WO2021132903A1 - 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법 - Google Patents

광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법 Download PDF

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    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering EEG damage in the brain of Alzheimer's disease using an optogenetics technique, and more particularly, to a method for recovering EEG that has been damaged in an Alzheimer's disease brain.
  • optogenetic technique By using optogenetic technique without directly damaging the brain, it selectively absorbs Parvalbumin (PV) or Somatostatin (SST) among the inhibitory neurons that play a pivotal role in EEG generation.
  • PV Parvalbumin
  • SST Somatostatin
  • It relates to a method for recovering EEG damage in an Alzheimer's disease brain using an optogenetic technique, which selectively restores damaged theta and gamma waves in the Alzheimer's disease brain by transmitting a stimulus to control the activity of the corresponding nerve cell.
  • Alzheimer's disease is a representative degenerative brain disease, and it is known that beta-amyloid, a toxic substance, is abnormally deposited in the brain to cause learning and memory deterioration.
  • delta waves (0.1-3 Hz), theta waves (3-12 Hz), alpha waves (8-15 Hz), beta waves (16-30 Hz) and gamma waves due to the activity of various inhibitory neurons (20-120Hz), etc.
  • delta waves (0.1-3 Hz)
  • theta waves (3-12 Hz)
  • alpha waves (8-15 Hz)
  • beta waves (16-30 Hz)
  • gamma waves due to the activity of various inhibitory neurons (20-120Hz), etc.
  • gamma waves due to the activity of various inhibitory neurons (20-120Hz), etc.
  • this electrical stimulation not only contains the risk of inflicting direct damage to the nerve cells, but also reflects the various functions and activity patterns of the inhibitory nerve cells in the actual brain because the target of the stimulation is non-selective in the electrical stimulation technique. Therefore, there is a disadvantage that it is not possible to selectively control the activity.
  • Patent Document 1 discloses the steps of: transfecting a target tissue with a photosensitive channel protein sensitive to light of a specific wavelength; delivering light in a wavelength range to a target tissue through an optical stimulation device; detecting a biosignal at substantially the same time as delivering light to a target tissue; determining a patient treatment status based on the biosignal; It discloses a light stimulation therapy performed as a step of adjusting the transmission of light to a target tissue based on the detected treatment status of the patient, and describes that it is applied to neurological disorders such as dysfunction, dementia, Parkinson's disease, spasticity, and epilepsy.
  • neurological disorders such as dysfunction, dementia, Parkinson's disease, spasticity, and epilepsy.
  • Patent Document 2 recently, a method for treating depression through optogenetic stimulation of the left brain medial prefrontal cortex is disclosed.
  • social interaction according to stress is closely related to the left medial prefrontal cortex, and based on the above results, social interaction can be regulated through photostimulation in the left medial prefrontal cortex. It is described as being useful in the treatment of depression by expressing channelrhodopsin in the prefrontal cortex and providing control information of the interaction (social interaction) using a means of photostimulation.
  • Alzheimer's disease brain by optogenetic activity of SST inhibitory neurons by selectively regulating the activity by expressing photoreceptors only in PV and SST inhibitory neurons, which are inhibitory neurons known to play the most direct role in brain wave generation
  • SST inhibitory neurons which are inhibitory neurons known to play the most direct role in brain wave generation
  • the present invention is an animal model production step in which the CRE gene is expressed in inhibitory neurons,
  • EEG damage recovery in Alzheimer's disease brain using optogenetic technique comprising the step of selectively recovering damaged EEG in Alzheimer's disease brain by delivering photostimulation that responds to each nerve cell designed to the photoreceptor gene through the electrode and optical fiber provide a way
  • the step of quantifying the damage EEG recovery effect may be further performed.
  • the inhibitory neurons are neurons expressing PV or SST, and can selectively restore damaged gamma waves or damaged theta waves by the photostimulation.
  • the photoreceptor it is preferable to use a photoreceptor that responds to light in the wavelength range of 450, 470, 565 and 590 nm.
  • the method of recovering EEG damage in Alzheimer's disease brain using the optogenetic technique of the present invention is different from the conventional EEG treatment technology through electrical stimulation that directly damages nerve cells without using photostimulation to damage nerve cells.
  • EEG recovery in Alzheimer's disease brain is possible through the regulation of nerve cell activity.
  • the method of recovering EEG damage in Alzheimer's disease brain using the optogenetic technique of the present invention uses a viral vector to activate photoreceptors of specific neurons.
  • By using genetic manipulation technology to insert genes it is possible to selectively control the activity of only one type of cell among various inhibitory neurons in the brain.
  • the present invention can induce a neuronal activity pattern similar to that of inhibitory neurons that appears when generating an actual normal brain EEG in the Alzheimer's disease brain, so that the EEG generation mechanism of the normal brain can be induced by using various photostimulation patterns. It can be simulated to treat Alzheimer's disease brain wave damage.
  • FIG. 2 shows a viral vector and Aß injection technique using an optogenetic genetic manipulation technique and a stereotaxic method
  • FIG. 3 is a photograph of Aß expression and SST/PV neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease mice;
  • Figure 4 shows the damage theta wave recovery results in Alzheimer's disease hippocampus through optogenetic SST neuronal activity regulation
  • the present invention uses various photostimulation patterns to induce a neuronal activity pattern similar to that of inhibitory neurons that appears during actual normal brain EEG generation in the Alzheimer's disease brain, thereby mimicking the EEG generation mechanism of a normal brain and Alzheimer's disease. It relates to a method of repairing brain wave damage.
  • the present invention provides a step for producing an animal model in which the CRE gene is expressed in 1) inhibitory neurons,
  • EEG in Alzheimer's disease brain using optogenetic technique comprising the step of selectively recovering damaged EEG in Alzheimer's disease brain by transmitting photostimulation that responds to each nerve cell designed to the photoreceptor gene through the electrode and optical fiber Provides a way to recover from damage.
  • step 1) is the production step of an animal model of Alzheimer's disease, which is the most toxic and soluble substance among Aß peptides mainly used in Alzheimer's disease research.
  • a method of inducing Alzheimer's disease by directly injecting an Aß polymer (oligomer) into the brain or an animal model of Alzheimer's disease previously invented through genetic engineering is used.
  • FIG. 1 shows the Aß polymer synthesis process.
  • the Aß monomer with HFIP (Hexafluoro-2-propanol) as an organic solvent, it is suspended for 5 to 10 minutes to form a monomer, and then, using a vacuum concentrator, the Aß polymer is used. Remove the HFIP from the suspension and film it.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • an Aß suspension is prepared.
  • the Aß suspension to be used in the experiment is treated with artificial cerebrospinal fluid, diluted to 200 nM, and then refrigerated for about 12 hours to synthesize and use a soluble Aß polymer.
  • the Aß polymer synthesized as above is directly injected into the animal brain through stereotactic method to induce Alzheimer's disease.
  • the previously invented Alzheimer's disease animal model of step 1) includes Alzheimer's disease animal models manufactured through genetic manipulation, such as 5xFAD mice, APP/PS1 mice, and the like.
  • step 1) the inhibitory neurons use PV or SST neurons, and the CRE gene is expressed in the specific inhibitory neurons.
  • the CRE is a CRE recombination enzyme, which recognizes DNA of a specific sequence and cuts and splices it.
  • the PV-CRE animal model is an animal model with the CRE gene, and the promoter for expressing PV is in front of the CRE gene.
  • CRE enzyme is expressed only in neurons expressing PV.
  • step 2) prepares a viral vector containing a photoreceptor designed to target the inhibitory neurons expressing the CRE gene, and in the brain of the CRE transgenic animal model of step 1), the photoreceptor This is the step of injecting the viral vector containing the gene.
  • the viral vector refers to an adeno-associated virus having promoters such as EF1a-DIO, CAG-Flex, and Syn-Flex, and targets only specific neurons expressing the CRE gene to deliver photoreceptors.
  • promoters such as EF1a-DIO, CAG-Flex, and Syn-Flex
  • the photoreceptor includes all kinds of photoreceptors that increase the activity of nerve cells expressing the photoreceptor in response to light. Specific examples include ChIEF, which responds maximally to light with a wavelength of 450 nm, channelrhodopsin-2, which responds maximally to light with a wavelength of 470 nm, C1V1, 590 maximally for light with a wavelength of 565 nm. Crimson et al., which respond maximally to light with a wavelength of nm.
  • the photoreceptors in step 2) include all kinds of photoreceptors capable of activating nerve cells in addition to the photoreceptors shown in the above examples.
  • Figure 2 shows the viral vector and Aß injection technology using the optogenetic genetic manipulation technique and the stereotactic method.
  • CRE transgenic animal models more preferably SST-CRE and PV-CRE animal models, which are preferred embodiments of the present invention. If the viral vector encoding the photoreceptor is injected through a micro-injector after setting the location of the brain to be injected using the stereotaxic method, the photoreceptor can be selectively expressed only in SST and PV neurons.
  • the injected viral vector is expressed in specific inhibitory neurons containing the CRE gene to cause genetic modification, and a step of expressing the viral vector for 2 to 3 weeks is performed.
  • step 3) is a step of inserting an electrode and an optical fiber into the animal model injected with the viral vector, and an electrode and optical fiber for EEG measurement and photostimulation delivery in the brain of an animal model of Alzheimer's disease. insert
  • a photoelectrode (electrode + optical fiber) is injected after a hole is made in the skull of an anesthetized animal and the location of the brain where the electrode is to be inserted through the stereotaxic method is set, and then dental cement Cover the surgical site through
  • the present invention comprises a step of selectively recovering brain waves damaged in Alzheimer's disease brain by transmitting photostimulation through the electrode and optical fiber through step 4).
  • Step 4) is a photostimulation step in which light in a wavelength band such as 450, 470, 565 and 590 nm is irradiated to the brain of Alzheimer's disease.
  • a photostimulation step in which light in a wavelength band such as 450, 470, 565 and 590 nm is irradiated to the brain of Alzheimer's disease.
  • photostimulation to suppress specific expression of photoreceptors other than ChIEF, ChR2, C1V1, and Crimson Regulates the activity of sexual neurons.
  • FIG. 3 shows photographs of Aß expression and SST/PV neurons taken from the hippocampus of a mouse with Alzheimer's disease. That is, when photostimulation with a wavelength of 470 nm is given to the hippocampus of SST-CRE or PV-CRE mice injected with Aß and virus, it is possible to selectively activate ChR2-expressing SST/PV neurons in the brain of Alzheimer's disease. can restore damaged theta and gamma waves by irradiating the brain with Alzheimer's disease.
  • the photostimulation varies depending on the type of photoreceptor, and in the case of ChR2, a wavelength of 470 nm is used, and in the case of C1V1, light of a wavelength of 565 nm is used, and is given through a photoelectrode inserted into the brain.
  • FIG. 4 shows the results of recovery of theta waves from damage in the hippocampus of Alzheimer's disease through optogenetic regulation of SST nerve cell activity.
  • the recovery of damaged theta waves is achieved by activating photoreceptor-expressing SST nerve cells through photostimulation.
  • FIG. 5 shows the results of recovery of damaged gamma waves in the hippocampus of Alzheimer's disease through optogenetic PV nerve cell activity regulation, wherein the damaged gamma wave recovery activates photoreceptor-expressed PV nerve cells through photostimulation.
  • the intensity and pattern of photostimulation are provided in a direction to simulate various activity patterns for each type of inhibitory neuron occurring in the normal brain. For example, 470 nm wavelength light is applied as a sine wave pattern in the 5 Hz frequency band to ChR2 expression in the Alzheimer's disease brain.
  • 470 nm wavelength light is applied as a sine wave pattern in the 5 Hz frequency band to ChR2 expression in the Alzheimer's disease brain.
  • the albuminous neurons By irradiating the albuminous neurons, it is possible to simulate the activity pattern of the parvalbumin neurons, which show activity in the gamma wave band in the normal brain, and to restore gamma wave damage in the brain with Alzheimer's disease.
  • the intensity of the photostimulation can be given in proportion to the degree of EEG damage that appears in the Alzheimer's disease brain.
  • the pattern of the photostimulation may be given as a constant and continuous stimulation pattern, a sine wave pattern, a specific frequency pattern, or the like.
  • the method for recovering EEG damage in the Alzheimer's disease brain using the optogenetic technique of the present invention is to quantify the EEG recovery effect by verifying 5) recovery of the damaged EEG after step 4) of recovering the damaged EEG in the Alzheimer's disease brain. More steps may be performed.
  • the recovery of EEG damage in the brain with Alzheimer's disease is determined by band-pass filtering the EEG to the wavelength band to be observed, and then using a power analysis technique using Fast Fourier Transform, etc. can be quantified.
  • the EEG damage recovery method in the Alzheimer's disease brain using the above optogenetic technique is capable of EEG recovery in the Alzheimer's disease brain by controlling the activity of nerve cells without damaging nerve cells using photostimulation.
  • the photoreceptor gene of a specific nerve cell is not selectively applied to electrical stimulation to a large number of non-specific nerve cells in the prior art.
  • a genetic manipulation technique that inserts it is possible to selectively control the activity of only one type of inhibitory neurons in the brain.
  • the present invention is capable of recovering theta wave and gamma wave damage, which are known to be closely related to memory damage in the actual Alzheimer's disease brain.
  • the Aß monomer was treated with HFIP (Hexafluoro-2-propanol) solvent, suspended at a concentration of 1 mM for monomerization, and then HFIP was removed from the Aß suspension using a vacuum concentrator to form a film.
  • the filmed A ⁇ was treated with DMSO and suspended while slowing the aggregation of A ⁇ to prepare a 5 mM A ⁇ suspension.
  • the Aß suspension to be used in the experiment was treated with physiological saline, diluted to 200 nM, and cultured in refrigeration (4° C.) for about 12 hours to synthesize a soluble amyloid beta polymer (Aß oligomer).
  • 3 ⁇ l of the synthesized A ⁇ polymer was injected into the hippocampus CA1 of SST-CRE mice using the stereotaxic method.
  • the Aß polymer was injected using a micro-injector at a rate of 100 nl/min, and the micro-injector was fixed for 3 minutes to spread the Aß well.
  • ChR2 was used among photoreceptors.
  • -p2A-EYFP-WPRE virus (1 ⁇ l) was injected.
  • Virus injection was performed using a micro-injector at a rate of 100 nl/min. After injection, the micro-injector was fixed for 3 minutes so that the virus could spread well, and a recovery period of 3 weeks was maintained thereafter.
  • a photoelectrode was inserted into the anesthetized rat brain through stereotactic method to measure EEG in the hippocampus CA1 of an Alzheimer's mimic rat.
  • the photoelectrode includes an electrode for EEG measurement and an optical fiber for photostimulation delivery, and applies a band-pass filter in the 3-12Hz band to the local field potential measured through the electrode to generate theta wave. was obtained, and the power value and frequency band value of theta wave were obtained through fast Fourier transform.
  • the Aß and virus-injected SST-CRE rat hippocampus was irradiated with a wavelength of 470 nm through a photoelectrode.
  • the photostimulation was continuously delivered for 3 seconds at a constant intensity.
  • SST-inhibitory neurons were activated using optogenetic photostimulation, the theta waves, which were damaged in the hippocampus of mice mimicking Alzheimer's disease, were restored to normal levels [Fig. 4].
  • An amyloid beta polymer (Aß oligomer) was synthesized in the same manner as in Step 1 of Example 1, and 3 ⁇ l of the synthesized Aß polymer was injected into the hippocampus CA1 of PV-CRE mice using a stereotaxic method. At this time, the Aß polymer was injected using a micro-injector at a rate of 100 nl/min, and the micro-injector was fixed for 3 minutes to spread the Aß well.
  • ChR2 among photoreceptors was used.
  • AAV-EF1a-DIO-C1V1(E162T)-TS was used in the hippocampus CA1 of Aß-injected PV-CRE mice.
  • -p2A-EYFP-WPRE virus (1 ⁇ l) was injected.
  • Virus injection was performed using a micro-injector at a rate of 100 nl/min. After injection, the micro-injector was fixed for 3 minutes so that the virus could spread well, and a recovery period of 3 weeks was maintained thereafter.
  • a photoelectrode was inserted into the anesthetized rat brain through the stereotaxic method to measure EEG in the hippocampus CA1 of an Alzheimer's mimic rat, and a band pass in the 20-120Hz band to the local field potential measured through the electrode. -pass) filter was applied to obtain a gamma wave, and the power value and frequency band value of the gamma wave were obtained through fast Fourier transform.
  • the Aß and virus-injected PV-CRE mouse hippocampus were irradiated with a wavelength of 470 nm through a photoelectrode. At this time, the photostimulation was continuously delivered for 3 seconds at a constant intensity. As a result, when PV inhibitory neurons were activated using optogenetic photostimulation, the theta wave, which was damaged in the hippocampus of mice mimicking Alzheimer's disease, was restored to a normal level again [FIG. 5].

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Abstract

본 발명은 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법에 관한 것이다. 본 발명은 알츠하이머 질환 뇌에서 손상되었던 뇌파를 회복시키는 방법으로 전기 자극이 아닌 광자극을 통해 신경세포에 직접적으로 손상을 가하지 않으며, 광유전학(Optogenetics) 기법을 이용하여, 알츠하이머병의 뇌파 손상과 관련된 억제성 신경세포들을 특정한 후, 광유전학적 기법을 통해 손상된 신경세포들을 선택적으로 빛을 이용하여 활성을 조절함으로써 알츠하이머 질환 뇌에서 손상되었던 뇌파를 정상수준으로 회복시킬 수 있다. [대표도] 도 1

Description

광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법
본 발명은 광유전학(Optogenetics) 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 알츠하이머 질환 뇌에서 손상되었던 뇌파를 회복시키는 방법으로 전기 자극이 아닌 광자극을 통해 신경세포에 직접적으로 손상을 가하지 않으며 광유전학적 기법을 이용하여, 뇌파 생성에 중추적인 역할을 하는 억제성 신경세포들 중 파르브알부민(Parvalbumin, 이하 PV) 또는 소마토스타틴(Somatostatin, 이하 SST)에 선택적으로 광자극을 전달하여 해당 신경세포의 활성을 조절함으로써 알츠하이머 질환 뇌에서 손상되었던 세타파 및 감마파를 선택적으로 회복시키는, 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법에 관한 것이다.
알츠하이머 질환은 대표적 퇴행성 뇌질환으로서, 독성물질인 베타-아밀로이드가 뇌에 비정상적으로 침착되어 학습 및 기억 저하를 초래하는 것으로 알려져 있다.
정상 뇌에서는 기억 형성을 위해, 다양한 억제성 신경세포의 활성으로 인해 델타파(0.1-3Hz), 세타파(3-12Hz), 알파파(8-15Hz), 베타파(16-30Hz) 및 감마파(20-120Hz) 등의 다양한 주파수 대역의 뇌파가 발생하는데, 알츠하이머 질환 뇌에서는 베타아밀로이드 침착으로 인한 억제성 신경세포의 기능 저하로 인하여 뇌파 생성이 저해되며, 이는 알츠하이머 질환에서 나타나는 학습 및 기억 저하의 원인이 된다.
종래 알츠하이머 질환 뇌에서 손상된 뇌파를 회복시키고자 전극을 삽입하여 고주파수 대역의 전기 자극을 줌으로써 손상된 뇌파를 회복시키는 기술이 제안되고 있다.
그러나 이러한 전기적 자극은 신경세포에 직접적인 손상을 가할 수 있는 위험성을 내포하고 있을 뿐 아니라, 전기적 자극 기법은 그 자극의 대상이 비 선택적이므로, 실제 뇌의 억제성 신경세포의 다양한 기능 및 활성 패턴을 반영하여 선택적으로 활성 조절을 할 수 없다는 단점이 있다.
따라서 전기적 자극이 아닌, 광유전학을 통해 신경질환을 치료하는 기술이 제안되고 있다. 그 일례로, 특허문헌 1은 특정파장 빛에 민감한 감광성 채널 단백질로 표적 조직을 형질 감염시키는 단계; 광학 자극 장치를 통해 파장 범위의 광을 표적 조직으로 전달하는 단계; 목표 조직에 빛을 전달하는 것과 실질적으로 동시에 생체 신호를 감지하는 단계; 생체신호에 기초하여 환자 치료 상태를 결정하는 단계; 감지된 환자 치료 상태에 기초하여 표적 조직으로의 광의 전달 조정 단계;로 수행하는 광 자극 치료법을 개시하고 있으며 기능저하, 치매, 파킨슨 병, 경직, 간질 등의 신경장애에 적용된다고 기술하고 있다.
또한, 특허문헌 2에 따르면 최근에는 좌뇌 내측 전전두엽의 광유전적 자극을 통한 우울증 치료방법이 개시되어 있다.
구체적으로 스트레스에 따른 사회적 상호작용이 좌뇌 내측 전전두엽(left medial prefrontal cortex)과 밀접한 관련성이 있고, 상기 결과를 바탕으로 좌뇌 내측 전전두엽에 광자극을 통하여 사회적 상호작용을 조절할 수 있음을 확인하여, 좌뇌 내측 전전두엽에 채널로돕신을 발현시키고, 광자극을 주는 수단을 이용하여 상호작용(social interaction)의 조절 정보를 제공함으로써, 우울증의 치료에 유용하다고 기술하고 있다.
종래 발명들을 통해 광유전학 기술이 가진 신경질환 치료 방법으로서의 가능성에 대해서는 제기되어 왔으나, 아직까지 광유전학 기술을 활용한 알츠하이머 질환 치료 방법은 보고된 바 없으며 특히, 특정 파장 대역의 뇌파만을 선택적으로 회복시킬 수 있는 기술이 부재하다.
이에, 본 발명자들은 종래기술의 문제점을 개선하고자 노력한 결과, 알츠하이머 질환 뇌에서 손상되었던 뇌파를 회복시키는 방법으로 전기 자극이 아닌 광자극을 통해 신경세포의 활성을 조절하기 때문에 신경세포에 직접적으로 손상을 가하지 않으며, 뇌파 생성에 가장 직접적인 역할을 한다고 알려진 억제성 신경세포들인 PV 및 SST 억제성 신경세포에만 광수용체를 발현하여 선택적으로 활성을 조절함으로써 SST 억제성 신경세포의 광유전학적 활성으로 알츠하이머 질환 뇌에서 손상된 세타파를, PV 억제성 신경세포의 광유전학적 활성으로 알츠하이머 질환 뇌에서 손상된 감마파의 회복을 선택적으로 유도할 수 있는 기술을 제공하여, 알츠하이머 질환 치료 기술로서 적합함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
미국공개특허 제2011-0125078 (2011.05.26 공개)
대한민국공개특허 제2014-0125659호 (2014.10.29 공개)
본 발명의 목적은 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 억제성 신경세포에 CRE 유전자가 발현된 동물모델 제작단계,
상기 동물모델에, CRE 유전자가 발현된 억제성 신경세포를 표적으로 하도록 설계된 광수용체 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 주입하고 바이러스 벡터를 발현시키는 단계,
상기 바이러스 벡터가 주입된 동물모델에 전극 및 광섬유를 삽입하는 단계 및
상기 전극 및 광섬유를 통해 상기 광수용체 유전자에 설계된 신경세포별 반응하는 광자극을 전달하여 알츠하이머 질환 뇌에서의 손상 뇌파를 선택적으로 회복시키는 단계로 이루어진 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 알츠하이머 질환 뇌에서의 손상 뇌파를 회복시키는 단계 이후 손상 뇌파 회복효과를 정량화하는 단계를 더 수행할 수 있다.
상기에서 억제성 신경세포는 PV 또는 SST를 발현하는 신경세포이고, 상기 광자극에 의해 선택적으로 손상 감마파 또는 손상 세타파를 회복시킬 수 있다.
본 발명에서 광수용체는 450, 470, 565 및 590nm 파장영역의 광에 반응하는 광수용체를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법은 신경세포에 직접적인 손상을 가하는 종래의 전기적 자극을 통한 뇌파 치료 기술과는 달리 광자극을 사용하여 신경세포에 손상을 가하지 않으면서 신경세포의 활성 조절을 통해 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 회복이 가능하다.
또한, 종래기술이 비선택적으로 불특정 다수의 신경세포에 전기 자극을 가하였던 것과 달리, 본 발명의 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법은 바이러스 벡터를 통해 특정 신경세포의 광수용체 유전자를 삽입하는 유전자 조작 기술을 활용하여, 뇌의 다양한 억제성 신경세포들 중 한 종류의 세포만 선택적으로 활성 조절이 가능하다.
또한, 본 발명은 다양한 광자극 패턴을 사용하여, 실제 정상 뇌 뇌파 생성시 나타나는 억제성 신경세포들의 활성 패턴과 유사한 신경세포 활성 패턴을 알츠하이머 질환 뇌에서 유도할 수 있으므로, 정상 뇌의 뇌파 생성 기전을 모사하여 알츠하이머 질환 뇌파 손상을 치료할 수 있다.
도 1은 Aß 중합체 합성과정을 도시한 것이고,
도 2는 광유전학적 유전자 조작기법 및 정위방법을 이용한 바이러스 벡터 및 Aß 주입기술을 나타낸 것이고,
도 3은 알츠하이머성 질환 쥐 해마에서 Aß발현 및 SST/PV 신경세포 사진이고,
도 4는 광유전학적 SST 신경세포 활성 조절을 통한 알츠하이머 질환 해마에서의 손상 세타파 회복 결과를 나타낸 것이고,
도 5는 광유전학적 PV 신경세포 활성 조절을 통한 알츠하이머 질환 해마에서의 손상 감마파 회복 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 다양한 광자극 패턴을 사용하여, 실제 정상 뇌 뇌파 생성시 나타나는 억제성 신경세포들의 활성 패턴과 유사한 신경세포 활성 패턴을 알츠하이머 질환 뇌에서 유도함으로써, 정상 뇌의 뇌파 생성 기전을 모사하여 알츠하이머 질환 뇌파 손상을 회복하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명은 1) 억제성 신경세포에 CRE 유전자가 발현된 동물모델 제작단계,
2) 상기 동물모델에, CRE 유전자가 발현된 억제성 신경세포를 표적으로 하도록 설계된 광수용체 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 주입하고 바이러스 벡터를 발현시키는 단계,
3) 상기 바이러스 벡터가 주입된 동물모델에 전극 및 광섬유를 삽입하는 단계 및
4) 상기 전극 및 광섬유를 통해 상기 광수용체 유전자에 설계된 신경세포별 반응하는 광자극을 전달하여 알츠하이머 질환 뇌에서의 손상 뇌파를 선택적으로 회복시키는 단계로 이루어진 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법을 제공한다.
이하, 도면을 이용하여 각 단계별로 상세히 설명하고자 한다.
본 발명의 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법에 있어서, 1) 단계는 알츠하이머 질환 동물모델 제작단계로서, 알츠하이머 질환 연구에서 주로 사용되는 Aß 펩티드 중 가장 독성이 강하며 용해성 물질인 Aß 중합체(oligomer)를 뇌에 직접적으로 주입하여 알츠하이머성 질환을 유도하는 방법 또는 종래에 유전자 조작 기술을 통해 발명된 알츠하이머성 질환 동물모델을 이용한다.
도 1은 Aß 중합체 합성과정을 도시한 것으로서, Aß 단량체(monomer)에 유기용매인 HFIP(Hexafluoro-2-propanol)를 처리하여 5 내지 10분동안 부유시켜 모노머화시킨 후, 진공농축기를 이용하여 Aß부유액에서 HFIP를 제거하여 필름화한다. 상기 필름화된 Aß에 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 처리하여 Aß의 응집을 늦추면서 부유화하여 Aß 부유액을 제조한다. 이때 실험에 사용할 Aß 부유액은 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid)을 처리하여 200nM로 희석시킨 후 약 12시간 냉장 배양함으로써 용해성 Aß 형태인 중합체를 합성하여 사용한다. 위와 같이 합성된 Aß 중합체를 정위방법을 통해 동물 뇌에 직접 주입하여 알츠하이머성 질환을 유도한다.
상기 1) 단계의 종래 발명된 알츠하이머 질환 동물모델에는 5xFAD mice, APP/PS1 mice 등과 같은 유전자 조작을 통해 제작된 알츠하이머 질환 동물모델들을 포함한다.
상기 1) 단계에서 억제성 신경세포는 PV 또는 SST 신경세포를 사용하고, 상기 특정 억제성 신경세포에 CRE 유전자가 발현되도록 한다.
상기 CRE란 CRE 재결합효소로서, 특정 서열의 DNA를 인식하여 잘라내고 이어 붙이는 기능을 하는데, 예를 들어 PV-CRE 동물모델은 CRE 유전자를 가진 동물모델이며, PV를 발현시키는 프로모터가 CRE 유전자 앞에 있어, PV를 발현하는 신경세포에서만 CRE 효소가 발현된다.
본 발명의 방법에 있어서, 2) 단계는 CRE 유전자가 발현된 억제성 신경세포를 표적으로 하도록 설계된 광수용체를 포함하는 바이러스 벡터 제조하고, 1) 단계의 CRE 형질전환 동물 모델의 뇌에, 광수용체 유전자를 포함한 바이러스 벡터를 주입하는 단계이다.
상기 바이러스 벡터란 EF1a-DIO, CAG-Flex, 및 Syn-Flex와 같은 프로모터를 가진 아데노 연관 바이러스(adeno-associated virus)를 지칭하며, CRE 유전자를 발현하는 특정 신경세포만을 표적으로 하여 광수용체를 전달할 수 있다.
상기 광수용체는 빛에 의해 반응하여 광수용체를 발현하고 있는 신경세포의 활성을 증가시키는 모든 종류의 광수용체를 포함한다. 구체적인 예로는 450nm 파장의 빛에 의해 최대로 반응하는 ChIEF, 470nm 파장의 빛에 의해 최대로 반응하는 채널로돕신-2(channelrhodopsin-2, 이하 ChR2), 565 nm 파장의 빛에 의해 최대로 C1V1, 590 nm 파장의 빛에 의해 최대로 반응하는 Crimson 등을 포함한다. 2) 단계의 광수용체에는 상기 예시로 제시된 광수용체 외에도 신경세포를 활성화시킬 수 있는 모든 종류의 광수용체를 포함한다.
도 2는 광유전학적 유전자 조작기법 및 정위방법을 이용한 바이러스 벡터 및 Aß 주입기술을 나타낸 것으로서, CRE 형질전환 동물 모델, 더욱 바람직하게는 본 발명의 바람직한 실시형태인 SST-CRE 및 PV-CRE 동물모델의 뇌에, 정위방법(stereotaxic)을 사용하여 주입하고자 하는 뇌의 위치를 설정한 후 미세주사기를 통하여 광수용체를 인코딩하는 바이러스 벡터를 주입하면, SST 및 PV 신경세포에만 선택적으로 광수용체를 발현시킬 수 있다.
상기 바이러스 벡터 주입 후, 주입된 바이러스 벡터가 CRE 유전자를 포함하는 특정 억제성 신경세포에 발현되어 유전자 변형을 일으키기 위해 2주 내지 3주간 바이러스 벡터를 발현시키는 단계가 수행된다.
이후 본 발명의 방법에 있어서, 3) 단계는 상기 바이러스 벡터가 주입된 동물모델에 전극 및 광섬유를 삽입하는 단계로서, 알츠하이머 질환 동물모델의 뇌에서의 뇌파 측정 및 광자극 전달을 위한 전극 및 광섬유를 삽입한다.
구체적으로, In vitro 상황의 경우, 알츠하이머 질환 동물모델의 뇌 절편에 미세유리전극을 삽입하여 뇌파를 측정 가능하며, 광원과 현미경렌즈를 통해 광전극을 전달할 수 있다.
또한, In vivo 상황의 경우, 마취된 동물의 두개골에 구멍을 뚫은 후 정위 방법을 통해 전극을 삽입하고자 하는 뇌의 위치를 설정한 후 광전극(전극 + 광섬유)을 주입하고, 그 후에는 덴탈 시멘트를 통하여 수술 부위를 덮어 마무리한다.
이후, 본 발명은 4) 단계를 통해 상기 전극 및 광섬유를 통해 광자극을 전달하여 알츠하이머 질환 뇌에서의 손상 뇌파를 선택적으로 회복시키는 단계로 이루어진다.
상기 4) 단계는 450, 470, 565 및 590nm 등의 파장 대역의 빛을 알츠하이머 질환 뇌에 조사하는 광자극 단계로, 광자극을 활용하여 ChIEF, ChR2, C1V1, Crimson 외의 광수용체가 발현된 특정 억제성 신경세포의 활성을 조절한다.
도 3은 알츠하이머성 질환 쥐 해마에서 촬영된 Aß발현 및 SST/PV 신경세포 사진을 나타낸다. 즉, Aß 및 바이러스가 주입된 SST-CRE 또는 PV-CRE 쥐 해마에 470nm 파장의 광자극이 주어질 경우 알츠하이머 질환 뇌의 ChR2 발현 SST/PV 신경세포를 선택적으로 활성화할 수 있고, 그에 따라, 광자극을 알츠하이머 질환 뇌에 조사하여 손상 세타파 및 감마파를 회복시킬 수 있다.
상기 광자극은 광수용체의 종류에 따라 달라지며, ChR2의 경우 470nm 대역의 파장을 이용하고, C1V1의 경우 565nm 대역 파장의 빛을 이용하며, 뇌에 삽입된 광전극을 통해 주어진다.
도 4는 광유전학적 SST 신경세포 활성 조절을 통한 알츠하이머 질환 해마에서의 손상 세타파 회복 결과를 나타낸 것으로서, 상기 손상된 세타파 회복은 광수용체가 발현된 SST 신경세포를 광자극을 통하여 활성화시켜 이루어진 것이다.
또한, 도 5는 광유전학적 PV 신경세포 활성 조절을 통한 알츠하이머 질환 해마에서의 손상 감마파 회복 결과를 나타낸 것으로서, 상기 손상된 감마파 회복은 광수용체가 발현된 PV 신경세포를 광자극을 통하여 활성화시켜 이루어진 것이다.
광자극의 세기 및 패턴은 정상 뇌에서 일어나는 억제성 신경세포 타입별 다양한 활성 패턴을 모사하는 방향으로 제공되는데, 예를 들어 470nm 파장의 빛을 5Hz 주파수 대역의 사인파 패턴으로 알츠하이머 질환 뇌의 ChR2 발현 파르브알부민성 신경세포에 조사하여 정상 뇌에서 감마파 대역으로 활성을 나타내는 파르브알부민성 신경세포의 활성 패턴을 모사하고 알츠하이머성 질환 뇌에서의 감마파 손상을 회복시킬 수 있다. 이때, 광자극의 세기는 알츠하이머 질환 뇌에서 나타나는 뇌파 손상의 정도에 비례하여 주어질 수 있음은 당연히 이해될 것이다.
또한, 상기 광자극의 패턴은 일정하고 지속적인(continuous) 자극 패턴, 사인파 패턴, 특정 주파수 패턴 등으로 주어질 수 있다.
이후, 본 발명의 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법은 상기 알츠하이머 질환 뇌에서의 손상 뇌파를 회복시키는 4) 단계 이후 5) 손상 뇌파 회복여부를 검증하여 뇌파 회복효과를 정량화하는 단계를 더 수행할 수 있다.
즉, 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 여부는 관찰하고자 하는 파장 대역으로 뇌파를 밴드 패스 필터(band-pass filtering)한 후 고속 푸리에 변환(Fast Fourier Transform)등을 이용한 파워(power) 분석 기법을 통해 정량화 할 수 있다.
이상의 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법은 광자극을 사용하여 신경세포에 손상을 가하지 않으면서 신경세포의 활성 조절을 통해 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 회복이 가능하다.
또한, 본 발명의 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법에 의해, 종래기술이 비선택적으로 불특정 다수의 신경세포에 전기 자극을 가하였던 것과 달리, 특정 신경세포의 광수용체 유전자를 삽입하는 유전자 조작 술을 활용하여, 뇌의 다양한 억제성 신경세포들 중 한 종류의 세포만 선택적으로 활성 조절이 가능하다.
특히, 본 발명은 실제 알츠하이머 질환 뇌에서의 기억 손상과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 알려진 세타파 및 감마파 손상 회복이 가능하다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 알츠하이머 질환 뇌에서의 세타파 손상 회복 방법
1. 아밀로이드 베타 중합체 주입을 통한 알츠하이머 질환 동물 모델 확립
Aß 단량체에 HFIP(Hexafluoro-2-propanol) 용매처리하여 1mM 농도로 부유시켜 모노머화(monomerization) 시킨 후, 진공농축기를 이용하여 Aß 부유액에서 HFIP를 제거하여 필름화시켰다. 상기 필름화된 Aß에 DMSO 용매처리하여 Aß의 응집을 늦추면서 부유화하여 5mM의 Aß 부유액을 제조하였다. 실험에 사용할 Aß 부유액은 생리식염수를 처리하여 200nM로 희석시킨 후 약 12시간 냉장(4℃) 배양하여 용해성 아밀로이드 베타 중합체(Aß oligomer)를 합성하였다.
상기 합성된 Aß 중합체를 정위방법을 이용하여 SST-CRE 쥐의 해마 CA1에 3㎕ 주입하였다. 이때, Aß 중합체 주입은 미세주사기를 이용해 100nl/min 속도로 주입되었으며, Aß가 잘 퍼질 수 있게 3분간 미세주사기를 고정시켜 놓았다.
2. 광유전학 기법을 위한 바이러스 주입
SST 신경세포에 광수용체를 발현하기 위해, 광수용체 중 ChR2를 사용하였으며, 이를 위해 Aß가 주입된 SST-CRE 쥐의 해마 CA1에 정위방법을 사용하여 AAV- EF1a-DIO-C1V1(E162T)-TS-p2A-EYFP-WPRE 바이러스(1㎕)를 주입하였다.
바이러스 주입은 미세주사기를 이용해 100nl/min 속도로 주입되었으며, 주입 후 바이러스가 잘 퍼질 수 있게 3분간 미세주사기를 고정시켜 놓고, 그 후 3주간의 회복 기간을 유지하였다.
3. 바이러스 벡터가 주입된 동물모델에 전극 및 광섬유를 삽입하는 단계
알츠하이머 모사 쥐 해마 CA1에서 뇌파를 측정하기 위하여 정위방법을 통해 마취된 쥐 뇌에 광전극을 삽입하였다.
상기 광전극은 뇌파 측정용 전극과 광자극 전달용 광섬유를 포함하고 있으며 상기 전극을 통해 측정된 지역장 전위(local field potential)에 3-12Hz 대역으로 밴드 패스(band-pass) 필터를 걸어 세타파를 얻어냈고, 고속 푸리에 변환을 통해 세타파의 파워 값 및 주파수 대역 값을 구하였다.
4. 알츠하이머 질환 동물모델 해마에 광자극을 통한 세타파의 뇌파 회복 검증
세타파의 뇌파 회복을 위해서는 상기 Aß 및 바이러스가 주입된 SST-CRE 쥐 해마에 광전극을 통해 470nm 파장이 조사되었다. 이때, 광자극은 일정한 세기로 3초간 지속적으로 전달하였다. 그 결과, 광유전학적 광자극을 활용하여 SST 억제성 신경세포를 활성화시켰을 때는 알츠하이머 질환 모사 쥐 해마에서 손상되었던 세타파가 다시 정상수준으로 회복되는 결과를 얻었다[도 4].
<실시예 2> 알츠하이머 질환 뇌에서의 감마파 손상 회복 방법
상기 실시예 1의 단계 1과 동일하게 아밀로이드 베타 중합체(Aß oligomer)를 합성하고, 상기 합성된 Aß 중합체를 정위방법을 이용하여 PV-CRE 쥐의 해마 CA1에 3㎕ 주입하였다. 이때, Aß 중합체 주입은 미세주사기를 이용해 100nl/min 속도로 주입되었으며, Aß가 잘 퍼질 수 있게 3분간 미세주사기를 고정시켜 놓았다.
PV 신경세포에 광수용체를 발현하기 위해, 광수용체 중 ChR2를 사용하였으며, 이를 위해 Aß가 주입된 PV-CRE 쥐의 해마 CA1에 정위방법을 사용하여 AAV- EF1a-DIO-C1V1(E162T)-TS-p2A-EYFP-WPRE 바이러스(1㎕)를 주입하였다. 바이러스 주입은 미세주사기를 이용해 100nl/min 속도로 주입되었으며, 주입 후 바이러스가 잘 퍼질 수 있게 3분간 미세주사기를 고정시켜 놓고, 그 후 3주간의 회복 기간을 유지하였다.
알츠하이머 모사 쥐 해마 CA1에서 뇌파를 측정하기 위하여 정위방법을 통해 마취된 쥐 뇌에 광전극을 삽입하고, 상기 전극을 통해 측정된 지역장 전위(local field potential)에 20-120Hz 대역으로 밴드 패스(band-pass) 필터를 걸어 감마파를 얻어냈고, 고속 푸리에 변환을 통해 감마파의 파워 값 및 주파수 대역 값을 구하였다.
감마파의 뇌파 회복을 위해서는 상기 Aß 및 바이러스가 주입된 PV -CRE 쥐 해마에 광전극을 통해 470nm 파장이 조사되었다. 이때, 광자극은 일정한 세기로 3초간 지속적으로 전달하였다. 그 결과, 광유전학적 광자극을 활용하여 PV 억제성 신경세포를 활성화시켰을 때는 알츠하이머 질환 모사 쥐 해마에서 손상되었던 세타파가 다시 정상수준으로 회복되는 결과를 얻었다[도 5].
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (5)

  1. 억제성 신경세포에 CRE 유전자가 발현된 동물모델 제작단계,
    상기 동물모델에, CRE 유전자가 발현된 억제성 신경세포를 표적으로 하도록 설계된 광수용체 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 주입하고 바이러스 벡터를 발현시키는 단계,
    상기 바이러스 벡터가 주입된 동물모델에 전극 및 광섬유를 삽입하는 단계 및
    상기 전극 및 광섬유를 통해 표적 신경세포에만 선택적으로 발현하도록 설계된 광수용체 유전자에 광자극을 전달하여 알츠하이머 질환 뇌에서의 손상 뇌파를 회복시키는 단계로 이루어진, 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머 질환 뇌에서의 손상 뇌파를 회복시키는 단계 이후 손상 뇌파 회복효과를 정량화하는 단계를 더 수행하는 것을 특징으로 하는 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 억제성 신경세포가 파르브알부민(parvalbumin) 또는 소마토스타틴(somatostatin)를 발현하는 신경세포인 것을 특징으로 하는 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 광수용체가 450, 470, 565 및 590nm 파장영역의 광에 반응하는 광수용체인 것을 특징으로 하는 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 광자극에 의해 손상 감마파 또는 손상 세타파가 선택적으로 손상 회복된 것을 특징으로 하는 광유전학 기법을 이용한 알츠하이머 질환 뇌에서의 뇌파 손상 회복 방법.
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