JP2019518073A - Chrimsonを用いた光遺伝学的視覚回復 - Google Patents
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Abstract
Description
網膜ジストロフィーは、視覚情報の流れを損なう網膜細胞の不全および変性に関連し、最終的には視覚損失および失明に至る。網膜色素変性(RP)は網膜ジストロフィーの最も一般的なタイプであり、世界で4,000人に1人の視覚損失の原因である。RPは、常染色体優性(症例の30%〜40%)、常染色体劣性(50%〜60%)、またはX連鎖(5%〜15%)として受け継いだ60個より多い遺伝子のいずれかの変性により生じる。
遺伝子送達
マウス注射および動物割り当ての詳細
マウスをAAV注射後〜5週間(27日から53日:平均38日)または11カ月でCO2吸入続いて後頸椎脱臼によって犠牲にした。動物眼球を単離し解剖して、網膜を強膜に接着したままに保つ一方角膜およびレンズを除去した。この眼杯をエームズ溶液(Sigma−Aldrich、St Louis、MO)で満たした遮光性容器で保存した。次に網膜片(典型的には網膜の半分)を単離して多電極アレイ記録に使用した。
多電極アレイ(MEA)記録を生体外マウス網膜から得た。網膜断片をポリリジン(0.1%、Sigma)で予めインキュベートしたセルロース膜上に一晩置いた。極微操作装置上で一度、網膜片を、RGCを電極アレイに向けてMEA(MEA256 100/30 iR−ITO;Multi−Channel Systems、Reutlingen、ドイツ)に対してそっと押し付けた。ChR−tdT構築物により、電極アレイ上の網膜片でのtdTomatoの蛍光を、MEAシステム上に様々な光刺激を送達するために用いられるNikon Eclipse Ti倒立顕微鏡(Nikon、Dusseldorf、ドイツ)上での記録に先立ってチェックした。実験中、網膜を34℃、1〜2ml/分の速度で、95%O2および5%CO2により泡立てたエームズ培地(Sigma−Aldrich、St Louis、MO)で連続して灌流した。選択群IIIの代謝調節型グルタミン酸受容体作用薬L−(+)−2−アミノ−4−ホスホノ酪酸(L−AP4、50μM、Tocris Bioscience、Bristol、英国)を新たに希釈し、記録の10分前に灌流システムを通して灌流した。600nm(±15nm)に設定されSTG2008刺激発生器(MCS)により駆動されるPolychrome V単色光分光器(Olympus、Hamburg、ドイツ)により全分野光刺激を与えた。出力光強度を1.37×1014から6.78×1016光子.cm2.秒−1の範囲にわたるよう測定した。各光強度に対して、2秒フラッシュを各刺激間に5秒の間隔を開けて10回繰り返した。我々はまた、多彩色(最大光強度、6.78×1016光子.cm2.秒−1)を用いて、または600±20nm色フィルターとつながったデジタルマイクロミラー表示装置(DMD、Vialux、解像度1024×768)に投影される蛍光顕微鏡(X−cite、Lumen Dynamics)の光源を用いて、様々な持続時間の刺激への応答を記録した。測定は、網膜のレベルで2×1017光子.cm2.秒−1の光強度を示した。単一電極活性を、平均スパイク密度関数を用いて刺激の繰り返しにわたって平均化した(20ミリ秒ガウス標準偏差)。次に応答電極を各単一網膜に対して平均化する。
組織を室温で4%パラホルムアルデヒドにて30分間固定した。PBS、ウシ血清アルブミン(5%)、Triton(0.5%)およびTween(0.25%)の溶液にて飽和および透過化を1時間室温で行った。一次抗体:1/200tdTomatoと共に希釈飽和溶液(BSA2.5%、Triton0.25%、Tween0.125%)にてインキュベーションを4℃で一晩行った。PBSで20分間洗浄後、組織を室温で1時間二次抗体と共にインキュベートした。さらに5回のPBS洗浄後、組織をベクタシールド中に置き、20Xおよび63X対物レンズを備えた共焦点顕微鏡(Olympus、Tokyo、日本)を用いて撮像した。
トランスフェクト細胞の位置特定
ChrR−tdTの注射の5週間後、光遺伝学タンパク質、ChRの発現がtdTomato蛍光により容易に可視となった。その発現は神経節細胞層ならびに視神経円板に存在する大血管に沿って集中しているのが分かった(図2A参照)。
集団レベルでのおよび細胞統一性に影響を及ぼすことなくChrRおよびChrR−tdTの有効性を評価するために、多電極アレイシステムによりトランスフェクトRGCを記録した(図2B)。記録の成功率が蛍光レポーター、tdTomatoを含む構築物へと偏るのを避けるために、網膜片を電極アレイ上に乗せた後組織蛍光を調べた(図2B)。加えて、残りの光受容体から生じる潜在的な光応答の阻止(Farberら、1994)を、グルタミンシグナル伝達を妨害することで確実にした(方法の項を参照)。
600nmの光フラッシュを網膜組織に1.37×1014から6.78×1016光子.cm2.秒−1まで増大する光強度で2秒間当てた。図2CはそれぞれChrR−tdTおよびChrR構築物による記録された応答である。グラフの各ラインは応答電極で記録された活性のプロットを表し、光誘発応答は少なくとも最高光強度に対して記録された。
ChrimsonRの既知の光感受性を確認するために、ならびに誘発活性がChrimsonR活性のみによることを証明するために、波長全領域(400から650nm、図2C)にわたる光刺激を行った。公表データ(Klapoetkeら、2014)から予想されるように、577〜598nmでピーク発火に到達し、ChrimsonR活性のみに連結した光感受性と一致した。
網膜での発現は多くは神経節細胞層、網膜の最も奥の層の細胞に確認された。ChrR−tdTを発現する細胞のほとんどは、tdTomatoによって標識されるそれらの軸索によって示される網膜神経節細胞(RGC)であった(図4A−C)。ChrR−tdTを発現する細胞の詳しい検討(図4D−E)により、プラズマ膜でまたはその近くでtdTomato蛍光が濃厚であることが明らかになった。このような細胞膜での蛍光の集積はまた比較的弱い発現レベルの細胞で生じた。最後に、我々はChrRに対するポリクローナル抗体を試験する機会を持った(図4)。ChrR抗体標識化により、TdTomato関連蛍光はChrimsonR位置特定にとって良い代理となることが確認された。
本研究は、網膜変性の2つの異なるモデルの盲目網膜での網膜神経節細胞の再活性化のためのChrRの潜在性を示した。データによれば、ChrR−TdTはChrRよりずっと有力であることが示唆された。ChrR−TdTは安全レベルの光で活性化可能であった。これらの結果により、非ヒト霊長類の網膜でのChrR−TdT発現および機能のさらなる臨床前調査への道が開かれた(以下を参照)。
上記の研究では、我々はChrimsonR、赤方偏移オプシンは盲目齧歯類(rd1マウスおよびP23Hラット)での網膜神経節細胞(RGC)の光活性化を誘起することができることを示した。さらに、我々は蛍光タンパク質TdTomatoに融合した拡張形態ChrRは、光に応答する細胞数およびそれらの応答振幅の点からみるとより大きな機能的有効性を提供するように見えることを観察した。齧歯類と対照的に、AAV2は非ヒト霊長類において傍中心窩RGCの環のみを形質導入することは確立されている(Yinら、2011)。AAV2−7m8は、中心窩の環を越えて延び周辺領域での発現の島に至る(Dalkaraら、2013)。AAV2ベクターによる同様のパターンの形質導入はヒトにおいても期待される。
霊長類網膜へと遺伝子送達
AAV注射の2カ月(±5日)後霊長類は致死量のペントバルビタールを受けた。眼球を取り出して、滅菌20ゲージ針により目に孔を開けた後CO2非依存性培地(ThermoFisher Scientific)での輸送のために密封袋に置いた。次に網膜を単離し、記録に先立って12から36時間インキュベーター内で網膜外植片として保存した。半側中心窩網膜断片を細胞培養インキュベーター内での保存のためにNeurobasal+B27培地のポリカーボネートトランスウェル(Corning)上に移した。
多電極アレイ(MEA)記録を生体外半側中心窩網膜から得た。これらの網膜断片をポリリジン(0.1%、Sigma)上に一晩置いた。極微操作装置上で一度、網膜片を電極に向けてMEA(MEA256 100/30 iR−ITO;Multi−Channel Systems、Reutlingen、ドイツ)に対してそっと押し付けた。利用可能な場合はtdTomato蛍光を、MEAシステムの下に載置したNikon Eclipse Ti倒立顕微鏡(Nikon、Dusseldorf、ドイツ)による記録に先立ってチェックした。実験中、網膜を34℃、1〜2ml/分の速度で、95%O2および5%CO2により泡立てたエームズ培地(Sigma−Aldrich、St Louis、MO)で連続して灌流した。AMPA/カイニン酸グルタミン酸受容体作用薬6−シアノ−7−ニトロキノキサリンー2,3−ジオン(CNQX、25μM、Sigma−Aldrich)、NMDAグルタミン酸受容体作用薬[3H]3−(2−カルボキシピペラジン−4−イル)プロピルー1−ホスホン酸(CPP、10μM、Sigma−Aldrich)および選択群IIIの代謝調節型グルタミン酸受容体作用薬L−(+)−2−アミノ−4−ホスホノ酪酸(L−AP4、50μM、Tocris Bioscience、Bristol、英国)を新たに希釈し、記録の10分前に灌流システムを通して灌流した。STG2008刺激発生器(MCS)により駆動されるPolychrome V単色光分光器(Olympus、Hamburg、ドイツ)により全分野光刺激を与えた。出力光強度を1.37×1014から6.78×1016光子.cm2.秒−1の範囲にわたるよう測定した。各光強度に対して、10秒の間隔で刺激を2秒間与えて10回繰り返した。400から650nmまで10nmの波長帯域の刺激を2秒間に10nmのステップで10回与えることによって光スペクトル感度を生成した。試験した波長帯域の順番は網膜の順応を避けるためにランダムとした。応答を引き出すために必要な最小時間を明確にするために光刺激は最大光強度で1から2,000ミリ秒の持続期間、5秒ごとに10回の繰り返しで遂行した。
トランスフェクト細胞の位置特定
AAV2ベクターの硝子体内注射に続く遺伝子送達のついての前の研究では、トランスフェクト細胞が、網膜神経節細胞(RGC)の中心窩領域、特に傍中心窩の環に制約されることが示された(Dalkaraら、2013)。従って、RGCを記録するために網膜を切開して分けるとき、tdTomatoの発現をこの領域により注意を払って網膜内で調べた。中心窩をMEA記録のために二等分に切断した。図8は平に載置した網膜上の傍中心窩環でのtdTomatoを発現する細胞を持つ領域を示し、黒色ドットはMEA記録システムの電極を表す。構築物がtdTomatoを含まないときは、網膜を同様に切開し、黄斑色素の黄色変化を用いたその同定に基づいて、中心窩領域を同様に切開して分けた。
大集団レベルでのおよび細胞統一性に影響を及ぼすことなく様々な構築物の有効性を評価するために、多電極アレイシステム(MEA)によりトランスフェクトRGCを記録した。16個の記録したNHP網膜すべてにおいて、傍中心窩RGCからの自発的活性を記録することができた(図8B)。RGCスパイクが自発的に記録された「活性」電極の数は、1つのAAV2.7m8−ChrimsonR実験(40個の活性電極のみ)の例外を除いて、連続して高かった(平均152個の電極)。多数の電極から自発的活性を記録する能力は、優れた実験状態:1)健全な網膜およびRGC、および2)電極の網膜組織との十分な接触の証である。光パルスを網膜に加えると、多くの電極でスパイク活性の増加が測定された(図8A)。これらの電極を応答電極と名付けた。驚くべきことに、光誘発活性を示す細胞の点からみると網膜間に大きな差異があった(図8B)。実際に、AAV2.7m8−ChrR−TdTを注射したすべての網膜(n=4)は応答電極があった一方で、他の群すべては応答電極のない網膜であった(AAV2.7m8−ChrR:1/4、AAV2−ChrR−TdT:2/4、AAV2−ChrR:0/4)。トランスフェクト細胞を位置特定する蛍光マーカーTdTomatoが無い場合には、光応答が測定されないときサンプリング領域を増やすため電極アレイ上で網膜を何度も再配置したということは言及する価値がある。
光応答を検出するために、光フラッシュを網膜組織に1.37×1014から6.78×1016光子.cm2.秒−1まで上げる光強度により600nmで2秒間当てた。図9AはAAV2.7m8−ChrR−tdTを注射した目からのRGCでの様々な光強度への応答を示す。次いで、これらの光応答は、50ミリ秒ビン幅のスパイク速度で表された。(図9C)これらの光応答は強い持続成分を示すだけではなく、しばしば過渡的成分も示す。図9C〜9Eは、増大する光強度の下での様々な構築物に対するMEA記録した光応答を表す。応答の振幅は光強度の増大と共に増大したが、この最良の構築物を持つ4つの異なる網膜の間であるばらつきが観察された。
スパイク行動を誘発するために必要な刺激持続期間を決定するために、高い光強度(DMDを光源として使用、1.34×1018光子.cm2.秒−1)で可変持続期間(0.2ミリ秒から2,000ミリ秒)の刺激を加えた。図10は、AAV2.7m8−ChrR−tdTを注射した1個の網膜に対して得られたデータを示す。光応答を、すべての試験持続期間でのすべての応答細胞に対する測定瞬間発火率として示した。刺激中の増大発火率に基づいて活性電極を明確にするために2つの第2刺激を用いた。次にこれらの活性電極のすべてから、より短い刺激への応答を分析して、刺激にわたってまた50msを越えて延びるウィンドウ中のスパイク周波数の増加を調べた。図10A〜Bに見られるように、いくつかの細胞は0.4秒のような短い刺激に対して発火率の増大を示した。応答電極数ならびに瞬間発火率は50msまでのより長い刺激に対して連続して増大した。より長い刺激に対して、応答細胞数が変わらなければ瞬間発火率のピークは低下し始める(図10A)。臨床設定での最良刺激パラメータを明確にするために、我々は2つの重要な要因:所与の刺激持続期間中の活性部位の割合(図10C)、および最初のスパイクまでの平均時間(図10D)を評価した。選択された持続期間は、高速動力(最初のスパイクまでの時間)で十分な数の潜在的に活性の細胞での活性を始動させると予想される。活性部位の割合を、瞬間発火率の4つの異なる閾値(5−20−50−100Hz)に対して明確にした。瞬間発火率が考慮した閾値(自発発火率を差し引いた)より高い場合、電極は活性化したとみなされることになる。図10Cは、追加発火率は1msの刺激に対して60%より多い電極で5Hzを越えたことを示す。100Hzを越える活性レベルを持つ同様の割合の電極(ほぼ70%)を得るためには、10msの刺激が必要である。我々はすべての部位およびすべての持続期間に対して最初のスパイクまでの平均時間を測定することによって分析を完成した。この特定の分析では、自発活性は差し引かなかったし、追加スパイク行動を誘発しないかまたは非常に低いものしか誘発しない短い持続期間で正確な活性化閾値を決定するのは非常に困難となる。長い中央値(〜200ミリ秒)は実際には細胞の低い自発スパイク率(〜5Hz)に対応する(0.2〜1ms、図10D)。より長い刺激持続期間(4〜10ミリ秒)に対しては、最初のスパイクまでの平均値に対する中央値は安定期に達した。これらのデータにより、この特定の光強度では、10msは、応答細胞の半分より多くで高い活性率で高速応答動力を提供するであろうことが示される。従って、これらの特性は、網膜神経節細胞の少なくとも映像速度(video rate)活性化と両立し、よってAAV2.7m8−ChrR−tdTは視覚認知にとって十分な発現を提供するであろうことを示す。
3つの構築物(AAV2.7m8−ChrR−tdT、AAV2.7m8−ChrR、およびAAV2−ChrR−tdT)の、硝子体内注射後、光に感応しないRGCを光活性化可能細胞へと変える能力をマカクザルで調査した。
非ヒト霊長類および網膜色素変性罹患rd1マウスにおいて、AAV2.7m8−CAG―ChrimsonR−tdTomatoはTdTomatoのない同様の構築物(AAV2.7m8−CAG−ChrimsonR)より実質的により有力であった。従って、我々はその基礎をなすメカニズムを理解することを目指した。そのために、単独のまたはtdTomatoと融合したChrimsonRの発現およびトラフィッキングに焦点を当ててHEK293細胞でのインビトロ研究を行った。
ヒトHEK293細胞を、10%ウシ胎仔血清を追加したDMEM培地の24ウェルプレートに播種した。細胞は10から70%の合流でおよび流路3と20との間で用いた。pssAAV−CAG−ChrimsonR−tdTomato、pssAAV−CAG−ChrimsonRおよびpssAAV−CAG−ChrimsonR―GFPプラスミドの細胞トランスフェクションを、jetPrime(登録商標)をトランスフェクション剤(jetPrime(登録商標)を50μlの緩衝液中の0.5μgのプラスミドDNAに混合)として用いて完成させた。
HEK293T(ATCC)(登録商標)CRL−3216TM)細胞を、10%FBS(Invitrogen)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)を追加したDMEM培地(Invitrogen、Waltham、米国)にて10%と70%との間の合流で維持した。
細胞のpssAAV−CAG−ChrimsonR−tdTomato(プラスミド479)およびpssAAV−CAG−ChrimsonR(プラスミド480)によるトランスフェクションを、トランスフェクション試薬(http://www.polyplus−transfection.com/products/jetprime/)としてのjetPrime(登録商標)を用いて行った。24ウェルプレートを各ウェルの底にガラスのスライドスリップを置いて用意した。ガラスのスライドスリップはポリ−D−リジンおよびラミニンでコーティングした。HEK293T細胞をこれらの24ウェルプレートに各ウェル100,000細胞の密度でトランスフェクションの1日前に培養した。1μlのjetPrime(登録商標)を0.5μgのプラスミドDNA479または480と50μlの緩衝液中で混合した。51.5μlのトランスフェクションミックスを細胞に加え、トランスフェクションの4〜6時間後培地を変更した。次に細胞を分析に先立ってトランスフェクションの24時間後インキュベートした。
Nucleospin(登録商標)RNAキット(Macherey−Nagel)により細胞溶解物からRNAを抽出した。簡潔に述べれば、与えられた試薬を用いて細胞を溶解させ、溶解物をフィルタリングして細胞残屑を除去した。RNAをシリカ膜に連結させた。汚染DNAを噴霧およびDNAseの作用によって分解した。RNAを洗浄しRNAseを含まない水中で溶出した。RNA濃度および純度を、Nanodropを用いたUV分光分析によってアッセイした。1kbサイズのマーカーの存在下で1%アガロースゲル上に1μgを堆積させRNAの質を評価した。次にRNAを二次DNAse:TURBO(登録商標)DNAseで処置し(反応当たりに2UのTURBO DNAseを添加し次に室温(RT)で20〜30分のインキュベーション)、RT−qPCRのために1ngのRNAを使用した。一般的なオリゴdTプライマーを用いて逆転写を行った。ChrimsonR配列の一部と一致するプライマー(プライマーアクチンフォワード:GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT(配列番号9)、プライマーアクチンリバース:CTTCTGCATCCTGTCAGCAA(配列番号10)、プライマーChrimsonRフォワード:ACACCTACAGGCGAGTGCTT(配列番号11)、プライマーChrimsonRリバース:TCCGTAAGAAGGGTCACACC(配列番号12)により特定のqPCRを行った。ハウスキーピング遺伝子をコードするアクチンに対して標準化を行った。関連分析法を用いた(逆転写サンプルの等モル混合物による標準範囲物を調製し1:10の増分で順次希釈した)。標準物の各希釈物を、上記のプライマーとの混合前にqPCRプレート上に3通りで与えた。続いて関連発現分析を行った。RT−qPCRを(2つの96ウェルプレート上で)2度繰り返し、各トランスフェクション状態を3通りに試験した。
細胞をPBSですすぎ室温で10分間4%のPFAで固定した。遮断緩衝液(1%のTriton X−100、0.5%のTween20および10%のBSA緩衝液を含むPBS)を室温で15分間添加した。次に細胞を、遮断緩衝液(10%のBSA、1%のTriton X−100、0.5%のTween)中で、1:1,000で希釈したChrimsonR(0.59mg/mL)に対して向けたマウスポリクローナル抗体によりRTで2時間インキュベートした。3回のPBS洗浄を行った。次に細胞を、AlexaFluor 488(ロバで生成したA−31571 Thermofisher、希釈1:500)に結合した二次抗マウス抗体によりRTで1時間インキュベートした。実験は3回3通りに行った。
HEK293T細胞を上述のようにトランスフェクトまたは感染させた。ChrimsonRに対する抗体を上述のように処置済みおよび対照ウェルに加えた。細胞核をHoechst核染色により5分間着色し次に洗浄してCellomics Array Scan VTI上で撮像した。画像を、浜松ORCA−ERデジタルカメラを用いて10xズームで遠赤外色および青色チャネルから得た。露光時間を決定するために、標識付きまたは無しのウェルを対照として用いた。取得が完了すると、画像をソフトウェアCellomics Viewで分析した。各パラメータ(閾値化、分割、対象境界)を手動で設定して、自動細胞カウントが細胞の特殊性を反映するのを確実にした。25分野にわたる自動蛍光細胞カウントおよび核カウントを平均化して、各トランスフェクション状態に対する蛍光細胞のパーセンテージを得た。核の数を上まわる蛍光細胞の数を、Graphpadプリズムソフトウェアを用いて蛍光細胞のパーセンテージとしてプロットした。実験は3回行い、各サンプルを2通りで表した。
共焦点顕微鏡検査をOlympus FV1000レーザー走査共焦点顕微鏡で行った。励起および発光クロストークを減らすために、画像を1ラインずつ順次獲得し、Nyquist−Shannonサンプリング定理に従って刻み幅を明確にした。最終画像での過飽和ピクセルを最小限にする露光設定を用いた。次に各カバースリップからの12ビット画像をFIJIにより処理し、Z断面を、Z投影機能の下で最大強度を用いて単一プレーン上に投影し、最後に8ビットRGBカラーモードに変換した。実験を状態当たり3通りで3回繰り返した。各カバースリップに対して少なくとも3枚の画像を獲得した。
RT−qPCR
RNAをトランスフェクト細胞から抽出しRT−qPCRを用いて定量した(図11)。面白いことに、我々はChrimsonR−tdTomato(479)に比べてChrimsonR(480)でトランスフェクトさせた細胞内での方がChrimsonR mRNAの量が多いことを検出した。トランスフェクションはChrimsonRおよびChrimsonR−tdTomatoをコードするプラスミド間で類似すると仮定すると、これは、原理上はChrimsonRの方が発現レベルが高いということになる。しかし、細胞内に存在するmRNAの量は直接にタンパク質発現レベルを反映しない。翻訳後のステップが細胞内のタンパク質レベルおよびタンパク質位置特定全体を明確にする。従って、次の実験セットでは、HEK細胞をChrimsonRまたはChrimsonR−tdTomatoでトランスフェクトさせ、タンパク質発現を顕微鏡により追跡した。
アレイ走査を用いて、細胞の全数(それらの核に基づく)ならびにChrimsonR(480)対ChrimsonR−tdTomato(479)プラスミドでトランスフェクトさせたサンプルの抗ChrimsonR抗体標識の後の蛍光細胞をカウントした。tdTomatoに融合したまたは融合していないChrimsonRを発現する細胞数の間の相違は有意ではなかった(図13)。従って、このカウント方法によれば、tdTomatoの存在または不在に拘わらず同じ数の細胞がChrimsonRにトランスフェクトされ発現した。しかし、蛍光細胞のパーセンテージは蛍光の位置特定についての情報を伝えるものではない。膜で発現したChrimsonRのみが光活性化時の膜電位の変化に至ることができるので、共焦点顕微鏡検査を用いて、我々は次にtdTomatoの存在または不在下でのChrimsonRの細胞内位置特定の相違を調査した。
トランスフェクト/感染させた細胞を、材料および方法で述べたようにChrimsonRに対する抗体およびDAPIで標識した。次にカバースリップを載置して共焦点顕微鏡で観察した。同じパラメータを用いて獲得したZスタックを最大投影して、HEK細胞内のChrimsonRの分布の代表画像を得た。これらのデータは、ChrimsonR対ChrimsonR−tdTomatoの細胞内位置特定が有意に異なることを示す。ChrimsonRは、小胞体細網であると思われるものの中の核周辺領域にとどまる(図14および15)。一方ChrimsonR−tdTomatoは核周辺領域での蓄積はなく細胞にわたって広く分布する(図14および15)。注目すべきは、我々はいかなる抗小胞体細網着色も行わなかったが、HEK細胞でのKDEL(配列番号13)などのERマーカーによる着色パターンが類似の領域を標識するために示された(Wuら、Biochem J、464、13−22、2014)。
RT−qPCRによる転写分析により、mRNAレベルは、ChrimsonR発現プラスミド(480)でトランスフェクトさせた細胞は、ChrimsonR−tdTomato発現プラスミド(479)に比べて僅かに高いことが示された。しかし、tdTomatoと融合したまたは融合していないChrimsonRタンパク質を発現する細胞のパーセンテージはトランスフェクション後類似していた。光遺伝子(optogene)の細胞内位置特定の共焦点顕微鏡観察により、ChrimsonR−tdTomatoはChrimsonR単独に比べて異なる細胞分布パターンを有することが示された。ChrimsonR−tdTomatoは細胞内に広く分布した一方で、ChrimsonR単独は本質的には小胞体細網(ER)内に蓄積し、これはERからの解放およびこれに続く膜への挿入において変化を示すかも知れない。tdTomatoは大きな可溶タンパク質である一方ChrimsonRはかなり不溶性のタンパク質である(Shanerら、Nat Methods、2、905−909、2005)。従って、これらのデータにより、tdTomatoは実際に光遺伝学タンパク質の溶解性を改善し、ChrimsonRのC末端に融合タンパク質として含めるとChrimsonRのERからの解放を促進させるかも知れないことが示唆される。
Claims (25)
- 哺乳類の網膜神経節細胞(RGC)を活性化する方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のChrimsonタンパク質を発現するベクターを哺乳類に投与することを包含する方法。
- 対象でのニューロン介在障害を処置または防止する方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のChrimsonタンパク質を発現するベクターを備えた組成物をニューロンに投与することを包含する方法。
- 内網膜細胞での光への感受性を回復させる方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のChrimsonタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を内網膜細胞に投与することを包含する方法。
- 対象に視覚を回復させる方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のChrimsonタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を対象に投与することを包含する方法。
- 対象に視覚を回復させる方法であって、光覚または光感受性の欠損により視覚を損失した対象を同定すること、および蛍光タンパク質に融合した有効量のChrimsonタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を対象に投与することを包含する方法。
- 対象の網膜変性を処置または防止する方法であって、光受容体機能の損失により網膜変性を患う対象を同定すること、および蛍光タンパク質に融合した有効量のChrimsonタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を対象に投与することを包含する方法。
- ヒトの目の光受容体機能を回復させる方法であって、光覚または光感受性の欠損により視覚を損失した対象を同定すること、および蛍光タンパク質に融合した有効量のChrimsonタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を対象に投与することを包含する方法。
- 電気的に活性の細胞を脱分極する方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のChrimsonタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を細胞に投与することを包含する方法。
- RGC応答を誘起する光刺激レベルが放射線安全性限界より低い、請求項1から8のいずれか1つに記載の方法。
- 前記Chrimsonタンパク質はChrimson88またはChrimsonRである、請求項1から8のいずれか1つに記載の方法。
- 前記蛍光タンパク質はTd−Tomato(TdT)タンパク質および緑色蛍光タンパク質(GFP)から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記tdTタンパク質に融合したChrimsonタンパク質は、Chrimsonタンパク質単独に比べて光刺激への応答がより効果的である、請求項11に記載の方法。
- 前記蛍光タンパク質は、所定細胞数に対する融合Chrimsonタンパク質の発現レベルを、Chrimsonタンパク質単独の発現レベルに比べて増大させる、請求項10に記載の方法。
- 前記融合Chrimsonタンパク質の発現レベルは、前記Chrimsonタンパク質の向上した溶解度、トラフィッキング、および/またはタンパク質構造を通して増大する、請求項13に記載の方法。
- 前記ベクターはアデノ随伴ウィルス(AAV)ベクターである、請求項1から8のいずれか1つに記載の方法。
- 前記AAVベクターはAAV2ベクターおよびAAV2.7m8ベクターから選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記AAVベクターはAAV2.7m8ベクターである、請求項16に記載の方法。
- 前記ベクターはCAGプロモーターを含む、請求項1から8のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ベクターは硝子体内に注射される、1から8のいずれか1つに記載の方法。
- 蛍光タンパク質に融合した有効量の前記Chrimsonタンパク質は長期にわたって発現される、請求項1から8のいずれか1つに記載の方法。
- 蛍光タンパク質に融合した前記Chrimsonタンパク質の発現は投与後少なくとも2カ月、または投与後少なくとも11カ月持続する、請求項20に記載の方法。
- 請求項1から21のいずれか1つに記載のベクターの1つまたはそれ以上を備えた組成物。
- 1つまたはそれ以上のChrimsonタンパク質および1つまたはそれ以上の蛍光タンパク質を融合状態でまたは個別にコードする1つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを備えた組成物。
- 請求項1から21のいずれかに記載の方法の1つまたはそれ以上で使用するための請求項22および23のいずれか1つに記載の組成物。
- 哺乳類の網膜神経節細胞(RGC)を再活性化する、対象のニューロン介在障害を処置または防止する、内網膜細胞での光への感受性を回復させる、対象の網膜変性を処置または防止する、光受容体機能を回復させる、および/または電気的に活性の細胞を脱分極するための、請求項22および23に記載の組成物のいずれか1つの使用。
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