CN111093716B - 用于治疗神经性疼痛的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过软膜下施用少量组合物来治疗神经性疼痛的疗法，所述组合物用于使GAD65(谷氨酸脱羧酶)基因和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)基因的脊髓节段上调，从而通过增强囊泡GABA从被感染的背角神经元释放至突触间隙来有效地引起伤害感受效应。

Description

用于治疗神经性疼痛的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2017年9月8日提交的美国序列号62/556,088的优先权的权益，其全部内容通过引用被并入到本文中。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用而整体并入到本文。于2018年9月6日创建的ASCII副本命名为20378-201844_SL.txt，大小为22KB。

技术领域

本发明总体上涉及治疗神经性疼痛，并且更具体地涉及包括在脊髓软膜下递送一种或多种基因以治疗慢性神经性疼痛的联合治疗方案。

背景技术

神经性疼痛是由多种类型的神经损伤引起的疼痛。神经性疼痛病症的一些实例包括但不限于糖尿病周围神经病变、带状疱疹、疱疹后神经痛、三叉神经痛、复杂的区域性疼痛综合征、反射性交感神经营养不良、偏头痛、幻肢综合症、慢性疾病(多发性硬化症、HIV等)引起的神经性疼痛、外伤引起的神经性疼痛(灼性神经痛)、撞击引起的神经性疼痛(即坐骨神经痛、腕管神经痛等)、药物或有毒化学物质暴露引起的神经性疼痛、感染或感染后引起的神经性疼痛、器官功能受损引起的神经性疼痛、血管疾病引起的神经性疼痛、代谢性疾病引起的神经性疼痛、癌症或癌症治疗引起的神经性疼痛、自身免疫性疾病引起的神经性疼痛、神经性腰背痛、纤维肌痛引起的神经性疼痛，以及不明原因的神经性疼痛(特发性)。实际上，神经性疼痛通常基于症状来诊断，因此以灼热感和/或射痛和/或麻木感和/或刺痛和/或异常性疼痛为特征的任何疼痛通常被认为是神经性的。神经性疼痛的其他特征包括多发性神经病(对刺激的过度夸大疼痛感)、感觉过敏(对正常刺激的敏感性增加)、感觉迟钝(不悦异常感，当不是正在受到损伤时感受到好像正在受到损伤)和感觉异常(异常感觉，诸如“针刺感”，无论是自发的还是诱发的)。

众所周知，伤害性疼痛和神经性疼痛是由不同的机制引起的，因此它们对不同的治疗方式有不同的响应。伤害性疼痛由位于皮肤、骨骼、结缔组织、肌肉和内脏的受体介导。这些受体通常对有害的化学刺激、热刺激和机械刺激产生响应，从而导致通常被描述为锐痛、酸痛、抽痛或持续性剧痛(gnawing)的疼痛。相反，神经性疼痛是由于周围或中枢神经系统的损伤或病理变化而产生的，通常产生会自然地被描述为“灼痛”、“电击痛”、“刺痛”和“射痛”的疼痛。最后，伤害性疼痛通常对阿片类药物和非甾体类抗炎药(NSAIDS)有响应，而采用这些方法治疗神经性疼痛的成功受到限制。

目前，鞘内注入的抗伤害感受性化合物(如加巴喷丁和阿片类药物)用于实现脊髓限制的抗伤害感受性效果。然而，没有可用于治疗慢性神经性疼痛的基于基因治疗的技术。类似地，目前也没有可以有效地用于抑制特定脊髓节段中的为周围神经损伤部位同侧的伤害性传递基于基因治疗的技术。此外，当前可用的脊髓药物递送系统(诸如硬膜外递送或鞘内递送)不允许限制脊髓节段的治疗效果。因此，需要对神经性疼痛这种改进的治疗。

发明内容

本发明基于以下观察结果：由GAD65(谷氨酸脱羧酶)和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)的脊髓节段特异性上调组成的联合治疗通过增强囊泡GABA从被感染的背角神经元释放到突触间隙而有效地引起伤害感受效应。

因此，本发明提供了一种在受试者中治疗神经性疼痛的方法。该方法包括软膜下施用包括以下的组合物：(i)在组织特异性启动子的控制下的病毒载体序列、GAD65基因序列(例如，SEQ ID NO：2或5)和VGAT基因序列(例如，SEQ ID NO：4或6)，(ii)药学上可接受的病毒载体，从而治疗受试者的神经性疼痛。在各种实施方式中，受试者可以是哺乳动物。在各种实施方式中，核酸构建体包封在AAV血清型9衣壳中。在各种实施方式中，组合物中核酸构建体的浓度为约0.1×10¹³gc/ml至2.0×10¹³gc/ml。在各种实施方式中，药学上可接受的病毒载体选自由慢病毒载体、腺病毒载体(AV)或腺相关载体(AAV)组成的组。在各种实施方式中，AAV选自由AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh33、AAVrh34和AAV Anc80组成的组。在各种实施方式中，组织特异性启动子选自由人泛素启动子和人突触蛋白启动子组成的组。

在另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗神经性疼痛的方法。该方法包括软膜下施用包括治疗有效量的基因治疗构建体和药学上可接受的载体的组合物，从而治疗受试者的神经性疼痛，所述基因治疗构建体包含在组织特异性启动子的控制下的(i)病毒载体序列、(ii)GAD65基因序列和(iii)VGAT基因序列。在各种实施方式中，核酸构建体包封在AAV血清型9衣壳内。在各种实施方式中，组合物中核酸构建体的浓度为约0.1×10¹³gc/ml至2.0×10¹³gc/ml。在各种实施方式中，药学上可接受的病毒载体选自由慢病毒载体、腺病毒载体(AV)或腺相关载体(AAV)组成的组。在各种实施方式中，AAV选自由AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh33、AAVrh34和AAV Anc80组成的组。在各种实施方式中，组织特异性启动子选自由人泛素启动子和人突触蛋白启动子组成的组。

在另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗神经性疼痛的方法。该方法包括软膜下施用编码GAD65(谷氨酸脱羧酶)基因的第一载体和编码VGAT(囊泡GABA转运蛋白)基因的第二载体，从而治疗受试者的神经性疼痛。施用第一载体和第二载体引起受试者中GAD65基因和VGAT基因的脊髓特异性上调。在各种实施方式中，第一病毒载体包括编码GAD65的多核苷酸，并且第二病毒载体包编码VGAT的多核苷酸，其中GAD65和VGAT在受试者中表达，从而治疗受试者的神经性疼痛。第一载体和第二载体可为慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关载体(AAV)。AAV可以是AAV 9型(AAV9)或AAV Anc80。在各种实施方式中，第一载体是AAV9-UBI-GAD65，并且第二载体是AAV9-UBI-VGAT。

在另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗神经性疼痛的方法。该方法包括向有需要的受试者软膜下施用治疗有效量的包含编码GAD65的多核苷酸的病毒载体，并向该受试者全身施用GABA激动剂，从而治疗该受试者的痉挛。该载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关载体(AAV)，并且可以被直接施用到受试者的脊髓。AAV可以是AAV 9型(AAV9)或AAV Anc80。在各种实施方式中，载体是AAV9-UBI-GAD65。

在另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，该核酸构建体包括：在组织特异性启动子的控制下的病毒载体序列、GAD65基因序列和VGAT基因序列。在各种实施方式中，组织特异性启动子选自由人泛素启动子和人突触蛋白启动子组成的组。在各个实施方式中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体，诸如AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAV rh33、AAV rh34或AAV Anc80。

附图说明

图1A至图1C为示出了单侧脊椎软膜下载体递送的示图。图1A示出了动物模型中带有软膜下放置的导管的脊髓的示图。图1B示出了将注射针在单侧软膜下推进(3mm)到软膜下间隙中以递送载体组合物。图1C示出了在成年小鼠中单侧软膜下递送AAV9-UBI-GFP(0.5μl；1.2×10¹³gc/ml)2周的单侧背角mRNA-GFP信号(荧光原位杂交；FISH)。

图2A至图2F为示出了在患有发展性神经性疼痛的小鼠中，软膜下递送AAV9-UBI-GAD65/VGAT或Anc80-UBI-GAD65/VGAT后的抗伤害感受结果的示图和图示。图2A和图2B示出了在接受单侧软膜下注射AAV9-UBI-GAD65/VGAT载体的动物的后足中对触觉和刷诱发的伤害性感受作用的显著抑制。图2C和图2D示出了接受单侧软膜下注射AAV9-UBI-GAD65/VGAT载体的神经病变动物在旷场运动表现(跑动距离)和同侧后足放置模式(Cat Walk分析)的显著改善。图2E和图2F示出了在用Anc80-UBI-GAD65/VGAT载体治疗的神经病变动物中观察到的类似的抗伤害性感受作用。

图3A至图3E为示出了成年小鼠在单侧(同侧)(L2-L4)软膜下递送AAV9-UBI-GAD65/VGAT后，同侧背角兴奋性中间神经元中诱导混合抑制性-兴奋性神经递质表型的示图和图示。图3A至图3D示出了用VGLUT2(图3A)、GAD65(图3B)，VGAT(图3C)以及VGLUT2、GAD65和VGAT对染色的斑点共定位(图3D)来对同侧背角神经元进行染色的图像。检测到VGLUT2与VGAT以及VGLUT2与GAD65的清晰共表达(白色箭头)。图3E示出了在经治疗的动物(损伤的+GAD65+VGAT)和对照动物(损伤的+PBS)的背角(I-III层)中VGLUT、GAD65和VGAT表达的定量密度结果。用AAV9-UBI-GAD65/VGAT载体或单独用PBS对小鼠进行同侧(L2-L4)注射。在对侧背角中未观察到/测量到表达增加。

图4A至图4D是示出了用VGLUT2、GAD65和VGAT抗体染色预包埋免疫金与电子显微镜的结合示图，其中表明：如果与注射PBS的动物(PNI-PBS)相比，注射AAV9-UBI-GAD65/VGAT的动物(PNI+GAD65+VGAT)的VGLUT2+末端中，GAD65和VGAT免疫金标记的粒子明显增加。

图4E至图4J是示出了荧光原位杂交的结果的示图，其中表明在注射AAV9-UBI-GAD65/VGAT的动物的同侧背角神经元中明显出现VGLUT2、GAD65和VGAT mRNA双重标记和三重标记的神经元(白色箭头)。

图5A至图5D是示出了在成年猪模型中单侧Anc80-UBI-Rpl22(3xHA)递送的示图。如图所示，在成年猪模型的单侧软膜(L2-L3)下Anc80-UBI-Rpl22-3xHA载体(100μl；1.2×10¹³gc/ml)递送后，观察到同侧背角神经元特异性Rpl22蛋白表达(DH-背角；VH-腹角)。

图6A至图6D是示出了在成年猪中单侧Anc80-UBI-GAD65/VGAT递送在背角神经元中诱导混合的兴奋性-抑制性神经元表型的示图。在动物模型(成年猪；35kg)注射Anc80-UBI-GAD65/VGAT载体(100μl；1.2×10¹³gc/ml)同侧，用VGLUT2(图6A)、VGAT(图6B)和GAD65(图6C)抗体对同侧背角神经元染色。如图所示，能够检测到VGLUT2与VGAT和GAD65(白色的点)的清晰共表达(图6D)。

图7是示出了如下实验设计的示例性步骤的示意图，该实验设计用于研究在慢性脊髓损伤引起的肌肉痉挛的大鼠模型中，脊髓软膜下递送GAD65和VGAT基因的治疗性抗痉挛作用。步骤A和步骤B显示，后肢的肌肉痉挛由Th9脊髓节段横断引起，并且通过响应于足触觉刺激的腓肠肌肌电图(EMG)的定量变化来识别/测量痉挛。步骤C和步骤D显示，在引起肌肉痉挛后2至3个月，动物接受在腰椎软膜下注射AAV9(或Anc80)-UBI-GAD65/VGAT载体，并在额外的2个月测量是否存在痉挛反应。步骤E显示在处死后，通过免疫荧光染色来测量是否存在GAD65和VGAT上调。

图8A至图8D是示出了在脊髓横断引起的肌肉痉挛的慢性大鼠模型中，软膜下递送AAV9-UBI-GAD65/VGAT后的抗痉挛作用的示图和图示。图8A和图8B示出了在接受对照载体(AAV9-GFP)的动物中测量的肌肉痉挛结果，该结果表明病毒递送后8周内肌肉痉挛逐渐增加(与在脊髓横断2至3个月后测得的基线相比)。相比之下，在接受AAV9-UBI-GAD65/VGAT载体的动物中测量到接近完全被阻断的痉挛反应。图8C和图8D示出了对H-反射频率依赖性抑制(RDD)的测量结果，该结果显示在用AAV9-UBI-GAD65/VGAT载体治疗的动物中RDD的显著恢复。

图9A至图9D是示出了VGLUT2、GAD65和VGAT在注射有AAV9-UBI-GFP(对照载体)或AAV9-UBI-GAD65/VGAT载体的动物(大鼠)的背角神经元中表达的示图。图9A和图9B示出了在接受对照AAV9-UBI-GFP载体的动物中，VGLUT2末端中没有GAD65和VGAT共表达。图9C和图9D示出了在慢性肌肉痉挛的成年大鼠模型中，在双侧(L2-L4)软膜下AAV9-UBI-GAD65/VGAT递送后，在腰部兴奋性中间神经元中诱导混合抑制性-兴奋性神经递质表型。能够观察到脊髓神经元中出现混合的神经递质表型，如GAD65和VGAT在VGLUT2末端中共表达所证明。

具体实施方式

本发明基于以下观察结果：软膜下施用少量的由GAD65(谷氨酸脱羧酶)基因和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)基因的脊髓节段特异性上调组成的联合治疗通过增强囊泡GABA从被感染的背角神经元释放到突触间隙而有效地引起的伤害性效应。

在描述本发明的组合物和方法之前，应理解的是，本发明不限于所描述的具体组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。还应理解的是，本文中使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而无意于限制本发明，因为本发明的范围仅由所附权利要求书来限定。

除非上下文另有明确说明，否则在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该/所述(the)”涵盖复数涵义。因此，例如，提及“该方法/所述方法”时包括在阅读本公开后，对于本领域技术人员将变得显而易见本文描述的类型的一种或多种方法和/或步骤。

术语“包括(comprising)”可与“包含(including)”、“含有(containing)”或“特征在于(characterized by)”互换使用，是包含性或开放式语言，并且不排除其他未列举的要素或方法步骤。短语“由...组成”排除了权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤以及那些不会对所要求保护的发明的基本和新颖特征产生实质性影响的材料或步骤。本公开考虑了与这些短语中的每一个的范围相对应的本发明组合物和方法的实施方式。因此，包括所列举的要素或步骤的组合物或方法考虑了其中所述组合物或方法基本上由这些要素或步骤组成或者由些要素或步骤组成的特定实施方式。

本文提供的范围应理解为是该范围内所有值的简写。例如，范围1至50可以理解为包括由以下各数字组成的组中的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50。

术语“约”和“大约”通常是指在给定测量的性质或精度的情况下，对所测量的量可接受的误差程度。典型地，示例性误差程度在给定值或范围值的百分之20(％以内，优选在10％以内，更优选在5％以内。替代性地，并且特别是在生物体系中，术语“约”和“大约”可以指在给定值的数量级内的值，优选地在给定值的10倍或5倍之内，并且更优选地在2倍之内。除非另有说明，否则本文中给出的数值量是近似的，这意味着当没有明确说明时，可以推断出术语“约”或“大约”。

除非另有限定，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是现在对优选的方法和材料进行描述。

如本文所使用的，术语“受试者”是指进行本发明方法的任何个体或患者。通常，受试者是人，但是如本领域技术人员所理解的，受试者可以是动物。因此，受试者的定义还涵盖包括诸如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子之类的哺乳动物、农场动物(包括牛、马、山羊、绵羊、猪等)以及灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、红猩猩和大猩猩)在内的其他动物。

如本文所用，“治疗效果”涵盖如本文所述的治疗益处和/或预防益处。

如本文所用，术语“降低”和“抑制”是一起使用的，因为认识到在某些情况下，减少可以降低到低于特定测定的检测水平。因此，可能并不总是清楚表达水平或活性是被“降低”到低于测定的检测水平还是被完全“抑制”。然而，在根据本发明的方法进行治疗之后，这将能够明确确定。

如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指将组合物施用至患有不希望病症的受试者或体系。该病症可以包括疾病或紊乱。“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指将组合物施用至具有患病风险的受试者或体系。该病症可包括易患的疾病或紊乱。向受试者施用该组合物(治疗和/或预防)的效果可以是但不限于病症的一种或多种症状停止、病症的一种或多种症状减轻或预防、病症的严重程度降低、病症的完全消除、特定事件或特征的发展或进程的稳定或延迟，或特定事件或特征发生机会的最小化。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，用来表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、α-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。

氨基酸在本文中可以用其公知的三个字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸可以用它们普遍接受的单字母代码来指代。

如本文所用，“调控基因”或“调控序列”是编码控制其他基因表达的产物(例如转录因子)的核酸序列。

如本文所用，“蛋白质编码序列”或编码特定蛋白质或多肽的序列是置于适当调控序列控制下，在体外或体内转录成mRNA(在DNA的情况下)并翻译成多肽(在mRNA的情况下)的核酸序列。编码序列的边界由5'末端(N-末端)的起始密码子和3'末端(C-末端)的翻译终止无义密码子确定。编码序列可以包括但不限于来自真核mRNA的cDNA、来自真核DNA的基因组DNA序列和合成的核酸。转录终止序列通常位于编码序列的3'端。

如本文所用，“启动子”被定义为通常位于基因上游的调控DNA序列，其通过指导RNA聚合酶与DNA结合并启动RNA合成来介导转录的起始。启动子可以是组成型活性启动子(即持续处于活性/“ON”状态的启动子)，它可以是诱导型启动子(即，受外部刺激，例如特定化合物或蛋白质的存在的控制，启动子处于活性/“ON”或无活性/“OFF”的状态)，它可以是受空间限制的启动子(即，转录控制元件、增强子等)(例如，组织特异性启动子、特定细胞类型启动子等)，并且它可以是受时间限制的启动子(即，在胚胎发育的特定阶段期间或在生物过程的特定阶段期间，处于“ON”状态或“OFF”状态的启动子)。

如本文所用，术语“基因”是指包含结构基因的编码区的脱氧核糖核苷酸序列。“基因”还可以包括位于5'和3'末端的编码区附近的非翻译序列，使得该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5'端并且存在于mRNA上的序列被称为5'端非翻译序列。位于编码区3'端或下游并且存在于mRNA上的序列称为3'端非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有被非编码序列中断的编码区，其中这些非编码序列被称为“内含子”或“插入区域”或“插入序列”。内含子是被转录成异源核RNA(hnRNA)的基因片段。内含子可能含有调控元件，诸如增强子。内含子被从核或初级转录物中去除或“剪接”出来；因此，在信使RNA(mRNA)转录物中不存在内含子。mRNA在翻译过程中起作用，以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。

如本文所用，术语“功能性连接”和“可操作地连接”可互换使用，并且是指两个或更多个DNA区段之间的功能关系，特别是待表达的基因序列和控制其表达的那些序列之间的功能关系。例如，如果启动子/增强子序列(其包括顺式作用的转录控制元件的任何组合)在合适的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。与转录的基因序列可操作地连接的启动子调控序列在物理上与转录序列邻接。

“保守修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列这两者。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置处，密码子可以改变为所描述的任何相应的密码子，而不会改变编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；并且除了TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变都隐含在每个所述序列中。

关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的各个取代、缺失或添加(其改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸)是“保守修饰的变体”，其中该改变使得氨基酸被化学相似的氨基酸取代。提供本领域熟知的功能上相似的氨基酸的保守取代表。这些保守修饰的变体是对本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。

以下八个组各自含有彼此保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；以及

8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见，例如Creighton，Proteins(1984))。

保守取代可以包括诸如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等的取代。由此衍生的氨基酸组由于结构上的原因而可能是保守的。这些组可以以维恩图的形式来描述(Livingstone C.D.and Barton G.J.(1993)"Protein sequence alignments:a strategyfor the hierar chical analysis of residue conservation"Comput.Appl Biosci.9:745-756；Taylor W.R.(1986)"Th e classification of amino acid conservation"J.Theor.Biol.119；205-218)。例如，可以根据下表描述保守取代，该表描述了公认的氨基酸的维恩图分组。

表1：氨基酸分组

“序列一致性百分比”通过在比较窗口中比较两个最佳比对序列来确定，其中对于两个序列的最佳比对，比较窗口中多核苷酸序列的部分可以包含与参考序列(例如本发明的多肽)相比添加或缺失(即，空位)，而该参考序列不包含添加或缺失。通过以下方式来计算该百分比：确定在两个序列中出现一致核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得出匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数并将结果乘以100来得出序列的百分比。

在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“一致”或百分比“一致性”是指相同序列的两个或多个序列或子序列。当在比较窗口进行比较和比对以获得最大对应关系，或者在使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查时，如果两个序列具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷(即在指定区域，或当未指定时，在整条序列上具有60％的一致性，可选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％的一致性)，则这两个序列基本一致。本发明提供分别与本文所例示的多肽基本上相同的多肽及其用途，该用途包括但不限于用于治疗或预防神经系统疾病或紊乱(例如神经退行性疾病或紊乱)和/或治疗SCI。可选地，一致性存在于长度为至少约50个核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为100至500或1000或更多个核苷酸的区域上，或参考序列的整个长度上。

对于序列比较，通常一条序列充当参考序列，将测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。

如本文所用，“比较窗口”包括涉及选自由20至600，通常约50至约200，更通常约100至150组成的组的任一数量的连续位置的区段，其中，在将序列与具有相同数量连续位置的参考序列最佳比对后，可以将这两者进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。例如，用于比较的序列比对方法可以通过以下方式来进行：Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444的寻找相似方法，这些算法的计算机种执行(WisconsinGenetics软件包中GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575ScienceDr.,Madison,Wis)，或手动和目视检查(参见，例如，Ausubel et al.,Current Protocolsin Molecular Biology(1995supplement))。

适用于确定序列一致性和序列相似性百分比的算法的两个示例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul et al.(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字符(word)来识别高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中长度相同的字符比对时，该短字符匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为相邻字符得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的相邻字符命中充当用于启动搜索的种子，以查找包含它们的更长的HSP。只要可以增加累积比对得分，字符命中就沿着每条序列在两个方向上延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的处罚得分；始终<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，将停止每个方向上的字符命中的延伸：累积比对得分从其最大实现值下降数量X；由于一个或多个负得分残基比对的积累，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较作为默认值。

BLAST算法还对两条序列之间的相似性进行统计学分析(参见，例如，Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，该最小总和概率提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。

“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其聚合物和其互补物。该术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，这些核苷酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸类似的方式被代谢。这种类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。在各种实施方式中，当通过标准技术对其他细胞组分或其他污染物(例如，细胞中存在的其他核酸或蛋白质)进行纯化来分离核酸时，标准技术包括碱性/SDS处理、CsCl带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳以及本领域所熟知的其他技术。参见例如，F.Ausubel,et al.,ed.(1987)Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。在各种实施方式中，核酸例如是DNA或RNA，并且可以包含或不包含内含子序列。在优选的实施方式中，核酸是cDNA分子。

如本文所用，“载体”是当被引入宿主细胞时产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一个或多个可选择的标记基因和本领域已知的其他遗传元件。载体可包括“基因转移载体”、“基因治疗载体”或“基因治疗构建体”或类似术语，其是指适合于进行基因转移以施用所需基因的特定载体构建体。

因此，术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可以将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入到宿主细胞以转化宿主并促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)的运载工具。载体包括在与适当的控制元件结合时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等。因此，该术语包括克隆和表达运载工具，以及病毒载体。

如本文所用，“药学上可接受的载体”涵盖任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳液(例如油/水或水/油乳液)，以及各种类型的润湿剂。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽(malt)；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。合适的药物载体记载于该领域的标准参考书Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company中。

如本文所用，术语“基因治疗”是指通过外源施用基因，即GAD65和/或VGAT基因来改变内源基因表达的方法。如本文所用，基因治疗还指通过将与缺陷的或缺失的GAD65和/或VGAT基因相对应的功能基因或基因的一部分引入到有需要的个体的脊髓软膜下间隙来替代缺陷GAD65和/或VGAT基因或者替代缺失的GAD65和/或VGAT基因。为了本公开的目的，可以通过使用多种病毒载体(例如，AAV)、脂质体、纳米颗粒、蛋白质:DNA复合物、修饰的核酸或裸露的DNA的“体内”方法来完成基因治疗，以便达到治疗效果。

术语“转基因”是指被引入至受试者的细胞中并且能够在合适的条件下进行表达并赋予其被引入的细胞以期望的性质或以其他方式产生期望的治疗效果的多核苷酸。

用于表示病毒滴度的术语“基因组颗粒(gp)”、“基因组当量”或“基因组拷贝(gc)”是指在不考虑感染性或功能性的情况下，包含重组AAV DNA基因组的病毒体的数量。特定载体制剂中基因组颗粒的数量可以通过诸如本文其他地方描述的方法来测量或者例如通过Clark et al.(1999)Hum.Gene Ther.,10:1031-1039；Veldwijk et al.(2002)Mol.Ther.,6:272-278中描述的方法来测量。

如本文所用，术语“神经元”包括神经元及其一部分或多个部分(例如，神经元细胞体、轴突或树突)。因此，如本文所用，术语“神经元”表示神经系统细胞，这些神经系统细胞包括中央细胞体或体细胞，以及两种类型的延伸或突出：树突，通常大多数神经元信号通过树突传递至细胞体，以及轴突，通常大多数神经元信号通过轴突从细胞体传递至效应细胞(诸如靶神经元或肌肉)。神经元可以将信息从组织和器官的传递到中枢神经系统(传入神经元或感觉神经元)，并将信号从中枢神经系统传递到效应细胞(传出神经元或运动神经元)。被称为中间神经元的其他神经元连接中枢神经系统(大脑和脊髓)内的神经元。可以进行根据本发明的治疗或方法的神经元类型的某些具体实例包括小脑颗粒神经元、背根神经节神经元和皮质神经元。

术语“神经元退化”被广泛使用，并且是指神经元细胞中的任何病理性变化，这些病理性变化包括但不限于神经元细胞的死亡或丧失，细胞死亡之前的任何变化以及神经元细胞的活性或功能的任何降低或丧失。病理性变化可以是自发的或可以由任何事件诱发，并且包括例如与细胞凋亡相关的病理性变化。神经元可以是任何神经元，包括但不限于感觉神经元、交感神经元、副交感神经元或肠神经元，例如背根神经节神经元、运动神经元和中枢神经元(例如来自脊髓的神经元。神经元退化或细胞损失是多种神经系统疾病或紊乱(例如神经退行性疾病或紊乱)的特征。在一些实施方式中，神经元是感觉神经元。在一些实施方式中，神经元是运动神经元。在一些实施方式中，神经元是受损的脊髓神经元。

如本文所用，“神经退行性紊乱”或“神经紊乱”是指导致神经细胞或神经细胞群的形态和/或功能异常的紊乱。神经退行性紊乱会导致受试者中正常神经功能受损或缺失，或者使受试者出现神经功能异常。例如，神经退行性紊乱可以是疾病、损伤和/或衰老的结果。形态和功能异常的非限制性实例包括神经细胞的物理退化和/或死亡；神经细胞的异常生长方式；神经细胞之间的物理连接异常；神经细胞产生的一种或多种物质(例如神经递质)不足或过量；神经细胞无法产生其正常产生的一种或多种物质；物质(例如神经递质)的产生和/或电脉冲的传输以异常模式或在异常时间下进行。神经退行性紊乱可发生在受试者的大脑的任何区域，并伴有多种疾病，这些疾病包括例如头部创伤、中风、ALS、多发性硬化、亨廷顿氏病、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。

如本文所用，术语“伤害感受”是指感觉神经系统对某些有害的或潜在有害刺激的反应。在伤害感受中，被称为伤害感受器的感觉神经细胞受到强烈的化学刺激(例如，眼中的辣椒粉)、机械刺激(例如，切割、压碎)或热刺激(热和冷)时会产生沿着神经纤维链经由脊髓传导到大脑的信号。伤害感受会引发各种生理和行为反应，并通常会导致有情众生的主观感受性疼痛。

γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸是哺乳动物中的主要抑制性和兴奋性神经递质。GABA和谷氨酸之间的平衡控制着多种过程，诸如神经发生、运动、昼夜节律、组织发育和血糖调节。GABA由谷氨酸盐通过吡哆醛磷酸盐(PLP)依赖性酶谷氨酸脱羧酶的亚型65kDa和67kDa(分别为GAD65和GAD67)来合成。

大鼠GAD2/GAD65的核酸序列是本领域已知的。参见，例如GenBank登录号：NM_012563，褐家鼠谷氨酸脱羧酶2(Gad2)，mRNA，其提供了核酸序列(SEQ ID NO:5)：

Bu et al.(1992)Proc Natl Acad Sci 89:2115-2119中已分离并克隆了人GAD65和GAD67。人GAD65 cDNA编码具有585个氨基酸残基的分子量为65000的多肽(Genbank登录号NM000818；M81882)，人GAD67编码具有594个氨基酸残基的分子量为67000的多肽(Genbank登录号NM013445；M81883)；其中的每个都通过引用并入到本文中。另请参见美国公开号2016/0081956，其通过引用并入到本文中。

人GAD65的其他核酸和氨基酸序列是本领域已知的。请参见例如GenBank登录号：Q05329，人谷氨酸脱羧酶2(GAD2/GAD65)，其提供了氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

MASPGSGFWSFGSEDGSGDSENPGTARAWCQVAQKFTGGIGNKLCALLYGDAEKPAESGGSQPPRAAARKAACACDQKPCSCSKVDVNYAFLHATDLLPACDGERPTLAFLQDVMNILLQYVVKSFDRSTKVIDFHYPNELLQEYNWELADQPQNLEEILMHCQTTLKYAIKTGHPRYFNQLSTGLDMVGLAADWLTSTANTNMFTYEIAPVFVLLEYVTLKKMREIIGWPGGSGDGIFSPGGAISNMYAMMIARFKMFPEVKEKGMAALPRLIAFTSEHSHFSLKKGAAALGIGTDSVILIKCDERGKMIPSDLERRILEAKQKGFVPFLVSATAGTTVYGAFDPLLAVADICKKYKIWMHVDAAWGGGLLMSRKHKWKLSGVERANSVTWNPHKMMGVPLQCSALLVREEGLMQNCNQMHASYLFQQDKHYDLSYDTGDKALQCGRHVDVFKLWLMWRAKGTTGFEAHVDKCLELAEYLYNIIKNREGYEMVFDGKPQHTNVCFWYIPPSLRTLEDNEERMSRLSKVAPVIKARMMEYGTTMVSYQPLGDKVNFFRMVISNPAATHQDIDFLIEEIERLGQDL.

另请参见例如GenBank登录号：X69936，谷氨酸脱羧酶(GAD2/GAD65)的智人mRNA，其提供了核酸序列(SEQ ID NO:2)：

GABA通过与突触前和突触后神经元过程的质膜中的特异性跨膜受体结合而作用于脑中的抑制性突触。这种结合引起离子通道的打开，从而使带负电的氯离子流入细胞或带正电的钾离子流出细胞。该作用引起跨膜电位的负变化，这通常会引起超极化。已知有两类通用的GABA受体：GABA_A，其中该受体是配体门控离子通道复合物的一部分；以及，GABA_B代谢型受体，该受体是通过中间体(G蛋白)打开或关闭离子通道的G蛋白偶联受体。

本领域所熟知的GABA激动剂包括蝇蕈醇(muscimol)、普罗加比(progabide)、利鲁唑、巴氯芬、加巴喷丁维加巴因(vigabatrin)、丙戊酸、替加滨/>拉莫三嗪/>普瑞巴林、苯妥英钠/>卡马西平/>托吡酯/>以及这些GABA激动剂的类似物、衍生物、前药和药学上可接受的盐。本领域技术人员将认识到，其他GABA激动剂也可用于本发明的组合、药物组合物、方法和试剂盒。已经公开了GABA激动剂可用于中枢神经系统疾病，诸如癫痫、亨廷顿舞蹈病、脑缺血、帕金森氏病、迟发性运动障碍和痉挛的抗癫痫治疗中。已经公开了GABA激动剂可用作抗抑郁药、抗焦虑药、抗精神病药，并且在治疗疼痛中具有效用。

VGAT(囊泡GABA转运蛋白)(也称为囊泡抑制氨基酸转运蛋白(VIAAT))是人体中由SLC32A1基因(也称为VGAT基因)编码的蛋白质。VGAT高度集中在脑和脊髓中的G ABA能神经元的神经末梢，以及甘氨酸能神经末梢中。Caudhry,et al.,J.Neurosci.,18(23):9733-9750(1998)通过引用被并入到本文中。人VGAT的核酸和氨基酸序列是本领域已知的。请参见例如GenBank登录号：Q9H598，人囊泡抑制性氨基酸转运蛋白(VIAAT/VGAT)，其提供了氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

MATLLRSKLSNVATSVSNKSQAKMSGMFARMGFQAATDEEAVGFAHCDDLDFEHRQGLQMDILKAEGEPCGDEGAEAPVEGDIHYQRGSGAPLPPSGSKDQVGGGGEFGGHDKPKITAWEAGWNVTNAIQGMFVLGLPYAILHGGYLGLFLIIFAAVVCCYTGKILIACLYEENEDGEVVRVRDSYVAIANACCAPRFPTLGGRVVNVAQIIELVMTCILYVVVSGNLMYNSFPGLPVSQKSWSIIATAVLLPCAFLKNLKAVSKFSLLCTLAHFVINILVIAYCLSRARDWAWEKVKFYIDVKKFPISIGIIVFSYTSQIFLPSLEGNMQQPSEFHCMMNWTHIAACVLKGLFALVAYLTWADETKEVITDNLPGSIRAVVNIFLVAKALLSYPLPFFAAVEVLEKSLFQEGSRAFFPACYSGDGRLKSWGLTLRCALVVFTLLMAIYVPHFALLMGLTGSLTGAGLCFLLPSLFHLRLLWRKLLWHQVFFDVAIFVIGGICSVSGFVHSLEGLIEAYRTNAED.

另请参见，例如GenBank登录号：NM_080552，智人溶质载体家族32成员1(SLC32A1)，mRNA，其提供了核酸序列(SEQ ID NO:4)：

此外，大鼠VGAT的核酸序列是本领域已知的。请参见，例如GenBank登录号：AF030253.1，褐家鼠囊泡GABA转运蛋白(VGAT)mRNA，完整的cd，其提供了核酸序列(SEQ IDNO:6)：

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在患有慢性神经性疼痛的人类患者和动物模型中，导致神经性疼痛状态的机制以及相关的神经病理性变化是相对明确的。这些可以通过周围神经损伤引起的神经瘤或部分脊髓节段性外伤或缺血性损伤的存在来表示。这样，可以确定引起疼痛的刺激的节段水平以及起源部位。因此，本发明提供了治疗策略，该治疗策略将选择性地靶向于负责在相关脊髓节段传递伤害性刺激的关键脊髓神经元群，而不会影响其他神经元群(诸如非靶向的相邻节段中的α-运动神经元或中间神经元)。本文提供的数据证明，通过将GAD65和VGAT基因软膜下递送至患有神经性疼痛的小鼠模型的L3-L5脊髓节段可提供强效且持久的抗伤害感受作用。

GAD65基因在受感染的星形胶质细胞(相对于神经元)中的优先表达似乎提供了关于预期的GABA介导的抗痉挛效果的特定优势(请参见，例如WO2014/116652和PCT/US2017/024285，其中的每个都通过引用被并入到本文中)。如已在体外所表明的，原代星形胶质细胞的感染导致细胞外GABA浓度独立于Ca²⁺增加。因此，预期星形胶质细胞介导的GABA在脊髓实质中的释放将独立于局部神经元抑制电路的功能性和连接性，并且将特异性对Ia传入神经元和/或α-运动神经元上表达的GABA_B受体发挥其超极化作用。星形胶质细胞产生的GABA的生物活性通过其在优先表达GABA_A受体培养的hNT神经元上的去极化诱导作用得以证实。

GAD65和VGAT双重基因治疗的使用代表了旨在增加区域神经元抑制作用的新方法，该新方法以前并未在脊髓或大脑递送的情况下测试。首先，该方法使用软膜下施用来小剂量递送的载体，从而仅导致在周围神经损伤部位单侧的注射有载体的节段的背角神经元的局部感染。这与鞘内递送技术相反，在鞘内递送技术中，载体在整个注射区域(多个节段的左侧和右侧以及上)内有效感染腹角神经元和背根神经节细胞。鞘内递送载体后，没有背角神经元(负责将伤害感受刺激脊髓传输到大、脑的主要神经元群)被感染。其次，需要GAD65和VGAT基因的组合来通过增强囊泡GABA从被感染的背角神经元释放到突出间隙而有效地诱导伤害感受效应。

因此，一方面，本发明提供了通过脊髓特异性上调GAD65基因和VGAT基因来治疗受试者的神经性疼痛的方法。在各种实施方式中，该方法包括软膜下施用编码GAD65和VGAT的病毒载体，并在施用部位的远端、对侧和/或同侧以受试者的治疗水平量表达GAD65和VGAT，从而减轻受试者的神经性疼痛。在各种实施方式中，载体包括编码GAD65和VGAT的核苷酸序列。与GAD65或其功能片段具有至少60％同源性的核苷酸序列编码的多肽(即，与GAD65或其片段具有约70％同源性，约75％同源性，约80％同源性，约85％同源性，约90％同源性，约95％同源性，约99％同源性的核苷酸序列编码的多肽)同样在本发明范围内。与VGAT或其片段具有至少60％同源性的核苷酸序列编码的多肽(即，由与VGAT或其片段具有约70％同源性，约75％同源性，约80％同源性，约85％同源性，约90％同源性，约95％同源性，约99％同源性的核苷酸序列编码的多肽)同样在本发明范围内。

病毒载体对于将实施本发明方法的多核苷酸引入靶细胞可能是非常有用的。已经开发了用于特定宿主系统，特别是哺乳动物系统的病毒载体，包括例如逆转录病毒载体、诸如基于人免疫缺陷病毒(HIV)的那些其他慢病毒载体、腺病毒载体(AV)、腺相关病毒载体(AAV)、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等(请参见Miller and Rosman,BioTechniques 7:980-990,1992；Anderson et al.,Nature 392:25-30Suppl.,1998；Verma and Somia,Nature 389:239-242,1997；Wilson,New Engl.J.Med.334:1185-1187(1996)，其各自通过引用被并入到本文中)。在本发明的一方面，使用慢病毒、AV或AAV。

腺病毒代表最大的无包膜病毒，这是因为它们是能够通过核内体转运(即，不需要包膜融合)的最大尺寸。病毒体还具有与衣壳的每个五邻体碱基质相关的独特“刺突”或纤维，其有助于与宿主细胞的附着。AAV是一种依赖性细小病毒，根据定义，它需要与另一种病毒(通常是腺病毒或疱疹病毒)共感染，以启动并维持生产性感染周期。在没有这种辅助病毒的情况下，AAV仍然能够通过受体介导的结合和内化作用来感染或转导靶细胞，穿透非分裂细胞和分裂细胞中的细胞核。

一旦进入细胞核，病毒就会脱壳并且转基因以多种不同的形式表达-其中最持久的是环状单体。AAV将整合到1％至5％的稳定转导的细胞的基因组中(Nakai et al.,J.Virol.76:11343-349,2002)。转基因的表达可能异常稳定。由于在没有辅助病毒的情况下不会由AAV感染而产生子代病毒，因此转导的程度仅限于被病毒感染的初始细胞。正是这一特征使得AAV成为本发明的合适的基因治疗载体。

描述可用于本发明方法的腺病毒载体和其他病毒载体的其他参考文献包括以下：Horwi tz,M.S.,Adenoviridae and Their Replication,in Fields,B.,et al.(eds.)Virology,Vol.2,Raven Press New York,pp.1679-1721,1990)；Graham,F.,et al.,pp.109-128in Methods in Molecular Biology,Vol.7:Gene Transfer and ExpressionProtocols,Murray,E.(ed.),Humana Press,Clifton,N.J.(1991)；Miller,N.,et al.,FASEB Journal 9:190-199,1995；Schreier,H,Pharmaceutica Acta Helvetiae 68:145-159,1994；Schneider and French,Circulation 88:1937-1942,1993；Curiel D.T.,etal.,Human Gene Therapy 3:147-154,1992；Graham,F.L.,et al.,WO 95/00655(5Jan.1995)；Falck-Pedersen,E.S.,WO 95/16772(22Jun.1995)；Denefle,P.et al.,WO95/23867(8Sep.1995)；Haddada,H.et al.,WO 94/26914(24Nov.1994)；Perricaudet,M.etal.,WO 95/02697(26Jan.1995)；Zhang,W.,et al.,WO 95/25071(12Oct.1995)。还可从商业来源获得多种腺病毒质粒，包括例如安大略省多伦多(Toronto,Ontario)的MicrobixBiosystems(请参见，例如Microbix产品信息表：用于腺病毒载体构建的质粒，1996)。

描述可用于本发明方法的AAV载体的其他参考文献包括以下：Carter,B.,Handbook of Parvoviruses,vol.I,pp.169-228,1990；Berns,Virology,pp.1743-1764(Raven Press 1990)；Carter,B.,Curr.Opin.Biotechnol.,3:533-539,1992；Muzyczka,N.,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:92-129,1992；Flotte,T.R.,et al.,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.7:349-356,1992；Chatterjee et al.,Ann.NYAcad.Sci.,770:79-90,1995；Flotte,T.R.,et al.,WO 95/13365(18May 1995)；Trempe,J.P.,et al.,WO 95/13392(18May 1995)；Kotin,R.,Human Gene Therapy,5:793-801,1994；Flotte,T.R.,et al.,Gene Therapy 2:357-362,1995；Allen,J.M.,WO 96/17947(13Jun.1996)；and Du et al.,Gene Therapy 3:254-261,1996。

如本文所用，术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV11型、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV和现在已知的任何其他AAV。AAV载体衍生自对哺乳动物无致病性的单链(ss)DNA细小病毒(综述在Muzyscka(1992)Curr.Top.Microb.Immunol.,158:97-129，该文献通过引用被并入到本文中)。简而言之，基于AAV的载体去除了占病毒基因组96％的rep病毒基因和cap病毒基因，仅留下两个侧翼的145个碱基对(bp)的反向末端重复序列(ITR)，用于启动病毒DNA复制、包装和整合。在没有辅助病毒的情况下，野生型AAV会以优先的位点特异性在19q 13.3号染色体上整合到人类宿主细胞基因组中，或者它仍可能保持游离地表达。单个AAV粒子最多可容纳5kb的ssDNA，因此为转基因和调控元素留有约4.5kb的空间，这个量通常是足够。然而，例如在美国专利6,544,785中描述的反式剪接体系可能几乎是这个限值的两倍。已经对许多血清型的腺相关病毒进行广泛研究了并已经将其作为基因治疗载体。本领域技术人员将熟悉基于AAV的功能性基因治疗载体的制备。在大量发表的文献中可以找到许多关于用于施用至人类受试者而生产、纯化和制备AAV的多种方法的参考文献(参见，例如Viral Vectors for GeneTherapy:Methods and Protocols,ed.Machida,Humana Press,2003，其通过引用被并入到本文中)。此外，在美国专利号6,180,613和6,503,888(各自通过引用被并入到本文中)中已经描述了靶向CNS细胞的基于AAV的基因治疗。

可选地，AAV病毒衣壳是AAV2/9、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAV Anc80或AAV PHP.B；然而，在本发明的某些实施方式，所使用的血清型病毒衣壳可以选自已知的病毒衣壳，这些已知的病毒衣壳包括其他已知血清型的AAV病毒衣壳。

可选地，可以对基因治疗载体(例如AAV载体或基于AAV的载体)进行修饰，以改善病毒对目标靶组织的摄取、病毒稳定性和嗜性(tropism)。例如，AAV载体的衣壳可以用与目标组织处或目标组织中的受体结合的配体(例如，合成或天然存在的小分子、肽或多肽或其他生物分子)来修饰。可以进行其他修饰来改善和/或增强载体的靶向于目标组织以及使构建体进入并有效转导靶细胞的功能性质。这种修饰在本领域普通技术人员的技能范围内。

取决于所使用的宿主细胞/载体系统，可以在表达载体中使用许多合适的转录和翻译元件中的任何一种，包括组成型启动子和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等(Bitter et al.,Meth.Enzymol.153:516-544,1987)。如上文所定义，对“启动子”或“启动子序列”的提及应在其最广泛的背景下理解，并且包括能够在细胞中结合RNA聚合酶并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、小核核仁RNA或由任何种类的任何RNA聚合酶转录的任何种类的RNA)的转录的DNA调控区域。本文所考虑的“启动子”还可以包括经典基因组基因的转录调控序列，包括在真核细胞中准确转录启动所需的戈德堡-霍格内斯(Goldberg-Hogness)框，具有或不具有CAT框序列和其他调控元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子)。

将序列置于启动子序列的调控控制下是指将所述分子放置成使得表达受启动子序列控制。启动子通常位于其控制的基因的5'端(上游)。在异源启动子/结构基因组合的构建中，启动子位置通常可以是距基因转录起始位点的距离，该距离该启动子与其在天然环境中控制的基因(即该启动子源自的基因)之间的距离大致相同。如本领域中已知的，可以对该距离进行一些变动，而不损失启动子的功能。类似地，调节序列元件相对于待置于其控制下的异源基因的定位由该元件在其天然环境(即该元件源自的基因)中的定位来限定。同样，如本领域中已知的，该距离也可能会发生一些变化。

本领域熟知具有不同特征和表达谱的启动子序列，包括组织特异性、组织特异性、组成型和诱导型的启动子序列。可以进一步参考例如Papadakis et al.,“Promoters andControl E lements:Designing Expression Cassettes for Gene Therapy.”CurrentGene Therapy,2004,4,89-113，该文献的内容通过引用被并入到本文中。本发明考虑的启动子包括但不限于：Apo A-I、ApoE、丝酶抑蛋白(serpina)(TBG)、α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)(肝特异性)；MCK(肌肉特异性)；GFAP、NSE、突触素I、前脑啡肽、多巴胺b-羟化酶(dbH)、催乳素、髓鞘碱性蛋白(神经元特异性)、GUSB、CBA、CAG、锚定蛋白(类胡萝卜素特异性)、人泛素启动子(UBI)和人突触蛋白启动子。然而，可以使用其他已知的组织特异性或细胞特异性启动子。

用于产生重组AAV粒子的合适宿主细胞包括但不限于微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，它们可以被用作或已经被用作外源核酸分子的接受者。因此，如本文所用的“宿主细胞”通常是已经用外源核酸分子转染的细胞。宿主细胞包括任何真核细胞或细胞系，只要该细胞或细胞系与要表达的蛋白质、所选的选择系统或采用的发酵系统相容即可。

可以通过将AAV载体溶解、悬浮或乳化在适当的药学上可接受的载体或稀释剂中来将该AAV载体配制成用于注射或施用的制剂。这类药学上可接受的载体或稀释剂的实例包括水性或非水性溶剂，诸如油、合成脂族酸甘油酯、高级脂族酸的酯或丙二醇；如果需要，其可与常规添加剂，诸如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起使用。

如果不能获得对细胞类型特异的病毒载体，则可修饰该载体以表达对靶细胞上表达的配体(或受体)特异的受体(或配体)，或者可以将该载体包封在脂质体内，该脂质体也可以被修饰为包括这样的配体(或受体)。可以通过多种方法将肽试剂引入到细胞中，这些方法包括例如通过改造肽以包含可以促进肽向细胞中转移的蛋白质转导结构域，诸如人免疫缺陷病毒TAT蛋白质转导结构域。此外，还有各种基于生物材料的技术，诸如纳米笼和药递送晶片(诸如用于脑癌化学疗法的晶片)，其也可以被修饰以适应该技术。

因此，在另一方面，本发明提供了包含GAD65和/或VGAT基因或其衍生物和/或突变体的基因治疗载体或构建体，所述GAD65和/或VGAT基因或其衍生物和/或突变体可操作地连接到至少能够在中枢神经系统的组织中表达的启动子元件。如本文使用公认的小鼠、大鼠和猪模型所证明的，本发明的基因治疗载体有效地治疗神经性疼痛和/或肌肉痉挛。

因此，在各种实施方式中，本发明中使用的血清型病毒载体可以选自由以下各项组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh8、AAV rh10、AAVrh33、AAV rh34、AAV Anc80(Anc80)、AAV PHP.B以及其他(请参见，例如Cao et al.(2002)PNAS,99:11854-11859；and Viral Vectors for Gene Therapy:Method s andProtocols,ed.Machida,Humana Press,2003，该文献通过引用被并入到本文中)。除了本文所列出的那些血清型病毒载体之外，还可以考虑其他血清型病毒载体。在某些示例性实施方式中，使用AAV9或Anc80。还可以考虑，所公开的组合物和方法可以使用AAV嵌合载体，通过将AAV的一部分与其他类似载体，诸如腺病毒融合。

在各个实施方式中，本文所述的基因治疗构建体还可包含其中克隆了目标基因(例如GAD65和/或VGAT的载体，或者以使得其核苷酸序列能够表达目标基因表达(组成型或以某种方式调节)的方式包括目标基因的载体(或基因治疗表达载体)。本文所述的载体构建体包括能够被递送至组织(例如，CNS)并将在所选目标组织(例如，CNS)中提供基因的表达的任何合适的基因表达载体。

因此，本发明还提供了一种基因治疗组合物，该基因治疗组合物包含本文所述的提供GAD65和/或VGAT的载体。因此，本发明的基因治疗组合物可包括本文所述的载体以及用于促进向细胞或组织(例如CNS细胞或组织)进入的一种或多种药学上可接受的载体，以治疗神经性疼痛或肌肉痉挛。有利地，本发明的基因治疗组合物以最佳速率和治疗剂量将活性基因，特别是治疗基因受控地递送至作用位点。基因治疗载体和/或含有这种基因治疗载体的病毒载体与递送系统的联合特别能够使其被特异性地递送到作用位点或者在靶向作用为位点之后受控地表达。

除了在使用慢病毒载体后整合基因转移的细胞外，还报道了在AAV-GAD65注射到丘脑底核后成功过表达GAD65基因。在那些研究中，在AAV-GAD65注射后长达4到5个月都能观察到持续的GAD65表达。更重要的是，最近的系统数据表明，即使在有限数量的AAV注射(1到2次注射)后，基于AAV的基因仍可以高效地递送到大鼠或小型猪纹状体中。因此，在另一实施方式中，本发明采用基于AAV的、基因组非整合的GAD65编码和VGAT编码载体来实现节段特异性GAD65和VGAT表达。

如本文中所证明的，通过联合脊髓递送(即，软膜下施用)GAD65和VGAT(通过使用编码这两个基因的单一载体，或通过使用编码每个单个基因的独立载体)，实现了对神经性疼痛的显著且功能上相关的降低。在充分表征的患有慢性神经性疼痛的小鼠模型中测试脊髓抑制的效力(请参见，例如Pain 76(1-2):215-222,1998，该文献通过引用被并入到本文中)。

可以使用对本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种来实现或进行本联合治疗的施用。如本文所用，术语“施用(administration)”或“施用(administering)”被定义为包括进行本发明的方法时，向受试者提供本发明的化合物或药物组合物的行为。示例性的途径包括但不限于静脉内、关节内、脑池内、眼内、心室内、鞘内、软膜下、肌肉内，腹膜内、皮内、腔内等，以及其任意两种或更多种的组合。在某些实施方式中，可以将载体组合物直接递送至脊髓实质、脊髓鞘内间隙、受试者的脊髓软膜下间隙和/或外周痉挛肌中，以实现GAD65基因和VGAT基因的脊髓上调。请参见，例如WO2016/122791，其通过引用被并入到本文中。

因此，本文提供的方法允许在大型动物或人类中例如通过使用AAV来进行脊髓软膜下基因治疗。用于将载体递送到软膜下间隙的示例性递送系统包括弯折成90°的导向管和导管(例如，PE-5或PE-10)，从而能够精确地导向软膜下导管并将其放置到靶向的脊髓节段的背侧软膜下间隙中。在放置导管后，注入载体并持续一定的时间，然后取出该导管。

如本文所用，术语“PE-10”是指内径大约为0.010英寸的聚乙烯管。在某些实施方式中，PE-10管的内径将为约0.011英寸。同样地，术语“PE-5”是指内径大约为0.005英寸的聚乙烯管。在某些实施方式中，PE-5管的内径将为约0.008英寸。

因此，所要求保护的方法提供了软膜下递送(即，绕过软脑膜)，从而在被治疗的受试者的白质和灰质中均提供几乎完全的脊髓实质载体介导的基因表达。当前可用的非侵入性技术不能实现类似水平的脊髓实质转基因表达或控制良好的节段特异性基因沉默。

图7中示出了在哺乳动物受试者中放置软膜下导管的示例性方法，其中可以根据几个连续的过程步骤以最大程度地降低与裸露的“无硬脑膜”脊髓附近的器械/导管操作相关的潜在脊髓损伤。如图7的步骤A和步骤B所示，Th9脊髓节段横断引起后肢中的肌肉痉挛，并通过响应于足触觉刺激的腓肠肌EMG的定量变化来识别/测量该痉挛。在诱发肌肉痉挛后的2至3个月，动物接受在脊髓腰椎软膜下注射AAV9(或Anc80)-UBI-GAD65/VGAT载体，并还测量额外的2个月内是否存在痉挛反应(图7；步骤C和步骤D)。在处死后，通过免疫荧光染色来测量GAD65和VGAT的上调(图7；步骤E)。

为了将本文所述的基因治疗载体特异性地递送至中枢神经系统的特定区域，特别是脊髓软膜下间隙，可以通过立体定向显微注射来进行施用。因此，在各种实施方式中，可使用尾椎和颅骨脊髓夹(放置在椎板的正上方和下方)来最大限度地降低在导管放置期间的脊髓搏动。同样在各种实施方式中，可使用安装在XYZ机械手(例如在美国公开号2015/0224331中所述的，其通过引用被并入到本文中)上的“L”形导管不锈钢导向管(例如，弯曲成90°的16-26G不锈钢管)来促进软膜下导管的放置。

在某些实施方式中，首先使用弯曲的30G针刺穿软膜(pia)。一旦穿刺针(例如30G针)的尖端进入软膜下间隙约1毫米至1.5毫米，软膜便会被略微抬起1毫米至2毫米。然后通过在导向管中推进导管来将软膜下导管放置到软膜下间隙中。在将导管推进到目标长度后，将导向管的穿透针尖端从软膜下间隙中移出。然后可以注射在药学上可接受的载体中的载体。一旦载体注射完成(通常在2分钟至5分钟内，在某些实施方式中，在约3分钟以上)，便将导管从软膜下间隙拉出，并关闭硬膜(dura)。使用该技术方法，可以在打开硬膜时刻起约3分钟至5分钟内完成软膜下导管的放置。此后，转基因以治疗水平量在施用部位的远端、对侧和/或同侧表达。

术语“治疗有效量”或“有效量”是指研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在寻找的引起组织、系统、动物和人类的生物或医学反应，例如GAD65基因和VGAT基因的脊髓上调的化合物或组合物的量。因此，术语“治疗有效量”在本文中用来表示当在一段时间内重复到患处时使得疾病病症得到显著改善的任何制剂量。该量依据所治疗的病症、病症的发展阶段以及所用制剂的类型和浓度而变化。在任何给定情况下，适当量对于本领域技术人员而言将是显而易见的，或者能够通过常规实验确定。例如，对于本发明的治疗方法，例如单独编码GAD65基因或者编码GAD65基因和VGAT基因的载体或者包含编码GAD65基因和VGAT基因的载体的组合物的“治疗有效量”是指制剂中载体的量，当其作为所需治疗方案的一部分施用时使GAD65基因和VGAT基因的上调。在某些情况下，施用多剂量的载体。例如，在一些实施方式中，除了第一施用位点之外，可将包含本文所述的携带转基因的基因治疗载体的组合物施用至与位于第一施用位点对侧或同侧的另一位点。

有效量还可能取决于所使用的特定载体。例如，靶向CNS组织的剂量可能取决于AAV的血清型(例如衣壳蛋白)。例如，AAV可具有选自由以下各项组成的组的AAV血清型的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rh.10、rh.39、rh.43和CSp3。在某些实施方式中，AAV的有效量为每千克10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴基因组拷贝。在某些实施方式中，AAV的有效量为每个受试者10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵基因组拷贝。在实验小鼠中，注射的载体(例如AAV载体)溶液的总体积例如在0.25μl至1.0μl之间；而在实验猪中注射的载体溶液的总体积在50μl至150μl之间。

可以使用常规计算方法基于动物数据来确定递送载体的治疗或预防有效量。除其他因素外，适当的剂量将取决于所选择的转移载体的特异性，施用途径，所治疗的哺乳动物(例如人或非人灵长类动物或其他哺乳动物)，待治疗的受试者的年龄、体重和一般症状，待治疗疾病的严重程度，被治疗心脏内区域的位置以及施用方式。因此，适当的剂量可以因患者而异。本领域技术人员能够容易地确定适当的有效量。

人的剂量量可以通过由小鼠、大鼠和/或猪中使用的化合物的量推断而初步确定，这是因为本领域技术人员知晓，通过与动物模型相比较来对剂量进行修改以适用于人在本领域中是常规的。在某些实施方式中，可以设想，该剂量可以在约1mg化合物/Kg体重至约5000mg化合物/Kg体重之间变动；或在约5mg/Kg体重至约4000mg/Kg体重之间变动或在约10mg/Kg体重至约3000mg/Kg体重之间变动；或约50mg/Kg体重至约2000mg/Kg体重之间变动；或者在约100mg/Kg体重至约1000mg/Kg体重之间变动；或者在约150mg/Kg体重至约500mg/Kg体重之间。在其他实施方式中，该剂量可以为约1mg/Kg体重、5mg/Kg体重、10mg/Kg体重、25mg/Kg体重、50mg/Kg体重、75mg/Kg体重、100mg/Kg体重、150mg/Kg体重、200mg/Kg体重、250mg/Kg体重、300mg/Kg体重、350mg/Kg体重、400mg/Kg体重、450mg/Kg体重、500mg/Kg体重、550mg/Kg体重、600mg/Kg体重、650mg/Kg体重、700mg/Kg体重、750mg/Kg体重、800mg/Kg体重、850mg/Kg体重、900mg/Kg体重、950mg/Kg体重、1000mg/Kg体重、1050mg/Kg体重、1100mg/Kg体重、1150mg/Kg体重、1200mg/Kg体重、1250mg/Kg体重、1300mg/Kg体重、1350mg/Kg体重、1400mg/Kg体重、1450mg/Kg体重、1500mg/Kg体重、1600mg/Kg体重、1700mg/Kg体重、1800mg/Kg体重、1900mg/Kg体重、2000mg/Kg体重、2500mg/Kg体重、3000mg/Kg体重、3500mg/Kg体重、4000mg/Kg体重、4500mg/Kg体重、5000mg/Kg体重。在其他实施方式中，设想可以使用更高的剂量，诸如使用约5mg化合物/Kg体重至约20mg化合物/Kg体重的剂量。在其他实施方式中，剂量可以是约8mg/Kg体重、10mg/Kg体重、12mg/Kg体重、14mg/Kg体重、16mg/Kg体重或18mg/Kg体重。当然，可以根据初始临床试验的结果和特定患者的需要来向上或向下调节该剂量，如这种治疗方案中常规进行的那样。在某些实施方式中，该剂量可以为载体浓度。例如，本文所述的基因治疗载体的浓度可以为至少0.5×10¹³gc/ml、0.75×10¹³gc/ml、1.0×10¹³gc/ml、1.1×10¹³gc/ml、1.2×10¹³gc/ml、1.3×10¹³gc/ml、1.4×10¹³gc/ml、1.5×10¹³gc/ml、1.6×10¹³gc/ml、1.7×10¹³gc/ml、1.8×10¹³gc/ml、1.9×10¹³gc/ml或2.0×10¹³gc/ml。

剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。此外，适当地，可以向受试者施用多个剂量。本领域技术人员可以容易地确定剂量的适当次数。然而，考虑到替代性的施用途径或者治疗益处与任何副作用之间的平衡，可能需要对剂量进行调节。这样的剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。

可选地，根据本发明的AAV介导的递送可以与通过其他病毒和非病毒载体进行的递送结合。包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、杆状病毒载体和合成载体的这些其它病毒载体可以根据本领域已知的方法容易地选择和产生。类似地，包括但不限于脂质体、基于脂质的载体、多聚复合载体、分子缀合物、多胺和聚阳离子载体的非病毒载体可以根据本领域已知的方法容易地选择和产生。当通过这些替代途径施用时，剂量在上述范围内是可取的。

本发明的基因治疗组合物可以与施用说明书一起包括在试剂盒和/或药物包装体、容器、或分配器中。因此，本公开提供了用于治疗神经性疼痛和/或肌肉痉挛的试剂盒。在一个实施方式中，该试剂盒包括治疗组合物，其中该治疗组合物含有有效剂量的单位剂型的基因治疗载体。在一些实施方式中，该试剂盒包括无菌容器，该无菌容器容纳有治疗组合物；这种容器可以是盒、安瓿瓶、瓶子、小药瓶(vial)、管、袋(bag)、小包(pouch)、泡罩包装(blisterpack)或本领域已知的其他合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适合容纳药物的其他材料制成。说明书通常将包括关于使用组合物用于治疗神经性疼痛和/或肌肉痉挛的信息。在其他实施方式中，该说明书包括以下中的至少一项：组成的说明；用于治疗神经性疼痛和/或肌肉痉挛或与其相关的症状的用量和用法；注意事项；警告；适应症；禁忌症；过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考。这些说明可以直接印在容器上(如果有的话)，也可以作为标签贴在容器上，或也可以以单独的纸张、小册子、卡片或纸夹提供在容器中或随容器一起提供。

在另一方面，治疗神经性疼痛的方法可包括联合疗法，其中本文所述的一种或多种基因的局部节段的上调与GABA摄取抑制剂(诸如替加滨)的全身治疗联合进行，从而增强对仅存在于GAD65/VGAT过表达的脊髓节段和相关皮节中的抗伤害感受作用。因此，该治疗方案可以包括与全身施用GABA摄取抑制剂相结合地编码GAD65基因和VGAT基因的病毒载体。

此外，本发明的方法可用于治疗神经损伤，诸如由暴露于有毒化合物以及药物所引起的周围神经损伤，其中有毒化合物包括重金属(例如铅、砷和汞)和工业溶剂，药物包括化疗剂(例如长春新碱和顺铂)、氨苯砜、HIV药物(例如齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、扎西他滨、利托那韦和安普那韦)、降胆固醇药物(例如洛伐他汀、吲达帕胺和吉非罗齐)、心脏或血压药物(例如，胺碘酮、肼屈嗪、哌己昔林)和甲硝唑。

本发明的方法还可用于治疗由物理、机械或化学创伤导致的神经系统损伤。因此，这些方法可用于治疗由物理伤害(与例如烧伤、创伤、手术和意外事故相关)、局部缺血、长时间暴露于低温(例如冻伤)引起的周围神经损伤，以及由于例如中风或颅内出血(诸如脑出血)对中枢神经系统造成的损伤。同样，本发明的方法可用于治疗由这些损伤引起的慢性疼痛/伤害感受。

以下实施例旨在说明而非限制本发明。

实施例1

小鼠模型中的载体递送

图1A和图1B示例性地示出了将编码GAD65(谷氨酸脱羧酶65)和VGAT(囊泡GABA转运蛋白)的AAV9(或Anc80)载体软膜下递送到靶向节段中。将空白C57BL6小鼠的坐骨神经直径的1/3至1/2进行紧固结扎(单侧结扎)，以诱发机械异常性疼痛。在神经损伤后的10天内，使用von Frey细丝和刷诱发的异常性疼痛来测试动物的触觉伤害阈值的变化。

在诱导坐骨神经损伤后10天，动物接受单侧软膜下注射在泛素启动子(UBI)下的编码GAD65和VGAT基因的AAV9。研究了两个对照组。在第一个对照组中，仅在坐骨神经损伤的动物的L2-L3处软膜下注射了PBS。在另一个对照组(未受损伤的空白动物)中，未进行任何治疗。在使用了编码GFP的AAV9的单独空白动物组(n＝6)中，已经证明，软膜下单侧注射0.5μl的AAV9(1.2×10¹³gc/ml；注射到L2-L3软膜下间隙)可选择性地感染成年小鼠的单侧背角神经元(图1C)。因此，本文提供的数据证明，使用软膜下载体递送技术可实现仅限于背角神经元且与载体递送同侧的靶向转基因表达。

从坐骨神经结扎后第2天开始，当触觉回缩阈值从约1g(损伤前基线)降低至约0.2g时，在坐骨神经损伤的动物中测量到与坐骨神经结扎部位在同侧的持续高度的触觉超敏反应。在软膜下递送PBS后长达10周内，在注射PBS的坐骨神经损伤的对照动物中没有观察到触觉超敏反应的变化，并且所有动物均表现出持续的神经性疼痛迹象(即触觉和刷诱发的超敏反应)(图2A和图2B)。相比之下，在接受了软膜下递送AAV9-UBI-GAD65/VGAT或Anc80-UBI-GAD65/VGAT的动物中，观察到触觉和刷诱发的超敏反应的进行性和完全性逆转(P<0.05)，并且其持续10周(即研究的持续时间)(图2A、图2B、图2E和图2F)。这些数据表明，单侧软膜下递送AAV9-UBI-GAD65/VGAT在提供持久的抗伤害感受作用方面非常有效。重要的是，没有发现可检测到的副作用，诸如运动无力(这是使用全身或鞘内递送的抗伤害感受药后的主要问题)。

在用AAV9-UBI-GAD65/VGAT经软膜下治疗的动物中，开放视野运动表现(奔跑距离)和同侧后足放置模式(Cat Walk分析)的分析证实，奔跑距离的显著增加以及同侧足放置的正常化(图2C和图2D)。

如图3A至图3E所示，在成年小鼠的单侧(同侧)(L2-L4)软膜下递送AAV9-UBI-GAD65/VGAT使得在同侧背角兴奋性中间神经元中诱导混合的抑制性-兴奋性神经递质表型。然而，用VGLUT2、GAD65和VGAT抗体对对侧背角神经元染色未检测到VGLUT2与GAD65或VGAT的共定位。而用相同抗体对同侧背角神经元染色表明，VGLUT2与VGAT以及VGLUT与GAD65均明显共表达(图3A至图3D；白色箭头)。同样，定量密度分析显示，在注射了AAV9-UBI-GAD65/VGAT载体的同侧背角中，GAD65和VGAT表达显著增加(图3E)。未测量到在对侧背角中的表达增加。

用VGLUT2、GAD65和VGAT抗体染色预包埋免疫金与电子显微镜的结合表明，在注射AAV9-UBI-GAD65/VGAT的动物的VGLUT2+末端中，GAD65和VGAT免疫金标记的粒子明显增加(图4C和图4D；PNI+GAD65+VGAT：Ipsi图像)。在注射了PBS的对照动物中观察到VGLUT2与GAD65和VGAT粒子有小共表达或没有共表达(图4A和图4B；PNI+PBS：Ipsi图像)。荧光原位杂交表明注射AAV9-UBI-GAD65/VGAT的动物中明显出现VGLUT2、GAD65和VGAT mRNA的双重标记和三重标记的神经元(PNI：GAD65+VGAT；Ipsi图像)(图4E至图4J)。

因此，在动物模型中，在兴奋性(VGLUT2)神经元/末端中共表达抑制性神经递质机制(即GAD65和VGAT)使得在动物模型中测得抗伤害性感受效应和改善的运动表现。此外，所诱导的兴奋性-抑制性双重神经递质表型在外周伤害感受传入被激活后，产生优先的抑制作用。

实施例2

猪模型中的载体递送

在该实施例中，使用成年猪模型来证明载体的软膜下递送在脊髓尺寸与成年人的脊髓尺寸相似的动物物种中实现了良好的靶向转基因表达。成年猪(尤加坦猪，15kg至25kg；n＝3)接受单侧软膜(L2-L3)下Anc80-UBI-Rpl22-3xHA载体递送(100μl；1.2×10¹³gc/ml)。注射载体后，动物存活了48小时，然后用4％多聚甲醛灌注固定。然后制备横断脊髓切片，并用抗HA抗体染色。用共聚焦显微镜对染色的切片进行分析。如图5A至图5D所示，观察到与载体注射侧同侧的背角神经元-特异性Rpl22蛋白表达。

另一组的成年猪(哥廷根-明尼苏达州；35kg至45kg；n＝3)接受单侧软膜下(L2-L3)Anc80-UBI-GAD65/VGAT(100μl；1.2×10¹³gc/ml)以证明在被感染的神经元中诱导了混合的兴奋性抑制性神经元表型，类似于在小鼠模型中观察到的现象。注射载体后，动物存活8周，并对其旷场运动表现进行定期评估。在动物中均未观察到可检测到的运动无力。在第8周，用4％多聚甲醛灌注固定动物，并由L1-L4节段制备横断脊髓切片。切片用抗VGLUT2、GAD65和VGAT抗体染色，并用共聚焦显微镜分析。

如图6A至图6D所示，VGLUT2、GAD65和VGAT抗体对同侧背角神经元染色示出了VGLUT2与VGAT和GAD65的清晰共表达。因此，通过控制递送到软膜下间隙内的载体体积，在尺寸与成年人脊髓尺寸相似的脊髓中实现靶向转基因的可比较的多节段表达。

实施例3

在慢性肌肉痉挛的大鼠模型中的载体递送

在慢性肌肉痉挛的大鼠模型(即，脊髓横引起的肌肉痉挛的大鼠)中，提供载体治疗以证明在软膜下递送AAV9-UBI-GAD65/VGAT后具有抗痉挛作用。如图8A和图8B所示，在接受对照载体(AAV9-GFP)的动物中测量的肌肉痉挛表明，在病毒递送后8周内肌肉痉挛逐渐增加(与在脊髓横断2至3个月后测量的基线相比)。相比之下，在接受AAV9-UBI-GAD65/VGAT载体的动物中测量到接近完全被阻断的痉挛反应。对H-反射频率依赖性抑制(RDD)的测量显示，在用AAV9-UBI-GAD65/VGAT载体治疗的动物中，RDD的显著恢复(图8C和图8D)。

在慢性肌肉痉挛的成年大鼠模型中，双侧(L2-L4)软膜下AAV9-UBI-GAD65/VGAT递送在腰部兴奋性中间神经元中诱导混合的抑制性-兴奋性神经递质表型。如图9C和图9D所示，观察到脊髓神经元中出现混合的神经递质表型，如GAD65和VGAT在VGLUT2末端中共表达所证明的。然而，在接受AAV9-UBI-GFP对照载体的动物中未观察到GAD65和VGAT在VGLUT2末端的共表达(图9A和图9B)。

与注射对照载体的动物相比，在接受腰部软膜下注射AAV9-UBI-GAD65/VGAT载体的痉挛大鼠中测量到GAD65、VGAT表达以及灰质中共表达GAD65和VGAT的VGLUT1和VGLUT2末端的数量的显著(p<0.01)增加(表2)。因此，在脊髓横断所致后肢痉挛的公认大鼠模型中，脊髓软膜下递送AAV9-UBI-GAD65/VGAT载体高度有效地抑制慢性肌肉痉挛。因此，测得抗痉挛作用的机制是基于在脊髓兴奋性中间神经元中诱导混合的兴奋性-抑制性神经递质表型并引起对原本加剧的痉挛性EMG反应。

表2：GAD65和VGAT表达的定量分析

尽管已经参考以上实施例描述了本发明，但是应当理解，修改和变型涵盖在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅由后附权利要求书来限定。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

<120> 用于治疗神经性疼痛的方法和组合物

<130> 20378-201844

<150> 62/556,088

<151> 2017-09-08

<160> 6

<170> PatentIn 3.5版本

<210> 1

<211> 585

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

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<213> 智人

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tcccggggct gcccgtgtcg cagaagtcct ggtccattat cgccacggcc gtgctgctgc 1020

cttgcgcctt ccttaagaac ctcaaggccg tgtccaagtt cagtctgctg tgcactctgg 1080

cccacttcgt catcaatatc ctggtcatag cctactgtct atcgcgggcg cgcgactggg 1140

cctgggagaa ggtcaagttc tacatcgacg tcaagaagtt ccccatctcc attggcatca 1200

tcgtgttcag ctacacgtct cagatcttcc tgccttcgct ggagggcaat atgcagcagc 1260

ccagcgagtt ccactgcatg atgaactgga cgcacatcgc agcctgcgtg ctcaagggcc 1320

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tgacgctgcg ctgcgcgctc gtcgtcttca cgctgctcat ggccatttat gtgccgcact 1620

tcgcgctgct catgggcctc accggcagcc tcacgggcgc cggcctctgt ttcttgctgc 1680

ccagcctctt tcacctgcgc ctgctctggc gcaagctgct gtggcaccaa gtcttcttcg 1740

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a 2581

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aattctattt ctatatcgtg gtgtcacagt agagtccagt ttaaaa 1966

<210> 6

<211> 2392

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 6

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aaggcagtcg tgccttcttc cccgcctgct acggtggcga cggtcgcctt aagtcctggg 1380

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ttgaggcctg aaaggctgac cgggaaatcc atttcgggca ggcgacttcc ctctggagaa 2220

gccgcggcag gggcccccgt ttgcctgccg gttttcagga acccaaactc atcttgtgca 2280

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Claims (18)

1.组合物在制备用于在受试者中治疗神经性疼痛的药物中的用途，其中，所述组合物包括：(i)腺相关病毒(AAV)载体、在组织特异性启动子的控制下的GAD65基因序列和VGAT基因序列，以及(ii)药学上可接受的载体，其中所述治疗包括软膜下施用所述组合物。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述受试者是哺乳动物。

3.根据权利要求1所述的用途，其中，AAV载体是AAV血清型9。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述基因序列包封在AAV血清型9中。

5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述组织特异性启动子选自由人泛素启动子和人突触蛋白启动子组成的组。

6.根据权利要求1所述的用途，其中，所述GAD65基因序列是SEQ ID NO:2。

7.根据权利要求1所述的用途，其中，所述VGAT基因序列是SEQ ID NO:4。

8.组合物在制备用于通过基因治疗在受试者中治疗神经性疼痛的方法中的药物中的用途，所述组合物包括治疗有效量的基因治疗构建体和药学上可接受的载体，所述治疗的方法包括软膜下施用所述组合物，所述基因治疗构建体包含(i)腺相关病毒(AAV)载体、在组织特异性启动子的控制下的(ii)GAD65基因序列和(iii)VGAT基因序列。

9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述AAV载体是AAV9。

10.根据权利要求8所述的用途，其中，所述基因治疗构建体包括由SEQ ID NO:2所示的基因和由SEQ ID NO:4所示的基因。

11.根据权利要求8所述的用途，其中，所述组织特异性启动子选自由人泛素启动子和人突触蛋白启动子组成的组。

12.根据权利要求8所述的用途，其中，所述受试者是哺乳动物。

13.在组织特异性启动子的控制下的编码GAD65的第一载体和编码VGAT基因序列的第二载体在用于制备在受试者中治疗神经性疼痛的药物中的用途，其中所述治疗的方法包括软膜下施用所述编码GAD65的第一载体和编码VGAT的第二载体，从而治疗所述受试者的神经性疼痛，其中所述第一载体和所述第二载体均为AAV载体。

14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述受试者是哺乳动物。

15.根据权利要求13所述的用途，其中，所述AAV载体是AAV9。

16.根据权利要求13所述的用途，其中，所述第一载体包括由SEQ ID NO：2所示的基因，并且其中，所述第二载体包括由SEQ ID NO：4所示的基因。

17.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含：(i)AAV病毒载体、在组织特异性启动子的控制下的(ii)GAD65基因序列和(iii)VGAT基因序列。

18.根据权利要求17所述的核酸构建体，其中，所述组织特异性启动子选自由人泛素启动子和人突触蛋白启动子组成的组。