JP7397532B2 - 眼遺伝子送達のためのｏｎ双極細胞に特異的なプロモーター - Google Patents

Description

本発明は、視力の改善及び／又は回復のための眼への治療的な導入遺伝子送達における合成網膜ＯＮ双極細胞に特異的なプロモーター配列及びそれらの使用に関する。本発明は、ＯＮ双極細胞における増強されたより特異的な発現のための代謝型グルタミン酸受容体６（ｍＧｌｕＲ６）プロモーターを特徴とする。それは特に、専らヒト網膜黄斑に存在する錐体ＯＮ双極細胞における効率的発現の場合である。

説明
失明の多くの原因は、治療可能性を有しても限定的に過ぎないか、又は全く治療法を有しない。それらの中で、網膜色素変性症（ＲＰ）と同様、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）及び遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）が最も一般的である。これらの変性疾患は、最終的に全盲に至る光受容体（ＰＲ）の漸進的減少によって特徴づけられる。遺伝子療法、治療用ＤＮＡ若しくはＲＮＡの送達、欠陥遺伝子の置換若しくは発現抑制又は外因性治療用遺伝子のコード化は、疾患進行の緩徐化、症状の寛解又は失われた機能の導入が意図される。

オプトジェネティクス遺伝子療法は、網膜変性に起因する失明の治療のために利用され得る最も有望な認められつつある技術の一つである。オプトジェネティクス治療の進行中の臨床試験は、光感受性を網膜に再導入するため、チャネルロドプシンを有する網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を非特異的に標的とする。将来的には、細胞適合性の次世代オプトジェネティクス遺伝子療法は、これらの非特異的治療法に対する優位性を立証することになる。これらの次世代治療法は、新規且つ有効なオプトジェネティクスツールを網膜の特定の細胞型に送達するため、細胞型に特異的なプロモーターを利用する。細胞型標的の中で最も有望なものは、天然にＰＲからの直接入力を受け取る網膜の第１の介在ニューロンの網膜双極細胞（ＢＣ）である。ＢＣは、ＯＮ型及びＯＦＦ型ＢＣに分かれ、各々、光の増大又は減衰のいずれかに応答し、ｍＧｌｕＲ６又はＡＭＰＡ／カイニン酸グルタミン酸受容体のいずれかを発現する。ＯＮ双極細胞（ＯＢＣ）は、特に遺伝子療法における興味深い標的である。ＮＹＸ、ＧＲＭ６、ＧＰＲ１７９又はＴＲＰＭ１などのＯＢＣに特異的な遺伝子における突然変異は、これらの遺伝子がｍＧｌｕＲ６シグナル伝達カスケードに関与し、ＯＢＣが結果的に非機能的になることから、全てが全盲（先天性停止性夜盲症）を引き起こす。より最近では、ＯＢＣにおけるオプトジェネティクスタンパク質の発現が、変性の後期を患っている光受容体変性マウスモデルにおいて視力を回復させることが判明している。チャネルロドプシン２（Ｌａｇａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００８．１１：ｐ．６６７－６７５）、ロドプシン（Ｃｅｈａｊｉｃ－Ｋａｐｅｔａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ２０１５．２５：ｐ．２１１１－２１２２）及びキメラＯｐｔｏ－ｍＧｌｕＲ６（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ２０１５．１３：ｐ．ｅ１００２１４３）が、盲目マウスのＯＢＣにおいて十分に発現されており、網膜、皮膚及び行動レベルで機能的視力が回復されている。上記全ての手法において、ＯＢＣ型は、特に網膜コードを破壊するオフターゲット細胞からの厄介なシグナル伝達を回避するためのオプトジェネティクス手法の場合、特異的に標的化される必要がある。さらに、特異的なＯＢＣの標的化は、より少ない、ひいてはより安全なＡＡＶ投与も可能にする。これまで、機能的なＯＢＣに特異的なプロモーターの欠如は、ＯＢＣ標的化遺伝子療法の臨床適用を妨げた。

短いエンハンサープロモーター配列は、典型的にはＡＡＶに基づく遺伝子療法と組み合わせたＯＢＣに特異的な標的化を達成するための分野において利用された。これは、ＡＡＶのパッケージング能力が４．７ｋｂに制限され、典型的には長さが数ｋｂの内因性プロモーターに適応しないためである。この点で、網膜のＯＢＣにおいて排他的に発現される、ＯＢＣに特異的なｍＧｌｕＲ６グルタミン酸受容体に由来するエンハンサープロモーター配列は、最も良好であることが判明している。最近になるまで、マウスＧｒｍ６遺伝子に由来し、ＳＶ４０ウイルスコアプロモーターと組み合わせた２００ｂｐ長のエンハンサー配列（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００８．２８：ｐ．７７４８－７７６４．）は、２００Ｅｎ－ＳＶ４０と略称されており、標準的に使用された。しかし、発明者は最近、その変異体として、四重のエンハンサー配列を保有する、４×２００Ｅｎ－ＳＶ４０（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０１４．６：ｐ．１１７５－１１９０）が、進行性網膜変性においてＯＢＣに特異的でもなく機能的でもないことを示した（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１７．１１：ｐ．１６１）。より最近では、全体的にマウスＧｒｍ６遺伝子に基づく短いエンハンサー／プロモーターが、比較的良好なＯＢＣ特異性で野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス網膜において発現するように設計された（２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐ）（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１６．２３：ｐ．６８０－９．）。にもかかわらず、変性した網膜のＯＢＣにおける発現は示されず、発現は桿体型ＯＢＣにおいてほぼ排他的に駆動された。したがって、専ら（ヒトを含む）中心窩動物の網膜の網膜黄斑に見出され、そして高い色視覚を媒介する中心窩錐体につながっている錐体型ＯＢＣは、２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐにより実質的に標的化されず、このプロモーターをヒトの高い中心視力の回復に適合化しない。さらに、ヒトＧＲＭ６遺伝子に基づくプロモーターは、遺伝子発現、即ち機能を媒介するが細胞傷害性を誘導しないタンパク質レベルの発現を調節するヒトトランスクリプトーム機構により完全に制御されることから、有利である。

上記最新技術に基づき、本発明の目的は、新規な合成ＯＢＣに特異的なヒトプロモーターを供するための手段及び方法を提供することである。この目的は、本明細書の独立クレームの主題によって達成される。

本発明の第１の態様は、
ａ．配列番号１～６から選択されるエンハンサー配列エレメント、及び
ｂ．配列番号７～１０から選択されるプロモーター配列エレメント
を含む、８５０塩基対（ｂｐ）～１５００ｂｐの長さの単離核酸分子に関する。

本発明の第１の態様の代替は、
ａ．配列番号１及び２から選択される配列に対して、少なくとも（≧）７０％、特には≧７５％、より特には≧８０％、より特には≧８５％、より特には≧９０％、より特には≧９５％、さらにより特には≧９８％、最も特には１００％同一であるエンハンサー配列エレメント；及び
ｂ．配列番号７の配列に対して、≧７０％、特には≧７５％、より特には≧８０％、より特には≧８５％、より特には≧９０％、より特には≧９５％、さらにより特には≧９８％、最も特には１００％同一であるプロモーター配列エレメント
を含み、
且つ単離核酸分子は、配列番号１３の配列から、≧４０％、特には≧５０％、より特には≧６０％、さらにより特には≧７０％、より特には≧８０％、さらにより特には≧９０％、最も特には１００％の錐体ＯＮ双極細胞の特異性、及び≧２０％、特には≧２５％、より特には≧３０％、さらにより特には≧３５％、より特には≧４０％、最も特には≧５０％の錐体ＯＮ双極細胞の選択性を有する、８５０塩基対（ｂｐ）～１５００ｂｐの長さの単離核酸分子に関する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に従う核酸分子を含む核酸発現ベクターに関する。

本発明の第３の態様は、プロモーターによって駆動される導入遺伝子に関する。

本発明の第４の態様は、第１の態様に従う単離核酸分子、第２の態様に従う核酸発現ベクター又は第３の態様に従う導入遺伝子を含むアデノ随伴ビリオン粒子に関する。

本発明の第５の態様は、薬剤としての使用のための、第１の態様に従う単離核酸分子、第２の態様に従う核酸発現ベクター、第３の態様に従う導入遺伝子及び第４の態様に従うアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤に関する。

本発明の薬剤を含む投与形態は、本発明のさらなる態様である。

用語及び定義
本明細書と関連するＯＢＣという用語は、ＯＮ双極細胞に関する。

本明細書と関連するＲＢＣという用語は、桿体双極細胞に関する。

本明細書と関連するｃＯＢＣという用語は、錐体ＯＮ双極細胞に関する。

本明細書と関連するＲＧＣという用語は、網膜神経節細胞に関する。

本明細書と関連するＰＲという用語は、光受容体に関する。

本明細書と関連するＡＡＶという略語は、アデノ随伴ウイルスに関する。他に述べられる場合を除き、ＡＡＶは、全てのサブタイプ又は血清型及び複製可能な形態と組換え形態の双方を指す。

本明細書と関連するＡＡＶビリオン及びＡＡＶウイルス粒子という用語は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成核酸からなるウイルス粒子に関する。

特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学の場合）。分子的、遺伝的及び生化学的方法（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）並びに化学的方法の場合、標準技術が使用される。

本明細書と関連するＡＡＶカプシドという用語は、合成カプシド（ｃａｐ）遺伝子に関する。本明細書で開示されるＡＡＶカプシドは、遺伝子療法における組換えアデノ随伴ウイルスをパッケージングするため、使用されてもよい。

本明細書と関連する相同性という用語は、それらの配列の大部分を共有するが、核酸又はアミノ酸の挿入、欠失又は置換によりいくつかの位置で異なる配列に関する。

本明細書と関連する導入遺伝子という用語は、一方の生物からもう一方の生物に導入されている遺伝子又は遺伝子材料に関する。これに関連して、該用語はまた、遺伝子配列の天然変異体又は生理的に無傷の変異体の、それが欠損している患者の組織への導入を指してもよい。それは、天然コード化配列の導入をさらに指してもよく、その発現は、標的組織内に不在であるか又は発現停止されたプロモーターにより駆動される。導入遺伝子という用語は、本明細書で用いられるとき、損傷又は罹患した網膜において発現されるとき、視力を改善又は回復させるのに有用な場合がある、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。光感受性又は視力の回復を意図した特定目的の導入遺伝子は、光感受性タンパク質、例えばオプシン遺伝子、即ちチャネルロドプシン、脊椎動物オプシン及びそれらの変異体を含む。

本明細書と関連する組換えという用語は、クローニング、制限及び／又はライゲーションの１つ又はいくつかのステップの産物であり、且つ天然に存在する核酸と異なる核酸に関する。組換えウイルス粒子は、組換え核酸を含む。

本明細書と関連する硝子体内投与という用語は、薬剤が眼の硝子体に送達される場合の医薬品、例えばウイルスの投与の経路に関する。硝子体内投与は、硝子体の体液ゲルと称されるゼリー状体液で満たされた、眼の背後における硝子体空洞と称される空間に薬物を直接的に配置するための方法である。

本明細書と関連する網膜下投与という用語は、本明細書との関連では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞と光受容体との間の空間への医薬品、特にウイルスの投与の経路に関する。

本明細書と関連する「ヌクレオチド」という用語は、核酸又は核酸類似体の構成要素であり、それらのオリゴマーは、塩基対合に基づいてＲＮＡ又はＤＮＡオリゴマーと選択的ハイブリッドを形成する能力がある。これに関連するヌクレオチドという用語は、古典的なリボヌクレオチド構成要素のアデノシン、グアノシン、ウリジン（及びリボシルチミン）、シチジン、古典的なデオキシリボヌクレオチドのデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン及びデオキシシチジンを含む。

本明細書と関連する、配列同一性及び配列同一性の百分率という用語は、２つの整列された配列を比較することにより決定された値を指す。比較用の配列の整列化のための方法は、当該技術分野で周知である。比較用の配列の整列化は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のグローバルアライメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の類似性方法のための検索により、又は限定はされないが、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含む、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行により実施されてもよい。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に利用可能である。

核酸配列の比較のための１つのかかる例は、デフォルト設定：期待閾値：１０；ワードサイズ：２８；クエリー範囲内の最大マッチ：０；マッチ／ミスマッチスコア：１．－２；ギャップコスト：線形を使用するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムである。特に断りのない限り、本明細書に提供される配列同一性値は、プログラムのＢＬＡＳＴスイーツ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を用いて、タンパク質及び核酸比較用の上で同定されたデフォルトパラメータを各々用いて得られた値を指す。

本明細書と関連する上流という用語は、５’末端方向を指す。エンハンサー及びプロモーター配列の場合、一本鎖配列は、本願中で与えられ、エンハンサーがプロモーターの上流であるとき、これはエンハンサーがプロモーターの５’方向であることを意味する。同様に、下流という用語は、３’末端方向を指す。

本明細書と関連するスペーサー配列という用語は、エンハンサー及びプロモーターを接続し、一本鎖核酸分子を作製するために使用される可変長の核酸を指す。本明細書で特定される発明を実施するのに有用なリンカーの例示的な実施形態は、１～１０００核酸からなるオリゴ核酸鎖である。

ヒト網膜外植片における錐体ＯＮ双極細胞（ｃＯＢＣ）の特異性は以下のプロトコルを用いて測定される

第１に、プロモーターは、レポーター導入遺伝子ｍＣｉｔｒｉｎｅと組み合わされ、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクターｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）にパッケージングされる（Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ２０１３．５：ｐ．１８９ｒａ７６）。０日目、（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１７．１１：ｐ．１６１）に詳述される通り、約１０^１０ｖｇ（ベクターゲノム）が培養された死後ヒト網膜外植片のＲＧＣ側に添加される。４％ＰＦＡとの培養の７日目、網膜が固定され、その後、凍結保護され（ＰＢＳ中、１０／２０／３０％スクロース）、凍結される。網膜凍結切片が、導入遺伝子ｍＣｉｔｒｉｎｅに対する抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ１１１２２，１：５００）、ユビキタスＯＢＣマーカーＧαｏ（ＥＭＤ，ＭＡＢ３０７３，１：７５０）及びＲＢＣ特異抗体ＰＫＣα（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ８３９３，１：７５０）で三重染色される。発現ＲＢＣが［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、ＰＫＣα（＋）］として同定される一方で、［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、ＰＫＣα（－）、Ｇαｏ（＋）］細胞が発現ｃＯＢＣとして同定される。ｃＯＢＣ型の特異性は、全ての発現ＯＢＣ中の発現ｃＯＢＣの比により決定される：

（Ｎは括弧内に与えられる染色特徴を伴う細胞の数である）

その後、錐体ＯＮ双極細胞の選択性が次のように決定される。

ＲＢＣ及びｃＯＢＣの量は、同一でなく、異なる網膜領域内で異なる。外植片は、ＲＢＣ対ｃＯＢＣの比

が外植片の小領域にわたりほぼ一定である場合、網膜の中間周辺部から作製される。結果として、発現ｃＯＢＣ対発現ＲＢＣの比

は、同様に外植片において一定であると推定可能である。これは、（３）に（４）を掛けることにより、外植片におけるｃＯＢＣ及びＲＢＣの特異的分布を説明する、ＲＢＣに対するｃＯＢＣの選択性比率（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｒａｔｉｏ）のファクター

の計算を可能にする。次に、パーセント単位のｃＯＢＣの選択性が

で計算される。

本明細書で用いられるとき、任意の疾患又は障害（例えば視力喪失）の治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）又は治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、一実施形態では、疾患又は障害の寛解（例えば、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発現を緩徐化し、又は停止させ、又は低減すること）を指す。別の実施形態では、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、少なくとも１つの身体的パラメータ、例えば患者によって識別可能でない場合があるものを軽減又は寛解することを指す。さらに別の実施形態では、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、身体的に、（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に、（例えば、身体的パラメータの安定化）、又は両方のいずれかにより、疾患又は障害を調節することを指す。さらに別の実施形態では、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、外因性の治療的機能を標的細胞型に導入することを指す。疾患の治療及び／又は予防を評価するための方法は、本明細書で以下に特記されない限り、一般に当該技術分野で公知である。

本発明は、マウス及びヒト死後網膜における、２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐと比較して、増強されたＯＢＣの特異性とはるかに増強されたｃＯＢＣ誘導タンパク質発現を有するヒトＧＲＭ６エンハンサープロモーター配列を開示する。本明細書に記載のプロモーターは、修飾代謝型グルタミン酸受容体６（ｍＧｌｕＲ６）プロモーターであって、ＯＢＣ、特にＲＢＣ及びｃＯＢＣに対するｍＧｌｕＲ６タンパク質の発現を駆動する調節エレメントからの配列を有するものからなる。本発明は、ｍＧｌｕＲ６エンハンサー又はその変異体及びｍＧｌｕＲ６プロモーター又はその変異体を含む、単離核酸分子又は核酸発現ベクターを特徴とする。この新規なＧＲＭ６エンハンサープロモーター配列は、ヒト網膜、特にヒト傍中心窩のｃＯＢＣにおいて最初に効率的な導入遺伝子発現を駆動する。さらに、オプトジーン（ｏｐｔｏｇｅｎｅ）と組み合わせた新規なヒトＧＲＭ６エンハンサープロモーター配列（ＭＷＯＰＮ＿ｍＧｌｕＲ６、配列番号１６）は、変性マウス（ｒｄ１，Ｃ３ＨＨｅ／ＯｕＪ）網膜において広範なＯＢＣに特異的な発現を引き起こし、他の盲目の光受容体変性マウスにおいて機能的視力（視運動性反応）を回復させた。新規なヒトＧＲＭ６エンハンサー／プロモーターは、マウス及びヒト網膜において高度に効率的な、広範且つ特異的なＯＢＣの標的化を示した。

本発明の第１の態様は、
ａ．配列番号１～６から選択されるエンハンサー配列エレメント、及び
ｂ．配列番号７～１０から選択されるプロモーター配列エレメント
を含む単離核酸分子に関する。

本発明の第１の態様の代替は、
ａ．配列番号１～６から選択されるエンハンサー配列エレメント、及び
配列番号７～１０から選択されるプロモーター配列エレメント
を含む、８５０塩基対（ｂｐ）～１５００ｂｐの長さの単離核酸分子に関する。

本発明の第１の態様の別の代替は、
ａ．配列番号１及び２から選択される配列に対して、≧７０％、特には≧７５％、より特には≧８０％、より特には≧８５％、より特には≧９０％、より特には≧９５％、さらにより特には≧９８％、最も特には１００％同一であるエンハンサー配列エレメント；及び
ｂ．配列番号７の配列に対して、≧７０％、特には≧７５％、より特には≧８０％、より特には≧８５％、より特には≧９０％、より特には≧９５％、さらにより特には≧９８％、最も特には１００％同一であるプロモーター配列エレメント；
を含み、
且つ単離核酸分子は、配列番号１３の配列から、≧４０％、特には≧５０％、より特には≧６０％、さらにより特には≧７０％、より特には≧８０％、さらにより特には≧９０％、最も特には１００％の錐体ＯＮ双極細胞の特異性、及び≧２０％、特には≧２５％、より特には≧３０％、さらにより特には≧３５％、より特には≧４０％、最も特には≧５０％の錐体ＯＮ双極細胞の選択性を有する、単離核酸分子に関する。

本発明の第１の態様の別の代替は、
ａ．配列番号１及び２から選択される配列に対して、≧７０％、特には≧７５％、より特には≧８０％、より特には≧８５％、より特には≧９０％、より特には≧９５％、さらにより特には≧９８％、最も特には１００％同一であるエンハンサー配列エレメント；及び
ｂ．配列番号７の配列に対して、≧７０％、特には≧７５％、より特には≧８０％、より特には≧８５％、より特には≧９０％、より特には≧９５％、さらにより特には≧９８％、最も特には１００％同一であるプロモーター配列エレメント；
を含み、
且つ単離核酸分子は、配列番号１３の配列から、≧４０％、特には≧５０％、より特には≧６０％、さらにより特には≧７０％、より特には≧８０％、さらにより特には≧９０％、最も特には１００％の錐体ＯＮ双極細胞の特異性、及び≧２０％、特には≧２５％、より特には≧３０％、さらにより特には≧３５％、より特には≧４０％、最も特には≧５０％の錐体ＯＮ双極細胞の選択性を有する、８５０塩基対（ｂｐ）～１５００ｂｐの長さの単離核酸分子に関する。

ｃＯＢＣの特異性及びｃＯＢＣの発現レベルは、上記のように測定される。

発明者は、配列番号１又は２と配列番号７との組み合わせが、高い錐体ＯＮ双極細胞の特異性及び高い錐体ＯＮ双極細胞の発現レベルをもたらすことを示している。当業者は、本発明の開示に基づき、等しい錐体ＯＮ双極細胞の特異性及び錐体ＯＮ双極細胞の発現レベルと類似した配列を見出すことができる。

特定の実施形態では、エンハンサー配列エレメントは、プロモーター配列エレメントの上流である。

特定の実施形態では、単離核酸分子は、１～１０００塩基対、特に１～３９４塩基対の長さのスペーサー配列をさらに含む。特定の実施形態では、スペーサーは、エンハンサーとプロモーターとの間に位置する。特定の実施形態では、単離核酸分子は、１～１０００塩基対、特に１～３９４塩基対の長さのスペーサー配列をさらに含み、スペーサーは、エンハンサーとプロモーターとの間に位置する。

特定の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号１１～配列番号１５から選択される配列を含む。

特定の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号１１又は配列番号１３の配列を含む。

本発明の第２の態様は、第１の態様に従う核酸分子を含む核酸発現ベクターに関する。

特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスゲノムである。

特定の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター又は組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）である。

特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、一本鎖ベクター（ｓｓＡＡＶ）又は自己相補的ベクター（ｓｃＡＡＶ）のいずれかである。

特定の実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、又はＡＡＶ１２ベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶ２ベクターである。

特定の実施形態では、核酸発現ベクターは、
ａ．カプシドタンパク質をコードする配列、及び
ｂ．導入遺伝子
をさらに含む。

５’末端から３’末端にかけて、単離核酸分子は、最初にエンハンサー、次に任意選択的にスペーサーと次にプロモーターを含む。導入遺伝子は、プロモーターの３’方向に位置する。特定の実施形態では、導入遺伝子は、最適化されたＫＯＺＡＫ配列に先行される。

ＫＯＺＡＫ配列は、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＡｃｃＡＵＧＧ（配列番号２４）又は（ｇｃｃ）ｇｃｃＧｃｃＡＵＧＧ（配列番号２５）を有し、翻訳の開始において重要である。

特定の実施形態では、核酸発現ベクターは、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）調節配列も含む。ＷＰＲＥは、転写されるとき、発現を増強する三次構造を作成するＤＮＡ配列である。特定の実施形態では、核酸発現ベクターは、導入遺伝子の下流に挿入されるポリＡテールも含む。ポリＡテールは、導入遺伝子の翻訳を促進する。

特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２（７ｍ８）又はＡＡＶ８（ＢＰ２）である。

本発明の第３の態様は、プロモーターによって駆動される導入遺伝子に関する。

特定の実施形態では、導入遺伝子は、先天性停止性夜盲症における光感受性又は視力を回復するためのＮＹＸ、ＧＲＭ６、ＧＰＲ１７９又はＴＲＰＭ１である。

特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１６の配列を含むか又は本質的にそれからなる。

特定の実施形態では、導入遺伝子は、光検出又は視力を回復させるオプシン遺伝子である。

特定の実施形態では、オプシン遺伝子は、チャネルロドプシン、メラノプシン、ロドプシン、錐体オプシン、松果体オプシン、フォトプシン、ハロロドプシン、細菌ロドプシン、プロテオロドプシン、クラゲオプシン、ハエトリグモオプシン又はそれらの任意の機能的変異体若しくは断片からなる群から選択される。

特定の実施形態では、オプシン遺伝子は、オプシンと網膜ＯＢＣの代謝型グルタミン酸受容体ｍＧｌｕＲ６との間のキメラタンパク質である。

特定の実施形態では、キメラタンパク質は、Ｏｐｔｏ－ｍＧｌｕＲ６である。

特定の実施形態では、キメラタンパク質は、マウス又はヒトＭＷＯＰＮ＿ｍＧｌｕＲ６（配列番号１６）である。

本発明の第４の態様は、第１の態様に従う単離核酸分子又は第２の態様に従う核酸発現ベクターを含むアデノ随伴ビリオン粒子に関する。

本発明の第５の態様は、薬剤としての使用のための、第１の態様に従う単離核酸分子又は第２の態様に従う核酸発現ベクター、並びに第３及び第４の態様に従うアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤に関する。

さらなる態様は、網膜双極細胞を冒す病態の治療における使用のための、第１の態様に従う単離核酸分子、第２の態様に従う核酸発現ベクター、第３の態様に従う導入遺伝子及び第４の態様に従うアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤に関する。

さらなる態様は、先天性停止性夜盲症又は桿体錐体ジストロフィー及び錐体桿体ジストロフィー、特に網膜色素変性症及び黄斑変性症の治療における使用のための、第１の態様に従う単離核酸分子、第２の態様に従う核酸発現ベクター、第３の態様に従う導入遺伝子及び第４の態様に従うアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤に関する。

さらなる態様は、第１の態様に従う単離核酸分子、第２の態様に従う核酸発現ベクター、第３の態様に従う導入遺伝子及び第４の態様に従うアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤に関し、薬剤は、
ａ．硝子体内投与、特に硝子体内注射、又は
ｂ．網膜下注射
により投与される。

さらなる態様は、本発明の薬剤を、それを必要とする患者に投与する治療方法に関する。

例えばプロモーター配列又は医学的適応などの単一の分離可能な特徴における代替が本明細書中で「実施形態」として展開される場合は常に、かかる代替が本明細書で開示される本発明の別々の実施形態を形成するように自由に組み合わせられてもよいことは理解されるべきである。したがって、プロモーター配列についての他の実施形態のいずれかは、ＯＢＣ機能を損なわせる任意の医学的適応、及び任意のＤＮＡ送達媒体又は方法、例えば遺伝子銃又はエレクトロポレーションを使用することによる、代替的なウイルス、ナノ粒子、リポソーム又は「ネイキッド」ＤＮＡの送達と組み合わせられてもよい。

本明細書に記載の方法から利益を得ることがある網膜疾患の非限定的リストとして、先天性夜盲症、黄斑変性症、加齢性黄斑変性症、先天性錐体ジストロフィー及び網膜色素変性症（ＲＰ）関連障害の大群が挙げられる。

項目
１．ａ．配列番号１～６から選択されるエンハンサー配列エレメント、及び
ｂ．配列番号７～１０から選択されるプロモーター配列エレメント
を含む、８５０塩基対（ｂｐ）～１５００ｂｐの長さの単離核酸分子。
２．ａ．配列番号１及び２から選択される配列に対して、少なくとも（≧）７０％、特には≧７５％、≧８０％、より特には≧８５％、より特には≧９０％、より特には≧９５％、さらにより特には≧９８％、最も特には１００％同一であるエンハンサー配列エレメント；及び
ｂ．配列番号７の配列に対して、≧７０％、特には≧７５％、より特には≧８０％、より特には≧８５％、より特には≧９０％、より特には≧９５％、さらにより特には≧９８％、最も特には１００％同一であるプロモーター配列エレメント
を含み、
且つ単離核酸分子は、配列番号１３の配列から、≧４０％、特には≧５０％、より特には≧６０％、さらにより特には≧７０％、より特には≧８０％、さらにより特には≧９０％、最も特には１００％の錐体ＯＮ双極細胞の特異性、及び≧２０％、特には≧２５％、より特には≧３０％、さらにより特には≧３５％、より特には≧４０％、最も特には≧５０％の錐体ＯＮ双極細胞の選択性を有する、８５０塩基対（ｂｐ）～１５００ｂｐの長さの単離核酸分子。
３．前記エンハンサー配列エレメントの１つ及び１つのみ、前記プロモーター配列エレメントの１つ及び１つのみ、また任意選択的にはエンハンサー配列エレメントをプロモーター配列エレメントから分離するスペーサーからなる、項目１又は２に従う単離核酸分子。
４．配列番号１１～配列番号１５から選択される配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号１１～配列番号１５から選択される配列に対する≧９８％の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、項目１～３のいずれか一項に従う単離核酸分子。
５．配列番号１１若しくは配列番号１３の配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号１１若しくは配列番号１３に対する≧９８％の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、特に配列番号１３の配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号１３に対する≧９８％の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、項目１～４のいずれか一項に従う単離核酸分子。
６．項目１～５のいずれか一項に従う核酸分子を含む核酸発現ベクター。
７．アデノ随伴ウイルスベクター又は組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）である、特に組換えＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、又はＡＡＶ１２ベクターである、より特には組換えＡＡＶ２ベクターである、項目６に従う核酸発現ベクター。
８．ａ．カプシドタンパク質をコードする配列、及び
ｂ．導入遺伝子
をさらに含む、項目６～７のいずれか一項に従う核酸発現ベクター。
９．導入遺伝子が配列番号１６の配列を含む、項目８に従う核酸発現ベクター。
１０．項目１～５のいずれか一項に従う単離核酸分子又は項目６～９のいずれか一項に従う核酸発現ベクターを含むアデノ随伴ビリオン粒子。
１１．薬剤としての使用のための、項目１～５のいずれか一項に従う単離核酸分子又は項目６～９のいずれか一項に従う核酸発現ベクター、及び項目１０に従うアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤。
１２．網膜双極細胞を冒す病態の治療、特に先天性停止性夜盲症（ＣＳＢＮ１）又は桿体錐体ジストロフィー及び錐体桿体ジストロフィー、より特には網膜色素変性症及び黄斑変性症の治療における使用のための、項目１～５のいずれか一項に従う単離核酸分子、項目６～９のいずれか一項に従う核酸発現ベクター、及び項目１０に従うアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤。
１３．項目１～５のいずれか一項に従う単離核酸分子、項目６～９のいずれか一項に従う核酸発現ベクター、及び項目１０に従うアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤であって、
ａ．硝子体内投与、特に硝子体内注射、又は
ｂ．網膜下注射
により投与される薬剤。

本発明は、さらなる実施形態及び利点を導くことができる、以下の実施例及び図面によりさらに例示される。これらの実施例は、本発明を例示するが、その範囲を限定しないことが意図される。

図１：プロモーター設計用に選択されたヒトＧＲＭ６配列のゲノムブラウザ図。（Ａ）マウスＧｒｍ６とヒトＧＲＭ６との間の３１０ｂｐの保存領域（水平ストライプ状）及びＫｉｍのマウス２００Ｅｎ（Ｇｒｍ６）に対する１８８ｂｐのシンテニー領域（水平ストライプ状及び影付きセクション）を含む３つの選択されたエンハンサーエレメントを示す、（翻訳開始部位（ＴＬＳＳ）まで約－１４ｋｂ ｒｅｌ．に位置する）ヒトＧＲＭ６の遠位エンハンサー領域。（Ｂ）転写開始部位（ＴＳＳ）及び翻訳開始部位（ＴＬＳＳ）（後者は発明者により０位と定義される）を含む、ヒトＧＲＭ６のプロモーター配列。選択された２つのプロモーターも示され、マウス及びヒト遺伝子間の１６７ｂｐの保存領域が水平ストライプ状セクションによって示される。グラフは、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／のＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒからダウンロードされ、修飾された。灰色影付きストレッチは、転写因子結合部位、種間保存領域（Ｖｅｒｔ．Ｃｏｎｓ）及びＤｎａｓｅ高感受性クラスター（Ｄｎａｓｅクラスター）を含む、潜在的に関連するシス調節領域を図示する。加えて、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ Ｍａｒｋシグナルピーク及びＣｈｉｐ－ｓｅｑピークの追跡についても検討された。 （上記の通り。） 死後ヒト網膜外植片のＯＢＣにおけるプロモーター駆動性のｍＣｉｔｒｉｎｅ発現強度。ヒト網膜外植片に、ｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）－４０７Ｅｎ＿５６６Ｐ（ｈＧＲＭ６）－ｍＣｉｔｒｉｎｅ（ｎ＝３）、ｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）－４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）－ｍＣｉｔｒｉｎｅ（ｎ＝３）、ｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）－７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）－ｍＣｉｔｒｉｎｅ（ｎ＝５）、ｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）－４０７Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）－ｍＣｉｔｒｉｎｅ（ｎ＝３）及びｓｃＡＡＶ（７ｍ８）－２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐ－ｍＣｉｔｒｉｎｅ（ｎ＝４）が形質導入された。ｍＣｉｔｒｉｎｅは、免疫組織化学的に標識され、発現ＯＮ双極細胞内での蛍光強度が導入遺伝子発現強度の測定として決定された。５６６Ｐのプロモーターエレメントは、プロモーターの４５４Ｐの近位エレメントとの組み合わせと比較して、ＯＢＣ内でのはるかに弱いｍＣｉｔｒｉｎｅ発現を媒介した。それ故、４５４Ｐは、全ての後続実験において選択された。７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）（Ｆ＝５．４２±０．９；平均±標準偏差）及び４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）（Ｆ＝５．５９±０．５１；平均±標準偏差）は、導入遺伝子発現強度の観点で十分に等しく、またマウスゲノム由来の２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐ（Ｆ＝３．９４±０．４５；平均±標準偏差）よりも有意に良好に実施された。^＊はＰ≦０．０５を表し、^＊＊はＰ≦０．０１を表し、^＊＊＊はＰ≦０．００１を表し、ｎ．ｓ．は非有意差を表す（チューキーの正確な有意性検定を伴う一元配置分散分析）。 ヒト網膜外植片中の錐体ＯＮ双極細胞（ｃＯＢＣ）におけるプロモーター特異性。ヒト網膜外植片に、ｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）－４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）－ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）－７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）－ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）－４０７Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）－ｍＣｉｔｒｉｎｅ又はｓｃＡＡＶ（７ｍ８）－２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐ－ｍＣｉｔｒｉｎｅが形質導入された。垂直な凍結切片がｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＰＫＣα（桿体双極細胞（ＲＢＣ）の場合及びＧα０（ＯＢＣに対するユビキタスマーカー）に対して標識され、ｍＣｉｔｒｉｎｅ発現細胞が計数された。（Ａ）細胞計数から、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）は、２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐよりも有意に多いｃＯＢＣにおける発現を駆動した。（Ｂ）標的のｃＯＢＣ及びＲＢＣの量を計数された特定の網膜領域内のそれらの総数に正規化することで、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）及び４０７Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）がｃＯＢＣ内で、ＲＢＣにおいて明らかな選択性を有する２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐよりもはるかに効率的に発現を駆動することが可視化される。７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）は、ｃＯＢＣのみが存在する場合の中心窩の遺伝子療法において重要な特徴である、ｃＯＢＣ及びＲＢＣにおける各々５０％の等しい選択性をさらに示す。（Ｃ）プロモーター４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）（ｎ＝５）のｃＯＢＣ型の選択性は、プロモーター７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）の場合と有意には異ならなかった。平均±標準偏差が示され、^＊はＰ≦０．０５を表し、^＊＊はＰ≦０．０１を表す（チューキーの正確な有意性検定を伴う一元配置分散分析）。有意差のみが示される。 ヒト網膜外植片における７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）駆動性のｍＣｉｔｒｉｎｅ発現のＯＢＣ発現の有効性及び特異性。（Ａ）ｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）にパッケージングされるとき、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）駆動性のｍＣｉｔｒｉｎｅ発現を２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐ駆動性のｍＣｉｔｒｉｎｅ発現と比較する。７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）は、２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐと比較してはるかに高いＯＢＣの選択性を示し、後者はアマクリン細胞における有意により高いオフターゲット発現をさらに有する。特定の細胞型の発現細胞の％が平均±標準偏差として示され、^＊＊はＰ≦０．０１を表し、^＊＊＊はＰ≦０．００１を表す（スチューデントｔ検定）。 プロモーター７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）は変性ｒｄ１マウス網膜において導入遺伝子発現を確実且つ広範に駆動する。２２週齢のｒｄ１マウスに、導入遺伝子ＭＷＯＰＮ＿ｍＧｌｕＲ６＿ＩＲＥＳ２＿ＴｕｒｂｏＦＰ６３５（配列番号１６、プラスミドマップの図９）を保有する３×１０^９ｖｇのＡＡＶが注射された。Ａ～Ｄにおける略図は、網膜ホールマウント内の形質導入された網膜領域を灰色で表す。Ａ）２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐと組み合わされたｓｓＡＡＶ２（７ｍ８）はまた、ｒｄ１網膜内で発現するが、（４×Ｇｒｍ６－ＳＶ４０と対照的に）限定された領域内に限られる。Ｂ）７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）と組み合わされたｓｓＡＡＶ（７ｍ８）は、おそらくは変性に起因するＧｒｍ６の下方制御が生じているときの発現における閾値を克服する増強された発現強度に起因し、２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐと比較して、変性した網膜のより大規模且つ広範な形質導入をもたらす。Ｃ）（略図Ｂに表される）ＴｕｒｂｏＦＰ６３５が免疫細胞化学的に標識された場合の、ＯＫＲ検査を受けているｒｄ１マウスからの治療された網膜の網膜ホールマウントのレーザー走査顕微鏡写真例（実施例７及び図６を参照）。（Ｄ）ｒｄ１の変性した網膜における平均発現特異性（発現する全細胞の発現ＯＢＣの％、６６．６±８．５％）及び効率（全ＯＢＣの発現ＯＢＣの％、５４．７±８．３）。平均±標準偏差、Ｎ＝９（スチューデントｔ検定）。 ｓｓＡＡＶ（７ｍ８）－ＭＷＯＰＮ＿ｍＧｌｕＲ６＿ＩＲＥＳ２＿ＴｕｒｂｏＦＰ６３５で硝子体内及び両側治療された、完全に光受容体が減少した２２週齢のｒｄ１マウスにおける視運動性反射により測定された視力回復。視力は、形質導入から４１、４７、５５、８２及び１１２日後、実質的な視運動系において視運動性反応がさらに誘発されるときの空間的頻度の閾値を決定することにより測定された。治療マウス（ｎ＝３）は、非注射対照ｒｄ１同腹仔（ｎ＝７）と比較して視力の有意な増加を示したが、依然として野生型対照マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ｎ＝１０）よりも有意に低い視力を有した。（全ての試験及び個体にわたる）平均±標準偏差が示され、^＊＊はＰ≦０．０１を表し、^＊＊＊はＰ≦０．００１を表す（スチューデントｔ検定）。 プロモーター７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）による外植されたヒト網膜黄斑のｃＯＢＣにおける高度に効率的なｍＣｉｔｒｉｎｅ発現。ｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）－７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）－ｍＣｉｔｒｉｎｅが形質導入され、導入遺伝子ｍＣｉｔｒｉｎｅに対して、またＯＢＣ（Ｇαｏ）及び細胞核（ＤＡＰＩ）について免疫組織化学的に標識されたヒト網膜黄斑の外植片の例。（Ａ）は、ヒト網膜黄斑並びにＢ及びＣにおける顕微鏡写真が撮影された領域の略図である。小窩は、それらの細胞体が光が光受容体への回折を伴わずに通過するように押しのけられることから、Ｍ－及びＬ－錐体光受容体のみを有し、ＯＢＣもＲＧＣも有しない。中心窩は、錐体（Ｍ、Ｌ及びＳ）のみを有し、各錐体が１つのＢＰＣ及び１つのＲＧＣに接続された、微小系を伴う最高視力の領域である。（Ｂ）は、傍中心窩を通る切片であり、ＤＡＰＩ（上の顕微鏡写真）は、光受容体（ＯＮＬ）、ＢＰＣ及びアマクリン細胞（ＩＮＬ）の透明層形成及び網膜黄斑を意味するＲＧＣの三次元層（ＧＣＬ）形成を示す。下の顕微鏡写真は、専ら導入遺伝子の標識を示し、それは専らＯＢＣが位置するＩＮＬにおけるｍＣｉｔｒｉｎｅ発現を意味する。（Ｃ）は、中心窩を通る切片を示す。左側の顕微鏡写真は、単独でＯＢＣのＧαｏ標識を示し、全てがＰＫＣ標識がなく（ここでは示されない）、それ故、ｃＯＢＣとして明確に同定される。右側の顕微鏡写真は、細胞質内部でのｍＣｉｔｒｉｎｅの標識をさらに表し、それは中心窩の実質的にそれぞれのｃＯＢＣがｍＣｉｔｒｉｎｅ（矢頭）を発現していることを示す。これは、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）が、ｃＯＢＣ、特にヒト網膜黄斑のｃＯＢＣにおける良好な発現を駆動し、それ故、ヒト患者における高度な視力回復にとって十分に適していることの非常に明確な証拠である。 新規な７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター下、錐体オプシン及びｍＧｌｕＲ６キメラ光遺伝学タンパク質ＭＷＯＰＮ＿ｍＧｌｕＲ６－ＩＲＥＳ２－ＴｕｒｂｏＦＰ６３５をコードするＡＡＶプラスミドのプラスミドマップ。ＴｕｒｂｏＦＰ６３５は、発現の同定のための赤色蛍光タンパク質マーカーであり、ＷＰＲＥ及びＢＧＨｐＡは調節配列であり、５’及び３’ＩＴＲ（内部リピート）は（ＩＴＲ間における）導入遺伝子をカプシドにパッケージングするためのＡＡＶ機構によって用いられる領域である。このプラスミドは、ｒｄ１変性マウス網膜の形質導入に使用された（図面及び実施例５及び６）。クローニング用のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎプライマーについても示される。 ヒト網膜外植片中でｍＣｉｔｒｉｎｅ発現を駆動する７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）及び４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）のＯＢＣ発現の特異性及び有効性の例。ｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）－７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）－ｍＣｉｔｒｉｎｅ（Ａ）及びｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）－４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）－ｍＣｉｔｒｉｎｅ（Ｂ）の各々が形質導入されたヒト網膜外植片による垂直な凍結切片。凍結切片は、核染色ＤＡＰＩで標識され（灰色、配向性については顕微鏡写真の左端に限り示される）、そして導入遺伝子ｍＣｉｔｒｉｎｅマーカーに対して標識された（白色）。７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）は８５．２％±１２．３％（ｎ＝４）、また４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）は８７．９％±６．５％（ｎ＝５）のＯＢＣ有効性（ＩＮＬにおける明るい細胞のパーセント）を有する。ＯＮＬは外核層、ＩＮＬは内核層、ＧＣＬは神経節細胞層である。双極細胞は、末梢ＩＮＬに位置する。

実施例
実施例１：ｒｄ１マウスモデルにおけるＧｒｍ６遺伝子発現変化の分析
発明者は、プロモーター設計のための鋳型として、網膜のＯＮ双極細胞（ＯＢＣ）内で選択的に発現される代謝型グルタミン酸受容体６（ｍＧｌｕＲ６）をコードする遺伝子（マウスにおけるＧｒｍ６及びヒトにおけるＧＲＭ６）を選択した。これは、ｍＧｌｕＲ６の発現がＯＢＣに対して選択的であるからであり、それは最近、成体マウス網膜の単一細胞トランスクリプトーム解析により確認され（Ｓｉｅｇｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１２．１５：ｐ．４８７－９５）、また全長Ｇｒｍ６プロモーターが特に網膜ＯＢＣ内で導入遺伝子発現を駆動する場合での、以前に発明者によって作製されたトランスジェニックマウス株において非常に明白であった（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｂｉｏｌ ２０１５．１３：ｐ．ｅ１００２１４３）。さらに、マウスＧｒｍ６遺伝子に由来する短いプロモーターバージョンが巧みに構築され、ＯＢＣにおける優先的発現を駆動することが示されている（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０１４．６（９）：ｐ．１１７５－１１９０；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００８．２８：ｐ．７７４８－７７６４；Ｌａｇａｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００８．１１ｐ：６６７－６７５）。Ｋｉｍらは、野生型マウス網膜におけるＯＢＣに特異的な発現を増強する、マウスＧｒｍ６遺伝子のプロモーター内の２００ｂｐの遠位エンハンサー配列を最初に選択した。このエンハンサー配列は、後に４×ＧＲＭ６－ＳＶ４０プロモーターにおいて利用された［Ｃｒｏｎｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０１４．６（９）：ｐ．１１７５－１１９０］が、それはタンデム型のこれらの２００ｂｐのエンハンサー配列の４つを有する。しかし、発明者は最近、４×ＧＲＭ６－ＳＶ４０プロモーター［Ｃｒｏｎｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０１４．６（９）：ｐ．１１７５－１１９０］が、たとえ遺伝子療法が光受容体変性完了前の３．５週齢時に実施されたときであっても、変性ｒｄ１（Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕ）マウス網膜において完全に下方制御されることを示した（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１７．１１：ｐ．１６１）。これにより、４×ＧＲＭ６－ＳＶ４０（及びＧＲＭ６－ＳＶ４０同様）が変性した網膜の治療に適しないようになる。さらに、ＳＶ４０基本ウイルスプロモーターは、細胞の細胞傷害性をもたらす慢性的活性化及びタンパク質過剰発現の下での発現抑制などの問題を被る。より適したＯＢＣに特異的なプロモーターを設計するため、発明者は、Ｇｒｍ６の発現がｒｄ１変性マウスモデルにおける変性プロセス中に上方制御され続けるか否かを最初に検討した。発明者は、この重度且つ迅速な変性モデルにおけるプロモーター活性が大部分の大して重症でない網膜の変性疾患において活性がある可能性が高いという理論的根拠の下で、ｒｄ１マウスモデルを利用した。これは以前に発明者により例示され、４×ＧＲＭ６－ＳＶ４０がいくつかの発現を依然として駆動することができる場合、より緩徐に変性するｒｄ１０（Ｂ６．ＣＸＢ１－Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０）マウスモデルにおける導入遺伝子発現と比較された［ｖａｎ Ｗｙｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１７．１１（１６１）：ｐ．１６１．］。発明者は、ｒｄ１マウス網膜におけるＧｒｍ６遺伝子発現を、Ｐ１４、Ｐ２１、Ｐ２８及びＰ５４の時点でのリアルタイム定量ＰＣＲにより定量化し、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス網膜と発現レベルを比較した。リボソームタンパク質Ｌ８（Ｒｐｌ８）の発現を発現レベルの正規化のために使用した。Ｇｒｍ６の発現は、変性中、Ｐ２１とＰ２８の間でのわずかな下方制御（０．５９倍）を除いては一定を維持した（Ｐ＝０．８７９５）。これから、発明者は、４×ＧＲＭ６－ＳＶ４０プロモーターにおいて認められた著しい下方制御［ｖａｎ Ｗｙｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１７．１１（１６１）：ｐ．１６１．］が、Ｇｒｍ６エンハンサーエレメントの下方制御に起因する可能性は低く、おそらくは変性が進行したＳＶ４０基本プロモーターの機能性低下の結果であると結論づけた。結果的に、Ｇｒｍ６遺伝子は、発明者によりＯＢＣに特異的なプロモーター設計のための鋳型として使用された。

実施例２：ＧＲＭ６に基づくプロモーターの設計
ヒトの治療法における将来的使用の観点からヒト転写機構に適合させるため、発明者は、鋳型として、マウスＧｒｍ６配列ではなく、ヒトＧＲＭ６配列を使用した。

発明者は、「やや類似する」配列について最適化されたＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ，ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）（ｂｌａｓｔｎ）［Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９０．２１５（３）：ｐ．４０３－１０；Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｏｒｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１８．４６（Ｄ１）：ｐ．Ｄ８－Ｄ１３］を使用し、マウスＧｒｍ６及びヒトＧＲＭ６遺伝子配列を整列した。エンハンサーの仕様においては、発明者は、Ｋｉｍらによって同定されたマウス２００Ｅｎエンハンサー配列［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００８．２８（３１）：ｐ．７７４８－６４．］辺りの１５００ｂｐを整列させた。発明者は、マウス及びヒトゲノム間に、３’及び５’の両方向においてＫｉｍらによって定義された２００Ｅｎ配列を越えて伸びている３１０ｂｐ長の保存配列［ＧＲＭ６の翻訳開始部位（ＴＬＳＳ）までの－１３８１９～－１３５１０ｒｅｌ．］を見出した（図１Ａ、水平ストライプ状セクション）。プロモーター配列を同定するため、発明者は、翻訳開始部位（ＴＬＳＳ、発明者により０位に定義された）５’側のＧＲＭ６配列に注目した（図１Ｂ）。整列化後、発明者は、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚのゲノムブラウザ（ＵＣＳＣゲノムブラウザ）［Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｂｉｏｌ，２０１１．９（７）：ｐ．ｅ１００１０９１．］，［Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００２．１２（６）：ｐ．９９６－１００６．；Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ，２０１３．１４（２）：ｐ．１４４－６１．］［ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／；ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｆｅｂ．２００９（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９］を使用し、ＧＲＭ６遺伝子の潜在的な調節配列、例えば、種間保存配列、活性クロマチン領域（ＤｎａｓｅＩ高感受性クラスター又はＨ３Ｋ２７Ａｃ Ｍａｒｋトラック）又は転写因子結合部位を同定した。さらに、クロマチン免疫沈降－ＤＮＡ配列決定（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）ピークを同定するため、遺伝子転写調節データベース（ＧＴＲＤ）［Ｙｅｖｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１７．４５（Ｄ１）：ｐ．Ｄ６１－Ｄ６７］を使用し、実験的に検証された転写因子結合部位を得た。まとめると、この情報により、発明者は、ＧＲＭ６遺伝子発現においておそらくは機能的に重要である、上で同定された領域内の配列に注目することができた。

次に、発明者は、４０７Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）（－１３８７３～－１３４６７ｒｅｌ．ＴＬＳＳ ＧＲＭ６）がマウス及びヒトゲノム間の３００ｂｐの保存配列（図１Ａ中の水平ストライプ状）からなるという理論的根拠に従い、３つの有望なエンハンサー領域［４０７Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）、４４４Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）及び７７０Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）］及び２つの有望なプロモーター領域［５６６Ｐ（ｈＧＲＭ６）及び４５４Ｐ（ＧＲＭ６）］を選択した（図１及び表１）。７７０Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）（－１４２３６～－１３４６７ｒｅｌ．ＴＬＳＳ ＧＲＭ６）は、４０７Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）に加えて、３’ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク及びＤｎａｓｅ高感受性クラスター（－１３９９０～－１３８１６ｒｅｌ．ＴＬＳＳ ＧＲＭ６）も有する。４４４Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）（－１４０３３～－１３５９０ｒｅｌ．ＴＬＳＳ ＧＲＭ６）は、７７０Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）の３’及び５’切断バージョンであり、ＣｈｉＰ－ｓｅｑピークの３’及び５’のみを含む。

ＧＲＭ６の配列－１０００～－１（ｒｅｌ．ＴＬＳＳ）を整列するとき、発明者は、１６７ｂｐの保存領域（－４２５～－２５９ｒｅｌ．ＴＬＳＳ ＧＲＭ６）を同定した（図１Ｂ、図１Ｂ中の水平ストライプ状）。発明者は、この保存配列を含めるとともに、５’転写開始部位（ＴＳＳ、－１７９ｒｅｌ．ＴＬＳＳ ＧＲＭ６）及び５’Ｈ３Ｋ２７Ａｃ Ｍａｒｋシグナルピーク（－６５６～－４０５ｒｅｌ．ＴＬＳＳ ＧＲＭ６）及び第２の３’ＥＲＧ ＣｈｉＰ－Ｓｅｑピークをさらに有する２つのプロモーター：５６６Ｐ（ｈＧＲＭ６）（－６９１～－１２６ｒｅｌ．ＴＬＳＳ ＧＲＭ６）を設計した。ＥＲＧは、７７０Ｅｎ及び４４４Ｅｎに含まれるＦＬＩ１と相互作用するアクチベーターとして公知である。第２の選択されたプロモーター配列４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）（－４５３～＋１ｒｅｌ．ＴＬＳＳ ＧＲＭ６）は、ＴＬＳＳや、ＴＣＦ７Ｌ１及びＭＹＣ ＣｈｉＰ－Ｓｅｑピークなど、ＴＬＳＳとＴＳＳとの間に位置する追加的な潜在的調節配列を含む５６６Ｐ（ｈＧＲＭ６）と比較すると、さらに５’に至る。

レポーター導入遺伝子に先行するエンハンサー及びプロモーター配列の５つの有望な組み合わせ（表１）を、標準の分子的方法を用いて、下の実施例中に詳述される通りのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのＩＴＲ配列間にクローン化した：

実施例３：ヒト網膜における機能的プロモーターの評価
ヒト患者における治療使用の観点で、ヒトＧＲＭ６遺伝子に対してプロモーターを設計しており、全てのプロモーターを死後ヒト網膜外植片において評価した。このため、プロモーターをｍＣｉｔｒｉｎｅ導入遺伝子と組み合わせ、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶカプシド、特にｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）にパッケージングした（Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１３．５：ｐ．１８９ｒａ７６）。

［ｖａｎ Ｗｙｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１７．１１（１６１）：ｐ．１６１．］に詳述の通り、１日目、約５×１０^６ｖｇ（ベクターゲノム）を培養した死後ヒト網膜外植片のＲＧＣ側に添加した。ｓｃＡＡＶからの導入遺伝子発現が可視である培養７日目、網膜を凍結させた。発明者は、レポータータンパク質ｍＣｉｔｒｉｎｅ及びＯＢＣマーカーＧｏαに対する凍結切片を染色し、発現の局在化を可視化し、発現強度を比較した。ＯＢＣの最大８５％が、十分に形質導入された領域内でｍＣｉｔｒｉｎｅを発現していた（図９）。最新技術に対する性能を比較するため、Ｌｕの２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐプロモーター（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１６．２３：ｐ．６８０－９．）もｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）にパッケージングし、ヒト網膜外植片の形質導入に使用した。各プロモーターにおいては、組織学的に染色され、分析された網膜全体を通じて、３つのヒトの眼からの培養物にプロモーター構築物及び凍結切片を形質導入した。実験間の差異について制御するため、プロセシング及び免疫組織化学的検査は、全てのサンプルに対して並行的に実施した。ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ８８０をＡｉｒｙｓｃａｎ及びＺＥＮ２．１ソフトウェアとともに使用し、蛍光画像を取得した。共焦点顕微鏡写真（ｚスタック）は、同じ顕微鏡設定で２０倍の対物レンズ下で撮影した。形質導入有効性の平均を決定するため、細胞質Ａｌｅｘａ４８８蛍光（ｍＣｉｔｒｉｎｅに対する二次抗体）を形質導入ＯＢＣ細胞体［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）及びＧｏα（＋）］から決定した。特に、直径が４．１５μｍのＯＢＣ体細胞領域からの任意の蛍光値を、Ｆｉｊｉ画像処理ソフトウェアの輝度機能を用いて決定した。蛍光定量化及び細胞計数を含む画像分析は、Ｆｉｊｉ ２１ｕｌｆｉｌｓ２１（バージョン２．０．０，ｈｔｔｐｓ：／／ｆｉｊｉ．ｓｃ／，Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２．９（７）：ｐ．６７６－８２）を用いて実施した。正規化のため、各発現ＯＢＣ［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）及びＧｏα（＋）］からの蛍光値を、非発現ＯＢＣ［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（－）及びＧｏα（＋）］からの測定値から決定したバックグラウンド蛍光値の平均で除した。図２から明白なように、５６６Ｐ基本プロモーターは、ＯＢＣにおいて最も弱いｍＣｉｔｒｉｎｅ発現を媒介した一方で、４５４Ｐからの発現は常に、使用したエンハンサーエレメントと独立して、Ｌｕの２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐからの場合よりも有意に強力であった。したがって、全ての後続実験において４５４Ｐを選択した。７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）（Ｆ＝６．０３±１．５３；平均±標準偏差）及び４０７Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）（Ｆ＝５．６５±０．０９；平均±標準偏差）は、有効性の観点で十分に等しく、またＬｕのマウス由来２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐ（Ｆ＝４．４９±０．２２；平均±標準偏差）よりも有意に良好に実施し、したがって両者をより詳細に分析した。

実施例４：ヒト網膜外植片における有意に増強された錐体ＯＮ双極細胞の選択性
次のステップで、ＯＢＣ細胞型の発現特異性について切片を分析した。この目的のため、切片を導入遺伝子ｍＣｉｔｒｉｎｅに対する抗体、ユビキタスＯＢＣマーカーＧαｏ及び桿体双極細胞特異抗体ＰＫＣαで染色し、［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、ＰＫＣα（＋）、Ｇαｏ（＋）］細胞が発現桿体ＯＮ双極細胞（ＲＢＣ）として明確に同定された一方で、［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、ＰＫＣα（－）、Ｇαｏ（＋）］細胞が発現錐体ＯＮ双極細胞（ｃＯＢＣ）として明確に同定された。したがって、［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（－）、ＰＫＣα（＋）］細胞は非発現ＲＢＣとして、また［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（－）、ＰＫＣα（－）、Ｇαｏ（＋）］細胞は非発現ｃＯＢＣとして同定された。図３に示す結果は、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）及び４０７Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）の双方が、ｃＯＢＣにおいて、２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐと比較して有意により高い導入遺伝子発現を駆動することを明示する。ｃＯＢＣ選択性における測定（図３Ｂ）は、分析された網膜領域において、発現ｃＯＢＣ及びＲＢＣの量をｃＯＢＣ及びＲＢＣの総数に正規化することにより決定した。かかる正規化は、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）（４９．５％のｃＯＢＣ選択性）及び４０７Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）（３６．４％のｃＯＢＣ選択性）が、２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐ（１６．３％のｃＯＢＣ選択性）と比較して、ｃＯＢＣ細胞型における発現を駆動するための高度に増強された能力を有することを示した。特に注目すべきは、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）は、ＲＢＣ及びｃＯＢＣにおいて等しい選択性を示す（各々、約５０％、図３Ｂ）。

さらに、外植されたヒト網膜の網膜黄斑にｓｃＡＡＶ２（７ｍ８）－７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）－ｍＣｉｔｒｉｎｅを形質導入した。ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＰＫＣα及びＧαｏによる免疫標識により、中心窩が専らｃＯＢＣを有し、且つ７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）が実質的に全てのｃＯＢＣにおけるｍＣｉｔｒｉｎｅ発現を駆動することが明示された（図７）。中心窩が高度な視力を媒介し、ひいては視力を回復させる網膜遺伝子療法における主要な標的を代表する（中心窩はｃＯＢＣのみを有する）ことから、ヒト中心窩のｃＯＢＣにおいて導入遺伝子発現を効率的に駆動する能力は、ヒト治療において大変重要である。

実施例５：２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐと比較しての７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）のＯＢＣ特異性
ＯＢＣに対する高い選択性は、網膜シグナル伝達の破壊などのオフターゲット効果を回避するために必要である。ヒト網膜切片をｍＣｉｔｒｉｎｅ（導入遺伝子）に対する抗体、Ｇｏα（通常のＯＢＣマーカー）及び核染色ＤＡＰＩで標識し、細胞層を識別した。これから、発現細胞型の識別は、光受容体（ＰＲ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、外核層中に位置する）、ＯＢＣ［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、Ｇｏα（＋）、内核層中に位置する］、アマクリン細胞［ＡＣ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、Ｇｏα（－）、内核層中に位置する］及び神経節細胞（ＧＣ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、神経節細胞層中に位置する）に基づくことができた。図４Ａは、新規なプロモーター７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）が、２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐ（７０．１±１２．２％）と比較して、ＯＢＣに対する有意に増加した選択性（８８．３±７．８％）を有することを明示する。さらに、２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐのオフターゲット発現は、特にＡＣにおいて、新規な７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター（４．１±３．２％）と比較して、一般により高かった（１６．９±９．１％）。後者は、オフターゲット発現が網膜シグナル伝達を破壊する場合のオプトジェネティックな視力回復にとって特に重要である。

実施例６：変性マウス網膜におけるプロモーターの評価
網膜療法においては、組織の治療しやすさが重要である。これは、解剖学的、機能的及び転写的変化を伴う変性プロセスにおける課題であり得る。発明者は、Ｋｉｍのマウス２００Ｅｎ－ＳＶ４０プロモーターが迅速な変性ｒｄ１マウスモデルにおいてもはや機能的でないことを以前に示していた（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１７．１１：ｐ．１６１）。したがって、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）の性能［及び比較としてそのマウス対応物２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐ［Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１６．２３ｐ：６８０－６８９］を変性ｒｄ１マウスモデルにおいて試験した。プロモーターをオプトジェネティックなＭＷＯＰＮ＿－ｍＧｌｕＲ６－ＩＲＥＳ２－ＴｕｒｂｏＦＰ６３５（配列番号１６、図８のプラスミドマップ）導入遺伝子と組み合わせ、ｓｓＡＡＶ２（７ｍ８）にパッケージングした（Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１３．５：ｐ．１８９ｒａ７６）。３×１０^９ｖｇを、（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１７．１１：ｐ．１６１；ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｂｉｏｌ ２０１５．１３：ｐ．ｅ１００２１４３）に記載の通り、後の変性２２週齢ｒｄ１マウスの眼に硝子体内注射した。注射の４週後、マウスを安楽死させ、前述の通り、免疫組織化学的分析のために網膜を抽出した［ｖａｎ Ｗｙｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１７．１１（１６１）：ｐ．１６１；ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｂｉｏｌ ２０１５．１３：ｐ．ｅ１００２１４３］。発明者は、切片を導入遺伝子ＴｕｒｂｏＦＰ６３５、ＯＢＣに特異的なＧｏαマーカー及び核染色ＤＡＰＩに対して標識した。２００Ｅｎ－ＳＶ４０と異なり、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）及びＬｕのＧｒｍ６由来の２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐは、ｒｄ１網膜のＯＢＣにおいて機能的であった（図５）。しかし、２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐは、図５Ａに図示の通り、限られた網膜領域内に限り発現を引き起こした一方で、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）は、おそらくは、いくつかのＧｒｍ６の下方制御が生じていると発現閾値を超える、その増強された発現強度に起因し、変性した網膜のはるかにより大規模且つ広範な形質導入を引き起こした（図５Ｂ）。変性した網膜内で７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）によって駆動された導入遺伝子（ｍＣｉｔｒｉｎｅ）発現の特異性及び有効性を分析するため、発明者は、さらなるｒｄ１マウス９匹にさらに後の時点（２９～３３週齢）で注射した。４週後、動物を安楽死させ、眼を凍結させ、切片を作成した。凍結切片をｍＣｉｔｒｉｎｅに対する抗体及びＧｏαで再び標識し、共焦点顕微鏡下で分析した。この段階でも、これらの完全に変性された網膜において、導入遺伝子を発現する［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、Ｇｏα（－）］全ての細胞の約６７％がＯＢＣ［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、Ｇｏα（＋）］であった。同様に、全ＯＢＣ［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（－）、Ｇｏα（＋）］の約５５％が導入遺伝子を発現した［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、Ｇｏα（＋）］（図５Ｄ）。変性した網膜内の治療導入遺伝子の広範且つ特異的な発現は、効率的な遺伝子療法における基本である。

実施例７：ｒｄ１マウスにおけるオプトジェネティクス遺伝子療法及び視力回復
７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）の好ましい特性がＯＢＣで標的化されるオプトジェネティックな機能的視力回復を支持するか否かを理解するため、発明者はｒｄ１変性マウスモデルを用いて原理証明実験を実施した。発明者は、３×１０^９ｖｇのｓｓＡＡＶ（７ｍ８）－７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）－ＭＷＯＰＮ＿ｍＧｌｕＲ６－ＩＲＥＳ２－ＴｕｒｂｏＦＰ６３５－ＷＰＲＥ－ＢＧＨｐＡ（図８のプラスミドマップ）を３つの完全に光受容体の少ない２２週齢のｒｄ１マウスに両側性に注射した。ＭＷＯＰＮ＿ｍＧｌｕＲ６（配列番号１６）は、マウス錐体中波長オプシン（ＭＷＯＰＮ）とＯＢＣ活性を媒介し、この視力回復を伴うＯｐｔｏ－ｍＧｌｕＲ６に対して類似的に機能するマウスｍＧｌｕＲ６との間のキメラタンパク質である（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｂｉｏｌ ２０１５．１３：ｐ．ｅ１００２１４３）。発明者は、注射後の異なる時点（４１、４７、５５、８２及び１１２日目）で、動物を配置可能なプラットフォームに囲まれた、４つのスクリーン（２３．８”完全ＨＤ ＩＰＳパネル）を有する小型チャンバー（５４×５４×３０ｃｍ）を含む自動化された実質的なＯｐｔｏＤｒｕｍ（Ｓｔｒｉａｔｅｃｈ（登録商標））内で、（［Ｐｒｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ，２００４．４５（１２）：ｐ．４６１１－６．］に従い）視運動性反応（ＯＭＲ）を検出することにより、視力を測定した。スクリーンの輝度を２５０ｃｄ／ｍ^２に調整し、チャンバーの底部及び頂部をミラーで覆った。コンパクトな産業用カメラ（グローバルシャッター及び広角レンズを有するＩＲ感受性１／３”ＣＭＯＳセンサ、Ｆ１．６）が、上部からマウスの頭部の動きを、黒色及び白色の非正弦の垂直バーの回転パターンを異なる空間的頻度でスクリーン上に表示させながら追跡した。ソフトウェアＯｐｔｏｄｒｕｍが、記録された頭部の動きを分析し、適用された刺激の厚さ、コントラスト及び速度を制御した。動くバーの速度を１２°／秒に、コントラストを１００％に設定した。図６に示すように、各マウスにおける視力中央値を異なる試験の全ての測定された視力から決定した。治療マウスの視力中央値は、０．２９±０．０３サイクル／°（ｎ＝３、±標準偏差、Ｐ＝０．００４８）であり、０．１５±０．０６サイクル／°（ｎ＝７、Ｐ≧１９４）の非注射ｒｄ１対照マウスの場合よりも有意に良好であったが、０．４３±０．０５サイクル／°の平均視力を有する、参照用のＣ５７ＢＬ／６陽性対照の場合よりもやはり不良であった（ｎ＝１０、標準偏差、Ｐ＝０．０００６）。しかし、オプトジェネティックなＯＢＣ標的療法は、視運動性反応における著明な改善をもたらした。まとめると、結果により、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）が、変性においてｃＯＢＣを含むＯＢＣに対してやはり非常に効率的且つ特異的である、短い（１２４３ｂｐ）、ヒト遺伝子に基づくプロモーターであることから、ＯＢＣが標的化されるヒト遺伝子療法におけるすべての要件を満たすことが立証される。

材料及び方法
生物活性アッセイ
生物活性アッセイは、上の実施例セクションで説明される。培養及びヒト網膜外植片のＡＡＶ形質導入並びにマウス眼への硝子体内ＡＡＶ注射及びその後の凍結した網膜切片の免疫組織化学的処理は、他で詳述される［ｖａｎ Ｗｙｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１７．１１（１６１）：ｐ．１６１．］。

錐体ＯＮ双極細胞の特異性の決定
この目的のため、網膜凍結切片を導入遺伝子ｍＣｉｔｒｉｎｅに対する抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ１１１２２，１：５００）、ユビキタスＯＢＣマーカーＧαｏ（ＥＭＤ，ＭＡＢ３０７３，１：７５０）及びＲＢＣ特異抗体ＰＫＣα（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ８３９３，１：７５０）で三重染色した。［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、ＰＫＣα（＋）、Ｇαｏ（＋）］細胞を発現ＲＢＣとして明確に同定した一方で、［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、ＰＫＣα（－）、Ｇαｏ（＋）］細胞を発現ｃＯＢＣとして明確に同定した。図３Ａに表示するＯＢＣ型の選択性は、発現ｃＯＢＣ対全ＯＢＣの比［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、ＰＫＣα（－）、Ｇαｏ（＋）］／［Ｇαｏ（＋）］により、またＲＢＣ型の選択性は、発現ＲＢＣ対全ＯＢＣの比［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、ＰＫＣα（＋）、Ｇαｏ（＋）］／［Ｇαｏ（＋）］により決定した。発現ｃＯＢＣの選択性、換言すればｃＯＢＣが発現する確率の測定値を得るため、発明者は、発現ｃＯＢＣ及びＲＢＣの数をこの特定の分析対象の網膜領域内のｃＯＢＣ及びＲＢＣの量と各々関連付けた。この正規化は、［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（－）、ＰＫＣα（＋）、Ｇαｏ（＋）］細胞を非発現ＲＢＣ及び非発現ｃＯＢＣとしての［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（－）、ＰＫＣα（－）、Ｇαｏ（＋）］として明確に同定できることから可能であった。したがって、［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、ＰＫＣα（＋）、Ｇαｏ１３（＋）］／［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（－）、ＰＫＣα（＋）、Ｇαｏ（＋）］の比は、形質導入された発現ＲＢＣの百分率を表す一方で、［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（＋）、ＰＫＣα（－）、Ｇαｏ（＋）］／［ｍＣｉｔｒｉｎｅ（－）、ＰＫＣα（－）、Ｇαｏ（＋）］の比は、分析対象の各網膜領域内の形質導入された発現ｃＯＢＣの百分率を表す。したがって、図３Ｂに示される得られた百分率は、ｃＯＢＣが形質導入される確率を示す。

分子設計に使用されるソフトウェア
発明者は、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚのゲノムブラウザ（ＵＣＳＣゲノムブラウザ、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）［Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００２．１２（６）：ｐ．９９６－１００６；Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ，２０１３．１４（２）：ｐ．１４４－６１］を使用し、ゲノムプロモーター配列及びゲノムアノテーションを試験した。

新規なＧＲＭ６に基づくプロモーターにより得られる遺伝子発現の調節に関与する可能性のある転写因子及び転写因子結合部位を同定するため、発明者は、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＧＴＲＤ，ｇｔｒｄ．ｂｉｏｕｍｌ．ｏｒｇ／）からのＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを利用した［Ｙｅｖｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１７．４５（Ｄ１）：ｐ．Ｄ６１－Ｄ６７］。

プラスミドマップをＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｄｖａｎｃｅ（バージョン１１．５．２）において作成した。

抗体

共焦点イメージングハードウェア及びソフトウェア
Ａｉｒｙｓｃａｎ及びＺＥＮ２．１ソフトウェアを搭載したＺＥＩＳＳ ＬＳＭ８８０を使用し、２０倍又は４０倍いずれかの対物レンズで共焦点画像を取得した。画像を処理し、Ｆｉｊｉで評価した［Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄ，２０１２．９（７）：ｐ．６７６－８２．］。細胞計数用にセルカウンタープラグインを、また画像処理用に標準のＦｉｊｉツールを使用した。Ｆｉｊｉがタイルスキャン画像を自動的に組み合わせなかった場合には、Ｓｔｉｔｃｈプラグイン［Ｐｒｅｉｂｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９．２５（１１）：ｐ．１４６３－５．］を使用した。

統計学
他に記載がなければ、値を両側スチューデントｔ検定と比較し、本研究全体を通じて生体サンプルにわたる±標準偏差を伴う平均値が得られた。有意水準は星印によって示され：^＊はＰ≦０．０５を表し、^＊＊はＰ≦０．０１を表し、^＊＊＊はＰ≦０．００１を表す。

他の方法
実施例１及び２における上で言及されていない残りの方法は、［ｖａｎ Ｗｙｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１７．１１（１６１）：ｐ．１６１．］に見出すことができる。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．ａ．配列番号１～３から選択されるエンハンサー配列エレメント、及び
ｂ．配列番号７のプロモーター配列エレメント
を含む、８５０塩基対（ｂｐ）～１５００ｂｐの長さの単離核酸分子。
２．ａ．配列番号１～３から選択される配列に対して、少なくとも（≧）７０％、特には≧７５％、≧８０％、より特には≧８５％、より特には≧９０％、より特には≧９５％、さらにより特には≧９８％、最も特には１００％同一であるエンハンサー配列エレメント；及び
ｂ．配列番号７の配列に対して、≧７０％、特には≧７５％、より特には≧８０％、より特には≧８５％、より特には≧９０％、より特には≧９５％、さらにより特には≧９８％、最も特には１００％同一であるプロモーター配列エレメント；
を含み、且つ単離核酸分子は、配列番号１３の配列から、≧４０％、特には≧５０％、より特には≧６０％、さらにより特には≧７０％、より特には≧８０％、さらにより特には≧９０％、最も特には１００％の錐体ＯＮ双極細胞の特異性、及び≧２０％、特には≧２５％、より特には≧３０％、さらにより特には≧３５％、より特には≧４０％、最も特には≧５０％の錐体ＯＮ双極細胞の選択性を有する、
８５０塩基対（ｂｐ）～１５００ｂｐの長さの単離核酸分子。
３．前記エンハンサー配列エレメントの１つ及び１つのみ、前記プロモーター配列エレメントの１つ及び１つのみ、並びに任意選択的には、前記エンハンサー配列エレメントを前記プロモーター配列エレメントから分離するスペーサーからなる、上記１又は２に記載の単離核酸分子。
４．配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５から選択される配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５から選択される配列に対する≧９８％の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、上記１～３のいずれかに記載の単離核酸分子。
５．配列番号１１若しくは配列番号１３の配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号１１若しくは配列番号１３に対する≧９８％の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、特に配列番号１３の配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号１３に対する≧９８％の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、上記１～４のいずれかに記載の単離核酸分子。
６．上記１～５のいずれかに記載の核酸分子を含む核酸発現ベクター。
７．上記６に記載の核酸発現ベクターであって、アデノ随伴ウイルスベクター又は組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）であり、特に、組換えＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、又はＡＡＶ１２ベクターであり、より特には、組換えＡＡＶ２ベクターである、核酸発現ベクター。
８．ａ．カプシドタンパク質をコードする配列、及び
ｂ．導入遺伝子
をさらに含む、上記６～７のいずれかに記載の核酸発現ベクター。
９．前記導入遺伝子は、配列番号１６の配列を含む、上記８に記載の核酸発現ベクター。
１０．上記１～５のいずれかに記載の単離核酸分子又は上記６～９のいずれかに記載の核酸発現ベクターを含む、アデノ随伴ビリオン粒子。
１１．薬剤としての使用のための、上記１～５のいずれかに記載の単離核酸分子又は上記６～９のいずれかに記載の核酸発現ベクター、及び上記１０に記載のアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤。
１２．先天性停止性夜盲症（ＣＳＢＮ１）又は桿体錐体ジストロフィー及び錐体桿体ジストロフィー、特に網膜色素変性症及び黄斑変性症の治療における使用のための、上記１～５のいずれかに記載の単離核酸分子、上記６～９のいずれかに記載の核酸発現ベクター、及び上記１０に記載のアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤。
１３．上記１～５のいずれかに記載の単離核酸分子、上記６～９のいずれかに記載の核酸発現ベクター、及び上記１０に記載のアデノ随伴ビリオン粒子から選択される薬剤であって、
ａ．硝子体内投与、特に硝子体内注射、又は
ｂ．網膜下注射
によって投与される、薬剤。

配列

配列番号１：４０７Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）

配列番号２：７７０Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）

配列番号３：４４４Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）

配列番号４：４２９Ｅｎ（ｍＧｒｍ６）、４０７Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）に対応するマウス配列

配列番号５：７９２Ｅｎ（ｍＧｒｍ６）、７７０Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）に対応するマウス配列

配列番号６：４６０Ｅｎ（ｍＧｒｍ６）、４４４Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）に対応するマウス配列

配列番号７：４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）

配列番号８：５６６Ｐ（ｈＧＲＭ６）

配列番号９：４５４Ｐ（ｍＧｒｍ６）、４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）に対応するマウス配列

配列番号１０：５６６Ｐ（ｍＧｒｍ６）、５６６Ｐ（ｈＧＲＭ６）に対応するマウス配列

配列番号１１：４０７Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）

配列番号１２：４０７Ｅｎ＿５６６Ｐ（ｈＧＲＭ６）

配列番号１３：７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）

配列番号１４：７７０Ｅｎ＿５６６Ｐ（ｈＧＲＭ６）

配列番号１５：４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）

配列番号１６：ＭＷＯＰＮ＿ｍＧｌｕＲ６

配列番号１７：ＩＲＥＳ２

配列番号１８：ｍＣｉｔｒｉｎｅ

配列番号１９：ＴｕｒｂｏＦＰ６３５

配列番号２０：ＷＰＲＥ

配列番号２１：ＢＧＨ ｐＡ

配列番号２２：ｓＮＲＰ－１ ｐＡ
１ ａａａｔａａａａｔａ ｃｇａａａｔｇ １７
配列番号２３：ＷＴカプシドＡＡＶ２

配列番号２４
ｇｃｃｇｃｃＡｃｃＡＵＧＧ
配列番号２５
ｇｃｃｇｃｃＧｃｃＡＵＧＧ

Claims (14)

1. ａ．配列番号１～３から選択されるエンハンサー配列エレメント、及び
   ｂ．配列番号７のプロモーター配列エレメント
   を含む、８５０塩基対（ｂｐ）～１５００ｂｐの長さの単離核酸分子。
2. ａ．配列番号１～３から選択される配列に対して、少なくとも（≧）９０％同一であるエンハンサー配列エレメント；及び
   ｂ．配列番号７の配列に対して、≧９０％同一であるプロモーター配列エレメント；
   を含み、且つ単離核酸分子は、配列番号１３の配列から、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、又は１００％の錐体ＯＮ双極細胞の特異性、及び≧２０％、≧２５％、≧３０％、≧３５％、≧４０％、又は≧５０％の錐体ＯＮ双極細胞の選択性を有する、
   ８５０塩基対（ｂｐ）～１５００ｂｐの長さの単離核酸分子。
3. 前記単離核酸分子が、前記エンハンサー配列エレメントのいずれか１つ、及び前記プロモーター配列エレメントのいずれか１つからなるか、又は、前記単離核酸分子が、前記エンハンサー配列エレメントのいずれか１つ、前記プロモーター配列エレメントのいずれか１つ、及び、前記エンハンサー配列エレメントを前記プロモーター配列エレメントから分離するスペーサーからなる、請求項１又は２に記載の単離核酸分子。
4. 配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５から選択される配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５から選択される配列に対する≧９８％の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
5. 配列番号１１若しくは配列番号１３の配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号１１若しくは配列番号１３に対する≧９８％の同一性によって特徴づけられる配列を含むか若しくはそれからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む核酸発現ベクター。
7. 請求項６に記載の核酸発現ベクターであって、アデノ随伴ウイルスベクター又は組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）であり、特に、組換えＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、又はＡＡＶ１２ベクターである、核酸発現ベクター。
8. ａ．カプシドタンパク質をコードする配列、及び
   ｂ．導入遺伝子
   をさらに含む、請求項６～７のいずれか一項に記載の核酸発現ベクター。
9. 前記導入遺伝子は、配列番号１６の配列を含む、請求項８に記載の核酸発現ベクター。
10. 請求項１～５のいずれか一項に記載の単離核酸分子又は請求項６～９のいずれか一項に記載の核酸発現ベクターを含む、アデノ随伴ビリオン粒子。
11. 請求項１～５のいずれか一項に記載の単離核酸分子、請求項６～９のいずれか一項に記載の核酸発現ベクター、又は請求項１０に記載のアデノ随伴ビリオン粒子を含む、医薬組成物。
12. 療法のための、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 先天性停止性夜盲症（ＣＳＢＮ１）、桿体錐体ジストロフィー及び錐体桿体ジストロフィー、網膜色素変性症又は黄斑変性症の治療のための、請求項１１に記載の医薬組成物。
14. 請求項１２又は１３に記載の医薬組成物であって、
    ａ．硝子体内投与、
    ｂ．硝子体内注射、又は
    ｃ．網膜下注射
    によって投与される、医薬組成物。