttg gat gac tgc atc ttt gaa caa 1873
Ala Cys Asp Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln
610 615 620
taa 1876
<210> 5
<211> 621
<212> PRT
<213> adeno-associated virus 2
<400> 5
Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu
50 55 60
Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu
85 90 95
Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile
100 105 110
Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu
115 120 125
Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly
130 135 140
Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys
145 150 155 160
Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Gln Tyr Leu
165 170 175
Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His
180 185 190
Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn
195 200 205
Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr
210 215 220
Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys
225 230 235 240
Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala
245 250 255
Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys
260 265 270
Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln
275 280 285
Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu
290 295 300
Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala
305 310 315 320
Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala
325 330 335
Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro
340 345 350
Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp
355 360 365
Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala
370 375 380
Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg
385 390 395 400
Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val
405 410 415
Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser
420 425 430
Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe
435 440 445
Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln
450 455 460
Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val
465 470 475 480
Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala
485 490 495
Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val
500 505 510
Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp
515 520 525
Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu
530 535 540
Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Ile Cys
545 550 555 560
Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu
565 570 575
Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr
580 585 590
Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp
595 600 605
Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln
610 615 620
<210> 6
<211> 1194
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<213> Artificial
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<223> AAV2 Rep52 AcMNPV optimized
<220>
<221> misc_feature
<223> AcMNPV optimized Rep52 coding sequence
<400> 6
atggaattgg tcggttggtt ggtggacaag ggtattacct cggagaagca atggatacaa 60
gaagatcaag cctcatacat ctcgtttaat gcggcatcca actcgcgtag ccaaatcaaa 120
gctgccttgg acaatgcggg caagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180
gtgggccagc aacccgtgga agacatttcc agcaatcgca tctataagat tttggagtta 240
aacggctacg atcctcaata tgcggcttcc gtatttttgg gctgggcgac gaaaaagttt 300
ggcaaaagaa acaccatttg gttgtttgga cctgcaacta cgggaaaaac aaacatagcg 360
gaggccatag cccacactgt acctttttat ggctgcgtta actggaccaa tgagaacttt 420
ccattcaacg actgtgtcga caagatggtt atttggtggg aggaaggcaa aatgaccgct 480
aaagtcgtgg agtcggccaa agcaatttta ggaggcagca aagtgcgcgt agaccagaaa 540
tgcaaaagct ctgcgcagat agacccgaca ccggtgatcg ttacaagcaa cacgaacatg 600
tgcgccgtga ttgacggtaa cagtacgaca ttcgaacacc aacaaccgtt gcaagaccga 660
atgttcaaat ttgaattgac gcgccgactg gatcatgatt ttggcaaggt aacaaaacaa 720
gaagtcaaag acttctttcg ttgggcaaag gatcacgttg ttgaagtgga acatgaattt 780
tacgtcaaaa aaggtggtgc taagaaaaga cccgccccga gtgatgcaga tataagtgag 840
cccaaacgag tgagagaatc ggttgcgcag ccaagcacgt cagatgcgga agcttcgata 900
aactacgcag accgctacca aaacaaatgt tctcgtcacg taggcatgaa cttaatgttg 960
tttccctgca gacaatgtga gagaatgaat cagaatagta atatctgttt cactcacggc 1020
cagaaagact gtttagaatg ctttccggtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtaaaa 1080
aaggcgtatc aaaaattatg ctatattcat catatcatgg gaaaagtgcc agacgcttgt 1140
actgcctgcg atctggttaa tgtggatttg gatgactgta tctttgaaca ataa 1194
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gcatttcgca gctctccttc aatt 24
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aacgatcaag ctgttaataa acg 23
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cgctataagc gcgggttac 19
17
18
Claims (3)
1.一种确定包括含转基因的细小病毒载体的组合物是否被视为临床上纯的方法，并且其中所述方法包括以下步骤：a）对所述组合物进行高通量测序以获得核苷酸序列的随机读段；b）将来自步骤a）的随机读段与用于产生所述组合物的方法中使用的生物组分的核苷酸序列进行比较，通过随机读段和生物组分的核苷酸序列之间的匹配鉴定核酸杂质，其中所述生物组分的核苷酸序列选自以下核苷酸序列组成的组：宿主细胞核苷酸序列、质粒核苷酸序列、除重组细小病毒载体外的载体的核苷酸序列和辅助病毒的核苷酸序列；c）确定每细小病毒载体的平均读段数目；和d）确定过多出现的核酸杂质的每核苷酸读段数目，其中当核酸杂质的每核苷酸读段数目为每细小病毒载体的平均读段数目的至少0.001%时，核酸杂质被鉴定为过多出现的杂质，且如果通过过多出现核酸杂质的相对丰度确定，存在的核酸杂质比所述转基因少至少10倍，则确定所述组合物为临床上纯的；其中所述细小病毒载体是重组腺相关病毒载体；其中所述除重组细小病毒载体外的载体是杆状病毒载体；且其中所述辅助病毒是重组腺病毒。
2.根据权利要求1的方法，其中所述过多出现的核酸杂质在第二组合物或进一步的组合物中进行定量。
3.根据权利要求1的方法，其中包含所述含转基因的细小病毒载体的所述组合物是药物组合物。
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| WO2022188797A1 (en) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Huigene Therapeutics Co., Ltd. | Engineered crispr/cas13 system and uses thereof |
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| WO2023283962A1 (en) | 2021-07-16 | 2023-01-19 | Huigene Therapeutics Co., Ltd. | Modified aav capsid for gene therapy and methods thereof |
| WO2024057210A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Augmedics Ltd. | Augmented reality eyewear for image-guided medical intervention |
| CN117660534B (zh) * | 2023-12-13 | 2024-05-07 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种降低重组腺相关病毒中宿主细胞dna残留的辅助质粒及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101018858A (zh) * | 2004-06-01 | 2007-08-15 | 建新公司 | 防止aav载体聚集的组合物和方法 |
| WO2011112089A2 (en) * | 2010-03-11 | 2011-09-15 | Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. | Mutated rep encoding sequences for use in aav production |
| WO2014007120A1 (ja) * | 2012-07-06 | 2014-01-09 | タカラバイオ株式会社 | アデノ随伴ウイルスベクターの産生細胞 |
| WO2014144486A2 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Vectors comprising stuffer/filler polynucleotide sequences and methods of use |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| DK0834575T3 (da) * | 1990-12-06 | 2002-04-02 | Affymetrix Inc A Delaware Corp | Identifikation af nucleinsyrer i prøver |
| ES2340230T3 (es) | 1998-11-10 | 2010-05-31 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Vectores viricos y sus procedimientos de preparacion y administracion. |
| JP2003511037A (ja) * | 1999-10-01 | 2003-03-25 | ジェノボ， インコーポレイテッド | ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むアデノウイルスを使用する組換えＡＡＶの産生 |
| US6723551B2 (en) | 2001-11-09 | 2004-04-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of adeno-associated virus in insect cells |
| SI2657248T1 (sl) | 2003-06-19 | 2017-07-31 | Genzyme Corporation | AAV virioni z zmanjšano imunoreaktivnostjo in njihova uporaba |
| PT3272872T (pt) | 2005-10-20 | 2020-06-26 | Uniqure Ip Bv | Vetores aav melhorados produzidos em células de insetos |
| CN103849629B (zh) | 2006-06-21 | 2017-06-09 | 尤尼克尔Ip股份有限公司 | 具有经修饰的用于在昆虫细胞中产生aav的aav‑rep78翻译起始密码子的载体 |
| RU2487935C2 (ru) * | 2006-09-15 | 2013-07-20 | Медиммун, Ллк. | Линии клеток почки собаки майдин-дэрби (mdck), поддерживающие рост вирусов до высоких титров, и способ применения этих клеток в биореакторе |
| BRPI0814459B1 (pt) | 2007-07-26 | 2023-01-24 | Uniqure Ip B.V | Método para produzir um vírion parvoviral recombinante em uma célula de inseto, e, construção de ácido nucleico |
| WO2009104964A1 (en) | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Amsterdam Molecular Therapeutics B.V. | Optimisation of expression of parvoviral rep and cap proteins in insect cells |
| AU2011209743B2 (en) * | 2010-01-28 | 2016-03-10 | The Children's Hospital Of Philadelphia | A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy |
| KR101334072B1 (ko) * | 2010-11-25 | 2013-11-29 | 한국표준과학연구원 | 핵산 정량 방법 및 키트 |
| US10294519B2 (en) | 2011-07-19 | 2019-05-21 | Hitachi High-Technologies Corporation | Method and apparatus for nucleic acid analysis |
| FR2986239A1 (fr) | 2012-01-31 | 2013-08-02 | Univ Strasbourg | Biomarqueur pour les maladies inflammatoires pulmonaires chroniques |
| KR101890466B1 (ko) | 2012-07-24 | 2018-08-21 | 내테라, 인코포레이티드 | 고도의 다중 ｐｃｒ 방법 및 조성물 |
| PT3224376T (pt) | 2014-11-28 | 2019-10-25 | Uniqure Ip Bv | Impurezas de dna numa composição compreendendo um vírus parvoviral. |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101018858A (zh) * | 2004-06-01 | 2007-08-15 | 建新公司 | 防止aav载体聚集的组合物和方法 |
| WO2011112089A2 (en) * | 2010-03-11 | 2011-09-15 | Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. | Mutated rep encoding sequences for use in aav production |
| WO2014007120A1 (ja) * | 2012-07-06 | 2014-01-09 | タカラバイオ株式会社 | アデノ随伴ウイルスベクターの産生細胞 |
| WO2014144486A2 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Vectors comprising stuffer/filler polynucleotide sequences and methods of use |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Evidence for Encapsidation of Prokaryotic Sequences during Recombinant Adeno-Associated Virus Production and Their in Vivo Persistence after Vector Delivery;Gilliane Chadeuf et al;《MOLECULAR THERAPY》;20051001;第12卷(第04期);第744-753页 * |
| Integration Frequency and Intermolecular Recombination of rAAV Vectors in Non-human Primate Skeletal Muscle and Liver;Ali Nowrouzi et al;《MOLECULAR THERAPY》;20120630;第20卷(第06期);第1179页右栏第2段，第1184页右栏第3段 * |
| Native Molecular State of Adeno-Associated Viral Vectors Revealed by Single-Molecule Sequencing;Philipp Kapranov et al;《HUMAN GENE THERAPY》;20120101;第23卷(第01期);摘要，第47页左栏第5段，第48页左栏第2-3段，第52页左栏最后1段、右栏第1段、表1 * |
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