CN115052988A - 用于眼部基因递送的给光型双极细胞特异性启动子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及合成的视网膜给光型双极细胞特异性启动子序列及其将治疗转基因递送到眼睛以改善和/或恢复视力的用途。本发明的特征在于用于在给光型双极细胞中、特别是在人黄斑的视锥给光型双极细胞中实现增加且更特异性的表达的代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)启动子。
Description
本发明涉及合成的视网膜给光型双极细胞特异性启动子序列及其将治疗转基因递送到眼睛以改善和/或恢复视力的用途。本发明的特征在于用于在给光型双极细胞中实现增加且更特异性的表达的代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)启动子。特别地，视锥给光型双极细胞中的高效表达仅存在于人黄斑中。
说明
背景技术
许多失明病因仅具有有限的治疗可能性或根本无法治愈。其中最常见的病因是年龄相关性黄斑变性(AMD)和遗传性视网膜疾病(IRD)如视网膜色素变性(RP)。这些变性疾病的特征在于光感受器(PR)的进行性丧失，最终导致完全失明。递送治疗性DNA或RNA、替换或沉默缺陷基因或者编码外源治疗性基因的基因治疗旨在减缓疾病进展、减轻症状或引入失去的功能。
光遗传基因治疗是最有前景的新兴技术之一，该技术可用于治疗由视网膜变性引起的失明。正在进行的光遗传治疗临床试验利用通道视紫红质非特异性地靶向视网膜神经节细胞(RGC)以将光敏感性重新引入到视网膜。在将来，下一代细胞定制型光遗传基因治疗将被证明优于这些非特异性治疗。这些下一代治疗采用细胞类型特异性启动子将新型且有效的光遗传工具递送到视网膜的特异性细胞类型。细胞类型靶标中最有前景的是视网膜双极细胞(BC)，这些细胞是天然地从PR接收直接输入的视网膜的第一中间神经元。BC被分成给光(ON)型BC和撤光(OFF)型BC，它们分别对光增量或减量作出反应，并且表达mGluR6或AMPA/海人藻酸谷氨酸受体。给光型双极细胞(OBC)是特别令人感兴趣的基因治疗靶标。OBC特异性基因诸如NYX、GRM6、GPR179或TRPM1的突变全都导致完全失明(先天性静止性夜盲)，这是由于这些基因参与mGluR6信号级联并且OBC因此变得无功能。最近，光遗传蛋白质在OBC中的表达已被证明在患有晚期变性的光感受器变性小鼠模型中恢复了视力。通道视紫红质-2(Lagali等人，Nat Neurosci[自然-神经科学]2008.11:第667-675页)、视紫红质(Cehajic-Kapetanovic等人，Curr Biol[当代生物学]2015.25:第2111-2122页)和嵌合Opto-mGluR6(van Wyk等人，PLoS Biol[公共科学图书馆：生物学]2015.13:第e1002143页)已在盲小鼠的OBC中成功表达并且已在视网膜水平、皮层水平和行为水平恢复功能性视力。对于所有上述方法而言，OBC类型都需要被特异性地靶向，特别是在光遗传方法的情况下，以避免来自脱靶细胞的争议性信号传导破坏视网膜代码。另外，特异性OBC靶向还允许更低并因此更安全的AAV给药。迄今为止，功能性和OBC特异性的启动子的缺乏阻止了OBC靶向基因治疗的临床应用。
在本领域中通常采用短增强子启动子序列以实现与基于AAV的基因治疗组合的OBC特异性靶向。该序列由于AAV的包装能力而受限于4.7kb，并且通常不能容纳长度为几kb的内源启动子。在这方面，来源于OBC特异性mGluR6谷氨酸受体(仅在视网膜的OBC中表达)的增强子启动子序列已被证明最为成功。直到最近，才以标准的方式使用来源于鼠Grm6基因并与SV40病毒核心启动子组合的200bp长的增强子序列(Kim等人，J Neurosci[神经科学杂志]，2008.28:第7748-7764页)，缩写为200En-SV40。然而，本发明人最近证实，携带四重增强子序列的其变体4x200En-SV40(Cronin等人，EMBO Mol Med[EMBO分子医学]2014.6:第1175-1190页)在晚期变性视网膜中既不是OBC特异性的也不是功能性的(van Wyk等人，Front Neurosci[神经科学前沿]2017.11:第161页)。最近，设计了完全基于鼠Grm6基因的短增强子/启动子(200En-mGluR500P)，该序列在野生型C57BL/6小鼠视网膜中表达，具有相对良好的OBC特异性(Lu等人，Gene Ther[基因治疗]，2016.23:第680-689页)。然而，未显示在变性视网膜的OBC中的表达并且几乎仅在视杆型OBC中驱动表达。因此，仅在有中央凹的动物(包括人)的视网膜的黄斑中发现的并与介导高敏度色觉的中央凹视锥连接的视锥型OBC几乎不被200En-mGluR500P靶向，使得该启动子不适于恢复高敏度中央人视力。另外，基于人GRM6基因的启动子是有利的，因为它将完全受人转录组机制控制，从而调控基因表达，即介导功能但不诱导细胞毒性的蛋白质水平的表达。
基于上述现有技术，本发明的目的是提供手段和方法来提供新型的合成OBC特异性人启动子。该目的通过本说明书的独立权利要求的主题来实现。
发明内容
本发明的第一方面涉及长度为850碱基对(bp)至1500bp的分离的核酸分子，该分离的核酸分子包含：
a.选自SEQ ID NO 1至6的增强子序列元件，以及
b.选自SEQ ID NO 7至10的启动子序列元件。
本发明的第一方面的替代方案涉及长度为850碱基对(bp)至1500bp的分离的核酸分子，该分离的核酸分子包含：
a.增强子序列元件，所述增强子序列元件与选自SEQ ID NO 1和2的序列具有至少(≥)70％，特别是≥75％，更特别是≥80％，更特别是≥85％，更特别是≥90％，更特别是≥95％，甚至更特别是≥98％，最特别是100％同一性；以及
b.启动子序列元件，所述启动子序列元件与SEQ ID NO 7的序列具有≥70％，特别是≥75％，更特别是≥80％，更特别是≥85％，更特别是≥90％，更特别是≥95％，甚至更特别是≥98％，最特别是100％同一性；
并且所述分离的核酸分子具有来自SEQ ID NO 13的序列的视锥给光型双极细胞特异性的≥40％，特别是≥50％，更特别是≥60％，甚至更特别是≥70％，更特别是≥80％，甚至更特别是≥90％，最特别是100％，以及≥20％，特别是≥25％，更特别是≥30％，甚至更特别是≥35％，更特别是≥40％，最特别是≥50％的视锥给光型双极细胞偏好。
本发明的第二方面涉及包含根据第一方面的核酸分子的核酸表达载体。
本发明的第三方面涉及由启动子驱动的转基因。
本发明的第四方面涉及腺相关病毒颗粒，该腺相关病毒颗粒包含根据第一方面的分离的核酸分子、根据第二方面的核酸表达载体或根据第三方面的转基因。
本发明的第五方面涉及药剂，该药剂选自根据第一方面的分离的核酸分子、根据第二方面的核酸表达载体、根据第三方面的转基因和根据第四方面的腺相关病毒颗粒并用作药物。
包含本发明的药剂的施用形式是本发明的其他方面。
术语和定义
在本说明书的上下文中，术语OBC涉及给光型双极细胞。
在本说明书的上下文中，术语RBC涉及视杆双极细胞。
在本说明书的上下文中，术语cOBC涉及视锥给光型双极细胞。
在本说明书的上下文中，术语RGC涉及视网膜神经节细胞。
在本说明书的上下文中，术语PR涉及光感受器。
在本说明书的上下文中，缩写AAV涉及腺相关病毒。除非另有说明，否则AAV是指所有亚型或血清型以及可复制型和重组型。
在本说明书的上下文中，术语AAV病毒粒子和AAV病毒颗粒涉及由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化核酸组成的病毒颗粒。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如，细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学领域)普通技术人员通常理解的相同的含义。标准技术用于分子、遗传和生物化学方法(一般参见Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.[冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港]以及Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology[精编分子生物学实验指南](1999)第4版,John Wiley&Sons,Inc.[约翰·威利父子出版公司])以及化学方法。
在本说明书的上下文中，术语AAV衣壳涉及合成的衣壳(cap)基因。本文披露的AAV衣壳可用于包装用于基因治疗的重组腺相关病毒。
在本说明书的上下文中，术语同源涉及共用其大部分序列的序列，但在一些位置上由于核酸或氨基酸的插入、缺失或置换而不同。
在本说明书的上下文中，术语转基因涉及已经从一种生物体转移到另一种生物体的基因或遗传物质。在本文的上下文中，该术语还可以指将基因序列的天然或生理上完整的变体转移到其缺失的患者组织中。它还可以指天然编码序列的转移，该天然编码序列的表达由靶组织中不存在或沉默的启动子驱动。本文所用的术语转基因是指编码感兴趣的多肽的多核苷酸，该多核苷酸在受损或患病的视网膜中表达时，可用于改善或恢复视力。对于恢复光敏感性或视力而言特别令人感兴趣的转基因包括光敏蛋白质，诸如视蛋白基因，即通道视紫红质、脊椎动物视蛋白以及它们的变体。
在本说明书的上下文中，术语重组涉及核酸，该核酸是克隆、限制性酶切和/或连接的一个或几个步骤的产物，并且不同于天然存在的核酸。重组病毒颗粒包含重组核酸。
在本说明书的上下文中，术语玻璃体内施用涉及药剂(例如病毒)的施用途径，通过该施用途径将药剂递送到眼睛的玻璃体中。玻璃体内施用是将药物直接置于称为玻璃体腔的眼后部空间中的程序，该玻璃体腔填充有称为玻璃体液凝胶的胶状流体。
在本说明书的上下文中，术语视网膜下施用涉及将药剂，特别是本说明书的上下文中的病毒施用到视网膜色素上皮(RPE)细胞和光感受器之间的空间中的途径。
在本说明书的上下文中，“核苷酸”是核酸或核酸类似物结构单元，它们的寡聚体能够基于碱基配对来与RNA或DNA寡聚体形成选择性杂交体。该上下文中的术语核苷酸包括经典的核糖核苷酸结构单元腺苷、鸟苷、尿苷(和核糖胸苷)、胞苷，经典的脱氧核糖核苷酸脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷和脱氧胞苷。
在本说明书的上下文中，术语序列同一性和序列同一性百分比是指通过比较两个比对的序列而确定的值。用于比较的序列比对方法在本领域是熟知的。用于比较的序列比对可以通过以下来进行：通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学]48:443(1970)的全局比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性搜索方法，或通过这些算法的计算机化实现，包括但不限于：CLUSTAL、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。用于执行BLAST分析的软件可例如通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology-Information)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得。
用于比较核酸序列的一个这样的实例是使用如下默认设置的BLASTN算法：预期阈值：10；字长：28；查询范围内的最大匹配数：0；匹配/错配得分：1、-2；空位成本：线性。除非另有说明，否则本文提供的序列同一性值是指通过BLAST程序组分别使用以上确定的蛋白质和核酸比较的默认参数获得的值(Altschul等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990))。
在本说明书的上下文中，术语上游是指朝向5'端的方向。对于增强子和启动子序列，在本申请中给出了单链序列，并且当增强子在启动子的上游时，这意味着增强子在启动子的5'-方向。类似地，术语下游是指朝向3'端的方向。
在本说明书的上下文中，术语间隔区序列是指用于连接增强子和启动子以产生单链核酸分子的可变长度的核酸。可用于实施本文指定的发明的接头的示例性实施例是由1至1000个核酸组成的寡核酸链。
使用以下方案测量人视网膜外植体中的视锥给光型双极细胞(cOBC)特异性。
首先，将启动子与报告子转基因mCitrine组合，并包装到自身互补型(sc)AAV载体scAAV2(7m8)中(Dalkara等人，Sci Transl Med[科学转化医学]2013.5:第189ra76页)。在第0天将大约1010vg(载体基因组)加入到培养的死后人视网膜外植体的RGC侧，如以下文献中详述：(van Wyk等人，Front Neurosci[神经科学前沿]2017.11:第161页)。在培养的第7天用4％PFA固定视网膜，随后冷冻保护(10/20/30％蔗糖的PBS溶液)并冻存。用抗转基因mCitrine的抗体(英杰公司(Invitrogen)，A11122，1:500)、抗遍在OBC标志物Gαo的抗体(EMD，MAB3073，1:750)和RBC特异性抗体PKCα(圣克鲁斯公司(Santa Cruz)，sc8393，1:750)对视网膜冷冻切片进行三重染色。表达RBC被鉴定为[mCitrine(+)，PKCα(+)]，而[mCitrine(+)，PKCα(-)，Gαo(+)]细胞被鉴定为表达cOBC。cOBC型特异性由表达cOBC占所有表达OBC的比率确定：
其中N是具有括号中给出的染色特征的细胞数。
随后如下确定视锥给光型双极细胞偏好。
RBC和cOBC的量不相同并且在不同视网膜区域中有差异。这些外植体从视网膜的赤道部产生，其中RBC与cOBC的比率
在外植体的小区域内大致恒定。因此，也可以假定表达cOBC与表达RBC的比率
在外植体中恒定。这允许计算cOBC相对于RBC的偏好比率因子
该式通过将(3)乘以(4)来考虑外植体中cOBC和RBC的特定分布。然后用下式计算以百分比计的cOBC偏好：
如本文所用，在一个实施例中，术语任何疾病或障碍(例如视力丧失)的“治疗(treating或treatment)”是指减轻疾病或障碍(即，减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施例中，“治疗(treating或treatment)”是指缓解或减轻至少一种身体参数、包括不能被患者辨别的那些。在又另一个实施例中，“治疗(treating或treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定化)或在生理上(例如，身体参数的稳定化)或二者调节疾病或障碍。在又另一个实施例中，“治疗(treating或treatment)”是指将外源性治疗功能引入靶细胞类型中。除非下文具体描述，否则用于评估疾病的治疗和/或预防的方法通常在本领域是已知的。
具体实施方式
本发明披露了人GRM6增强子启动子序列，与200En-mGluR500P相比，这些序列在小鼠和人死后视网膜中具有增强的OBC特异性和显著增强的cOBC诱导的蛋白质表达。本文所述的启动子由修饰的代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)启动子组成，该启动子含有来自指导mGluR6蛋白质表达至OBC(特别是RBC和cOBC)的调控元件的序列。本发明的特征在于包含mGluR6增强子或其变体和mGluR6启动子或其变体的分离的核酸分子或核酸表达载体。这种新型的GRM6增强子启动子序列首次在人视网膜(特别是人副中央凹)的cOBC中驱动高效的转基因表达。此外，与感光基因(MWOPN_mGluR6，SEQ ID NO:16)组合的新型人GRM6增强子启动子序列引起了变性鼠(rd1，C3HHe/OuJ)视网膜中广泛的OBC特异性表达，并且在原本失明、光感受器变性的小鼠中恢复了功能性视力(视动反应)。该新型人GRM6增强子/启动子在小鼠和人视网膜中表现出高效、广泛和特异性的OBC靶向。
本发明的第一方面涉及分离的核酸分子，该分离的核酸分子包含：
a.选自SEQ ID NO 1至6的增强子序列元件，以及
b.选自SEQ ID NO 7至10的启动子序列元件。
本发明的第一方面的替代方案涉及长度为850碱基对(bp)至1500bp的分离的核酸分子，该分离的核酸分子包含：
a.选自SEQ ID NO 1至6的增强子序列元件，以及
选自SEQ ID NO 7至10的启动子序列元件。
本发明的第一方面的另一个替代方案涉及分离的核酸分子，该分离的核酸分子包含：
a.增强子序列元件，所述增强子序列元件与选自SEQ ID NO 1和2的序列具有≥70％，特别是≥75％，更特别是≥80％，更特别是≥85％，更特别是≥90％，更特别是≥95％，甚至更特别是≥98％，最特别是100％同一性；以及
b.启动子序列元件，所述启动子序列元件与SEQ ID NO 7的序列具有≥70％，特别是≥75％，更特别是≥80％，更特别是≥85％，更特别是≥90％，更特别是≥95％，甚至更特别是≥98％，最特别是100％同一性；
并且所述分离的核酸分子具有来自SEQ ID NO 13的序列的视锥给光型双极细胞特异性的≥40％，特别是≥50％，更特别是≥60％，甚至更特别是≥70％，更特别是≥80％，甚至更特别是≥90％，最特别是100％，以及≥20％，特别是≥25％，更特别是≥30％，甚至更特别是≥35％，更特别是≥40％，最特别是≥50％的视锥给光型双极细胞偏好。
本发明的第一方面的另一个替代方案涉及长度为850碱基对(bp)至1500bp的分离的核酸分子，该分离的核酸分子包含：
a.增强子序列元件，所述增强子序列元件与选自SEQ ID NO 1和2的序列具有≥70％，特别是≥75％，更特别是≥80％，更特别是≥85％，更特别是≥90％，更特别是≥95％，甚至更特别是≥98％，最特别是100％同一性；以及
b.启动子序列元件，所述启动子序列元件与SEQ ID NO 7的序列具有≥70％，特别是≥75％，更特别是≥80％，更特别是≥85％，更特别是≥90％，更特别是≥95％，甚至更特别是≥98％，最特别是100％同一性；
并且所述分离的核酸分子具有来自SEQ ID NO 13的序列的视锥给光型双极细胞特异性的≥40％，特别是≥50％，更特别是≥60％，甚至更特别是≥70％，更特别是≥80％，甚至更特别是≥90％，最特别是100％，以及≥20％，特别是≥25％，更特别是≥30％，甚至更特别是≥35％，更特别是≥40％，最特别是≥50％的视锥给光型双极细胞偏好。
如上所述的那样测量cOBC特异性和cOBC表达水平。
本发明人已证实SEQ ID NO 1或2与SEQ ID NO 7的组合引起高视锥给光型双极细胞特异性和高视锥给光型双极细胞表达水平。基于本发明的披露内容，本领域技术人员能够发现具有相同视锥给光型双极细胞特异性和视锥给光型双极细胞表达水平的类似序列。
在某些实施例中，增强子序列元件在启动子序列元件的上游。
在某些实施例中，分离的核酸分子另外包含长度为1至1000个碱基对，特别是1至394个碱基对的间隔区序列。在某些实施例中，间隔区位于增强子和启动子之间。在某些实施例中，分离的核酸分子另外包含长度为1至1000个碱基对，特别是1至394个碱基对的间隔区序列，并且间隔区位于增强子和启动子之间。
在某些实施例中，分离的核酸分子包含选自SEQ ID NO 11-SEQ ID NO 15的序列。
在某些实施例中，分离的核酸分子包含序列SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 13。
本发明的第二方面涉及包含根据第一方面的核酸分子的核酸表达载体。
在某些实施例中，病毒载体是病毒基因组。
在某些实施例中，载体是腺相关病毒载体或重组腺相关载体(rAAV)。
在某些实施例中，AAV载体是单链载体(ssAAV)或自身互补型载体(scAAV)。
在某些实施例中，载体是重组AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12载体。在某些实施例中，载体是重组AAV2载体。
在某些实施例中，核酸表达载体另外包含：
a.编码衣壳蛋白的序列，和
b.转基因。
从5'端至3'端，分离的核酸分子包含：首先是增强子，接着是任选的间隔区，然后是启动子。转基因位于启动子的3'方向。在某些实施例中，转基因前面是优化的KOZAK序列。
KOZAK序列具有共有序列(gcc)gccAccAUGG(SEQ ID NO 24)或(gcc)gccGccAUGG(SEQ ID NO 25)，并且在翻译的起始中很重要。
在某些实施例中，核酸表达载体还包含WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)调控序列。WPRE是在转录时产生增强表达的三级结构的DNA序列。在某些实施例中，核酸表达载体还包含插入在转基因下游的多聚腺苷酸尾。多聚腺苷酸尾促进转基因的翻译。
在某些实施例中，衣壳蛋白是AAV2、AAV2(7m8)或AAV8(BP2)。
本发明的第三方面涉及由启动子驱动的转基因。
在某些实施例中，转基因是恢复先天性静止性夜盲中的光敏感性或视力的NYX、GRM6、GPR179或TRPM1。
在某些实施例中，转基因包含SEQ ID NO 16的序列或基本上由该序列组成。
在某些实施例中，转基因是恢复光检测或视力的视蛋白基因。
在某些实施例中，视蛋白基因选自下组，该组由以下组成：通道视紫红质、黑视蛋白、视紫红质、视锥视蛋白、松果体视蛋白、光视蛋白、盐视紫红质、细菌视紫红质、变形菌视紫红质、水母视蛋白、跳蜘蛛视蛋白或它们的任何功能性变体或片段。
在某些实施例中，视蛋白基因是视蛋白和视网膜OBC的代谢型谷氨酸受体mGluR6之间的嵌合蛋白质。
在某些实施例中，嵌合蛋白质是Opto-mGluR6。
在某些实施例中，嵌合蛋白质是鼠或人MWOPN_mGluR6(SEQ ID NO:16)。
本发明的第四方面涉及腺相关病毒颗粒，该腺相关病毒颗粒包含根据第一方面的分离的核酸分子或根据第二方面的核酸表达载体。
本发明的第五方面涉及药剂，该药剂选自根据第一方面的分离的核酸分子或根据第二方面的核酸表达载体以及根据第三方面和第四方面的腺相关病毒颗粒并用作药物。
另一方面涉及药剂，该药剂选自根据第一方面的分离的核酸分子、根据第二方面的核酸表达载体、根据第三方面的转基因和根据第四方面的腺相关病毒颗粒并用于治疗影响视网膜双极细胞的病症。
另一方面涉及药剂，该药剂选自根据第一方面的分离的核酸分子、根据第二方面的核酸表达载体、根据第三方面的转基因和根据第四方面的腺相关病毒颗粒并用于治疗先天性静止性夜盲或视杆-视锥和视锥-视杆营养不良，特别是视网膜色素变性和黄斑变性。
另一方面涉及药剂，该药剂选自根据第一方面的分离的核酸分子、根据第二方面的核酸表达载体、根据第三方面的转基因和根据第四方面的腺相关病毒颗粒，其中通过以下方式施用该药剂：
a.玻璃体内施用，特别是玻璃体内注射，或
b.视网膜下注射。
另一方面涉及向有需要的患者施用本发明的药剂的治疗方法。
无论单个可分离特征(例如启动子序列或医学指征)的替代方案在本文何处布局为“实施例”，都应理解此类替代方案可自由组合以形成本文披露的本发明的离散实施例。因此，启动子序列的任何替代实施例可以与损害OBC功能的任何医学指征和任何DNA递送载体或方法组合，包括替代病毒、纳米颗粒、脂质体或通过使用例如基因枪或电穿孔的“裸”DNA递送。
可受益于本文所述方法的视网膜疾病的非限制性列表包括先天性夜盲、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、先天性视锥营养不良和一大组视网膜色素变性(RP)相关障碍。
项目
1.一种长度为850碱基对(bp)至1500bp的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含：
a.选自SEQ ID NO 1至6的增强子序列元件，以及
b.选自SEQ ID NO 7至10的启动子序列元件。
2.一种长度为850碱基对(bp)至1500bp的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含：
a.增强子序列元件，所述增强子序列元件与选自SEQ ID NO 1和2的序列具有至少(≥)70％，特别是≥75％，≥80％，更特别是≥85％，更特别是≥90％，更特别是≥95％，甚至更特别是≥98％，最特别是100％同一性；以及
b.启动子序列元件，所述启动子序列元件与SEQ ID NO 7的序列具有≥70％，特别是≥75％，更特别是≥80％，更特别是≥85％，更特别是≥90％，更特别是≥95％，甚至更特别是≥98％，最特别是100％同一性；
并且所述分离的核酸分子具有来自SEQ ID NO 13的序列的视锥给光型双极细胞特异性的≥40％，特别是≥50％，更特别是≥60％，甚至更特别是≥70％，更特别是≥80％，甚至更特别是≥90％，最特别是100％，以及≥20％，特别是≥25％，更特别是≥30％，甚至更特别是≥35％，更特别是≥40％，最特别是≥50％的视锥给光型双极细胞偏好。
3.根据项目1或2所述的分离的核酸分子，其中所述分离的分子由所述增强子序列元件中的一个且只有一个增强子序列元件、所述启动子序列元件中的一个且只有一个启动子序列元件以及任选地将所述增强子序列元件与所述启动子序列元件分开的间隔区组成。
4.根据前述项目中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含选自SEQ ID NO 11-SEQ ID NO 15的序列或由其组成，或者包含特征在于与选自SEQ ID NO 11-SEQ ID NO 15的序列具有≥98％同一性的序列或由其组成。
5.根据前述项目中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含所述序列SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 13或由其组成，或者包含特征在于与SEQ ID NO 11或SEQID NO 13具有≥98％同一性的序列或由其组成，特别是包含所述序列SEQ ID NO 13或由其组成，或者包含特征在于与SEQ ID NO 13具有≥98％同一性的序列或由其组成。
6.一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包含根据前述项目中任一项所述的核酸分子。
7.根据项目6所述的核酸表达载体，其中所述核酸表达载体是腺相关病毒载体或重组腺相关载体(rAAV)，特别是其中所述核酸表达载体是重组AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12载体，更特别是其中所述核酸表达载体是重组AAV2载体。
8.根据项目6至7中任一项所述的核酸表达载体，所述核酸表达载体另外包含：
a.编码衣壳蛋白的序列，和
b.转基因。
9.根据项目8所述的核酸表达载体，其中所述转基因包含SEQ ID NO 16的序列。
10.一种腺相关病毒颗粒，所述腺相关病毒颗粒包含根据项目1至5中任一项所述的分离的核酸分子或根据项目6至9中任一项所述的核酸表达载体。
11.一种药剂，所述药剂选自根据项目1至5中任一项所述的分离的核酸分子或根据项目6至9中任一项所述的核酸表达载体和根据项目10所述的腺相关病毒颗粒并用作药物。
12.一种药剂，所述药剂选自根据项目1至5中任一项所述的分离的核酸分子、根据项目6至9中任一项所述的核酸表达载体和根据项目10所述的腺相关病毒颗粒并用于治疗影响视网膜双极细胞的病症，特别是治疗先天性静止性夜盲(CSBN1)或视杆-视锥和视锥-视杆营养不良，更特别是治疗视网膜色素变性和黄斑变性。
13.一种药剂，所述药剂选自根据项目1至5中任一项所述的分离的核酸分子或根据项目6至9中任一项所述的核酸表达载体和根据项目10所述的腺相关病毒颗粒，其中通过以下方式施用所述药剂：
a.玻璃体内施用，特别是玻璃体内注射，或
b.视网膜下注射。
通过以下实施例和附图进一步说明本发明，从中可以得出进一步的实施例和优点。这些实例旨在说明本发明，但不限制本发明的范围。
附图说明
图1为启动子设计选择的人GRM6序列的基因组浏览器视图。(A)人GRM6的远端增强子区(位于相对于翻译起始位点(TLSS)的约-14kb处)，指示了三个所选择的增强子元件，包括鼠Grm6和人GRM6之间的310bp保守区(带横条纹)以及Kim的鼠200En(Grm6)的188bp同线区(带横条纹和阴影的部分)。(B)人GRM6的启动子序列，包括转录起始位点(TSS)和翻译起始位点(TLSS)，后者由本发明人定义为位置0。还指示了所选择的两个启动子，并且小鼠基因和人基因之间的167bp保守区由带横条纹的部分显示。这些图表从https:// genome.ucsc.edu/的UCSC基因组浏览器下载并且作了修改。灰色阴影段说明潜在相关的顺式调控区，包括转录因子结合位点、种间保守区(脊椎动物保守区)和DNA酶超敏感性聚簇(DNA酶聚簇)。另外，还考虑了H3K27Ac标志信号峰和Chip-seq峰的轨迹。
图2死后人视网膜外植体的OBC中启动子驱动的mCitrine表达。用scAAV2(7m8)-407En_566P(hGRM6)-mCitrine(n＝3)、scAAV2(7m8)-444En_454P(hGRM6)-mCitrine(n＝3)、scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine(n＝5)、scAAV2(7m8)-407En_454P(hGRM6)-mCitrine(n＝3)和scAAV(7m8)-200En-mGluR500P-mCitrine(n＝4)转导人视网膜外植体。对mCitrine进行免疫组织化学标记并且表达给光型双极细胞中的荧光强度被确定为转基因表达强度的量度。与具有近端元件的启动子组合454P相比，566P启动子元件在OBC中介导弱得多的mCitrine表达。因此，454P被选择用于所有后续实验。770En_454P(hGRM6)(F＝5.42±0.9；平均值±标准偏差)和444En_454P(hGRM6)(F＝5.59±0.51；平均值±标准偏差)在转基因表达强度方面表现同样出色，并且显著好于鼠基因组来源的200En-mGluR500P(F＝3.94±0.45；平均值±标准偏差)。*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001，并且n.s.表示非显著差异(单因素方差分析与Tukey诚实显著性检验)。
图3人视网膜外植体中的视锥给光型双极细胞(cOBC)的启动子特异性。用scAAV2(7m8)-444En_454P(hGRM6)-mCitrine、scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine、scAAV2(7m8)-407En_454P(hGRM6)-mCitrine或scAAV(7m8)-200En-mGluR500P-mCitrine转导人视网膜外植体。针对mCitrine、PKCα(对于视杆双极细胞(RBC))和Gα0(OBC的遍在标志物)来标记纵向冷冻切片并且对表达mCitrine的细胞进行计数。(A)根据细胞计数得出，与200En-mGluR500P相比，770En_454P(hGRM6)在显著更多的cOBC中驱动表达。(B)将靶cOBC和RBC的量归一化到由此进行计数的特定视网膜区内的其总数，直观地显示了770En_454P(hGRM6)和407En_454P(hGRM6)比200En-mGluR500P高效得多地在cOBC中驱动表达，后者对RBC具有明显偏好。770En_454P(hGRM6)甚至对cOBC和RBC显示出等同的偏好，每种均为50％，这是仅存在cOBC的中央凹基因治疗的重要标志。(C)启动子444En_454P(hGRM6)(n＝5)的cOBC类型偏好与启动子770En_454P(hGRM6)的cOBC类型偏好没有显著差异。显示了平均值±标准偏差，*表示P≤0.05，**表示P≤0.01(单因素方差分析与Tukey诚实显著性检验)。仅指示了显著差异。
图4人视网膜外植体中770En_454P(hGRM6)驱动的mCitrine表达的OBC表达功效和特异性。(A)当包装进scAAV2(7m8)中时，比较770En_454P(hGRM6)驱动的mCitrine表达与200En-mGluR500P驱动的mCitrine表达。770En_454P(hGRM6)显示出比200En-mGluR500P高得多的OBC偏好，并且后者另外在无长突细胞中具有显著更高的脱靶表达。以平均值±标准偏差的形式显示了特定细胞类型的表达细胞的％，**表示P≤0.01并且***表示P≤0.001(学生T检验)。
图5启动子770En_454P(hGRM6)在变性rd1小鼠视网膜中可靠、广泛地驱动转基因表达。在22周龄时为rd1小鼠注射携带转基因MWOPN_mGluR6_IRES2_TurboFP635(SEQ IDNO:16，质粒图谱图9)的AAV的3×109vg。A-D中的草图以灰色表示全视网膜铺片中的转导视网膜区域。A)ssAAV2(7m8)与200En-mGluR500P的组合也在rd1视网膜中表达，但仅在限制区域中表达(与4xGrm6-SV40相反)。B)与200En-mGluR500P相比，ssAAV(7m8)与770En_454P(hGRM6)的组合引起变性视网膜的更广泛和普遍的转导，这可能是由于表达强度增加，从而在已发生变性引起的Grm6下调时克服表达的阈值。C)取自进行OKR测试的rd1小鼠的经处理视网膜的全视网膜铺片的实例激光扫描显微图(参见实例7和图6)，其中对TurboFP635进行了免疫细胞化学标记(描绘于草图B中)。(D)rd1变性视网膜中的平均表达特异性(所有表达细胞中的表达OBC的％，66.6％±8.5％)和效率(所有OBC中的表达OBC的％，54.7％±8.3％)。平均值±标准偏差，N＝9(学生T检验)。
图6通过在22周龄时用ssAAV(7m8)-MWOPN_mGluR6_IRES2_TurboFP635进行玻璃体内和双侧治疗的完全无光感受器的rd1小鼠中的视动反射来确定的视力恢复。在转导后41、47、55、82和112天，通过确定在虚拟视动系统中仍然引起视动反应的空间频率的阈值来测量视敏度。与未注射的对照rd1同窝出生仔畜(n＝7)相比，经治疗的小鼠(n＝3)表现出视敏度显著增加，但视敏度仍显著低于野生型对照小鼠(C57BL/6J，n＝10)。显示了平均值(相对于所有试验和个体)±标准偏差，**表示P≤0.01并且***表示P≤0.001(学生T检验)。
图7通过启动子770En_454P(hGRM6)实现的移植人黄斑的cOBC中的高效mCitrine表达。用scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine转导并且针对转基因mCitrine以及OBC(Gαo)和细胞核(DAPI)进行免疫组织化学标记的人黄斑的实例外植体。(A)是人黄斑以及拍摄B和C中的显微照片的区域的草图。中央小凹只包含M-视锥光感受器和L-视锥光感受器，并且既不包含OBC也不包含RGC，因为它们的细胞体被推开以便光穿过而不衍射到光感受器。中央凹仅包含视锥(M、L和S)并且是具有侏儒系统的最高敏度视力的区域，其中每个视锥连接到一个BPC和一个RGC。(B)显示了穿过副中央凹的剖面，其中DAPI(顶部显微图)显示了光感受器(ONL)、BPC和无长突细胞(INL)的清晰分层以及指示黄斑的RGC(GCL)的三维分层。底部显微图仅显示了转基因标记，指示mCitrine仅在OBC所位于的INL中表达。(C)显示了穿过中央凹的剖面。左边的显微照片仅显示了OBC的Gαo标记，这些OBC全部没有PKC标记(此处未显示)，因此被明确鉴定为cOBC。右显微照片另外描绘了细胞质内的mCitrine标记，指示中央凹的几乎每个cOBC都表达mCitrine(箭头)。这是770En_454P(hGRM6)在cOBC(特别是人黄斑的cOBC)中驱动优异表达的非常明确的证据，因此非常适合人类患者的高敏度视力恢复。
图8在新型770En_454P(hGRM6)启动子下编码视锥视蛋白和mGluR6嵌合光遗传蛋白质MWOPN_mGluR6-IRES2-TurboFP635的AAV质粒的质粒图谱。TurboFP635是用于鉴定表达的红色荧光蛋白标志物，WPRE和BGHpA是调控序列，并且5'和3'ITR(内部重复序列)是AAV机制用于将转基因(在ITR之间)包装到衣壳中的区域。该质粒用于转导rd1变性小鼠视网膜(图和实例5和6)。还给出了用于克隆的In-Fusion引物。
图9 770En_454P(hGRM6)和444En_454P(hGRM6)驱动人视网膜外植体中mCitrine表达的OBC表达特异性和功效的实例。分别用scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine(A)和scAAV2(7m8)-444En_454P(hGRM6)-mCitrine(B)转导的人视网膜外植体的纵向冷冻切片。用核染剂DAPI(灰色，仅在显微图的最左侧显示以进行定向)标记冷冻切片并针对转基因mCitrine标志物(白色)来标记冷冻切片。770En_454P(hGRM6)具有85.2％±12.3％(n＝4)的OBC功效(INL中亮细胞的百分比)并且444En_454P(hGRM6)具有87.9％±6.5％(n＝5)的OBC功效。ONL外核层，INL内核层，GCL神经节细胞层。双极细胞位于周边INL中。
实例
实例1：rd1小鼠模型中Grm6基因表达变化的分析
本发明人选择编码在视网膜的给光型双极细胞(OBC)中选择性表达的代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)的基因(小鼠中的Grm6和人中的GRM6)作为启动子设计的模板。这是因为mGluR6的表达对OBC有选择性，最近通过成年小鼠视网膜的单细胞转录组分析证实了这一点(Siegert等人，Nat Neurosci[自然-神经科学]2012.15:第487-495页)并且在本发明人先前产生的转基因小鼠品系中也十分明显，在该转基因小鼠品系中全长Grm6启动子驱动转基因在视网膜OBC中特异性表达(van Wyk等人，PloS Biol[公共科学图书馆：生物学]2015.13:第e1002143页)。此外，已经成功地构建了来源于鼠Grm6基因的短启动子形式，并且显示其驱动OBC中的优先表达(Cronin等人，EMBO Mol Med[EMBO分子医学]，2014.6(9):第1175-1190页；Kim等人，J Neurosci[神经科学杂志]2008.28:第7748-7764页；Lagali等人，Nat Neurosci[自然-神经科学]2008.11第667-675页)。Kim等人最初在鼠Grm6基因的启动子中选择了远端200bp增强子序列，该增强子序列增强了野生型小鼠视网膜中的OBC特异性表达。该增强子序列随后用于4xGRM6-SV40启动子[Cronin,T.等人，EMBO Mol Med[EMBO分子医学]，2014.6(9):第1175-1190页]，该启动子含有串联的四个这些200bp增强子序列。然而，本发明人最近证实，4xGRM6-SV40启动子[Cronin,T.等人，EMBO Mol Med[EMBO分子医学]，2014.6(9):第1175-1190页]在变性rd1(C3H/HeOu)小鼠视网膜中完全下调，即使在完全光感受器变性之前在3.5周龄时执行了基因治疗(van Wyk等人，Front Neurosci[神经科学前沿]2017.11:第161页)。这使得4xGRM6-SV40(以及同样地GRM6-SV40)不适于治疗变性视网膜。另外，SV40基本病毒启动子存在诸如慢性激活下的沉默和导致细胞毒性的蛋白质过表达之类的问题。为了设计更合适的OBC特异性启动子，本发明人首先在rd1变性小鼠模型中研究了Grm6表达在变性过程期间是否保持上调。本发明人采用rd1小鼠模型的基本原理是，在该严重和快速变性模型中有活性的启动子很可能在大多数不太严重的视网膜变性疾病中有活性。此前通过本发明人在较慢变性的rd10(B6.CXB1-Pde6brd10)小鼠模型中比较转基因表达而对这一点进行了例示，在该小鼠模型中4xGRM6-SV40仍能够驱动一些表达[van Wyk,M.等人，Front Neurosci[神经科学前沿]，2017.11(161):第161页]。本发明人通过实时定量PCR在时间点P14、P21、P28和P54定量了rd1小鼠视网膜中的Grm6基因表达，并与野生型C57BL/6J小鼠视网膜比较了表达水平。核糖体蛋白L8(Rpl8)表达用于表达水平的归一化。除了P21和P28之间的轻微下调(0.59倍)之外，Grm6表达在变性期间保持恒定(P＝0.8795)。由此，本发明人得出结论，所观察到的4xGRM6-SV40启动子的严重下调[van Wyk,M.等人，Front Neurosci[神经科学前沿]，2017.11(161):第161页]不太可能是由于Grm6增强子元件的下调，而可能是SV40基本启动子随着变性进展而功能减弱的结果。因此，本发明人使用Grm6基因作为OBC特异性启动子设计的模板。
实例2：基于GRM6的启动子的设计
鉴于未来在人类治疗中的用途，为了符合人转录机制，本发明人采用人GRM6序列而不是鼠Grm6序列作为模板。
本发明人使用针对“略微相似”序列(blastn)优化的基本局部比对搜索工具(BLAST，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)[Altschul等人，J Mol Biol[分子生物学杂志]，1990.215(3):第403-410页；协调员，Nucleic Acids Res[核酸研究]，2018.46(D1):第D8-D13页]来比对鼠Grm6和人GRM6基因序列。对于增强子特化，本发明人比对了Kim等人所鉴定的鼠200En增强子序列周围的1500bp[Kim等人，J Neurosci[神经科学杂志]，2008.28(31):第7748-7764页]。本发明人发现了小鼠基因组和人类基因组之间的310bp长的保守序列[相对于GRM6的翻译起始位点(TLSS)的-13819至-13510]，该序列在3'和5'方向上延伸超过Kim等人定义的200En序列(图1A，带横条纹的部分)。为了鉴定启动子序列，本发明人聚焦于翻译起始位点(TLSS，由本发明人定义为位置0)5’的GRM6序列(图1B)。比对后，本发明人使用加利福尼亚大学圣克鲁斯分校(University of CaliforniaSanta Cruz)的基因组学研究所(Genomics Institute)的基因组浏览器(UCSC基因组浏览器)[Church等人，PloS Biol[公共科学图书馆：生物学]，2011.9(7):第e1001091页]、[Kent等人，Genome Res[基因组研究]，2002.12(6):第996-1006页；Kuhn等人，Brief Bioinform[生物信息学简报]，2013.14(2):第144-161页]、[https://genome.ucsc.edu/；基因组组装2009年2月(GRCh37/hg19)]来鉴定GRM6基因的潜在调控序列，诸如种间保守序列、活性染色质区(DNA酶I超敏感性聚簇或H3K27Ac标志轨迹)或转录因子结合位点。基因转录调控数据库(GTRD)[Yevshin等人，Nucleic Acids Res[核酸研究]，2017.45(D1):第D61-D67页]进一步用于鉴定染色质免疫沉淀-DNA测序(ChIP-seq)峰，从而提供经实验验证的转录因子结合位点。总之，该信息使得本发明人能够突出显示可能在GRM6基因表达中具有功能重要性的以上鉴定区域中的序列。
然后本发明人根据以下基本原理选择了三个可能的增强子区[407En(hGRM6)、444En(hGRM6)和770En(hGRM6)]和两个可能的启动子区[566P(hGRM6)和454P(GRM6)](图1和表1)：407En(hGRM6)(相对于TLSS GRM6的-13873至-13467)由鼠基因组和人类基因组之间的300bp保守序列(图1A中带横条纹)组成。除了407En(hGRM6)之外，770En(hGRM6)(相对于TLSS GRM6的-14236至-13467)也包含3’ChIP-seq峰和DNA酶超敏感性聚簇(相对于TLSSGRM6的-13990至-13816)。444En(hGRM6)(相对于TLSS GRM6的-14033至-13590)是770En(hGRM6)的3’和5’截短形式，包括仅3’和5’的ChiP-seq峰。
当比对GRM6的序列-1000至-1(相对于TLSS)时，本发明人鉴定了167bp保守区(相对于TLSS GRM6的-425至-259)(图1B，图1B中带横条纹)。在包括该保守序列的情况下，本发明人设计了两个启动子：另外包含5’转录起始位点(TSS，相对于TLSS GRM6的-179)和5’H3K27Ac标志信号峰(相对于TLSS GRM6的-656至-405)以及第二3’ERG ChiP-Seq峰的566P(hGRM6)(相对于TLSS GRM6的-691至-126)。ERG被称为与770En和444En中所含的FLI1相互作用的激活因子。第二所选择的启动子序列454P(hGRM6)(相对于TLSS GRM6的-453至+1)与566P(hGRM6)相比在5’进一步延伸，包括TLSS和另外位于TLSS与TSS之间的潜在调控序列，诸如TCF7L1和MYC ChiP-Seq峰。
使用标准分子方法，在以下实例中详述的腺相关病毒(AAV)载体的ITR序列之间克隆报告子转基因前面的增强子和启动子序列的五种可能组合(表1)：
表1：所选择的增强子/启动子组合。
实例3：人视网膜中的功能性启动子评价
鉴于在人类患者中的治疗用途而在人GRM6基因上设计启动子后，在死后人视网膜外植体中评价所有启动子。为此，将启动子与mCitrine转基因组合并包装进自身互补型(sc)AAV衣壳，特别是scAAV2(7m8)(Dalkara等人，Sci Transl Med[科学转化医学]2013.5:第189ra76页)。
在第1天将大约5×106vg(载体基因组)加入到培养的死后人视网膜外植体的RGC侧，如以下文献中详述：[van Wyk,M.等人，Front Neurosci[神经科学前沿]，2017.11(161):第161页]。在培养的第7天，当来自scAAV的转基因表达可见时，冻存视网膜。本发明人对冷冻切片的报告子蛋白mCitrine和OBC标志物Goα进行染色以显现表达的定位并比较表达强度。高达85％的OBC在转导良好的区域中表达mCitrine(图9)。为了比较其与现有技术的性能，还将Lu的200En-mGluR500P启动子(Lu等人，Gene Ther[基因治疗]，2016.23:第680-689页)包装进scAAV2(7m8)中并且用于人视网膜外植体转导。对于每个启动子，用启动子构建体转导取自三只人眼的培养物，并对整个视网膜的冷冻切片进行组织学染色和分析。为了控制实验之间的差异，对所有样品平行进行处理和免疫组织化学。用配有Airyscan和ZEN2.1软件的ZEISS LSM880获取荧光图像。在具有相同显微镜设置的20x物镜下拍摄共聚焦显微照片(z叠层)。为了测定平均转导功效，从转导的OBC细胞体[mCitrine(+)和Goα(+)]测定细胞质Alexa488荧光(mCitrine的二抗)。特别地，使用Fiji图像处理软件的亮度函数测定来自4.15μm直径OBC体细胞区域的任意荧光值。用Fiji 21ulfils21进行图像分析(包括荧光定量和细胞计数)(版本2.0.0，https://fiji.sc/，Schindelin等人，NatMethods[自然-方法]，2012.9(7):第676-682页)。为了归一化，将来自每个表达OBC[mCitrine(+)和Goα(+)]的荧光值除以由来自非表达OBC[mCitrine(-)和Goα(+)]的测量结果确定的平均背景荧光值。如从图2明显看出，566P基本启动子介导OBC中最弱的mCitrine表达，而来自454P的表达总是显著强于来自Lu的200En-mGluR500P的表达，与所用增强子元件无关。因此，454P被选择用于所有后续实验。770En_454P(hGRM6)(F＝6.03±1.53；平均值±标准偏差)和407En_454P(hGRM6)(F＝5.65±0.09；平均值±标准偏差)在功效方面表现同样出色，并且显著好于Lu的小鼠来源200En-mGluR500P(F＝4.49±0.22；平均值±标准偏差)，因此更详细地分析了这两者。
实例4：人视网膜外植体中显著增强的视锥给光型双极细胞偏好
在下一步中，分析切片的OBC细胞类型表达特异性。为此，用抗转基因mCitrine的抗体、抗遍在OBC标志物Gαo的抗体和视杆双极细胞特异性抗体PKCα对切片进行染色。[mCitrine(+)，PKCα(+)，Gαo(+)]细胞被明确鉴定为表达视杆给光型双极细胞(RBC)，而[mCitrine(+)，PKCα(-)，Gαo(+)]细胞被明确鉴定为表达视锥给光型双极细胞(cOBC)。因此，[mCitrine(-)，PKCα(+)]细胞被鉴定为非表达RBC，并且[mCitrine(-)，PKCα(-)，Gαo(+)]细胞被鉴定为非表达cOBC。图3所示的结果清楚地表明，与200En-mGluR500P相比，770En_454P(hGRM6)和407En_454P(hGRM6)在cOBC中驱动显著更高的转基因表达。通过将表达cOBC和RBC的量归一化到所分析的视网膜区域中cOBC和RBC的总数来确定cOBC偏好的量度(图3B)。这种归一化揭示，与200En-mGluR500P(16.3％的cOBC偏好)相比，770En_454P(hGRM6)(49.5％的cOBC偏好)和407En_454P(hGRM6)(36.4％的cOBC偏好)在cOBC细胞类型中具有高度增强的驱动表达的能力。特别值得注意的是，770En_454P(hGRM6)对RBC和cOBC显示出等同的偏好(各约50％，图3B)。
另外，用scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine转导移植的人视网膜的黄斑。用mCitrine、PKCα和Gαo免疫标记清楚地显示中央凹仅含有cOBC，并且770En_454P(hGRM6)驱动mCitrine在几乎所有cOBC中表达(图7)。在人中央凹的cOBC中有效驱动转基因表达的能力对于人类治疗至关重要，因为中央凹介导高敏度视力，因此代表恢复视力的视网膜基因治疗的主要靶标-中央凹仅含有cOBC。
实例5：770En_454P(hGRM6)与200En-mGluR500P相比的OBC特异性
需要对OBC的高度偏好以避免脱靶效应，诸如被破坏的视网膜信号传导。用抗mCitrine(转基因)的抗体、抗Goα(通用OBC标志物)的抗体和核染剂DAPI标记人视网膜切片以区分细胞层。由此可以推导出表达细胞类型的身份：光感受器(PR，mCitrine(+)，位于外核层)、OBC[mCitrine(+)，Goα(+)并位于内核层]、无长突细胞[AC，mCitrine(+)，Goα(-)并位于内核层]和神经节细胞(GC，mCitrine(+)，位于神经节细胞层)。图4A清楚地显示，与200En-mGluR500P(70.1％±12.2％)相比，新型启动子770En_454P(hGRM6)对OBC的偏好显著增加(88.3％±7.8％)。另外，与新型770En_454P(hGRM6)启动子(4.1％±3.2％)相比，200En-mGluR500P的脱靶表达通常更高，特别是在AC中(16.9％±9.1％)。该新型启动子对于光遗传视力恢复特别重要，在光遗传视力恢复中脱靶表达破坏视网膜信号传导。
实例6：变性小鼠视网膜中的启动子评价
对于视网膜治疗重要的是组织对治疗的可及性。这在具有解剖、功能和转录变化的变性过程中可能具有挑战性。本发明人先前已经表明，Kim的鼠200En-SV40启动子在快速变性rd1小鼠模型中不再具有功能(van Wyk等人，Front Neurosci[神经科学前沿]2017.11:第161页)。因此，在变性rd1小鼠模型中测试了770En_454P(hGRM6)[以及用于比较的其鼠对应物200En-mGluR500P[Lu等人，Gene Ther[基因治疗]2016.23第680-689页]的性能。将这些启动子与光遗传MWOPN_-mGluR6-IRES2-TurboFP635(SEQ ID NO:16，质粒图谱图8)转基因组合，并包装进ssAAV2(7m8)中(Dalkara等人，Sci Transl Med[科学转化医学]2013.5:第189ra76页)。如以下文献所述的那样将3×109vg玻璃体内注射到变性晚期22周龄rd1小鼠的眼睛中：(van Wyk等人，Front Neurosci[神经科学前沿]2017.11:第161页；van Wyk等人，PloS Biol[公共科学图书馆：生物学]2015.13:第e1002143页)。注射后4周，对小鼠施以安乐死并如先前所述的那样提取视网膜用于免疫组织化学分析[van Wyk,M.等人，Front Neurosci[神经科学前沿]，2017.11(161):第161页；van Wyk等人，PloS Biol[公共科学图书馆：生物学]2015.13:第e1002143页]。本发明人针对转基因TurboFP635、OBC特异性Goα标志物和核染剂DAPI标记了切片。与200En-SV40相反，770En_454P(hGRM6)以及Lu的Grm6来源200En-mGluR500P在rd1视网膜的OBC中有功能(图5)。然而，200En-mGluR500P引起仅在受限制的视网膜区域中表达，如图5A中所例示，而770En_454P(hGRM6)引起变性视网膜的更加广泛和普遍的转导(图5B)，这可能是由于其表达强度增加，从而在已发生一些Grm6下调时克服表达阈值。为了分析在变性视网膜中由770En_454P(hGRM6)驱动的转基因(mCitrine)表达的特异性和功效，本发明人在甚至更晚的时间点(29-33周龄)注射另外9只rd1小鼠。4周后，对动物施以安乐死，将眼睛冷冻并切片。再次用抗mCitrine的抗体和抗Goα的抗体标记冷冻切片，并在共聚焦显微镜下分析冷冻切片。即使在此，在这些完全变性的视网膜中，表达转基因的所有细胞[mCitrine(+)，Goα(-)]中的约67％是OBC[mCitrine(+)，Goα(+)]。同样地，所有OBC[mCitrine(-)，Goα(+)]中的约55％表达转基因[mCitrine(+)，Goα(+)](图5D)。治疗性转基因在变性视网膜中的广泛和特异性表达是有效基因治疗的基础。
实例7：rd1小鼠中的光遗传基因治疗和视力恢复
为了了解770En_454P(hGRM6)的有利特性是否支持靶向于OBC的功能性光遗传视力恢复，本发明人用rd1变性小鼠模型进行了原理验证实验。本发明人将ssAAV(7m8)-770En_454P(hGRM6)-MWOPN_mGluR6-IRES2-TurboFP635-WPRE-BG HpA(质粒图谱图8)的3×109vg双侧注射到三只22周龄的完全无光感受器的rd1小鼠中。MWOPN_mGluR6(SEQ ID NO16)是鼠视锥中波长视蛋白(MWOPN)与鼠mGluR6之间的嵌合蛋白质，该蛋白质以与介导OBC活性的Opto-mGluR6类似的方式起作用且具有此视觉恢复(van Wyk等人，PloS Biol[公共科学图书馆：生物学]2015.13:第e1002143页)。本发明人通过在注射后的不同时间点(第41、47、55、82和112天)在自动化虚拟OptoDrum
中检测视动反应(OMR)(依照[Prusky等人，Invest Ophthalmol Vis Sci[眼科研究与视力学]，2004.45(12):第4611-4616页])来测量视敏度，该自动化虚拟OptoDrum包含小室(54×54×30cm)和围绕可放置动物的平台的四个屏幕(23.8”全高清IPS面板)。将屏幕的亮度调节至250cd/m2，并用镜子覆盖室的底部和顶部。在屏幕上以不同空间频率显示黑色和白色非正弦垂直条的旋转图案时，小型工业相机(具有全局快门和广角镜头的IR敏感1/3”CMOS传感器，F1.6)从上方跟踪小鼠的头部运动。软件Optodrum分析记录的头部运动并且控制所施加的刺激的厚度、对比度和速度。移动条的速度被设定为12°/s，并且对比度被设定为100％。如图6所示，根据不同试验的所有测量的视敏度来确定每只小鼠的中值视敏度。经治疗的小鼠的中值视敏度为0.29±0.03周/°(n＝3，±标准偏差，P＝0.0048)，显著优于未注射的rd1对照小鼠(0.15±0.06周/°(n＝7，P≥194))，但仍差于有视觉的C57BL/6阳性对照(其平均视敏度为0.43±0.05周/°(n＝10，标准偏差，P＝0.0006))。然而，光遗传OBC靶向治疗带来了视动反应的显著改善。总之，结果证明770En_454P(hGRM6)满足靶向OBC的人类基因治疗的所有要求，其为基于人类基因的短(1243bp)启动子，但在变性中仍然高效并且对于OBC(包括cOBC)具有特异性。
材料与方法
生物活性测定法
在上述实例部分中描述了生物活性测定法。在别处详细描述了对人视网膜外植体进行培养和AAV转导以及将AAV玻璃体内注射到小鼠眼睛中并随后对冷冻视网膜切片进行免疫组织化学处理[van Wyk,M.等人，Front Neurosci[神经科学前沿]，2017.11(161):第161页]。
视锥给光型双极细胞特异性的确定
为此，用抗转基因mCitrine的抗体(英杰公司，A11122，1:500)、抗遍在OBC标志物Gαo的抗体(EMD，MAB3073，1:750)和RBC特异性抗体PKCα(圣克鲁斯公司，sc8393，1:750)对视网膜冷冻切片进行三重染色。[mCitrine(+)，PKCα(+)，Gαo(+)]细胞被明确鉴定为表达RBC，而[mCitrine(+)，PKCα(-)，Gαo(+)]细胞被明确鉴定为表达cOBC。图3A中描绘的OBC类型偏好通过表达cOBC与所有OBC的比率[mCitrine(+)，PKCα(-)，Gαo(+)]/[Gαo(+)]确定，并且RBC类型偏好通过表达RBC与所有OBC的比率[mCitrine(+)，PKCα(+)，Gαo(+)]/[Gαo(+)]确定。为了获得cOBC表达偏好的量度，换句话说，cOBC表达的机会，本发明人将表达cOBC和RBC的数量分别与该特定视网膜分析区域中cOBC和RBC的量相关联。该归一化是可能的，因为[mCitrine(-)，PKCα(+)，Gαo(+)]细胞可被明确鉴定为非表达RBC，并且[mCitrine(-)，PKCα(-)，Gαo(+)]可被明确鉴定为非表达cOBC。因此，比率[mCitrine(+)，PKCα(+)，Gαo13(+)]/[mCitrine(-)，PKCα(+)，Gαo(+)]表示转导和表达的RBC的百分比，而比率[mCitrine(+)，PKCα(-)，Gαo(+)]/[mCitrine(-)，PKCα(-)，Gαo(+)]表示在相应视网膜分析区域中转导和表达的cOBC的百分比。因此，图3B中所示的所得百分比指示cOBC被转导的机会。
用于分子工程的软件
本发明人使用加利福尼亚大学圣克鲁斯分校的基因组学研究所的基因组浏览器(UCSC基因组浏览器，https://genome.ucsc.edu/)[Kent等人，Genome Res[基因组研究]，2002.12(6):第996-1006页；Kuhn等人，Brief Bioinform[生物信息学简报]，2013.14(2):第144-161页]来研究基因组启动子序列和基因组注释。
为了鉴定可能参与调控由基于GRM6的新型启动子产生的基因表达的转录因子和转录因子结合位点，本发明人采用了来自基因转录调控数据库(GTRD，gtrd.biouml.org/)的ChIP-seq数据[Yevshin等人，Nucleic Acids Res[核酸研究]，2017.45(D1):第D61-D67页]。
在Vector NTI Advance(版本11.5.2)中生成质粒图谱。
抗体
表3：用于免疫组织化学的抗体
共聚焦成像硬件和软件
使用配有Airyscan和ZEN2.1软件的ZEISS LSM 880以20x或40x物镜拍摄共聚焦图像。在Fiji中处理和评价图像[Schindelin等人，Nat Methods[自然-方法]，2012.9(7):第676-682页]。细胞计数器插件用于细胞计数，并且标准Fiji工具用于图像处理。在Fiji无法自动组合瓦片扫描图片的情况下使用Stitch插件[Preibisch等人，Bioinformatics[生物信息学],2009.25(11):第1463-1465页]。
统计
如果没有另外说明，则使用双尾学生t检验比较数值，并给出整个该工作过程中的生物样品的平均值和±标准偏差。显著性水平由星号指示：*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，并且***表示P≤0.001。
其他方法
上文及实例1和2中未描述的其余方法可见于[van Wyk,M.等人，Front Neurosci[神经科学前沿]，2017.11(161):第161页]。
序列
表4：本研究中使用的序列
SEQ ID NO.1：407En(hGRM6)
SEQ ID NO.2：770En(hGRM6)
SEQ ID NO.3：444En(hGRM6)
SEQ ID NO.4：429En(mGrm6)，对应于407En(hGRM6)的鼠序列
SEQ ID NO.5：792En(mGrm6)，对应于770En(hGRM6)的鼠序列
SEQ ID NO.6：460En(mGrm6)，对应于444En(hGRM6)的鼠序列
SEQ ID NO.7：454P(hGRM6)
SEQ ID NO.8：566P(hGRM6)
SEQ ID NO.9：454P(mGrm6)，对应于454P(hGRM6)的鼠序列
SEQ ID NO.10：566P(mGrm6)，对应于566P(hGRM6)的鼠序列
SEQ ID NO.11：407En_454P(hGRM6)
SEQ ID NO.12：407En_566P(hGRM6)
SEQ ID NO.13：770En_454P(hGRM6)
SEQ ID NO.14：770En_566P(hGRM6)
SEQ ID NO.15：444En_454P(hGRM6)
SEQ ID NO.16：MWOPN_mGluR6
SEQ ID NO.17：IRES2
SEQ ID NO.18：mCitrine
SEQ ID NO.19：TurboFP635
SEQ ID NO.20：WPRE
SEQ ID NO.21：BGH pA
SEQ ID NO.22：sNRP-1pA
1aaataaaata cgaaatg 17SEQ ID NO.23：野生型衣壳AAV2
SEQ ID NO 24
gccgccAccAUGG
SEQ ID NO 25
gccgccGccAUGG
Claims (13)
1.一种长度为850碱基对(bp)至1500bp的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含：
a.选自SEQ ID NO 1至3的增强子序列元件，以及
b.SEQ ID NO 7的启动子序列元件。
2.一种长度为850碱基对(bp)至1500bp的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含：
a.增强子序列元件，所述增强子序列元件与选自SEQ ID NO 1至3的序列具有至少(≥)70％，特别是≥75％，≥80％，更特别是≥85％，更特别是≥90％，更特别是≥95％，甚至更特别是≥98％，最特别是100％同一性；以及
b.启动子序列元件，所述启动子序列元件与SEQ ID NO 7的序列具有≥70％，特别是≥75％，更特别是≥80％，更特别是≥85％，更特别是≥90％，更特别是≥95％，甚至更特别是≥98％，最特别是100％同一性；
并且所述分离的核酸分子具有来自SEQ ID NO 13的序列的视锥给光型双极细胞特异性的≥40％，特别是≥50％，更特别是≥60％，甚至更特别是≥70％，更特别是≥80％，甚至更特别是≥90％，最特别是100％，以及≥20％，特别是≥25％，更特别是≥30％，甚至更特别是≥35％，更特别是≥40％，最特别是≥50％的视锥给光型双极细胞偏好。
3.根据权利要求1或2所述的分离的核酸分子，其中所述分离的分子由所述增强子序列元件中的一个且只有一个增强子序列元件、所述启动子序列元件中的一个且只有一个启动子序列元件以及任选地将所述增强子序列元件与所述启动子序列元件分开的间隔区组成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含选自SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 15的序列或由其组成，或者包含特征在于与选自SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 15的序列具有≥98％同一性的序列或由其组成。
5.根据前述权利要求中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含所述序列SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 13或由其组成，或者包含特征在于与SEQ ID NO 11或SEQID NO 13具有≥98％同一性的序列或由其组成，特别是包含所述序列SEQ ID NO 13或由其组成，或者包含特征在于与SEQ ID NO 13具有≥98％同一性的序列或由其组成。
6.一种核酸表达载体，所述核酸表达载体包含根据前述权利要求中任一项所述的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的核酸表达载体，其中所述核酸表达载体是腺相关病毒载体或重组腺相关载体(rAAV)，特别是其中所述核酸表达载体是重组AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12载体，更特别是其中所述核酸表达载体是重组AAV2载体。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的核酸表达载体，所述核酸表达载体另外包含：
a.编码衣壳蛋白的序列，和
b.转基因。
9.根据权利要求8所述的核酸表达载体，其中所述转基因包含SEQ ID NO 16的序列。
10.一种腺相关病毒颗粒，所述腺相关病毒颗粒包含根据权利要求1至5中任一项所述的分离的核酸分子或根据权利要求6至9中任一项所述的核酸表达载体。
11.一种药剂，所述药剂选自根据权利要求1至5中任一项所述的分离的核酸分子或根据权利要求6至9中任一项所述的核酸表达载体和根据权利要求10所述的腺相关病毒颗粒并用作药物。
12.一种药剂，所述药剂选自根据权利要求1至5中任一项所述的分离的核酸分子、根据权利要求6至9中任一项所述的核酸表达载体和根据权利要求10所述的腺相关病毒颗粒并用于治疗先天性静止性夜盲(CSBN1)或视杆-视锥和视锥-视杆营养不良，更特别是治疗视网膜色素变性和黄斑变性。
13.一种药剂，所述药剂选自根据权利要求1至5中任一项所述的分离的核酸分子、根据权利要求6至9中任一项所述的核酸表达载体和根据权利要求10所述的腺相关病毒颗粒，其中通过以下方式施用所述药剂：
a.玻璃体内施用，特别是玻璃体内注射，或
b.视网膜下注射。
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Legal Events
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