JP7397532B2 - 眼遺伝子送達のためのon双極細胞に特異的なプロモーター - Google Patents
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Description
失明の多くの原因は、治療可能性を有しても限定的に過ぎないか、又は全く治療法を有しない。それらの中で、網膜色素変性症(RP)と同様、加齢性黄斑変性症(AMD)及び遺伝性網膜疾患(IRD)が最も一般的である。これらの変性疾患は、最終的に全盲に至る光受容体(PR)の漸進的減少によって特徴づけられる。遺伝子療法、治療用DNA若しくはRNAの送達、欠陥遺伝子の置換若しくは発現抑制又は外因性治療用遺伝子のコード化は、疾患進行の緩徐化、症状の寛解又は失われた機能の導入が意図される。
a.配列番号1~6から選択されるエンハンサー配列エレメント、及び
b.配列番号7~10から選択されるプロモーター配列エレメント
を含む、850塩基対(bp)~1500bpの長さの単離核酸分子に関する。
a.配列番号1及び2から選択される配列に対して、少なくとも(≧)70%、特には≧75%、より特には≧80%、より特には≧85%、より特には≧90%、より特には≧95%、さらにより特には≧98%、最も特には100%同一であるエンハンサー配列エレメント;及び
b.配列番号7の配列に対して、≧70%、特には≧75%、より特には≧80%、より特には≧85%、より特には≧90%、より特には≧95%、さらにより特には≧98%、最も特には100%同一であるプロモーター配列エレメント
を含み、
且つ単離核酸分子は、配列番号13の配列から、≧40%、特には≧50%、より特には≧60%、さらにより特には≧70%、より特には≧80%、さらにより特には≧90%、最も特には100%の錐体ON双極細胞の特異性、及び≧20%、特には≧25%、より特には≧30%、さらにより特には≧35%、より特には≧40%、最も特には≧50%の錐体ON双極細胞の選択性を有する、850塩基対(bp)~1500bpの長さの単離核酸分子に関する。
本明細書と関連するOBCという用語は、ON双極細胞に関する。
(Nは括弧内に与えられる染色特徴を伴う細胞の数である)
が外植片の小領域にわたりほぼ一定である場合、網膜の中間周辺部から作製される。結果として、発現cOBC対発現RBCの比
は、同様に外植片において一定であると推定可能である。これは、(3)に(4)を掛けることにより、外植片におけるcOBC及びRBCの特異的分布を説明する、RBCに対するcOBCの選択性比率(preference ratio)のファクター
の計算を可能にする。次に、パーセント単位のcOBCの選択性が
で計算される。
a.配列番号1~6から選択されるエンハンサー配列エレメント、及び
b.配列番号7~10から選択されるプロモーター配列エレメント
を含む単離核酸分子に関する。
a.配列番号1~6から選択されるエンハンサー配列エレメント、及び
配列番号7~10から選択されるプロモーター配列エレメント
を含む、850塩基対(bp)~1500bpの長さの単離核酸分子に関する。
a.配列番号1及び2から選択される配列に対して、≧70%、特には≧75%、より特には≧80%、より特には≧85%、より特には≧90%、より特には≧95%、さらにより特には≧98%、最も特には100%同一であるエンハンサー配列エレメント;及び
b.配列番号7の配列に対して、≧70%、特には≧75%、より特には≧80%、より特には≧85%、より特には≧90%、より特には≧95%、さらにより特には≧98%、最も特には100%同一であるプロモーター配列エレメント;
を含み、
且つ単離核酸分子は、配列番号13の配列から、≧40%、特には≧50%、より特には≧60%、さらにより特には≧70%、より特には≧80%、さらにより特には≧90%、最も特には100%の錐体ON双極細胞の特異性、及び≧20%、特には≧25%、より特には≧30%、さらにより特には≧35%、より特には≧40%、最も特には≧50%の錐体ON双極細胞の選択性を有する、単離核酸分子に関する。
a.配列番号1及び2から選択される配列に対して、≧70%、特には≧75%、より特には≧80%、より特には≧85%、より特には≧90%、より特には≧95%、さらにより特には≧98%、最も特には100%同一であるエンハンサー配列エレメント;及び
b.配列番号7の配列に対して、≧70%、特には≧75%、より特には≧80%、より特には≧85%、より特には≧90%、より特には≧95%、さらにより特には≧98%、最も特には100%同一であるプロモーター配列エレメント;
を含み、
且つ単離核酸分子は、配列番号13の配列から、≧40%、特には≧50%、より特には≧60%、さらにより特には≧70%、より特には≧80%、さらにより特には≧90%、最も特には100%の錐体ON双極細胞の特異性、及び≧20%、特には≧25%、より特には≧30%、さらにより特には≧35%、より特には≧40%、最も特には≧50%の錐体ON双極細胞の選択性を有する、850塩基対(bp)~1500bpの長さの単離核酸分子に関する。
a.カプシドタンパク質をコードする配列、及び
b.導入遺伝子
をさらに含む。
a.硝子体内投与、特に硝子体内注射、又は
b.網膜下注射
により投与される。
1.a.配列番号1~6から選択されるエンハンサー配列エレメント、及び
b.配列番号7~10から選択されるプロモーター配列エレメント
を含む、850塩基対(bp)~1500bpの長さの単離核酸分子。
2.a.配列番号1及び2から選択される配列に対して、少なくとも(≧)70%、特には≧75%、≧80%、より特には≧85%、より特には≧90%、より特には≧95%、さらにより特には≧98%、最も特には100%同一であるエンハンサー配列エレメント;及び
b.配列番号7の配列に対して、≧70%、特には≧75%、より特には≧80%、より特には≧85%、より特には≧90%、より特には≧95%、さらにより特には≧98%、最も特には100%同一であるプロモーター配列エレメント
を含み、
且つ単離核酸分子は、配列番号13の配列から、≧40%、特には≧50%、より特には≧60%、さらにより特には≧70%、より特には≧80%、さらにより特には≧90%、最も特には100%の錐体ON双極細胞の特異性、及び≧20%、特には≧25%、より特には≧30%、さらにより特には≧35%、より特には≧40%、最も特には≧50%の錐体ON双極細胞の選択性を有する、850塩基対(bp)~1500bpの長さの単離核酸分子。
3.前記エンハンサー配列エレメントの1つ及び1つのみ、前記プロモーター配列エレメントの1つ及び1つのみ、また任意選択的にはエンハンサー配列エレメントをプロモーター配列エレメントから分離するスペーサーからなる、項目1又は2に従う単離核酸分子。
4.配列番号11~配列番号15から選択される配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号11~配列番号15から選択される配列に対する≧98%の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、項目1~3のいずれか一項に従う単離核酸分子。
5.配列番号11若しくは配列番号13の配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号11若しくは配列番号13に対する≧98%の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、特に配列番号13の配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号13に対する≧98%の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、項目1~4のいずれか一項に従う単離核酸分子。
6.項目1~5のいずれか一項に従う核酸分子を含む核酸発現ベクター。
7.アデノ随伴ウイルスベクター又は組換えアデノ随伴ベクター(rAAV)である、特に組換えAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、又はAAV12ベクターである、より特には組換えAAV2ベクターである、項目6に従う核酸発現ベクター。
8.a.カプシドタンパク質をコードする配列、及び
b.導入遺伝子
をさらに含む、項目6~7のいずれか一項に従う核酸発現ベクター。
9.導入遺伝子が配列番号16の配列を含む、項目8に従う核酸発現ベクター。
10.項目1~5のいずれか一項に従う単離核酸分子又は項目6~9のいずれか一項に従う核酸発現ベクターを含むアデノ随伴ビリオン粒子。
11.薬剤としての使用のための、項目1~5のいずれか一項に従う単離核酸分子又は項目6~9のいずれか一項に従う核酸発現ベクター、及び項目10に従うアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤。
12.網膜双極細胞を冒す病態の治療、特に先天性停止性夜盲症(CSBN1)又は桿体錐体ジストロフィー及び錐体桿体ジストロフィー、より特には網膜色素変性症及び黄斑変性症の治療における使用のための、項目1~5のいずれか一項に従う単離核酸分子、項目6~9のいずれか一項に従う核酸発現ベクター、及び項目10に従うアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤。
13.項目1~5のいずれか一項に従う単離核酸分子、項目6~9のいずれか一項に従う核酸発現ベクター、及び項目10に従うアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤であって、
a.硝子体内投与、特に硝子体内注射、又は
b.網膜下注射
により投与される薬剤。
実施例1:rd1マウスモデルにおけるGrm6遺伝子発現変化の分析
発明者は、プロモーター設計のための鋳型として、網膜のON双極細胞(OBC)内で選択的に発現される代謝型グルタミン酸受容体6(mGluR6)をコードする遺伝子(マウスにおけるGrm6及びヒトにおけるGRM6)を選択した。これは、mGluR6の発現がOBCに対して選択的であるからであり、それは最近、成体マウス網膜の単一細胞トランスクリプトーム解析により確認され(Siegert et al.Nat Neurosci 2012.15:p.487-95)、また全長Grm6プロモーターが特に網膜OBC内で導入遺伝子発現を駆動する場合での、以前に発明者によって作製されたトランスジェニックマウス株において非常に明白であった(van Wyk et al.,PloS Biol 2015.13:p.e1002143)。さらに、マウスGrm6遺伝子に由来する短いプロモーターバージョンが巧みに構築され、OBCにおける優先的発現を駆動することが示されている(Cronin et al.,EMBO Mol Med,2014.6(9):p.1175-1190;Kim et al.J Neurosci 2008.28:p.7748-7764;Lagali et al.Nat Neurosci 2008.11p:667-675)。Kimらは、野生型マウス網膜におけるOBCに特異的な発現を増強する、マウスGrm6遺伝子のプロモーター内の200bpの遠位エンハンサー配列を最初に選択した。このエンハンサー配列は、後に4×GRM6-SV40プロモーターにおいて利用された[Cronin,T.,et al.,EMBO Mol Med,2014.6(9):p.1175-1190]が、それはタンデム型のこれらの200bpのエンハンサー配列の4つを有する。しかし、発明者は最近、4×GRM6-SV40プロモーター[Cronin,T.,et al.,EMBO Mol Med,2014.6(9):p.1175-1190]が、たとえ遺伝子療法が光受容体変性完了前の3.5週齢時に実施されたときであっても、変性rd1(C3H/HeOu)マウス網膜において完全に下方制御されることを示した(van Wyk et al.Front Neurosci 2017.11:p.161)。これにより、4×GRM6-SV40(及びGRM6-SV40同様)が変性した網膜の治療に適しないようになる。さらに、SV40基本ウイルスプロモーターは、細胞の細胞傷害性をもたらす慢性的活性化及びタンパク質過剰発現の下での発現抑制などの問題を被る。より適したOBCに特異的なプロモーターを設計するため、発明者は、Grm6の発現がrd1変性マウスモデルにおける変性プロセス中に上方制御され続けるか否かを最初に検討した。発明者は、この重度且つ迅速な変性モデルにおけるプロモーター活性が大部分の大して重症でない網膜の変性疾患において活性がある可能性が高いという理論的根拠の下で、rd1マウスモデルを利用した。これは以前に発明者により例示され、4×GRM6-SV40がいくつかの発現を依然として駆動することができる場合、より緩徐に変性するrd10(B6.CXB1-Pde6brd10)マウスモデルにおける導入遺伝子発現と比較された[van Wyk,M.,et al.,Front Neurosci,2017.11(161):p.161.]。発明者は、rd1マウス網膜におけるGrm6遺伝子発現を、P14、P21、P28及びP54の時点でのリアルタイム定量PCRにより定量化し、野生型C57BL/6Jマウス網膜と発現レベルを比較した。リボソームタンパク質L8(Rpl8)の発現を発現レベルの正規化のために使用した。Grm6の発現は、変性中、P21とP28の間でのわずかな下方制御(0.59倍)を除いては一定を維持した(P=0.8795)。これから、発明者は、4×GRM6-SV40プロモーターにおいて認められた著しい下方制御[van Wyk,M.,et al.,Front Neurosci,2017.11(161):p.161.]が、Grm6エンハンサーエレメントの下方制御に起因する可能性は低く、おそらくは変性が進行したSV40基本プロモーターの機能性低下の結果であると結論づけた。結果的に、Grm6遺伝子は、発明者によりOBCに特異的なプロモーター設計のための鋳型として使用された。
ヒトの治療法における将来的使用の観点からヒト転写機構に適合させるため、発明者は、鋳型として、マウスGrm6配列ではなく、ヒトGRM6配列を使用した。
ヒト患者における治療使用の観点で、ヒトGRM6遺伝子に対してプロモーターを設計しており、全てのプロモーターを死後ヒト網膜外植片において評価した。このため、プロモーターをmCitrine導入遺伝子と組み合わせ、自己相補的(sc)AAVカプシド、特にscAAV2(7m8)にパッケージングした(Dalkara et al.Sci Transl Med 2013.5:p.189ra76)。
次のステップで、OBC細胞型の発現特異性について切片を分析した。この目的のため、切片を導入遺伝子mCitrineに対する抗体、ユビキタスOBCマーカーGαo及び桿体双極細胞特異抗体PKCαで染色し、[mCitrine(+)、PKCα(+)、Gαo(+)]細胞が発現桿体ON双極細胞(RBC)として明確に同定された一方で、[mCitrine(+)、PKCα(-)、Gαo(+)]細胞が発現錐体ON双極細胞(cOBC)として明確に同定された。したがって、[mCitrine(-)、PKCα(+)]細胞は非発現RBCとして、また[mCitrine(-)、PKCα(-)、Gαo(+)]細胞は非発現cOBCとして同定された。図3に示す結果は、770En_454P(hGRM6)及び407En_454P(hGRM6)の双方が、cOBCにおいて、200En-mGluR500Pと比較して有意により高い導入遺伝子発現を駆動することを明示する。cOBC選択性における測定(図3B)は、分析された網膜領域において、発現cOBC及びRBCの量をcOBC及びRBCの総数に正規化することにより決定した。かかる正規化は、770En_454P(hGRM6)(49.5%のcOBC選択性)及び407En_454P(hGRM6)(36.4%のcOBC選択性)が、200En-mGluR500P(16.3%のcOBC選択性)と比較して、cOBC細胞型における発現を駆動するための高度に増強された能力を有することを示した。特に注目すべきは、770En_454P(hGRM6)は、RBC及びcOBCにおいて等しい選択性を示す(各々、約50%、図3B)。
OBCに対する高い選択性は、網膜シグナル伝達の破壊などのオフターゲット効果を回避するために必要である。ヒト網膜切片をmCitrine(導入遺伝子)に対する抗体、Goα(通常のOBCマーカー)及び核染色DAPIで標識し、細胞層を識別した。これから、発現細胞型の識別は、光受容体(PR、mCitrine(+)、外核層中に位置する)、OBC[mCitrine(+)、Goα(+)、内核層中に位置する]、アマクリン細胞[AC、mCitrine(+)、Goα(-)、内核層中に位置する]及び神経節細胞(GC、mCitrine(+)、神経節細胞層中に位置する)に基づくことができた。図4Aは、新規なプロモーター770En_454P(hGRM6)が、200En-mGluR500P(70.1±12.2%)と比較して、OBCに対する有意に増加した選択性(88.3±7.8%)を有することを明示する。さらに、200En-mGluR500Pのオフターゲット発現は、特にACにおいて、新規な770En_454P(hGRM6)プロモーター(4.1±3.2%)と比較して、一般により高かった(16.9±9.1%)。後者は、オフターゲット発現が網膜シグナル伝達を破壊する場合のオプトジェネティックな視力回復にとって特に重要である。
網膜療法においては、組織の治療しやすさが重要である。これは、解剖学的、機能的及び転写的変化を伴う変性プロセスにおける課題であり得る。発明者は、Kimのマウス200En-SV40プロモーターが迅速な変性rd1マウスモデルにおいてもはや機能的でないことを以前に示していた(van Wyk et al.Front Neurosci 2017.11:p.161)。したがって、770En_454P(hGRM6)の性能[及び比較としてそのマウス対応物200En-mGluR500P[Lu et al.Gene Ther 2016.23p:680-689]を変性rd1マウスモデルにおいて試験した。プロモーターをオプトジェネティックなMWOPN_-mGluR6-IRES2-TurboFP635(配列番号16、図8のプラスミドマップ)導入遺伝子と組み合わせ、ssAAV2(7m8)にパッケージングした(Dalkara et al.Sci Transl Med 2013.5:p.189ra76)。3×109vgを、(van Wyk et al.Front Neurosci 2017.11:p.161;van Wyk et al.,PloS Biol 2015.13:p.e1002143)に記載の通り、後の変性22週齢rd1マウスの眼に硝子体内注射した。注射の4週後、マウスを安楽死させ、前述の通り、免疫組織化学的分析のために網膜を抽出した[van Wyk,M.,et al.,Front Neurosci,2017.11(161):p.161;van Wyk et al.,PloS Biol 2015.13:p.e1002143]。発明者は、切片を導入遺伝子TurboFP635、OBCに特異的なGoαマーカー及び核染色DAPIに対して標識した。200En-SV40と異なり、770En_454P(hGRM6)及びLuのGrm6由来の200En-mGluR500Pは、rd1網膜のOBCにおいて機能的であった(図5)。しかし、200En-mGluR500Pは、図5Aに図示の通り、限られた網膜領域内に限り発現を引き起こした一方で、770En_454P(hGRM6)は、おそらくは、いくつかのGrm6の下方制御が生じていると発現閾値を超える、その増強された発現強度に起因し、変性した網膜のはるかにより大規模且つ広範な形質導入を引き起こした(図5B)。変性した網膜内で770En_454P(hGRM6)によって駆動された導入遺伝子(mCitrine)発現の特異性及び有効性を分析するため、発明者は、さらなるrd1マウス9匹にさらに後の時点(29~33週齢)で注射した。4週後、動物を安楽死させ、眼を凍結させ、切片を作成した。凍結切片をmCitrineに対する抗体及びGoαで再び標識し、共焦点顕微鏡下で分析した。この段階でも、これらの完全に変性された網膜において、導入遺伝子を発現する[mCitrine(+)、Goα(-)]全ての細胞の約67%がOBC[mCitrine(+)、Goα(+)]であった。同様に、全OBC[mCitrine(-)、Goα(+)]の約55%が導入遺伝子を発現した[mCitrine(+)、Goα(+)](図5D)。変性した網膜内の治療導入遺伝子の広範且つ特異的な発現は、効率的な遺伝子療法における基本である。
770En_454P(hGRM6)の好ましい特性がOBCで標的化されるオプトジェネティックな機能的視力回復を支持するか否かを理解するため、発明者はrd1変性マウスモデルを用いて原理証明実験を実施した。発明者は、3×109vgのssAAV(7m8)-770En_454P(hGRM6)-MWOPN_mGluR6-IRES2-TurboFP635-WPRE-BGHpA(図8のプラスミドマップ)を3つの完全に光受容体の少ない22週齢のrd1マウスに両側性に注射した。MWOPN_mGluR6(配列番号16)は、マウス錐体中波長オプシン(MWOPN)とOBC活性を媒介し、この視力回復を伴うOpto-mGluR6に対して類似的に機能するマウスmGluR6との間のキメラタンパク質である(van Wyk et al.,PloS Biol 2015.13:p.e1002143)。発明者は、注射後の異なる時点(41、47、55、82及び112日目)で、動物を配置可能なプラットフォームに囲まれた、4つのスクリーン(23.8”完全HD IPSパネル)を有する小型チャンバー(54×54×30cm)を含む自動化された実質的なOptoDrum(Striatech(登録商標))内で、([Prusky et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci,2004.45(12):p.4611-6.]に従い)視運動性反応(OMR)を検出することにより、視力を測定した。スクリーンの輝度を250cd/m2に調整し、チャンバーの底部及び頂部をミラーで覆った。コンパクトな産業用カメラ(グローバルシャッター及び広角レンズを有するIR感受性1/3”CMOSセンサ、F1.6)が、上部からマウスの頭部の動きを、黒色及び白色の非正弦の垂直バーの回転パターンを異なる空間的頻度でスクリーン上に表示させながら追跡した。ソフトウェアOptodrumが、記録された頭部の動きを分析し、適用された刺激の厚さ、コントラスト及び速度を制御した。動くバーの速度を12°/秒に、コントラストを100%に設定した。図6に示すように、各マウスにおける視力中央値を異なる試験の全ての測定された視力から決定した。治療マウスの視力中央値は、0.29±0.03サイクル/°(n=3、±標準偏差、P=0.0048)であり、0.15±0.06サイクル/°(n=7、P≧194)の非注射rd1対照マウスの場合よりも有意に良好であったが、0.43±0.05サイクル/°の平均視力を有する、参照用のC57BL/6陽性対照の場合よりもやはり不良であった(n=10、標準偏差、P=0.0006)。しかし、オプトジェネティックなOBC標的療法は、視運動性反応における著明な改善をもたらした。まとめると、結果により、770En_454P(hGRM6)が、変性においてcOBCを含むOBCに対してやはり非常に効率的且つ特異的である、短い(1243bp)、ヒト遺伝子に基づくプロモーターであることから、OBCが標的化されるヒト遺伝子療法におけるすべての要件を満たすことが立証される。
生物活性アッセイ
生物活性アッセイは、上の実施例セクションで説明される。培養及びヒト網膜外植片のAAV形質導入並びにマウス眼への硝子体内AAV注射及びその後の凍結した網膜切片の免疫組織化学的処理は、他で詳述される[van Wyk,M.,et al.,Front Neurosci,2017.11(161):p.161.]。
この目的のため、網膜凍結切片を導入遺伝子mCitrineに対する抗体(Invitrogen,A11122,1:500)、ユビキタスOBCマーカーGαo(EMD,MAB3073,1:750)及びRBC特異抗体PKCα(Santa Cruz,sc8393,1:750)で三重染色した。[mCitrine(+)、PKCα(+)、Gαo(+)]細胞を発現RBCとして明確に同定した一方で、[mCitrine(+)、PKCα(-)、Gαo(+)]細胞を発現cOBCとして明確に同定した。図3Aに表示するOBC型の選択性は、発現cOBC対全OBCの比[mCitrine(+)、PKCα(-)、Gαo(+)]/[Gαo(+)]により、またRBC型の選択性は、発現RBC対全OBCの比[mCitrine(+)、PKCα(+)、Gαo(+)]/[Gαo(+)]により決定した。発現cOBCの選択性、換言すればcOBCが発現する確率の測定値を得るため、発明者は、発現cOBC及びRBCの数をこの特定の分析対象の網膜領域内のcOBC及びRBCの量と各々関連付けた。この正規化は、[mCitrine(-)、PKCα(+)、Gαo(+)]細胞を非発現RBC及び非発現cOBCとしての[mCitrine(-)、PKCα(-)、Gαo(+)]として明確に同定できることから可能であった。したがって、[mCitrine(+)、PKCα(+)、Gαo13(+)]/[mCitrine(-)、PKCα(+)、Gαo(+)]の比は、形質導入された発現RBCの百分率を表す一方で、[mCitrine(+)、PKCα(-)、Gαo(+)]/[mCitrine(-)、PKCα(-)、Gαo(+)]の比は、分析対象の各網膜領域内の形質導入された発現cOBCの百分率を表す。したがって、図3Bに示される得られた百分率は、cOBCが形質導入される確率を示す。
発明者は、Genomics Institute of the University of California Santa Cruzのゲノムブラウザ(UCSCゲノムブラウザ、https://genome.ucsc.edu/)[Kent et al.,Genome Res,2002.12(6):p.996-1006;Kuhn et al.,Brief Bioinform,2013.14(2):p.144-61]を使用し、ゲノムプロモーター配列及びゲノムアノテーションを試験した。
Airyscan及びZEN2.1ソフトウェアを搭載したZEISS LSM880を使用し、20倍又は40倍いずれかの対物レンズで共焦点画像を取得した。画像を処理し、Fijiで評価した[Schindelin et al.,Nat Method,2012.9(7):p.676-82.]。細胞計数用にセルカウンタープラグインを、また画像処理用に標準のFijiツールを使用した。Fijiがタイルスキャン画像を自動的に組み合わせなかった場合には、Stitchプラグイン[Preibisch et al.,Bioinformatics,2009.25(11):p.1463-5.]を使用した。
他に記載がなければ、値を両側スチューデントt検定と比較し、本研究全体を通じて生体サンプルにわたる±標準偏差を伴う平均値が得られた。有意水準は星印によって示され:*はP≦0.05を表し、**はP≦0.01を表し、***はP≦0.001を表す。
実施例1及び2における上で言及されていない残りの方法は、[van Wyk,M.,et al.,Front Neurosci,2017.11(161):p.161.]に見出すことができる。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
1.a.配列番号1~3から選択されるエンハンサー配列エレメント、及び
b.配列番号7のプロモーター配列エレメント
を含む、850塩基対(bp)~1500bpの長さの単離核酸分子。
2.a.配列番号1~3から選択される配列に対して、少なくとも(≧)70%、特には≧75%、≧80%、より特には≧85%、より特には≧90%、より特には≧95%、さらにより特には≧98%、最も特には100%同一であるエンハンサー配列エレメント;及び
b.配列番号7の配列に対して、≧70%、特には≧75%、より特には≧80%、より特には≧85%、より特には≧90%、より特には≧95%、さらにより特には≧98%、最も特には100%同一であるプロモーター配列エレメント;
を含み、且つ単離核酸分子は、配列番号13の配列から、≧40%、特には≧50%、より特には≧60%、さらにより特には≧70%、より特には≧80%、さらにより特には≧90%、最も特には100%の錐体ON双極細胞の特異性、及び≧20%、特には≧25%、より特には≧30%、さらにより特には≧35%、より特には≧40%、最も特には≧50%の錐体ON双極細胞の選択性を有する、
850塩基対(bp)~1500bpの長さの単離核酸分子。
3.前記エンハンサー配列エレメントの1つ及び1つのみ、前記プロモーター配列エレメントの1つ及び1つのみ、並びに任意選択的には、前記エンハンサー配列エレメントを前記プロモーター配列エレメントから分離するスペーサーからなる、上記1又は2に記載の単離核酸分子。
4.配列番号11、配列番号13、及び配列番号15から選択される配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号11、配列番号13、及び配列番号15から選択される配列に対する≧98%の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、上記1~3のいずれかに記載の単離核酸分子。
5.配列番号11若しくは配列番号13の配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号11若しくは配列番号13に対する≧98%の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、特に配列番号13の配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号13に対する≧98%の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、上記1~4のいずれかに記載の単離核酸分子。
6.上記1~5のいずれかに記載の核酸分子を含む核酸発現ベクター。
7.上記6に記載の核酸発現ベクターであって、アデノ随伴ウイルスベクター又は組換えアデノ随伴ベクター(rAAV)であり、特に、組換えAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、又はAAV12ベクターであり、より特には、組換えAAV2ベクターである、核酸発現ベクター。
8.a.カプシドタンパク質をコードする配列、及び
b.導入遺伝子
をさらに含む、上記6~7のいずれかに記載の核酸発現ベクター。
9.前記導入遺伝子は、配列番号16の配列を含む、上記8に記載の核酸発現ベクター。
10.上記1~5のいずれかに記載の単離核酸分子又は上記6~9のいずれかに記載の核酸発現ベクターを含む、アデノ随伴ビリオン粒子。
11.薬剤としての使用のための、上記1~5のいずれかに記載の単離核酸分子又は上記6~9のいずれかに記載の核酸発現ベクター、及び上記10に記載のアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤。
12.先天性停止性夜盲症(CSBN1)又は桿体錐体ジストロフィー及び錐体桿体ジストロフィー、特に網膜色素変性症及び黄斑変性症の治療における使用のための、上記1~5のいずれかに記載の単離核酸分子、上記6~9のいずれかに記載の核酸発現ベクター、及び上記10に記載のアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤。
13.上記1~5のいずれかに記載の単離核酸分子、上記6~9のいずれかに記載の核酸発現ベクター、及び上記10に記載のアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤であって、
a.硝子体内投与、特に硝子体内注射、又は
b.網膜下注射
によって投与される、薬剤。
配列番号2:770En(hGRM6)
配列番号3:444En(hGRM6)
配列番号4:429En(mGrm6)、407En(hGRM6)に対応するマウス配列
配列番号5:792En(mGrm6)、770En(hGRM6)に対応するマウス配列
配列番号6:460En(mGrm6)、444En(hGRM6)に対応するマウス配列
配列番号7:454P(hGRM6)
配列番号8:566P(hGRM6)
配列番号9:454P(mGrm6)、454P(hGRM6)に対応するマウス配列
配列番号10:566P(mGrm6)、566P(hGRM6)に対応するマウス配列
配列番号11:407En_454P(hGRM6)
配列番号12:407En_566P(hGRM6)
配列番号13:770En_454P(hGRM6)
配列番号14:770En_566P(hGRM6)
配列番号15:444En_454P(hGRM6)
配列番号16:MWOPN_mGluR6
配列番号17:IRES2
配列番号18:mCitrine
配列番号19:TurboFP635
配列番号20:WPRE
配列番号21:BGH pA
配列番号22:sNRP-1 pA
1 aaataaaata cgaaatg 17
配列番号23:WTカプシドAAV2
配列番号24
gccgccAccAUGG
配列番号25
gccgccGccAUGG
Claims (14)
- a.配列番号1~3から選択されるエンハンサー配列エレメント、及び
b.配列番号7のプロモーター配列エレメント
を含む、850塩基対(bp)~1500bpの長さの単離核酸分子。 - a.配列番号1~3から選択される配列に対して、少なくとも(≧)90%同一であるエンハンサー配列エレメント;及び
b.配列番号7の配列に対して、≧90%同一であるプロモーター配列エレメント;
を含み、且つ単離核酸分子は、配列番号13の配列から、≧40%、≧50%、≧60%、≧70%、≧80%、≧90%、又は100%の錐体ON双極細胞の特異性、及び≧20%、≧25%、≧30%、≧35%、≧40%、又は≧50%の錐体ON双極細胞の選択性を有する、
850塩基対(bp)~1500bpの長さの単離核酸分子。 - 前記単離核酸分子が、前記エンハンサー配列エレメントのいずれか1つ、及び前記プロモーター配列エレメントのいずれか1つからなるか、又は、前記単離核酸分子が、前記エンハンサー配列エレメントのいずれか1つ、前記プロモーター配列エレメントのいずれか1つ、及び、前記エンハンサー配列エレメントを前記プロモーター配列エレメントから分離するスペーサーからなる、請求項1又は2に記載の単離核酸分子。
- 配列番号11、配列番号13、及び配列番号15から選択される配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号11、配列番号13、及び配列番号15から選択される配列に対する≧98%の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、請求項1~3のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
- 配列番号11若しくは配列番号13の配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号11若しくは配列番号13に対する≧98%の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、請求項1~4のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸分子を含む核酸発現ベクター。
- 請求項6に記載の核酸発現ベクターであって、アデノ随伴ウイルスベクター又は組換えアデノ随伴ベクター(rAAV)であり、特に、組換えAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、又はAAV12ベクターである、核酸発現ベクター。
- a.カプシドタンパク質をコードする配列、及び
b.導入遺伝子
をさらに含む、請求項6~7のいずれか一項に記載の核酸発現ベクター。 - 前記導入遺伝子は、配列番号16の配列を含む、請求項8に記載の核酸発現ベクター。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の単離核酸分子又は請求項6~9のいずれか一項に記載の核酸発現ベクターを含む、アデノ随伴ビリオン粒子。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の単離核酸分子、請求項6~9のいずれか一項に記載の核酸発現ベクター、又は請求項10に記載のアデノ随伴ビリオン粒子を含む、医薬組成物。
- 療法のための、請求項11に記載の医薬組成物。
- 先天性停止性夜盲症(CSBN1)、桿体錐体ジストロフィー及び錐体桿体ジストロフィー、網膜色素変性症又は黄斑変性症の治療のための、請求項11に記載の医薬組成物。
- 請求項12又は13に記載の医薬組成物であって、
a.硝子体内投与、
b.硝子体内注射、又は
c.網膜下注射
によって投与される、医薬組成物。
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