CN110267673B - 利用chrimson来进行光遗传视觉恢复 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了(包括但不限于)用于重新激活哺乳动物视网膜神经节细胞的方法，包括施用有效量的蛋白或核酸形态的通道视紫红质(channelrhodopsin)(如ChrimsonR)或有效量的蛋白或核酸形态的与荧光蛋白融合的此类通道视紫红质(如ChrimsonR)或其组合物。所述方法可以包括低于辐射安全极限的光刺激水平诱导RGC应答。所述方法可以包括通过腺相关病毒载体给药。所述方法可以包括使用CAG启动子。所述方法可以导致长期表达有效量的通道视紫红质(如ChrimsonR蛋白)。

Description

利用CHRIMSON来进行光遗传视觉恢复
相关申请交叉引用
本申请针对2016年4月29日提交的第62/329，692号美国临时申请主张优先权，以引用方式将该在先申请的内容全部纳入本申请。
序列表
本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式电子提交并以引用方式被全部纳入本申请。所述ASCII格式的文件副本于2017年4月28日创建，命名为"12295_0006-00304.txt"，大小为31字节。
技术领域
本发明提供了(包括但不限于)用于改变跨膜电导、细胞活性和细胞功能的组合物和方法，并涉及外源光激活离子通道在细胞和目标主体中的用途。具体而言，根据本发明的具体实施方式一方面涉及用于重新激活哺乳动物视网膜神经元细胞(RGC)的方法，所述方法包括对哺乳动物施用有效量的Chrimson多肽。在一些具体实施方式中，所述方法可包括低于辐射安全界限的光刺激水平诱导RGC应答。在一些具体实施方式中，所述Chrimson多肽与荧光蛋白融合。在一些具体实施方式中，所述荧光蛋白为tdTomato(tdT)或绿色荧光蛋白(GFP)。
背景技术
视网膜由光感受器组成，光感受器是高度特化的神经元，其通过光转导负责视网膜的光敏性，光转导是指光转换为在视觉系统内传播一连串事件的电信号和化学信号，最终生成世界的图像。在脊椎动物的视网膜中，光转导是通过激活光敏受体蛋白视紫红质来开始的。
光感受器缺失或退化，例如视网膜色素变性(RP)或黄斑变性(MD)，即使没有完全抑制，也会严重的降低视网膜内视觉信息的光转导。光感受器细胞的缺失和/或光感受器细胞功能的缺失是视敏度下降、光敏性下降和失明的主要原因。
现在有数种专门用于视网膜退化疾病的疗法在研发中，包括基因疗法、干细胞疗法、光遗传学和视网膜假体(Scholl等，2016年，《Science Translational Medicine》，8(368)，368第6次修订)。
举例而言，有人提议通过被称为光遗传学的基因和神经工程学技术来控制规定数量的神经元的活动同时不影响大脑中的其它神经元来恢复目标主体视网膜的光敏性。与试图替换或修复有缺陷的基因或通过修正蛋白缺失或功能障碍来绕过基因缺陷的传统基因疗法相反，用光遗传学方法进行治疗可被用于赋予视网膜中通常对光不敏感的细胞对光进行应答的能力，从而为患者恢复有用视力。与向双极或神经节细胞提供细胞外电刺激的视网膜芯片移植物不同，基于光遗传学的疗法从细胞内部刺激细胞。
光遗传学(Deisseroth，《Nat Methods》8(1):26-9，2011)是指遗传学和光学组合来控制生物体组织中特定细胞内的充分定义事件。光遗传学涉及将光敏感通道导入细胞，所述光敏感通道允许以毫秒精度来操纵神经活动，同时通过特定靶向机制来保持细胞类型分辨率(cell-type resolution)。它包括发现赋予光应答性的基因并将该基因插入细胞。它还包括用于将光送入复杂如哺乳动物的有机体，将光敏性靶向感兴趣的细胞，以及对该光学控制的特定输出结果或效果进行评估的相关技术。
举例而言，WO2007024391、WO2008022772或WO2009127705描述了来自植物和微生物(如古细菌、细菌和真菌)的、编码光敏感离子通道和离子泵(如二型通道视紫红质[ChR2]；氯视紫红质[NpHR])的蛋白酶基因的用途，其被改造为在哺乳动物神经元中表达，并能够通过病毒载体在基因水平上植入特定的神经群。当暴露在具有适当波长的光中时，动作电位可以在表达视蛋白的神经元中触发，从而使这些细胞具有光敏性。
近年来，来自于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)或团藻(Volvoxcarteri)的四种通道视紫红质基因的一些通道视紫红质被改造用于神经科学应用。然而，这些天然通道视紫红质只有蓝绿色(430-550nm)的光谱峰，被改造的红移通道视紫红质(如C1V1和ReaChR)的峰值波长敏感性在绿色光谱(～545nm)(mattis等人，《Nature Methods》，2011年12月18日；9(2):159-72；Lin等人，《Nature Neuroscience》，2013年10月；16(10):1499-508)。
在2014年，Klapoetke等人(《Nat Methods》，11(3)，338-346)因此通过探索天然通道视紫红质的基因多样性来寻求克服这些缺陷，旨在发现具有未在前述通道视紫红质中找到的独特性质的新型视蛋白。因此，WO2013071231披露了新的通道视紫红质Chronos和Chrimson，它们彼此之间以及与现有技术(如ChR2/VChRl)之间具有不同的激活光谱，并允许使用多个不同波长的光对同一组织中的不同细胞群进行去极化，所述去极化是通过以下方式实现的：通过在不同细胞中基因表达具有不同激活光谱的通道，然后用不同颜色的光照射所述组织。更具体而言，与任何以往通道视紫红质相比，Chrimson具有45nm的红移；这对于优选使用红光的情况可能很重要，因为与其它通道视紫红质变体所需的蓝色到绿色波长相比，红光被组织散射得更弱，被血液吸收的也更少。
视蛋白通常与荧光蛋白融合，以促进在表达视蛋白的细胞中的可视化，从而监测它们的细胞内定位。有进一步的情况表明，所使用的某些类型的荧光蛋白可以在特定条件下调节视蛋白细胞定位。例如，Arrenberg等人(2009年，《PNAS》，106(42)，17968-73)观察到，含有相同视蛋白但不同荧光标签(即红色荧光蛋白mCherry或黄色荧光蛋白YFP)的融合蛋白有时分布在不同的细胞区室。
然而，这一发现在tdTomato荧光标签上没有得到证实，因为在表达与tdTomato融合的二型通道视紫红质的转基因动物中没有发现表达水平或膜定位存在明显差异(Madisen等人，2012年，《Nat Neurosci.》，15(5):793-802)。此外，到目前为止，没有任何与融合蛋白的定位或表达水平的变化相关的视蛋白活性改进的报告。
发明内容
在一个具体实施方式中，本发明显示，Chrimson蛋白，特别是其一种被称为ChrimsonR(ChrR)的特殊突变体，与tdTomato(tdT)荧光蛋白或绿色荧光蛋白(GFP)融合后，比单独的Chrimson蛋白能更有效地应答光刺激。在所述方法的一些具体实施方式中，对于给定数量的细胞，与单独/未融合的Chrimson蛋白的表达水平相比，荧光蛋白提高了融合的Chrimson蛋白的表达水平，尤其是质膜上的蛋白水平。在所述方法的另一些具体实施方式中，与单独/未融合的Chrimson蛋白的细胞运输相比，荧光蛋白提高了融合的Chrimson到质膜的细胞运输能力。在所述方法的一些具体实施方式中，融合的Chrimson蛋白的表达水平和/或细胞运输能力通过增强的Chrimson蛋白溶解度、运输能力和/或蛋白构象来提高。
在一个方面，本发明包括编码Chrimson蛋白和荧光蛋白的多核苷酸序列。
在另一个方面，本发明包括编码与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白的多核苷酸序列。
在另一个方面，本发明包括一种组合物，所述组合物包括载体。所述载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括至少一个Chrimson蛋白和荧光蛋白。
在另一个方面，本发明包括一种组合物，所述组合物包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
在另一个方面，本发明包括一种用于治疗或预防目标主体神经元介导的障碍的方法，其中所述方法包括向细胞(即神经元)施用包括载体的组合物。所述载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括至少一个Chrimson蛋白和荧光蛋白。优选地，被施用的组合物的载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
在另一个方面，本发明包括一种恢复视网膜内部细胞的光敏感性的方法。所述方法包括向细胞施用包括载体的组合物。所述载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括至少一个Chrimson蛋白和荧光蛋白。优选地，被施用的组合物的载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
在另一个方面，本发明包括一种恢复目标主体视力的方法。所述方法包括确认目标主体是因为光感知或敏感性不足而丧失视力；对眼睛施用包括载体的组合物，所述载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括至少一个Chrimson蛋白和荧光蛋白；用光激活所述多肽；测定目标主体的光敏感性，其中增加的光敏感性代表视力恢复。
在另一个方面，本发明包括一种恢复目标主体视力的方法，其中所述方法包括确认目标主体是因为光感知或敏感性不足而丧失视力；对眼睛施用包括载体的组合物，所述载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括至少一个与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白；用光激活所述多肽；测定目标主体的光敏感性，其中增加的光敏感性代表视力恢复。
在其他方面，本发明包括治疗或预防目标主体视网膜变性的方法。所述方法包括确认目标主体是因为光感受器功能丧失而导致视网膜变性；对眼睛施用包括载体的组合物，所述载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括至少一个Chrimson蛋白和荧光蛋白；以及测定目标主体的光敏感性，其中增加的敏感性代表对视网膜变性具有疗效。
在另一个方面，本发明包括治疗或预防目标主体视网膜变性的方法。所述方法包括确认目标主体是因为光感受器功能丧失而导致视网膜变性；施用包括载体的组合物，所述载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括至少一个与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白；以及测定目标主体的光敏感性，其中增加的敏感性代表对视网膜变性具有疗效。
在某些方面，本发明包括一种恢复人眼光感受器功能的方法。所述方法包括施用有效量的组合物，所述组合物包括载体，所述载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括至少一个Chrimson蛋白和荧光蛋白。
在另一个方面，本发明包括一种恢复人眼光感受器功能的方法。所述方法包括施用有效量的组合物，所述组合物包括载体，所述载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括至少一个与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
在其它方面，本发明包括一种电活性细胞的去极化方法。所述方法包括对细胞施用组合物，所述组合物包括载体，所述载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括至少一个Chrimson蛋白和荧光蛋白。
在另一个方面，本发明包括一种电活性细胞的去极化方法。所述方法包括对细胞施用组合物，所述组合物包括载体，所述载体包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括至少一个与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
在根据本发明的方法的一些具体实施方式中，载体是腺相关病毒(AAV)载体。在根据本发明的方法的一些具体实施方式中，载体是AAV2.7m8载体或AAV2载体。在一些具体实施方式中，所述方法还包括使用CAG启动子。
在一些具体实施方式中，载体是通过注射给药的，优选的为玻璃体注射。
在根据本发明的方法的一些具体实施方式中，有效量的Chrimson蛋白是长期表达的。在根据本发明的方法的一些具体实施方式中，在注射后至少11个月后，Chrimson蛋白仍持续表达。在根据本发明的方法的一些具体实施方式中，在注射后至少2个月后，Chrimson蛋白仍持续表达。
在根据本发明的方法的一些具体实施方式中，目标主体是哺乳动物。在一些具体实施方式中，目标主体是人。在一些具体实施方式中，所述哺乳动物是小鼠。在根据本发明的方法的一些具体实施方式中，所述小鼠是rd1。在根据本发明的方法的一些具体实施方式中，所述哺乳动物是大鼠。在根据本发明的方法的一些具体实施方式中，所述大鼠是P23H。在根据本发明的方法的一些具体实施方式中，所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。在根据本发明的方法的一些具体实施方式中，所述非人类灵长类动物是食蟹猕猴。以下披露内容还提供了以下附加具体实施方式:
具体实施方式1提供了一种用于重新激活哺乳动物视网膜神经节细胞(RGC)的方法，所述方法包括对哺乳动物施用载体，所述载体表达有效量的与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
具体实施方式2提供了一种治疗或预防目标主体神经元介导的障碍的方法，所述方法包括对神经元施用组合物，所述组合物包括载体，所述载体表达有效量的与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
具体实施方式3提供了一种恢复内部视网膜细胞光敏感性的方法，其中所述方法包括对内部视网膜细胞施用组合物，所述组合物包括载体，所述载体表达有效量的与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
具体实施方式4提供了一种恢复目标主体视力的方法，其中所述方法包括对目标主体施用组合物，所述组合物包括载体，所述载体表达有效量的与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
具体实施方式5提供了一种恢复目标主体视力的方法，其中所述方法包括确认目标主体是因为光感知或敏感性不足而丧失视力，并对目标主体施用组合物，所述组合物包括载体，所述载体表达有效量的与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
具体实施方式6提供了一种治疗或预防目标主体视网膜变性的方法，所述方法包括确认目标主体是因为光感受器功能丧失而导致视网膜变性，并对目标主体施用组合物，所述组合物包括载体，所述载体表达有效量的与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
具体实施方式7提供了一种恢复人眼光感受器功能的方法，其中所述方法包括确认目标主体是因为光感知或敏感性不足而丧失视力，并对目标主体施用组合物，所述组合物包括载体，所述载体表达有效量的与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
具体实施方式8提供了一种电活性细胞的去极化方法，所述方法包括对细胞施用组合物，所述组合物包括载体，所述载体表达有效量的与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白。
具体实施方式9提供了根据具体实施方式1至8中任一项所述的方法，其中低于辐射安全极限的光刺激水平诱导RGC应答。
具体实施方式10提供了根据具体实施方式1至8中任一项所述的方法，其中Chrimson蛋白为Chrimson88或ChrimsonR。
具体实施方式11提供了具体实施方式10所述的方法，其中所述荧光蛋白选自Td-Tomato(TdT)蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)。
具体实施方式12提供了具体实施方式11所述的方法，其中与TdT蛋白融合的Chrimson蛋白比单独的Chrimson蛋白更有效地应答光刺激。
具体实施方式13提供了具体实施方式10所述的方法，其中，对于给定数量的细胞，与单独的Chrimson蛋白的表达水平相比，所述荧光蛋白提高了融合的Chrimson蛋白的表达水平。
具体实施方式14提供了具体实施方式13所述的方法，其中融合的Chrimson蛋白的表达水平通过增强的Chrimson蛋白溶解度、运输能力和/或蛋白构象来提高。
具体实施方式15提供根据具体实施方式1至8中任一项所述的方法，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。
具体实施方式16提供了具体实施方式15所述的方法，其中所述AAV载体选自AAV2载体和AAV2.7m8载体。
具体实施方式17提供了具体实施方式16所述的方法，其中所述AAV载体为AAV2.7m8载体。
具体实施方式18提供了根据具体实施方式1至8中任一项所述的方法，其中所述载体包括CAG启动子。具体实施方式19提供了根据具体实施方式1至8中任一项所述的方法，其中所述载体是通过玻璃体注射的。
具体实施方式20提供了根据具体实施方式1至8中任一项所述的方法，其中有效量的与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白被长期表达。
具体实施方式21提供了具体实施方式20所述的方法，其中所述与荧光蛋白融合的Chrimson蛋白在给药后至少2个月后或至少11个月后仍持续表达。
具体实施方式22提供了组合物，所述组合物包括具体实施方式1至21中任一项所述的一个或多个载体。具体实施方式23提供了组合物，所述组合物包括编码一个或多个Chrimson蛋白和一个或多个荧光蛋白的多核苷酸，所述一个或多个Chrimson蛋白和一个或多个荧光蛋白可以是融合的，也可以是单独的。
具体实施方式24提供权利要求22和23中任一项所述的组合物在权利要求1-21中任一项所述的一个或多个方法中的用途。
具体实施方式25提供权利要求22和23中所述的任何一种组合物在以下方面的用途：重新激活哺乳动物的视网膜神经节细胞(RGC)、治疗或预防目标主体的神经元介导的障碍、恢复内部视网膜细胞对光的敏感性、治疗或防止目标主体视网膜变性、恢复光感受器功能和/或去极化电活性细胞。
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附图说明
图1：在rdl小鼠体内的方法。
图2A至2D：变性rdl小鼠视网膜应答具有匹配ChrimsonR光谱灵敏度的波长的光，应答时长小于10ms。图2A-注射后2个月表达ChrR-tdT的rdl小鼠的眼底。图2B-安装在MEA芯片上的rdl小鼠视网膜的TdT荧光。图2C-表达ChrR的小鼠视网膜的光谱灵敏度(n＝l视网膜，188个电极)。图2D-对波长为590nm、射流密度为le17photons.cm-2s-1、时长递增的刺激应答而增加的放电频率(firing rate)。所有记录都是在L-AP4、CNQX和CCP混合物存在的条件下进行的。
图3A至3C：ChrimsonR在rdl小鼠中与tdT融合时效率更高。图3A-感染ChrR或ChrR-tdT的视网膜对比，ChrR-tdT更有效地应答光刺激。图3B-表达ChrR-tdT的视网膜的应答RGC的原始数据、栅格图和平均PSTH(分别从上到下)。图3C-表达ChrR(n＝4个视网膜，27个细胞)或ChrR-tdT(n＝6个视网膜，548个细胞)的视网膜的强度图，显示了不同刺激强度下的激活水平。
图4A到4G：ChrimsonR在神经节细胞中的表达。ChrR-tdT在rdl小鼠的视网膜神经节细胞(RGC)中的表达。ChrR-tdT在体内AAV感染后的表达主要限于视网膜神经节细胞.图4A、图4B和图4C-共焦层叠(confocal stack)的投影显示在两个RGC示例中的膜定位表达。图4A-内生tdTomato的图像，无免疫放大。图4B-我们定制的ChrR抗体的标记图像。图4C-两个图像(图4A和4B)的重叠，品红色和青色分别为tdTomato和ChrR抗体。图像用40x物镜拍摄。ChrR-tdT表达在RGC膜中富集。图4D和图4E-显示两个RGC细胞体的三个光学片的投影(见图4C中的小图)，用60x物镜拍摄。图4F和图4G-图4D和图4E中细胞体各自荧光强度的3D曲面图。表示最高荧光强度的峰，在细胞膜或附近集中。
图5A至5D：Chrimson R长期表达。记录注射后10个月的rdl小鼠的多电极阵列。图5A-表达ChrR-tdT的视网膜图像，其显示在注射后10个月表达仍在持续。图5B-在一个电极上测定的活动示例，顶部-红色光刺激，中部-相同细胞应答重复10次闪光的栅格图，底部-平均PTSH(块大小：SOms)。图5C-对强度递增(n＝4个视网膜，308个电极)的闪光应答而增加的放电频率。图5D-对波长为590nm、射流密度为le17photons.cm-2s-1、时长递增的闪光应答而增加的放电频率。所有记录都是在L-AP4、CNQX和CCP混合物存在的条件下进行的。
图6A至6B：Chrimson R重新激活P23H视网膜。记录了另一个变性啮齿类模型-P23H大鼠的多电极阵列。图6A-注射后1个月多电极阵列上的P23H视网膜荧光图像。图6B-对波长为590nm、射流密度为le17photons.cm-2s-1、强度递增(n＝2个视网膜，91个电极)的刺激应答而增加的放电频率。所有记录都是在L-AP4、CNQX和CCP混合物存在的条件下进行的。
图7：非人类灵长类动物体内的方法。采用四种不同的策略检测了非人类灵长类动物(食蟹猕猴)的ChrR表达。2种不同的构建物：ChrimsonR(ChrR)或融合蛋白ChrimsonR-td-Tomato(ChrR-tdT)，均在CAG启动子作用下。2种不同的病毒衣壳：野生类型AAV2和突变型AAV2-7m8(Dalkara等人，2013年，《Science Translational Medicine》，5(189):189ra76)。在MEA(512阵列、MCS)或膜片钳(见Poster Chaffiol等人，摘要599-B0072)记录前两个月进行了单病毒剂量(5x1011vg/眼)注射。所有记录都是在突触封闭剂(LAP4 50μM和CPP 10μM)存在的情况下进行的。
图8A至8C：在体内注射构建物后，Chrimson R在周围凹(peri fovea)中表达。体内注射构建物导致在周围凹环的RGC中表达。图8A-视网膜外植体的红外图像，星号表示周围凹坑的凹陷。黑点是MEA阵列的电极。图8B-相同视网膜片的荧光图像，其感染了AAV2.7m8-ChrR-tdT构建物。表达被局限于周围凹环。图8C-图8A和图8B所示的视网膜外植体的光谱灵敏度。应答是所有应答电极每10次重复的平均值。光谱的形状和突触封闭剂的存在表明RGC中的ChrR是所记录活动来源。
图9A至9G：确定导致最有效转导的测试构建物。转导是通过应答电极的数量和光诱发应答的敏感性来评估的。图9A-一个电极对4种不同强度的闪光的应答示例。图9B-4种构建物的成套实验概述。有效电极：检测到动作电位的电极。应答电极：通过光刺激提高放电频率的电极。图9C-，图9D和图9E-每个应答视网膜对不同构建物的群体应答。每条彩色线代表单个电极应答，是每10次重复的平均值。每一行图表代表一个视网膜的应答，不同视网膜的每一列应答都是针对相同的光刺激(顶部的强度单位为photons/cm2/sec)。图9F-每个应答视网膜针对不同光强度平均增加的放电频率。已减去自然放电频率。图9G-图9F的细节放大图，以更好地显示应答阈值。所有刺激都是在600nm进行的。
图10A至图10D：感染了AAV2.7m8-ChR-tdT的视网膜对时长递增的周围凹RGC刺激的应答。在感染了AAV2.7m8-ChrR-tdT的视网膜中，周围凹RGC对时长递增的刺激的应答。图10A-对时长递增的光刺激的应答，每条线代表针对每次刺激的单个电极尖峰密度函数的10次重复平均值。图10B-所有被测时长的平均放电频率。图10C-4种不同的活动阈值在不同刺激时长时活性位点的分数(fraction)。图10D-到达首次高峰的时间，为在所有被测时长中每10次刺激重复的平均值。红点代表中值，框的边缘为数据的25％和75％，其余部分除了单独绘制的异常值外都被省略了。在1到5毫秒刺激之间的中值重要下降表明，大多数记录位点开始在这些时长内做出应答。所有刺激都是600+/-20nm，强度为2xl017photons.cm-2.s-1。
图11：tdTomato对ChrimsonR mRNA水平的影响。ChrimsonR在RT-qPCR反应中的扩增曲线。Y轴表示对应于实验反应的增量Rn值减去基线信号的Rn值。该参数可靠地计算由一组给定的PCR引物生成的特定信号的大小。洋红色和紫色的痕迹代表ChrimsonR；黄色和橙色的痕迹代表ChrimsonR-tdTomato；深蓝色和浅蓝色的痕迹是不可转染的对照物。实验重复3次，每次实验在2个板材上进行，总共重复6次。每个样品在每个板材上都进行三次实验。
图12A至12B：HEK293细胞与pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato、pssAAV-CAG-ChrimsonR及pssAAV-CAG-ChrimsonR-GFP质粒转染时的ChrimsonR蛋白水平。
图13：tdTomato对表达ChrimsonR的细胞数量的影响。ChrimsonR阳性细胞的百分比代表用质粒479(ChrimsonR-tdTomato)和480(ChrimsonR)转染的细胞与非转染对照物的比值。荧光细胞的百分比是通过使用阈值来消除背景荧光来确定的。需要注意的是，细胞的数量并不代表每个细胞的荧光强度。基于该细胞计数方法，与两种构建物转染后表达ChrimsonR的细胞的百分比在统计学上无显著性差异。本实验中，误差条表示SEM(平均值标准误差)，实验重复了3次，在每个条件下技术重复实验3次。
图14A至14B：tdTomato对HEK293T细胞中ChrimsonR亚细胞定位的影响。转染的HEK293T细胞的图像；通过共焦z层叠(Z-stack)的最大投影获得。细胞核显示为蓝色(DAPI)，Chrimson R显示为白色。图14A显示了Chrimson R-tdTomato的定位；图14B显示了单独ChrimsonR的分布情况。刻度条20μm。
图15A至15B：tdTomato对AAV感染后的HEK293T细胞中ChrimsonR亚细胞定位的影响。转染HEK293T细胞的图像；通过共焦z层叠(Z-stack)的最大投影获得。细胞核显示为蓝色(DAPI)，Chrimson R显示为白色。图15A显示了Chrimson R-dtTomato的定位；图15B显示了单独ChrimsonR的分布情况。刻度条20μm。详细说明
在本发明中，除非另有具体说明，单数的使用包括复数、"一"或"一个"表示"至少一个"，而使用"或"表示"和/或"。此外，使用"包括"一词以及"包括(一般过去时)"和"包括(动名词)"等其他形式没有限定性。此外，除非另有具体说明，"要素"或"部件"等术语既包括含有一个单元的要素和部件，也包括含有一个以上单元的要素或部件。
本文中使用的术语"约"，当与百分比或其他数量一起使用时，是指该百分比或其他数量加减10％。例如，"约80％"包括80％加减8％。
本申请中引用的所有文件或部分文件，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和条约，都在此明确通过引用方式纳入本发明，以用于任意目的。如果一个或多个被纳入的文献和类似材料对某一术语的定义与本申请对该术语的定义互相矛盾，则以本申请的定义为准。
本发明所使用的术语"蛋白"、"多肽"和"肽"是可互换的，除非另有指明。
在本发明中使用时，术语"融合蛋白"或"与另一个...融合的蛋白"是指蛋白构建物或嵌合蛋白。它是指单个蛋白分子，包含两个或两个以上的蛋白或其片段，通过它们各自的肽链中的肽键共价连接，没有额外的化学接头。一个蛋白可以在N端或C端与另一个蛋白融合。融合蛋白可以进一步包含由遗传构建产生的接头部分。
在本发明中使用时，除非另有说明，术语"治疗(动词)"、"治疗(动名词)"、"治疗(名词)"和"疗法"是指当目标主体患有疾病(例如神经元介导的障碍或视觉障碍)时发生的一种行为，从而减少了一个或多个症状的严重程度或该疾病的影响。在本发明中使用时，除非另有说明，"预防(动词)"、"预防(动名词)"和"预防(名词)"等术语是指在目标主体开始患有疾病(如神经元介导的障碍或视觉障碍)之前发生的行为，该行为延迟了疾病的发生，和/或抑制或降低上述疾病的严重程度。应当理解的是，治疗可以是预防性治疗，也可以是诊断出疾病或状况后实施的治疗。本发明的治疗可以减少或消除障碍、疾病或状况的症状或特征，也可以消除该障碍、疾病或状况本身。应当理解的是，本发明的治疗方法可以减缓或消除疾病、或障碍状况的发展，并在某些情况下可能导致疾病、障碍或状况的倒退。在本发明的一些具体实施方式中，本发明的一种或多种光激活离子通道多肽可在细胞群中表达，并用于治疗障碍或状况的方法。
在本发明中使用时，除非另有说明，化合物的"治疗有效量"是在神经元介导的障碍或视觉障碍的治疗或管理中足以提供任何治疗效益的量，或足以延迟或减轻与障碍(例如神经元介导的障碍或视觉障碍)相关的一个或多个症状的量。化合物的治疗有效量是指单独或与一种或多种其他疗法和治疗剂结合使用的化合物的量，所述化合物的量在障碍(例如神经元介导的障碍或视觉障碍)的治疗或管理中提供任何治疗效益。术语"治疗有效量"可以包括减轻神经元介导的障碍或视觉障碍、改善或减少视觉障碍、改善整体治疗、或提高另一种治疗剂的疗效的量。
在本发明中使用时，"患者"或"目标主体"包括正在患有或易患有本发明所述疾病的哺乳动物，如人类和非人类哺乳动物，非人类哺乳动物的非限制性示例包括啮齿动物、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物、陪伴动物(如狗和猫)，以及牲畜(如绵羊、牛、马等)。
通过根据本发明的编码Chrimson多肽的核酸(例如载体)对视网膜神经元转染，向视网膜神经元提供光敏膜通道，所述视网膜神经元优选双极细胞和/或神经节细胞。因此，可以如本发明所设想的用光刺激来测定视觉刺激到动物视觉皮层的传输，动物视觉皮层是大脑中负责处理构成一种视觉形式的视觉信号的区域。这种视觉可能不同于正常的人类视觉形式，也可能被称为对光的感觉，也被称为"光检测"或"光感知"。因此，本文中使用的"视觉"一词被定义为生物体有效地检测作为刺激的光的能力。"视觉"旨在涵盖以下方面：(一)光检测或感知，即辨别光是否存在的能力；(二)光投影，即辨别光刺激来自何方的能力；(三)分辨率，即能够检测格栅或字母目标中不同亮度水平(即对比度)；(四)识别，即通过参照目标内不同的对比度来识别视觉目标形状的能力。因此，"视觉"包括简单检测光是否存在的能力，所述光优选的为红光，更优选的所述光的波长为约365nm和约700nm之间，在约530nm和约640nm之间，并且在一些具体实施方式中，峰值激活可以在与波长约590nm的光接触时发生。
在本发明中使用时，"功能性衍生物"包括"突变体"、"变体"和"片段"，无论这些术语是结合使用还是交替使用。虽然保守性替换了例如2、3、4或5个残基也是符合本发明主旨的，优选的变体是单氨基酸保守性替换变体。在一些具体实施方式中，功能性衍生物与原始多肽的全长氨基酸序列至少有70％同源，优选的至少75％同源，更优选为至少80％同源，更优选为至少85％同源，更优选为至少90％同源，更优选为至少95％同源，更优选为至少99％同源，更优选为100％同源。同源性的百分比是根据相关氨基酸序列的长度确定的。因此，如果根据本发明的多肽包含在较大的多肽内，则仅就与根据本发明的多肽相对应的多肽部分确定同源性的百分比，而不是确定整个较大的多肽的同源性百分比。与多肽序列相关的"同源性百分比"，是指使用碱基局部对齐检索工具(BLAST)引擎对齐的至少两个多肽序列之间的相同氨基酸的百分比。见Tatusova等人(1999年)(出处从前)。BLAST引擎由马里兰州贝塞斯达的国家生物技术信息中心(NCBI)向公众提供。根据特定的具体实施方式，功能性衍生物是一种多肽，它包括与原始多肽的全长序列至少有70％同源性的氨基酸序列，其中它与父多肽的区别仅在于一个或多个位置的替换。所述替换优选的为"保守性替换"或"半保守性"。此外/或者，功能性衍生物与原始多肽的全长氨基酸序列具有至少70％的一致性，优选的具有至少75％的一致性，更优选的具有至少80％的一致性，更优选的具有至少85％的一致性，更优选的具有至少90％的一致性，更优选的具有至少95％的一致性，更优选的具有至少99％的一致性，更优选的具有100％的一致性。确定序列一致性或同源性的方法在本领域是已知的。
在本发明中使用时，术语"保守性替换"一般是指保持蛋白或多肽的结构和功能特性的氨基酸替换。这种功能等效(保守性替换)肽氨基酸序列包括但不限于在由导致沉默变化(silent change)的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的氨基酸残基的添加或替换，从而制造功能等效的基因产物。保守型氨基酸替换可以基于相关残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行。例如:非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
本发明在某些方面涉及光激活离子通道多肽在细胞中的表达，所述光激活离子通道多肽可通过与一个或多个光脉冲接触而激活，从而导致细胞的强去极化。根据本发明的光激活通道多肽，也称为光激活离子通道，可在特定细胞、组织和/或生物体中表达，并用于控制体内、离体和体外的细胞对具有合适波长的光脉冲的应答。
在本发明中，术语"离子通道"是指形成孔的跨膜多肽，它在被激活时打开，允许离子电导通过孔穿过膜。根据本发明，光激活离子通道多肽包括Chrimson蛋白或其功能性衍生物，以及荧光蛋白。
根据本发明，光激活离子通道多肽包括与荧光蛋白融合Chrimson蛋白或其功能性衍生物。
根据特定具体实施方式，所述Chrimson蛋白选自蛋白ChR88(也称为Chrimson88-SEQ ID No:1)或其功能性衍生物,以及在K176R被替换的Chrimson88蛋白(也本发明中亦称为具有K176R替换的Chrimson88或ChrimsonR-SEQ ID No:2)或其功能性衍生物组成的组。
根据本发明，光激活离子通道多肽包括(i)ChR88蛋白(SEQ ID No:1)或其功能性衍生物，以及(ii)荧光蛋白。根据优选具体实施方式，根据本发明的光激活离子通道多肽包括(i)ChrimsonR蛋白(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物和(ii)荧光蛋白。
根据特殊具体实施方式，根据本发明的光激活离子通道多肽由ChR88蛋白(SEQIDNo:1)或其功能性衍生物和荧光蛋白组成，两种蛋白均以独立蛋白的方式表达。
根据另一具体实施方式，根据本发明的光激活离子通道多肽由ChrimsonR蛋白(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物和荧光蛋白组成，两种蛋白均以独立蛋白的方式表达。
根据优选具体实施方式，根据本发明的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChR88蛋白(SEQ ID No:1)或功能性衍生物组成。
根据更优选的具体实施方式，根据本发明的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChrimsonR蛋白(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物组成。
根据本发明的光激活离子通道多肽通过与红光接触，优选与波长在约365nm和约700nm之间的光接触，与波长在约530nm和约640nm之间的光接触，来被强烈激活，并且在一些具体实施方式中，峰值激活出现在与波长为约590nm的光接触时。
将包括根据本发明的光激活离子通道多肽的可兴奋细胞与波长在激活范围内的光接触将对细胞进行强烈的去极化。可用于对表达了根据本发明的光激活离子通道多肽的细胞进行去极化的示例性光波长，包括至少为约365nm、385nm、405nm、425nm、445nm、465nm、485nm、505nm、525nm、545nm、565nm、585nm；590nm、605nm、625nm、645nm、665nm、685nm；和700nm的波长，包括上述波长之间的所有波长。在一些具体实施方式中，根据本发明的光激活离子通道多肽在590nm具有峰值波长灵敏度，并可能会早上至660nm处引起尖峰。
根据本发明的光激活离子通道多肽可用于对可兴奋细胞进行去极化，所述可兴奋细胞中表达根据本发明的一个或多个光激活离子通道。在一些具体实施方式中，根据本发明的光激活离子通道多肽可以在细胞群中的细胞亚群中表达，所述细胞群还包括一个或多个额外细胞亚群，所述一个或多个额外细胞亚群表达被不会激活根据本发明的光激活离子通道多肽的光波长激活的光激活离子通道。
可用于各种具体实施方式的肽氨基酸序列包括本发明所述的光激活离子通道多肽(SEQ ID No:1或2，或5)以及功能等效多肽。
这种功能等效肽氨基酸序列(保守性替换体)包括但不限于在根据本发明的氨基酸序列中氨基酸残基的添加或替换，但这导致沉默变化，从而生成功能等效的多肽。氨基酸替换可以基于相关残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/和两亲性质的相似性进行。例如:非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守性氨基酸替换也可以基于氨基酸的亲水指数来进行。根据每个氨基酸的疏水性和电荷特性，为其分配亲水指数。它们是:异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯基丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。亲水氨基酸指数在赋予蛋白的相互作用生物功能的用途在本领域中是已知的(Kyte和Doolittle，《J.Mol.Biol.》，157:105-132，1982)。已知在某些情况下，某些氨基酸可以被替换为具有类似的亲水指数或分数的其他氨基酸，并仍然保留类似的生物活性。在基于相似亲水指数进行更改时，在某些具体实施方式中包括亲水指数在+-2范围内的氨基酸替换，在其他具体实施方式中包括亲水指数在+-1范围内的氨基酸替换，而在另一些具体实施方式中则包括亲水指数在+-0.5范围内的氨基酸替换。
保守性氨基酸替换也可以在亲水性的基础上进行，特别是在由此产生的生物功能性蛋白或肽旨在免疫学具体实施方式的情况下。在某些具体实施方式中，蛋白的最大局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性决定)与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白的生物学特性相关。这些氨基酸残基被分配了以下亲水值:精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+-1)；谷氨酸(+3.0+-1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+-1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯基丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水值进行更改时，在某些具体实施方式中包括亲水值在+-2范围内的氨基酸替换，在其他具体实施方式中包括亲水值在+-1范围内的氨基酸替换，而在另一些具体实施方式中则包括亲水值在+-0.5范围内的氨基酸替换。
根据一个优选具体实施方式，根据本发明的光激活离子通道多肽是一种Chrimson多肽(例如ChR88蛋白或其功能性衍生物，或ChrimsonR蛋白或其功能性衍生物)和荧光蛋白的融合蛋白。本发明描述了融合蛋白的用途，所述融合蛋白中多肽或肽或肽的截短或突变版本与一个不相关的蛋白、多肽或肽融合，并可以基于编码所需肽的核酸和/或氨基酸序列来设计。在某些具体实施方式中，融合蛋白可以通过利用选择性地与所表达的融合蛋白结合的抗体来很容易地纯化。
总体而言，根据本发明的光激活离子通道多肽的功能所需的视黄醛或视黄醛衍生物是由将要与所述通道多肽转染的细胞产生的。然而，根据本发明，进一步公开了包括本发明所述的光激活离子通道多肽的通道视紫红质和视黄醛或视黄醛衍生物，例如3,4-脱氢视黄醛，13-乙基视黄醛，9-dm-视黄醛，3-羟基视黄醛，4-羟基视黄醛，萘基视黄醛；3,7,1l-三甲基-十二烷-2,4,6,8,10-五烯醛；3,7-二甲基-癸烷-2,4,6,8-四烯醛；3,7-二甲基-辛烷-2,4,6-三烯醛；以及6-7-或8-9-或10-11旋转受阻的视黄醛(WO03084994)。
虽然本发明所述的所需的肽氨基酸序列可以化学合成(参见例如Proteins:Structures and Molecular Principles"(Creighton，编辑，W.H.Freeman公司，纽约州纽约市，1984)，大的多肽序列可以优选的通过重组DNA技术利用本领域众所周知的用于表达含有编码所需肽的核酸序列的核酸的技术来生成。此类方法可用于构建含有编码肽的核苷酸序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组(参见例如Molar Cloning,A Laboratory Manual"，见上文，和Current Protocols in Molecular Biology，见上文)。或者，编码核苷酸序列的RNA和/或DNA可以用例如合成器来化学合成，其中所述核苷酸序列编码所需的肽(参见例如Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach(Gait，编辑，IRL出版社(IRL Press)，英国牛津，1984))。
可用于各种具体实施方式的肽氨基酸序列包括本发明所述的光激活离子通道多肽(SEQ ID No:1或2、5或6)及其功能等效肽及其功能性衍生物，以及它们的功能性片段。事实上，在一些具体实施方式中，由特定核苷酸序列编码的任何所需的肽氨基酸序列都可以像编码全部所需肽氨基酸序列或其任意部分的多核苷酸序列一样来使用。基因编码的退化性质是众所周知的，并且，相应的，每个编码光激活通道多肽氨基酸的核苷酸序列是众所周知的核酸"三联"密码子，或在许多情况下代表可以编码氨基酸的密码子的一般代表物。因此，正如本发明所设想的，本文所述的通道视紫红质肽氨基酸序列，如果与基因编码结合起来(参见如Molecular Cell Biology，第109页表4-1(Darnell等人，编辑，W.H.Freeman公司，纽约州纽约市，1986))，是能够编码此类氨基酸序列的核酸序列的全部各种排列和组合的一般代表物。
一些具体实施方式是分离的核酸分子，所述核酸分子包括核苷酸序列，该序列编码根据本发明的光激活离子通道多肽。在一些具体实施方式中，核苷酸序列编码多肽，所述多肽包括(i)ChR88蛋白(SEQ ID No:1)或其功能性衍生物，以及(ii)荧光蛋白。在另一些具体实施方式中，核苷酸序列编码多肽，所述多肽包括(i)ChrimsonR蛋白(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物，以及(ii)荧光蛋白。
根据一个特殊的具体实施方式，核苷酸序列编码多肽，所述多肽由与荧光蛋白融合的ChR88蛋白(SEQ ID No:1)或其功能性衍生物组成。根据优选具体实施方式，核苷酸序列编码多肽，所述多肽包括与荧光蛋白融合的ChrimsonR蛋白(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物。
根据某些特殊具体实施方式，根据本发明的荧光蛋白选自tdTomato(tdT)荧光蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)。tdTomato是一种鲜红色荧光蛋白(tdTomato的激发峰为554nm，发射波长峰值581nm)(Shaner NC等人，Nat Biotechnol，22，1567-1572，2004)。对根据本发明的tdTomato编码的基因组序列可以显示出与合成构建物串联二聚体红色荧光蛋白基因完整编码序列(Genbank访问号：AY678269)具有至少84％的一致性。根据优选的具体实施方式，根据本发明的被编码的tdTomato蛋白部分是一种多肽，所述多肽的氨基酸与SEQ IDNo:3的氨基酸序列具有约70％至约75％的一致性；或更优选的具有约75％至约80％的一致性；或更优选的具有约80％至约90％的一致性；甚至更优选的具有约90％至约99％的一致性。
在其他具体实施方式中，本发明提供了编码多肽的分离的核酸，所述多肽的氨基酸与SEQ ID No:5的氨基酸序列或其片段具有约70％至约75％的一致性；或更优选的具有约75％至约80％的一致性；或更优选的具有约80％至约90％的一致性；甚至更优选的具有约90％至约99％的一致性。
根据本发明的核酸可包括额外序列，所述额外序列包括但不限于一个或多个信号序列(例如增强子、多腺苷酸信号、额外的限制性酶位点、多克隆位点)和/或启动子序列、或其他编码段、或其组合。启动子可以是诱导型或组成型的一般或细胞特异性启动子。细胞特异性启动子的一个示例是双极细胞特异性mGlu6启动子。一些具体实施方式是所公开的任何方法，其中启动子是组成型启动子。一些具体实施方式是所公开的任何方法，组成型启动子包括但不限于CMV启动子或CAG启动子(CAG启动子是与鸡beta-肌动蛋白启动子(CBA)及SV40内含子插入序列融合的混合巨细胞病毒(CMV)早期增强子；Alexopoulou等人，BMCCell Biol.2008；9:2；SEQ ID No:8)。一些具体实施方式为所公开的任何方法，其中启动子包括但不限于诱导型和/或细胞类型特异性启动子。对于本领域的技术人员而言，选择启动子、载体、增强子、多腺苷酸位点是常规设计的问题。这些要素文献中已有充分描述，并可从市场上获得。
在一些具体实施方式中，本发明涉及分离的核酸段和重组载体，所述分离的核酸段和重组载体编码蛋白或肽，所述蛋白或肽在其氨基酸序列内包括根据本发明的光激活离子通道多肽的氨基酸序列或其功能性部分或其变体，如已识别的那些(例如SEQ ID No:5)。
在某些具体实施方式中，本发明涉及分离的的核酸段和重组载体，其中所述分离的核酸段和重组载体包括SEQ ID No:6或SEQ ID No:7的氨基酸序列。
一些具体实施方式是重组核酸，所述重组核酸包括核苷酸序列，所述核苷酸序列编码氨基酸，所述氨基酸为(i)SEQ ID No:1或2的氨基酸和(ii)SEQ ID No:3或4的氨基酸。
一些优选的具体实施方式是重组核酸，所述重组核酸包括核苷酸序列，所述核苷酸序列编码氨基酸，所述氨基酸为SEQ ID No:5的氨基酸或其片段。
一些优选的具体实施方式是重组核酸，所述重组核酸包括核苷酸序列，所述核苷酸SEQ ID No:6或7。
一些具体实施方式为重组核酸，所述重组核酸包括核苷酸序列，所述核苷酸序列编码氨基酸，所述氨基酸为(i)SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的氨基酸，且所述核苷酸徐序列与异源启动子可操作相连；和(ii)对编码SEQ ID No:3或4的氨基酸的、与异源启动子可操作相连的核苷酸序列。
一些优选的具体实施方式为重组核酸，所述重组核酸包括核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ ID No:5的氨基酸或其片段，且所述核苷酸序列与异源启动子可操作相连。
一些优选的具体实施方式为重组核酸，所述重组核酸包括SEQ ID No:6或7的核苷酸序列，所述核苷酸序列与异源启动子可操作相连。
一些优选的具体实施方式为重组核酸，所述重组核酸包括SEQ ID No:6或7的核苷酸序列，所述核苷酸序列与CAG异源启动子(SEQ ID No:8)可操作相连。
根据另一个方面，本发明涉及核酸表达载体，所述载体包括编码前述任意光激活离子通道多肽的核酸序列。在本发明中，术语"核酸表达载体"是指能够在不同的基因环境之间运输另一个核酸的核酸分子，所述核酸分子与所述另一个核酸可操作的相连。术语"载体"还指能够运输核酸分子的病毒或生物体。一种类型的载体是附加体(episome)，即能够进行染色体外复制的核酸分子。一些有用的载体是那些能够自主复制和/或表达与其相连的核酸的载体。能够指导与其可操作相连的基因表达的载体在此称为"表达载体"。表达载体及其使用方法在本领域是众所周知的。本发明提供了合适的表达载体及其使用方法的非限制性示例。在优选的具体实施方式中，该载体适用于基因疗法，尤其是用于病毒介导的基因转移。适合基因疗法的病毒示例包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒、痘病毒(例如MVA)、甲病毒、疱疹病毒。然而，基因疗法进一步包括非病毒方法，例如使用裸DNA、脂质体相关的核酸。适用于根据本发明的一些方法中的载体可以将光激活离子通道多肽基因化地插入分裂和不分裂细胞中，并可以将光激活的离子通道多肽插入体内、体外或离体细胞。
在一些优选的具体实施方式中，包括用于根据本发明的光激活离子通道的基因的核酸表达载体选自AAV病毒载体。根据优选的具体实施方式，所述AAV病毒载体是AAV2病毒载体，更优选的是AAV2-7m8病毒载体(WO2012/145601)。
本发明的某些方面包括使用根据本发明的光激活离子通道多肽治疗细胞、组织或目标主体中的障碍或状况的方法。根据本发明的治疗方法可包括向需要这种治疗的目标主体施用治疗有效量的光激活离子通道多肽来治疗该障碍。
根据本发明的光激活离子通道多肽的给药可包括含有有效量的根据本发明的至少一个光激活离子通道多肽的药物组合物的给药。根据本发明的光激活离子通道多肽的给药可包括含有细胞的药物组合物的给药，其中所述细胞表达根据本发明的光激活离子通道。根据本发明的光激活离子通道多肽的给药可包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括载体，其中所述载体包括编码根据本发明的光激活离子通道多肽的核酸序列，施用所述载体导致所述光激活离子通道多肽在目标主体的细胞中表达。
一些具体实施方式是治疗或预防神经元介导的障碍的方法，所述方法包括:(a)向靶细胞递释核酸表达载体，所述载体编码根据本发明的光激活离子通道多肽，所述光激活离子通道多肽能在所述靶细胞中表达，所述载体包括开放阅读框(open reading frame)，所述开放阅读框编码根据本发明的光激活离子通道多肽、与启动子序列可操作的连接并且任选的与转录调节序列可操作的连接；(b)在所述靶细胞中表达所述载体，其中所表达的光激活离子通道多肽在暴露于光时激活所述靶细胞。
在一些具体实施方式中，所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChR88蛋白(SEQ ID No:1)或其功能性衍生物组成。
根据优选的具体实施方式，所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChrimsonR(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物组成。
在优选的具体实施方式中，所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChR88蛋白(SEQ ID No:1)或其功能性衍生物组成，所述荧光蛋白选自由tdTomato(tdT)荧光蛋白或绿色荧光蛋白(GFP)组成的组。
根据优选的具体实施方式，所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChrimsonR(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物组成，所述荧光蛋白选自由tdTomato(tdT)荧光蛋白(SEQ ID No:3)或绿色荧光蛋白(GFP)(SEQ ID No:4)组成的组。
在本文中使用时，除非另有说明，可能使用根据本发明的方法和组合物的神经元介导的障碍包括但不限于神经元功能障碍、脑部障碍、中枢神经系统障碍、外周神经系统障碍、神经系统状况、记忆障碍和学习障碍、心律失常、帕金森病、视觉障碍、听力障碍、脊髓损伤等。
在本文中使用时，除非另有说明，可使用根据本发明的方法和组合物改善一项或多项视力参数的视觉障碍一词包括但不限于影响眼前节(anterior segment)和眼后节(posterior segment)的发育异常。前节障碍包括但不限于青光眼、白内障、角膜营养不良、锥形角膜。后节障碍包括但不限于由光感受器的变性、功能失调、丢失和死亡引起的致盲障碍。视网膜障碍包括视网膜色素变性(RP)、黄斑变性(MD)、先天性静止性夜盲症、与年龄有关的黄斑变性和先天性视锥营养不良。
根据本发明的某些具体实施方式的靶细胞可以是可兴奋细胞或非可兴奋细胞。它优选为根据本发明的光激活离子通道多肽可在其中表达并可用于本发明方法的细胞。它包括原核细胞和真核细胞。靶细胞包括但不限于哺乳动物细胞。可表达根据本发明的光激活离子通道多肽的细胞示例是可兴奋细胞，其包括能够产生和应答电信号的细胞。
根据本发明的靶细胞的非限制性示例包括神经元细胞(神经元)、神经系统细胞、心肌细胞、循环系统细胞、视觉系统细胞、听觉系统细胞、分泌细胞(如胰腺细胞、肾上腺髓质细胞、垂体细胞等)、内分泌细胞或肌肉细胞。在一些具体实施方式中，与本发明一起使用的靶细胞可以是健康的正常细胞，已知不存在疾病、障碍或异常状况。在一些具体实施方式中，与本发明的方法和通道一起使用的靶细胞可能是异常细胞，例如，被诊断为患有障碍、疾病或状况的细胞，包括但不限于变性细胞、患有神经性疾病的细胞、患有疾病或状况的细胞模型、受损细胞等。在根据本发明的一些具体实施方式中，细胞可以是对照细胞。
根据一个特殊具体实施方式，根据本发明的光激活离子通道多肽可在培养细胞、溶液中的细胞、从目标主体获得的细胞和/或目标主体自身的细胞(体内细胞)中表达。光激活离子通道可以在培养的细胞、培养的组织(如大脑切片制备品等)和活体目标主体中表达和激活。
在优选的具体实施方式中，靶细胞是哺乳动物细胞并且是电可兴奋细胞。优选地，它是一个光感受器细胞、视网膜杆体细胞、视网膜锥体细胞、视网膜神经节细胞(RGC)、无长突细胞、双极神经元、神经节细胞、螺旋神经节神经元(SGNs)、耳蜗核神经元、多极神经元、颗粒细胞、神经元或海马细胞。
有些具体实施方式是恢复视网膜对光敏感性的方法，所述方法包括:(a)向靶视网膜神经元递释核酸表达载体，所述载体编码根据本发明的光激活离子通道多肽，所述光激活离子通道多肽能在所述靶视网膜神经元中表达，所述载体包括开放阅读框，所述开放阅读框编码根据本发明的光激活离子通道多肽、与启动子序列可操作的连接并且任选的与转录调节序列可操作的连接；(b)在所述靶视网膜神经元中表达所述载体，其中所表达的光激活离子通道多肽使所述视网膜神经元对光敏感，从而恢复对所述视网膜或其一部分的光敏感性。
一个具体实施方式是一种恢复视网膜光敏感性的方法，其中所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChR88蛋白(SEQ ID No:1)或其功能性衍生物组成。
一个优选具体实施方式是一种恢复视网膜光敏感性的方法，其中所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChrimsonR(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物组成。
一个优选的具体实施方式是恢复视网膜光敏感性的方法，其中所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChR88蛋白(SEQ ID No:1)或其功能性衍生物组成，所述荧光蛋白选自由tdTomato(tdT)荧光蛋白或绿色荧光蛋白(GFP)组成的组。
一个优选的具体实施方式是恢复视网膜的光敏感性的方法，其中所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChrimsonR(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物组成，所述荧光蛋白选自由tdTomato(tdT)荧光蛋白(SEQ ID No:3)或绿色荧光蛋白(GFP)(SEQ IDNo:4)组成的组。
一些具体实施方式是恢复目标主体视网膜光敏感性的方法，所述目标主体视力减退或失明，其视网膜光感受器细胞正在变性或已变性和死亡，所述方法包括:(a)向靶视网膜神经元递释核酸表达载体，所述载体编码根据本发明的光激活离子通道多肽，所述根据本发明的光激活离子通道多肽可在所述靶视网膜神经元中表达，所述载体包括开放阅读框，所述开放阅读框编码所述根据本发明的光激活离子通道多肽、与启动子序列可操作的连接并且任选的与转录调节序列可操作的连接；(b)在所述靶视网膜神经元中表达所述载体，其中所表达的光激活的离子通道多肽使所述视网膜神经元对光敏感，从而恢复对所述视网膜或其一部分的光敏感性。
一些具体实施方式是恢复目标主体视网膜光敏感性的方法，所述目标主体视力减退或失明，其视网膜光感受器细胞正在变性或已变性和死亡，其中所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChR88蛋白(SEQ ID No:1)或其功能性衍生物组成。
一些具体实施方式是恢复目标主体视网膜光敏感性的方法，所述目标主体视力减退或失明，其视网膜光感受器细胞正在变性或已变性和死亡，其中所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChrimsonR(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物组成。
一些优选的具体实施方式是恢复目标主体视网膜光敏感性的方法，所述目标主体视力减退或失明，其视网膜光感受器细胞正在变性或已变性和死亡，其中所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChR88蛋白(SEQ ID No:1)或其功能性衍生物组成，所述荧光蛋白选自由tdTomato(tdT)荧光蛋白或绿色荧光蛋白(GFP)组成的组。
一些优选的具体实施方式是恢复目标主体视网膜光敏感性的方法，所述目标主体视力减退或失明，其视网膜光感受器细胞正在变性或已变性和死亡，其中所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChrimsonR(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物组成，所述荧光蛋白选自由tdTomato(tdT)荧光蛋白(SEQ ID No:3)或绿色荧光蛋白(GFP)(SEQ IDNo:4)组成的组。
在一些具体实施方式中，在所述治疗神经元障碍、或恢复视网膜光敏感性、或恢复视力减退或失明并且视网膜光感受器细胞正在变性或已变性和死亡的目标主体的方法中的靶神经元是视网膜神经元。
一些具体实施方式是所述的任何一种方法，其中所表达的光激活离子通道多肽具有SEQ ID No:5的全部或部分氨基酸序列，或其保留了所述被编码的光激活通道多肽的生物活性的生物活性片段，或SEQ ID No:5或所述片段的具有生物活性的保守性氨基酸替换变体。
一些具体实施方式是本发明的任何一种方法，其中所表达的光激活离子通道多肽是由SEQ ID No:6的核酸序列编码的。
本发明的另一个方面是使用远红光(660nm)来进行无创经颅和/或经耳刺激来调节神经回路。
根据本发明某些方面的工作操作描述如下：在可兴奋细胞中基因表达根据本发明的的光激活离子通道多肽，用合适波长的光照射细胞，并验证细胞在对光的应答下快速去极化，以及在光停止照射时快速摆脱去极化。根据具体的实施方式，根据本发明的方法允许在体内、离体和体外对细胞功能进行光控。
在根据本发明的方法的非限制示例中，根据本发明的光激活离子通道多肽及其衍生物可在正常的细胞环境条件和离子浓度下用于哺乳动物细胞中，无需任何种类的化学补充。
根据本发明的光激活离子通道多肽已被发现适于在正常的细胞环境条件和离子浓度下在哺乳动物细胞中表达和使用，无需任何种类的化学补充。根据本发明的光激活离子通道多肽已被发现在365nm至700nm的光波长范围内激活，优选的激活波长为530nm至640nm，峰值激活波长为530nm。
光激活离子通道多肽或核酸表达载体的有效量是将细胞、组织或目标主体中的光激活离子通道水平提升至对目标主体有益的水平的量。有效量也可以通过评估对细胞或目标主体给药的生理影响来确定，例如给药后症状减少。其他检测对于本领域的普通技术人员而言是已知的，并可用于测定治疗的应答水平。治疗的量可以改变，例如，通过增加或减少施用的光激活离子通道多肽或核酸表达载体的量、改变含有施用的光激活离子通道多肽或核酸表达载体的治疗组合物、改变给药途径、改变给药时机、改变根据本发明光激活离子通道的激活量和参数等方式。所述有效量会随着被治疗的特定状况、被治疗目标主体的年龄和身体状况、病情的严重程度、治疗的时长、并行疗法的性质(如有)、具体的给药途径以及医生知识和专长范围内的类似因素而变化。例如，有效的数量可能取决于需要在其中表达光激活离子通道多肽的细胞在目标主体中的位置和数量。有效量也可以取决于待治疗的组织的位置。这些因素对于本领域的普通技术人员是熟知的，只需通过常规实验就可以解决。一般情况下，优选的使用组合物的最大剂量-即根据合理的医疗判断所获得的最高安全剂量或量-以提高光激活离子通道多肽的水平，和/或改变所用光激活离子通道多肽(单独或与其他治疗制剂一起)在目标主体中的激活时长或时机。本领域的普通技术人员将会理解，由于医疗原因、心理原因或几乎任何其他原因，目标主体可能会坚持使用较低的剂量或耐受剂量。
根据本发明的光激活离子通道多肽(例如与tdT或GFP融合的ChR88或ChrimsonR或其衍生物)可使用本领域已知的方法进行给药。在某些具体实施方式中，对目标主体施用将编码根据本发明的光激活离子通道多肽的核酸，在某些具体实施方式中，对目标主体施用光激活离子通道多肽。给药的方式和剂量可由医生或兽医单独调整，特别是在出现任何并发症的情况下。所施用的绝对量将取决于各种因素，包括选定用于给药的材料、是单剂量给药还是多剂量给药、以及目标主体个人参数，包括年龄、身体状况、体型、体重以及疾病或状况的阶段。这些因素对于本领域的普通技术人员而言是众所周知的，仅需通过常规实验即可解决。
递释根据本发明的光激活离子通道多肽或核酸表达载体的药物组合物可以单独施用，或彼此组合使用，和/或与对目标主体施用的其他药物疗法或其它治疗方案组合使用。在上述方法中使用的药物组合物优选的含有有效量的治疗化合物，所述有效量的治疗化合物使光激活离子通道多肽的水平提高到产生所需应答的水平，所述有效量以适于对目标患者给药的重量或体积为单位。
向目标主体施用以提高目标主体细胞中的光激活离子通道多肽水平的药物组合物的剂量可以根据不同的参数-特别是根据使用的给药模式和目标主体的状态-来选择。其他因素包括所需的治疗期。如果在最初的剂量下目标主体的应答不足，可以在病人耐受允许的范围内使用更高的剂量(或通过不同的但更局部的给药途径获得更高的有效剂量)。已对目标主体施用的根据本发明的光激活离子通道的激活量和激活时机(例如，光波长、光接触时长等)也可以根据特定目标主体的治疗效果来进行调整。用于对已向目标主体施用的光激活离子通道照射和激活的参数可以使用本领域已知的方法来确定，而无需进行不必要的实验。
可以有效地递释药物组合物以提高目标主体的期望细胞、组织或身体区域中的根据本发明的光激活离子通道多肽的水平的各种给药模式对于本领域的普通技术人员而言是已知的。用于施用根据本发明的这种组合物或其他药物化合物的方法可以是局部给药、静脉给药、口服给药、腔内给药、鞘内给药、滑膜内给药、颊给药、舌下给药、鼻内给药、经皮给药、玻璃体腔给药、视网膜下给药、皮下给药、肌肉给药和皮内给药。本发明不受本发明所披露的特定给药模式的限制。本领域的标准参考资料(例如Remington's PharmaceuticalSciences，第18版，1990年)提供了各种药物制剂和剂型通过药物载体给药的给药模式和剂型。其他对根据本发明的治疗化合物给药有用的方案对本该领域的普通技术人员而言是已知的，其中的剂量、给药时间表、给药位点、给药方式(例如器官内)等与本发明所示的不同。
施用用于提高非人哺乳动物光激活离子通道多肽水平的细胞或载体，或施用和应用根据本发明的光激活离子通道，例如用于检测目的或兽医治疗目的，是在上文所述的基本相同条件下进行的。本领域的普通技术人员将会理解，本发明对于人类和动物都适用。因此，本发明旨在用于畜牧业和兽医学以及人类疗法。在本发明的某些方面，使用本发明的光激活离子通道多肽的治疗方法适用于细胞，所述细胞包括但不限于神经元细胞、神经系统细胞、神经元、心肌细胞、循环系统细胞、视觉系统细胞、听觉系统细胞、肌肉细胞或内分泌细胞等。
使用本发明的方法可以治疗的障碍和状况包括受伤、脑损伤、神经状况变性(如帕金森病、阿尔茨海默氏症、癫痫发作、视力减退、听力减退等)。
在一些具体实施方式中，根据本发明的方法和光激活离子通道多肽可用于治疗视觉系统障碍，例如用于治疗视力减少或减退。根据本发明的光激活离子通道多肽或编码这种多肽的载体可给视力减少或减退的目标主体施用，所表达的光激活离子通道可作为视觉系统中的光敏感细胞来发挥作用，从而允许目标主体获得视觉功能。
所披露的方法和组合物的临床应用包括(但不限于)光遗传治疗方法，如通过在用于年龄相关的黄斑变性、糖尿病视网膜病变和视网膜色素变性以及其他导致光感受器细胞减少的状况的视觉障碍基因疗法治疗中将根据本发明的光激活离子通道多肽引入视网膜的受体后神经元中来恢复视力；将本发明的光激活离子通道多肽整合入房室束(希氏束)中的可兴奋心肌细胞中来控制心功能，以控制心跳节律，而不用电起搏器设备；帕金森病患者与多巴胺相关的运动功能障碍的恢复；抑郁症的改善；脊髓损伤后呼吸的恢复；对干细胞分化进行无创控制，评估移植细胞对组织和网络功能的具体贡献。
同样，感音神经性听力减退可以通过对听觉神经中的下游目标进行光刺激来治疗(见Hernandez等人，2014，J.Clin.Invest，124(3)、1114-1129或Darrow等人，2015年，BrainRes.，1599，44-56)。根据特殊的具体实施方式，本发明涉及使用光学耳蜗植入物治疗传导性听力减退的方法，所述方法包括:(a)将核酸表达载体递释到耳蜗，所述核酸表达载体编码根据本发明的光激活离子通道多肽，所述根据本发明的光激活离子通道多肽可在所述耳蜗中表达，所述载体包括开放阅读框，所述开放阅读框编码根据本发明的光激活离子通道多肽、与启动子序列可操作的连接并且任选的与转录调控序列可操作的连接；(b)在所述耳蜗中表达所述载体，其中所表达的光激活离子通道多肽使所述耳蜗光敏，以及(c)使用带有闪光的耳蜗植入物。
一些具体实施方式是用光学耳蜗植入物治疗传导性听力减退的方法，其中所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChR88蛋白(SEQ ID No:1)或其功能性衍生物组成。
一些具体实施方式是用光学耳蜗植入物治疗传导性听力减退的方法，其中所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChrimsonR(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物组成。
一些优选的具体实施方式是用光学耳蜗植入物治疗传导性听力减退的方法，其中所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChR88蛋白(SEQ ID No:1)或其功能性衍生物组成，所述荧光蛋白选自由tdTomato(tdT)荧光蛋白或绿色荧光蛋白(GFP)组成的组。
一些优选的具体实施方式是用光学耳蜗植入物治疗传导性听力减退的方法，其中所表达的光激活离子通道多肽由与荧光蛋白融合的ChrimsonR(SEQ ID No:2)或其功能性衍生物组成，所述荧光蛋白选自由tdTomato(tdT)荧光蛋白(SEQ ID No:3)或绿色荧光蛋白(GFP)(SEQ ID No:4)组成的组。
本发明在某些方面包括制备核酸序列和多核苷酸序列；在细胞和膜中表达由所制备的核酸和多核苷酸序列编码的多肽；用适当的光照射所述细胞和/或膜，并验证对光应答而产生的细胞的快速去极化和/或跨膜电导率的变化，以及在光消退后快速摆脱去极化。通过光可控地改变跨膜电压和细胞去极化的能力已经得到了验证。本发明使对体内、离体和体外的细胞功能的光控成为可能，并且根据本发明的光激活离子通道及其用途，在药物筛选、治疗和研究应用中具有广泛的应用，其中一些应用已在本发明中有所描述。
在本发明的示例性实施方式中，光学干扰、修改或控制细胞功能的能力相对于物理操控机制具有许多优势。这些优势包括速度、无创性以及轻松跨越巨大空间尺度-从纳米尺度到宏观尺度-的能力。
本发明中使用的试剂(以及它们所代表的分子类别)至少允许:使在以前光激活离子通道中无用的光波长来激活电流，使光激活离子通道在被激活时有效地允许钙电导率为零，以及来自较老分子的不同光谱(开创细胞的多色控制)。
以下实施例部分提供了有关各种具体实施方式的实施例的进一步详细信息。本领域的技术人员应当理解下文实施例中所披露的技术代表发明人发现的能很好地发挥作用的技术和/或组合物。但是，根据本发明，本领域的技术人员应当理解，在不背离发明精神和范围的情况下，可以对所披露的具体实施方式进行许多修改，这些修改仍然会获得类似或近似的结果。这些实施例是本文所述方法和系统的例举，目的不是限制本发明的范围。此类非限制性实施例包括但不限于下文介绍的实施例。
实施例
实施例1:rdl和P23H变性啮齿类动物模型的验证
视网膜营养不良与视网膜细胞功能障碍和变性有关，损害了视觉信息流，最终导致视力严重减退和失明。视网膜色素变性(RP)是最常见的视网膜营养不良，全球每4000个视力减退的人中就有一个是由视网膜营养不良导致的。RP是由作为常染色体显性遗传(30％-40％的病例)、常染色体隐性遗传(50％-60％)或X-连锁遗传(5％-15％)的60多个基因中的任何一个基因的改变而导致的。
在RP的大多数常见形式中，杆体光感受器首先变性，其次是锥体变性。因此，RP的早期症状通常是夜盲症和因外围视野减退而导致的管状视野。所有RP状况都是渐进的，患者的视力恶化特征各不相同，但是最终结果都是失明。尚无RP的治疗方法。
由于RP是由多个基因中的多种类型的突变而引起的，因此相当一部分的RP都是显性的，并且该疾病的时间进程可变性很高，所以视网膜光遗传治疗方法具有潜在的意义。在这方面，视网膜神经节细胞(RGC)似乎是一个有吸引力的目标，原因如下：1)视网膜神经节细胞是放电细胞，其轴突直接对视觉皮层中心投射并将视觉信息传送到视觉皮层中心；2)即使在视网膜变性后期，剩余的RGC仍保留在RP患者的黄斑区；3)RP患者的视网膜神经纤维层厚度减少、增加或保持正常；4)使用OCT和扫描激光偏振法可以很容易地评估RGC光遗传学疗法的临床标准。导致视网膜组织的类似改变的光感受器变性发生在更复杂的视网膜疾病中，如年龄相关性黄斑变性。
利用二型通道视紫红质的RGC光遗传学疗法已证明其为患有RP的啮齿类模型和正常猴子提供光诱导的视网膜电活动、视觉诱发电位和视觉功能。此外，由于RGC与玻璃体视网膜表面最接近，所以它们是适合通过玻璃体内注射进行AAV感染，从手术的角度看，这是一个主要的优势。
如果二型通道视紫红质在视网膜神经节细胞中的异位表达显示恢复了失明的rd1小鼠的视力，则由于在蓝色波长范围内所需的高兴奋阈值引起了对光毒性的担忧。
在这项研究中，因为红光范围的辐射安全极限要高得多，所以我们研究了一种红移视蛋白，ChrimsonR(ChrR)的使用。ChrimsonR是一种微生物视蛋白CnChRl的强化形式，CnChRl亦称为为Chrimson或Chrimson 88，是从夜配衣藻(Chlamydomonas noctigama)中分离出来的(Klapoetke等人，2014年，见上文)。相对于以前的通道视紫红质，Chrimson激发谱被红移了45nm。ChrimsonR是Chrimson的K176R突变体，具有相似的激发光谱，但具有较好的Tetaoff值(15.8毫秒对21.4ms)。我们在此研究了ChrR在失明rd1小鼠和失明P23H大鼠这两种变性模型中恢复视力的用途。
在本研究中，我们进一步比较了ChrR与构建物ChrimsonR-tdTomato(ChrR-tdT)的功能性效用。
方法(图1):
基因给药
用于小鼠实验的病毒批次:
Figure GDA0004072109420000181
用于GS030_NC_PHAR_007研究的病毒悬浮液是在无菌2毫升艾本德(Eppendorf)管内用PBS+0.001％的
Figure GDA0004072109420000182
F68配制的即用型透明无色液体。病毒悬浮液用PBS+0.001％的
Figure GDA0004072109420000183
F68稀释储备病毒悬浮液而得到的。
病毒悬浮液在使用前的储存温度为5±3℃。
所有实验都是按照美国国家卫生研究院的实验动物护理和使用指南进行的。该方案已经得到了地方动物伦理委员会的批准，并根据欧洲议会第201/63/EU号指令进行。
4周龄小鼠用异氟烷麻醉，并在双侧进行玻璃体内注射。简而言之，用托吡卡胺扩张瞳孔，用针头在异色边缘附近对巩膜穿孔。然后使用汉密尔顿氏(Hamilton)注射器通过钝型注入器将2μl注入眼睛中。
小鼠注射及动物分配详情:
Figure GDA0004072109420000191
视网膜制备
在AAV注射后约5周(27至53天，平均:38天)或11个月后，通过吸入二氧化碳并随后施以颈椎脱位杀死小鼠。分离并切开动物眼球，以去除角膜和晶状体，同时保持视网膜与巩膜相连。该眼杯被保存在不透光容器中，里面装满了Ames'溶液(Sigma-Aldrich公司，密苏里州圣路易斯市)。然后将视网膜片(通常是半个视网膜)进行分离，用于多电极阵列记录。
MEA记录
获得来自小鼠离体视网膜的多电极阵列(MEA)记录。视网膜片段被放置在纤维素膜上，事先用聚赖氨酸对所述纤维素膜进行整夜预培养。一旦置于微型机械手上，视网膜片被朝向MEA轻轻挤压(MEA256 100/30iR-ITO；多通道系统公司，德国罗伊特林根市)，RGC面向电极阵列。利用ChR-tdT构建物，在用于在MEA系统上提供不同光刺激的Nikon EclipseTi倒置显微镜(尼康公司，德国杜塞尔多夫市)上记录之前，对电极阵列上视网膜片中的tdTomato的荧光进行了检查。在实验中，以每分钟1-2ml的速度在34℃将用95％的氧气和5％的二氧化碳起泡的Ames'培养基(Sigma-Aldrich公司，密苏里州圣路易斯市)对视网膜进行连续灌注。在记录前10分钟，选择性组III代谢型谷氨酸受体激动剂-L-(+)-2-氨基-4-膦酰基丁酸(L-AP4,50μM,托克利斯生物科学公司，英国布里斯托尔市)-被新鲜稀释并浸泡整个灌注系统。用被STG2008刺激发生器(MCS)驱动的设置为600nm(+/-15nm)的PolychromeV单色仪(奥林巴斯公司，德国汉堡)来施加全场光刺激。输出光强度被校准到1.37x1014至6.78x1016photon.cm2.sec-1。对于每个光强度，在每次刺激中呈现了重复10次的2-s闪光，每次间隔5秒。我们还使用多色(在最大光强度，6.78x1016 photons.cm2.sec-1)或使用荧光显微镜的光源(X-cite，Lumen Dynamics公司)投射在与600+/-20nm滤色器相连的数字微镜显示器(DMD，Vialux公司，分辨率1024x768)上记录了对不同刺激时长的响应。校准显示视网膜水平的光强度为2x1017 photons.cm2.sec-1。使用平均尖峰密度函数(20msec高斯标准偏差)在刺激重复过程中对单个电极活动进行平均化。然后对每个视网膜的应答电极进行平均化。
免疫组织化学和成像
在室温下，在4％的多聚甲醛中将组织固定30分钟。在PBS、牛血清白蛋白(5％)、Triton(0.5％)和吐温(Tween)(0.25％)溶液中室温下进行一小时的饱和度和渗透性处理。在稀释的饱和溶液(BSA2.5％，Triton 0.25％，吐温(Tween)0.125％)中用第一抗体1/200tdTomato在4℃进行整夜培养。在PBS中进行了四次每次20分钟的洗涤后，组织在室温下用第二抗体培养1小时。在又进行了五次PBS洗涤后，组织在vectashield中封固，并使用配备了20x和63x物镜的共焦显微镜(奥林巴斯公司，日本东京)进行成像。
结果
转染细胞的定位
注射ChrR-tdT5周后，由于tdTomato荧光的存在，光遗传蛋白ChR的表达很容易被看到。它的表达被发现沿着大血管集中存在于神经节细胞层以及视盘中(见图2A)。
MEA记录
为了评估ChrR和ChrR-tdT在种群水平上的效能，同时不影响细胞完整性，我们用多电极阵列系统(图2B)记录转染RGC。为了避免对包括荧光报告基因tdTomato在内的构建物的记录成功率产生影响，在将视网膜片定位在电极阵列(图2B)后对组织荧光进行检查。此外，通过封锁谷氨酸发射信号，确保抑制残留光感受器产生的潜在光应答(Farber等人，1994年)(见方法部分)。
对于两个不同的条件，对动物的单眼或双眼进行了测试。当足够数量的电极显示自发RGC活动时则开始记录(图3A)。这种有效电极的数量为237到101。记录大量电极自发活动的能力是良好的实验组织条件的标志:1)健康的视网膜和RGC，2)电极与视网膜组织的充分接触。然后，产生高光强度的视觉刺激，以激活微生物视蛋白ChrR。在注射ChrR-tdT的7只眼睛中有6只可以记录光致应答，而在注射ChrR构建物的6只眼睛中有4只可以记录光致应答(图3A-B)。在应答视网膜中，确定了记录在光刺激下电活动的有效电极的百分比。ChrR-tdT和ChrR构建物的比例分别达到47％和2％(图3A)。这些结果表明，ChrR-tdT比ChrR构建物更有效地将rdl小鼠的RGC转化为光敏细胞。
对各种光强度的敏感性
600nm光闪烁施加在视网膜组织上，持续2秒，光强度从1.37x1014增加到6.78x1016photons.cm2.sec-1。图2C分别记录了ChrR-tdT和ChrR构建物的应答。图上的每一条线都代表在应答电极上记录的绘制活动，其中至少记录了最高光强度时的光致应答。
这些图清楚地表明ChrR-tdT构建物(图3C)所产生的应答振幅在包括最大强度的所有强度中都明显高于ChrR。这些记录还显示，诱导活动主要是瞬态活动，与持续振幅相比，峰值较高。最后，ChrR-tdT构建物的激活阈值似乎较低，第一次明显活动在2.34x1015photons.cm2.sec-1。测量应答作为光刺激引起的最大增加的放电频率，这证实了表达ChrR-tdT的视网膜在2.34x1015 photons.cm2.sec-1下应答阈值较低，而ChrR在8.82x1015photons.cm2.sec-1时激活(图3C)。这些观察表明，与ChrR-tdT构建物相比，ChrR构建物在给定强度下诱导的光遗传学应答具有更高的强度阈值和更低的尖峰频率。
波长灵敏度
为了证实ChrimsonR的已知光敏感性，以及证明诱发活动仅仅是由于ChrimsonR的活性，我们在全波长范围内进行了光刺激(400至650nm，图2C)。如已公布的数据(Klapoetke等人，2014年)中所预期的一样，在577-598nm达到峰值放电，这与仅与ChrimsonR激活有关的光敏感性一致。
表达特征
在视网膜中的表达主要局限于神经节细胞层-即视网膜最内层-的细胞。被tdTomato标记的轴突表明大多数表达ChrR-tdT的细胞都是视网膜神经节细胞(RGC)(图4A-C)。对表达ChrR-tdT的细胞进行的近距离检查(图4D-E)显示tdTomato荧光在质膜处或其附近富集。这种在细胞膜上的荧光积累也发生在表达水平相对较弱的细胞中。最后，我们有机会测试针对ChrR的多克隆抗体(图4)。ChrR抗体标记证实了与tdTomato相关的荧光是ChrimsonR定位的一个很好的代用物。
当表达ChrR-tdT的rdl小鼠视网膜在接受病毒载体注射(AAV2-7m8-ChrR-tdT)后11个月被记录时RGC仍然在表达tdTomato的区域对光刺激产生重大应答(图5)。对光的敏感性与在表达1个月后记录的敏感性相似，虽然达到的应答振幅较小(图5C)。这些振幅较小的应答归因于在光感受器缺失后出现的RGC变性，这在视网膜色素变性的动物模型和患者中已有报告。最后，应答振幅达到20ms的稳定水平，这与注射后1个月获得的观测结果一致(图5D)。因此，这些结果表明，病毒载体AAV2-7m8-ChrR-tdT可以诱发ChrR-tdT的长期表达，以驱使失明rdl动物的RGC对光应答。
为了进一步证明ChrR-tdT在光感受器的不同神经变性模型中重新激活RGC的潜力，还在P23H大鼠的玻璃体内注射了病毒载体(AAV2.7m8-ssCAG-ChrimsonR-tdTomato)。MEA记录在RGC对所施加的光强度应答的振幅方面提供了类似的结果(图6)。这些结果证实了ChrR-tdT在光感受器丧失后对光重新激活RGC的益处。
分析：
这项研究证明了ChrR在两个不同的视网膜变性模型的失明视网膜中重新激活视网膜神经节细胞的潜力。数据表明，ChrR-tdT的效力远超ChrR。ChrR-tdT可以在安全的光水平下被激活。这些结果为ChrR-tdT在非人类灵长类动物视网膜中表达和功能的进一步临床前研究铺平了道路(见下文)。
实施例2：在安全辐射极限以下激活非人类灵长类动物的视网膜神经节细胞群
在上面的研究中，我们已经证明ChrimsonR(ChrR)，一种红移视蛋白，可以诱发失明啮齿类动物(rdl小鼠和P23H大鼠)的视网膜神经节细胞(RGC)的光激活。此外，我们还观察到，与荧光蛋白tdTomato融合的ChrR扩展形式在对光应答细胞数量及其应答振幅方面似乎提供了更大的功能效用。众所周知，与啮齿类动物相比，AAV2在非人类灵长类动物中仅转导至侧凹环的RGC(Yin等人，2011年)。AAV2-7m8，延伸越过中心凹环，导致周边地区的表达岛(Dalkara等人，2013年)。预计在人类也会出现类似的AAV2载体转导特征。因此，为了进一步评估这种治疗干预的翻译潜力，我们在此评估了在非人类灵长类动物身上通过玻璃体内注射驱动ChrR的表达或与荧光蛋白tdTomato融合的ChrR(ChrR-tdT)的表达的AAV载体是否可以产生足够的光遗传学蛋白表达，从而使RGC直接被光激活。
方法(见图7):
基因递释至灵长类动物的视网膜
所使用的病毒批次：
Figure GDA0004072109420000211
GS030研究所用的病毒悬浮液是在无菌2毫升微量艾本德(Eppendorf)管中的PBS+0.001％
Figure GDA0004072109420000212
F68溶液中配制的即用型透明无色液体。用PBS+0.001％
Figure GDA0004072109420000213
F68溶液稀释储备病毒悬浮液制得所述病毒悬浮液。
使用前以5±3℃的温度存储病毒悬浮液。
Figure GDA0004072109420000221
灵长类动物视网膜的分离和保存
在注射AAV两个月(+/-5天)后，灵长类动物接受了致命剂量的戊巴比妥。用无菌20G针穿刺眼睛以后，移除眼球并将其放置在密封的袋子中从而与C02非依赖型介质媒介(Thermofisher scientific公司)一起被运输。然后将视网膜分离并作为视网膜外植物在培养其中保存12至36小时，然后再进行记录。半中心凹视网膜片段在神经基础培养基(Neurobasal)+B27介质中的聚碳酸转移小室上转移，从而在细胞培养器中保存。
MEA记录
获得来自离体半中心凹视网膜的多电极阵列(MEA)记录。这些视网膜片段被置于用聚赖氨酸(0.1％,Sigma)整夜预培养的纤维素膜上。一旦处于微机械手上，视网膜片被朝向MEA轻轻挤压(MEA256 100/30iR-ITO；多通道系统公司，德国罗伊特林根市)，视网膜神经节细胞面向电极阵列。如果使用了TdTomato荧光，则在记录之前，用安装在MEA系统中的Nikon Eclipse Ti倒置显微镜(尼康公司，德国杜塞尔多夫市)对tdTomato的荧光进行检查。在实验中，以每分钟1-2ml的速度在34℃将用95％的氧气和5％的二氧化碳起泡的Ames'培养基(Sigma-Aldrich公司，密苏里州圣路易斯市)对视网膜进行连续灌注。在记录前10分钟，AMPA/Kainate谷氨酸受体激动剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX,25μM,Signma-Aldrich公司)、NMDA谷氨酸受体激动剂[3H]3-(2-羧基哌嗪-4-基)丙基-1-膦酸(CPP,10μM,Signma-Aldrich公司)、选择性组III代谢型谷氨酸受体激动剂-L-(+)-2-氨基-4-膦酰基丁酸(L-AP4,50μM,托克利斯生物科学公司，英国布里斯托尔市)被新鲜稀释并浸泡整个灌注系统10分钟。用被STG2008刺激发生器(MCS)驱动的Polychrome V单色仪(奥林巴斯公司，德国汉堡)来施加全场光刺激。输出光强度被校准到1.37x1014至6.78x1016photon.cm2.sec-1的范围内。对于每个光强度，在每次刺激中呈现了重复10次的2-s闪光，每次间隔10秒。光谱灵敏度是通过施加光刺激生成的，所述光刺激具有10个波长带宽，分为从400到600nm不等，阶差为10nm，每次光刺激持续2秒，一共10次。测试波长带宽的顺序是随机的，以防止视网膜的任何适应。为了定义引起应答所需的最小时间，在最大光强下，以1至2000毫秒的时长实现了光刺激，每5秒重复10次。
结果
转染细胞的定位
先前关于在玻璃体内注射AAV2载体后进行的基因给药的研究表明，转染细胞被限制在中心凹区域，特别是视网膜神经节细胞(RGC)的周围凹环(Dalkara等人，2013年)。因此，当视网膜被解剖出来以记录RGC时，在视网膜中检查了tdTomato的表达，对这一区域给予了更多的关注。为了进行MEA记录，中心凹被切成两半。图8显示了平放的视网膜上的周围凹环中表达tdTomato的细胞的区域，黑色的点代表了MEA记录系统的电极。当构建物不包括tdTomato时，基于使用黄斑色素进行黄色着色的特性以类似的方式解剖视网膜和中心凹区域。
MEA记录
为了评估不同构建物在大种群水平上的有效性，同时不影响细胞完整性，我们用多电极阵列系统(MEA)记录转染的RGC。在所有16例记录的NHP视网膜中，我们能够记录周围凹RGC的自发活动(图8B)。当RGC尖峰被自发记录时，除一个AAV2.7m8-ChrimonR实验(只有40个有效电极)外，"有效"电极的数量一直很高(平均152个电极)。记录大量电极自发活动的能力是良好实验条件的标志:1)健康的视网膜和RGC，2)电极与视网膜组织的充分接触。当在视网膜上施加光脉冲时，在许多电极上测量到了尖峰活动的增加(图8A)。这些电极被命名为应答电极。令人惊讶的是，视网膜之间在显示光诱发活动的细胞方面存在很大差异(图8B)。事实上，所有注入AAV2.7m8-ChrR-tdT的视网膜(n＝4)都有应答电极，而所有其他群体都有没有应答电极的视网膜(AAV2.7 m8-ChR:1/4；AAV2-ChrR-TdT:2/4，AAV2-ChrR:0/4)。值得一提的是，在没有荧光标记物tdTomato对转染细胞进行定位的情况下，视网膜在电极阵列上被多次重新定位，以便在没有测量光应答的情况下增加采样面积。
光敏感性
为了检测光应答，在600nm处对视网膜组织施加了2秒的光闪烁，光强度从1.37x1014增加到6.78x1016photons.cm2.sec-1。图9A显示了注射有AAV2.7m8-ChrR-tdT的眼睛的RGC对不同光强度的应答。然后，这些光应答由组距为50毫秒的尖峰频率表示(图9C)。这些应答不仅显示了一个强大的常驻组分，而且往往显示了一个瞬态组分。图9C-E表示在光强度逐渐增加的情况下，不同构建物的MEA记录光应答。尽管在具有这种最佳构建物的4种不同的视网膜中观察一些变化，但应答的振幅随着光强度的增加而增加。采用AAV2.7m8-ChrR-tdT构建物，不仅所有视网膜都具有光敏感性，而且大多数视网膜的应答振幅较高(图9C)。此外，与其他治疗组相比，RGC表现出更大的光敏感性(图9C-E)。两个视网膜显示了光应答在2.34x1015 photons.cm2.sec-1的尖峰直方图(图9C)。在测试的最高光强度，某些电极的尖峰频率接近400Hz。图9F-G提供了显示根据各种AAV构建物的光强度的光应答振幅的图表。曲线表示2秒刺激期间细胞放电频率减去自发放电频率的平均差值。这两个图表采用两个不同的Y轴刻度，以彻底显示全范围的电应答强度，同时更好地显示低光照水平下的应答振幅。在根据各自的应答振幅对不同构建物进行排序时，AAV2.7m8-ChR-tdT转染的3个视网膜比任何其他转染视网膜都敏感得多。在两个应答性AAV2-ChrR-tdT视网膜中，一个排在第四位；第二个应答性视网膜与唯一表达AAV2.7m8-ChrR的应答性视网膜或表达AAV2.7m8-ChrR-tdT的第四个视网膜的水平相似。因此，AAV2.7m8-ChrR-tdT看起来是最强大的构建物，其具有更多应答性视网膜、更高的敏感性和总体最高的电应答振幅。
动作光谱
就所有表现出光遗传学光应答的视网膜测定了在不同波长下的光诱导电应答。在这种情况下动作光谱是通过量化刺激过程中的放电频率来建立的。在平均单个细胞测量的不同动作光谱时，我们得到了单个视网膜的动作光谱，顺便说一下，其与上面为小鼠获得的动作光谱相当一致。图8C显示了注入AAV2.7m8-ChrR-tdT的视网膜的光谱。在达到ChrimsonR的峰值敏感性(575nm)时，活动也达到峰值。
可变时长刺激
为了确定诱发尖峰行为所需的刺激时长，我们在高光强度(使用DMD作为光源，1.34x1018 photons.cm2.sec-1)下施加了不同时长(从0.2毫秒到2000毫秒)的刺激。图10显示了从注射了AAV2.7m8-ChrR-tdT的视网膜获取的数据。光应答显示为所有应答细胞在所有测试时长内测定的瞬时放电频率。2秒刺激用于在刺激过程中基于增加的放电频率来定义有效电极。然后，从所有这些有效电极，分析对较短的刺激的应答，以检查在从刺激发生到之后50毫秒这个窗口的尖峰频率的增加。在图10A-B上可以看出，一些细胞显示对短至0.4毫秒的刺激而增加的放电频率。应答电极的数量以及瞬时放电频率在长达50毫秒的刺激中持续增加。对于更长的刺激，如果应答细胞的数量不变，瞬时放电频率的峰值开始下降(图10A)。为了确定临床环境中的最佳刺激参数，我们评估了两个重要因素:在给定刺激时长内活动位点的比例(图10C)，以及首次尖峰的平均时间(图10D)。所选时长预计将触发足够数量的具有快速动态(到达首次尖峰的时间)的潜在活动细胞的活动。为瞬时放电频率的4个不同阈值(5-20-50-100Hz)定义了活动位点的比例。如果刺激过程中的瞬时放电频率高于所考虑的阈值(减去自发放电频率)，则该电极被认为被激活。图10C显示了，在超过60％的电极上，1毫秒刺激增加的放电频率超过5Hz。为了活动水平高于100Hz的电极获得类似比例(约70％)，需要10毫秒的刺激。我们通过测量所有位点和所有时长的到达首次尖峰的平均时间来完成分析。对于该具体分析，自发活动没有被减去，很难为在短时间内没有诱发或仅诱发了非常低的额外尖峰行为确定准确的激活阈值。长期中值(约200毫秒)实际上对应于细胞的低自发尖峰频率(约5Hz)(0.2-lms，图10D)。对于较长的刺激时长(4-10毫秒)，到达第一次尖峰的平均时间的中值达到了稳定水平。这些数据表明，在该具体光强度下，10毫秒将在一半以上的应答细胞中以高活动频率提供快速应答动力学。因此，这些特征至少与视网膜神经节细胞的视频频率激活相兼容，因此表明AAV2.7m8-ChrR-tdT将提供一个足以满足视觉感知的表达。
分析
研究了三种构建物(AAV2.7m8-ChrR-tdT、AAV2.7m8-ChrR和AAV2-ChrR-tdT)在通过玻璃体内注射入猕猴体内后将光不敏感的RGC转化为光可激活的RGC的能力。
首先，我们的数据再现了之前的发现，显示了在玻璃体内给药AAV2后，在周围凹环内出现了RGC特异性感染。然而，与Dalkara等人(2013年)一样，AAV2.7 m8的感染速明显强于常规AAV2。在玻璃体内注射后两个月，用MEA来表征平放视网膜中RGC对600nm光的功能性应答。结果清楚地表明，AAV2-7m8-ChrR-tdT在表达水平和功能性活动方面都是四个测试构建物中的最佳选择。在这方面，在表示ChrR-tdT的4个视网膜中，有3个在应答照明时产生了较大的光电流和高放电频率。在接受AAV2.7m8-ChrR处理的四个视网膜中，仅有一个视网膜对光应答，这表明ChrR与tdTomato的融合显著增强了光遗传蛋白的功能。
在本研究中，我们确定了引起ChrR-tdT改造RGC刺激所需的光强度范围。对RGC中的ChrR在不同光强度下引起的光电流的分析提供了关于ChrR激活和不激活的动力学方面的有用信息。10毫秒的刺激被证明可以募集大量的应答细胞，产生具有快速动力学的高尖峰速率。确立了光遗传蛋白的动作光谱，其表明ChrimsonR-tdTomato构建物在波长为约575nm时得到最大应答。综合来看，这些结果允许选择AAV2.7m8-ChrR-tdT作为恢复患者视力的候选项。
实施例3:荧光蛋白tdTomato在光遗传蛋白ChrimsonR表达和定位中的作用
在非人类灵长类动物和患有视网膜色素变性的rdl小鼠身上，AAV2.7m8-CAG-ChrimsonR-tdTomato比缺少tdTomato的类似构建物(AAV2.7m8-CAG-ChrimsonR)有效得多。因此，我们的目标是了解其基本机制。为此，我们在HEK293细胞中进行了体外研究，重点是单独或与tdTomato融合的ChrimsonR的表达和运送。方法
人HEK293细胞在DMEM培养基中的24孔板中播种，并辅以10％的胎牛血清。细胞的拥挤状态(Confluence)为10％至70％，在第3和第20通路之间使用。pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato、pssAAV-CAG-ChrimsonR和pssAAV-CAG-ChrimsonR-GFP质粒的细胞转染是利用
Figure GDA0004072109420000241
作为转染剂(在50微升缓冲液中将1微升的
Figure GDA0004072109420000242
与0.5微克的质粒DNA混合)来实现的。
用RT-PCR检查ChrimsonR、ChrimsonR-tdTomato和ChrimsonR-GFP mRNA表达，肌动蛋白管家基因的mRNA表达也同时进行。用免疫化学方法评价了与ChrimsonR蛋白量相对应的细胞荧光水平。一种属于Gensight公司并由其提供的抗ChrimsonR抗体以1：1000的稀释度使用。与Alexafluor相连的第二抗小鼠抗体被用于免疫荧光定量。
HEK 293T细胞培养
HEK 293T(
Figure GDA0004072109420000251
CRL-3216TM)细胞在DMEM培养基(Invitrogen公司，美国沃尔坦姆市)中保持10％至70％的拥挤状态，辅以10％的FBS(Invitrogen公司)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen公司)。
转染和感染
利用
Figure GDA0004072109420000252
作为转染剂使pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato(质粒479)和pssAAV-CAG-ChrimsonR(质粒480)转染至细胞(http://www.polyplus-transfection.com/products/jetprime/)。制备24孔板，在每个孔的底部具有玻璃盖片。玻璃盖片上涂有多聚赖氨酸(D型)和层粘连蛋白。HEK 293T细胞在转染前一天在这些24孔板中铺板，密度为每孔100000个细胞。将1微升的
Figure GDA0004072109420000253
与0.5微克的质粒DNA479或480在50微升的缓冲液中混合。细胞中加入51.5微升转染混合物，转染4-6小时后更换培养基。然后在转染后对细胞进行培养24小时，然后进行分析。
对于感染，以上述方式制备细胞(在转染前一天在24孔板中铺板，密度为每孔约100000个细胞)。第二天，一个孔中的细胞被胰蛋白酶化，并进行计数，以确定细胞/孔的确切数量以计算MOI。细胞随后以500000的MOI被AAV2-7m8-CAG-ChrimsonR-tdTomato(IDV批次768)或AAV2-7m8-CAG-ChrimsonR(IDV批次752)感染。感染24小时后的细胞被固定在4％的PFA中。
RT-qPCR
RNA是用
Figure GDA0004072109420000254
RNA试剂盒(Macherey-Nagel)从细胞裂解物中提取的。简单地说，使用所提供的试剂对细胞进行裂解，并对裂解液进行过滤，以去除细胞残骸。RNA与硅膜连接。污染DNA因雾化和DNAse的作用而降解。RNA在不含RNAse的水中被清洗和洗脱。使用Nanodrop通过UV光谱法测定了RNA的浓度和纯度。在1kb大小标记物存在的情况下，在1％琼脂糖凝胶上沉积了一微克，以评估RNA质量。然后用第二DNAse:
Figure GDA0004072109420000255
DNAse(每个反应添加2U的TURBO DANse，然后在室温(RT)下培养20-30分钟)处理RNA，并且将1纳克的RNA用于RT-qPCR。逆转录是用通用寡核苷酸dT引物完成的。用与ChrimsonR序列部分匹配的引物进行了特异性qPCR(上游肌动蛋白引物:GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT(SEQ ID NO:9)，下游肌动蛋白引物:CTTCTGCATCCTGTCAGCAA(SEQ ID NO:10)，上游ChrimsonR引物:ACACCTACAGGCGAGTGCTT(SEQ ID NO:11)，下游ChrimsonR引物:TCCGTAAGAAGGGTCACACC(SEQID NO:12)。针对编码肌动蛋白的管家基因进行了标准化处理。采用了相关分析方法(制备了具有逆转录样品的等摩尔混合物的一系列标准物，并以1:10增量按顺序稀释)。标准物的每个稀释物都分成三份分放在qPCR板上，然后再与上述引物混合。随后进行了相对表达分析。RT-qPCR重复两次(在两个96孔板上)，每个转染条件测试三次。
免疫组织化学
用PBS冲洗细胞，并在室温下用4％PFA固定10分钟。在室温下添加15分钟的封闭缓冲液(PBS与1％Triton X-100，0.5％的吐温20(Tween 20)和10％的BSA封闭缓冲液)。然后用针对ChrimsonR的小鼠多克隆抗体(0.59mg/mL)在室温下培养2小时，所述小鼠多克隆抗体在封闭缓冲液(10％的BSA，1％的Triton X-100，0.5％的吐温(Tween))中以1：1000的比例稀释。进行了三次PBS清洗。然后用与AlexaFluor 488(A-31571Thermo Fisher公司的Donkey产品，稀释度1:500)相连的第二抗小鼠抗体在室温下培养细胞1小时。实验在3个复制品中进行3次。
阵列扫描成像和定量
HEK 293T细胞以上文所述方式被转染或感染。同样如上所述，针对ChrimsonR的抗体被适用于已被处理和对照孔。用Hoechst核染料对细胞染色5分钟，然后清洗并在Cellomics阵列扫描仪VTI上成像。利用滨松ORCA-ER数码相机以10x变焦从远红色和蓝色通道中获得图像。为了确定曝光时间，使用了有标记或无标记的孔作为对照。一旦采集完成，就使用Cellomics View软件分析图像。每个参数(阈值、分区、对象边框)都是手动设置的，以确保自动细胞计数反映细胞的特殊性。25个场的自动荧光细胞计数和细胞核计数被平均化，以获得每个转染条件下荧光细胞的百分比。利用Graphpad prism软件将荧光细胞数超出细胞核数的数量绘制为荧光细胞的百分比。实验进行了3次，每个样品均分成两份。
共焦显微法
共焦显微法是用奥林巴斯FV1000激光扫描共焦显微镜进行的。为了减少激发和发射的串音，按顺序逐行获取图像，并根据奈奎斯特-香农采样定理定义阶差。使用了在最终图像中最小化过饱和像素的曝光设置。然后使用FIJI处理每个盖片的12位图像，并在Z投影功能下使用最大强度将Z部分投影到单个平面上，最后转换为8位RGB颜色模式。每个条件下实验在3个复制物中重复3次。为每个盖板获得至少3张图像。
结果
RT-qPCR
RNA从转染细胞中提取，并使用RT-qPCR定量(图11)。有趣的是，与ChrimsonR-tdTomato(479)相比，我们在与ChrimsonR(480)转染的细胞中检测到了更多的ChrimsonRmRNA。假设编码ChrimsonR和ChrimsonR-tdTomato的质粒之间的转染相似，这将主要导致ChrimsonR的更高水平的表达。然而，细胞内存在的mRNA量并不能直接反映蛋白表达水平。翻译后的阶差定义细胞内的整体蛋白水平和蛋白定位。因此，在接下来的一组实验中，用ChrimsonR或ChrimsonR-tdTomato转染HEK细胞，并通过显微镜跟踪蛋白的表达。
图11显示了pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato、pssAAV-CAG-ChrimsonR和pssAAV-CAG-ChrimsonR-GFP质粒的RT-PCR原始数据。无论测试构建物如何，肌动蛋白基因mRNA的表达都是相似的。ChrimsonR-tdTomato的表达看起来要比单独ChrimsonR和ChrimsonR-GFP之一要低。
相比之下，使用pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato和pssAAV-CAG-ChrimsonR-GFP而不是pssAAV-CAG-ChrimsonR质粒时，ChrimsonR蛋白的水平更高(图12)。图12A显示了分别用pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato和pssAAV-CAG-ChrimsonR转染的HEK293细胞的荧光图像。细胞核显示为蓝色(DAPI染色)。
在图11B中，显示在50000个被分析的细胞中，当ChrimsonR与tdTomato或GFP融合时，ChrimsonR的水平较高。
图12显示了HEK293细胞与pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato、pssAAV-CAG-ChrimsonR和pssAAV-CAG-ChrimsonR-GFP质粒转染后的ChrimsonR蛋白水平。
阵列扫描成像和定量
阵列扫描用于对用ChrimsonR(480)或ChrimsonR-tdTomato(479)质粒转染的样本进行抗ChrimsonR抗体标记后进行细胞总数(基于其细胞核)以及荧光细胞计数。表达与tdTomato融合或未融合的ChrimsonR的细胞数量差异不显著(图13)。因此，根据这种计数方法，无论是否存在tdTomato，转染和表达ChrimsonR的细胞数量相同。然而，荧光细胞的百分比并不传达有关荧光定位的任何信息。由于只有在膜上表达的ChrimsonR才会在光激活时导致膜电位的变化，因此我们接下来利用共焦显微镜研究了在tdTomato存在和不存在的情况下，ChrimsonR亚细胞定位的差异。
共焦显微法
在材料和方法部分已经介绍了用抗ChrimsonR的抗体和DAPI对转染/感染细胞进行标记。然后盖上盖片，用共焦显微镜观察盖片。用相同参数获得的Z层叠进行了最大投影，以获得表示HEK细胞中的ChrimsonR分布的图像。我们的数据表明，与ChrimsonR-tdTomato相比，ChrimsonR的亚细胞定位存在显著差异。ChrimsonR存在于近核区域，该区域似乎是内质网(图14和15)。另一方面，ChrimsonR-tdTomato广泛分布在整个细胞中，在近核区域没有积累(图14和15)。值得注意的是，我们没有进行任何抗内质网染色，但是HEK细胞内的ER标记物(如KDEL(SEQ ID NO:13))的染色特征显示标记了相似区域(Wu等人，BiochemJ，464，13-22，2014)。
分析
RT-qPCR的转录分析表明，与ChrimsonR-tdTomato表达质粒(479)相比，与ChrimsonR表达质粒(480)转染的细胞的mRNA水平要稍高一些。然而，表达转染后与tdTomato融合或未融合的ChrimsonR蛋白的细胞百分比是相似的。对光基因亚细胞定位的共焦显微镜观察表明，与单独的ChrimsonR相比，ChrimsonR-tdTomato具有不同的细胞分布特征。虽然ChrimsonR-tdTomato广泛分布在细胞内，但只有单独ChrimsonR在内质网(ER)积累，这可能表明其从ER中的释放和随后的插入到膜中的变化。ChrimsonR是一种相当不溶于水的蛋白，而tdTomato是一种大型可溶性蛋白(Shaner等人，Nat Methods，2，905-909，2005)。因此，这些数据表明，当tdTomato作为融合蛋白被包括在ChrimsonR的C端时，它可能实际提高光遗传蛋白的溶解度，并促进ChrimsonR从ER中释放。
以下序列在本发明中披露：
Figure GDA0004072109420000271
Figure GDA0004072109420000272
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Figure GDA0004072109420000291
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Figure GDA0004072109420000385
Figure GDA0004072109420000391
SEQ ID N08CAG启动子：下划线序列分别表示启动子的三个组分：巨细胞病毒早期增强子、鸡beta-肌动蛋白启动子和SV40内含子插入序列。
CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAAT AATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTG CCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCC TGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACTCGAGGCCACGTTCTGCTTC ACTCTCCCCATCTCCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGG GGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGC GGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGC GAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGCGGGATCAGCCACCGCGGTGGCGGCCTAGAGTCGACGAGGAACTGAAAAACCAGAA AGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACC CGCGGCCGATCCACCGGTCGC
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Figure GDA0004072109420000393
Figure GDA0004072109420000401
Figure GDA0004072109420000402
Figure GDA0004072109420000403
Figure GDA0004072109420000404

Claims (25)

1.一种光敏感离子通道多肽，其特征在于，所述光敏感离子通道多肽包含与Td-Tomato荧光蛋白融合的Chrimson蛋白，其中所述融合的Chrimson蛋白比单独的Chrimson蛋白能更有效地应答光刺激，
其中，所述Td-Tomato荧光蛋白包含Td-Tomato荧光蛋白SEQ ID NO: 3；
所述Chrimson蛋白包含Chrimson 88 SEQ ID NO: 1或Chrimson R SEQ ID NO: 2。
2.根据权利要求1所述的光敏感离子通道多肽，其特征在于，所述光刺激为红光。
3. 根据权利要求1所述的光敏感离子通道多肽，所述光刺激具有在365 nm和700 nm之间的波长。
4. 根据权利要求1所述的光敏感离子通道多肽，所述光刺激具有590 nm的波长。
5. 根据权利要求1所述的光敏感离子通道多肽，其特征在于，所述光敏感离子通道多肽包含融合蛋白SEQ ID NO: 5。
6.根据权利要求1所述的光敏感离子通道多肽，其特征在于，有效量的与Td-Tomato荧光蛋白融合的Chrimson蛋白被长期表达，其中所述与Td-Tomato荧光蛋白融合的Chrimson蛋白在给药后至少2个月后仍持续表达。
7.根据权利要求6所述的光敏感离子通道多肽，其特征在于，所述与Td-Tomato荧光蛋白融合的Chrimson蛋白在给药后至少11个月后仍持续表达。
8.一种编码根据权利要求1至5中任一项所述的光敏感离子通道多肽的多核苷酸。
9. 根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 6。
10.一种编码包含根据权利要求1至5中任一项所述的光敏感离子通道的多肽和/或权利要求8或权利要求9所述的多核苷酸的核酸构建物。
11.一种包含根据权利要求1至5中任一项所述的光敏感离子通道多肽、权利要求8或权利要求9所述的多核苷酸、或权利要求10所述的核酸构建物的表达载体。
12.根据权利要求11所述的表达载体，其中所述载体为腺相关病毒AAV载体。
13. 根据权利要求12所述的表达载体，所述AAV载体选自AAV2载体和/或 AAV2.7m8 载体。
14. 根据权利要求11所述的表达载体，所述表达载体包含SEQ ID NO: 7 或SEQ IDNO: 8。
15.根据权利要求11所述的表达载体，其特征在于，所述载体是通过玻璃体注射的。
16.一种包含根据权利要求1至5中任一项所述的光敏感离子通道多肽、权利要求8或权利要求9所述的多核苷酸、权利要求10所述的核酸构建物和/或权利要求11至14中任一项所述的表达载体的组合物。
17.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，对于给定数量的细胞，与单独的Chrimson蛋白的表达水平相比，所述Td-Tomato荧光蛋白提高了所述融合的Chrimson蛋白的表达水平。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述融合的Chrimson蛋白的表达水平通过增强的Chrimson蛋白的溶解度、运输能力和/或蛋白构象来提高。
19.一种包含根据权利要求1至5中任一项所述的光敏感离子通道多肽、权利要求8或权利要求9所述的多核苷酸、权利要求10所述的核酸构建物和/或权利要求11至14中任一项所述的表达载体的组合物在制备用于治疗眼部疾病的药物中的用途。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述疾病包括视网膜疾病。
21.根据权利要求19所述的用途，其中所述疾病为视网膜色素变性RP、黄斑变性MD、先天性静止性夜盲和/或先天性视锥营养不良。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述黄斑变性MD为与年龄有关的黄斑变性。
23.一种包含根据权利要求1至5中任一项所述的光敏感离子通道多肽、权利要求8或权利要求9所述的多核苷酸、权利要求10所述的核酸构建物和/或权利要求11至14中任一项所述的表达载体的组合物在制备药物中的用途，所述用途如下a)-g)：
a) 重新激活哺乳动物视网膜神经节细胞RGC；
b) 治疗或预防目标主体神经元介导的障碍；
c) 恢复内部视网膜细胞光敏感性；
d) 恢复目标主体视力；
e) 治疗或预防目标主体视网膜变性，包括确认目标主体是因为光感受器功能丧失而导致视网膜变性；
f) 恢复人眼光感受器功能，其中包括确认目标主体是因为光感知或敏感性不足而丧失视力；
g) 电活性细胞的去极化；
其特征在于，包括对细胞施用含有有效量的与Td-Tomato荧光蛋白融合的Chrimson蛋白的组合物，或施用表达有效量的与Td-Tomato荧光蛋白融合的Chrimson蛋白的载体。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述用途为恢复目标主体视力，其中包括确认目标主体是因为光感知或敏感性不足而丧失视力。
25.根据权利要求23所述的用途，诱导RGC应答的光刺激水平低于辐射安全极限。
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