CN113227386A

CN113227386A - Kir 7.1基因治疗载体及其使用方法

Info

Publication number: CN113227386A
Application number: CN201980081804.XA
Authority: CN
Inventors: B·帕特耐克; P·夏希
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2018-10-10
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2021-08-06
Also published as: EP3864160A1; AU2019357602A1; JOP20210067A1; WO2020077091A1; IL282181A; US20210348196A1; CA3115782A1; JP2022512667A; EP3864160A4

Abstract

本发明涉及用于表达Kir7.1的基因治疗构建体和药物组合物。这些基因治疗构建体包含载体，所述载体包含与编码Kir7.1多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子。还提供了对患有与Kir7.1多肽的表达或功能不足相关联的病症的受试者进行治疗的方法。

Description

KIR 7.1基因治疗载体及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年10月10日提交的美国临时专利申请第62/743,623号的优先权，该临时专利申请的全部内容以引用的方式并入本文中。

关于联邦政府资助研究的声明

本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的EY024995的政府支持下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。

序列表

名为“960296_03962_ST25.txt”的序列表的ASCII文本文件的内容(其大小为34.2kb)是于2019年10月9日创建并经由EFS-Web以电子方式提交，其全部内容以引用的方式并入本文中。

背景技术

莱伯氏先天性黑矇(LCA)是以出生时视力严重丧失为特征的遗传性儿科形式的失明。患有LCA的儿童还会显示多种其他异常，包括飘忽眼动(眼球震颤)、眼睛深陷、对强光敏感、和中枢神经系统异常。通常，在婴儿出生后的头几个月内，父母注意到缺乏视觉反应和眼球震颤。尽管患有LCA的婴儿的视网膜看起来正常，但通过视网膜电图(ERG)在视网膜中检测到很少(如果有的话)的活动。然而，在青春期的早期会检测到视网膜外观的各种变化，包括视网膜色素上皮(RPE)中的色素变化和血管收缩的存在。

LCA通常以常染色体隐性遗传的方式在家族中传递。在外部视网膜感光细胞和视网膜色素上皮(RPE)中表达的至少21个基因中的突变与LCA有关。在过去的十年中，已在患有特定形式LCA(称为LCA16)的患者中鉴定出了人KCNJ13基因中的常染色体隐性遗传突变(在染色体基因座2q37.1上的603203)。迄今为止，LCA16致病性等位基因变异体包括：c.158G>A (p.Trp53Ter)、c.359T>C(p.Iso120Thr)、c.458C>T(p.Thr153Iso)、c.496C>T(p.Arg166Ter)和 c.722T>C(p.Leu241Pro)。另外，已知复合杂合KCNJ13突变c.314G>T(p.Ser105Iso)和 c.655C>T(p.G219Ter)会导致LCA患者中的早发性视网膜营养不良⁵。常染色体显性KCNJ13 突变c.484C>T(p.Arg162Trp)导致称为雪花玻璃体视网膜变性(SVDOMIM-193230)的早发性失明。

人KCNJ13基因编码向内整流钾通道-Kir7.1。Kir7.1蛋白在数个人体组织中被表达，包括RPE的细胞顶端过程(cell apical process)，其中该过程调节视网膜的功能和健康。Kir7.1通道在其他器官中的作用仍有待阐明。

尽管在如LCA16的疾病中正开始了解Kir7.1的作用，但没有经批准的疗法用以治疗与 Kir7.1蛋白的表达或功能不足有关的通道病或疾病。因此，在本领域中需要用于治疗这种疾病的新疗法。

发明内容

在本发明的一方面，提供了基因治疗载体。基因治疗载体可包含可操作地与编码Kir7.1 多肽的多核苷酸连接的启动子。

在另一方面，本发明涉及治疗组合物。这些治疗组合物可包含本文中所述的任何基因治疗载体、及药学上可接受的载体。

在本发明的另一个方面，提供对患有与Kir7.1多肽的表达或功能不足相关的疾病的受试者进行治疗的方法。所述方法可包括向受试者施用治疗有效量的本文中所述基因治疗载体中的任一种或者本文中所述治疗组合物中的任一种。

附图说明

图1A-图1N示出了具有LCA16表型的患者来源的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮。 (图1A)示出了具有正常TGG序列(SEQ ID NO:19)的成熟视网膜色素上皮细胞的图(明视场像)。表示样本来源的家族谱。(图1B)示出了来源于具有TAG序列的LCA16先证者的成熟视网膜色素上皮细胞的明视场像。(SEQ ID NO:20)(图1C)示出了无克隆性异常的患者样本中的正常核型。(图1D)示出了对来自对照LCA16和野生型人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮系和人胎儿视网膜色素上皮细胞的Nhe1消化产物的分析。全长Kir7.1序列的长度为1083bp，经消化产物的长度为925和158bp。(图1E)示出了人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中的视网膜色素上皮细胞特异性基因表达。(图1F)示出了代表性LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞的电子显微照片。(图1G)示出了在10μm的细胞内部的平均线粒体(Mit) 计数的比较。(图1H)示出了对视网膜色素上皮顶端(AP)过程的平均长度的评估。(图1I)示出了在对照人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中Kir7.1(红色)、ZO-1(绿色)和DAPI(蓝色) 的免疫荧光定位。下方格和侧方格两者示出了有关于ZO-1和DAPI的Kir7.1的极化分布(z 堆栈图像)。(图1J)示出了在LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮中的Kir7.1(红色)、 ZO-1(绿色)和DAPI(蓝色)的定位。(图1K)是蛋白质印迹结果，这些结果示出了在两个组织样本中视网膜色素上皮细胞特异性蛋白的表达。使用针对Kir7.1的C末端特异性抗体，我们在来自对照人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮的全细胞裂解物中检测到Kir7.1蛋白，但在 LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮的全细胞裂解物中未检测到Kir7.1蛋白。示出了在对照人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮(图1L)和LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮(图1M)样本中的吞噬体(红色)定位。(图1N)示出了饲养4小时后和随后的48小时消化期或者在饲养1天接着消化6天后，在对照和病变人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中的固定的200μm²区域内的平均吞噬体计数的图。

图2A-图2N示出了经过无义突变抑制或基因扩增的推定Kir7.1功能丧失缓解。(图2A) 示出了在对照人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮单元中使用正常外部K+(黑色)或高外部 Rb+(浅蓝色)的Kir7.1电流的平均电流-电压(I/V)曲线图。(图2B)示出了在LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中使用正常K+(红色)和高Rb+(浅蓝色)的平均I/V曲线。(图2C) 示出了在-150mV处测量的向内电流幅值的平均图。颜色表示如a和b中所示。(图2D)示出了对照(黑色)细胞与去极化LCA16(红色)视网膜色素上皮细胞的平均膜电位的比较。(图2E) 示出了在用NB84处理之前(红色)和之后(深蓝色)的平均I/V关系。在Rb+中测量的电流被显示为浅蓝色迹线。对在-150mV处测量的平均内向电流(图2F)、和膜电位(图2G)的评估，用以展示NB84的作用。(图2H)示出了使用抗GFP抗体作为阱使GFP融合蛋白沉淀，并且银染色显示了全长Kir7.1和W53X蛋白的经纯化组分带。GFP对照样本显示较小的蛋白产物。 (图2I)细胞裂解物的蛋白质印迹分析显示了当用GFP特异性抗体进行探测时的各个条带。在 NB84处理后观察到全长蛋白产物的部分修复。(图2J)示出了在表达人Kir7.1克隆的正常拷贝的GFP阳性细胞中所测量的Kir7.1电流的平均I/V曲线图。示出了K+(绿色)和Rb+(浅蓝色) 迹线两者。在-150mV处测量的电流幅值(图2K)、和膜电位(图2L)的平均图，用以显示出基因扩增后的挽救。(图2M)是经培养LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮，显示了野生型Kir7.1(绿色)、ZO-1(红色)和DAPI(蓝色)蛋白。在下方框和侧方框中示出了Z堆栈平面。(图 2N)示出了在使用抗GFP抗体的基因扩增后所检测的LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中的Kir7.1蛋白表达的蛋白质印迹分析。

图3A-图3D示出了患者来源的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞的表型。对照人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞(图3A)和LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞(图3B)的电子显微照片的比较，显示了正常的柱状形态以及基底褶、大核、线粒体(m)、黑素体和完整的顶端膜以及扩展过程(ap)。在x-y-z维度中的实时对照人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮(图3C)和患者来源的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮(图3D)细胞的图像，显示了在用荧光标记牛POS饲养细胞1天的6天后成像的POS(红色)和细胞核(蓝色)。在LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中可见更多的未消化的红色荧光POS颗粒。

图4A-图4D表明人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮的亚群显示膜电位的挽救，但未显示电流幅值。(图4A)是用100μM NB84处理细胞后，正常K+林格氏液和高Rb+林格氏液中LCA16 hiPSC-RPE细胞亚组的平均电流响应的I/V图。(图4B)示出了用500μM NB84处理后在LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮中的K+和Rb+电流响应的I/V图。(图4C)示出了膜电位的平均图，显示了用100或500μM NB84处理LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮后膜电位恢复至对照水平。(图4D)电流幅值图清楚地表明用100或者500μM NB84处理后电流幅值中没有恢复。

图5A-图5D示出了在CHO细胞中异位表达的Trp53Ter的通读。如在LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中，经转导的CHO细胞仅在用NB84处理后向内整流由Rb+ 激活的Kir7.1电流。(图5A)是显示用NB84处理后的K+(黑色)和Rb+(红色)电流的细胞的I/V图，该图示出了电流幅值和膜电位的恢复。(图5B)是一组经NB84处理的细胞，显示了K+(黑色)和Rb+(红色)的稍微呈线性的I/V图，仅示出了膜电位但未示出电流幅值的恢复。示出了在表达Trp53Ter的CHO细胞的处理后，电流幅度(图5C)和膜电位(图5D)的平均恢复率的比较。

图6A-图6D示出了功能性挽救所需的野生型蛋白表达的程度的测定。我们对于恢复通道功能需要多少基因扩增/修正的定量尤其感兴趣。我们在CHO细胞中单独地或以各种组合表达了Trp53Ter或者野生型Kir7.1蛋白。(图6A)将当前的记录显示为I/V图。(图6B)在x轴的扩展刻度上静息膜电位显示负位移，其中野生型蛋白质仅占蛋白表达的20％。(图6C)示出了归一化电流幅值(实心圆)或者膜电位(灰色条)的平均图，其是作为野生型蛋白表达增加的函数。实线最适合于使用图6D中所示方程式的分配。获得了半峰值电流以及约26％的野生型蛋白表达。(图6D)是指示半最大响应和希尔坡度的最佳拟合曲线的值。

图7A-图7D示出了对各治疗方式中的膜电位的恢复的比较。(图7A)在x轴的扩大标度内，对照(黑色)和LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮(红色)的静息膜电位在I/V图中显示正位移。(图7B)就LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞(红色迹线)而言，使用 NB84的处理使I/V图位移至阴性(蓝色)。(图7C)平均I/V的图还示出了基因增强后静止电位的负位移(绿色)。(图7D)静息膜电位的柱状图比较显示，在用NB84处理后或基因扩增后，LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮的恢复至对照水平。

图8示出了来自野生型(左图)和W53X突变体(右图)稳定细胞的全细胞电流-电压关系。 Rb+(红色迹线)显著地增加了野生型稳定细胞中向内整流K+电流(黑色迹线)。在右侧的W53X 突变稳定细胞中，未记录到K+电流也未记录到Rb+电流(p＝1.05E-0.5)。

图9A-图9E显示表达W53X突变体的CHO细胞的基因扩增具有平均向内整流K+电流的恢复(图9A是与之前没有电流相比，红色轨迹中的IV曲线)(图9A示出了黑色轨迹中的IV曲线)。(图9B)示出了基因增强后W53X突变体表达细胞中的平均较高Rb+电流(红色迹线)。(图9C)示出了基因增强后经过Kir7.1通道的Rb+通透性的净增加(蓝色)。(图9D)示出了以蓝方框方式所给出的W53X表达细胞的AAV-Kir7.1转导后的静息膜电位(RMP)的完全恢复。(图 9E)是蛋白质印迹结果，示出了基因扩增后在泳道W53X+AAV(红色条带)中全长蛋白产物的表达。

图10A-图10B示出了在经由AAV-Kir7.1进行基因扩增后在W53X突变系中的Kir7.1表达(绿色)(图10A)。(图10B)较高放大图像示出了在膜标志物WGA-Alexa 594旁边的Kir7.1蛋白的膜定位。在下方框中的是红色和绿色的线扫描，示出了膜标志物与Kir7.1共定位。

图11示出了体内Kir7.1基因疗法。在左侧的是对照小鼠，该对照小鼠显示视网膜电图的正常波形并且在基因扩增后没有变化。在中间的是有条件性敲除小鼠，在右侧黑色迹线中未显示c波。在基因治疗后4周，直接依赖于Kir7.1表达的该波被完全地恢复。箱形图中示出了平均结果，并且在实验性基因治疗中c波有显著恢复。

图12示出了用于递送Kir7.1蛋白的示例性AAV病毒载体的载体图。

图13示出了用于递送Kir7.1蛋白的示例性慢病毒病毒载体的载体图。

图14A-图14F展示了在基因治疗后缺乏Kir7.1蛋白的视网膜色素上皮(RPE)细胞的功能恢复。(图14A)示出了在WT小鼠和cKO对照小鼠上的注射对照，描绘了用PBS注射8周后的视网膜色素上皮反应功能。(图14B)示出了来自Kir7.1 cKO小鼠的视网膜电图响应，其在筛选期间未显示a波、b波和c波。用携带组成型EF1a启动子或者视网膜色素上皮特异性VMD2启动子的慢病毒递送Kir7.1不能拯救视网膜色素上皮功能，其原因是严重的表型，因为视网膜色素上皮和感光细胞两者发生了退化。(图14C)通过携带由EF1a和VMD2启动子所驱动的携带kcnj13基因的慢病毒的视网膜下递送，在cKO小鼠中从视网膜色素上皮中恢复c波，其中在筛选期间光感受器未发生退化，但没有来自视网膜色素上皮细胞的反应。(图14D)、 (图14E)、(图14F)是代表性的光学相干断层扫描(OCT)图像，示出了来自对照小鼠、cKO小鼠(无a、b、c波)且无恢复的视网膜结构，以及分别在慢病毒基因递送后的筛选期间和8周后的c波恢复小鼠(有a波、b波但无c波)。

图15A-图15E展示了未显示c波恢复的小鼠亚群的结果。(图15A)是表示在携带由EF1a 和VMD2启动子所驱动的kcnj13基因的慢病毒的注射后未显示c波恢复的小鼠亚群的图。(图 15B)、(图15C)在筛选期间无c波的cKO小鼠的光学相干断层扫描(OCT)图像显示完整的视网膜但在8周后逐渐消失，这表明由于缺少RPE细胞中的Kir7.1蛋白所导致的视网膜变性的进行性本质。(图15D)、(图15E)是光学相干断层扫描图像，显示了来自cKO小鼠的视网膜结构，这些小鼠具有来自感光体(a波和b波)的响应但缺乏来自视网膜色素上皮的c波响应。注射携带kcnj13基因的慢病毒未能使c波恢复，这可能是由于视网膜色素上皮转导效率低下或者因注射导致的毁损。

图16描绘了表2和表3，这些表展示了用于本发明的示例性AAV载体，该载体含有特异性组分以及包含视网膜色素上皮特异性启动子和Kir7.1基因的AAV载体的合适的示例性序列。

图17描绘了表5和表6，这些表展示了本发明的示例性慢病毒载体，该载体包含慢病毒载体的特定组分和合适的示例性序列。

具体实施方式

在此，本发明人公开了可用于治疗莱伯氏先天性黑矇16(LCA16)或与Kir7.1蛋白表达或功能不足有关的其他疾病的新基因治疗载体及治疗组合物。在非限制性实施例中，本发明人令人惊讶地表明，基因治疗方法可用于有效地在体内或体外在视网膜色素上皮(RPE)视网膜色素上皮细胞中恢复Kir7.1多肽的功能，从而形成具有经拯救的电生理表型的视网膜色素上皮细胞。因此，本发明人已发现基因治疗方法可用于有效地递送膜蛋白Kir7.1。本发明人部分地证明，仅Kir7.1蛋白开放阅读框的表达不足以使Kir7.1蛋白到达适当的亚细胞区室。这些结果为治疗莱伯氏先天性黑矇16(LCA16)或与Kir7.1蛋白表达或功能不足有关的其他疾病的潜在治疗学提供了希望。

基因治疗载体

在本发明的一方面，提供了基因治疗载体。这些基因治疗载体可包含启动子，该启动子可操作地与编码Kir7.1多肽的多核苷酸连接。本发明某些方面中的一般方法是用于提供一种细胞，该细胞具有编码Kir7.1多肽的表达构建体，从而允许Kir7.1多肽在细胞中的表达。在表达构建体的递送之后，利用细胞的转录和翻译机制而合成由该表达构建体所编码的Kir7.1 多肽。

如本文中使用的“编码Kir7.1多肽的表达构建体”是指可操作地与编码Kir7.1多肽的多核苷酸连接的启动子。

如本文中使用的术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸”和“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸(这些术语可互换地使用)或者它们的任何片段。这些短语也指代天然或合成来源的DNA或RNA(它们可以是单链或双链的，并且可代表有义链或反义链)。在一些实施方案中，启动子和编码本文中所述Kir7.1多肽的Kir7.1多核苷酸或表达构建体，在双链DNA、单链DNA或RNA编码中被编码。

如本文中使用的“基因治疗载体”是指可用于将编码Kir7.1多肽的表达构建体递送至细胞(即，真核细胞)中的病毒或非病毒载体系统。在以下的各节中描述了两个广泛类型的载体系统。为了基因治疗的目的，在表达构建体的递送中还应用了两个主要方法：间接的体外方法或者直接的体内方法。离体基因转移包括：在培养中(宿主)细胞的载体修饰、以及载体修饰细胞向基因治疗接受者的施用或移植。体内基因转移包括：将载体直接引入(例如，注射、吸入)靶源或治疗性基因接受者中。

在本发明的某些实施方案中，可将编码Kir7.1多肽的表达构建体稳定地整合入细胞的基因组中。在另外的实施方案中，编码Kir7.1多肽的表达构建体可以以DNA的分离的游离片段的方式在细胞中稳定地或短暂地维持。这种核酸区段或“附加体”编码足以允许独立于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步地维持和复制的序列。表达构建体如何递送至细胞、和/或核酸在细胞中保留于何处取决于所采用载体的类型。以下的基因递送方法为选择并开发最适合于优选用途的基因递送系统提供了架构。

非病毒基因治疗载体

在一些实施方案中，基因治疗载体可以是递送颗粒。适合于递送多核苷酸的递送颗粒在本领域中是已知的，并且可包括但不限于：聚合物颗粒、脂质体颗粒、以及包含脂质和至少一种类型的聚合物的颗粒。在一些实施方案中，可使用普通的脂质体转染试剂而形成递送颗粒。

递送颗粒可包括纳米级颗粒和/或微米级颗粒，例如，作为用于基因组编辑的从组分向细胞的递送载体。这些颗粒的有效平均直径可小于约500μm、100μm、50μm、20μm、10μm、5μm、2μm、1μm、0.5μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm、0.02μm、0.01μm，或者有效平均直径在500μm、100μm、50μm、20μm、10μm、5μm、2μm、1μm、0.5μm、0.2μm、0.1 μm、0.05μm、0.02μm、0.01μm的范围内(例如，0.01-5μm)。纳米级颗粒和微米级颗粒可分别被称为“纳米颗粒”和“微米颗粒”。

聚合颗粒已在现有技术中已有描述(美国专利公开20140066388)。聚合物颗粒可包含可生物降解聚合物分子或者可由可生物降解聚合物分子所形成，在一些实施方案中其可包含树枝状聚合物。合适的树枝状聚合物可以包括但不限于：聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状聚合物。聚酰胺-胺树枝状聚合物在本领域中已被用作用于治疗剂细胞内递送的载体。适用于制备本文中所公开纳米颗粒的聚酰胺基胺型胺树枝状聚合物可包括第三、第四、第五或优选地至少第六代的树枝状聚合物。

聚合物颗粒也可包含其他可生物降解的聚合物分子或者由其形成，这些可生物降解的聚合物分子可包括但不限于：聚乳酸(PLA)，聚乙醇酸(PGA)，PLA与PGA的共聚物(例如，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA))，聚ε-己内酯(PCL)，聚乙二醇(PEG)，聚(3-羟基丁酸酯)，聚对二氧环已酮，聚富马酸酯丙二醇酯，聚原酸酯，多元醇/二烯酮缩醛加成聚合物，聚氰基丙烯酸烷基酯(PAC)，聚癸二酸酐(PSA)，聚羧基双羧基苯氧基苯氧基苯氧基己酮(PCPP)，聚双对羧基苯氧基氧基甲烷(PCPM)，PSA、PCPP与PCPM的共聚物，聚氨基酸，聚伪氨基酸，聚磷腈，聚二氯磷腈和聚[(有机)磷腈]的衍生物，聚羟基丁酸，或S-己酸，弹性蛋白，明胶和壳聚糖(参见，例如Kumari等人，Colloids and Surfaces B：Biointerfaces 75(2010)1-18；及美国专利号6,913,767；6,884,435；6,565,777；6,534,092；6,528,087；6,379,704；6,309,569；6,264,987； 6,210,707；6,090,925；6,022,564；5,981,719；5,871,747；5,723,269；5,603,960；和5,578,709；以及美国公开申请号2007/0081972；和国际申请公开WO 2012/115806；和WO 2012/054425)。在一些实施方案中，颗粒可包含PLGA与PAMAM的混合物。

聚合物颗粒可通过本领域中已知的方法而制备(国际专利申请公开WO 2012/115806；和 WO 2012/054425)。用于制备纳米颗粒的合适方法可以包括使用预聚物的分散体的方法，其可以包括但不限于：溶剂蒸发法、纳米沉淀法、乳化/溶剂扩散法、盐析法、透析法、和超临界流体技术。在一些实施方案中，可通过形成双重乳液(例如，水包油包水)随后执行溶剂蒸发法而制备纳米颗粒。根据需要，通过公开的方法获得的纳米颗粒可经过进一步的处理步骤，例如清洗和冷冻干燥。任选地，可将纳米颗粒与防腐剂(例如，海藻糖)混合。

基于胶束和脂质体的颗粒也可用作合适的递送颗粒。参见例如，美国专利8,252,324。胶束是由两亲性分子形成的自组装球形胶体纳米颗粒。胶束也被描述为在液体胶体中分配的聚集的表面活性剂分子。在水性环境中被分离的胶束的核心能够包封多核苷酸和/或蛋白质，从而保护它们免受破坏和生物环境的影响，同时改善其药代动力学和生物分布。胶束的直径通常为大约5-50nm，并且由于增强的渗透性和保留作用因而能够在具有渗漏的脉管系统的病理区域(例如梗塞区和肿瘤中)积聚。胶束还能够规避颗粒系统靶向药物的主要障碍：网状内皮系统的非特异性摄取和肾分泌。与胶束相反，脂质体是直径大约为50至1,000nm的双层磷脂囊泡。脂质体具有生物惰性并且具有完全的生物相容性；它们实际上不导致毒性或抗原反应。包含于脂质体中的多核苷酸被防止脂质体受到外部介质的破坏作用。因此，脂质体能够将其内容物递送到细胞内，甚至递送到不同的细胞室内。通常，脂质体被认为是具有显著治疗潜力的有前途载体，如在许多实验室测试和临床试验所证明。

递送颗粒特可包括包含脂质和聚合物组分的颗粒。例如，已开发出了包含磷脂双层和聚 (β-氨基酯)(PBAE)的颗粒，用于多核苷酸的体内递送。

递送颗粒优选地具有有助于被靶细胞摄取的物理性质。例如，优选地这些颗粒具有有助于被靶细胞摄取的大小和电荷。通常，这些颗粒的平均有效直径小于1微米，优选地这些颗粒的平均有效直径是在约25nm至约500nm之间、较优选地在约50nm至约250nm之间、更优选地在约50nm至约250nm之间、最优选地在100nm至约150nm之间。可利用本领域中的已知方法来评估颗粒的尺寸(例如，平均有效直径)，这些方法可包括但不限于：透射电子显微镜法(TEM)、扫描电子显微镜法(SEM)、原子力显微镜(AFM)、光子相关光谱法(PCS)、纳米颗粒表面积监测仪(NSAM)、凝聚粒子计数器(CPC)、微分迁移率分析仪(DMA)、扫描电迁移率粒径谱仪(SMPS)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)、X射线衍射法(XRD)、气溶胶飞行时间质谱仪(ATFMS)、和气溶胶颗粒质量分析仪(APM)。

即使颗粒在其表面上不包含特异性配体，递送颗粒也将被细胞非特异性吸收。然而，所公开的递送颗粒可构造成也包含特异性地靶向特定细胞类型的配体。为了实现对递送颗粒的更特异性靶向，可利用先进的接合方法用各种配体对这些颗粒进行改性。例如，抗体和小肽已附着到聚乙二醇链的水暴露末端。抗体和小肽也已经由反应性对硝基苯基羰基、N-苯并三唑羰基或马来酰亚胺封端的PEG-磷脂酰乙醇胺进行偶联。

病毒基因治疗载体

基因治疗载体也可以是病毒载体。该病毒载体可以是病毒颗粒或者可以编码于DNA质粒上。在其中病毒载体是病毒颗粒(例如慢病毒病毒颗粒)的一些实施方案中，病毒颗粒可包含VSV-G包膜蛋白。某些病毒载体有效地感染或进入细胞、整合入宿主细胞基因组并稳定地表达病毒基因的能力，已导致许多不同病毒载体系统的开发和应用(Robbins等人，1998年)。目前正在开发病毒系统，用作离体和体内基因转移的载体。例如，目前正在对腺病毒/单纯疱疹病毒/逆转录病毒和腺伴随病毒载体在人类疾病中的治疗进行评估下面所述的各种病毒载体根据特定的基因治疗用途而给出特定的优点和缺点。

可根据本发明而使用的合适的病毒载体可以包括但不限于：逆转录病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、或单纯疱疹载体。逆转录病毒载体可以包括例如慢病毒载体。

在此，在非限制性实施例中，本发明人证明使用慢病毒或腺相关病毒(AAV)载体可以在体外或者体内成功地将编码Kir7.1多肽的多核苷酸引入视网膜色素上皮(RPE)细胞中并在其中表达，从而拯救KCNJ13基因中的功能缺陷。因此，在一些实施方案中，病毒载体可以是慢病毒载体或AAV，合适地是AAV2载体。本文中所述的AAV载体还可包含表2或表3中所列出组分中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个。本文中所述的慢病毒载体还可包含2}表5或表6中所列出组件中的至少一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、或十五个。

逆转录病毒载体

在本发明的某些实施方案中，涉及逆转录病毒在Kir7.1表达构建体的基因递送中的用途。逆转录病毒或逆转录病毒载体是包含RNA基因组的RNA病毒。当宿主细胞被逆转录病毒感染时，基因组RNA被逆转录成DNA中间体，该中间体被整合到被感染细胞的染色体DNA中。该经整合的DNA中间体被称为原病毒。逆转录病毒的一个特定优点是，它们可以通过整合入宿主DNA中并且不表达免疫原性病毒蛋白，而用感兴趣基因(例如，治疗基因)稳定地感染分裂细胞。从理论上讲，经整合的逆转录病毒载体将在受感染宿主细胞的整个生命周期中保持不变，从而表达感兴趣基因。

慢病毒载体是可以感染分裂和不分裂细胞两种细胞的一种类型的逆转录病毒。慢病毒可以用于提供高效的基因治疗，因为慢病毒可以在长达六个月的时间内改变其靶细胞的基因的表达。它们可以用于不分裂的或终末分化的细胞，如神经元、巨噬细胞、造血干细胞、视网膜光感受器及肌细胞和肝细胞、未能使用以前的基因治疗方法的细胞类型。

腺相关病毒(AAV)载体

作为细小病毒家族的一个成员的腺相关病毒(AAV)是正越来越多地用于基因递送疗法的人类病毒。AAV具有其他病毒系统中未发现的若干有利特征。首先，AAV可以感染大范围的宿主细胞，包括非分裂细胞。其次，AAV可以感染来自不同物种的细胞。第三，AAV尚未与任何人类或动物疾病相关联，并且似乎在整合后不改变宿主细胞的生物学特性。例如，据估计有80-85％的人口接触过AAV。最后，AAV在大范围的物理和化学条件下是稳定的，这使其满足生产、储存和运输要求。

AAV基因组是含有4681个核苷酸的线性单链DNA分子。AAV基因组通常包含内部非重复基因组，该基因组在各端部位于长度为大约145bp的末端反向重复序列(ITR)的侧面。ITR 具有多个功能，包括DNA复制的起点、以及用于病毒基因组的包装信号。AAV ITR可以来源于若干AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、 AAV9、AAV10、AAV11、鸟类AAV、牛AAV等人。本文中所公开的AAV病毒载体可以来源于这些AAV血清型中的任一种。侧面与本文中所公开AAV病毒载体线相接的5'和3'ITR 不必一定是相同或者来源于相同的AAV血清型。因此，rAAV载体的设计和生产允许在不同的AAV血清型之间交换衣壳蛋白。可以产生同源载体，该同源载体包含表达盒的(该表达盒的侧面与是例如AAV2-ITR接触并且被包装在AAV2衣壳中)；以及异源杂交载体，其中转基因表达盒的侧面与例如AAV2ITR接触，但衣壳起源于另一种AAV血清型，例如AAV5。适当地，在一些实施方案中，本发明人已发现AAV2病毒载体可用于有效地将Kir7.1表达构建体递送到细胞中。

AAV基因组的内部非重复部分包括两个大的开放阅读框，称为AAV复制(rep)和衣壳蛋白(cap)基因。rep和cap基因编码病毒蛋白，这使病毒能够复制病毒基因组并将其包装入病毒粒子中。根据它们的表观分子量，从AAV rep区(Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40)表达至少四个病毒蛋白的家族。AAV帽区域编码至少三个蛋白VP1、VP2和VP3。

AAV是辅助依赖病毒，该病毒需要与辅助病毒(例如，腺病毒，疱疹病毒或牛痘)的共感染，从而形成AAV病毒粒子。在无与辅助病毒的共感染的情况下，AAV建立了潜伏状态，其中病毒基因组插入宿主细胞染色体中，但不产生感染性病毒粒子。随后被辅助病毒感染“拯救”了整合基因组，使其能够复制其基因组并将其包装成可感染的AAV病毒粒子。尽管AAV 可以感染了来自不同物种的细胞，但辅助病毒必须与属于与宿主细胞相同的物种(例如，人 AAV将在与犬腺病毒共感染的犬细胞中复制)。

通过删除AAV基因组的内部非重复部分并在ITR之间插入异源基因，已将AAV设计成可以传递目标基因。异源基因可在功能上与能够驱动靶细胞中的基因表达的异源启动子(组成型、细胞特异性、或诱导型)连接。为了产生含有异源基因的传染性重组AAV(rAAV)，而用含有异源基因的rAAV载体转染合适的生产细胞系。同时用第二质粒转导生产细胞，该质粒携带AAV rep和cap基因，它们分别在其内源启动子或异源启动子的控制下。最后，用辅助病毒感染生产细胞。一旦这些因素结合到一起，便复制并包装异源基因，就好像它是野生型AAV 基因组。当所形成的rAAV病毒粒子感染靶细胞时，异源基因进入靶细胞并在靶细胞中被表达。因为靶细胞缺少rep和cap基因以及腺病毒辅助基因，所以rAAV不能进一步复制、包装或形成野生型AAV。

合适的AAV载体在本领域中在是已知的。例如，合适的AAV载体包括AAV2/5，其在“脉络膜炎患者的来源于人诱导多能干细胞的视网膜色素上皮中的AAV2/5介导的基因治疗”中被证实，该文献的全部内容以引用的方式整体并入本文中。参见例如，Cereso等人。Mol Ther Methods Clin Dev.2014。可以适用于本发明基因递送的AAV载体的其他例子可参见“在人多能干细胞、视网膜色素上皮及人和大鼠皮层神经元中使用载体血清型1–9、7m8和8b的比较性AAV-eGFP转基因表达”参见Duong等人。Stem Cells Int.2019。

腺病毒载体

在具体实施方案中涉及到腺病毒载体，该载体被设想用于Kir7.1表达构建体的递送。“腺病毒载体”意图包括如下构建体，这些构建体含有足以(a)支持该构建体的包装和(b)最终表达已在其中被克隆的构建体的腺病毒序列。

腺病毒包含线性双链DNA，其中基因组的大小为30至35kb。根据本发明的腺病毒载体包含基因工程形式的腺病毒。腺病毒基因转移的优点包括能够感染很多种细胞类型的能力，包括非分裂细胞、中等大小的基因组；易于操作；高感染性，并且它们可以生长至高滴度。此外，宿主细胞的腺病毒感染并不导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以以游离方式复制，并且没有与其他病毒载体相关的潜在遗传毒性。腺病毒在结构上也是稳定的，并且在广泛扩增后尚未检测到基因组重排。根据本发明的示例性腺病毒载体是将不具有腺病毒E1区的复制缺陷型载体。腺病毒的生长和操纵对于本领域技术人员而言是已知的，并且在体外和体内显示广泛的宿主范围。参见例如，美国专利No.5,670,488；美国专利5,932,210；美国专利 5,824,544。

单纯疱疹病毒载体

I型和II型单纯疱疹病毒(HSV)含有大约150kb的双链线性DNA基因组，从而编码70-80 个基因。野生型HSV能够裂解性感染细胞，并且在某些细胞类型(例如神经元)中建立延迟。与腺病毒相似，HSV也可以感染多种细胞类型。为了用于治疗性基因递送，必须使HSV是复制缺陷型的。已描述了用于产生无复制缺陷型HSV辅助病毒的细胞系的方案(美国专利号 5,879,934；美国专利号5,851,826，各专利的全部内容以引用的方式并入本文中)。

其他病毒载体

用于基因递送的病毒载体的开发和应用正在不断改善和逐步发展。其他病毒载体，如痘病毒；例如牛痘病毒、α病毒；例如，辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、呼吸道肠道病毒、和甲型流感病毒被考虑用于本发明，并且可以根据靶系统的必要特性进行选择。

启动子

如本文中使用的术语“启动子”、“启动子区域”或“启动子序列”通常是指基因的转录调控区，该区可在本文中所述的多核苷酸的5'或3'侧、或在多核苷酸的编码区内部、或在多核苷酸的内含子内部被发现。通常，启动子是DNA调节区，该区能够与细胞中的RNA聚合酶结合并启动下游(3'方向)编码序列的转录。典型的5'启动子序列在其3'末端与转录起始位点结合，并且向上游延伸(5'方向)以包括在高于背景水平的可检测水平下启动转录所必需的最小数量的碱基或元件。在启动子序列内部的是转录起始位点(方便地通过用核酸酶S1作图来定义)，以及负责RNA聚合酶的结合的蛋白质结合域(共有序列)。

在一些实施方案中，启动子对将要表达Kir7.1的细胞类型具有特异性。例如，合适的细胞类型包括：视网膜色素上皮、小肠细胞、子宫细胞、肾细胞等人。启动子对于极化细胞是特异性的，例如具有方向性的细胞，而Kir7.1钾泵在维持细胞极化方面发挥作用。可以以组织特异性方式使用的合适的启动子包括所述的视网膜色素上皮启动子(例如，EF1a或VMD2) 和下表7中所示的启动子。在一些实施方案中，启动子在受试者眼睛的视网膜色素上皮(RPE) 中具有活性。

“启动子”可以是例如在受试者中发现的KCNJ13基因的内源启动子。可替代地，启动子可以是异源启动子(即，非KCNJ13基因的启动子)。可用于实施本发明的异源启动子包括但不限于：组成型启动子、诱导型启动子、暂时调控启动子、发育调控前启动子、化学调控、组织优选启动子、和组织特异性启动子。

合适的异源启动子可以包括但不限于：EF1a启动子或VMD2启动子。示例性的EF1a启动子是作为SEQ ID NO:3而提供。示例性的VMD2启动子是作为SEQ ID NO:4而提供。合适的EF1a启动子也可包括作为SEQ ID NO:3而提供的EF1a启动子的变体，从而具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％的与SEQ ID NO:3的序列同一性。合适的VMD2启动子也可包括作为SEQ ID NO:4而提供的VMD2启动子的变体，从而具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的与SEQ ID NO:4的序列同一性。

关于本文中所述的如启动子和Kir7.1多核苷酸的多核苷酸，短语“序列同一性％”、“同一性百分比”或“同一性％”是指使用标准化算法进行比对的至少两个多核苷酸序列之间的碱基匹配的百分比。多核苷酸序列比对的方法是众所周知的。

在一些实施方案中，公开的编码Kir7.1多肽的多核苷酸可操作地与启动子连接。如本文中使用的、当把多核苷酸置于与第二多核苷酸序列具有功能关系时，其是“可操作地连接 (connected)”或“可操作地连接(linked)”。例如，如果启动子与多核苷酸连接，则启动子可操作地与多核苷酸连接，因而其可影响多核苷酸的转录。在各种实施方案中，多核苷酸可以可操作地与至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少10个启动子连接。

如本文中使用的“Kir7.1多肽”是指向内整流钾通道，其特征是允许钾流入细胞而不是从细胞中流出的更大趋势。人Kir7.1多肽的是作为SEQ ID NO:1而提供。Kir7.1多肽也可以作为SEQ ID NO:1而提供的人Kir7.1多肽的变异体或同源物，从而具有至少60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的与SEQ ID NO:1的序列同一性。

如本文中使用的术语“蛋白质”或“多肽”或“肽”可互换地使用，是指氨基酸的聚合物。本文中设想的“多肽”通常包括天然氨基酸(例如，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸)的聚合物。

关于Kir7.1多肽，短语“序列同一性％”，“同一性百分比”或“同一性％”是指用标准化算法进行比对的至少两个氨基酸序列之间的残基匹配的百分比。氨基酸序列比对的方法是众所周知的。一些比对方法考虑到了保守的氨基酸取代。下面更详细解释的这种保守取代通常在取代的部位保留电荷和疏水性，从而保留了多肽的结构(并因此保留了功能)。氨基酸序列的同一性百分比可以如本领域中所理解的方式来确定。(参见例如，美国专利7,396,664，该专利的全部内容以引用的方式并入本文中)。美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基本局部序列比对搜索工具(BLAST)提供了一套常用且可免费获得的序列比较算法，该工具可从数个来源的网站获得，包括马里兰州贝塞斯达市的NCBI。BLAST软件套件包括各种序列分析程序，包括“blastp”，用于将已知氨基酸序列与来自多个数据库的其他氨基酸序列进行比对。

多肽序列同一性可以在整个定义的多肽序列的长度上进行测量，例如，如由特定的系列号所定义，或者可在较短的长度上进行测量，例如，从较大的定义多肽序列中获得的片段的长度上，例如至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少70个或至少150个相邻残基的片段。这样的长度仅是示例性的，并且应当理解的是在表格、附图或序列表中由本文中所示的序列所支持的任何片段长度可用于描述可以测量同一性百分比的长度。

本文中公开的Kir7.1多肽可包括“变体”多肽、“突变体”及“其衍生物”。如本文中使用的术语“野生型”是本领域技术人员理解的术语，并且表示区别于变异体或突变体形式的天然存在的多肽的典型形式。如本文中使用的“变体”、“突变体”或“衍生物”是指具有不同于参考蛋白质或多肽分子的氨基酸序列的多肽分子。变体或变体可相对于参考分子具有一个或多个氨基酸残基的插入、缺失或取代。例如，相对于本文中公开的Kir7.1“野生型”多肽，Kir7.1多肽突变体或变体可具有至少一个氨基酸残基的一个或多个插入、缺失或取代。“野生型”Kir7.1多肽的多肽序列是作为SEQ ID NO:1而提供。该序列可用作参考序列。

本文中提供的Kir7.1多肽可以是全长多肽，或者可以是全长多肽的片段。如本文中使用的“片段”是氨基酸序列的一部分，其序列与参考序列相同但长度短于参考序列。片段可包含多达参考序列的全长，减去至少一个氨基酸残基。例如，片段可分别包含参考多肽的5-350 个相邻氨基酸残基。在一些实施方案中，片段可包含参考多肽的至少5、10、15、20、25、 30、40、50、60、70、80、90、100、150或250个相邻氨基酸残基。片段可优先地选自分子的某些区域。术语“至少一个片段”包含全长多肽。Kir7.1多肽的片段可以包含全长Kir7.1 多肽(参见SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的连续部分或者基本上由其组成。相对于全长Kir7.1多肽，片段可包含N端截短、C端截短或者同时包含这两个截短。

Kir7.1多肽中的“缺失”是指氨基酸序列的变化，从而导致一个或多个氨基酸残基的不存在。缺失可去除至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、200或更多的氨基酸残基。缺失可包括内部缺失和/或末端缺失(例如，参考多肽的N末端截短、C末端截短或两者)。

Kir7.1多肽中的“插入”和“添加”是指氨基酸序列的变化，从而导致一个或多个氨基酸残基的添加。插入或添加可指代1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、 100、150、200或更多的氨基酸残基。Kir7.1多肽的变体可具有N末端插入、C末端插入、内部插入，或者N末端插入、C末端插入和内部插入的任意组合。

本文中设想的Kir7.1多肽变体、突变体、衍生物或片段的氨基酸序列可包括相对于参考氨基酸序列为保守的氨基酸取代。例如，变体、突变体、衍生物或片段多肽可包括相对于参考分子为保守的氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指氨基酸被不同氨基酸取代的那些取代，其中预测该取代对参考多肽的特性的干扰最小。换句话说，保守氨基酸取代基本上保留了参考多肽的结构和功能。保守氨基酸取代通常维持(a)取代区域中的多肽骨架的结构，例如，呈β折叠或α螺旋构象；(b)在取代部位的分子的电荷或疏水性；和/或(c)大部分的侧链。

本文中描述的所公开变体和片段Kir7.1多肽可具有由参考多肽所表现出的一种或多种功能性或生物学活性(例如，由野生型Kir7.1多肽所表现出的一种或多种功能性或生物学活性 (即，SEQ ID NO:1)。适当地，公开的变体或片段Kir7.1多肽保留了至少20％、40％、60％、 80％或100％的参考多肽的钾电导特性。如本文中使用的Kir7.1多肽的“功能片段”是例如 SEQ ID NO:1的多肽的片段，其保留了至少20％、40％、60％、80％或100％的全长ADH多肽的钾电导特性。

另外，对于本领域技术人员而言显而易见的是，可通过将来自两个或更多个物种的Kir7.1 多肽序列进行比对而产生另外的Kir7.1多肽变体。基于这些比对，本领域技术人员可鉴定可改变(即取代，缺失等)并且基本上不影响多肽的钾电导特性的各种氨基酸残基。例如，本领域技术人员将会理解，参考Kir7.1多肽的取代可以基于在来自其他物种的其他Kir7.1多肽中的相应位置所存在的替代氨基酸残基。

在一些实施方案中，基因治疗载体可以是慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体，其包括具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的与SEQ ID NO:5(EF1a-Kir7.1)或SEQ ID NO:6(VMD2-Kir7.1)的序列同一性。

治疗组合物

在另一个方面，本发明涉及治疗组合物。这些治疗组合物可包含本文中所述的任何基因治疗载体和药学上可接受的载体。这些治疗组合物可包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，它们在所采用的剂量和浓度下对与它们所接触的细胞或受试者是无毒的。药物稀释剂常常是在pH缓冲的水溶液中。药学上可接受载体或赋形剂的示例可包括但不限于：水；缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10 个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；形成盐的反离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN^TM品牌的表面活性剂、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS ^TM表面活性剂。

治疗的方法

在本发明的另一个方面，提供了对患有与Kir7.1多肽的表达或功能不足相关的病症的受试者进行治疗的方法。这些方法可包括向受试者施用治疗有效量的本文中所述的基因治疗载体中的任一种或本文中所述的治疗组合物中的任一种。如本文所使用的术语“受试者”和“患者”在本文可互换地使用并且是指人和非人动物两者。本公开的术语“非人类动物”可包括哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、猪、小鼠、大鼠等。在一些实施方案中，受试者是人类患者。受试者可以是具有表现出Kir7.1多肽的表达或功能不足的细胞(即，视网膜色素上皮细胞)的人类患者。

与Kir7.1多肽的表达或功能不足相关的病症可包括与对照相比，受试者在细胞内或细胞外具有降低或消除的Kir7.1表达或功能的病症。如本文中使用的“对照”可包括具有野生型 Kir7.1功能的受试者。例如，在一些实施方案中，对照可以是具有野生型KCNJ13基因的受试者，该基因在控制KCNJ13基因的表达的非编码调控序列(即，启动子、增强子等)中或者在编码KCNJ13基因的区域(即，SEQ ID NO:1和2)中均不包含任何功能丧失突变。

受试者可具有可表现出Kir7.1多肽的表达或功能不足的数种“细胞”类型。如本文中使用的“细胞”可以指在野生型受试者中通常表达Kir7.1多肽的细胞。合适的细胞可包括但不限于眼细胞，如视网膜细胞或视网膜色素上皮(RPE)细胞。Kir7.1还可以在各种器官的上皮细胞中被表达，包括肾脏、甲状腺、中枢神经系统神经元、室管膜细胞、脉络丛上皮、脊髓、肌层平滑肌、小肠、胃黏膜的神经区域以及胃壁细胞，以及在肺、前列腺、肝、胰腺、耳蜗核、睾丸和卵巢中。

在一些实施方案中，与Kir7.1多肽的表达或功能不足有关的病症可与KCNJ13基因中的至少一种功能丧失突变有关。人KCNJ13基因是以UniProt 060928而提供。可通过使用本领域众所周知的同源性搜索方法来鉴定其他非人类受试者中的KCNJ13基因。KCNJ13基因中的合适的功能缺失突变可包括对作为SEQ ID NO:1而提供的Kir7.1蛋白的至少一个取代，该 SEQ ID NO:1是选自由W53Ter、Q116R、I120T、T153I、R162Q、R166Ter、L241P、E276A、S105I和G219Ter组成的群组。在一些实施方案中，与Kir7.1多肽的表达或功能不足相关的病症可以是但不限于：Leber先天性阿默氏病16(LCA16)、色素性视网膜炎、或雪花玻璃体视网膜变性(SVD)。

在一些实施方案中，显示Kir7.1多肽的表达或功能不足的细胞是在受试者的小肠内。可使用小肠特异性启动子来构建合适的载体，该启动子包括但不限于例如HIFABP、HMUC2或 HLY(见表7)，用以将Kir7.1靶向至小肠。提供了对在小肠中具有Kir7.1的表达或功能不足的受试者进行治疗的方法。这些方法可包括向受试者施用治疗有效量的包含与Kir7.1多核苷酸可操作地连接的小肠特异性启动子(例如HIFABP，HMUC2或HLY)的基因治疗载体或者包含该载体的治疗组合物，从而提供在受试者小肠中的Kir7.1的表达。

在一些实施方案中，细胞在受试者的子宫内表现出不足的Kir7.1多肽的表达或功能。可使用平滑肌特异性启动子例如SM22a(见表7)来构建合适的载体。用以将Kir7.1靶向至子宫。提供了对在子宫中Kir7.1中表达或功能不足的受试者进行治疗的方法。该方法可包括向受试者施用治疗有效量的包含平滑肌或子宫特异性启动子(例如与Kir7.1多核苷酸可操作地连接的SM22a)的基因治疗载体或者包含该载体的治疗组合物，从而提供在受试者子宫中的Kir7.1 的表达。该方法可通过调节Kir7.1表达和/或调节子宫平滑肌内的钾平衡来控制子宫收缩。

在一些实施方案中，显示出Kir7.1多肽的表达或功能不足的细胞是在受试者的肾脏内。导致肾脏特异性表达的合适的启动子包括但不限于，例如，KAP(肾脏雄激素调节蛋白或NPHS2(podocin)启动子(参见表7)。提供了对患有与肾脏内Kir7.1多肽的表达或功能不足有关的病症的受试者进行治疗的方法。这些方法可包括向受试者施用治疗有效量的基因治疗载体(该基因治疗载体包含可操作地与Kir7.1多核苷酸序列连接的肾脏特异性启动子(例如，KAP 或NPHS2))或者包含这种载体的治疗组合物，从而在受试者的肾脏中表达Kir7.1。

表7：对于细胞类型为特异性的启动子

对与Kir7.1多肽表达或功能不足有关的疾病进行“治疗”包括但不限于：增加受试者细胞内或细胞外的功能性Kir7.1多肽的水平。本领域技术人员将会理解的是，功能性Kir7.1的量的增加会只需要增加至少约10％、优选地至少约20％、或者约30％，这会导致在其中表达功能性Kir7.1的细胞内的钾通道的正常功能，从而导致该疾病的一个或多个症状的减轻。例如，细胞内功能性和非功能性Kir7.1的比例需要足以允许钾通道正常发挥作用，并且可能会根据细胞类型和位置而有所不同。

如本文中使用的“治疗有效量”或“有效量”是指当向受试者施于治疗状态、病症或病状时足以实现治疗(如上文所定义)的组合物的量。治疗有效量将根据化合物、制剂或组合物、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重、身体状况和反应性而变化。

本文中所述的组合物(即基因治疗载体和/或治疗组合物)可以通过本领域技术人员已知的任何方式而施用，包括但不限于局部或全身性施用，包括例如眼内、局部、鼻内、肌内、或皮下施用。当在眼内进行给药时，在一些实施方案中，可通过例如注射至受试者的至少一个视网膜将所述组合物(即基因治疗载体和/或治疗组合物)进行视网膜下给药。在视网膜中，用于递送所述组合物(即基因治疗载体和/或治疗组合物)的靶向区可以包括中央视网膜上或黄斑。

应当理解的是，在任何给定情况下进行给药的具体剂量将根据正在施用的组合物、待治疗或抑制的疾病、受试者的病情、以及其他可能会改变组合物活性的相关医学因素或受试者的响应来进行调节，如本领域技术人员所公知的。例如，用于特定受试者的具体剂量取决于：年龄、体重、总体健康状况、饮食、施用的时间和方式、组合使用的药物、以及给予治疗的特定病症的严重程度。用于给定患者的剂量可以利用常规的考虑因素而确定，例如，通过对本文中所描述组合物的不同活性以及已知药剂的惯用比较较，例如借助于合适的常规药理学或预防方案。受试者的最大剂量是不导致不良或不可忍受的副作用的最高剂量。有关于单独治疗方案的变量的数量较大，并且预期有相当大范围的剂量。给药途径也将影响剂量要求。

本文中描述的有效剂量是指施用的总量，即，如果将多于一个的组合物进行施用，则有效剂量对应于给药的总量。这些组合物可以以单剂量或分剂量的形式而施用。例如，可将该组合物施用两次或更多次，间隔达4小时、6小时、8小时、12小时、一天、两天、三天、四天、一周、两周、或者三周或更长时间。

可将本文中所述的组合物(即基因治疗载体和/或治疗组合物)向受试者施用一次或多次，以有效地增加受试者的细胞内或细胞外的功能性Kir7.1多肽的水平。这些组合物(基因治疗载体或治疗组合物)可以基于编码传递给受试者的Kir7.1多肽的表达构建体的拷贝数而施用。可以以在10⁶至10¹⁴之间、或10⁸至10¹²之间、或10⁹至10¹¹之间，或其中任何范围的拷贝数给受试者施用。在其中基因治疗载体是病毒载体的实施方案中，可以将在10⁶至10¹⁴之间、或在在10⁸至10¹²之间、或在10⁹至10¹¹之间、或者其中任何范围内的病毒基因组施用给受试者。

本公开不限于本文中所陈述的构造、部件的布置、或方法步骤的具体细节。本文中公开的组合物和方法能够以对于本领域技术人员将是显而易见的各种方式进行制备、实施、使用、执行和/或形成。本文中所使用的用词和术语只是为了描述的目的，而不应被视为限制权利要求的范围。如在描述和权利要求书中使用的诸如第一、第二和第三的顺序指示物指代各种结构或方法步骤，并非意图被解释为将任何特定的结构或步骤、或任何特定的顺序或构造指定为这样的结构或步骤。除非本文另有2说明或者与上下文明显地矛盾，本文描述的所有方法均可以按任何合适的顺序而执行。本文中提供的任何和所有示例或示例性语言(如，“诸如”) 的使用仅旨在使本公开便于理解，并不暗示对本公开范围的任何限制，除非另有要求。说明书中的语言以及附图中未示出的结构不应被解释为指示任何未要求保护的要素对于所公开主题的实施是必不可少的。本文中对术语“包含(including)”、“包括(comprising)”或“具有 (having)”和其变体的使用意图包含其后所列出的要素及其等同物以及另外的要素。叙述为“包含”、“包括”或“具有”某些要素的实施例也被考虑是“基本上由那些特定要素组成”和“由那些特定要素组成”。

除非本文中另有说明，对本文中对值范围的叙述仅旨在用作单独地提及落入所述范围内的各单独值的速记方法，并且各单独值并入本说明书中如同在本文中单独地叙述。例如，如果将浓度范围陈述为1％至50％，则意图是在本说明书中明确地列举如2％至40％、10％至30％、或者1％至3％等的值。这些只是具体指代的示例，并且在所列举的最低值与最高值之间以及包含最低值和最高值的数值的所有可能组合都被认为在本公开中明确地陈述。用以描述特定的叙述量或量的范围的词语“约”的使用意图表示包括非常接近所述量的值包含于该量中，例如由于制造公差而可以或自然地设想的值，形成测量时中的仪器误差和人为误差等。除非另有说明，所有涉及量的百分数均是以重量计。

不承认包括本说明书中所引用的任何非专利或专利文件在内的任何参考文献构成现有技术。特别地，将理解的是，除非另有说明，本文中对任何文件的引用均不承认这些文件中的任何文件构成美国或任何其他国家的本领域的普通常识的一部分。对参考文献的任何讨论均陈述其作者的主张，并且申请人保留质疑本文引用的任何文件的准确性和相关性的权利。除非另外明确地指出，本文中引用的所有参考文献均以引用的方式整体并入本文中。在所引用参考文献中发现的任何定义和/或描述之间存在任何不一致情况下，应以本公开为准。

除非上下文另有说明或指示，术语“一个”，“一种”和“该”表示“一个或多个”。例如，“一个蛋白质”或“一个RNA”应分别被解释为表示“一个或多个蛋白质”或“一个或多个RNA”。

以下的实施例意图只是说明性的，而并不意味着对本发明或所附权利要求的范围的限制。

实施例

实施例1–用于突变-特异性失明的精确药物治疗

莱伯先天性黑朦(LCA)是遗传性小儿失明，其与至少21个不同的基因相关。我们使用了患者来源的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞来揭示作为LCA16基础的分子机制， LCA16是由于KCNJ13基因中的无义突变导致无功能的Kir7.1离子通道。利用通读或基因扩增，我们通过精密医学方法在患者来源的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中拯救了 Kir7.1通道功能。

在外部视网膜感光器和视网膜色素上皮(RPE)中表达的至少21个基因的突变导致从出生到儿童早期的遗传性失明，这被称为莱伯先天性黑朦(LCA)。在过去十年中，已在具有LCA 表型(LCA16 OMIM-614186，第16个基因吧被证明导致LCA)的患者中鉴定出KCNJ13基因中的常染色体隐性突变(染色体基因座2q37.1上的603203)^1-3。LCA16致病性等位基因变体包括：c.158G>A(p.Trp53Ter)、c.359T>C(p.Iso120Thr)、c.458C>T(p.Thr153Iso)、c.496C>T(p.Arg166Ter)和c.722T>C(p.Leu241Pro)^1,2,4。另外，已知复合杂合的KCNJ13突变c.314G>T(p.Ser105Iso)和c.655C>T(p.G219Ter)导致LCA患者中的早发性视网膜营养不良⁵。常染色体显性遗传KCNJ13突变c.484C>T(p.Arg162Trp)导致称为雪花玻璃体视网膜变性(SVD OMIM-193230)的早发性失明⁶。

基因筛查的进展将无疑地增进我们对由通道病所引起一系列疾病的理解，并扩大我们对 KCNJ13在健康和疾病中的作用的了解。内向整流钾通道Kir7.1是由KCNJ13编码，并在数个组织中被表达^7,8。在视网膜中，Kir7.1仅仅在视网膜色素上皮的细胞顶端过程中被表达，在该过程中它调节视网膜的功能和健康。Kir7.1通道在其他器官中的作用仍有待阐明^9,10。

如同其他的通道病变，KCNJ13中的功能丧失是方便的治疗靶。我们采用了精密医学方法，在该方法中我们使用患者来源的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞对LCA16进行建模，并且探索了基于突变特异性和基因增强方法的新型疗法。

结果

我们之前曾报道过，小鼠视网膜中对Kir7.1的靶向抑制(使用siRNA或者药理阻断剂进行诱导)导致视网膜电图表型的改变，这与在LCA16患者中所观察到的一致¹¹。这里，我们概述了我们对皮肤活检患者来源人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞的开发，该1上皮细胞是取自来自一名LCA16患者的皮肤活检的，该患者在KCNJ13基因外显子2中携带无义突变(Trp53Ter)并且是未受影响的健康家族成员。我们能够使用转录因子的混合物，在通过体外分化所获得的视网膜色素上皮细胞中对特征性LCA16病理特征进行建模¹²。这些细胞具有正常的视网膜色素上皮形态，包括鹅卵石外观和色素沉着(图1A和图1B)。DNA测序证实，就突变158G>A而言，对照细胞是杂合的而LCA16细胞是纯合的。另外，LCA16细胞具有正常的核型(图1C)。LCA16突变引入了用于Nhe1的限制性位点，使得能够在患者来源的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮中鉴定Kir7.1突变序列，从而进一步证实了纯合突变的存在(图 1D)。测试了对照人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮，并且发现其是杂合的携带者，与供体的基因型一致(图1D)。在这两种细胞类型之间，在视网膜色素上皮特异性基因的表达中没有差异(图1E)。因此，患者来源的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮符合遗传性视网膜营养不良的基因型，因此提供了疾病特异性细胞模型¹。

Kir7.1通道位于视网膜色素上皮的高度专业化顶端膜过程中^11,13。对完整顶端膜结构的电子显微镜图像分析表明，这些细胞具有极化结构，包括完整的基底膜折叠和细长的顶突过程，在对照中测量的长度为1.49±0.05μm，在突变体中对照中长度为1.5±0.14μm(P＝0.96，n ＝7)(图1F、图1H和图3A-图3D)。在这两个细胞系中线粒体的分布和数目似乎是正常的，在对照和突变细胞中分别平均为8.4±1和6.22±0.8(P＝0.12，n＝6)(图1F和1G)。在成熟的对照人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞的顶端膜上检测到Kir7.1蛋白表达，但在LCA16 人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞的膜上却未检测到(图1I和1J)。除了Kir7.1(图1K) 外，我们在这两种细胞系之间均未发现蛋白质表达的任何差异。Trp53Ter基因座位于3外显子KCNJ13序列的第二个外显子内。先前我们已证明，在氨基酸53处的无义取代导致截断的蛋白产物，这解释了为何LCA16患者来源的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮未能表达全长Kir7.1蛋白。

视网膜色素上皮细胞的关键生理功能之一是光感受器外段的每日吞噬作用，这有助于更新过程。为了测试正常Kir7.1蛋白的缺失是否改变吞噬作用，我们用荧光标记的感光外段 (POS)饲养了对照和LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞培养物。将细胞用POS 饲养4个小时，然后再用视网膜色素上皮细胞进行吞噬体消化48个小时。然后，我们确定对照人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮的吞噬体摄取率高于LCA16患者来源的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮(169±40相对于66.5±7.4，P＝0.04，n＝4)(图1L、图1M和图1N)。相反，当用POS饲养细胞1天然后允许其消化吞噬体6天时，LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞未能消化POS(200μm²视野内的计数为80.2±11.1相对于244.2±27.6，P＝ 0.001，n＝4)(图3A-图3D)。该发现表明，在LCA16中所观察到的色素沉着可能是由于未能正常吞噬POS，因此POS会随时间累积在受影响个体的视网膜中。

我们假设非功能性通道有助于LCA16表型，并且我们通过对人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞进行全细胞电生理学测试了该假设。研究人诱导多能干细胞细胞中的离子通道的挑战之一是它们的低水平或缺乏表达。正如我们已显示了专门顶端过程的发展并证明了Kir7.1定位于顶端膜，我们能够在对照人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中检测到小的但可测量的Kir7.1电流(-120.2±37pA)。正常功能是通过Rb+渗透性的倍数增加(-439.5±155.7 pA，n＝5)得到证实(图2A和图2C)，这是Kir7.1通道的特有属性¹⁴。然而，在LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中，我们未检测到由Rb+电导所介导的电流幅值中的任何倍数变化(-98.1±15.7pA和-100.7±15.9pA，n＝9)(图2B和图2C)。电流幅值(带Rb的P＝0.0006) 与细胞膜电位的直接比较(-50±5.1相对于-30.6±3.7mV，P＝0.0005；如图2D中所示)支持我们的假设，即失明的原因是截断的非功能性Kir7.1通道。我们先前已证明，利用小鼠和Kir7.1 通道的外源表达可以使无功能的通道使视网膜色素上皮细胞去极化^1,11。

我们正在研究的LCA16突变是色氨酸(UGG)到琥珀色终止密码子(UAG)的变体。真核生物中的这种无意义的突变可通过在小分子通读设计者氨基糖苷NB84存在下掺入近同源氨基酸tRNA来抑制(美国专利公开号20140357590A1)^15-17。我们进一步评估了LC84在LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中NB84介导的Kir7.1电流通读的功能性结果。在用500 μM NB84处理后，我们在LCA16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮中获得了-94.3±24pA的可测量电流，当引入Rb+(其是渗透离子)后该电流可提高10倍(-1562.7±546.7pA，P＝0.005， n＝8)(图2E和图2F)。膜电位从未处理细胞中的-30.6±3.7显著恢复至经处理细胞中的– 56.3±3.6mV(P＝0.0001，n＝10)(图2G)，进一步证明使用通读药物疗法的合理性。我们能够判定细胞中的一个亚群具有膜电位的恢复并且电流幅值没有任何显著变化(图4A-图4D)。该结果可能是基于在Kir7.1蛋白质翻译期间近同源氨基酸(UAG到UAC酪氨酸、UCG丝氨酸、 GAG谷氨酸或CAG谷氨酰胺)被掺入。为了优化Kir7.1蛋白质的检测，我们使用了Kir7.1-GFP 融合克隆的低表达水平的稳定细胞系。在NB84处理的细胞中，除了截短的蛋白带外，还检测到与全长产物相当的蛋白带，以及经整流的膜电位和电流(图2H、图2I和图5A-图5D)。 NB84增强了隐性Trp53Ter密码子突变的特定通读，我们发现低至25％的功能通道挽救足以同时避开膜电位和钾电流，从而挽救疾病表型(图6A-图6D)。

鉴于FDA最近批准了一种用于失明的治疗方法，本文中研究的特定突变和其他导致失明的突变是基因治疗的潜在标靶^18,19。我们设计了一种慢病毒载体，其中该载体的N端GFP在 EF1a启动子的控制下与人Kir7.1开放阅读框融合²⁰。有趣的是，在用慢病毒颗粒进行转导后，表达Kir7.1的细胞给出正常的Kir7.1电流，甚至比在对照细胞中观察到的幅值稍高(-920.5±223 pA，P＝0.001，n＝8)。如对正常运行的Kir7.1通道所预期的那样，通过引入Rb+(-5452.8±929 pA)进一步增强了该电流(图2J和图2K)。除了K+电流外，还对LCA16人诱导多能干细胞- 视网膜色素上皮细胞的膜电位进行了归一化处理(-57.5±5.4mV，P＝0.0008)(图2l)。另外，显示出新表达的Kir7.1定位于患病的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞的顶端膜(图2M 和图2N)。因此，视网膜色素上皮细胞中Kir7.1功能的逆转是一种潜在的干预措施，可以改善由于KCNJ13突变而导致的先天性失明患者的视力。

总之，在常染色体隐性隐性LCA16中，我们使用重编程的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞来鉴定与无义突变相关的独特特征。在未能吞噬POS的患病细胞中，膜电位被去极化的发现与LCA16患者除其他临床表现(如视网膜电图异常和视网膜色素沉着)外所观察到的失明进展缓慢相一致。在人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮模型中使用内源表达的Kir7.1，我们说明使用通过无义突变抑制通过设计者氨基糖苷进行的突变特异性疗法和/或通过慢病毒基因扩增挽救通道病均产生了钾电流和正常膜电位(图7A-图7D)。因此，我们在本文中示出了用于小儿失明的临床前治疗和用于治疗遗传性疾病的精确医学方法。

方法

人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮的分化。将来自两个受试者的成纤维细胞重新编程为人诱导多能干细胞，并使用既定方法进行培养^1-3。一名受试者是LCA16患者，该患者在 KCNJ13基因中具有两个拷贝的Trp53Ter常染色体隐性突变，而第二名受试者对该突变是杂合的。利用先前描述的方案，将人诱导多能干细胞品系区分为视网膜色素上皮^2-5。简要地，在iPS细胞培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM):F12(1:1)、20％敲除血清、1％最低必需培养基(MEM)非必需氨基酸、1％GlutaMAX、β-巯基乙醇(20ng/ml FGF-2)，中的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上，或者在含有mTeSR1培养基的

上培养人诱导多能干细胞。将细胞酶提并使它们在无FGF-2的iPS培养基中以胚状体(EBs)的形式生长，在第4天更换为神经诱导培养基(NIM；DMEM:F12；1％N2补充剂、1％MEM非必需氨基酸、1％L-谷氨酰胺、2μg/ml肝素)或者在mTeSR1中培养并在第4天逐渐过渡到NIM。在这两种方法之间，视网膜色素上皮的区分中未观察到有差异。在第7天，将自由漂浮的Ebs铺在层粘连蛋白覆盖的培养板上，以继续以贴壁培养的形式进行分化。在第16天，去除3D神经结构，并将培养基切换为视网膜分化培养基(DMEM/F12(3：1)，2％B27补充剂(不含视黄酸)，1％抗生素- 抗真菌剂)。如前所述，让剩余的粘附细胞继续分化另外45天，接着进行显微解剖和染色色视网膜色素上皮贴片进行传代，以获得经纯化的视网膜色素上皮的单层，如前所述⁵。MEF、

和FGF-2是购自WiCell(威斯康星州麦迪逊)，所有其他组织培养试剂均购自ThermoFisher。

RT-PCR和限制性片段长度多态性(RFLP)。按照制造商的说明(Qiagen)，使用

试剂盒从来自患者和载体的成熟人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中分离总RNA。使用Nanodrop(ThermoFisher)对分离的RNA的质量和浓度进行测量，并根据制造商的说明 (ThermoFisher)使用Superscript III第一链cDNA合成试剂盒将200ng RNA用于cDNA合成。利用以下的条件(95℃)下，用MyTaqHS预混液(Bioline)以25μl的最终体积执行PCR：达5 分钟，然后在95℃下进行变性达35个循环，达15秒，在55℃下退火达30秒，在72℃下扩展达30秒钟。在72℃下进行10分钟的最后延伸步骤，通过在含有Midori绿色高级染料的 2％琼脂糖凝胶上的电泳(Nippon Genetics Europe)而使扩增产物可视化。对于RFLP测定而言，如用对于全长KCNJ13mRNA(Fwd 5`-GCTTCGAATTCCGACAGCAGTAATTG-3`(SEQ ID NO:7)和Rev 5`-ATCCGGTGGATCCTTATTCTGTCAGT-3`(SEQ ID NO:8)为特异性的引物所描述的方式，执行PCR。然后用NheI限制性内切酶(ThermoFisher)消化PCR产物，在含有Midori 绿色高级染料的2％琼脂糖凝胶上通过电泳进行可视化(Nippon Genetics Europe)。

透射电子显微术。在室温(RT)下，将在Transwell插入物(Corning，Cat#3470)上的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮的单层膜，在2.5％戊二醛、2.0％多聚甲醛的0.1M磷酸钠缓冲液(PB)pH 7.4中固定约1小时。将样本在0.1M PB中清洗5×5分钟。然后，在室温下将经清洗的培养物在PB中的1％四氧化锇(O_SO₄)、1％亚铁氰化钾中进行1小时固定。在固定后，以如前述的方式，将样本在PB中冲洗，接着在蒸馏水中冲洗3×5分钟以清除磷酸盐。然后在室温下将样本在乙酸双氧铀中全体地染色2小时，再使用乙醇系列进行脱水。将膜从transwell 支架上切下，将其置于铝称重盘中，在环氧丙烷(PO)中进行转换，再使其在新鲜的PilyBed 812(Polysciences有限公司，宾夕法尼亚州沃灵顿)中进行聚合。由这些聚合的样本制备超薄切片并进行处理，然后使用安装有AMT BioSprint12(美国马萨诸塞州沃本市的Advanced Microscopy Techniques公司)数码相机的FEI CM120透射电子显微镜来捕获并记录图像。

免疫细胞化学(ICC)。以如下方式固定来自患者或者对照组的具有单层人诱导多能干细胞 -视网膜色素上皮细胞的Transwell插入物：切出transwell膜，通过在暗处将其在磷酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛中浸泡10分钟而将其固定。然后将带细胞的膜用冷却的PBS清洗两次，并在封闭溶液中封闭2小时，该封闭溶液在1X PBS中含有5％山羊血清和0.25％Tween-20。就共聚焦显微镜分析而言，然后将细胞与针对Kir7.1(小鼠单克隆IgG，1:250-Santa Cruz)、和在培养溶液中制备的ZO-1(兔多克隆，2.5μg/ml–ThermoFisher)(封闭溶液用1X PBS以1:3稀释)进行培养。在与第一抗体一起进行培养后，将膜用冷却的1X PBS清洗三次，在培养溶液中在暗处与偶联的第二抗体(驴抗山羊

驴抗兔

和DAPI，1： 500)一起进行1小时培养。所有实验均不包含第一抗体对照。在尼康C2共聚焦显微镜(纽约州梅尔维尔的尼康仪器公司)上将免疫染色的样本进行成像。

蛋白质印迹。利用放射免疫沉淀测定法(RIPA)裂解缓冲液(ThermoFisher)以及超声处理，从超过60天的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞中分离蛋白质⁶。使用市售的二喹啉甲酸(BCA)测定试剂盒(ThermoFisher)测量裂解物的蛋白质含量。将样本稀释至含有等量的蛋白质，再与2X Laemmli样本缓冲液(Bio-Rad)混合，然后在

-12％预制聚丙烯酰胺凝胶(ThermoFisher)上进行电泳，接着转移至使用

干印迹系统(ThermoFisher)的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。将膜用含有0.1％Tween-20的奥德赛封闭缓冲液(LI-COR Biosciences)在4℃下封闭至少2小时。在封闭后，将膜在含有0.1％Tween-20的Odyssey封闭缓冲液中制备的适当的第二抗体中进行培养。用于此目的的主要抗体是抗Kir7.1(小鼠单克隆抗体，1:1000-Santa Cruz Biotech)、抗Bestrophin1(小鼠单克隆抗体，1:1000-Novus bios)、抗视网膜色素上皮65(小鼠单克隆抗体，1:1000-ThermoFisher)、抗GFP(小鼠单克隆抗体， 1:1000-NeuroMab)、抗GAPDH(兔子单克隆抗体，1:1000-细胞信号传导)、和作为加载控件的抗β-肌动蛋白(兔子单克隆抗体，1:1000-细胞信号传导)技术。将这些膜与这些第一抗体连同对照在4℃下培养一夜，然后用含有0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水清洗4次，然后与在封闭缓冲液中以1:20000比例稀释的适当的IRDye^TM第二抗体(LI-COR Biosciences)一起培养1小时。将膜清洗4次，并在

成像系统上进行成像。

光感受器外段(POS)隔离。在暗红色的光下解剖新鲜的牛眼，并从眼杯中小心地取出视网膜。将分离的视网膜置于冷冻的均化溶液(20％w/v蔗糖、20毫摩尔Tris/酸盐pH7.2、2mM MgCl₂、10mM葡萄糖、5mM牛磺酸)中并轻轻地混合。然后使悬浮液经过纱布以除去团块。将此滤液在4℃下以25000rpm通过25-60％蔗糖梯度进行一小时离心。除去含有POS的粉红色层，通过分别以3000g离心10分钟而用清洗溶液1(20mMTis醋酸酯pH 7.2和5mM牛磺酸)、清洗液2(10％蔗糖、20mM醋酸三乙酸pH 7.2和5mM牛磺酸)和清洗液3(10％蔗糖， pH7.2的20mM磷酸钠和5mM牛磺酸)进行清洗，然后重悬于含有2.5％蔗糖的DMEM中，在-80℃下保存直至使用。为了将POS进行荧光标记，使未标记的等分试样解冻再以2400g 离心5分钟。然后，将沉淀再悬浮于200μl DMEM中。向此溶液中混合入Alexa Fluor

(1 毫克/毫升，赛默飞世)结合的1μl的WGA(麦胚凝集素)并在37℃下培养10分钟在与WGA 的培养完成后，将试管再次以2400×g离心5分钟，再DMEM清洗POS球团两次，然后将其用于吞噬作用试验。

吞噬作用试验。将标记的POS加入到培养基中，在供给到在transwell中生长的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞，该transwell具有>150Ωcm²的跨上皮电阻(TEER)。¹给细胞提供POS达4小时或者24小时，之后通过用DMEM培养基清洗细胞3次而除去所有尚未被吞噬的任何2POS。然后在成像之前将细胞分别培养24小时或6天。捕获图像，再使用尼康C2共焦显微镜(Nikon Instruments有限公司，Mellville，NY)用NIS-Elements进行分析。

GFP融合蛋白的免疫沉淀和银染：将CHO-K1细胞短暂地转染，以外源性地表达Kir7.1 WT蛋白或者Kir7.1 Trp53Ter蛋白作为与GFP的N末端融合体。然后用NB84处理表达Trp53Ter蛋白的细胞⁸。使用GFP-Trap琼脂糖珠(ChromoTek，德国)按照制造商的方案执行免疫沉淀反应。⁶。简要地，以如上所述的方式收集细胞并分离蛋白质用于蛋白质印迹。将GFP-Trap琼脂糖珠添加到细胞裂解物中，在4℃下持续搅拌2小时。然后将混合物以2500g离心2分钟，将小珠清洗两次。将SDS样本缓冲液添加到小珠中并在95℃下培养10分钟，接着以2500×g离心。将上清液在4-12％丙烯酰胺凝胶上进行分离，按照制造商的说明使用Pierce Silver Stain试剂盒(ThermoFisher)通过银染使蛋白条带可见。

人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮转导。慢病毒是由Cyagen Biosciences(美国加利福尼亚州圣塔克拉拉)生产，经过定制工程设计，不含致病成分，并带有在EF1a启动子控制下在 N-末端与绿色荧光蛋白(GFP)融合的KCNJ13基因。转导⁹。用pLV-EF1αKir7.1-GFP以200 的MOI感染LCA-16人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮单层。感染后将细胞培养4-5天，然后用于免疫细胞化学和蛋白质印迹。

电生理学。如描述的那样在单个细胞上进行标准全细胞膜片钳⁶简而言之，将生长在6.5 mm Transwell上的人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮的紧密单层如下解离为单个细胞悬液：完全除去保存细胞的培养基，并用0NaCMF(135mM NMDG-Cl、5mM KCl、10mMHEPES、10mM葡萄糖、2mM EDTA-KOH)溶液清洗两次，再用NMDG游离碱调节至pH 7.4。然后，将细胞与含有木瓜蛋白酶(2.5μl/ml)、半胱氨酸(0.3mg/ml)、谷胱甘肽(0.25mg/ml)和牛磺酸(0.05mg/ml)的0NaCMF在37℃下培养45分钟。用0NaCMF溶液冲洗细胞以去除酶，然后重悬于HEPES-Ringer's(HR)溶液中[NaCl(135mM)、KCl(5mM)、CaCl₂(1.8mM)、MgCl₂(1 mM)、HEPES(10mM)、D-葡萄糖(10mM)、用NaOH调节至pH 7.4±0.1中，在ddH₂O]中制备，并在冰上保存8个小时，直至用于电生理记录。

选择具有独特顶突的单个人诱导多能干细胞-视网膜色素上皮细胞进行常规的膜片钳。使用移液管拉出器

由硼硅酸盐毛细管制造电阻为3-5mΩ的膜片移液管。然后使用微型炉(

Narshige)对玻璃电极进行火抛光。使用

软件(Axon仪器)对数据采集和保持电位参数进行控制。使用

(Axon Instruments)放大从成功的补丁记录的电流，并以2KHz的频率进行滤波。信号使用

(Axon仪器)进行数字化处理，并使用

(Axon仪器)进行分析。在膜片夹持期间，将HR解决方案作为外部解决方案进行持续灌注。膜片吸管充满了含有30mM KCl、83mM葡糖酸钾、5.5毫EGTA-KOH溶液， 0.05毫摩尔氯化钙、4毫摩尔MgCl₂、10mM HEPES，pH值用KOH调节to7.2并使用0.2过滤μm过滤器。

统计分析。使用Origin(9.1版)和双尾Student's t检验进行统计分析，以评估显著性差异。 P<0.05被认为具有统计学意义。方差分析和事后Tukey检验也用于多重比较。数据表示为平均值±SEM。

方法的参考

1.Singh,R.等人。最佳疾病的iPS细胞建模：对遗传性黄斑变性的病理生理学的见解。Hum Mol Genet 22,593-607(2013).

2.Meyer,JS等人。用人类胚胎干细胞和人诱导多能干细胞对早期视网膜发育进行建模。国家科学院院刊USA 106,16698-703(2009)。

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9.Yanez-Munoz，RJ等人。使用非整合型慢病毒载体进行有效的基因治疗。自然医学12, 348-53(2006)。

除方法外，还参考实施例1

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2.Sergouniotis，PI等人。KCNJ13中的隐性突变(其编码一个向内整流的钾通道亚基)导致莱伯先天性黑病。Am J Hum Genet 89,183-90(2011).

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12.Singh,R.等人。最佳疾病的iPS细胞建模：对遗传性黄斑变性的病理生理学的见解。人体分子遗传学22,593-607(2013)。

13.Yang,D.,Pan,A.,Swaminathan,A.,Kumar,G.&Hughes，BA在天然牛视网膜色素上皮细胞中向内整流的钾通道Kir7.1的表达和定位。Invest Ophthalmol Vis Sci 44,3178-85(2003).

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20.White,M.,Whittaker,R.,Gandara,C.&Stoll,E.A，《慢病毒介导的基因疗法的监管注意事项指南》。人类基因治疗方法28,163-176(2017)。

实施例2-细胞培养模型和体内的Kir7.1基因治疗

为了在LCA16细胞培养模型中测试基因治疗的功效，我们测试了AAV-Kir7.1挽救在 Kcnj13基因中带有W53X突变的CHO细胞中的生理缺陷的能力。图8示出了来自野生型(左图)和W53X突变体(右图)稳定细胞的全细胞电流电压关系。Rb+(红色迹线)显著增加了野生型稳定细胞中向内整流的K+电流(黑色迹线)。在右侧的W53X突变稳定细胞中，既未记录K+电流，也未记录Rb+电流(p＝1.05E-0.5)。

图9示出了W53X突变体的CHO细胞的基因扩增具有平均向内整流K+电流的恢复(图9A。与之前没有电流相比，红色轨迹中的IV曲线)(图9A是黑色轨迹中的IV曲线)。(图9B) 示出了基因增强后，W53X突变体表达细胞中的平均更高的Rb+电流(红色迹线)。(图9C)示出了基因增强后，通过Kir7.1通道的Rb+通透性的净增加增加(蓝色)。(图9D)以蓝框表示的W53X表达细胞的AAV-Kir7.1转导后，静息膜电位(RMP)的完全恢复。(图9E)蛋白质印迹结果示出了基因扩增后在泳道W53X+AAV(红色条带)中全长蛋白产物的表达。

图10示出了在通过AAV-Kir7.1进行基因扩增后在W53X突变株中的Kir7.1表达(绿色)(图 10A)。(图10B)较高的放大图像示出了Kir7.1蛋白在膜标志物WGA-Alexa 594旁边的膜定位。在下面的面板中是红色和绿色的线扫描，示出了膜标志物和Kir7.1共定位。

为了测试体内基因治疗的功效，测试了野生型和缺乏Kcnj13基因的小鼠。在图11的左方框中的是通过视网膜下注射接受2μl Lenti-EF1a-eGFPKir7.1的野生型小鼠的示例。在注射后(黑色迹线)和1(蓝色迹线)、2(红色迹线)和4(绿色迹线)之前获得电生理结果。在图11的左方框中，记录为正常a波和b波的视网膜反应显示在左侧，而视网膜色素上皮细胞反应c波显示在右侧。仅在第1周注射后出现了视网膜反应的减少，否则，几乎没有基因治疗对预后电任何影响。在图11的右方框中，我们示出了缺少Kcnj13基因的小鼠的结果，该小鼠接受了2μl的Lenti-EF1a-eGFPKir7.1。右方框是c波的视网膜色素上皮响应，在左图所示的这些小鼠中，a波和b波略有减少，而在这些小鼠中完全消失了(黑色迹线)。在基因治疗后，我们立即注意到在注射后一周开始的c波反应增加(右图为蓝色)。迹线显示在基因治疗后的接下来的2周(红色迹线)和4周(绿色)中，c波的持续增加。箱形图示出了在4只野生型和4只缺乏 Kcnj13基因的小鼠中的平均测量结果，在c波中有明显恢复，并且对野生型小鼠的视力没有影响。在图下面的数字示出了在野生型和缺乏Kcnj13的小鼠中a，b和c波测量的实际幅度。

另外，图14A-图14F示出了在cKO小鼠模型中的基因治疗后，缺少Kir7.1蛋白的视网膜色素上皮(RPE)细胞的功能恢复。图14A示出了对WT小鼠和cKO对照小鼠的注射对照，描绘了在用PBS注射8周后RPE反应起作用。来自Kir7.1 cKO小鼠的视网膜电图反应在筛选过程中未显示a、b和c波(图14B)。用携带组成型EF1a启动子或视网膜色素上皮特异VMD2 启动子的慢病毒递送Kir7.1不能恢复视网膜色素上皮功能，因为严重的表型，因为视网膜色素上皮和感光器均被变性，CKO小鼠通过视网膜下从视网膜色素上皮回收了C波。携带由 EF1a和VMD2启动子驱动的kcnj13基因的慢病毒的慢病毒递送，其中在筛选过程中光感受器未变性但没有来自视网膜色素上皮细胞的反应(图14C)。无花果图14D-F显示了代表性的光学相干断层扫描(OCT)图像，显示了来自对照小鼠，无恢复的cKO小鼠(无a、b、c波) 和经c波恢复的小鼠(a-、b-但无c)的视网膜结构-c-wave)分别在慢病毒基因递送过程中和筛选后8周后进行。因此，体内数据表明在视网膜色素上皮中表达Kir 7.1可以恢复这些缺陷小鼠的视力。

材料和方法

动物

为了在体内阐明KCNJ13基因在视网膜色素上皮细胞中的生理作用，我们使用了缺少该基因的菌株。使用视网膜电图(ERG)测量这些小鼠的视力。小鼠在威斯康星比奥创大学(威斯康星州麦迪逊市)饲养和繁殖。

视网膜电图

在进行ERG之前，使小鼠黑暗适应一夜。腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪(80:16mg/kg)混合物麻醉小鼠。在用加热垫将体温保持在37℃的同时，用一滴托吡卡胺(Bausch+Lomb， Rochester，NY)扩张小鼠的瞳孔。使用Espion记录系统(Diagnosys)通过将角膜接触镜 (Ocusciences有限公司，MO)与2.5％羟丙甲纤维素眼部缓和剂Gonak(GONIOVISC，HUBPharmaceuticals有限责任公司，CA)一起放在扩张的眼睛上进行ERGs。参比电极和接地电极分别放在嘴和背部中。ERG协议包括从0.1到30cd.sm–2的闪光强度记录，并使用滤波器消除了60Hz的线路噪声。对于c波测量，我们使用5毫秒的25cd.s.m–2强度的闪光在5秒钟的间隔内采集数据。在视网膜下注射之前和之后，对小鼠进行ERG分析。

视网膜下注射

没有c波形的KCNJ13基因敲除小鼠用于此目的。将小鼠维持在200流明光照环境中在严格控制的温度(23±5℃)，湿度(40-50％)和明/暗(12/12h)循环条件下。在注射之前，将小鼠麻醉并以如上所述的方式扩瞳。通过使用10毫米34号针通过视网膜下注射将2μl携带功能完整的KCNJ13基因的慢病毒或腺相关病毒(AAV)与eGFP融合并由EF1a或VMD2启动子驱动。我们使用了10μl Nanofil注射器和UMP3，NanoFil视网膜色素上皮-KIT和Micro4控制器(佛罗里达州萨拉索塔的世界精密仪器公司)。在注射后1周，2周，4周和8周对这些小鼠进行 ERG，并分析数据。

转基因表达检测

在制备分离的视网膜色素上皮的平板支架后，使用共聚焦显微镜对eGFP荧光进行检测。在注射后的一周，从携带eGFP-KCNJ13基因注射的慢病毒/AAV小鼠的眼睛中取出。用PBS 清洗来自被处死小鼠的去核的眼睛两次，用28号针头在锯齿缘进行穿刺，并沿角膜切口张开眼睛。然后小心地取下镜片。眼杯是扁平的，在中心处形成放射状切口，从而形成“海星”外观。然后将视网膜与视网膜色素上皮层轻轻分开。将分离的视网膜色素上皮和视网膜平整地安装在盖玻片上，并使用Nikon C2共焦显微镜(纽约州梅尔维尔的尼康仪器公司)用NIS-Elements成像。我们使用488nm二极管激光器进行绿色激发，并通过低噪声PMT C2检测器在Plan Apo VC 20X/0.75，1mm WD透镜中捕获了图像。

实施例3–用于递送AAV的AAV病毒载体的制备Kir7.1蛋白

AAV病毒载体构建

使用Cyagen Biosciences的VectorBuilder软件和Cyagen Biosciences的包装服务制作了用于递送Kir7.1蛋白的AAV载体。以下的表1-表3和图12总结了成功地拯救Kcnj13基因中的生理缺陷的AAV载体的构建。

表1：载体总结

图16中的表2和表3具有用于编码Kir7.1的AAV载体的彩色编码的片段和序列(SEQID NO:9)。

AAV病毒载体包装

腺相关病毒(AAV)载体系统是用于体外和体内基因递送的流行且通用的工具。AAV可有效转导许多哺乳动物细胞类型，并且与腺病毒不同，AAV具有非常低的免疫原性，在体内几乎完全没有致病性。这使AAV成为许多动物研究的理想病毒载体系统。

首先将AAV载体构建为大肠杆菌中的质粒。然后将其与辅助质粒一起转染到包装细胞中，其中将在两个反向末端重复序列(ITR)之间的载体区域包装到活病毒中。当病毒被添加到靶细胞中时，双链线性DNA基因组被传递到细胞中，并进入细胞核并以游离DNA形式存在，而没有整合到宿主基因组中。置于两个ITR之间的任何基因都将与其余病毒基因组一起被引入靶细胞中。

AAV的主要实际优点在于，在大多数情况下AAV可以在生物安全等级1(BSL1)的设施中进行处理。这是由于AAV天生具有复制缺陷，几乎不产生炎症，也没有引起人类已知疾病。

在自然界中已经鉴定出许多AAV菌株。根据衣壳蛋白在病毒表面的不同抗原性，将它们分为不同的血清型。不同的血清型可使病毒具有不同的组织嗜性(即感染的组织特异性)。不同的AAV血清型对不同的细胞类型具有嗜性，某些细胞类型可能很难通过任何血清型进行转导。参见例如，Curr Opin Pharmacol.24:59-67(2015)。我们发现，AAV2血清型可用于在体外或体内有效转导视网膜色素上皮细胞(REP)。参见例如实施例1和2。

实施例4–用于Kir7.1蛋白的递送的慢病毒载体的制备

慢病毒病毒载体的构建

使用Cyagen Biosciences的VectorBuilder软件和Cyagen Biosciences的包装服务生产了用于递送Kir7.1蛋白的慢病毒载体。以下的表4-表6和图13总结了成功地拯救KCNJ13基因中的生理缺陷的慢病毒载体的构建。

表4：载体总结

载体识别号	VB161020-1047mdf
		载体名称	pLV[Exp]-Bsd-EFIA>{EGFP-Kir7.1}
形成的日期(太平洋时间)	2016年10月19日
		大小	10207bp
载体类型	慢病毒基因表达载体(第三代)
		插入的启动器	EF1A
插入的DRF	{EGFP-Kir 7.1}
		拷贝数	高
细菌耐药性	氨苄青霉素
		克隆宿主	Stbl3

图17中的表5和表6提供了慢病毒载体的颜色索引和序列表(SEQ ID NO:10)。

慢病毒病毒载体包装

慢病毒载体系统是高效的载体，用于将基因永久性地引入哺乳动物细胞中。慢病毒载体来源于HIV，它是逆转录病毒家族的成员。野生型慢病毒具有正链线性RNA基因组。

首先在大肠杆菌中构建慢病毒载体，作为大肠杆菌中的质粒。然后将它与几种辅助质粒一起转染到包装细胞中。在包装细胞中，位于两个长末端重复序列(LTR)之间的载体DNA被转录到RNA中，由辅助质粒表达的病毒蛋白将RNA进一步包装至病毒中。然后使活病毒释放入上清液中，该上清液可以用于直接地或在浓缩后感染靶细胞。

通过设计，慢病毒载体缺少病毒包装和转导所需的基因(这些基因由病毒包装过程中使用的辅助质粒携带)。作为结果，从慢病毒载体中产生的病毒具有不能复制的重要安全特征(这意味着它们可以转导靶细胞但不能在其中复制)。

本文中所述的慢病毒病毒载体可来源于第三代慢病毒载体系统。参见例如，《病毒学杂志 (J Virol)72:8463(1998)。其被优化以便在大肠杆菌中进行高拷贝数复制、活病毒的高滴度包装、大范围细胞的有效病毒转导、有效地将载体整合入宿主基因组中、以及高水平转基因表达。

本文中所述的慢病毒病毒载体的包装系统可将VSV-G包膜蛋白添加到病毒表面。该蛋白具有广泛的向化性，我们发现它可在体外或体内有助于转导视网膜色素上皮(RPE)细胞。

序列表

<110> 威斯康星校友研究基金会

B·帕特耐克

P·夏希

<120> KIR 7.1基因治疗载体及其使用方法

<130> 960296.03962

<150> US 62/743,623

<151> 2018-10-10

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 360

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Asp Ser Ser Asn Cys Lys Val Ile Ala Pro Leu Leu Ser Gln Arg

1 5 10 15

Tyr Arg Arg Met Val Thr Lys Asp Gly His Ser Thr Leu Gln Met Asp

20 25 30

Gly Ala Gln Arg Gly Leu Ala Tyr Leu Arg Asp Ala Trp Gly Ile Leu

35 40 45

Met Asp Met Arg Trp Arg Trp Met Met Leu Val Phe Ser Ala Ser Phe

50 55 60

Val Val His Trp Leu Val Phe Ala Val Leu Trp Tyr Val Leu Ala Glu

65 70 75 80

Met Asn Gly Asp Leu Glu Leu Asp His Asp Ala Pro Pro Glu Asn His

85 90 95

Thr Ile Cys Val Lys Tyr Ile Thr Ser Phe Thr Ala Ala Phe Ser Phe

100 105 110

Ser Leu Glu Thr Gln Leu Thr Ile Gly Tyr Gly Thr Met Phe Pro Ser

115 120 125

Gly Asp Cys Pro Ser Ala Ile Ala Leu Leu Ala Ile Gln Met Leu Leu

130 135 140

Gly Leu Met Leu Glu Ala Phe Ile Thr Gly Ala Phe Val Ala Lys Ile

145 150 155 160

Ala Arg Pro Lys Asn Arg Ala Phe Ser Ile Arg Phe Thr Asp Thr Ala

165 170 175

Val Val Ala His Met Asp Gly Lys Pro Asn Leu Ile Phe Gln Val Ala

180 185 190

Asn Thr Arg Pro Ser Pro Leu Thr Ser Val Arg Val Ser Ala Val Leu

195 200 205

Tyr Gln Glu Arg Glu Asn Gly Lys Leu Tyr Gln Thr Ser Val Asp Phe

210 215 220

His Leu Asp Gly Ile Ser Ser Asp Glu Cys Pro Phe Phe Ile Phe Pro

225 230 235 240

Leu Thr Tyr Tyr His Ser Ile Thr Pro Ser Ser Pro Leu Ala Thr Leu

245 250 255

Leu Gln His Glu Asn Pro Ser His Phe Glu Leu Val Val Phe Leu Ser

260 265 270

Ala Met Gln Glu Gly Thr Gly Glu Ile Cys Gln Arg Arg Thr Ser Tyr

275 280 285

Leu Pro Ser Glu Ile Met Leu His His Cys Phe Ala Ser Leu Leu Thr

290 295 300

Arg Gly Ser Lys Gly Glu Tyr Gln Ile Lys Met Glu Asn Phe Asp Lys

305 310 315 320

Thr Val Pro Glu Phe Pro Thr Pro Leu Val Ser Lys Ser Pro Asn Arg

325 330 335

Thr Asp Leu Asp Ile His Ile Asn Gly Gln Ser Ile Asp Asn Phe Gln

340 345 350

Ile Ser Glu Thr Gly Leu Thr Glu

355 360

<210> 2

<211> 1083

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

atggacagca gtaattgcaa agttattgct cctctcctaa gtcaaagata ccggaggatg 60

gtcaccaagg atggccacag cacacttcaa atggatggcg ctcaaagagg tcttgcatat 120

cttcgagatg cttggggaat cctaatggac atgcgctggc gttggatgat gttggtcttt 180

tctgcttctt ttgttgtcca ctggcttgtc tttgcagtgc tctggtatgt tctggctgag 240

atgaatggtg atctggaact agatcatgat gccccacctg aaaaccacac tatctgtgtc 300

aagtatatca ccagtttcac agctgcattc tccttctccc tggagacaca actcacaatt 360

ggttatggta ccatgttccc cagtggtgac tgtccaagtg caatcgcctt acttgccata 420

caaatgctcc taggcctcat gctagaggct tttatcacag gtgcttttgt ggcgaagatt 480

gcccggccaa aaaatcgagc tttttcaatt cgctttactg acatagcagt agtagctcac 540

atggatggca aacctaatct tatcttccaa gtggccaaca cccgacctag ccctctaacc 600

agtgtccggg tctcagctgt actctatcag gaaagagaaa atggcaaact ctaccagacc 660

agtgtggatt tccaccttga tggcatcagt tctgacgaat gtccattctt catctttcca 720

ctaacgtact atcactccat tacaccatca agtcctctgg ctactctgct ccagcatgaa 780

aatccttctc actttgaatt agttgtattc ctttcagcaa tgcaggaggg cactggagaa 840

atatgccaaa ggaggacatc ctacctacag tctgaaatca tgttacatca ctgttttgca 900

tctctgttga cccgaggttc caaatgtgaa tatcaaatca agatggagaa ttttgacaag 960

actgtccctg aatttccaac tcctctggtt tctaaaagcc caaacaggac tgacctggat 1020

atccacatca atggacaaag cattgacaat tttcagatct ctgaaacagg actgacagaa 1080

taa 1083

<210> 3

<211> 1179

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240

gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300

acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360

gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420

cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480

ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540

caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600

gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660

gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720

ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780

gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840

acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900

tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960

tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020

gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080

ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140

gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179

<210> 4

<211> 626

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

aattctgtca ttttactagg gtgatgaaat tcccaagcaa caccatcctt ttcagataag 60

ggcactgagg ctgagagagg agctgaaacc tacccggggt caccacacac aggtggcaag 120

gctgggacca gaaaccagga ctgttgactg cagcccggta ttcattcttt ccatagccca 180

cagggctgtc aaagacccca gggcctagtc agaggctcct ccttcctgga gagttcctgg 240

cacagaagtt gaagctcagc acagccccct aacccccaac tctctctgca aggcctcagg 300

ggtcagaaca ctggtggagc agatccttta gcctctggat tttagggcca tggtagaggg 360

ggtgttgccc taaattccag ccctggtctc agcccaacac cctccaagaa gaaattagag 420

gggccatggc caggctgtgc tagccgttgc ttctgagcag attacaagaa gggactaaga 480

caaggactcc tttgtggagg tcctggctta gggagtcaag tgacggcggc tcagcactca 540

cgtgggcagt gccagcctct aagagtgggc aggggcactg gccacagagt cccagggagt 600

cccaccagcc tagtcgccag gtcgac 626

<210> 5

<211> 3048

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成的

<400> 6

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<220>

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<212> DNA

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成的

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tttgcccttt ttgagtttgg atcttggttc attctcaagc ctcagacagt ggttcaaagt 1320

ttttttcttc catttcaggt gtcgtgacaa gtttgtacaa aaaagcaggc tgccaccatg 1380

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 1440

gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 1500

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 1560

gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 1620

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 1680

aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 1740

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 1800

ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 1860

atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 1920

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 1980

ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 2040

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtccgga 2100

ctcagatctc gagctcaagc ttcgaattct gacagcagta attgcaaagt tattgctcct 2160

ctcctaagtc aaagataccg gaggatggtc accaaggatg gccacagcac acttcaaatg 2220

gatggcgctc aaagaggtct tgcatatctt cgagatgctt ggggaatcct aatggacatg 2280

cgctggcgtt ggatgatgtt ggtcttttct gcttcttttg ttgtccactg gcttgtcttt 2340

gcagtgctct ggtatgttct ggctgagatg aatggtgatc tggaactaga tcatgatgcc 2400

ccacctgaaa accacactat ctgtgtcaag tatatcacca gtttcacagc tgcattctcc 2460

ttctccctgg agacacaact cacaattggt tatggtacca tgttccccag tggtgactgt 2520

ccaagtgcaa tcgccttact tgccatacaa atgctcctag gcctcatgct agaggctttt 2580

atcacaggtg cttttgtggc gaagattgcc cggccaaaaa atcgagcttt ttcaattcgc 2640

tttactgaca cagcagtagt agctcacatg gatggcaaac ctaatcttat cttccaagtg 2700

gccaacaccc gacctagccc tctaaccagt gtccgggtct cagctgtact ctatcaggaa 2760

agagaaaatg gcaaactcta ccagaccagt gtggatttcc accttgatgg catcagttct 2820

gacgaatgtc cattcttcat ctttccacta acgtactatc actccattac accatcaagt 2880

cctctggcta ctctgctcca gcatgaaaat ccttctcact ttgaattagt tgtattcctt 2940

tcagcaatgc aggagggcac tggagaaata tgccaaagga ggacatccta cctaccgtct 3000

gaaatcatgt tacatcactg ttttgcatct ctgttgaccc gaggttccaa aggtgaatat 3060

caaatcaaga tggagaattt tgacaagact gtccctgaat ttccaactcc tctggtttct 3120

aaaagcccaa acaggactga cctggatatc cacatcaatg gacaaagcat tgacaatttt 3180

cagatctctg aaacaggact gacagaataa ggatccaccc agctttcttg tacaaagtgg 3240

tgatggccgg ccgcttcgag cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 3300

aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 3360

tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt 3420

tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg 3480

taatcgatag atctaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg 3540

ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc 3600

ctcagtgagc gagcgagcgc gcagctgcct gcaggcagct tggcactggc cgtcgtttta 3660

caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 3720

cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 3780

cgcagcctga atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 3840

atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 3900

cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 3960

ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 4020

taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 4080

aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 4140

ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 4200

tcaaccctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 4260

ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 4320

ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 4380

cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 4440

cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 4500

caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 4560

tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 4620

ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 4680

gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 4740

cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 4800

tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 4860

tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 4920

cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 4980

tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 5040

agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 5100

ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 5160

ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 5220

aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 5280

gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 5340

tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 5400

ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc 5460

cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 5520

atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 5580

cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 5640

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 5700

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 5760

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 5820

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 5880

taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 5940

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 6000

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 6060

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 6120

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 6180

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 6240

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 6300

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 6360

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt 6420

ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga 6480

ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc 6540

tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 6600

cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt 6660

tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 6720

caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tg 6752

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

ccgctcgagt accttccaag tgctgtcaaa c 31

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

cgacgcgtca tgctgaattc cttaatttgc 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

ctagctagct cctcccagcg taacgtgagc 30

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

gaagatctct agtggcagcc ccatggtg 28

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

ctagctagcc tgtcctctta ggcagataca ga 32

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

gaagatctag agccttcatg ttgactgcta 30

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 17

gaaagttggg gatgaggcga 20

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 18

caatcaaagc ttcctcagag ctgccgggcg gct 33

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

gacatgcgct ggcgttggat g 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

gacatgcgct agcgttggat g 21

Claims

1.一种基因治疗载体，其包含与编码Kir7.1多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子。

2.根据权利要求1所述的基因治疗载体，其中所述Kir7.1多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的多肽。

3.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中所述启动子是异源启动子。

4.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中所述启动子在受试者的眼睛的视网膜色素上皮(RPE)中具有活性。

5.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中所述启动子是EF1a启动子或VMD2启动子。

6.根据权利要求5所述的基因治疗载体，其中所述启动子是与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的EF1a启动子。

7.根据权利要求5所述的基因治疗载体，其中所述启动子是与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的VMD2启动子。

8.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中所述启动子和多核苷酸是在双链DNA、单链DNA或RNA中被编码。

9.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体是病毒载体。

10.根据权利要求9所述的基因治疗载体，其中所述病毒载体选自由逆转录病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体和腺病毒载体所组成的组。

11.根据权利要求10所述的基因治疗载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

12.根据权利要求11所述的基因治疗载体，其中所述慢病毒载体还包含表5或表6所列出组分中的至少一种组分。

13.根据权利要求10所述的基因治疗载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒载体(AAV)。

14.根据权利要求13所述的基因治疗载体，其中所述AAV载体还包含表2或表3中所列出组分中的至少一种组分。

15.根据权利要求13-14中任一项所述的基因治疗载体，其中所述AAV载体是AAV2载体。

16.根据权利要求9-15中任一项所述的基因治疗载体，其中所述病毒载体是病毒颗粒。

17.根据权利要求16所述的基因治疗载体，其中所述病毒颗粒包含VSV-G包膜蛋白。

18.一种慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体，其包含与SEQ ID NO:5(EF1a-Kir7.1)或SEQ ID NO:6(VMD2-Kir7.1)具有至少90％序列同一性的多核苷酸。

19.一种治疗组合物，其包含根据权利要求1-18中任一项所述的基因治疗载体、和药学上可接受的载体。

20.一种对患有与Kir7.1多肽表达或功能不足相关联的病症的受试者进行治疗的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的基因治疗载体或根据权利要求19所述的治疗组合物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述病症与KCNJ13基因中的至少一个功能丧失突变相关联。

22.根据权利要求20-21中任一项所述的方法，其中所述至少一个功能丧失突变导致对SEQ ID NO:1的选自由以下项组成的组的取代：W53Ter、Q116R、I120T、T153I、R162Q、R166Ter、L241P、E276A、S105I和G219Ter。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述病症选自由莱伯氏先天性黑蒙症16(LCA16)、色素性视网膜炎、和雪花玻璃体视网膜变性(SVD)所组成的组。

24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述基因治疗载体或治疗组合物是在眼内施用。

25.根据权利要求24所述的方法，其中将所述基因治疗载体或治疗组合物经视网膜下施用于所述受试者的至少一只眼睛。

26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法，其中将所述基因治疗载体的10⁹至10¹²个拷贝施用给所述受试者。

27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

28.一种在视网膜色素上皮(RPE)细胞中表达异源多肽的方法，其包括使所述RPE细胞与腺相关病毒2(AAV2)病毒颗粒接触，所述AAV2病毒颗粒包含与所述异源多肽可操作地连接的启动子。