KR102466887B1 - Chrimson을 사용한 광유전학적 시력 회복 - Google Patents

Chrimson을 사용한 광유전학적 시력 회복 Download PDF

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Abstract

다른 방법들 중에서도 단백질 또는 핵산 형태의, 채널로돕신 (예컨대, ChrimsonR)의 유효량, 또는 형광 단백질에 융합된 상기 채널로돕신 (예컨대, ChrimsonR)의 유효량, 및 그의 조성물을 투여함으로써 포유동물에서 망막 신경절 세포를 재활성화시키는 방법을 개시한다. 본 방법은 방사선 안전 한계 미만인, RGC 반응을 유도하는 광 자극 수준을 포함할 수 있다. 본 방법은 아데노연관 바이러스 벡터에 의한 전달을 포함할 수 있다. 본 방법은 CAG 프로모터 사용을 포함할 수 있다. 본 방법으로 유효량의 채널로돕신 (예컨대, ChrimsonR 단백질)을 장기간 발현할 수 있다.

Description

Chrimson을 사용한 광유전학적 시력 회복
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 4월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 62/329,692의 우선권의 이익을 주장하고, 상기 출원의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 방식으로 제출되었고, 그 전문이 본원에서 참조로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2017년 4월 28일 작성된 상기 ASCII 사본은 12295_0006-00304.txt로 명명되고, 그 크기는 31 바이트이다.
분야
본 개시내용은 다른 것들 중에서도 막 간의 전도도, 세포 활성, 및 세포 기능을 변경시키기 위한 조성물 및 방법을 제공하고, 세포 및 대상체에서 외인성 광 활성화 이온 채널의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명의 한 실시양태의 한 측면은 포유동물에게 Chrimson 폴리펩티드의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 망막 신경절 세포 (RGC)를 재활성화시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 방사선 안전 한계 미만인, RGC 반응을 유도하는 광 자극 수준을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Chrimson 폴리펩티드는 형광 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 tdTomato (tdT) 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)이다.
망막은 광수용체로 구성되며, 이 광수용체는 광변환, 즉, 궁극적으로는 세계를 표현할 수 있도록 시각계 내 이벤트들의 캐스케이드를 전파하는 전기 및 화학 신호로의 광의 전환에 의한 망막의 감광성을 담당하는 고도로 분화된 뉴런이다. 척추동물의 망막에서, 광변환은 광 감수성 수용체 단백질인 로돕신의 활성화에 의해 개시된다.
예컨대, 색소성 망막염 (RP) 또는 황반 변성 (MD) 사례에서와 같은, 광수용체 상실 또는 변성은 망막 내에서 시각 정보의 광변환을 완전히 억제시키지 않는다면, 그를 심하게 손상시킨다. 광수용체 세포의 상실 및/또는 광수용체 세포 기능의 상실은 시력 감소, 광 감수성 감소 및 실명의 주요 원인이다.
유전자 요법, 줄기 세포 요법, 광유전학적 방법, 및 망막 인공 기관을 비롯한, 망막 변성 질환에 주력한 여러 치료 접근법이 현재 개발 중에 있다 (Scholl et al., 2016, Science Translational Medicine, 8 (368), 368rv6).
예를 들어, 광유전학적 방법으로 명명되는 유전공학 및 신경공학 기술에 의해 뇌 중의 다른 뉴런에는 어떤 영향도 미치지 않으면서, 정의된 뉴런 집단의 활성을 조절함으로써 대상체의 망막의 감광성을 회복시키는 것이 제안되어 왔다. 단백질 결핍 또는 기능 장애의 보정을 통해 결함이 있는 유전자를 대체하거나, 또는 수복시키거나, 또는 유전적 결함을 회피하기 위해 시도하는 전통적인 유전자 요법과 달리, 요법에 대한 광유전학적 접근법은 망막 내의 보통은 비-감광성인 세포에 광에 대하여 반응할 수 있는 능력을 부여하여 환자에게 유용한 시력을 회복시키는데 사용될 수 있다. 양극성 또는 신경절 세포에 세포외 전기 자극을 제공하는 망막 칩 임플란트와 달리, 광유전학적 방법 기반의 요법은 세포 내부로부터 세포를 자극시킨다.
광유전학적 방법 (Deisseroth. Nat Methods 8 (1): 26-9, 2011)이란, 살아있는 조직의 특정 세포 내의 잘 정의된 이벤트를 조절하기 위한 유전학적 방법과 광학적 방법의 조합을 지칭한다. 광유전학적 방법은 특이적인 표적화 기전을 사용하여 세포 유형 분해는 유지하면서, 밀리초 단위의 정밀도로 신경 활성을 조작할 수 있는 광 활성화된 채널을 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 이는 광 반응성을 부여하는 유전자의 발견, 및 상기 유전자의 세포 내로의 삽입을 포함하고; 이는 또한 포유동물과 같이 복잡한 유기체 내 심부로 광을 전달하기 위한, 광 감수성을 관심 세포로 표적화하기 위해, 및 이러한 광학적 제어의 특정의 판독치, 또는 효과를 사정하기 위한 관련 기술을 포함한다.
예를 들어, WO2007024391, WO2008022772 또는 WO2009127705에는 광 활성화 이온 채널 및 펌프 (예컨대, 채널로돕신-2 [ChR2]; 할로로돕신 [NpHR])를 코딩하는 것으로서, 포유동물 뉴런에서의 발현을 위해 조작된 것이고, 바이러스 벡터를 사용하여 유전적으로 특정의 신경 집단으로 표적화될 수 있는, 식물 및 미생물 유기체 (예컨대, 고세균, 박테리아, 및 진균)로부터 유래된 옵신 유전자의 용도가 기술되어 있다. 적절한 파장의 광에 노출되었을 때, 옵신 발현 뉴런에서 활동 전위가 유발될 수 있고, 이로써, 상기 세포에 광 감수성을 부여할 수 있다.
최근 몇 년간, 클라미도모나스 레인하르디티이(Chlamydomonas reinhardtii) 또는 볼복스 카테리(Volvox carteri)로부터의 4개의 채널로돕신 유전자로부터 유래된, 다수의 채널로돕신이 신경 과학 적용을 위해 조작되어 왔다. 그러나, 상기의 천연 채널로돕신은 오직 청색-녹색 (430-550 nm) 스펙트럼 피크만을 가지며, 조작된 적색 이동 채널로돕신, 예컨대, C1V1 및 ReaChR은 녹색 (~545 nm)에서 피크 파장 감수성을 가진다 ([Mattis et al., Nature Methods, 2011 Dec 18;9(2): 159-72]; [Lin et al., Nature Neuroscience, 2013 Oct; 16(10): 1499-508]).
이에, 2014년, 문헌 [Klapoetke et al., Nat Methods, 11(3), 338-346]에서는, 앞서 기술된 채널로돕신에서는 발견되지 않았던 독특한 특징을 가지는 신규한 옵신을 발견하는 것을 목표로 하면서, 천연 채널로돕신 유전적 다양성 연구를 통해 상기와 같은 한계를 극복하고자 하였다. 따라서, WO2013071231에는 서로, 및 당업계의 최신 기술 (예컨대, ChR2/VChR1)과 상이한 활성화 스펙트럼을 가지며, 상이한 세포에서 유전적으로 발현되는, 상이한 활성화 스펙트럼을 가지는 채널을 발현한 후, 상이한 색상의 광을 조직에 조사함으로써 다중의 상이한 파장의 광이 동일한 조직 내의 상이한 세포 세트를 탈분극시키는데 사용될 수 있도록 하는, 신규한 채널로돕신인 Chronos 및 Chrimson이 개시되어 있다. 더욱 특히, Chrimson은 임의의 이전 채널로돕신에 비해 45 nm 적색 이동되어 있고; 이는, 적색 광은 조직에 의해 더욱 약하게 산란되고, 다른 채널로돕신 변이체에 의해 요구되는 청색 내지 녹색 파장보다 더 적게 혈액에 의해 흡수되기 때문에, 적색 광이 바람직할 수 있는 상황에서는 중요할 수 있다.
옵신은 대개 옵신 발현 세포에서의 시각화를 촉진시키고, 이로써 그의 세포내 국재화를 모니터링하기 위해 형광 단백질에 융합된다. 사용되는 일부 유형의 형광 단백질은 특정 조건하에서는 옵신 세포 국재화를 조정할 수 있다는 것이 추가로 제시된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Arrenberg et al. (2009, PNAS, 106(42), 17968-73)에서는 동일한 옵신, 그러나, 상이한 형광성 태그 (즉, 적색 형광 단백질 mCherry 또는 황색 형광 단백질 YFP)를 함유하는 융합 단백질이 종종 상이한 세포 구획에 분포된다는 것을 관찰하게 되었다.
그러나, tdTomato에 융합된 채널로돕신-2를 발현하는 트랜스제닉 동물에서 발현 수준 또는 막 국재화에서의 어떤 뚜렷한 차이도 관찰되지 않았는 바 (Madisen et al. 2012, Nat Neurosci., 15(5): 793-802), 상기와 같은 관찰결과는 tdTomato 형광성 태그를 사용해서는 확인되지 못했다. 더욱이, 융합 단백질의 국재화 또는 그의 발현 수준에서의 상기와 같은 변화와 연관된 옵신의 활성에 대한 개선에 대해서는 현재까지는 보고된 바 없다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 tdTomato (tdT) 형광 단백질 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된, Chrimson 단백질, 및 더욱 특히, Chrimson R (ChrR)로 명명되는, Chrimson 단백질의 한 특별한 돌연변이체가 Chrimson 단백질 단독과 비교 시 광 자극에 대해 반응하는데 있어서 더욱 효과적이라는 것을 제시한다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 형광 단백질은 단독/융합되지 않은 Chrimson 단백질의 발현 수준과 비교 시 주어진 세포에 대한 융합된 Chrimson 단백질의 발현 수준, 더욱 특히, 원형질막에서의 단백질 수준을 증가시킨다. 본 방법의 일부 다른 실시양태에서, 형광 단백질은, 단독/융합되지 않은 Chrimson 단백질의 세포 트래픽킹과 비교 시 융합된 Chrimson의 원형질막으로의 세포 트래픽킹을 증가시킨다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 융합된 Chrimson 단백질의 발현 수준 및/또는 세포 트래픽킹은 Chrimson 단백질의 증강된 가용성, 트래픽킹, 및/또는 단백질 입체구조를 통해 증가된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 Chrimson 단백질 및 형광 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다. 벡터는 적어도 하나의 Chrimson 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다.
다른 추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포 (즉, 뉴런)에 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 뉴런 매개 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 벡터는 적어도 하나의 Chrimson 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게, 투여되는 조성물의 벡터는 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 내부 망막 세포에서 광에 대한 감수성을 회복시키는 방법을 포함한다. 본 방법은 세포에 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 벡터는 적어도 하나의 Chrimson 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게, 투여된 조성물의 벡터는 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상이한 측면에서, 본 개시내용은 대상체에게 시력을 회복시키는 방법을 포함한다. 본 방법은 광 지각 또는 감수성 결핍에 기인하여 시력이 상실된 대상체를 확인하는 단계; 눈에 적어도 하나의 Chrimson 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; 광을 사용하여 폴리펩티드를 활성화시키는 단계; 및 대상체에서 광 감수성을 측정하는 단계로서, 여기서 광 감수성이 증가하였다는 것은 시력이 회복되었음을 지시하는 것인 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 광 지각 또는 감수성 결핍에 기인하여 시력이 상실된 대상체를 확인하는 단계; 눈에 적어도 하나의 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; 광을 사용하여 폴리펩티드를 활성화시키는 단계; 및 대상체에서 광 감수성을 측정하는 단계로서, 여기서 광 감수성이 증가하였다는 것은 시력이 회복되었음을 지시하는 것인 단계를 포함하는, 대상체에게 시력을 회복시키는 방법을 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 망막 변성을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 본 방법은 광수용체 기능 상실에 기인하여 망막 변성을 앓는 대상체를 확인하는 단계; 눈에 적어도 하나의 Chrimson 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; 및 대상체에서 광 감수성을 측정하는 단계로서, 여기서 광에 대한 감수성이 증가하였다는 것은 망막 변성이 치료되었음을 지시하는 것인 단계를 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 광수용체 기능 상실에 기인하여 망막 변성을 앓는 대상체를 확인하는 단계; 적어도 하나의 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; 및 대상체에서 광 감수성을 측정하는 단계로서, 여기서 광에 대한 감수성이 증가하였다는 것은 망막 변성이 치료되었음을 지시하는 것인 단계를 포함하는, 대상체에서 망막 변성을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 인간 눈에서 광수용체 기능을 회복시키는 방법을 포함한다. 본 방법은 적어도 하나의 Chrimson 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 인간 눈에서 광수용체 기능을 회복시키는 방법을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 전기적으로 활성인 세포를 탈분극시키는 방법을 포함한다. 본 방법은 전기적으로 활성인 세포에 적어도 하나의 Chrimson 단백질 및 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 전기적으로 활성인 세포에 적어도 하나의 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 전기적으로 활성인 세포를 탈분극시키는 방법을 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시양태에서, 벡터는 아데노연관 바이러스 (AAV) 벡터이다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 벡터는 AAV2.7m8 벡터 또는 AAV2 벡터이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 CAG 프로모터의 사용을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 주사에 의해 투여되거나, 바람직하게는 유리체내로 주사된다.
본 방법의 일부 실시양태에서, Chrimson 단백질의 유효량은 장기간 발현된다. 본 방법의 일부 실시양태에서, Chrimson 단백질의 발현은 주사 후 적어도 11개월 후에도 지속된다. 본 방법의 일부 실시양태에서, Chrimson 단백질의 발현은 주사 후 적어도 2개월 후에도 지속된다.
본 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 마우스이다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 마우스는 rd1이다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 포유동물은 래트이다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 래트는 P23H이다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간 또는 비-인간 영장류이다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 비-인간 영장류는 시노몰구스 마카크이다.
하기 개시내용은 또한 하기 추가의 실시양태를 제공한다:
실시양태 1은 포유동물에게 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 유효량을 발현하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 망막 신경절 세포 (RGC)를 재활성화시키는 방법을 제공한다.
실시양태 2는 뉴런에 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 유효량을 발현하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 뉴런 매개 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
실시양태 3은 내부 망막 세포에 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 유효량을 발현하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 내부 망막 세포에서 광에 대한 감수성을 회복시키는 방법을 제공한다.
실시양태 4는 대상체에게 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 유효량을 발현하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 시력을 회복시키는 방법을 제공한다.
실시양태 5는 광 지각 또는 감수성 결핍에 기인하여 시력이 상실된 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 유효량을 발현하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 시력을 회복시키는 방법을 제공한다.
실시양태 6은 광수용체 기능 상실에 기인하여 망막 변성을 앓는 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 유효량을 발현하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 망막 변성을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
실시양태 7은 광 지각 또는 감수성 결핍에 기인하여 시력이 상실된 대상체를 확인하는 단계 및 대상체에게 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 유효량을 발현하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 인간 눈에서 광수용체 기능을 회복시키는 방법을 제공한다.
실시양태 8은 전기적으로 활성인 세포에 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 유효량을 발현하는 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 전기적으로 활성인 세포를 탈분극시키는 방법을 제공한다.
실시양태 9는 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, RGC 반응을 유도하는 광 자극 수준이 방사선 안전 한계 미만인 방법을 제공한다.
실시양태 10은 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, Chrimson 단백질이 Chrimson 88 또는 Chrimson R인 방법을 제공한다.
실시양태 11은 실시양태 10에 있어서, 형광 단백질이 Td-Tomato (TdT) 단백질 및 녹색 형광 단백질 (GFP)로부터 선택되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 12는 실시양태 11에 있어서, tdT 단백질에 융합된 Chrimson 단백질이 Chrimson 단백질 단독과 비교 시 광 자극에 대해 반응하는데 있어서 더욱 효과적인 것인 방법을 제공한다.
실시양태 13은 실시양태 10에 있어서, 형광 단백질이 Chrimson 단백질 단독의 발현 수준과 비교 시 주어진 수의 세포에 대해 융합된 Chrimson 단백질의 발현 수준을 증가시키는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 14는 실시양태 13에 있어서, 융합된 Chrimson 단백질의 발현 수준이 Chrimson 단백질의 증강된 가용성, 트래픽킹, 및/또는 단백질 입체구조를 통해 증가되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 15는 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 벡터가 아데노연관 바이러스 (AAV) 벡터인 방법을 제공한다.
실시양태 16은 실시양태 15에 있어서, AAV 벡터가 AAV2 벡터 및 AAV2.7m8 벡터로부터 선택되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 17은 실시양태 16에 있어서, AAV 벡터가 AAV2.7m8 벡터인 방법을 제공한다.
실시양태 18은 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 벡터가 CAG 프로모터를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 19는 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 벡터가 유리체내로 주사되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 20은 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 유효량이 장기간 발현되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 21은 실시양태 20에 있어서, 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 발현이 투여 후 적어도 2개월, 또는 투여 후 적어도 11개월 후에도 지속되는 것인 방법을 제공한다.
실시양태 22는 실시양태 1 내지 21 중 어느 한 실시양태에 따른 벡터 중 하나 이상의 것을 포함하는 조성물을 제공한다.
실시양태 23은 융합된 또는 별개로의, 하나 이상의 Chrimson 단백질 및 하나 이상의 형광 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
실시양태 24는 실시양태 22 또는 23에 있어서, 실시양태 1 내지 21 중 어느 한 실시양태의 방법 중 하나 이상의 것에서 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
실시양태 25는 포유동물에서 망막 신경절 세포 (RGC)를 재활성화시키기 위한, 대상체에서 뉴런 매개 장애를 치료 또는 예방하기 위한, 내부 망막 세포에서 광에 대한 감수성을 회복시키기 위한, 대상체에서 망막 변성을 치료 또는 예방하기 위한, 광수용체 기능을 회복시키기 위한, 및/또는 전기적으로 활성인 세포를 탈분극시키기 위한, 실시양태 22 또는 23의 조성물 중 어느 하나의 용도를 제공한다.
도 1 : rd1 마우스에서의 생체내 방법
도 2a 내지 2d : 변성된 rd1 마우스 망막은 ChrimsonR 스펙트럼 감수성에 매칭되는 파장의 광에 대해 및 10 ms 미만의 지속기간에 반응한다. 도 2a - 주사 후 2개월째의 ChrR-tdT 발현 rd1 마우스의 눈 기저부. 도 2b. MEA 칩 상에 탑재된 rd1 마우스 망막의 TdT 형광. 도 2c - ChrR 발현 마우스 망막의 스펙트럼 감수성 (n=1 망막, 188개의 전극). 도 2d - 590 nm에서의 1e17개의 광자.cm-2.s-1에서 증가하는 지속기간의 자극에 대한 반응으로 나타나는 부가된 발화율. 모든 기록은 L-AP4, CNQX 및 CCP 믹스의 존재 하에서 수행된 것이다.
도 3a 내지 3c : Chrimson R은 rd1 마우스에서 tdT와 융합되었을 때 더욱 효율적이다. 도 3a. ChrR 또는 ChrR-tdT로 감염된 망막 사이의 비교가 광 자극에 대한 반응에 있어서 더욱 효과적이었다. 도 3b. ChrR-tdT 발현 망막의 반응 RGC의 원시 데이터, 래스터 플롯 및 평균 PSTH (각각 상단에서부터 하단으로). 도 3c. 상이한 자극 강도에서의 활성화 수준을 제시하는, ChrR (n=4 망막, 27개의 세포) 또는 ChrR-tdT (n=6 망막, 548개의 세포)를 발현하는 망막의 강도 플롯.
도 4a 내지 4g : 신경절 세포에서의 Chrimson R의 발현. rd1 마우스의 망막 신경절 세포 (RGC)에서의 ChrR-tdT의 발현. 생체내 AAV 감염 이후의 ChrR-tdT의 발현은 대체로 RGC로 국한되었다. 도 4a, 도 4b 및 도 4c - 2가지 RGC 예에서의 막 국재화된 발현을 제시하는 공초점 스택의 투영도. 도 4a - 면역학적 증폭 부재하의, 내인성 tdTomato의 영상. 도 b. 본 발명자들의 주문 제작된 ChrR 항체에 대하여 표지된 것의 영상. 도 4c - 두 영상 (도 4a 및 도 4b)의 오버레이, tdTomato 및 ChrR 항체는 각각 자홍색 및 청록색. 40x 대물렌즈를 사용하여 촬영된 영상. ChrR-tdT의 발현은 RGC 막에 증강되어 있다. 도 4d 및 도 4e - 60x 대물렌즈를 사용하여 촬영된, 2개의 RGC 세포체 (도 4c의 인서트 참조)를 제시하는 3개의 눈 슬라이스의 투영도. 도 4f 및 도 4g - 각각 도 4d 및 도 4e에서의 세포체에 대한 형광 강도의 3D 표면 플롯. 가장 높은 형광 강도를 나타내는 피크는 세포막에, 또는 세포막 주변에 집중되어 있다.
도 5a 내지 5d : Chrimson R 장기간 발현. 주사 후 10개월째의 rd1 마우스에서의 다전극 어레이 기록. 도 5a - 발현은 주사 후 10개월 경과시에도 지속된다는 것을 제시하는, ChrR-tdT를 발현하는 망막의 영상. 도 5b - 한 전극 상에서 측정된 활성의 예, 상단 - 적색광 자극, 중간 - 10회의 플래쉬 반복 동안 동일한 세포 반응의 래스터 플롯, 하단 - 평균 PTSH (빈 크기: SOms). 도 5c - 증가하는 강도의 플래쉬에 대한 반응으로 나타나는 부가된 발화율 (n=4 망막, 308개의 전극). 도 5d - 590 nm에서의 1e17개의 광자.cm-2.s-1에서 증가하는 지속기간의 플래쉬에 대한 반응으로 나타나는 부가된 발화율. 모든 기록은 L-AP4, CNQX 및 CPP 믹스의 존재 하에서 수행된 것이다.
도 6a 내지 6b : Chrimson R은 P23H 망막을 재활성화시킨다. 또 다른 변성 설치류 모델: P23H 래트에서의 다전극 어레이 기록. 도 6a - 주사 후 1개월째의, 다전극 어레이 상의 P23H 망막의 형광 영상. 도 6b - 590 nm에서의 1e17개의 광자.cm-2.s-1에서 증가하는 강도의 자극에 대한 반응으로 나타나는 부가된 발화율 (n=2 망막, 91개의 전극). 모든 기록은 L-AP4, CNQX 및 CPP 믹스의 존재 하에서 수행된 것이다.
도 7 : 비 인간 영장류에서의 생체내 방법. 4가지 상이한 전략법을 비-인간 영장류 (마카카 파스키쿨라리스(macaca fascicularis))에서의 ChrR 발현에 대하여 시험하였다. 2개의 상이한 구축: 둘 다가 CAG 프로모터 하에 있는, ChrimsonR (ChrR) 또는 융합된 단백질 ChrimsonR-td-Tomato (ChrR-tdT). 2개의 상이한 바이러스 캡시드: 야생형 AAV2, 및 돌연변이체 AAV2-7m8 (Dalkara et al. 2013, Science Translational Medicine, 5(189): 189ra76). MEA (512개의 어레이, MCS) 또는 패치 클램프 (포스퍼 [Chaffiol et al., abstract 599 - B0072] 참조) 기록 2개월 전에 단일 바이러스 용량 (5x1011 vg/눈)의 주사를 수행하였다. 모든 기록은 시냅스 차단제 (LAP4 50 μM 및 CPP 10 μM)의 존재 하에서 수행되었다.
도 8a 내지 8c : Chrimson R은 구축물의 생체내 주사 후 중심와주변에서 발현된다. 구축물의 생체내 주사는 중심와주변 고리의 RGC에서의 발현을 유도한다. 도 8a - 망막 외식편의 적외선 영상, 별표 표시는 중심와 피트 오목부를 나타내는 것이다. 검은색 점은 MEA 어레이의 전극이다. 도 8b - AAV2.7m8-ChrR-tdT 구축물로 감염된, 동일한 망막 조각의 형광 영상. 발현은 중심와주변 고리로 국한되어 있다. 도 8c - 도 8a & 도 8b에 제시된 망막 외식편의 스펙트럼 감수성. 10회에 걸친 반복 및 모든 반응성 전극 간의 평균값으로 나타낸 반응. 스펙트럼의 형상 및 시냅스 차단제의 존재는 RGC 중 ChrR이 기록된 활성의 공급원이라는 것을 나타낸다.
도 9a 내지 9g : 가장 효율적인 형질도입을 유도한 시험 구축물의 확인. 형질도입을 반응성 전극의 수 및 광 유발 반응의 감수성으로서 평가한다. 도 9a - 4개의 상이한 강도에서의 광 플래쉬에 대한 하나의 전극의 반응에 관한 예. 도 9b - 4개의 구축물에 대한 완전한 실험 세트에 관한 개요. 활성 전극: 활동 전위가 검출되는 전극. 반응 전극: 발화율이 광 자극에 의해 증가된 전극. 도 9c, 도 9d 및 도 9e - 상이한 구축물에 관한 각각의 반응성 망막에 대한 집단 반응. 각각의 유색선은 10회 반복에 대한 평균값으로 제시된, 개별 전극 반응을 나타내는 것이다. 그래프의 각 행은 한 망막으로부터의 반응을 나타내고, 각 열은 동일한 광 자극 (상단에 제시된 강도 (단위는 광자/cm2/sec))에 대한 상이한 망막의 반응을 나타낸다. 도 9f - 상이한 광 강도에서의 각각의 반응성 망막에 대한 평균 부가된 발화율, 자발적 발화율은 감산된 것이다. 도 9g - 반응 임계치를 더욱 잘 시각화하기 위한 f의 상세도. 모든 자극은 600 nm에서 수행하였다.
도 10a 내지 10d : AAV2.7m8-ChR-tdT로 감염된 망막에서의 증가하는 지속기간의 자극에 대한 중심와주변 RGC의 반응. AAV2.7m8-ChrR-tdT로 감염된 망막에서의 증가하는 지속기간의 자극에 대한 중심와주변 RGC의 반응. 도 10a - 증가하는 지속기간의 광 자극에 대한 반응, 각 선은 자극당 10회에 걸친 반복 간의 평균값으로 나타낸 단일 전극 스파이크 밀도 함수를 나타낸다. 도 10b - 시험된 모든 지속기간에 대한 평균 발화율. 도 10c - 4개의 상이한 활성 임계치에 대한 상이한 자극 지속기간에서의 활성 부위의 분율. 도 10d - 시험된 모든 지속기간에 대하여 10회에 걸친 자극 반복 간의 평균값으로 나타낸, 제1 스파이크까지의 시간. 적색 점은 중앙값을 표시하고, 박스의 에지는 데이터의 제25 및 제75 백분위수를 표시하고, 위스커는 개별적으로 플롯팅된 이상점을 제외한 나머지를 표시하는 것이다. 1 내지 5 msec 자극에서의 중앙값의 현저한 하락은 대부분의 기록 부위가 상기 지속기간 동안에 반응하기 시작한다는 것을 나타내는 것이다. 모든 자극은 600 +/- 20 nm에서 2x1017개의 광자.cm-2.s-1인 강도로 제공되었다.
도 11 : tdTomato가 ChrimsonR mRNA 수준에 미치는 효과. RT-qPCR 반응에서 ChrimsonR의 증폭 곡선. Y축은 기준선 신호의 Rn 값을 뺀 실험 반응에 상응하는 델타 Rn 값을 나타낸다. 상기 파라미터는 주어진 PCR 프라이머 세트로부터 발생된 특이적 신호의 크기를 신뢰가능한 방식으로 계산한다. 자홍색 및 보라색 트레이스는 ChrimsonR을 나타내고; 황색 및 오렌지색 트레이스는 ChrimsonR-tdTomato를 나타내고; 진한 청색 및 옅은 청색은 형질감염되지 않은 대조군이다. 실험은 3회 반복되었고, 각 실험은 2개의 플레이트 상에서 진행되었으며, 이를 통해 총 6회 반복되었다. 각 샘플은 각 플레이트 상에서 3중으로 진행되었다.
도 12a 내지 12b : pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato, pssAAV-CAG-ChrimsonR 및 pssAAV-CAG-ChrimsonR-GFP 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켰을 때의 ChrimsonR 단백질의 수준.
도 13 : tdTomato가 ChrimsonR을 발현하는 세포 수에 미치는 효과. 형질감염되지 않은 대조군과 비교하여, 플라스미드 479 (ChrimsonR-tdTomato) 및 480 (ChrimsonR)으로 형질감염된 세포에 대한 ChrimsonR-양성 세포의 백분율이 제시되어 있다. 배경 형광을 소거하기 위해 임계치 값을 사용함으로써 형광 세포의 백분율을 측정하였다. 세포 수가 세포당 형광 강도를 나타내는 것이 아니라는 것에 주의하는 것이 중요하다. 상기 세포 카운팅 방법에 기초하였을 때, 두 구축물로의 형질감염 이후, ChrimsonR 발현 세포의 백분율 사이에는 어떤 통계학상 유의적인 차이도 없다. 오차 막대는 상기 실험 내에서의 SEM을 나타내고, 본 실험은 각 조건에 대하여 기술상 2중으로 3회에 걸쳐 반복되었다.
도 14a 내지 14b : tdTomato가 HEK 293T 세포에서 ChrimsonR의 세포내 소기관 국재화에 미치는 효과. 공초점 z 스택의 최대 투영법에 의해 수득된, 형질감염된 HEK 293T 세포의 영상. 세포 핵은 청색 (DAPI)으로 제시되어 있고, Chrimson R은 백색으로 제시되어 있다. 도 14a는 Chrimson R-dtTomato의 국재화를 제시하는 것이고; 도 14b는 ChrimsonR 단독의 분포를 제시하는 것이다. 스케일 막대 20 μm.
도 15a 내지 15b : tdTomato가 AAV 감염 후의 HEK 293T에서 ChrimsonR의 세포내 소기관 국재화에 미치는 효과. 공초점 z 스택의 최대 투영법에 의해 수득된, 형질감염된 HEK 293T 세포의 영상. 세포 핵은 청색 (DAPI)으로 제시되어 있고, Chrimson R은 백색으로 제시되어 있다. 도 15a는 Chrimson R-dtTomato의 국재화를 제시하는 것이고; 도 15b는 ChrimsonR 단독의 분포를 제시하는 것이다. 스케일 막대 20 μm.
본 개시내용에서, 구체적으로 언급되지 않는 한, 단수형 사용은 복수형을 포함하고, "한"이라는 단어는 "적어도 하나"라는 것을 의미하며, "또는" 사용은 "및/또는"을 의미하는 것이다. 추가로, "포함하는"이라는 용어 뿐만 아니라, 예컨대, "포함하다" 및 "포함된"이라는 다른 형태의 용어 사용은 제한적인 것이 아니다. 또한, 구체적으로 언급되지 않는 한, 예컨대, "요소" 또는 "성분"과 같은 용어는 하나의 단위의 요소 및 성분, 및 하나 초과의 단위를 포함하는 요소 또는 성분을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 백분율 또는 다른 수치량과 함께 사용될 때 "약"이라는 용어는 상기 백분율 또는 다른 수치량의 플러스 또는 마이너스 10%를 의미한다. 예를 들어, "약 80%"라는 용어는 80% 플러스 또는 마이너스 8%를 포함할 것이다.
특허, 특허 출원, 기사, 서적, 및 논문을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 본 출원에서 인용된 모든 문헌, 또는 상기 문헌의 일부는 그 전문이 임의 목적을 위해 본원에서 참조로 명백하게 참조된다. 포함된 문헌 및 유사 자료들 중 하나 이상의 것이 본 출원에서의 상기 용어에 관한 정의와 상충하는 방식으로 용어를 정의하는 경우, 본 출원이 조정한다.
본원에서 사용되는 바, "단백질", ≪ 폴리펩티드 ≫ 및 "펩티드"라는 용어는 달리 지시되지 않는 한, 상호교환적이다.
본원에서 사용되는 바, ≪ 융합 단백질 ≫ 또는 ≪ 또 다른 것에 융합된 단백질 ≫이라는 용어는 단백질 구축물 또는 키메라 단백질을 지칭한다. 이는 추가의 화학적 링커 없이, 그의 각 펩티드 쇄 내의 펩티드 결합을 통해 공유적으로 연결된, 2개 이상의 단백질 또는 그의 단편을 함유하는 단일 단백질 분자를 의미한다. 한 단백질은 그의 N-말단 또는 C-말단에서 또 다른 단백질에 융합될 수 있다. 융합 단백질은 유전적 구축으로부터 생성되는 링커 모이어티를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 및 달리 명시되지 않는 한, "치료하다," "치료하는" "치료" 및 "요법"이라는 용어는 환자가 장애, 예컨대, 뉴런 매개 장애 또는 안구 장애를 앓는 동안 발생하는, 상기 장애의 하나 이상의 증상 또는 효과의 중증도를 감소시키는 작용인 것으로 간주된다. 본원에서 사용되는 바, 및 달리 명시되지 않는 한, "예방하다," "예방하는" 및 "예방"이라는 용어는 환자가 장애, 예컨대, 뉴런 매개 장애 또는 안구 장애를 앓기 시작 전에 발생하는, 상기 장애의 발병을 지연시키고/거나, 그를 억제시키거나, 또는 그의 중증도를 감소시키는 작용인 것으로 간주된다. 치료는 예방적 치료일 수 있거나, 질환 또는 병태 진단 이후에 투여되는 치료일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 치료는 장애, 질환, 또는 병태의 증상 또는 특징을 감소 또는 제거할 수 있거나, 또는 장애, 질환, 또는 병태 그 자체를 제거할 수 있다. 본 발명의 치료는 질환, 장애 또는 병태의 진행을 감소 또는 제거할 수 있거나, 또는 일부 경우에서는 질환, 장애 또는 병태를 퇴행시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 세포 집단에서 발현될 수 있고, 장애 또는 병태를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 및 달리 언급되지 않는 한, 화합물의 "치료적 유효량"은 뉴런 매개 장애 또는 안구 장애의 치료 또는 관리에서 임의의 치료적 이익을 제공하는데, 또는 장애, 예컨대, 뉴런 매개 장애 또는 안구 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 지연시키거나, 또는 최소화하는데 충분한 양이다. 화합물의 치료적 유효량은 장애, 예컨대, 뉴런 매개 장애 또는 안구 장애의 치료 또는 관리에서 임의의 치료적 이익을 제공하는, 단독, 또는 하나 이상의 다른 요법 및/또는 치료제와 함께 조합된 화합물의 양을 의미한다. "치료적 유효량"이라는 용어는 뉴런 매개 장애 또는 안구 장애를 완화시키거나, 안구 장애를 개선 또는 감소시키거나, 전체 요법을 개선시키거나, 또는 또 다른 치료제의 치료 효능을 증진시키는 양을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "환자" 또는 "대상체"는 본원에 기술된 장애를 앓고 있거나, 또는 장애에 걸리기 쉬운 포유동물 유기체, 예컨대, 인간 및 비-인간 포유동물, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 설치류, 마우스, 래트, 비-인간 영장류, 반려 동물, 예컨대, 개 및 고양이 뿐만 아니라, 가축, 예컨대, 양, 소, 말 등을 포함한다.
본 발명의 Chrimson 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예컨대, 벡터)으로 망막 뉴런을 형질감염시키면, 망막 뉴런, 바람직하게, 양극성 세포 및/또는 신경절 세포에 감광성 막 채널을 제공할 수 있다. 따라서, 본원에서 의도되는 바와 같이, 광 자극을 사용하여, 시력의 한 형태를 구성하는 시각 신호의 프로세싱을 담당하는 뇌 영역인 동물의 시각 피질로의 시각 자극의 전달을 측정할 수 있다. 상기 시력은 보통의 인간 시력 형태와는 다를 수 있고, "광 감지" 또는 "광 지각"로도 또한 명명되는 광 감각으로 지칭될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, "시력"이라는 용어는 자극으로서 광을 유용하게 감지하는 유기체의 능력인 것으로 정의된다. "시력"은 하기: (i) 광 감지 또는 지각, 즉, 광의 존재 여부를 식별할 수 있는 능력; (ii) 광 투사 식별능, 즉, 광 자극이 오는 방향을 식별할 수 있는 능력; (iii) 해상능, 즉, 격자 또는 문자 표적에서 상이한 휘도 수준 (즉, 콘트라스트)을 감지할 수 있는 능력; 및 (iv) 인식, 즉, 표적 내의 상이한 콘트라스트 수준을 참조로 하여 시각적 표적의 형상을 인식할 수 있는 능력을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, "시력"은 단순히 광, 바람직하게, 적색광, 더욱 바람직하게, 약 365 nm 내지 약 700 nm, 약 530 nm 내지 약 640 nm 파장을 가지는 광의 존재를 감지할 수 있는 능력을 포함하고, 일부 실시양태에서, 최고 활성화는 약 590 nm 파장을 가지는 광과의 접촉 시에 발생할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "기능적 유도체"는 본 용어가 접속형으로 사용되든, 대안형으로 사용되든, 그와는 상관없이 "돌연변이체," "변이체" 및 "단편"을 포함한다. 예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개의 잔기의 보존적 치환 또한 의도되기는 하지만, 바람직한 변이체는 단일 아미노산 보존적 치환 변이체이다. 일부 실시양태에서, 기능적 유도체는 원래 폴리펩티드의 전장의 아미노산 서열과 적어도 70%의 상동성, 바람직하게, 적어도 75%, 더욱 바람직하게, 적어도 80%의 상동성, 더욱 바람직하게, 적어도 85%의 상동성, 더욱 바람직하게, 적어도 90%의 상동성, 더욱 바람직하게, 적어도 95%의 상동성, 더욱 바람직하게, 적어도 99%의 상동성, 더욱 바람직하게, 100%의 상동성을 가진다. 퍼센트 상동성은 관련 아미노산 서열의 길이와 관련하여 측정된다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩티드가 더욱 큰 폴리펩티드 내에 포함되는 경우, 퍼센트 상동성은 더욱 큰 폴리펩티드 전체에 대해 상대적인 퍼센트 상동성이 아니라, 오직 본 발명의 폴리펩티드의 상응하는 상기 폴리펩티드 일부분에 대해서만 그와 관련하여 측정된다. 폴리펩티드 서열에 관한 "퍼센트 상동성"은 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool: BLAST) 엔진을 사용하여 정렬된 적어도 두 폴리펩티드 서열 사이의 동일한 아미노산의 백분율을 지칭한다. 문헌 [Tatusova et al. (1999), 상기 문헌 동일]을 참조한다. BLAST 엔진은 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information (NCBI)): 메릴랜드주 베데스다)에 의해 공중에게 제공된다. 구체적인 실시양태에 따라, 기능적 유도체는 원래의 폴리펩티드의 전장의 서열과 적어도 70%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 이는 오직 하나 이상의 위치(들)에서의 치환에 의해 그의 모체 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드이다. 상기 치환은 바람직하게, ≪ 보존적 치환 ≫ 또는 ≪ 반 보존적 ≫인 것이다. 추가로, 또는 대안적으로, 기능적 유도체는 원래의 폴리펩티드의 전장의 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성, 바람직하게, 적어도 75%의 동일성, 더욱 바람직하게, 적어도 80%의 동일성, 더욱 바람직하게, 적어도 85%의 동일성, 더욱 바람직하게, 적어도 90%의 동일성, 더욱 바람직하게, 적어도 95%의 동일성, 더욱 바람직하게, 적어도 99%의 동일성, 더욱 바람직하게, 100%의 동일성을 가진다. 서열 동일성 또는 상동성을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "보존적 치환"이라는 용어는 일반적으로 단백질 또는 폴리펩티드의 구조 및 기능적 특성을 보존하는 아미노산 치환을 지칭한다. 상기 기능적으로 등가인 (보존적 치환) 펩티드 아미노산 서열은 침묵 변이를 초래함으로써 기능적으로 등가인 유전자 생성물을 생성하는, 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 부가 또는 치환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 보존적 아미노산 치환은 포함된 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성, 및/또는 양쪽성 성질의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어,: 비극성 (소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 세포를 강력하에 탈분극시키는 1회 이상의 광 펄스와의 접촉 시에 활성화될 수 있는 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드의 세포에서의 발현에 관한 것이다. 본원에서는 광 활성화 이온 채널로도 지칭되는, 본 발명의 광 활성화된 채널 폴리펩티드는 특정 세포, 조직, 및/또는 유기체에서 발현될 수 있고, 생체내, 생체외, 및 시험관내에서의 적합한 파장의 광 펄스에 대한 반응에서 세포를 제어하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "이온 채널"이라는 용어는, 활성화되었을 때, 개방되고, 이로써, 막을 가로지르는 포어를 통한 이온 전도도를 허용하는, 포어를 형성하는 막횡단 폴리펩티드를 의미한다.
본 발명에 따라, 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 Chrimson 단백질, 또는 그의 기능적 유도체, 및 형광 단백질을 포함한다.
본 발명에 따라, 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 형광 단백질에 융합된 Chrimson 단백질, 또는 그의 기능적 유도체를 포함한다.
특정 실시양태에 따라, 상기 Chrimson 단백질은 단백질 ChR88 (이는 또한 본원에서 Chrimson88로도 지칭된다 - 서열식별번호(SEQ ID NO): 1) 또는 그의 기능적 유도체, 및 K176R 치환된 Chrimson88 단백질 (이는 또한 본원에서 K176R 치환을 포함하는 Chrimson88 단백질 또는 ChrimsonR로도 지칭된다 - 서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명에 따라, 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 (i) 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체 및 (ii) 형광 단백질을 포함한다.
바람직한 실시양태에 따라, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 (i) 단백질 ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체, 및 (ii) 형광 단백질을 포함한다.
특정 실시양태에 따라, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는, 둘 다가 독립된 단백질로서 발현되는 것인, 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체, 및 형광 단백질로 이루어진다.
또 다른 실시양태에 따라, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는, 둘 다가 독립된 단백질로서 발현되는 것인, 단백질 ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체, 및 형광 단백질로 이루어진다.
바람직한 실시양태에 따라, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 형광 단백질에 융합된 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진다.
더욱 바람직한 실시양태에 따라, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 형광 단백질에 융합된 단백질 ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진다.
본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 적색광, 바람직하게, 약 365 nm 내지 약 700 nm, 약 530 nm 내지 약 640 nm 파장을 가지는 광과의 접촉에 의해 강력하게 활성화되고, 일부 실시양태에서, 최고 활성화는 약 590 nm 파장을 가지는 광과의 접촉 시에 발생할 수 있다.
본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 포함하는 여기가능한 세포와, 활성화 파장 범위의 광을 접촉시키면, 세포는 강력하게 탈분극된다. 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 발현하는 세포를 탈분극시키는데 사용될 수 있는 예시적인 광 파장으로는 적어도 약 365 nm, 385 nm, 405 nm, 425 nm, 445 nm, 465 nm, 485 nm, 505 nm, 525 nm, 545 nm, 565 nm, 585 nm; 590 nm, 605 nm, 625 nm, 645 nm, 665 nm, 685 nm; 및 700 nm (상기 값 사이의 모든 파장 포함)로부터의 파장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 590 nm에서 최고 파장 감수성을 가지고, 최대 660 nm 이하에서 스파이크를 유도할 수 있다.
본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 본 발명의 하나 이상의 광 활성화 이온 채널이 발현되는 여기가능한 세포를 탈분극시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 활성화시키지 않는 파장의 광에 의해 활성화되는 광 활성화 이온 채널을 발현하는 하나 이상의 추가의 세포 서브집단 또한 포함하는 세포 집단 중의 세포의 서브집단에서 발현될 수 있다.
다양한 실시양태에서 사용될 수 있는 펩티드 아미노산 서열은 본원에 기술된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드 (서열식별번호: 1 또는 2, 또는 5) 뿐만 아니라, 기능적으로 등가인 폴리펩티드를 포함한다.
상기 기능적으로 등가인 펩티드 아미노산 서열 (보존적 치환)로는 침묵 변이를 초래함으로써 기능적으로 등가인 폴리펩티드를 생성하는, 본 발명의 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 부가 또는 치환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 아미노산 치환은 포함된 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성, 및/또는 양쪽성 성질의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어,: 비극성 (소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌; 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 대안적으로, 보존적 아미노산 치환은 아미노산의 소수친수 지수에 기초하여 이루어질 수 있다. 각 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특징에 기초하여 소수친수 지수를 배정받았다. 이는 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (- 0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5)이다. 단백질에 상호작용하는 생물학적 기능을 부여하는데 소수친수 아미노산 지수를 사용하는 것은 관련 기술분야에 사용되고 있다 (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982). 특정 경우에서, 특정 아미노산은 소수친수 지수 또는 점수가 유사한 다른 아미노산을 대신하여 치환될 수 있고, 이는 여전히 유사한 생물학적 활성을 유지하는 것으로 공지되어 있다. 소수친수 지수에 기초하여 변이를 제조할 때, 특정 실시양태에서는 소수친수 지수가 +-2 내인 아미노산의 치환이 포함되는 반면, 다른 실시양태에서는, +-1 내인 아미노산 치환이 포함되고, 또 다른 실시양태에서는, +-0.5 내인 아미노산 치환이 포함된다.
대안적으로, 보존적 아미노산 치환은 특히, 그에 의해 생성된 생물학적으로 기능적인 단백질 또는 펩티드가 면역학적 실시양태에서의 사용을 위한 것으로 의도되는 경우에, 친수성에 기초하여 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 그의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이, 그의 면역원성 및 항원성과, 즉, 단백질의 생물학적 특성과 상관관계를 가진다. 하기 친수성 값이 이들 아미노산 잔기에 배정되었다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0+-1); 글루타메이트 (+3.0+-1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5+-1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5) 및 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값에 기초하여 변이를 제조할 때, 특정 실시양태에서는 친수성 값이 +-2 내인 아미노산의 치환이 포함되는 반면, 특정 실시양태에서는, +-1 내인 것이 포함되고, 특정 실시양태에서는, +-0.5 내인 것이 포함된다.
한 바람직한 실시양태에 따라, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 chrimson 폴리펩티드 (예컨대, 단백질 ChR88 또는 그의 기능적 유도체, 또는 단백질 ChrimsonR 또는 그의 기능적 유도체)와 형광 단백질 사이의 융합 단백질이다. 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 펩티드의 말단절단된 버전 또는 돌연변이체 버전이 비관련된 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드에 융합되고, 원하는 펩티드를 코딩하는 본원에 기술된 핵산 및/또는 아미노산 서열에 기초하여 디자인될 수 있는 융합 단백질의 사용. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 발현되는 융합 단백질에 선택적으로 결합하는 항체를 이용함으로써 쉽게 정제될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드의 작용에 필요한 레티날 또는 레티날 유도체는 상기 채널 폴리펩티드로 형질감염되는 세포에 의해 생성된다. 그러나, 본 발명에 따라, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드, 및 레티날 또는 레티날 유도체, 예컨대, 예를 들어, 3,4-데히드로레티날, 13-에틸레티날, 9-dm-레티날, 3-히드록시레티날, 4-히드록시레티날, 나프틸 레티날; 3,7, 11-트리메틸-도데카-2,4,6,8,10-펜타에날; 3,7-디메틸-데카-2,4,6,8-테트라에날; 3,7-디메틸-옥타-2,4,6-트리에날; 뿐만 아니라, 6-7- 또는 8-9- 또는 10-11 회전 차단된 레티날 (WO03084994)을 포함하는 채널로돕신을 추가로 개시한다.
기술된, 원하는 펩티드 아미노산 서열은 화학적으로 합성될 수 있지만 (예컨대, 문헌 ["Proteins: Structures and Molecular Principles" (Creighton, ed., W. H. Freeman & Company, New York, N.Y., 1984)] 참조), 큰 폴리펩티드 서열은 이롭게는 원하는 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 핵산을 발현하기 위한, 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 상기 방법은 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다 (예컨대, 문헌 ["Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 상기 문헌 동일] 및 ["Current Protocols in Molecular Biology", 상기 문헌 동일] 참조). 대안적으로, 원하는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 RNA 및/또는 DNA는 예를 들어, 합성기를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (예컨대, 문헌 ["Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" (Gait, ed., IRL Press, Oxford, United Kingdom, 1984)] 참조).
다양한 실시양태에서 사용될 수 있는 펩티드 아미노산 서열은 본원에 기술된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드 (서열식별번호: 1 또는 2, 5 또는 6) 뿐만 아니라, 기능적으로 등가인 펩티드 및 그의 기능적 유도체, 및 그의 기능적 단편을 포함한다. 실제로, 일부 실시양태에서, 원하는 펩티드 아미노산 서열 모두, 또는 그의 임의의 일부분을 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 사용과 같이, 특정 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 임의의 원하는 펩티드 아미노산 서열이 사용될 수 있다. 유전자 코드의 축퇴성 성질은 널리 공지되어 있고, 따라서, 각각의 광 활성화된 채널 폴리펩티드 아미노산 코딩 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 널리 공지된 핵산 "트리플렛" 코돈으로, 또는 다수의 경우에서는 아미노산을 코딩할 수 있는 코돈으로 표현된다. 따라서, 본원에서 고려되는 바와 같이, 본원에 기술된 채널로돕신 펩티드 아미노산 서열은 유전자 코드와 함께 (예컨대, 문헌 ["Molecular Cell Biology", Table 4-1 at page 109 (Darnell et al., eds., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1986)] 참조) 일반적으로 상기 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 핵산 서열의 모든 다양한 순열 및 조합으로 표현된다.
일부 실시양태는 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 (i) 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체, 및 (ii) 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 (i) 단백질 ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체, 및 (ii) 형광 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다.
한 특정 실시양태에 따라, 뉴클레오티드 서열은 형광 단백질에 융합된 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직한 실시양태에 따라, 뉴클레오티드 서열은 형광 단백질에 융합된 단백질 ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다.
특정의 특별한 실시양태에 따라, 본 발명의 형광 단백질은 tdTomato (tdT) 형광 단백질 및 녹색 형광 단백질 (GFP)로부터 선택된다.
TdTomato는 밝은 적색 형광 단백질 (tdTomato의 여기 피크 554 nm, 방출 파장의 피크 581 nm)이다 (Shaner NC et al., Nat Biotechnol, 22, 1567-1572, 2004). 본 발명에 따른 tdTomato를 코딩하는 게놈 서열은 합성 탠덤-이량체 구축물 적색 형광 단백질, 완전 cds (진뱅크 수탁 번호 AY678269))와 적어도 84%의 동일성을 제시할 수 있다. 바람직한 실시양태에 따라, 본 발명의 코딩된 tdTomato 단백질 모이어티는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열과 동일한 아미노산의 약 70% 내지 약 75%; 또는 더욱 바람직하게, 약 75% 내지 약 80%; 또는 더욱 바람직하게, 약 80% 내지 90%; 또는 더욱더 바람직하게, 약 90% 내지 약 99%를 가지는 폴리펩티드이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 5의 아미노산 서열, 또는 그의 단편과 동일한 아미노산의 약 70% 내지 약 75%; 또는 더욱 바람직하게, 약 75% 내지 약 80%; 또는 더욱 바람직하게, 약 80% 내지 90%; 또는 더욱더 바람직하게, 약 90% 내지 약 99%를 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 핵산은 하나 이상의 신호 서열 (예컨대, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 추가의 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위) 및/또는 프로모터 서열, 또는 다른 코딩 세그먼트, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는 추가 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 유도성 또는 구성적, 일반 또는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 세포 특이적 프로모터의 예로는 양극성 세포에 특이적인 mGlu6-프로모터가 있다. 일부 실시양태는 프로모터가 구성적 프로모터인 개시된 방법 중 임의의 것이다. 일부 실시양태는 구성적 프로모터가 CMV 프로모터 또는 CAG 프로모터 (CAG 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터 (CBA) 및 SV40 인트론 삽입부에 융합된 하이브리드 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 인핸서이다; 문헌 [Alexopoulou et al., BMC Cell Biol. 2008; 9: 2]; 서열식별번호: 8)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 것인, 개시된 방법 중 임의의 것이다. 일부 실시양태는 프로모터가 유도성 및/또는 세포 유형 특이적인 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는 것인, 개시된 방법 중 임의의 것이다. 프로모터, 벡터, 인핸서, 폴리아데닐화 부위의 선택은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 통상적인 디자인 문제이다. 상기 요소는 문헌에 잘 기술되어 있고, 상업적으로 이용가능하다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열 내에 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 일부 또는 변이체, 예컨대, 확인된 것 (예컨대, 서열식별번호: 5)을 포함하는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 세그먼트, 및 재조합 벡터에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 7인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 핵산 세그먼트, 및 재조합 벡터에 관한 것이다.
일부 실시양태는 (ii) 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 함께 (i) 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산이다.
일부 바람직한 실시양태는 서열식별번호: 5의 아미노산 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산이다.
일부 바람직한 실시양태는 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산이다.
일부 실시양태는 (i) 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산이다.
일부 바람직한 실시양태는 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열식별번호: 5의 아미노산 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산이다.
일부 바람직한 실시양태는 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산이다.
일부 바람직한 실시양태는 CAG 이종성 프로모터 (서열식별번호: 8)에 작동가능하게 연결된, 열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산이다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 상기 언급된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 발현 벡터에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바, "핵산 발현 벡터"라는 용어는 해당 핵산 분자가 작동적으로 연결되는 대상이 되는 또 다른 핵산을 상이한 유전적 환경 사이에 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. "벡터"라는 용어는 또한 핵산 분자를 수송할 수 있는 바이러스 또는 유기체를 지칭한다. 한 유형의 벡터는 에피솜, 즉, 염색체외 복제를 가능하게 하는 핵산 분자이다. 일부 유용한 벡터는 자율 복제 및/또는 그가 연결된 핵산의 발현을 가능하게 하는 것이다. 그가 작동적으로 연결되는 대상이 되는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터가 본원에서는 "발현 벡터로" 지칭된다. 발현 벡터 및 그의 사용 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 적합한 발현 벡터 및 그의 사용 방법에 관한 비제한적인 예는 본원에 제공되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 벡터는 유전자 요법에, 더욱 특히, 바이러스 매개 유전자 전달에 적합하다. 유전자 요법에 적합한 바이러스의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스, 폭스바이러스 (예컨대, MVA), 알파바이러스, 헤르페스바이러스가 있다. 그러나, 유전자 요법은 예컨대, 네이키드 DNA, 핵산과 회합된 리포좀 사용과 같은 비-바이러스 방법을 추가로 포함한다. 본 발명의 일부 방법에서 유용한 벡터는 분열 및 비분열 세포로 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 유전적으로 삽입할 수 있고, 생체내, 시헌관내, 또는 생체외 세포인 세포로 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 삽입할 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 광 활성화 이온 채널에 대한 유전자를 포함하는 핵산 발현 벡터는 AAV 바이러스 벡터 중에서 선택된다. 바람직한 실시양태에 따라, 상기 AAV 바이러스 벡터는 AAV2이고, 더욱 바람직하게, AAV2-7m8 바이러스 벡터이다 (WO 2012/145601).
본 발명의 일부 측면은 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 사용하여 세포, 조직, 또는 대상체에서 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명의 치료 방법은 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 투여하여 장애를 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 투여하는 것은 본 발명의 적어도 하나의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드의 유효량을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 투여하는 것은, 본 발명의 광 활성화 이온 채널을 발현하는 세포를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 투여하는 것은, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 벡터 투여로 대상체에서의 세포에서 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 발현된다.
일부 실시양태에서, (a) 표적 세포에, 상기 표적 세포에서 발현가능한 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 발현 벡터를 전달하는 단계로서, 상기 벡터는 프로모터 서열에 작동적으로 연결된, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임, 및 임의적으로 전사 조절 서열을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 상기 표적 세포에서 상기 벡터를 발현하는 단계로서,여기서 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 광에의 노출 시 상기 표적 세포를 활성화시키는 것인 단계를 포함하는, 뉴런 매개 장애를 치료 또는 예방하는 방법이다.
일부 실시양태에서, 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 형광 단백질에 융합된, 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진다.
바람직한 실시양태에 따라, 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 형광 단백질에 융합된, ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진다.
바람직한 실시양태에서, 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 tdTomato (tdT) 형광 단백질 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)로 이루어진 군에서 선택되는 형광 단백질에 융합된, 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진다.
바람직한 실시양태에 따라, 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 tdTomato (tdT) 형광 단백질 (서열식별번호: 3) 또는 녹색 형광 단백질 (GFP) (서열식별번호: 4)로 이루어진 군에서 선택되는 형광 단백질에 융합된, ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진다.
본원에서 사용되는 바, 및 달리 명시되지 않는 한, 본 방법 및 조성물이 사용될 수 있는 뉴런 매개 장애라는 용어는 그 중에서도 특히 뉴런 기능 장애, 뇌, 중추 신경계, 말초 신경계 장애, 신경계 병태, 기억 장애 및 학습 장애, 심장 부정맥, 파킨슨병, 안구 장애, 귀 장애, 척수 손상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 및 달리 명시되지 않는 한, 하나 이상의 시력 파라미터를 개선시키는데 본 방법 및 조성물이 사용될 수 있는 안구 장애라는 용어는 눈의 전안부 및 후안부, 둘 다를 이환시키는 발달 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전안부 장애로는 녹내장, 백내장, 각막 이영양증, 원추각막을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 후안부 장애로는 광수용체 변성, 기능 장애, 상실 및/또는 장애에 의해 유발되는 눈을 멀게 하는 장애를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 망막 장애로는 색소성 망막염 (RP), 황반 변성 (MD), 선천성 비진행성 야맹증, 연령 관련 황반 변성 및 선천성 추체 이영양증을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에 따른 표적 세포는 여기가능한 세포 또는 비-여기가능한 세포일 수 있다. 상기 표적 세포는 바람직하게, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 발현될 수 있고, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 세포이다. 상기 표적 세포는 원핵 및 진핵 세포를 포함한다. 표적 세포로는 포유동물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 발현될 수 있는 세포의 예로는 여기가능한 세포가 있으며, 이는 전기 신호를 생성하고, 그에 대해 반응할 수 있는 세포를 포함한다.
본 발명에 따른 표적 세포의 비제한적인 예로는 뉴런 세포 (뉴런), 신경계 세포, 심장 세포, 순환계 세포, 시각계 세포, 청각계 세포, 분비 세포 (예컨대, 췌장 세포, 부신 수질 세포, 뇌하수체 세포 등), 내분비 세포, 또는 근육 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명과 함께 사용되는 표적 세포는 질환, 장애 또는 비정상적인 병태를 앓는 것으로 알려져 있지 않은, 건강한 정상적인 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 채널과 함께 사용되는 표적 세포는, 변성 세포, 신경계 질환 보유 세포, 질환 또는 병태의 세포 모델, 손상된 세포 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 비정상적인 세포, 예를 들어, 장애, 질환, 또는 병태를 앓는 것으로 진단받은 세포일 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 세포는 제어 세포일 수 있다.
한 특정 실시양태에 따라, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 배양물로부터의 세포, 용액 중 세포, 대상체로부터 수득된 세포, 및/또는 대상체내 세포 (생체내 세포)에서 발현될 수 있다. 광 활성화 이온 채널은 배양된 세포, 배양된 조직 (예컨대, 뇌 슬라이스 표본 등)에서, 및 살아있는 대상체 등에서 발현되고, 활성화될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 표적 세포는 포유동물 세포이고, 전기적으로 여기가능한 세포이다. 바람직하게, 표적 세포는 광수용체 세포, 망막 간상 세포, 망막 추상 세포, 망막 신경절 세포 (RGC), 무축삭 세포, 양극성 뉴런, 신경절 세포, 나선상 신경절 뉴런 (SGN), 달팽이관 세포핵 뉴런, 다극성 뉴런, 과립 세포, 뉴런, 또는 해마 세포이다.
일부 실시양태는 (a) 표적 망막 뉴런에, 상기 표적 망막 뉴런에서 발현가능한 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 발현 벡터를 전달하는 단계로서, 상기 벡터는 프로모터 서열에 작동적으로 연결된, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임, 및 임의적으로 전사 조절 서열을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 상기 표적 망막 뉴런에서 상기 벡터를 발현하는 단계로서, 여기서 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 상기 망막 뉴런에 감광성을 부여하고, 이로써, 상기 망막 또는 그의 일부에 광 감수성을 회복시키는 것인 단계를 포함하는, 망막에 광 감수성을 회복시키는 방법이다.
한 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 형광 단백질에 융합된 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 것인, 망막에 광 감수성을 회복시키는 방법이다.
한 바람직한 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 형광 단백질에 융합된 ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 것인, 망막에 광 감수성을 회복시키는 방법이다.
한 바람직한 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 tdTomato (tdT) 형광 단백질 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)로 이루어진 군에서 선택되는 형광 단백질에 융합된, 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 것인, 망막에 광 감수성을 회복시키는 방법이다.
한 바람직한 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 tdTomato (tdT) 형광 단백질 (서열식별번호: 3) 또는 녹색 형광 단백질 (GFP) (서열식별번호: 4)로 이루어진 군에서 선택되는 형광 단백질에 융합된, ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 것인, 망막에 광 감수성을 회복시키는 방법이다.
일부 실시양태는 (a) 표적 망막 뉴런에, 상기 표적 망막 뉴런에서 발현가능한 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 발현 벡터를 전달하는 단계로서, 상기 벡터는 프로모터 서열에 작동적으로 연결된, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임, 및 임의적으로 전사 조절 서열을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 상기 표적 망막 뉴런에서 상기 벡터를 발현하는 단계로서, 여기서 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 상기 망막 뉴런에 감광성을 부여하고, 이로써, 상기 망막 또는 그의 일부에 광 감수성을 회복시키는 것인 단계를 포함하는, 대상체 내의 망막 광수용체 세포가 변성 중이거나, 또는 변성되고, 사멸된 것인, 시력 상실 또는 실명으로 고생하는 대상체의 망막에 광 감수성을 회복시키는 방법이다.
일부 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 형광 단백질에 융합된 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 것인, 대상체 내의 망막 광수용체 세포가 변성 중이거나, 또는 변성되고, 사멸된 것인, 시력 상실 또는 실명으로 고생하는 대상체의 망막에 광 감수성을 회복시키는 방법이다.
일부 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 형광 단백질에 융합된 ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 것인, 대상체 내의 망막 광수용체 세포가 변성 중이거나, 또는 변성되고, 사멸된 것인, 시력 상실 또는 실명으로 고생하는 대상체의 망막에 광 감수성을 회복시키는 방법이다.
일부 바람직한 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 tdTomato (tdT) 형광 단백질 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)로 이루어진 군에서 선택되는 형광 단백질에 융합된, 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 것인, 대상체 내의 망막 광수용체 세포가 변성 중이거나, 또는 변성되고, 사멸된 것인, 시력 상실 또는 실명으로 고생하는 대상체의 망막에 광 감수성을 회복시키는 방법이다.
일부 바람직한 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 tdTomato (tdT) 형광 단백질 (서열식별번호: 3) 또는 녹색 형광 단백질 (GFP) (서열식별번호: 4)로 이루어진 군에서 선택되는 형광 단백질에 융합된, ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 것인, 대상체 내의 망막 광수용체 세포가 변성 중이거나, 또는 변성되고, 사멸된 것인, 시력 상실 또는 실명으로 고생하는 대상체의 망막에 광 감수성을 회복시키는 방법이다.
일부 실시양태에서, 상기의 뉴런 장애를 치료하는 방법, 또는 망막에 광 감수성을 회복시키는 방법, 또는 대상체 내의 망막 광수용체 세포가 변성 중이거나, 또는 변성되고, 사멸된 것인, 시력 상실 또는 실명으로 고생하는 대상체의 망막에 광 감수성을 회복시키는 방법에서 표적 뉴런은 망막 뉴런이다.
일부 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 서열식별번호: 5 모두 또는 그의 일부로 이루어진 아미노산 서열, 또는 코딩된 광 활성화된 채널 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유지하는, 그의 생물학적으로 활성인 단편, 또는 서열식별번호: 5의, 또는 상기 단편의 생물학적으로 활성인 보존적 아미노산 치환 변이체를 가지는 것인, 개시된 방법 중 임의의 것이다.
일부 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 서열식별번호: 6인 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인, 개시된 방법 중 임의의 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 신경 회로를 조정하기 위해 비침습적 경두개 및/또는 경경막 자극을 수행하기 위한 원적색광 (660 nm)의 용도이다.
본 발명의 특정 측면의 실행 작업은 여기가능한 세포에서 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 유전적으로 발현하고, 상기 세포에 적합한 파장의 광을 조사하고, 광에 대한 반응으로 나타나는 세포의 신속한 탈분극 뿐만 아니라, 조사 중단 시 탈분극으로부터의 신속한 해제를 보여줌으로써 그에 의해 설명되었다. 특정 구현에 의존하여, 본 발명의 방법을 통해 생체내, 생체외, 및 시험관내에서 세포 기능을 광으로 제어할 수 있다.
본 발명의 방법의 비제한적인 예에서, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드 및 그의 유도체는 어떤 종류의 화학적 보충제도 필요로 하지 않으면서 포유동물 세포에서, 및 정상적인 세포 환경 조건 및 이온 조건에서 사용된다.
본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 어떤 종류의 화학적 보충제도 필요로 하지 않으면서 포유동물 세포에서, 및 정상적인 세포 환경 조건 및 이온 조건에서의 발현 및 사용에 적합한 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 365 nm 내지 700 nm 범위의 파장의 광에서 활성화되고, 530 nm 내지 640 nm 범위의 광으로부터 최적으로 활성화되고, 590 nm 파장에서 최고로 최적으로 활성화되는 것으로 밝혀졌다.
광 활성화 이온 채널 폴리펩티드의, 또는 핵산 발현 벡터의 유효량은 세포, 조직 또는 대상체에서 광 활성화 이온 채널의 수준을 대상체에게 이로운 수준으로까지 증가시키는 양이다. 유효량은 또한 투여가 세포 또는 대상체에게 미치는 생리적 효과, 예컨대, 투여 이후의 증상 감소를 사정함으로써 결정될 수 있다. 다른 검정법도 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이며, 치료에 대한 반응 수준을 측정하는데 이용될 수 있다. 치료량은 예를 들어, 투여되는 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드 또는 핵산 발현 벡터의 양을 증가 또는 감소시킴으로써, 투여되는 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드 또는 핵산 발현 벡터를 포함하고 있는 치료 조성물을 변화시킴으로써, 투여 경로를 변화시킴으로써, 투여 타이밍을 변화시킴으로써, 본 발명의 광 활성화 이온 채널의 활성화 양 및 파라미터를 변화시킴으로써, 및 기타 방식으로 달리할 수 있다. 유효량은 치료되는 특정 병태, 치료되는 대상체의 연령 및 신체 상태; 병태 중증도, 치료 지속기간, (존재할 경우) 공동 요법의 성질, 특정 투여 경로, 및 건강 요원의 지식과 전문 기술 범위 내에 있는 기타 인자에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 유효량은 발현하고자 하는 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 있는 대상체 내의 세포의 위치 및 수에 의존할 수 있다. 유효량은 또한 치료하고자 하는 조직의 위치에 의존할 수 있다. 이들 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 단지 통상의 실험만으로도 처리될 수 있다. (단독으로 또는 다른 치료제와 함께 조합하여) 대상체에서 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드의 수준을 증가시키고/거나, 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드의 활성화 기간 또는 타이밍을 변경시키는 조성물의 최대 용량, 즉, 타당한 의학작 판단에 따라 가장 높은 안전 용량 또는 안전량으로 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 환자는 의학적 이유, 심리적인 이유에서 또는 임의의 실제 다른 이유에서 더 낮은 저용량 또는 내약 용량을 고집할 수 있다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다.
본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드 (예를 들어, tdT 또는 GFP에 융합된 ChR88, 또는 ChrimsonR, 또는 그의 유도체)는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 대상체에게 투여되고, 특정 실시양태에서, 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 대상체에게 투여된다. 투여 방식 및 투여량은 특별히 임의의 합병증이 발생할 경우, 개별 의사 또는 수의사에 의해 조정될 수 있다. 절대 투여량은 투여를 위해 선택된 물질, 투여가 단일 용량으로 또는 다회 용량으로 이루어지는지 여부, 및 연령, 신체 상태, 크기, 체중, 및 질환 또는 병태의 병기를 포함하는 개별 대상체 파라미터를 비롯한, 다양한 인자에 의존할 것이다. 상기 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 단지 통상의 실험만으로도 처리될 수 있다.
본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드 또는 핵산 발현 벡터를 전달하는 제약 조성물은 단독으로, 서로 함께 조합하여, 및/또는 대상체에게 투여되는 다른 약물 요법, 또는 다른 치료 요법과 함께 조합하여 투여될 수 있다. 상기 방법에서 사용되는 제약 조성물은 바람직하게 대상체에게로의 투여에 적합한 중량 또는 부피 단위로 치료 화합물을 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드의 수준을 원하는 반응을 일으키는 수준으로 증가시키게 되는 유효량으로 함유한다.
대상체의 세포에서 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드의 수준을 증가시키기 위해 대상체에게 투여되는 제약 조성물의 용량은 상이한 파라미터에 따라, 특히, 사용되는 투여 모드 및 대상체 상태에 따라 선택될 수 있다. 다른 인자로는 원하는 치료 기간을 포함한다. 대상체에서 반응이 적용된 초기 용량에서 불충분한 경우, 더 높은 고용량 (또는 상이하고, 더욱 국재화된 전달 경로에 의해 효과적으로 더 높은 고용량)은 환자 내약성이 허용하는 정도로까지 이용될 수 있다. 대상체에게 투여된 본 발명의 광 활성화 이온 채널의 활성화 양 및 타이밍 (예컨대, 광 파장, 광 접촉 기간 등) 또한 특정 대상체에서의 치료 효능에 기초하여 조정될 수 있다. 대상체에게 투여된 광 활성화 이온 채널에 대한 조사 및 그의 활성화를 위한 파라미터는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 및 과도한 실험은 필요로 하지 않으면서 결정될 수 있다.
대상체의 원하는 세포, 조직 또는 신체 부위에서 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드의 수준을 증가시키기 위해 제약 조성물을 효과적으로 전달하는데 사용될 수 있는 다양한 투여 모드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 본 발명의 상기 조성물 또는 다른 제약 화합물의 투여 방법은 국부, 정맥내, 구강, 공동내, 경막내, 활액내, 협측, 설하, 비내, 경피, 유리체내, 망막하, 피하, 근육내 및 진피내 투여일 수 있다. 본 발명은 본원에 개시된 특정 투여 모드에 의해 제한되지 않는다. 관련 기술분야의 표준 참고문헌 (예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990])이 제약 캐리어 중의 다양한 제약 제제, 및 제제의 전달을 위한 투여 모드 및 제제를 제공한다. 투약량, 투여 스케줄, 투여 부위, 투여 모드 (예컨대, 기관내) 등이 본원에서 제공된 것과 다른, 본 발명의 치료 화합물의 투여에 유용한 다른 프로토콜은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다.
인간 이외의 다른 포유동물에서 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드 수준을 증가시키기 위한 세포 또는 벡터의 투여; 및 예컨대, 검사 목적 또는 수의학적인 치료 목적의, 본 발명의 광 활성화 이온 채널의 투여 및 사용은 상기 기술된 것과 실질적으로 동일한 조건하에서 수행된다. 본 발명은 인간 및 동물, 둘 다에게 적용될 수 있다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 인간용 치료제에서 뿐만 아니라, 축산학 및 수의학에서도 사용되는 것으로 의도된다.
본 발명의 일부 측면에서, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 사용하는 치료 방법은 뉴런 세포, 신경계 세포, 뉴런, 심장 세포, 순환계 세포, 시각계 세포, 청각계 세포, 근육 세포, 또는 내분비 세포 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 세포에 적용된다.
본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 장애 및 병태로는 손상, 뇌 손상, 변성 신경계 병태 (예컨대, 파킨슨병, 알츠하이머병, 발작, 시력 상실, 청력 상실 등)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 시각계 장애 치료를 위해, 예를 들어, 시력 감소 또는 상실을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 벡터는 시력이 감소되거나, 또는 시력이 상실된 대상체에게 투여될 수 있고, 발현된 광 활성화 이온 채널은 시각계에서 광 감수성 세포로서 작용함으로써 대상체에서 시각 기능이 획득될 수 있도록 할 수 있다.
개시된 방법 및 조성물의 임상적 적용으로는 (제한하는 것은 아니지만) 예컨대: 연령 의존성 황반 변성, 당뇨 망막병증, 및 색소성 망막염 뿐만 아니라, 광수용체 세포 상실을 초래하는 다른 병태의 안구 장애 유전자 요법 치료를 위해 망막에서 후방 수용체 뉴런에의 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드 도입에 의한 시력 회복; 전기 심박 조율기 장치보다는 심장 박동 리듬을 조절하기 위해 방실 다발 (His 다발) 중의 여기가능한 심장 근육 세포 내로 도입된 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 사용함으로써 심장 기능을 조절하는 것; 파킨슨병 환자에서의 도파민 관련 운동 기능 장애 회복; 우울증 호전; 척수 손상 후 호흡 회복; 줄기 세포 분화를 비침습적으로 조절하는 것 및 이식된 세포의 조직 및 그물망 기능에의 특이적인 기여를 사정하는 것과 같은 요법에의 광유전학적 접근법을 포함한다.
유사하게, 감각신경성 청력 상실은 청신경 중 하류 표적의 광학적 자극을 통해 치료될 수 있다 (문헌 [Hernandez et al., 2014, J. Clin. Invest, 124(3), 11 14-1129] 또는 [Darrow et al., 2015,Brain Res., 1599, 44-56)] 참조). 특정 실시양태에 따라, 본 발명은 (a) 달팽이관에, 상기 달팽이관에서 발현가능한 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 발현 벡터를 전달하는 단계로서, 상기 벡터는 프로모터 서열에 작동적으로 연결된, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임, 및 임의적으로 전사 조절 서열을 포함하는 것인 단계; (b) 상기 달팽이관에서 상기 벡터를 발현하는 단계로서, 여기서 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드는 상기 달팽이관에 감광성을 부여하는 것인 단계 및 (c) 플래쉬와 함께 달팽이관 임플란트를 사용하는 단계를 포함하는, 광학 달팽이관 달팽이관 임플란트의 사용에 의해 전도성 청력 상실을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 형광 단백질에 융합된 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 것인, 광학 달팽이관 임플란트의 사용에 의해 전도성 청력 상실을 치료하는 방법이다.
일부 바람직한 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 형광 단백질에 융합된 ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 것인, 광학 달팽이관 임플란트의 사용에 의해 전도성 청력 상실을 치료하는 방법이다.
일부 바람직한 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 tdTomato (tdT) 형광 단백질 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)로 이루어진 군에서 선택되는 형광 단백질에 융합된, 단백질 ChR88 (서열식별번호: 1) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 것인, 광학 달팽이관 임플란트의 사용에 의해 전도성 청력 상실을 치료하는 방법이다.
일부 바람직한 실시양태는 발현된 광 활성화 이온 채널 폴리펩티드가 tdTomato (tdT) 형광 단백질 (서열식별번호: 3) 또는 녹색 형광 단백질 (GFP) (서열식별번호: 4)로 이루어진 군에서 선택되는 형광 단백질에 융합된, ChrimsonR (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 것인, 광학 달팽이관 임플란트의 사용에 의해 전도성 청력 상실을 치료하는 방법이다.
일부 측면에서 본 발명은 핵산 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열을 제조하고; 제조된 핵산 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 세포 및 막에서 발현하고; 세포 및/또는 막에 적합한 광을 조사하고, 및 세포의 신속한 탈분극 및/또는 광에 대한 반응으로 나타나는 막 간의 전도도 변화 뿐만 아니라, 조사 중단 시 탈분극으로부터의 신속한 해제를 제시하는 것을 포함한다. 광을 사용하여 막 간의 전압 및 세포 탈분극을 제어가능한 방식으로 변경시킬 수 있는 능력이 입증되었다. 본 발명을 통해 생체내, 생체외, 및 시험관내에서 세포 기능을 광으로 제어할 수 있고, 본 발명의 광 활성화 이온 채널 및 그의 용도는 약물 스크리닝, 치료, 및 연구 응용을 위해 광범위하게 적용되고, 그 중 일부는 본원에 기술되어 있다.
본 발명의 예시적인 구현에서, 세포 기능을 광학적으로 교란시키거나, 변형시키거나, 또는 조절할 수 있는 능력은 물리적인 조작 기전에 비하여 많은 이점을 제공한다. 이러한 이점은 속도, 비침습성, 및 나노스케일에서부터 마크로스케일까지 방대한 공간 스케일을 쉽게 포괄할 수 있는 능력을 포함한다.
본 발명에서 사용된 시약 (및 그를 대표하는 분자 부류)은 적어도 전류가 이전 광 활성화 이온 채널에서는 유용하지 않은 광 파장, 활성화되었을 때, 효과적으로 0 칼슘 전도도를 허용하는 광 활성화 이온 채널, 및 (다색 방식의 세포 제어를 가능하게 한) 기존 분자와 상이한 스펙트럼에 의해 활성화될 수 있게 한다.
하기 실시예 섹션은 다양한 실시양태의 예에 관한 추가 설명을 제공한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하기 실시예에 개시된 기술이 본 발명자들에 의해 잘 작동하는 것으로 밝혀진 기술 및/또는 조성물을 나타낸다는 것을 이해하여야 한다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용에 비추어, 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 다수의 변형이 개시된 구체적인 실시양태에서 진행될 수 있고, 이는 여전히 비슷하거나, 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 실시예는 본원에 기술된 방법 및 시스템을 예시하는 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 상기 것의 비제한적인 예로는 하기에 제공되는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1: rd1 및 P23H 변성 설치류 모델에서의 입증
망막 이영양증은 시각 정보의 흐름을 손상시켜, 결국에는 중증의 시력 상실 및 실명에 이르게 하는 망막 세포의 기능 장애 및 변성과 연관이 있다. 색소성 망막염 (RP)은 망막 이영양증 중 가장 일반적인 유형이고, 전세계 4,000명 중 1명에서의 시력 상실의 원인이 된다. RP은 상염색체 우성 (사례 중 30%-40%), 상염색체 열성 (50%-60%), 또는 X-연관 (5%-15%)으로 유전되는 60개 초과의 유전자들 중 임의의 것의 변경으로부터 발생하게 된다.
가장 일반적인 형태의 RP에서, 간상 광수용체가 먼저 변성되고, 이어서, 추체가 변성된다. 따라서, RP의 1차 증상은 일반적으로 야맹증 및 주변 시야 상실이고, 이는 터널 시야로 이어진다. RP의 모든 병태는 진행성이고, 시력 악화 패턴은 환자들마다 다르지만, 그러나 최종 결과는 실명이다. RP에 대한 치료법은 없다.
RP는 여러 유전자에서의 다중 유형의 돌연변이로부터 발생하고, 상당 비율의 RP는 우성이고, 상기 질환은 시간 경로는 고도로 가변적이기 때문에, 망막 광유전학적 치료 접근법은 잠재적으로 관심 대상이 된다. 이와 관련하여, 망막 신경절 세포 (RGC)는 하기 이유: 1) RGC는 그의 축색 돌기가 직접 돌출되어 있고, 시작 정보를 시각 피질 센터로 전달하는 발화 세포이고, 2) RGC는 심지어 진행성 망막 변성을 앓는 RP 환자의 황반 부위에서도 그대로 보존되었고, 3) 망막 신경 섬유 층 두께는 RP 환자에서 감소, 증가 또는 정상이고, 4) RGC 광유전학적 요법에 대한 임상적 기준이 OCT 및 스캐닝 레이저 편광측정법을 사용하여 쉽게 사정될 수 있다는 이유에서 관심을 끄는 표적이 되는 것으로 보인다. 망막 조직을 유사하게 변경시키는 광수용체 변성이 더욱 복합적인 망막 질환, 예컨대, 연령 관련 황반 변성에서 발생하고 있다.
채널로돕신-2를 사용하는 RGC의 광유전학적 요법은 RP를 앓는 설치류 모델 및 정상인 원숭이에서 광 유도성 망막 전기적 활성, 시각 유발 전위 및 시각 기능을 제공하는 것으로 입증되었다. 추가로, RGC가 유리체-망막 표면에 아주 가까이 있기 때문에, 이는 유리체내 주사에 의해 AAV로 쉽게 감염될 수 있고, 이는 외과적 관점에서 볼 때, 주된 이점이 된다.
망막 신경절 세포에서의 채널로돕신2의 이소성 발현이 시각 장애가 있는 rd1 마우스에서 시력을 회복시킨 것으로 제시되었고, 청색 파장 범위에서의 높은 여기 임계치가 요구되는 바, 그에 의해 광독성에 관한 우려가 제기되었다.
본 연구에서, 방사선 안전 한계가 적색광 범위에서 훨씬 더 높기 때문에, 본 발명자들은 적색 이동 옵신인 ChrimsonR (ChrR)의 사용에 대해 조사하였다. ChrimsonR은 클라미도모나스 녹티가마(Chlamydomonas noctigama)로부터 단리된, Chrimson 또는 Chrimson 88로도 명명되는, 미생물 옵신 CnChR1의 증진된 형태이다 (Klapoetke et al., 2014, 상기 문헌 동일). Chrimson 여기 스펙트럼은 이전 채널로돕신과 비교하여 45 nm만큼 적색 이동되어 있다. ChrimsonR은 유사한 여기 스펙트럼을 보이지만, tetaoff 값은 더 우수한 (15.8 ms 대 21.4 ms), Chrimson의 K176R 돌연변이체이다. 본 발명자들은 두 변성 모델: 시각 장애가 있는 rd1 마우스 및 시각 장애가 있는 P23H 래트에서 시력을 회복시키기 위한 ChrR의 용도에 관하여 조사하였다.
본 연구 동안, 본 발명자들은 ChrR 및 구축물 ChrimsonR-tdTomato (ChrR-tdT)의 기능적 효능을 추가로 비교하였다.
방법 (도 1):
유전자 전달
마우스 실험을 위해 사용된 바이러스 배치:
Figure 112018119338435-pct00001
GS030_NC_PHAR_007 연구를 위한 바이러스 현탁액은 멸균 2-ml 에펜도르프 튜브(Eppendorf) 중 PBS + 0.001% 플루로닉(Pluronic)® F68에서 제제화된 즉석 무색 투명한 액체였다. 바이러스 현탁액은 스톡 바이러스 현탁액으로부터 PBS + 0.001% 플루로닉® F68로 희석시킴으로써 제조되었다.
사용할 때까지 바이러스 현탁액을 5±3℃에서 보관하였다.
모든 실험은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리와 사용에 관한 가이드(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행하였다. 프로토콜은 지방 동물 윤리 위원회(Local Animal Ethics Committees)의 승인을 받았고, 유럽 연합 의회(European Parliament) 지시 문서(Directive) 2010/63/EU에 따라 수행하였다.
4주령된 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 유리체내 주사를 양측으로 수행하였다. 간략하면, 트로픽아미드를 사용하여 동공을 확장시키고, 각막윤부 근처에서 바늘을 사용하여 공막을 천공시켰다. 이어서, 해밀턴(Hamilton) 시린지를 사용하여 둔단 주사기를 통해 2 μl를 눈으로 전달하였다.
마우스 주사 및 동물 배정에 관한 세부 사항:
Figure 112018119338435-pct00002
망막 표본
마우스를 AAV 주사 후 ~5주째 (27일 내지 53일, 평균: 38일) 또는 11개월째에 CO2 흡입에 이어서, 경추 탈골에 의해 희생시켰다. 동물의 안구를 단리시키고, 절개하여, 망막은 공막에 부착된 상태 그대로 유지시키면서, 각막 및 수정체는 제거하였다. 이러한 아이 컵(eye cup)을 아메스(Ames) 용액 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미주리주 세인트 루이스))으로 충전된 차광 용기에서 보존시켰다. 이어서, 망막 조각 (전형적으로 망막 절반부)을 단리시키고, 다전극 어레이 기록을 위해 사용하였다.
MEA 기록
생체외 마우스 망막으로부터 다전극 어레이 (MEA) 기록값을 얻었다. 밤새도록 폴리리신 (0.1%, 시그마(Sigma))과 함께 미리 인큐베이션된 셀룰로스 막 상에 망막 단편을 배치시켰다. 일단 미세조작장치 상에서, RGC가 전극 어레이와 마주보게 한 상태에서, 망막 조각을 MEA (MEA256 100/30 iR-ITO; 멀티-채널 시스템즈(Multi-Channel Systems: 독일 로이틀링겐))에로 가볍게 가압하였다. ChR-tdT 구축물의 경우, MEA 시스템 상에서 상이한 광 자극을 전달하는데 사용된 니콘 이클립스 Ti(Nikon Eclipse Ti) 도립 현미경 (니콘(Nikon: 독일 뒤셀도르프)) 상에서 기록하기 전에, 전극 어레이 상의 망막 조각 중의 tdTomato의 형광을 체크하였다. 실험 동안 1-2 ml/분 속도로 34℃에서 95% O2 및 5% CO2로 버블링된 아메스 용액 (시그마-알드리치: 미주리주 세인트 루이스)을 망막에 연속하여 관류시켰다. 선택적 III 군 대사향성 글루타메이트 수용체 작용제인 L-(+)-2-아미노-4-포스포노부티르산 (L-AP4, 50 μM, 토크리스 바이오사이언스(Tocris Bioscience: 영국 브리스톨))을 새로 희석시키고, 기록 10분 전에 관류 시스템을 통해 배쓰에 적용시켰다. STG2008 자극 발생기 (MCS)에 의해 구동되는, 600 nm (+/- 15 nm)로 설정된 폴리크롬 V(Polychrome V) 모노크로메이터 (올림푸스(Olympus: 독일 함부르크))를 사용하여 전영역 광 자극을 적용시켰다. 출력된 광 강도를 1.37 x 1014 내지 6.78 x 1016개의 광자.cm2.sec-1 범위로 보정하였다. 각각의 광 강도에 대하여, 각 자극 사이에 5초의 간격을 두면서, 2 s 플래쉬를 10회 반복하여 제공한다. 본 발명자들은 또한 폴리크롬 (최대 광 강도, 6.78 x 1016개의 광자.cm2.sec-1)을 사용하여, 또는 600 +/-20 nm 유색 필터와 커플링된 디지털 마이크로미러 디스플레이 DMD, 비아룩스(Vialux), 해상도 1024x768) 상에 투사하는 형광 현미경 (X-사이트(X-cite), 루멘 다이나믹스(Dynamics))의 광원을 사용하여 가변 지속기간의 자극에 대한 반응을 기록하였다. 보정은 망막 수준에서 2 x 1017개의 광자.cm2.sec-1인 광 강도를 나타내었다. 평균 스파이크 밀도 함수 (20 msec 가우스 표준 편차)를 사용하여 자극 반복 간의 단일 전극 활성의 평균값을 구하였다. 이어서, 각각의 단일 망막에 대한 반응성 전극의 평균값을 구하였다.
면역조직화학법 및 영상화
조직을 4% 파라포름알데히드 중 실온에서 30분 동안 고정시켰다. PBS, 소 혈청 알부민 (5%), 트리톤 (0.5%) 및 트윈 (0.25%)으로 이루어진 용액 중 실온에서 1시간 동안 포화 및 투과화를 수행하였다. 희석된 포화 용액 (BSA 2.5%, 트리톤 0.25%, 트윈 0.125%) 중 4℃에서 밤새도록 1차 항체: 1/200 tdTomato와 함께 인큐베이션시켰다. PBS 중에서 4회에 걸쳐 20분 동안 세척한 후, 조직을 실온에서 1 h 동안 2차 항체와 인큐베이션시켰다. PBS로 5회 더 세척한 후, 조직을 벡타쉴드(vectashield)에 탑재시키고, 20X 및 63X 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경 (올림푸스: 일본 도쿄)을 사용하여 영상화하였다.
결과
형질감염된 세포의 국재화
ChrR-tdT 주사 5주 경과 후, 광유전학적 단백질, ChR의 발현은 tdTomato 형광 덕분에 쉽게 육안으로 관찰할 수 있었다. 그의 발현은 신경절 세포 층 뿐만 아니라, 시신경 원판에 존재하는 큰 혈관을 따라 집중되어 있는 것으로 나타났다 (도 2a 참조).
MEA 기록
세포 완전성에는 영향을 미치지 않으면서, 집단 수준에서 ChrR 및 ChrR-tdT의 효능을 사정하기 위해, 본 발명자들은 형질감염된 RGC를 다전극 어레이 시스템을 사용하여 기록하였다 (도 2b). 형광성 리포터, tdTomato를 포함하는 구축물에 대한 기록의 성공률이 편향되는 것을 막기 위해, 전극 어레이 상에 망막 조각을 배치시킨 후에 조직 형광을 조사하였다 (도 2b). 추가로, 글루타메이트 신호전달을 차단함으로써 잔류 광수용체 (Farber et al., 1994)로부터 기원하는 잠재적인 광 반응을 확실하게 억제시켰다 (방법 섹션 참조).
상이한 두 조건에 대해, 동물을 한쪽 눈 또는 양쪽 눈에 대해 시험하였다. 충분한 수의 전극이 자발적 RGC 활성을 제시하였을 때, 기록값이 입증되었다 (도 3a). 상기 활성 전극의 수는 237 내지 101개 범위이다. 다수의 전극으로부터 자발적 활성을 기록할 수 있는 능력이 1) 건강한 망막 및 RGC, 및 2) 전극과 망막 조직과의 적절한 접촉인, 탁월한 실험 조직 조건의 특징이다. 이어서, 미생물 옵신인 ChrR을 활성화시키기 위해 높은 광 강도에서 시각 자극을 발생시켰다. ChrR-tdT 주사를 맞은 7개의 눈 중 6개에서, 및 ChrR 구축물 주사를 맞은 6개의 눈 중 4개에서, 광 유도성 반응이 기록될 수 있다 (도 3a-b). 반응 망막에서, 광 자극 시 전기적 활성을 기록하는 활성 전극의 백분율을 측정하였다. ChrR-tdT 및 ChrR 구축물에 대한 비율은 각각 47% 및 2%에 달하였다 (도 3a). 상기 결과는 rd1 마우스의 RGC를 감광성 세포로 변환시키는데에는 ChrR-tdT가 ChrR 구축물보다 훨씬 더 효과적이라는 것을 제안하는 것이다.
가변 광 강도에 대한 감수성
광 강도를 1.37 x 1014에서 6.78 x 1016개의 광자.cm2.sec-1로 증가시키면서, 600 nm 광 플래쉬를 2초 동안 망막 조직 상에 적용시켰다. 도 2c는 각각 ChrR-tdT 및 ChrR 구축물을 사용하였을 때 기록된 반응이다. 그래프 상의 각 선은 반응성 전극에서 기록된 플롯팅된 활성을 나타내고, 여기서 광 유도성 반응은 적어도 최고 광 강도에 대해 기록되었다.
이들 도면은 ChrR-tdT 구축물 (도 3c)에 의해 발생된 반응이 최고 강도를 포함하는 모든 강도에서 ChrR보다 진폭이 유의적으로 더 컸다는 것을 분명하게 제시한다. 상기 기록은 또한 유도 활성은 대개 일시적이고, 지속되는 진폭과 비교하여 피크 값은 높다는 것을 보여준다. 마지막으로, 첫 번째 뚜렷한 활성은 2.34 x 1015개의 광자.cm2.sec-1에서 나타났으며, 활성화 임계치는 ChrR-tdT 구축물 경우에 더 낮은 것으로 보인다. 광 자극에 기인한 최대 부가된 발화율로서 반응을 측정하였을 때, ChrR 구축물의 경우, 2.34 x 1015개의 광자.cm2.sec-1에서 망막을 발현하는 ChrR-tdT에서의 반응의 더 낮은 임계치 및 8.82 x 1015개의 광자.cm2.sec-1에서의 활성화가 확인된다 (도 3c). 상기 관찰결과는 ChrR 구축물이 주어진 강도에 대하여 ChrR-tdT 구축물에 의해 생성된 것보다 더 높은 강도 임계치로 및 더 낮은 스파이킹 빈도로 광유전학적 반응을 유도하였다는 것을 나타낸다.
파장 감수성
ChrimsonR의 공지된 광 감수성을 확인하기 위해, 그뿐만 아니라, 유발된 활성이 오직 ChrimsonR 활성에만 기인하는 것인지 여부를 입증하기 위해, 본 발명자들은 전 범위의 파장에 걸쳐 광 자극을 수행하였다 (400 내지 650 nm, 도 2c). 공개된 데이터로부터 예측된 바와 같이 (Klapoetke et al., 2014), 피크 발화는 577-598 nm에서 도달하였고, 이는 오직 ChrimsonR 활성화에만 연관된 광 감수성과 일치한다.
발현 프로파일
망막에서의 발현은 망막의 가장 안쪽 층인 신경절 세포 층의 세포로 국한되었다. ChrR-tdT를 발현하는 세포 대부분은 tdTomato에 의해 표지된 그의 축색 돌기에 의해 제시되는 바와 같이, 망막 신경절 세포 (RGC)였다 (도 4a-c). ChrR-tdT를 발현하는 세포를 면밀히 조사한 결과 (도 4d-e), 원형질막에 또는 그에 가까운 위치에 tdTomato 형광이 농축되어 있는 것으로 나타났다. 세포막에서의 상기와 같은 형광 증강은 또한 발현 수준이 비교적 약한 세포에서도 발생하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 ChrR에 대한 폴리클로날 항체를 시험할 수 있는 기회가 있었다 (도 4). ChrR 항체를 표지함으로써 tdTomato 연관 형광이 ChrimsonR 국재화에 대한 우수한 대용물이 된다는 것을 확인할 수 있었다.
바이러스 벡터 주사 (AAV2-7m8-ChrR-tdT) 후 11개월째에 ChrR-tdT를 발현하는 rd1 마우스 망막을 기록하였을 때, RGC는 여전히 tdTomato가 발현된 부위 (도 5a)에서 광 자극에 대한 주요 반응을 일으켰다 (도 5). 비록 더 낮은 진폭 반응에 도달하기는 하였지만, 광 감수성은 발현 1개월 후에 기록된 것과 유사하였다 (도 5c). 상기의 더 낮은 진폭 반응은, 색소성 망막염을 앓는 동물 모델 및 환자에서 보고된, 광수용체 상실 후에 발생한 RGC 변성에 기인하는 것이었다. 마지막으로, 반응 진폭은 주사 후 1개월째에 수득된 관찰 결과와 일치하는 것으로, 20 ms에서 플래토에 도달하였다 (도 5d). 그러므로, 본 결과는 바이러스 벡터 AAV2-7m8-ChrR-tdT가 시각 장애가 있는 rd1 동물에서 ChrR-tdT의 장기간 지속되는 발현을 유도함으로써 RGC의 광 반응을 구동시킬 수 있다는 것을 지시하였다.
광수용체의 상이한 신경변성 모델에서 RGC를 재활성화시키는데 있어서 ChrR-tdT 발현의 잠재성에 대해 추가로 입증하기 위해, 바이러스 벡터 (AAV2.7m8- ssCAG-ChrimsonR-tdTomato)를 또한 P23H 래트에서 유리체내로 주사하였다. MEA 기록은 적용된 광 강도와 관련하여 RGC 반응 진폭면에서 유사한 결과를 제공하였다 (도 6). 이러한 결과를 통해 광수용체 상실 이후에 RGC를 광재활성화시키는데 있어서의 ChrR-TdT에 대한 관심을 확인할 수 있었다.
분석:
본 연구는 2개의 상이한 망막 변성 모델의 시각 장애가 있는 망막에서 망막 신경절 세포의 재활성화를 위한 ChrR의 잠재성을 입증하였다. 본 데이터는 ChrR-TdT가 ChrR보다 훨씬 더 강력하였다는 것을 제안하였다. ChrR-TdT는 안전한 광 수준에서 활성화될 수 있다. 이러한 결과가 비-인간 영장류 망막에서의 ChrR-TdT 발현 및 기능에 관한 추가의 임상전 조사를 위한 기틀이 되었다 (하기 참조).
실시예 2: 방사선 안전 한계 미만에서의 비-인간 영장류에서 망막 신경절 세포 집단의 활성화
상기 연구에서, 본 발명자들은 적색 이동 옵신인 ChrimsonR (ChrR)이 시각 장애가 있는 설치류 (rd1 마우스 및 P23H 래트)에서 망막 신경절 세포 (RGC)의 광 활성화를 유도할 수 있다는 것을 제시하였다. 추가로, 본 발명자들은 형광 단백질 TdTomato에 융합된 연장된 형태의 ChrR이 광에 대해 반응하는 세포의 수 및 그의 반응 진폭 면에 있어서 더욱 큰 기능적 효능을 제공하는 것으로 보였다고 관찰하였다. 설치류와 달리, AAV2는 비-인간 영장류에서 중심와주변 RGC 고리에만 형질도입된다는 것이 잘 확립되어 있다 (Yin et al., 2011). AAV2-7m8은 중심와 고리 너머로 확장되고, 주변 부위에서 발현 섬을 유도한다 (Dalkara et al., 2013). 인간에서도 AAV2 벡터에 의한 유사한 형질도입 패턴이 예상된다.
그러므로, 상기 치료적 개입의 번역상의 잠재성을 추가로 사정하기 위해, 본원에서 본 발명자들은 비-인간 영장류에서 ChrR, 또는 형광 단백질 tdTomato에 융합된 ChrR(ChrR-tdT)의 발현을 구동시키는 AAV 벡터의 유리체내 주사가 충분한 광유전학적 단백질 발현을 일으켜 RGC를 직접적으로 광활성화시킬 수 있는지 여부를 사정하였다.
방법 (도 7 참조):
영장류 망막에의 유전자 전달
사용된 바이러스 배치:
Figure 112018119338435-pct00003
GS030 연구를 위한 바이러스 현탁액은 멸균 2 ml 에펜도르프 튜브 중 PBS + 0.001% 플루로닉® F68에서 제제화된 즉석 무색 투명한 액체였다. 바이러스 현탁액은 스톡 바이러스 현탁액으로부터 PBS + 0.001% 플루로닉® F68로 희석시킴으로써 제조되었다.
사용할 때까지 바이러스 현탁액을 5±3℃에서 보관하였다.
Figure 112018119338435-pct00004
영장류 망막 단리 및 보존
AAV 주사 후 2개월 (+/- 5일) 경과하였을 때, 영장류는 치사량의 펜토바르비탈을 받았다. 안구를 제거하고, 멸균 20-게이지 바늘을 사용하여 눈을 천공시킨 후, CO2 비의존성 배지 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher scientific))와 함께 수송용 실링된 백에 배치시켰다. 이어서, 막을 단리시키고, 기록 전 12 내지 36시간 동안 인큐베이터에서 망막 외식편으로서 보존하였다. 반-중심와 망막 단편을 세포 배양 인큐베이터에서 보존하기 위해 폴리카르보네이트 트랜스웰 (코닝(Corning)) 상에 뉴로베이슬(Neurobasal) + B27 배지 중으로 옮겨 놓았다.
MEA 기록
생체외 반-망막와로부터 다수 전극 어레이 (MEA) 기록값을 얻었다. 밤새도록 폴리리신 (0.1%, 시그마)과 함께 미리 인큐베이션된 셀룰로스 막 상에 상기 망막 단편을 배치시켰다. 일단 미세조작장치 상에서, 망막 신경절 세포가 전극과 마주보게 한 상태에서, 망막 조각을 MEA (MEA256 100/30 iR-ITO; 멀티-채널 시스템즈: 독일 로이틀링겐)에로 가볍게 가압하였다. MEA 시스템하에 탑재된 니콘 이클립스 Ti 도립 현미경 (니콘: 독일 뒤셀도르프)으로 기록하기 전에, 이용가능할 경우, tdTomato 형광을 체크하였다. 실험 동안 1-2 ml/분 속도로 34℃에서 95% O2 및 5% CO2로 버블링된 아메스 용액 (시그마-알드리치: 미주리주 세인트 루이스)을 망막에 연속하여 관류시켰다. AMPA/카이네이트 글루타메이트 수용체 길항제, 6-시아노-7-니트로퀴녹살린-2,3-디온 (CNQX, 25 μM, 시그마-알드리치), NMDA 글루타메이트 수용체 길항제, [3H]3-(2-카르복시피페라진-4-일)프로필-1-포스폰산 (CPP, 10 μM, 시그마-알드리치) 및 선택적 III 군 대사향성 글루타메이트 수용체 길항제인 L-(+)-2-아미노-4-포스포노부티르산 (L-AP4, 50 μM, 토크리스 바이오사이언스: 영국 브리스톨)을 새로 희석시키고, 기록 10분 전에 관류 시스템을 통해 배쓰에 적용시켰다. STG2008 자극 발생기 (MCS)에 의해 구동되는, 폴리크롬 V 모노크로메이터 (올림푸스: 독일 함부르크)를 사용하여 전영역 광 자극을 적용시켰다. 출력된 광 강도를 1.37 x 1014 내지 6.78 x 1016개의 광자.cm2.sec-1 범위로 보정하였다. 각각의 광 강도에 대하여, 10회 반복 사이에 10초의 간격을 두면서, 2초 동안 자극을 적용하였다. 10회에 걸쳐 2초 동안 10 nm 스텝으로 400 내지 650 nm의 10 nm 파장 대역폭의 자극을 적용시킴으로써 광 스펙트럼 감수성을 발생시켰다. 망막의 임의의 적응을 막기 위해 시험된 파장 대역 순서는 무작위화하였다. 반응을 유도시키는데 필요한 최소 시간을 정의하기 위해, 10회에 걸쳐 매 5s마다 반복하면서, 최대 광 강도에서 1 내지 2,000 msec 지속기간을 사용하여 광 자극을 달성하였다.
결과
형질감염된 세포의 국재화
AAV2 벡터의 유리체내 주사 후의 유전자 전달에 관한 이전 연구에서는 형질감염된 세포가 중심와 부위, 특히, 망막 신경절 세포 (RGC)의 중심와주변 고리로 국한된 것으로 제시하였다 (Dalkara et al., 2013). 그러므로, RGC를 기록하기 위해 망막을 절개하였을 때, 특히 상기 부위에 대해 더 크게 주목하여 tdTomato의 발현을 망막에서 조사하였다. MEA 기록을 위해 망막와를 ½씩 둘로 절단하였다. 도 8은 플랫 탑재된 망막 상의 중심와주변 고리 중 tdTomato를 발현하는 세포가 있는 부위를 도시한 것이고, 여기서 검은 색 점은 MEA 기록 시스템의 전극을 나타낸다. 구축물이 tdTomato를 포함하지 않았을 때, 망막을 유사한 방식으로 절개하고, 중심와 부위는 황반 안료의 황색 착색을 사용한 그의 식별에 기초하여 유사한 방식으로 절개하였다.
MEA 기록
세포 완전성에는 영향을 미치지 않으면서, 큰 집단 수준에서 상이한 구축물의 효능을 사정하기 위해, 본 발명자들은 형질감염된 RGC를 다전극 어레이 시스템 (MEA)을 사용하여 기록하였다. 16개의 기록된 NHP 망막 모두에서 본 발명자들은 중심와주변 RGC로부터 자발적 활성을 기록할 수 있었다 (도 8b). RGC 스파이크가 자발적으로 기록된 "활성" 전극의 수는 일관되게 높았고 (평균 152개 전극), 단, 예외적으로, 한 AAV2.7m8-ChrimsonR 실험은 그렇지 않았다 (단지 40개의 활성 전극). 다수의 전극으로부터 자발적 흥분을 기록할 수 있는 능력이 1) 건강한 망막 및 RGC, 및 2) 전극과 망막 조직과의 적절한 접촉인, 탁월한 실험 조직 조건의 특징이다. 광 펄스를 망막 상에 적용시켰을 때, 다수의 전극에서 스파이킹 활성 증가가 측정되었다 (도 8a). 이들 전극은 반응성 전극으로 명명되었다. 놀랍게도, 광 유발 활성을 제시하는 세포에 있어서 망막 간에 큰 차이가 있었다 (도 8b). 실제로, AAV2.7m8-ChrR-TdT 주사를 맞은 망막 모두 (n=4) 반응성 전극을 가진 반면, 다른 군들은 모두 반응성 전극이 없는 망막을 가졌다 (AAV2.7m8-ChrR: 1/4, AAV2-ChrR-TdT: 2/4, AAV2-ChrR: 0/4). 형질감염된 세포를 국재화하는 형광성 마커 TdTomato가 부재하는 경우에도 망막이 전극 어레이 상에 다회에 걸쳐 재배치되었고, 광 반응이 측정되지 않았을 때에도 샘플링 부위를 증가시켰다는 것은 언급할 가치가 있다.
광 감수성
광 반응을 검출하기 위해, 광 강도를 1.37 x 1014에서 6.78 x 1016개의 광자.cm2.sec-1로 증가시키면서, 600 nm에서 2초 동안 망막 조직 상에 광 플래쉬를 적용시켰다. 도 9a는 AAV2.7m8-ChrR-tdT 주사를 맞은 눈으로부터의 RGC에서의 상이한 광 강도에 대한 반응을 제시하는 것이다. 이어서, 이러한 광 반응을 스파이크 속도로 나타내었고, 여기서 빈 너비는 50 msec였다 (도 9c). 이들 반응은 강하게 지속되는 구성 부분 뿐만 아니라, 자주 일시적인 구성 부분도 나타내었다. 도 9c-e는 증가하는 광 강도하의 상이한 구축물에 대한 MEA 기록된 광 반응을 나타낸 것이다. 상기 가장 우수한 구축물을 포함하는 4개의 상이한 망막 사이에서 일부 변동성이 관찰되기는 하였지만, 광 강도 증가에 따라 반응 진폭이 증가하였다.
AAV2.7m8-ChrR-tdT 구축물의 경우, 모든 망막이 광 감수성이었고, 그뿐만 아니라, 대부분의 망막은 더 높은 반응 진폭을 제시하였다 (도 9c). 추가로, 다른 처리군과 비교 시 RGC는 더욱 큰 광 감수성을 제시하였다 (도 9c-e). 두 망막은 2.34 x 1015개의 광자.cm2.sec-1에서 광 반응의 스파이크 히스토그램을 나타내었다 (도 9c). 시험된 가장 높은 광 강도에서, 일부 전극에서의 스파이킹 빈도는 400 Hz에 가까웠다. 도 9f-g는 다양한 AAV 구축물에 대한 광 강도에 따른 광 반응의 진폭을 제시하는 그래프를 제공하는 것이다. 곡선은 2초 자극 동안의 세포 발화율에서 자발적 발화율을 뺀 차이의 평균값을 나타낸다. 이들 두 그래프는 낮은 광 수준에서의 반응 진폭을 더욱 잘 도시하면서, 전 범위의 전기 반응 강도를 완전히 제시하기 위해 2개의 상이한 Y축 스케일을 사용하여 제시되어 있다. 상이한 구축물을 그의 각각의 반응 진폭에 따라 순위화하였을 때, AAV2.7m8-ChrR-tdT로 형질감염된 3개의 망막이 임의의 다른 형질감염된 망막보다 훨씬 더 큰 감수성을 보였다. 2개의 반응성 AAV2-ChrR-tdT 망막 중 하나는 4번째 위치에 달하였고; 두 번째 반응성 AAV2-ChrR-tdT 망막은 단지 하나의, AAV2.7m8-ChrR을 발현하는 반응성 망막 또는 AAV2.7m8-ChrR-tdT를 발현하는 4번째 망막과 유사한 수준에 있었다. 그러므로, AAV2.7m8- ChrR-tdT는 다수의 반응성이 더 큰 망막에서, 더욱 큰 감수성으로, 및 일반적으로 가장 높은 전기 반응 진폭을 가진, 가장 강력한 구축물인 것으로 보였다.
작용 스펙트럼
상이한 파장에서의 광 유도성 전기 반응을 광유전학적 광 반응을 보인 모든 망막에서 측정하였다. 본 경우에서는 자극 동안 발화율을 정량화함으로써 작용 스펙트럼을 확립시켰다. 개별 세포에 대해 측정된 상이한 작용 스펙트럼의 평균값을 구하였을 때, 본 발명자들은, 그런데, 상기 마우스에 대하여 수득된 것과 꽤 일치하는, 단일 망막의 작용 스펙트럼을 수득하였다. 도 8c는 AAV2.7m8-ChrR-tdT 주사를 맞은 망막의 스펙트럼을 제시하는 것이다. 활성 피크는 ChrimsonR의 감수성의 피크에 도달한다 (575 nm).
가변 지속기간 자극
스파이킹 거동을 유발하는데 필요한 자극 지속기간을 측정하기 위해, 본 발명자들은 높은 광 강도 (광원으로서 DMD 사용, 1.34 x 1018개의 광자.cm2.sec-1)에서 가변 지속기간 (0.2 msec 내지 2,000 msec)의 자극을 적용시켰다. 도 10은 AAV2.7m8-ChrR-tdT 주사를 맞은 한 망막에 대하여 수득된 데이터를 도시한 것이다. 광 반응은 시험된 모든 지속기간에서의 모든 반응성 세포에 대하여 측정된 순간 발화율로서 제시되어 있다. 자극 동안 증가된 발화율에 기초하여 활성 전극을 정의하는데 2초 자극이 사용된다. 이어서, 이들 모든 활성 전극으로부터, 더 짧은 자극에 대한 반응을 분석하여 자극 너머로 및 50 ms 초과로 확장된 윈도우 동안의 스파이킹 빈도 증가를 조사하였다. 도 10a-b에서 알 수 있는 바와 같이, 일부 세포는 0.4 msec만큼 단기간의 자극에 대하여 발화율 증가를 보였다. 반응성 전극의 수 뿐만 아니라, 순간 발화율은 더 긴 장기간의 자극 동안 최대 50 ms까지 연속하여 증가하였다. 더 긴 장기간의 자극의 경우, 반응성 세포의 수에 변함이 없다면, 순간 발화율의 피크는 감소하기 시작한다 (도 10a). 임상 환경에서 가장 우수한 자극 파라미터를 정의하기 위해, 본 발명자들은 2가지 중요한 인자: 주어진 자극 지속기간 동안의 활성 부위의 분율 (도 10c), 및 제1 스파이크까지의 평균 시간 (도 10d)을 사정하였다. 선택된 지속기간은 빠른 역학적 성질 (제1 스파이크까지의 시간)을 가진 충분한 수의 잠재적으로 활성을 띠는 세포에서 활성을 유발할 것으로 기대된다. 순간 발화율의 4개의 상이한 임계치 값 (5 - 20 - 50 - 100 Hz)에 대한 활성 부위의 분율을 정의하였다. 자극 동안 순간 발화율이 간주된 임계치 (자발적 발화율은 감산되었다)보다 더 높다면, 전극은 활성화된 것으로 간주될 것이다. 도 10c는 부가된 발화율이 1 ms 자극 동안 전극 중 60% 초과의 전극에서 5 Hz를 초과하였다는 것을 도시한 것이다. 활성 수준이 100 Hz를 초과하는 전극을 유사한 분율로 (대략 70%) 수득하기 위해, 10 ms의 자극이 필요하다. 본 발명자들은 모든 부위 및 모든 지속기간에 대한, 제1 스파이크까지의 평균 시간을 측정함으로써 분석을 완료하였다. 상기의 특정 분석의 경우, 자발적 활성을 감산하지 않았고, 전혀 유발하지 않거나, 또는 극도로 낮은 부가된 스파이킹 거동을 유발하는 단기간의 지속기간에 대한 정확한 활성화 임계치를 측정하는 것이 매우 어려워졌다. 긴 중앙값 (~200 msec)은 실제로 세포의 낮은 자발적 스파이킹 속도 (~5 Hz)에 상응한다 (0.2-1 ms, 도 10d). 더 긴 자극 지속기간 (4 - 10 msec)의 경우, 제1 스파이크까지의 평균 시간에 대한 중앙값에 플래토에 도달하였다. 이들 데이터는 상기의 특정 광 강도에서 10 ms가 반응성 세포 중 절반을 초과하는 세포에서 높은 활성 속도로 빠른 반응 동역학적 성질을 제공할 것이라는 것을 지시한다. 그러므로, 이들 특징들은 적어도, 망막 신경절 세포의 비디오 속도 활성화와 화합성이고, 이로써, AAV2.7m8-ChrR-tdT는 시각 지각에 적합한 발현을 제공할 것이라는 것을 나타낸다.
분석
3가지 구축물 (AAV2.7m8-ChrR.-tdT, AAV2.7m8-ChrR, 및 AAV2-ChrR-tdT)의 유리체내 주사 이후의 광 비감수성 RGC를 광활성화가능한 세포로 변환시킬 수 있는 능력에 관하여 마카크 원숭이에서 조사하였다.
먼저, 본 발명자들의 데이터는, AAV2의 유리체내 투여 후, 중심와주변 고리 내의 RGC의 특이적인 감염을 제시하는 이전 관찰결과를 재현하였다. 그러나, 및 문헌 [Dalkara et al. (2013)] 상의 내용과 일치하는 방식으로, 감염률은 종래 AAV2에 의한 것보다 AAV2.7m8에 의한 것이 명확하게 더 강력하였다. MEA를 사용하여 유리체내 주사 후 2개월째에 플랫 탑재된 망막에서의 600 nm 광에 대한 RGC의 기능적 반응을 특징화하였다. 결과를 통해, AAV2-7m8-ChrR-tdT가 발현 수준 및 기능적 활성, 둘 다와 관련하여 시험된 4개의 구축물 중 가장 우수한 후보 물질이라는 것이 명백하게 확립되었다. 이와 관련하여, ChrR-tdT를 발현하는 4개의 망막 중 3개는 조사에 대한 반응으로 큰 광전류 및 높은 발화 빈도를 일으켰다. AAV2.7m8-ChrR로 처리된 4개의 망막 중 단지 1개만이 광에 대하여 반응하였고, 이는 tdTomato와 ChrR의 융합이 광유전학적 단백질의 기능을 현저하게 증강시킨다는 것을 지시하는 것이다.
본 연구에서, 본 발명자들은 ChrR-tdT-조작된 RGC의 자극을 유발하기 위해 필요한 광 강도 범위를 확립하였다. 상이한 광 강도에서의 RGC에서 ChrR에 의해 유발된 광전류에 관한 분석은 ChrR 활성화 및 불활성화의 동력학적 성질에 관한 유익한 정보를 제공한다. 10 msec 자극이 빠른 동역학적 성질로 높은 스파이킹 속도를 발생시키면서, 다수의 반응성 세포를 동원하는 것으로 제시되었다. 광유전학적 단백질의 작용 스펙트럼이 확립되었고, 이는 ChrimsonR-tdTomato 구축물의 최대 반응은 약 575 nm 파장에서 이루어졌다는 것을 제시하였다. 종합해 볼 때, 본 결과들을 통해 환자에서 시력을 회복시키기 위한 후보 물질로서 AAV2.7m8-ChrR-tdT를 선택할 수 있다.
실시예 3: 광유전학적 단백질 Chrimson R의 발현 및 국재화에서의 형광 단백질 tdTomato의 역할
비-인간 영장류 및 색소성 망막염이 있는 rd1 마우스에서, AAV2.7m8- CAG-ChrimsonR-tdTomato는 tdTomato가 없는 유사 구축물 (AAV2.7m8-CAG-ChrimsonR)보다 실질적으로 더욱 강력하였다. 따라서, 본 발명자들은 근본적 기전을 이해하는 것을 목표로 하였다. 이를 수행하기 위해, ChrimsonR 단독, 또는 tdTomato와 융합된 ChrimsonR의 발현 및 트래픽킹에 주력하여, HEK293 세포에서 시험관내 연구를 수행하였다.
방법
24 웰 플레이트 중 10% 우태아 혈청으로 보충된 DMEM 배지에 인간 HEK293 세포를 시딩하였다. 전면생장률 10 내지 70% 및 계대수 3 내지 20인 세포를 사용하였다. 형질감염제로서 제트프라임(jetPrime)® (50 μl 완충제 용액 중 0.5 ㎍의 플라스미드 DNA에 혼합된 제트프라임® 1 μl)을 사용하여 pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato, pssAAV-CAG-ChrimsonR 및 pssAAV-CAG-ChrimsonR-GFP 플라스미드의 세포 형질감염을 달성하였다.
RT-PCR에 의해 ChrimsonR, ChrimsonR-tdTomato 및 ChrimsonR-GFP mRNA 발현을 조사하고, 액틴 하우스 키핑 유전자 mRNA 발현도 동시에 진행시켰다. ChrimsonR 단백질 양에 상응하는 형광 세포 수준을 면역화학법에 의해 평가하였다. 진사이트(GenSight)에 속하고, 그에 의해 제공받은 항-ChrimsonR 항체를 1:1,000 희석률로 사용하였다. 면역형광 정량화를 위해 알렉사플루오르(Alexafluor)에 커플링된 2차 항-마우스 항체를 사용하였다.
HEK 293T 세포 배양
HEK 293T (ATCC® CRL-3216™) 세포를 10% FBS (인비트로겐(Invitrogen: 미국 월섬)), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (인비트로겐)으로 보충된 DMEM 배지 (인비트로겐) 중에서 10% 내지 70% 전면생장률로 유지시켰다.
형질감염 및 감염
형질감염제로서 제트프라임을 사용하여 pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato (플라스미드 479), 및 pssAAV-CAG-ChrimsonR (플라스미드 480)을 사용한 세포 형질감염을 수행하였다 (http://www.polyplus-transfection.com/products/jetprime/). 각 웰의 바닥에 유리 커버슬립이 있는 24 웰 플레이트를 제조하였다. 유리 커버슬립을 폴리-D-리신 및 라미닌으로 코팅하였다. HEK 293T 세포를, 상기 24 웰 플레이트에서 형질감염을 수행하기 1일 전에 웰당 100,000개의 세포인 밀도로 플레이팅하였다. 1 μl의 제트프라임을 50 μl의 완충제 용액 중 0.5 ㎍의 플라스미드 DNA 479 또는 480과 혼합하였다. 51.5 μl의 형질감염 믹스를 세포에 첨가하고, 형질감염 후 4-6시간째에 배지를 교체하였다. 이어서, 형질감염 후 24시간째에 분석 이전에 세포를 인큐베이션시켰다.
감염을 위해, 세포를 상기와 같이 제조하였다 (24 웰 플레이트에서 형질감염을 수행하기 1일 전에 웰당 약 100,000개의 세포인 밀도로 플레이팅하였다). 다음날, 한 웰 중의 세포를 트립신으로 처리하고, 카운팅하여 웰당 세포의 정확한 수를 측정함으로써 MOI를 계산하였다. 이어서, 세포를 AAV2-7m8-CAG-ChrimsonR-tdTomato (IDV_로트 768) 또는 AAV2-7m8-CAG-ChrimsonR (IDV_로트 752)을 사용하여 MOI = 500,000으로 감염시켰다. 감염 후 24시간 경과하였을 때, 세포를 4% PFA로 고정시켰다.
RT- qPCR
뉴클레오스핀(Nucleospin)® RNA 키트 (맥세리-나겔(Macherey-Nagel))를 사용하여 세포 용해물로부터 RNA를 추출하였다. 간략하면, 제공된 시약을 사용하여 세포를 용해시키고, 용해물을 여과하여 세포 부스러기를 제거하였다. RNA를 실리카 막에 연결시켰다. 분무화에 의해 및 DNAse 작용에 의해 오염 DNA를 분해시켰다. RNA를 세척하고, RNAse 무함유 물 중에서 용출시켰다. 나노드롭(Nanodrop)을 사용하여 UV 분광법에 의해 RNA 농도 및 순도를 검정하였다. RNA 정질을 사정하기 위해 1 kb 크기 마커의 존재 하에서 1% 아가로스 겔 상에 1 ㎍을 침착시켰다. 이어서, 제2 DNAse: TURBO® DNAse (반응당 2 U의 TURBO DNAse를 첨가한 후, 실온 (RT)에서 20-30분 동안 인큐베이션)로 처리하고, RT-qPCR을 위해 1 ng의 RNA를 사용하였다. 범용 올리고 dT 프라이머를 사용하여 역전사를 수행하였다. ChrimsonR 서열의 부분과 매칭되는 프라이머 (프라이머 액틴 정방향: GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT (서열식별번호: 9), 프라이머 액틴 역방향: CTTCTGCATCCTGTCAGCAA(서열식별번호: 10), 프라이머 ChrimsonR, 정방향: ACACCTACAGGCGAGTGCTT(서열식별번호: 11), 프라이머 ChrimsonR 역방향: TCCGTAAGAAGGGTCACACC (서열식별번호: 12))를 사용하여 특이적 qPCR을 수행하였다. 액틴 코딩 하우스키핑 유전자에 대한 표준화를 수행하였다. 상대적 분석 방법을 사용하였다 (동몰량의 역전사체 혼합물을 사용하여 표준 범위를 제조하고, 1:10 증분으로 순차적으로 희석시켰다). 상기 언급된 프라이머와 혼합하기 전에 표준물의 각 희석 용액을 3중으로 qPCR 플레이트 상에 보냈다. 연속하여 상대적 발현 분석을 수행하였다. (2개의 96 웰 플레이트 상에서) 2회에 걸쳐 RT-qPCR을 반복하였고, 각 형질감염 조건에 대해 3중으로 시험하였다.
면역조직화학법
세포를 PBS로 세정하고, 실온에서 10분 동안 4% PFA로 고정시켰다. 차단 완충제 (1% 트리톤 X-100, 0.5% 트윈 20 및 10% BSA 차단 완충제를 포함하는 PBS)를 실온에서 15분 동안 첨가하였다. 이어서, 세포를 차단 완충제 (10% BSA, 1% 트리톤 X-100, 0.5%, 트윈) 중에서 1:1,000으로 희석된, ChrimsonR에 대한 마우스 폴리클로날 항체 (0.59 mg/mL)와 함께 RT에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회에 걸쳐 PBS 세척을 수행하였다. 이어서, 세포를 알렉사플루오르 488 (A-31571 써모 피셔(Thermo fisher), 당나귀에서 제조, 희석률 1:500)에 커플링된 제2 항-마우스 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 본 실험은 3중으로 3회에 걸쳐 수행되었다.
어레이 스캔 영상화 및 정량화
HEK 293T 세포를 상기 기술된 바와 같이 형질감염 또는 감염시켰다. ChrimsonR에 대한 항체를 상기 기술된 바와 같이 처리된 웰 및 대조군 웰에 적용시켰다. 세포 핵을 훽스트(Hoechst) 핵 염료로 5분 동안 염색한 후, 세척하고, 셀로믹스 어레이 스캔 VTI(Cellomics Array Scan VTI) 상에서 영상화하였다. 하마마츠(Hamamatsu) ORCA-ER 디지털 카메라를 사용하여 10x 줌을 사용하여 원적색 및 청색 채널로부터 영상을 수득하였다. 노출 시간을 측정하기 위해, 표지되거나, 또는 표지되지 않은 웰을 대조군으로서 사용하였다. 일단 획득을 완료하고 나면, 소프트웨어 셀로믹스 뷰(Cellomics View)를 사용하여 영상을 분석하였다. 자동 세포 카운트가 세포의 특이성을 확실히 반영할 수 있도록 하기 위해 각 파라미터 (임계값 설정, 분할, 객체 보더)를 수동으로 설정하였다. 25개의 필드 간의 자동화된 형광 세포 카운트 및 핵 카운트의 평균값을 구하여 각 형질감염 조건에 대한 형광 세포의 백분율을 얻었다. 그래프패드 프리즘(Graphpad prism) 소프트웨어를 사용하여 핵 수 대비 형광 세포 수를 형광 세포의 백분율로서 플롯팅하였다. 실험을 3회에 걸쳐 수행하였고, 각 샘플은 2중으로 나타내었다.
공초점 현미경법
올림푸스 FV1000 레이저-스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 공초점 현미경법을 수행하였다. 여기 및 방출 크로스 토크를 감소시키기 위해 한 라인씩 순차적으로 영상을 획득하였고, 나이퀴스트-샤논(Nyquist-Shannon) 샘플링 법칙에 따라 스텝 크기를 정의하였다. 최종 영상에서 과포화 픽셀을 최소화시킨 노출 설정환경을 사용하였다. 이어서, 각 커버슬립으로부터의 12 비트 영상을 FIJI로 프로세싱하고, Z 투영 기능하에서 최대 강도를 사용하여 Z형 단면을 단일 평면 상에 투영시키고, 마지막으로 8 비트 RGB 색상 모드로 변환시켰다. 실험은 조건당 3중으로 3회에 걸쳐 반복하였다. 각 커버슬립당 적어도 3개의 영상을 획득하였다.
결과
RT- qPCR
RNA를 형질감염된 세포로부터 추출하고, RT-qPCR을 사용하여 정량화하였다 (도 11). 흥미롭게도, 본 발명자들은 ChrimsonR-tdTomato (479)와 비교하여 ChrimsonR (480)로 형질감염된 세포 내에서 더 높은 양의 ChrimsonR mRNA를 검출하였다. ChrimsonR을 코딩하는 플라스미드와 ChrimsonR-tdTomato를 코딩하는 플라스미드 사이의 형질감염이 유사하였다고 가정할 때, 이는 이론상으로는 더 높은 수준의 ChrimsonR 발현을 유도하게 될 것이다. 그러나, 세포 내에 존재하는 mRNA의 양이 직접적으로 단백질 발현 수준을 반영하지는 않는다. 번역후 단계가 전체 단백질 수준 및 세포 내의 단백질 국재화를 정의한다. 그러므로, 다음 실험 세트에서, HEK 세포를 ChrimsonR 또는 ChrimsonR-tdTomato로 형질감염시키고, 단백질 발현을 현미경법에 의해 추적하였다.
도 11은 pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato, pssAAV-CAG-ChrimsonR 및 pssAAV-CAG-ChrimsonR-GFP 플라스미드에 대한 RT-PCR의 원시 데이터를 제시하는 것이다. 액틴 유전자 mRNA 발현은 시험된 구축물과 상관없이 유사하였다. ChrimsonR-tdTomato의 발현은 ChrimsonR 단독 및 ChrimsonR-GFP의 발현보다 약간 더 낮은 것처럼 보인다.
그에 반해, ChrimsonR 단백질의 수준은 pssAAV-CAG-ChrimsonR 플라스미드보다 pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato 및 pssAAV-CAG-ChrimsonR-GFP를 사용하였을 때 더 높았다 (도 12). 도 12a는 각각 pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato, 및 pssAAV-CAG-ChrimsonR로 형질감염된 HEK293 세포의 형광 영상을 제시하는 것이다. 세포 핵은 청색 (DAPI 염색)으로 제시되어 있다.
도 11b에서는 50,000개의 분석된 세포 중에서 ChrimsonR 수준은 ChrimsonR이 tdTomato 또는 GFP에 융합되었을 때에 더 높았다는 것을 제시하고 있다.
도 12는 pssAAV-CAG-ChrimsonR-tdTomato, pssAAV-CAG-ChrimsonR 및 pssAAV-CAG-ChrimsonR-GFP 플라스미드로의 HEK293 세포 형질감염시의, ChrimsonR 단백질의 수준을 제시한 것이다.
어레이 스캔 영상화 및 정량화
ChrimsonR (480) 대 ChrimsonR-tdTomato (479) 플라스미드로 형질감염된 샘플의 항-ChrimsonR 항체 표지 후, 어레이 스캔을 사용하여 (세포 핵 기준으로) 세포의 총 수 뿐만 아니라, 형광 세포를 카운팅하였다. tdTomato에 융합된, 또는 융합되지 않은 ChrimsonR을 발현하는 세포 수 사이의 차이는 유의적이지 않았다 (도 13). 따라서, 상기 카운팅 방법에 따라, 동일한 수의 세포가 형질감염되었고, tdTomato 존재와 상관없이, ChrimsonR을 발현하였다. 그러나, 형광 세포의 백분율이 형광 국재화에 관한 정보를 전달하지 못한다. 막에서 발현된 ChrimsonR만이 오직 광 활성화 시에 막 전위를 변화시킬 수 있기 때문에, 본 발명자들은 이어서, 공초점 현미경법을 사용하여 tdTomato의 존재 및 부재 하에서 ChrimsonR의 세포내 소기관 국재화의 차이를 조사하였다.
공초점 현미경법
물질 및 방법에 기술된 바와 같이, 형질감염된/감염된 세포를 ChrimsonR에 대한 항체로 및 DAPI로 표지하였다. 이어서, 커버슬립을 탑재하고, 공초점 현미경으로 관찰하였다. 동일한 파라미터를 사용하여 획득한 Z-스택을 최대 투영하여 HEK 세포 중 ChrimsonR의 분포에 관한 대표 영상을 수득하였다. 본 발명자들의 데이터는 ChrimsonR 대 ChrimsonR-tdTomato의 세포내 소기관 국재화가 유의적으로 상이하다는 것을 제시한다. ChrimsonR은 소포체인 것으로 보이는 핵 주변 영역에 그대로 남아있다 (도 14 및 15). 한편, ChrimsonR-tdTomato는 핵 주변 영역에 축적되지 않고, 세포 전역에 걸쳐 광범위하게 분포되어 있다 (도 14 및 15). 흥미롭게도, 본 발명자들은 어떤 항-소포체 염색도 수행하지 않았지만, 그러나 HEK 세포에서 ER 마커, 예컨대, KDEL (서열식별번호: 13)을 사용한 염색 패턴은 유사 부위를 표지한 것으로 제시되었다 (Wu et al. Biochem J, 464, 13-22, 2014).
분석
RT-qPCR에 의한 전사 분석 결과, mRNA 수준은 ChrimsonR-tdTomato 발현 플라스미드 (479)와 비교하여, ChrimsonR 발현 플라스미드 (480)로 형질감염된 세포에서 약간 더 높은 것으로 나타났다. 그러나, tdTomato와 융합된, 또는 융합되지 않은 ChrimsonR 단백질을 발현하는 세포의 백분율은 형질감염 후 유사하였다. 광유전자의 세포내 소기관 국재화에 관한 공초점 현미경 관찰결과는 ChrimsonR 단독과 비교하여 ChrimsonR-tdTomato가 상이한 세포 분포 패턴을 가진 것으로 제시하였다. ChrimsonR-tdTomato는 세포 내에 광범위하게 분포한 반면, ChrimsonR 단독은 본질적으로 소포체 (ER)에 축적되었으며, 이는 그의 ER로부터의 방출, 및 이어서, 막 내로의 삽입에서의 변경을 통해 나타날 수 있다. ChrimsonR은 매우 불용성인 단백질인 반면, tdTomato는 크고, 가용성인 단백질이다 (Shaner et al., Nat Methods, 2, 905-909, 2005). 따라서, 상기 데이터는 tdTomato가 실제로 광유전학적 단백질의 증강된 가용성을 개선시킬 수 있고, ChrimsonR의 C-말단 단부에 융합 단백질로서 포함되었을 때에는 ER로부터의 ChrimsonR의 방출을 촉진시킬 수 있다는 것을 제안한다.
하기 서열이 본 개시내용에서 개시된다:
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SEQUENCE LISTING <110> GENSIGHT BIOLOGICS SA UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE (PARIS 6) CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE <120> OPTOGENETIC VISUAL RESTORATION USING CHRIMSON <130> 12295.0006-00304 <140> <141> <150> 62/329,692 <151> 2016-04-29 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Met Ala Glu Leu Ile Ser Ser Ala Thr Arg Ser Leu Phe Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Ile Asn Pro Trp Pro Asn Pro Tyr His His Glu Asp Met Gly Cys 20 25 30 Gly Gly Met Thr Pro Thr Gly Glu Cys Phe Ser Thr Glu Trp Trp Cys 35 40 45 Asp Pro Ser Tyr Gly Leu Ser Asp Ala Gly Tyr Gly Tyr Cys Phe Val 50 55 60 Glu Ala Thr Gly Gly Tyr Leu Val Val Gly Val Glu Lys Lys Gln Ala 65 70 75 80 Trp Leu His Ser Arg Gly Thr Pro Gly Glu Lys Ile Gly Ala Gln Val 85 90 95 Cys Gln Trp Ile Ala Phe Ser Ile Ala Ile Ala Leu Leu Thr 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Arg Met Val Val Lys Leu 245 250 255 Met Ala Tyr Ala Tyr Phe Ala Ser Trp Gly Ser Tyr Pro Ile Leu Trp 260 265 270 Ala Val Gly Pro Glu Gly Leu Leu Lys Leu Ser Pro Tyr Ala Asn Ser 275 280 285 Ile Gly His Ser Ile Cys Asp Ile Ile Ala Lys Glu Phe Trp Thr Phe 290 295 300 Leu Ala His His Leu Arg Ile Lys Ile His Glu His Ile Leu Ile His 305 310 315 320 Gly Asp Ile Arg Lys Thr Thr Lys Met Glu Ile Gly Gly Glu Glu Val 325 330 335 Glu Val Glu Glu Phe Val Glu Glu Glu Asp Glu Asp Thr Val Ala Ala 340 345 350 Pro Val Val Ala Val Ser Lys Gly Glu Glu Val Ile Lys Glu Phe Met 355 360 365 Arg Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu 370 375 380 Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala 385 390 395 400 Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile 405 410 415 Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro 420 425 430 Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys 435 440 445 Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Leu Val Thr Val Thr 450 455 460 Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Met 465 470 475 480 Arg Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr 485 490 495 Met Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val 500 505 510 Leu Lys Gly Glu Ile His Gln Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His 515 520 525 Tyr Leu Val Glu Phe Lys Thr Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln 530 535 540 Leu Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Thr Lys Leu Asp Ile Thr Ser His 545 550 555 560 Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg 565 570 575 His His Leu Phe Leu Gly His Gly Thr Gly Ser Thr Gly Ser Gly Ser 580 585 590 Ser Gly Thr Ala Ser Ser Glu Asp Asn Asn Met Ala Val Ile Lys Glu 595 600 605 Phe Met Arg Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu 610 615 620 Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln 625 630 635 640 Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp 645 650 655 Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys 660 665 670 His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly 675 680 685 Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Leu Val Thr 690 695 700 Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val 705 710 715 720 Lys Met Arg Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys 725 730 735 Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp 740 745 750 Gly Val Leu Lys Gly Glu Ile His Gln Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly 755 760 765 Gly His Tyr Leu Val Glu Phe Lys Thr Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro 770 775 780 Val Gln Leu Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Thr Lys Leu Asp Ile Thr 785 790 795 800 Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu 805 810 815 Gly Arg His His Leu Phe Leu Tyr Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 820 825 830 <210> 6 <211> 2496 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6 atggctgagc tgatcagcag cgccaccaga tctctgtttg 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900 ttttggacct tcctggccca ccacctgagg atcaagatcc acgagcacat cctgatccac 960 ggcgacatcc ggaagaccac caagatggag atcggaggcg aggaggtgga agtggaagag 1020 ttcgtggagg aggaggacga ggacacagtg gcggcaccgg tagtagcagt gagtaagggc 1080 gaggaagtga tcaaagagtt catgcggttt aaggtgagaa tggaaggaag catgaacggc 1140 cacgagttcg aaattgaggg agaaggagag ggacggccct acgagggcac ccagacagcc 1200 aagctgaaag tgacaaaggg cgggcctctg ccattcgctt gggacatcct gagcccacag 1260 tttatgtacg gctccaaggc ctatgtgaaa catccagctg acattcccga ttataagaaa 1320 ctgagcttcc ccgaggggtt taagtgggaa agagtgatga acttcgagga cggaggcctg 1380 gtgactgtga cccaggacag ctccctgcag gatgggaccc tgatctacaa ggtgaaaatg 1440 agagggacaa attttccccc tgatggacct gtgatgcaga agaaaactat gggatgggag 1500 gcctccaccg aaaggctgta tccacgcgac ggggtgctga aaggagaaat ccaccaggct 1560 ctgaagctga aagatggggg acattacctg gtggagttca agacaatcta catggccaag 1620 aaacctgtgc agctgccagg ctactattac gtggacacaa aactggatat cacttcacac 1680 aacgaggact acactattgt ggagcagtat gaacggagcg aggggagaca ccatctgttc 1740 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 7 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtcgtgg tacctctggt cgttacataa 180 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 240 atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 300 tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 360 cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 420 tgggactttc ctacttggca gtacatctac tcgaggccac gttctgcttc actctcccca 480 tctccccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca 540 gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg 600 cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 660 ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 720 agcgggatca gccaccgcgg tggcggccta gagtcgacga ggaactgaaa aaccagaaag 780 ttaactggta agtttagtct ttttgtcttt 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Claims (25)

  1. 안구 장애 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위한, Td-Tomato (TdT) 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 유효량을 발현하는 벡터를 포함하는 조성물이며, 상기 Chrimson 단백질은 Chrimson 88 또는 Chrimson R이고, 벡터는 아데노연관 바이러스 (AAV) 벡터이고, 상기 안구 장애 또는 질병은 녹내장, 백내장, 각막 이영양증; 원추각막; 광수용체 변성, 기능 장애, 상실 또는 사멸에 의해 유발되는 눈을 멀게 하는 장애; 망막 이영양증; 색소성 망막염(RP); 광수용체 기능 상실에 기인한 망막 변성; 황반 변성(MD); 선천성 비진행성 야맹증; 연령 관련 황반 변성; 선천성 추체 이영양증 및 당뇨 망막병증으로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 TdT 단백질에 융합된 Chrimson 단백질은 Chrimson 단백질 단독과 비교 시 광 자극에 대해 반응하는데 있어서 더욱 효과적인 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 망막 신경절 세포 (RGC) 반응의 재활성화를 유도하는 광 자극 수준이 방사선 안전 한계 미만인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, TdT 단백질이 Chrimson 단백질 단독의 발현 수준과 비교 시 주어진 수의 세포에 대해 융합된 Chrimson 단백질의 발현 수준을 증가시키는 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 융합된 Chrimson 단백질의 발현 수준이 Chrimson 단백질의 증강된 가용성, 트래픽킹, 및/또는 단백질 입체구조를 통해 증가되는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, AAV 벡터가 AAV2 벡터 및 AAV2.7m8 벡터로부터 선택되는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, AAV 벡터가 AAV2.7m8 벡터인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 벡터가 CAG 프로모터를 포함하는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 벡터가 유리체내로 주사되는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 TdT 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 유효량이 장기간 발현되는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 TdT 단백질에 융합된 Chrimson 단백질의 발현이 투여 후 적어도 2개월, 또는 투여 후 적어도 11개월 후에도 지속되는 것인 조성물.
  11. 안구 장애 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위한, TdT 단백질에 융합된 하나 이상의 Chrimson 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이며, 상기 Chrimson 단백질은 Chrimson 88 또는 Chrimson R이고, 상기 안구 장애 또는 질병은 녹내장, 백내장, 각막 이영양증; 원추각막; 광수용체 변성, 기능 장애, 상실 또는 사멸에 의해 유발되는 눈을 멀게 하는 장애; 망막 이영양증; 색소성 망막염(RP); 광수용체 기능 상실에 기인한 망막 변성; 황반 변성(MD); 선천성 비진행성 야맹증; 연령 관련 황반 변성; 선천성 추체 이영양증 및 당뇨 망막병증으로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 TdT 단백질에 융합된 Chrimson 단백질은 Chrimson 단백질 단독과 비교 시 광 자극에 대해 반응하는데 있어서 더욱 효과적인 것인 조성물.
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