KR20220113398A - 안구 유전자 전달을 위한 on-양극성 세포-특이적 프로모터 - Google Patents

안구 유전자 전달을 위한 on-양극성 세포-특이적 프로모터 Download PDF

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존야 클라인로겔
엘마르 카를로스 훌리거
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유니버시태트 베른
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Abstract

본 발명은 합성 망막 ON-양극성 세포-특이적 프로모터 서열, 및 시력의 개선 및/또는 회복을 위한, 눈으로의 치료적 이식유전자 전달에 있어서의 그 용도에 관한 것이다. 본 발명은 인간 망막 황반의 ON-양극성 세포, 특히 원뿔형 ON-양극성 세포에서의 증가되고 보다 특이적인 발현을 위한 대사성 글루타메이트 수용체 6(mGluR6) 프로모터를 특징으로 한다.

Description

안구 유전자 전달을 위한 ON-양극성 세포-특이적 프로모터
본 발명은 합성 망막 ON-양극성 세포-특이적 프로모터 서열, 및 시력의 개선 및/또는 회복을 위한, 눈으로의 치료적 이식유전자 전달에 있어서의 그 용도에 관한 것이다. 본 발명은 ON-양극성 세포에서의 증가되고 보다 특이적인 발현을 위한 대사성 글루타메이트 수용체 6(mGluR6) 프로모터를 특징으로 한다. 특히, 효율적인 발현에서, 원뿔형으로(in cone) ON-양극성 세포가 인간 황반에 독점적으로 존재한다.
실명의 다양한 원인은 그 치료 가능성이 제한적이거나, 치료법이 전혀 없다. 그 중 가장 일반적인 것은 연령-관련 황반 변성(AMD) 및 색소성 망막염(RP)과 같은 유전성 망막 질환(IRD)이다. 이러한 퇴행성 질환은 결국 완전한 실명으로 이어지는 광수용체(PR)의 점진적인 손실을 특징으로 한다. 유전자 요법, 치료 DNA 또는 RNA 전달, 결함 유전자 교체 또는 사일런싱, 외인성 치료 유전자 암호화는 질환의 진행 속도를 늦추고, 증상을 개선하거나 상실된 기능을 도입하는 것을 목표로 한다.
광유전학적 유전자 요법은 망막 변성으로 인한 실명의 치료에 사용될 수 있는 가장 유망한 신흥 기술 중 하나이다. 광유전학 요법의 진행 중인 임상 시험은 망막에 광 민감성을 재도입하기 위해 채널로돕신(channelrhodopsin)을 사용하여 망막 신경절 세포(RGC)를 비특이적으로 표적화한다. 미래에는 차세대 세포-맞춤형 광유전학적 유전자 요법이 이러한 비특이적 요법보다 우수함을 입증할 것이다. 이러한 차세대 치료법은 세포 유형별 프로모터를 사용하여 망막의 특정 세포 유형에 새롭고 효과적인 광유전학적 도구를 전달한다. 세포 유형 표적 중에서 가장 유망한 것은 PR에서 직접 입력을 자연적으로 받는 망막의 첫 번째 중간뉴런인, 망막 양극성 세포(BC)이다. BC는 ON형 BC와 OFF형 BC로 나뉘며, 각각 가벼운 증가 또는 감소에 반응하고 mGluR6 또는 AMPA/Kainate 글루타메이트 수용체를 발현한다. ON-양극성 세포(OBC)는 유전자 요법의 특히 관심있는 표적이다. NYX, GRM6, GPR179 또는 TRPM1과 같은 OBC 특이적 유전자의 돌연변이는 이러한 유전자가 mGluR6 신호전달 캐스케이드에 관여하고 결과적으로 OBC가 기능하지 않게 되기 때문에 모두 완전 실명(선천성 정지성 야맹증)을 초래한다. 보다 최근에, OBC에서 광유전학적 단백질의 발현은 퇴행의 후기 단계로 고통받는 광수용체 퇴행성 마우스 모델에서 시력을 회복시키는 것으로 입증되었다. 채널로돕신(Channelrhodopsin)-2(문헌[Lagali et al., Nat Neurosci 2008. 11　:p. 667-675]), 로돕신(문헌[Cehajic-Kapetanovic et al., Curr Biol 2015. 25　: p. 2111-2122]) 및 키메라 Opto-mGluR6(문헌[van Wyk et al., PLoS Biol 2015. 13: p. e1002143])이 눈먼 마우스의 OBC에서 성공적으로 발현되었으며 망막, 피질 및 행동 수준에서 기능적 시력을 회복했다. 위에서 언급한 모든 접근방식의 경우, 특히 망막 코드를 손상시키는 표적외 세포로부터의 논란의 여지가 있는 신호전달을 피하기 위한 광유전학적 접근방식의 경우, OBC 유형이 구체적으로 표적화될 필요가 있다. 또한, 특정 OBC 표적화는 또한 더 낮고 따라서 더 안전한 AAV 투여를 허용한다. 기능적 및 OBC-특이적 프로모터의 부족은 지금까지 OBC-표적 유전자 요법의 임상 적용을 방해했다.
짧은 인핸서 프로모터 서열은 전형적으로 AAV-기반 유전자 요법과 조합하여 OBC-특이적 표적화를 달성하기 위해 현장에서 사용되었다. 이것은 AAV의 패키징 용량이 4.7 kb로 제한되고 전형적으로 길이가 수 kb인 내인성 프로모터를 수용하지 않기 때문이다. 이와 관련하여, 망막의 OBC에서 독점적으로 발현되는 OBC-특이적 mGluR6 글루타메이트 수용체에서 유래된 인핸서 프로모터 서열이 가장 성공적인 것으로 입증되었다. 최근까지, 200En-SV40으로 약칭되는, 뮤린 Grm6 유전자에서 유래되고 SV40 바이러스 코어 프로모터와 조합하는 200 bp 길이의 인핸서 서열(문헌[Kim et al. J Neurosci, 2008. 28: p. 7748-7764.])이 표준으로 사용되었다. 그러나, 본 발명자들은 최근에 인핸서 서열을 4배로 운반하는 이의 변이체, 4x200En-SV40(문헌[Cronin et al. EMBO Mol Med 2014. 6: p. 1175-1190])이 OBC-특이적이지 않고 진전된 퇴행성 망막에서 기능적이지 않다는 것을 보여주었다(문헌[van Wyk et al. Front Neurosci 2017. 11: p. 161]). 보다 최근에, 비교적 우수한 OBC 특이성을 갖는 야생형 C57BL/6 마우스 망막에서 발현하는 완전한 뮤린 Grm6 유전자 기반의 짧은 인핸서/프로모터가 설계되었다(문헌[Lu et al. Gene Ther, 2016. 23: p. 680-9.]). 그럼에도 불구하고, 퇴행성 망막의 OBC에서의 발현은 나타나지 않았고, 발현은 거의 전적으로 간상체형 OBC에서 유도되었다. 따라서 인간을 포함하여 중심와 동물(foveated animals)의 망막 황반에서만 독점적으로 발견되고 고정밀 색각을 매개하는 중심와 원뿔에 연결되어 있는 원뿔형 OBC는 거의 200En-mGluR500P로 표적화되지 않으므로 이 프로모터가 인간의 높은 중심 시력 복원에 적합하지 않다. 또한, 인간 GRM6 유전자 기반 프로모터는 인간 전사체 기구에 의해 완전히 제어되어 유전자 발현, 즉, 기능을 매개하지만 세포독성을 유도하지 않는 단백질 수준의 발현을 조절하기 때문에 유리하다.
상기 언급된 최신 기술에 기초하여, 본 발명의 목적은 신규한 합성 OBC-특이적 인간 프로모터를 제공하기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이다. 이 목적은 본 명세서의 독립 청구항의 주제에 의해 달성된다.
본 발명의 제1 양태는
a. 서열번호 1 내지 6으로부터 선택된 인핸서 서열 요소, 및
b. 서열번호 7 내지 10으로부터 선택된 프로모터 서열 요소
를 포함하는 850 염기쌍(bp) 내지 1500 bp 길이의 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 제1 양태의 대안은
a. 서열번호 1 및 2로부터 선택된 서열과 적어도 70% 이상(≥), 특히 75% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱 특히 85% 이상, 더욱 특히 90% 이상, 더욱 특히 95% 이상, 더욱더 특히 98% 이상, 가장 특히 100% 동일한 인핸서 서열 요소; 및
b. 서열번호 7의 서열과 70% 이상, 특히 75% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱 특히 85% 이상, 더욱 특히 90% 이상, 더욱 특히 95% 이상, 더욱더 특히 98% 이상, 가장 특히 100% 동일한 프로모터 서열 요소를 포함하는 850 염기쌍(bp) 내지 1500 bp 길이의 단리된 핵산 분자에 관한 것이며;
상기 단리된 핵산 분자는 서열번호 13의 서열로부터의 원뿔형 ON 양극성 세포-특이성의 40% 이상, 특히 50% 이상, 더욱 특히 60% 이상, 더욱더 특히 70% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱더 특히 90% 이상, 가장 특히 100%를 가지며, 20% 이상, 특히 25% 이상, 더욱 특히 30% 이상, 더욱더 특히 35% 이상, 더욱 특히 40% 이상, 가장 특히 50% 이상의 원뿔형 ON 양극성 세포 선호도를 가진다.
본 발명의 제2 양태는 제1 양태에 따른 핵산 분자를 포함하는 핵산 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 제3 양태는 프로모터에 의해 유도된 이식유전자에 관한 것이다.
본 발명의 제4 양태는 제1 양태에 따른 단리된 핵산 분자, 제2 양태에 따른 핵산 발현 벡터 또는 제3 양태에 따른 이식유전자를 포함하는 아데노-연관 비리온 입자에 관한 것이다.
본 발명의 제5 양태는 의약으로 사용하기 위한, 제1 양태에 따른 단리된 핵산 분자, 제2 양태에 따른 핵산 발현 벡터, 제3 양태에 따른 이식유전자 및 제4 양태에 따른 아데노-연관 비리온 입자로부터 선택되는 제제에 관한 것이다.
본 발명의 제제를 포함하는 투여 형태는 본 발명의 추가 양태이다.
용어 및 정의
본 명세서의 맥락에서 용어 OBC는 ON-양극성 세포에 관한 것이다.
본 명세서의 맥락에서 용어 RBC는 간상체 양극성 세포에 관한 것이다.
본 명세서의 맥락에서 용어 cOBC는 원뿔형 ON-양극성 세포에 관한 것이다.
본 명세서의 맥락에서 용어 RGC는 망막 신경절 세포에 관한 것이다.
본 명세서의 맥락에서 용어 PR은 망막 광수용체에 관한 것이다.
본 명세서의 맥락에서 약어 AAV는 아데노-연관 바이러스에 관한 것이다. 달리 표시되는 경우를 제외하고, AAV는 모든 아형 또는 혈청형 및 복제-적격과 재조합 형태를 둘 다 지칭한다.
본 명세서의 맥락에서 용어 AAV 비리온 및 AAV 바이러스 입자는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 핵산으로 구성된 바이러스 입자에 관한 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 (예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 혼성화 기술 및 생화학에서) 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 표준 기술은 분자, 유전 및 생화학적 방법(일반적으로, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 및 문헌[Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.] 참조) 및 화학적 방법에 사용된다.
본 명세서의 맥락에서 용어 AAV 캡시드는 합성 캡시드(cap) 유전자에 관한 것이다. AAV 캡시드는 유전자 요법을 위한 재조합 아데노-연관 바이러스를 패키징하는데 사용될 수 있다.
본 명세서의 맥락에서 용어 상동성은 서열의 많은 부분을 공유하지만 핵산 또는 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 일부 위치에서 상이한 서열에 관한 것이다.
본 명세서의 맥락에서 용어 이식유전자는 한 유기체에서 다른 유기체로 전달된 유전자 또는 유전 물질에 관한 것이다. 본 맥락에서, 이 용어는 또한 유전자 서열의 자연적 또는 생리학적으로 온전한 변이체가 결손된 환자의 조직으로 전달되는 것을 의미할 수 있다. 이는 표적 조직에 존재하지 않거나 사일런싱된 프로모터에 의해 발현이 유도되는 천연 암호화된 서열의 전달을 추가로 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 용어 이식유전자는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하며, 이는 손상되거나 질환에 걸린 망막에서 발현될 때 시력을 개선하거나 회복시키는 데 유용할 수 있다. 감광도 또는 시력의 회복에 특히 관심이 있는 이식유전자는 옵신 유전자, 즉 채널로돕신, 척추동물 옵신 및 이의 변이체와 같은 감광성 단백질을 포함한다.
본 명세서의 맥락에서 용어 재조합체는 클로닝, 제한 및/또는 결찰의 하나 또는 여러 단계의 산물이고 자연 발생 핵산과 상이한 핵산에 관한 것이다. 재조합 바이러스 입자는 재조합 핵산을 포함한다.
본 명세서의 맥락에서 용어 유리체내 투여는 제제가 눈의 유리체 내로 전달되는, 약제학적 제제, 예를 들어 바이러스의 투여 경로에 관한 것이다. 유리체내 투여는 유리체액 젤이라는 젤리 같은 액체로 채워진, 유리체강이라고 하는 눈 뒤쪽의 공간에 약제를 직접 주입하는 절차이다.
본 명세서의 맥락에서 용어 망막하 투여는 약제학적 제제, 특히 본 명세서의 맥락에서의 바이러스를 망막 색소 상피(RPE) 세포와 광수용체 사이의 공간으로 투여하는 경로에 관한 것이다.
본 명세서의 맥락에서 "뉴클레오타이드"는 핵산 또는 핵산 유사체 빌딩 블록이며, 이의 올리고머는 염기 쌍을 기반으로 RNA 또는 DNA 올리고머와 선택적 하이브리드를 형성할 수 있다. 이 맥락에서 뉴클레오타이드라는 용어는 고전적인 리보뉴클레오타이드 빌딩 블록 아데노신, 구아노신, 우리딘(및 리보실티민), 시티딘, 고전적인 데옥시리보뉴클레오타이드 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 데옥시우리딘 및 데옥시시티딘을 포함한다.
본 명세서의 맥락에서 용어 서열 동일성 및 서열 동일성 백분율은 2개의 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값을 지칭한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 정렬은, 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 글로벌 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988)]의 유사도 방법 검색 또는, CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 이러한 알고리즘의 컴퓨터 구현에 의해 진행될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 예를 들어, 미국 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology - Information)를 통해 공개적으로 이용 가능하다(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
핵산 서열 비교를 위한 한 가지 예는 기본 설정을 사용하는 BLASTN 알고리즘이다: 예상 임계값: 10; 단어 크기: 28; 쿼리 범위에서의 최대 일치:　0; 일치/불일치 점수:　1.-2; 갭 코스트: 선형. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 제공된 서열 동일성 값은 각각 단백질 및 핵산 비교에 대해 위에서 확인된 기본 매개변수를 사용하여 BLAST 프로그램 제품군(문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)])을 사용하여 얻은 값을 지칭한다.
본 명세서의 맥락에서, 용어 업스트림은 5' 말단을 향한 방향을 지칭한다. 인핸서 및 프로모터 서열의 경우, 단일-가닥 서열이 본 출원에 제공되고 인핸서가 프로모터의 업스트림에 있는 경우, 이는 인핸서가 프로모터의 5'-방향에 있음을 의미한다. 유사하게, 용어 다운스트림은 3' 말단을 향한 방향을 지칭한다.
본 명세서의 맥락에서, 용어 스페이서 서열은 단일 사슬 핵산 분자를 생성하기 위해 인핸서와 프로모터를 연결하는 데 사용되는 가변 길이의 핵산을 지칭한다. 본원에 특정된 본 발명을 실시하는데 유용한 링커의 예시적인 실시형태는 1 내지 1000개의 핵산으로 구성된 올리고 핵산 사슬이다.
인간 망막 외식편의 원뿔형 ON 양극성 세포(cOBC) -특이성 은 하기 프로토콜을 사용하여 측정된다.
먼저, 프로모터는 리포터 이식유전자 mCitrine과 결합되고 자가-상보성(sc) AAV 벡터 scAAV2(7m8)로 패키징된다(문헌[Dalkara et al. Sci Transl Med 2013. 5: p. 189ra76]). 대략 1010 vg(벡터 게놈)은 (문헌[van Wyk et al. Front Neurosci 2017. 11: p.161])에 상세히 설명된 바와 같이, 0일에 배양된 사후 인간 망막 외식편의 RGC 측에 추가된다. 망막은 배양 7일째에 4% PFA로 고정되고, 후속적으로 동결보호(PBS 중 10/20/30% 수크로스)되고 동결된다. 망막 동결절편은 이식유전자 mCitrine(Invitrogen, A11122, 1:500), 유비쿼터스 OBC 마커 Gαo(EMD, MAB3073, 1:750) 및 RBC 특이적 항체 PKCα(Santa Cruz, sc8393, 1:750)에 대한 항체들로 삼중 염색된다. 발현하는 RBC는 [mCitrine(+), PKCα(+)]로 식별되는 반면, [mCitrine(+), PKCα(-), Gαo(+)] 세포는 cOBC를 발현하는 것으로 식별된다. cOBC 유형 특이성은 모든 발현 OBC의 발현 cOBC 비율에 의해 결정된다:
[
Figure pct00001
(1)
N은 괄호 안에 주어진 염색 특성을 가진 세포의 수이다.
원뿔형 ON 양극성 세포 선호도 는 다음과 같이 후속적으로 결정된다.
RBC 및 cOBC의 양은 동일하지 않으며, 망막 영역에 따라 다르다. 외식편은 망막의 중간 주변부에서 생성되며, 여기서 RBC 대 cOBC의 비율
Figure pct00002
(3)은
외식편의 작은 영역에 대해 거의 일정하다. 결과적으로, 발현하는 RBC에 대한 발현하는 cOBC의 비율
Figure pct00003
(4)은
외식편에서도 일정하다고 가정될 수 있다. 이것은 RBC 선호 비율 계수에 대한 cOBC의 계산을 허용하며
Figure pct00004
(5)
이는 (3)과 (4)를 곱하여 외식편에서 cOBC와 RBC의 특정 분포를 설명한다. 퍼센트 단위의 cOBC 선호도는 다음과 같이 계산된다:
Figure pct00005
(6)
본원에 사용되는 바와 같이, 임의의 질환 또는 장애(예를 들어, 시력 상실)에 대한 용어 "치료하는" 또는 "치료"는, 일 실시형태에서, 질환 또는 장애를 호전시키는 것(예를 들어, 질환 또는 이의 임상적 증상 중 적어도 하나의 발달을 둔화 또는 정지 또는 감소시키는 것)을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 환자가 식별하지 못할 수도 있는 것을 비롯하여 적어도 하나의 신체 파라미터를 완화시키거나 개선시키는 것을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 물리적으로(예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화), 생리적으로(예를 들어, 물리적 매개변수의 안정화) 또는 둘 모두로 질환 또는 장애를 조절하는 것을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 외인성 치료 기능을 표적 세포 유형에 도입하는 것을 지칭한다. 질환의 치료 및/또는 예방을 평가하기 위한 방법은 아래에 구체적으로 설명되지 않는 한 일반적으로 당업계에 알려져 있다.
본 발명은 마우스 및 인간 사후 망막에서 200En-mGluR500P와 비교하여 향상된 OBC-특이성 및 훨씬 향상된 cOBC-유도 단백질 발현을 갖는 인간 GRM6 인핸서 프로모터 서열을 개시한다. 본원에 기재된 프로모터는 mGluR6 단백질의 발현을 OBC, 특히 RBC 및 cOBC로 지시하는 조절 요소로부터의 서열을 함유하는 변형된 대사성 글루타메이트 수용체 6(mGluR6) 프로모터로 구성된다. 본 발명은 mGluR6 인핸서 또는 그의 변이체 및 mGluR6 프로모터 또는 그의 변이체를 포함하는 단리된 핵산 분자 또는 핵산 발현 벡터를 특징으로 한다. 이 새로운 GRM6 인핸서 프로모터 서열은 인간 망막, 특히 인간 부중심와(parafovea)의 cOBC에서 처음으로 효율적인 이식유전자 발현을 유도한다. 또한, 새로운 인간 GRM6 인핸서 프로모터 서열은 광유전자(MWOPN_mGluR6, 서열번호 16)와 조합되어 퇴행된 뮤린(rd1, C3HHe/OuJ) 망막에서 광범위한 OBC-특이적 발현을 유도하고, 그렇지 않으면 시각장애, 광수용체 퇴행 마우스에서 기능적 시력(광운동 반응)을 회복했다. 새로운 인간 GRM6 인핸서/프로모터는 마우스 및 인간 망막에서 매우 효율적이고 광범위하며 특정 OBC 표적화를 보여주었다.
본 발명의 제1 양태는
a. 서열번호 1 내지 6으로부터 선택된 인핸서 서열 요소, 및
b. 서열번호 7 내지 10으로부터 선택된 프로모터 서열 요소
를 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 제1 양태의 대안은
a. 서열번호 1 내지 6으로부터 선택된 인핸서 서열 요소, 및
서열번호 7 내지 10으로부터 선택된 프로모터 서열 요소
를 포함하는 850 염기쌍(bp) 내지 1500 bp 길이의 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 제1 양태의 대안은
a. 서열번호 1 및 2로부터 선택된 서열과 70% 이상, 특히 75% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱 특히 85% 이상, 더욱 특히 90% 이상, 더욱 특히 95% 이상, 더욱더 특히 98% 이상, 가장 특히 100% 동일한 인핸서 서열 요소; 및
b. 서열번호 7의 서열과 70% 이상, 특히 75% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱 특히 85% 이상, 더욱 특히 90% 이상, 더욱 특히 95% 이상, 더욱더 특히 98% 이상, 가장 특히 100% 동일한 프로모터 서열 요소를 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이며;
상기 단리된 핵산 분자는 서열번호 13의 서열로부터의 원뿔형 ON 양극성 세포-특이성의 40% 이상, 특히 50% 이상, 더욱 특히 60% 이상, 더욱더 특히 70% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱더 특히 90% 이상, 가장 특히 100%를 가지며, 20% 이상, 특히 25% 이상, 더욱 특히 30% 이상, 더욱더 특히 35% 이상, 더욱 특히 40% 이상, 가장 특히 50% 이상의 원뿔형 ON 양극성 세포 선호도를 가진다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 대안은
a. 서열번호 1 및 2로부터 선택된 서열과 70% 이상, 특히 75% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱 특히 85% 이상, 더욱 특히 90% 이상, 더욱 특히 95% 이상, 더욱더 특히 98% 이상, 가장 특히 100% 동일한 인핸서 서열 요소; 및
b. 서열번호 7의 서열과 70% 이상, 특히 75% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱 특히 85% 이상, 더욱 특히 90% 이상, 더욱 특히 95% 이상, 더욱더 특히 98% 이상, 가장 특히 100% 동일한 프로모터 서열 요소를 포함하는 850 염기쌍(bp) 내지 1500 bp 길이의 단리된 핵산 분자에 관한 것이며;
상기 단리된 핵산 분자는 서열번호 13의 서열로부터의 원뿔형 ON 양극성 세포-특이성의 40% 이상, 특히 50% 이상, 더욱 특히 60% 이상, 더욱더 특히 70% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱더 특히 90% 이상, 가장 특히 100%를 가지며, 20% 이상, 특히 25% 이상, 더욱 특히 30% 이상, 더욱더 특히 35% 이상, 더욱 특히 40% 이상, 가장 특히 50% 이상의 원뿔형 ON 양극성 세포 선호도를 가진다.
cOBC 특이성 및 cOBC 발현 수준은 전술한 바와 같이 측정된다.
본 발명자들은 서열번호 1 또는 2와 서열번호 7의 조합이 높은 원뿔형 ON 양극성 세포-특이성 및 높은 원뿔형 ON 양극성 세포 발현 수준을 초래한다는 것을 보여주었다. 당업자는 본 발명의 개시내용에 기초하여 동일한 원뿔형 ON 양극성 세포-특이성 및 원뿔형 ON 양극성 세포 발현 수준을 갖는 유사한 서열을 찾을 수 있다.
특정 실시형태에서, 인핸서 서열 요소는 프로모터 서열 요소의 업스트림에 있다.
특정 실시형태에서, 단리된 핵산 분자는 1 내지 1000 염기쌍, 특히 1 내지 394 염기쌍 길이의 스페이서 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 스페이서는 인핸서와 프로모터 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 단리된 핵산 분자는 1 내지 1000 염기쌍, 특히 1 내지 394 염기쌍 길이의 스페이서 서열을 추가로 포함하며, 스페이서는 인핸서와 프로모터 사이에 위치한다.
특정 실시형태에서, 단리된 핵산 분자는 서열번호 11 ~ 서열번호 15로부터 선택된 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 단리된 핵산 분자는 서열번호 11 또는 서열번호 13의 서열을 포함한다.
본 발명의 제2 양태는 제1 양태에 따른 핵산 분자를 포함하는 핵산 발현 벡터에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는 바이러스 게놈이다.
특정 실시형태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 재조합 아데노-연관 벡터(rAAV)이다.
특정 실시형태에서, AAV 벡터는 단일-가닥 벡터(ssAAV) 또는 자가-상보적 벡터(scAAV)이다.
특정 실시형태에서, 벡터는 재조합 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAV12 벡터이다. 특정 실시형태에서, 벡터는 재조합 AAV2 벡터이다.
특정 실시형태에서, 핵산 발현 벡터는
a. 캡시드 단백질을 암호화하는 서열, 및
b. 이식유전자
를 추가로 포함한다.
5'-말단으로부터 3'-말단까지, 단리된 핵산 분자는 먼저 인핸서를 포함하고, 그 다음 선택적으로 스페이서 및 그 다음 프로모터를 포함한다. 이식유전자는 프로모터의 3'-방향에 있다. 특정 실시형태에서, 이식유전자는 최적화된 KOZAK 서열이 선행된다.
KOZAK 서열은 컨센서스 (gcc)gccAccAUGG(서열번호 24) 또는 (gcc)gccGccAUGG(서열번호 25)를 가지며, 번역 개시에 중요하다.
특정 실시형태에서, 핵산 발현 벡터는 또한 WPRE(우드척(Woodchuck) 간염 바이러스 전사후 조절 요소) 조절 서열을 포함한다. WPRE는 전사될 때 발현을 향상시키는 3차 구조를 생성하는 DNA 서열이다. 특정 실시형태에서, 핵산 발현 벡터는 또한 이식유전자의 하류에 삽입되는 폴리A 꼬리를 포함한다. 폴리A 꼬리는 이식유전자의 번역을 촉진한다.
특정 실시형태에서, 캡시드 단백질은 AAV2, AAV2(7m8) 또는 AAV8(BP2)이다.
본 발명의 제3 양태는 프로모터에 의해 유도된 이식유전자에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 이식유전자는 선천적 정지성 야맹증에서 광 민감성 또는 시력을 회복시키기 위한 NYX, GRM6, GPR179 또는 TRPM1이다.
특정 실시형태에서, 이식유전자는 서열번호 16의 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 이식유전자는 광 검출 또는 시력을 회복시키는 옵신 유전자이다.
특정 실시형태에서, 옵신 유전자는 채널로돕신, 멜라놉신, 로돕신, 원뿔형 옵신, 송과체 옵신, 포토신, 할로로돕신, 박테리오로돕신, 프로테오로돕신, 해파리 옵신, 점핑 스파이더 옵신 또는 그의 임의의 기능적 변이체 또는 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 옵신 유전자는 옵신과 망막 OBC의 대사성 글루타메이트 수용체 mGluR6 사이의 키메라 단백질이다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 Opto-mGluR6이다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 뮤린 또는 인간 MWOPN_mGluR6(서열번호 16)이다.
본 발명의 제4 양태는 제1 양태에 따른 단리된 핵산 분자 또는 제2 양태에 따른 핵산 발현 벡터를 포함하는 아데노-연관 비리온 입자에 관한 것이다.
본 발명의 제5 양태는 의약으로 사용하기 위한, 제1 양태에 따른 단리된 핵산 분자 또는 제2 양태에 따른 핵산 발현 벡터, 및 제3 및 제4 양태에 따른 아데노-연관 비리온 입자로부터 선택되는 제제에 관한 것이다.
추가 양태는 망막 양극성 세포에 영향을 미치는 상태의 치료에 사용하기 위한, 제1 양태에 따른 단리된 핵산 분자, 제2 양태에 따른 핵산 발현 벡터, 제3 양태에 따른 이식유전자 및 제4 양태에 따른 아데노-연관 비리온 입자로부터 선택되는 제제에 관한 것이다.
추가 양태는 선천성 정지성 야맹증 또는 간상체 및 원추체 이영양증, 특히 색소성 망막염 및 황반 변성의 치료에 사용하기 위한, 제1 양태에 따른 단리된 핵산 분자, 제2 양태에 따른 핵산 발현 벡터, 제3 양태에 따른 이식유전자 및 제4 양태에 따른 아데노-연관 비리온 입자로부터 선택되는 제제에 관한 것이다.
추가 양태는 제1 양태에 따른 단리된 핵산 분자, 제2 양태에 따른 핵산 발현 벡터, 제3 양태에 따른 이식유전자 및 제4 양태에 따른 아데노-연관 비리온 입자로부터 선택되는 제제에 관한 것이며, 여기서 제제는
a. 유리체내 투여, 특히 유리체내 주사 또는
b. 망막하 주사에 의해 투여된다.
추가 양태는 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 제제를 투여하는 치료 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 프로모터 서열 또는 의학적 징후와 같은 단일 분리 가능한 특징에 대한 대안이 "실시형태"로서 본원에 제시될 때마다, 그러한 대안들이 자유롭게 조합되어 본원에 개시된 본 발명의 별개의 실시형태를 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 프로모터 서열에 대한 임의의 대체 실시형태는 OBC 기능을 손상시키는 임의의 의학적 징후 및 예를 들어 유전자 총 또는 전기천공을 사용하여 대체 바이러스, 나노입자, 리포솜 또는 "네이키드" DNA 전달을 포함하는 임의의 DNA 전달 비히클 또는 방법과 조합될 수 있다.
본원에 기재된 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 망막 질환의 비제한적인 목록은 선천성 야맹증, 황반 변성, 연령-관련 황반 변성, 선천성 원뿔형 이영양증 및 많은 그룹의 색소성 망막염(RP)-관련 장애를 포함한다.
항목
1. 850 염기쌍(bp) 내지 1500 bp 길이의 단리된 핵산 분자로서,
a. 서열번호 1 내지 6으로부터 선택된 인핸서 서열 요소, 및
b. 서열번호 7 내지 10으로부터 선택된 프로모터 서열 요소
를 포함하는, 단리된 핵산 분자.
2. 850 염기쌍(bp) 내지 1500 bp 길이의 단리된 핵산 분자로서,
a. 서열번호 1 및 2로부터 선택된 서열과 적어도 70% (이상), 특히 75% 이상, 80% 이상, 더욱 특히 85% 이상, 더욱 특히 90% 이상, 더욱 특히 95% 이상, 더욱더 특히 98% 이상, 가장 특히 100% 동일한 인핸서 서열 요소; 및
b. 서열번호 7의 서열과 70% 이상, 특히 75% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱 특히 85% 이상, 더욱 특히 90% 이상, 더욱 특히 95% 이상, 더욱더 특히 98% 이상, 가장 특히 100% 동일한 프로모터 서열 요소를 포함하며;
상기 단리된 핵산 분자는 서열번호 13의 서열로부터의 원뿔형 ON 양극성 세포-특이성의 40% 이상, 특히 50% 이상, 더욱 특히 60% 이상, 더욱더 특히 70% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱더 특히 90% 이상, 가장 특히 100%를 가지며, 20% 이상, 특히 25% 이상, 더욱 특히 30% 이상, 더욱더 특히 35% 이상, 더욱 특히 40% 이상, 가장 특히 50% 이상의 원뿔형 ON 양극성 세포 선호도를 갖는, 단리된 핵산 분자.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 단리된 분자는 상기 인핸서 서열 요소 중 하나 및 단 하나, 상기 프로모터 서열 요소들 중 하나 및 단 하나 및 선택적으로, 프로모터 서열 요소로부터 인핸서 서열 요소를 분리하는 스페이서로 구성된, 단리된 핵산 분자.
4. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 11 ~ 서열번호 15로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 구성되거나, 서열번호 11 ~ 서열번호 15로부터 선택된 서열에 대해 98% 이상의 동일성을 특징으로 하는 서열을 포함하거나 이로 구성된, 단리된 핵산 분자.
5. 항목 1 내지 항목 4 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 11 또는 서열번호 13의 서열을 포함하거나 이로 구성되거나, 서열번호 11 또는 서열번호 13에 대해 98% 이상의 동일성을 특징으로 하는 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 특히 서열번호 13의 서열을 포함하거나 이로 구성되거나, 서열번호 13에 대해 98% 이상의 동일성을 특징으로 하는 서열을 포함하거나 이로 구성된, 단리된 핵산 분자.
6. 항목 1 내지 항목 5 중 어느 하나에 따른 핵산 분자를 포함하는 핵산 발현 벡터.
7. 항목 6에 있어서, 상기 핵산 발현 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 재조합 아데노-연관 벡터(rAAV)이며, 특히 상기 핵산 발현 벡터는 재조합 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAV12 벡터이며, 더욱 특히 상기 핵산 발현 벡터는 재조합 AAV2 벡터인, 핵산 발현 벡터.
8. 항목 6 내지 7에 있어서,
a. 캡시드 단백질을 암호화하는 서열, 및
b. 이식유전자
를 추가로 포함하는, 핵산 발현 벡터.
9. 항목 8에 있어서, 상기 이식유전자는 서열번호 16의 서열을 포함하는, 핵산 발현 벡터.
10. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 단리된 핵산 분자 또는 항목 6 내지 9중 어느 하나에 따른 핵산 발현 벡터를 포함하는 아데노-연관 비리온 입자.
11. 의약으로 사용하기 위한, 항목 1 내지 항목 5 중 어느 하나에 따른 단리된 핵산 분자 또는 항목 6 내지 항목 9중 어느 하나에 따른 핵산 발현 벡터, 및 항목 10에 따른 아데노-연관 비리온 입자로부터 선택된 제제.
12. 망막 양극성 세포에 영향을 미치는 상태의 치료, 특히 선천성 정지성 야맹증(CSBN1) 또는 간상체 및 원추체 이영양증, 보다 특히 색소성 망막염 및 황반 변성의 치료에 사용하기 위한, 항목 1 내지 항목 5중 어느 하나에 따른 단리된 핵산 분자, 항목 6 내지 9중 어느 하나에 따른 핵산 발현 벡터, 및 항목 10에 따른 아데노-연관 비리온 입자로부터 선택된 제제.
13. 항목 1 내지 항목 5중 어느 하나에 따른 단리된 핵산 분자, 항목 6 내지 9중 어느 하나에 따른 핵산 발현 벡터, 및 항목 10에 따른 아데노-연관 비리온 입자로부터 선택된 제제로서, 상기 제제는
a. 유리체내 투여, 특히 유리체내 주사 또는
b. 망막하 주사
에 의해 투여되는, 제제.
본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 예시되며, 이로부터 추가 실시형태 및 이점이 도출될 수 있다. 이들 실시예는 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서 본 발명을 예시하기 위한 것이다.
[도면의 간단한 설명]
도 1 프로모터 설계를 위해 선택된 인간 GRM6 서열의 게놈 브라우저 뷰. (A) 뮤린 Grm6 및 인간 GRM6 사이의 310 bp 보존 영역(가로 줄무늬) 뿐만 아니라 Kim'의 뮤린 200En(Grm6)에 대한 188 bp 합성 영역(가로 줄무늬 및 음영 부분)을 포함하는 3개의 선택된 인핸서 요소를 나타내는, 인간 GRM6의 원위 인핸서 영역(번역 시작 부위(TLSS)에 대해 대략 -14 kb에 위치됨). (B) 전사 시작 부위(TSS) 및 번역 시작 부위(TLSS)를 포함하는 인간 GRM6의 프로모터 서열로서, 후자는 발명자들에 의해 위치 0으로 정의됨. 선택된 2개의 프로모터도 또한 표시되며, 마우스와 인간 유전자 사이의 167 bp 보존 영역이 가로 줄무늬 섹션으로 표시된다. 그래프는 UCSC 게놈 브라우저https://genome.ucsc.edu/에서 다운로드하여, 수정하였다. 회색 음영 스트레치는 전사 인자 결합 부위, 종간 보존 영역(Vert. Cons) 및 Dnase 과민성 클러스터(Dnase clusters)를 포함하는, 잠재적으로 관련된 시스-조절 영역을 나타낸다. 또한, H3K27Ac Mark 신호 피크 및 Chip-seq 피크에 대한 트랙도 고려되었다.
도 2 사후 인간 망막 외식편의 OBC에서 프로모터 유도된 mCitrine 발현 강도. 인간 망막 외식편은 scAAV2(7m8)-407En_566P(hGRM6)-mCitrine(n=3), scAAV2(7m8)-444En_454P(hGRM6)-mCitrine(n=3), scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine(n=5), scAAV2(7m8)-407En_454P(hGRM6)-mCitrine(n=3) 및 scAAV(7m8)-200En-mGluR500P-mCitrine(n=4)로 형질도입되었다. mCitrine은 면역조직화학적으로 표지되었고, ON-양극성 세포를 발현할 때 형광 강도는 이식유전자 발현 강도의 척도로 결정되었다. 566P 프로모터 요소는 근위 요소 454P와의 프로모터 조합과 비교하여 OBC에서 훨씬 더 약한 mCitrine 발현을 매개하였다. 따라서, 454P는 모든 후속 실험을 위해 선택되었다. 770En_454P(hGRM6)(F = 5.42 ± 0.9; 평균 ± s.d.) 및 444En_454P(hGRM6)(F = 5.59 ± 0.51; 평균 ± s.d.)는 이식유전자 발현 강도 측면에서 동등하게 잘 수행되었으며, 뮤린 게놈-유도된 200En-mGluR500P(F = 3.94 ± 0.45; 평균 ± s.d.)보다 훨씬 더 우수하다. *는 P≤0.05를 나타내고, **는 P≤0.01을 나타내고, ***는 P≤0.001을 나타내고, n.s.는 유의하지 않은 차이를 나타낸다(Tukey의 정직 유의차 검정을 사용한 일원분산분석).
도 3 인간 망막 외식편에서 원뿔형 ON-양극성 세포(cOBC)에 대한 프로모터 특이성. 인간 망막 외식편은 scAAV2(7m8)-444En_454P(hGRM6)-mCitrine, scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine, scAAV2(7m8)-407En_454P(hGRM6)-mCitrine 또는 scAAV(7m8)-200En-mGluR500P-mCitrine로 형질도입되었다. 수직 저온 단면은 mCitrine, PKCα(간상 양극성 세포(RBC) 및 Gα0(OBC용 유비쿼터스 마커)에 대해 표지하고, mCitrine 발현 세포를 카운팅하였다. (A) 세포 카운팅에서, 770En_454P(hGRM6)가 200En-mGluR500P보다 훨씬 더 많은 cOBC에서 발현을 유도하였다. (B) 카운팅된 특정 망막 영역내에서 표지된 cOBC 및 RBC의 양을 전체 수로 정규화하면, 770En_454P(hGRM6) 및 407En_454P(hGRM6)가 200En-mGluR500P보다 cOBC에서 훨씬 더 효율적으로 발현을 유도한다는 것을 시각화하였으며, 이는 RBC에 대해 명확한 선호도를 갖는다. 770En_454P(hGRM6)는 심지어 cOBC 및 RBC에 대해 각각 50%의 동일한 선호도를 보여주며, 이는 cOBC만 존재하는 중심와 유전자 치료의 중요한 특징이다. (C) 프로모터 444En_454P(hGRM6)(n=5)의 cOBC 유형 선호도는 프로모터 770En_454P(hGRM6)의 것과 크게 다르지 않았다. 평균 ± s.d.가 개시되어 있으며, *는 P≤0.05를 나타내고, **는 P≤0.01을 나타낸다(Tukey의 정직 유의차 검정을 사용한 일원분산분석). 오로지 유의한 차이만 표시한다.
도 4 인간 망막 외식편에서 770En_454P(hGRM6)-유도된 mCitrine 발현의 OBC 발현 효능 및 특이성. (A) scAAV2(7m8)에 패키징할 때 770En_454P(hGRM6)-유도된 mCitrine 발현을 200En-mGluR500P 유도된 mCitrine 발현과 비교. 770En_454P(hGRM6)는 200En-mGluR500P에 비해 훨씬 더 높은 OBC 선호도를 나타내며, 후자는 또한 무축삭 세포에서 훨씬 더 높은 표적외 발현을 나타낸다. 특정 세포 유형의 발현 세포의 %를 평균 ± s.d.로 표시하고, **는 P≤0.01을 나타내고, ***은 P≤0.001을 나타낸다(스튜던트 T-검정).
도 5 프로모터 770En_454P(hGRM6)는 퇴행된 rd1 마우스 망막에서 안정적이고 광범위하게 이식유전자 발현을 유도한다. 22주령 rd1 마우스에 이식유전자 MWOPN_mGluR6_IRES2_TurboFP635(서열번호 16, 플라스미드 지도 도 9)를 보유하는 3x109 vg의 AAV를 주사하였다. A~D의 스케치는 망막 전체 마운트의 변환된 망막 영역을 회색으로 나타낸다. A) 200En-mGluR500P와 조합된 ssAAV2(7m8)는 rd1 망막에서도 발현되지만, 제한된 영역에서만 발현된다(4xGrm6-SV40과 반대). B) 770En_454P(hGRM6)와 조합된 ssAAV(7m8)는 200En-mGluR500P에 비해 퇴행성 망막의 더 확장되고 광범위한 형질도입을 유도하는데, 이는 아마도 변성으로 인한 Grm6 하향조절이 일어났을때 발현에 대한 역치를 극복하는 증가된 발현 강도 때문일 것이다. C) OKR 테스트를 받고 있는 rd1 마우스로부터 처리된 망막의 망막 전체-마운트의 예시 레이저 스캐닝 현미경사진(실시예 7 및 도 6 참조), 여기서 TurboFP635는 면역세포화학적으로 표지되었다(B의 스케치에 표시됨). (D) rd1 퇴행성 망막에서 평균 발현 특이성(발현하는 모든 세포의 OBC를 발현하는 %, 66.6 ± 8.5%) 및 효율(모든 OBC의 발현 OBC의 %, 54.7±8.3). 평균 ± s.d., N=9 (스튜던트 T-검정).
도 6 22주령에 ssAAV(7m8)-MWOPN_mGluR6_IRES2_TurboFP635로 유리체내 및 양측으로 처리된 완전히 광수용체-없는 rd1 마우스에서 시신경 반사에 의해 결정된 시력 회복. 시력은 변환 후 41일, 47일, 55일, 82일 및 112일 후에 가상 광운동 시스템에서 광운동 반응이 여전히 유도되는 공간 주파수의 임계값을 결정하여 측정되었다. 처리된 마우스(n=3)는 주사되지 않은 대조군 rd1 한배 새끼(n=7)에 비해 시력이 유의하게 증가했지만, 야생형 대조군 마우스(C57BL/6J, n=10)보다 여전히 유의하게 낮은 시력을 보였다. 표시된 평균(모든 시험 및 개인에 대해) ± s.d., **는 P≤0.01을 나타내고, ***은 P≤0.001을 나타낸다(스튜던트 T-검정).
도 7 프로모터 770En_454P(hGRM6)에 의한 이식된 인간 황반의 cOBC에서 고효율 mCitrine 발현. scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine으로 형질도입되고 이식유전자 mCitrine과 OBC(Gαo) 및 세포핵(DAPI)에 대해 면역조직화학적으로 표지된 인간 황반의 예시 이식편. (A)는 인간 황반과 B와 C의 현미경 사진을 찍은 영역의 스케치이다. 중심소와는 M 및 L-원뿔형 광수용체만을 포함하고, OBC 또는 RGC는 포함하지 않는데, 그 이유는 광수용체에 회절 없이 빛이 통과하기 위해 세포체가 옆으로 밀리기 때문이다. 중심와에는 원뿔형(M, L 및 S)만 포함되며, 각 원뿔형이 하나의 BPC 및 하나의 RGC에 연결되는 난소 시스템에서 가장 높은 시력의 영역이다. (B)는 광수용체(ONL), BPC 및 무축삭 세포(INL)의 명확한 계층화를 보여주는 DAPI(상단 현미경사진)와 황반을 나타내는 RGC(GCL)의 3차원 계층화와 함께 부중심와를 통한 단면을 보여준다. 하단 현미경사진은 독점적으로 OBC가 위치한 INL에서만 mCitrine 발현을 나타내는 이식유전자 라벨링을 독점적으로 보여준다. (C)는 중심와를 통한 단면을 보여준다. 왼쪽의 현미경사진은 OBC의 Gαo 라벨링만 보여주며, 모두 PKC 라벨링(여기에는 도시되지 않음)이 없기 때문에 cOBC로 명확하게 식별된다. 오른쪽 현미경사진은 세포질 내에서 추가로 mCitrine 라벨링을 보여주며, 이는 중심와의 거의 각 cOBC가 mCitrine(화살촉)을 발현하고 있음을 나타낸다. 이것은 770En_454P(hGRM6)가 cOBC, 특히 인간 황반의 cOBC에서 우수한 발현을 유도하므로 인간 환자의 높은 시력 회복에 매우 적합하다는 매우 분명한 증거이다.
도 8 신규 770En_454P(hGRM6) 프로모터 하에 원뿔형 옵신 및 mGluR6 키메라 광유전 단백질, MWOPN_mGluR6-IRES2-TurboFP635를 암호화하는 AAV 플라스미드의 플라스미드 맵. TurboFP635는 발현 식별을 위한 적색 형광 단백질 마커이고, WPRE 및 BGHpA는 조절 서열이고 5' 및 3' ITR(내부 반복부)은 AAV 기구가 캡시드로 이식유전자(ITR 사이)를 패키징하는 데 사용하는 영역이다. 이 플라스미드는 rd1 퇴행된 마우스 망막의 형질도입에 사용되었다(도 및 실시예 5 및 6). 클로닝을 위한 In-Fusion Primer도 제공된다.
도 9 인간 망막 외식편에서 mCitrine 발현을 유도하는 770En_454P(hGRM6) 및 444En_454P(hGRM6)의 OBC 발현 특이성과 효능의 예. scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine(A) 및 scAAV2(7m8)-444En_454P(hGRM6)-mCitrine(B)로 각각 형질도입된 인간 망막 외식편을 통한 수직 동결절편. 동결절편은 핵 얼룩 DAPI(회색, 배향을 위해 현미경사진의 맨 왼쪽에만 표시됨)로 및 이식유전자 mCitrine 마커(흰색)에 대하여 표시되었다. 770En_454P(hGRM6)는 85.2% ± 12.3%(n=4)의 OBC 효능(INL에서 밝은 세포의 백분율) 및 87.9% ± 6.5%(n=5)의 444En_454P(hGRM6)를 갖는다. ONL 외부 핵층, INL 내부 핵층, GCL 신경절 세포층. 양극성 세포는 말초 INL에 있다.
실시예
실시예 1: rd1 마우스 모델에서의 Grm6 유전자 발현 변화의 분석
본 발명자들은 망막의 ON-양극성 세포(OBC)에서 선택적으로 발현되는 대사성 글루타메이트 수용체 6(mGluR6)을 암호화하는 유전자(마우스에서의 Grm6 및 인간에서의 GRM6)를 프로모터 설계를 위한 주형으로 선택하였다. 이것은 mGluR6의 발현이 OBC에 선택적이기 때문이며, 이는 최근에 성체 마우스 망막의 단일 세포 전사체 분석에 의해 확인되었고(문헌[Siegert et al. Nat Neurosci 2012. 15: p. 487-95]), 본 발명자들에 의해 이전에 생성된 이식유전자 마우스 계통에서도 분명히 명백하며, 전장 Grm6 프로모터가 망막 OBC에서 특이적으로 이식유전자 발현을 유도한다(문헌[van Wyk et al., PloS Biol 2015. 13: p. e1002143]). 또한, 뮤린 Grm6 유전자에서 유래된 짧은 프로모터 버전이 성공적으로 작제되었고, OBC에서 우선적인 발현을 유도하는 것으로 나타났다(문헌[Cronin et al., EMBO Mol Med, 2014. 6(9): p. 1175-1190]; 문헌[Kim et al. J Neurosci 2008. 28: p. 7748-7764]; 문헌[Lagali et al. Nat Neurosci 2008. 11 p: 667-675]). Kim et al.은 처음에 야생형 마우스 망막에서 OBC-특이적 발현을 향상시킨, 뮤린 Grm6 유전자의 프로모터에서의 원위 200 bp 인핸서 서열을 선택하였다. 이 인핸서 서열은 후속해서 4xGRM6-SV40 프로모터에 사용하였으며[문헌[Cronin, T., et al., EMBO Mol Med, 2014. 6(9): p. 1175-1190]], 이는 이러한 200 bp 인핸서 서열 중 4개를 직렬로 함유한다. 그러나, 본 발명자들은 최근에 4xGRM6-SV40 프로모터[문헌[Cronin, T., et al., EMBO Mol Med, 2014. 6(9): p. 1175-1190]]가 광수용체 변성이 완료되기 전 3.5주령에 유전자 요법을 수행한 경우에도, 퇴행된 rd1(C3H/HeOu) 마우스 망막에서 완전히 하향조절되었음을 알아내었다(문헌[van Wyk et al. Front Neurosci 2017. 11: p. 161]). 이로 인해 4xGRM6-SV40(및 동일하게 GRM6-SV40)은 퇴행성 망막 치료에 적합하지 않다. 또한, SV40 기본 바이러스 프로모터는 만성 활성화 하의 사일런싱 및 단백질 과발현으로 인한 세포의 세포독성과 같은 문제를 겪고 있다. 더 적합한 OBC-특이적 프로모터를 설계하기 위해, 본 발명자들은 먼저 rd1 퇴행 마우스 모델에서 퇴행 과정 동안 Grm6 발현이 상향조절된 상태로 유지되는지를 조사하였다. 본 발명자들은 이 심각하고 급속한 퇴행 모델에서 활성인 프로모터가 대부분의 덜 심각한 망막 퇴행성 질환에서 활성일 가능성이 있다는 근거 하에 rd1 마우스 모델을 사용하였다. 이것은 4xGRM6-SV40이 여전히 일부 발현을 유도할 수 있는 더 느린 퇴행성 rd10 (B6.CXB1-Pde6brd10) 마우스 모델에서 이식유전자 발현을 비교하는 발명자들에 의해 이전에 예시되었다[문헌[van Wyk, M., et al., Front Neurosci, 2017. 11(161): p. 161.]]. 본 발명자들은 시점 P14, P21, P28 및 P54에서 실시간 정량적 PCR에 의해 rd1 마우스 망막에서의 Grm6 유전자 발현을 정량화하고, 발현 수준을 야생형 C57BL/6J 마우스 망막과 비교하였다. 리보솜 단백질 L8(Rp18) 발현을 발현 수준의 정상화에 사용하였다. Grm6 발현은 P21과 P28 사이의 작은 하향조절(0.59배)을 제외하고는 퇴행 동안 일정하게 유지되었다(P = 0.8795). 이로부터, 본 발명자들은 4xGRM6-SV40 프로모터[문헌[van Wyk, M., et al., Front Neurosci, 2017. 11(161): p. 161.]에 대해 관찰된 심각한 하향조절이 Grm6 인핸서 요소의 하향 조절 때문이 아니라 아마도 퇴행이 진행됨에 따라 SV40 기본 프로모터의 기능이 감소한 결과일 것으로 결론지었다. 결과적으로, 본 발명자들은 Grm6 유전자를 OBC-특이적 프로모터 디자인을 위한 주형으로 사용하였다.
실시예 2: GRM6-기반 프로모터의 설계
인간 치료법에서의 향후 사용에 비추어 인간 전사 기구와 정렬하기 위해, 본 발명자들은 주형으로서 뮤린 Grm6 서열이 아닌 인간 GRM6 서열을 사용하였다.
본 발명자들은 "다소 유사한" 서열(blastn)에 최적화된 기본 로컬 정렬 검색 도구(BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 사용하여[문헌[Altschul et al., J Mol Biol, 1990. 215(3): p. 403-10]; 문헌[Coordinators, Nucleic Acids Res, 2018. 46(D1): p. D8-D13]], 뮤린 Grm6 및 인간 GRM6 유전자 서열을 정렬하였다. 인핸서 사양을 위해, 본 발명자들은 Kim et al.에 의해 확인된 뮤린 200En 인핸서 서열 주위에 1500 bp를 정렬하였다 [문헌[Kim et al., J Neurosci, 2008. 28(31): p. 7748-64.]]. 본 발명자들은 Kim et al.에 의해 정의된 200En 서열을 넘어 3' 및 5' 방향 모두에서 확장하는 마우스와 인간 게놈 사이의 310 bp 길이의 보존된 서열[-13819 내지 -13510rel. GRM6의 번역 시작 부위(TLSS)로]을 발견하였다(도 1a, 가로 줄무늬 영역). 프로모터 서열을 식별하기 위해, 본 발명자들은 번역 시작 부위(TLSS, 발명가에 의해 위치 0으로 정의됨)의 GRM6 서열 5'에 초점을 맞추었다(도 1b). 정렬 후, 본 발명자들은 GRM6 유전자의 잠재적 조절 서열, 예컨대 종간 보존된 서열, 활성 염색질 영역(DnaseI 과민성 클러스터 또는 H3K27Ac 마크 트랙(Mark tracks)) 또는 전사 인자 결합 부위를 확인하기 위해 캘리포니아 산타 크루즈 대학의 게놈 연구소의 게놈 브라우저(UCSC Genome Browser)를 사용하였다[문헌[Church et al., PloS Biol, 2011. 9(7): p. e1001091.]], [문헌[Kent et al., Genome Res, 2002. 12(6): p. 996-1006.]; 문헌[Kuhn et al. Brief Bioinform, 2013. 14(2): p. 144-61.]] [https://genome.ucsc.edu/; genome assembly Feb. 2009 (GRCh37/hg19]. 염색질 면역침전-DNA-시퀀싱(ChIP-seq) 피크를 식별하기 위해 유전자 전자 조절 데이터베이스(GTRD)[문헌[Yevshin et al., Nucleic Acids Res, 2017. 45(D1): p. D61-D67]]를 추가로 사용하여, 전사 인자 결합 부위를 실험적으로 확인하였다. 더불어, 이 정보는 본 발명자들이 GRM6 유전자 발현에서 기능적으로 중요할 가능성이 있는 상기 확인된 영역의 서열을 강조할 수 있게 하였다.
그런 다음, 본 발명자들은 하기 근거들에 따라 3개의 가능한 인핸서 영역들[407En(hGRM6), 444En(hGRM6) 및 770En(hGRM6)] 및 2개의 가능한 프로모터 영역들[566P(hGRM6) 및 454P(GRM6)]을 선택하였다(도 1 및 표 1): 407En(hGRM6)(-13873 내지 -13467 rel. TLSS GRM6)은 뮤린과 인간 게놈 사이의 300 bp 보존된 서열로 구성된다(도 1a의 가로 줄무늬). 407En(hGRM6) 외에 770En(hGRM6)(-14236 내지 -13467 rel. TLSS GRM6)은 또한 3' ChIP-seq 피크 및 Dnase 과민성 클러스터(-13990 내지 -13816 rel. TLSS GRM6)를 함유한다. 444En(hGRM6)(-14033 내지 -13590 rel. TLSS GRM6)은 3' 및 5' ChiP-seq 피크만 포함하는 770En(hGRM6)의 3' 및 5' 절단된 버전이다.
GRM6의 서열 -1000 내지 -1(rel. TLSS)과 정렬할때 본 발명자들은 167 bp 보존된 영역(-425 내지 -259 rel. TLSS GRM6)을 식별하였다(도 1b, 도 1b의 가로 줄무늬). 이러한 보존된 서열을 포함하여, 본 발명자들은 2개의 프로모터를 설계하였다: 5' 전사 시작 부위(TSS, -179 rel. TLSS GRM6)에 더해 5' H3K27Ac Mark 신호 피크(-656 내지 -405 rel. TLSS GRM6) 및 제2 3' ERG ChiP-Seq 피크를 함유하는 566P(hGRM6)(-691 내지 -126 rel. TLSS GRM6). ERG는 770En 및 444En에 함유된 FLI1과 상호작용하는 활성화제로 알려져 있다. 두번째로 선택된 프로모터 서열 454P(hGRM6)(-453 내지 +1 rel. TLSS GRM6)는 TLSS 및 TLSS와 TSS 사이의 추가적인 잠재적 조절 서열, 예컨대 TCF7L1 및 MYC ChiP-Seq 피크를 포함하는 566P(hGRM6)에 비해 5' 더 확장된다.
표준 분자 방법을 사용하여 하기 실시예에 상세히 설명된 바와 같이 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터의 ITR 서열들 사이에 리포터 이식유전자에 선행하는 인핸서 및 프로모터 서열의 5개의 가능한 조합들(표 1)을 클로닝하였다:
[표 1]
Figure pct00006
실시예 3: 인간 망막에서의 기능적 프로모터 평가
인간 환자에 대한 치료적 사용을 고려하여 인간 GRM6 유전자에 프로모터를 설계함으로써, 모든 프로모터를 사후 인간 망막 외식편에서 평가하였다. 이를 위해, 프로모터를 mCitrine 이식유전자와 결합하고, 자가 상보적(sc) AAV 캡시드, 특히 scAAV2(7m8)로 패키징하였다(문헌[Dalkara et al. Sci Transl Med 2013. 5: p. 189ra76]).
대략 5x106 vg(벡터 게놈)을 [문헌[van Wyk, M., et al., Front Neurosci, 2017. 11(161): p. 161.]]에 상술된 바와 같이 1일에 배양된 사후 인간 망막 외식편의 RGC 측에 추가하였다. 망막은 scAAV로부터의 이식유전자 발현이 가시적일 때 배양 7일째에 동결되었다. 본 발명자들은 리포터 단백질 mCitrine 및 OBC 마커 Goα에 대한 저온-절편을 염색하여, 발현의 국소화를 시각화하고 발현 강도를 비교하였다. OBC의 최대 85%가 잘 형질도입된 영역에서 mCitrine을 발현하고 있었다(도 9). 성능을 최신 기술과 비교하기 위해 Lu의 200En-mGluR500P 프로모터(문헌[Lu et al. Gene Ther, 2016. 23: p. 680-9.])를 또한 scAAV2(7m8)에 패키징하고, 인간 망막 외식편 형질도입에 사용하였다. 각 프로모터에 대해, 조직학적으로 염색되고 분석된 망막 전체에 걸쳐 프로모터 작제물 및 저온 절편으로 3명의 인간 눈으로부터의 배양물에 형질도입하였다. 실험 간의 변동을 제어하기 위해, 모든 샘플에 대해 처리 및 면역조직화학을 동시에 수행하였다. 형광 이미지는 Airyscan 및 ZEN 2.1 소프트웨어가 포함된 ZEISS LSM 880으로 획득하였다. 공초점 현미경사진(z-스택)은 동일한 현미경 설정으로 20x 대물렌즈에서 촬영하였다. 평균 형질도입 효능을 결정하기 위해, 형질도입된 OBC 세포체[mCitrine(+) 및 Goα(+)]에서 세포질 Alexa488 형광(mCitrine에 대한 2차 항체)을 결정하였다. 특히, Fiji 이미지 처리 소프트웨어의 휘도 기능을 사용하여 4.15 um 직경의 OBC 체세포 영역에서 임의의 형광 값을 결정하였다. 형광 정량화 및 세포 카운팅을 포함한 이미지 분석은 Fiji-21울필(ulfil)21로 수행하였다(버전 2.0.0, https://fiji.sc/, 문헌[Schindelin et al., Nat Methods, 2012. 9(7): p. 676-82]). 정규화를 위해, 각각의 발현 OBC[mCitrine(+) 및 Goα(+)]로부터의 형광 값을 비발현 OBC[mCitrine(-) 및 Goα(+)]로부터의 측정으로부터 결정된 평균 배경 형광 값으로 나누었다. 도 2에서 입증된 바와 같이, 566P 기본 프로모터는 OBC에서 가장 약한 mCitrine 발현을 매개한 반면, 454P로부터의 발현은 사용된 인핸서 요소와 무관하게 Lu의 200En-mGluR500P보다 항상 유의하게 더 강력했다. 따라서, 454P는 모든 후속 실험을 위해 선택되었다. 770En_454P(hGRM6)(F = 6.03 ± 1.53; 평균 ± s.d.) 및 407En_454P(hGRM6)(F = 5.65 ± 0.09; 평균 ± s.d.)는 효능 측면에서 동등하게 잘 수행되었으며, Lu의 마우스 유도된 200En-mGluR500P(F = 4.49 ± 0.22; 평균 ± s.d.)보다 훨씬 더 우수했으며, 따라서 둘 다 더 자세히 분석되었다.
실시예 4: 인간 망막 외식편에서의 유의하게 개선된 원뿔형 ON-양극성 세포 선호도
다음 단계에서, 발현의 OBC 세포-유형 특이성에 대해 섹션을 분석하였다. 이를 위해 절편을 이식유전자 mCitrine, 유비쿼터스 OBC 마커 Gαo 및 간상체 양극성 세포 특이적 항체 PKCα에 대한 항체로 염색하였다. [mCitrine(+), PKCα(+), Gαo(+)] 세포는 발현하는 간상체 ON-양극성 세포(RBC)로 명확하게 확인된 반면, [mCitrine(+), PKCα(-), Gαo(+)] 세포는 발현하는 원뿔형 ON-양극성 세포(cOBC)로 명확하게 확인되었다. 따라서, [mCitrine(-), PKCα(+)] 세포는 비발현 RBC로 확인되고, [mCitrine(-), PKCα(-), Gαo (+)] 세포는 비발현 cOBC로 확인되었다. 도 3에 표시된 결과는 770En_454P(hGRM6) 및 407En_454P(hGRM6)가 200En-mGluR500P에 비해 cOBC에서 훨씬 더 높은 이식유전자 발현을 유도한다는 것을 분명하게 나타낸다. cOBC 선호도에 대한 척도(도 3의 B)는 발현하는 cOBC 및 RBC의 양을 분석된 망막 영역에서 cOBC 및 RBC의 전체 수로 정규화하여 결정되었다. 이러한 정규화는 770En_454P(hGRM6)(cOBC 선호도 49.5%) 및 407En_454P(hGRM6)(cOBC 선호도 36.4%)가 200En-mGluR500P(cOBC 선호도 16.3%)에 비해 cOBC 세포 유형에서 발현을 유도하는 능력이 매우 향상되었음을 보여준다. 특히, 770En_454P(hGRM6)는 RBC 및 cOBC에 대한 동일한 선호도를 나타낸다(각각 ~50%, 도 3의 B).
또한 외식된 인간 망막의 황반은 scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine으로 형질도입되었다. mCitrine, PKCα 및 Gαo를 사용한 면역표지화는 중심와가 cOBC를 독점적으로 포함하고 770En_454P(hGRM6)가 거의 모든 cOBC에서 mCitrine 발현을 유도한다는 것을 분명하게 보여주었다(도 7). 인간 중심와의 cOBC에서 이식유전자 발현을 효율적으로 유도하는 능력은 중심와가 높은 시력을 매개하고 시력을 회복하는 망막 유전자 요법의 주요 표적을 나타내기 때문에 인간 치료에 매우 중요하며, 중심와에는 cOBC만 포함된다.
실시예 5: 200En-mGluR500P와 비교한 770En_454P(hGRM6)의 OBC 특이성
손상된 망막 신호전달과 같은 표적외 효과를 피하기 위해 OBC에 대한 높은 선호도가 필요하다. 인간 망막 절편은 mCitrine(이식유전자), Goα(일반 OBC 마커) 및 핵 염색 DAPI에 대한 항체로 표지하여, 세포층을 분화하였다. 이로부터 발현 세포 유형의 식별이 유도될 수 있다: 광수용체(PRs, mCitrine(+), 외부 핵층에 위치), OBC[mCitrine(+),Goα(+) 및 내부 핵층에 위치], 무축삭 세포[ACs, mCitrine(+),Goα(-) 및 내부 핵층에 위치] 및 신경절 세포(GCs, mCitrine(+), 신경절 세포층에 위치). 도 4의 A는 신규 프로모터 770En_454P(hGRM6)가 200En-mGluR500P(70.1 ± 12.2%)에 비해 OBC에 대한 선호도가 크게 증가했음(88.3 ± 7.8%)을 분명히 보여준다. 또한, 200En-mGluR500P의 표적외 발현은 일반적으로 신규 770En_454P(hGRM6) 프로모터(4.1 ± 3.2%)에 비해 특히 AC에서 더 높았다(16.9 ± 9.1%). 후자는 표적 외 발현이 망막 신호전달을 손상시키는 광유전학적 시력 회복에 특히 중요하다.
실시예 6: 퇴행 마우스 망막에서의 프로모터 평가
망막 치료에서 중요한 것은 치료에 대한 조직의 접근성이다. 이것은 해부학적, 기능적 및 전사적 변화가 있는 퇴행성 과정에서 어려울 수 있다. 본 발명자들은 이전에 Kim의 뮤린 200En-SV40 프로모터가 급속 퇴행성 rd1 마우스 모델에서 더 이상 기능하지 않는다는 것을 보여주었다(문헌[van Wyk et al. Front Neurosci 2017. 11: p. 161]). 따라서, 770En_454P(hGRM6) [및 비교를 위한 그의 뮤린 대응물 200En-mGluR500P]의 성능[문헌[Lu et al. Gene Ther 2016. 23 p: 680~689]을 퇴행성 rd1 마우스 모델에서 테스트하였다. 프로모터는 광유전학적 MWOPN_-mGluR6-IRES2-TurboFP635(서열번호 16, 플라스미드 맵 도 8) 이식유전자와 조합되었고, ssAAV2(7m8)로 패키징되었다(문헌[Dalkara et al. Sci Transl Med 2013. 5: p. 189ra76]). (문헌[van Wyk et al. Front Neurosci 2017. 11: p. 161]; 문헌[van Wyk et al., PloS Biol 2015. 13: p. e1002143])에 기술된 대로 후기 퇴행된, 22주령의 rd1 마우스의 눈에 3x109 vg를 유리체내 주사하였다. 주사 4주 후, 마우스를 안락사시키고, 이전에 기술된 바와 같이 면역조직화학적 분석을 위해 망막을 추출하였다[문헌[van Wyk, M., et al., Front Neurosci, 2017. 11(161): p. 161];문헌[van Wyk et al., PloS Biol 2015. 13: p. e1002143]]. 본 발명자들은 이식유전자 TurboFP635, OBC-특이적 Goα 마커 및 핵 염색 DAPI에 대한 섹션에 라벨을 붙였다. 200En-SV40과 반대로, 770En_454P(hGRM6) 뿐만 아니라 Lu의 Grm6-유도된 200En-mGluR500P는 rd1 망막의 OBC에서 기능하였다(도 5). 그러나, 200En-mGluR500P는 도 5의 A에 예시된 바와 같이 제한된 망막 영역에서만 발현을 유도한 반면, 770En_454P(hGRM6)는 일부 Grm6 하향조절이 발생했을 때 발현 역치를 극복하는 발현 강도 증가로 인해 퇴행성 망막의 훨씬 더 확장되고 광범위한 형질도입을 유도한다(도 5의 B). 퇴행성 망막에서 770En_454P(hGRM6)에 의해 유도되는 이식유전자(mCitrine) 발현의 특이성 및 효능을 분석하기 위해, 본 발명자들은 더 늦은 시점(29~33주령)에 추가로 9마리의 rd1 마우스를 주사하였다. 4주 후, 동물을 안락사시키고, 눈을 동결시키고 절개하였다. 동결절편은 mCitrine 및 Goα에 대한 항체로 다시 표지되었고, 공초점 현미경으로 분석하였다. 여기에서도 이러한 완전히 퇴화된 망막에서, 이식유전자[mCitrine(+), Goα(-)]를 발현하는 모든 세포의 ~67%가 OBC[mCitrine(+), Goα (+)]였다. 마찬가지로, 모든 OBC [mCitrine(-), Goα (+)]의 ~55% 가 이식유전자 [mCitrine(+), Goα (+)]를 발현하였다(도 5의 D). 퇴행성 망막에서 치료적 이식유전자의 광범위하고 구체적인 발현은 효율적인 유전자 치료를 위한 기본이다.
실시예 7: rd1 마우스에서 광유전학적 유전자 요법 및 시력 회복
770En_454P(hGRM6)의 유리한 특성이 OBC를 표적으로 하는 기능적 광유전학적 시력 회복을 지원하는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 rd1 퇴행성 마우스 모델로 원리-증명 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 3x109 vg의 ssAAV(7m8)- 770En_454P(hGRM6)-MWOPN_mGluR6-IRES2-TurboFP635-WPRE-BGHpA(플라스미드 맵 도 8)를 3마리의 완전히 광수용체가 없는 22주령 rd1 마우스에 양측으로 주사하였다. MWOPN_mGluR6(서열번호 16)은 OBC 활성을 매개하고 이러한 시력 회복과 함께 Opto-mGluR6과 유사하게 동작하는 뮤린 원뿔형 중간-파장 옵신(MWOPN)과 뮤린 mGluR6 사이의 키메라 단백질이다(문헌[van Wyk et al., PloS Biol 2015. 13: p. e1002143]). 본 발명자들은 동물을 놓을 수 있는 플랫폼을 둘러싼 4개의 스크린(23.8인치 풀 HD IPS 패널)이 있는 작은 챔버(54 x 54 x 30 cm)를 포함하는 자동화된 가상 OptoDrum(Sriatech®)에 주사 후 다양한 시점(41일, 47일, 55일, 82일, 및 112일)에 광운동반응(OMR)([문헌[Prusky et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 2004. 45(12): p. 4611-6.]] 이후)을 감지하여 시력을 측정하였다. 스크린의 밝기는 250 cd/m2로 조절했고, 챔버의 바닥과 상단은 거울로 덮었다. 소형 산업용 카메라(글로벌 셔터 및 광각 렌즈가 있는 IR 감지 1/3" CMOS 센서, F1.6)는 위에서부터 마우스의 머리 움직임을 추적하면서, 흑백의 비정현파 수직 막대의 회전 패턴이 다른 공간 주파수의 스크린에 표시되었다. 소프트웨어 Optodrum은 기록된 머리 움직임을 분석하고, 적용된 자극의 두께, 대비 및 속도를 제어하였다. 움직이는 막대의 속도는 12°/s로 설정하고, 대비는 100%로 설정하였다. 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 각 마우스의 중앙값 시력은 다른 실험에서 측정된 모든 시력에서 결정되었다. 처리된 마우스의 시력 중앙값은 0.29 ± 0.03 주기/°(n=3, ± s.d., P=0.0048)로, 0.15 ± 0.06 주기/° (n=7, P≥194)를 갖는 주사되지 않은 rd1 대조군 마우스의 시력 중앙값보다 유의하게 양호했지만, 평균 시력이 0.43 ± 0.05 주기/° (n=10, s.d., P=0.0006)인, C57BL/6 양성 대조군의 시력 중앙값보다 여전히 더 나쁘다. 그러나 광유전학적 OBC 표적 치료는 광운동 반응의 현저한 개선을 초래하였다. 이와 함께, 결과는 770En_454P(hGRM6)가 짧은(1243 bp) 인간 유전자 기반 프로모터인 OBC-표적 인간 유전자 요법에 대한 모든 요건들을 충족하고, 퇴행시에 cOBC를 포함한, OBC에 대하여 여전히 매우 효율적이고 특이적임을 증명한다.
재료 및 방법
생물활성 분석
생물활성 분석은 위의 실시예 섹션에 설명되어 있다. 인간 망막 외식편의 배양 및 AAV 형질도입뿐만 아니라 마우스 눈으로의 유리체내 AAV 주사 및 동결된 망막 절편의 후속 면역조직화학적 처리는 [문헌[van Wyk, M., et al., Front Neurosci, 2017. 11(161): p. 161.]]에 상술되어 있다.
원뿔형 ON-양극성 세포 특이성의 결정
이를 위해, 망막 동결절편은 이식유전자 mCitrine(Invitrogen, A11122, 1:500), 유비쿼터스 OBC 마커 Gαo(EMD, MAB3073, 1:750) 및 RBC 특이적 항체 PKCα(Santa Cruz, sc8393, 1:750)에 대한 항체들로 삼중 염색하였다. [mCitrine(+), PKCα(+), Gαo(+)] 세포는 RBC를 발현하는 것으로 명확하게 확인된 반면, [mCitrine(+), PKCα(-),Gαo(+)] 세포는 cOBC를 발현하는 것으로 명확하게 확인되었다. 도 3의 A에 도시된 OBC 유형 선호도는 모든 OBC[mCitrine(+), PKCα(-), Gαo(+)] / [Gαo(+)]에 대한 cOBC의 발현 비율로 결정하고, RBC 유형 선호도는 모든 OBC[mCitrine(+), PKCα(+), Gαo(+)] / [Gαo (+)]에 대한 RBC의 발현 비율로 결정하였다. 발현에 대한 cOBC 선호도, 다시 말해서 cOBC가 발현할 확률을 측정하기 위해, 본 발명자들은 이 특정 망막 분석 영역에서 발현하는 cOBC 및 RBC의 수 각각을 cOBC 및 RBC의 양과 연관지었다. [mCitrine(-), PKCα(+),Gαo(+)] 세포가 비-발현 RBC로서, 그리고 [mCitrine(-), PKCα(-), Gαo(+)]가 비-발현 cOBC로서 명확하게 확인될 수 있기 때문에, 이러한 정규화가 가능하였다. 따라서, 비율 [mCitrine(+), PKCα(+), Gαo13(+)] / [mCitrine(-), PKCα(+),Gαo(+)]는 형질도입되고 RBC를 발현하는 백분율을 나타내는 반면, 비율 [mCitrine(+), PKCα(-),Gαo(+)] / [mCitrine(-), PKCα(-), Gαo(+)]는 각 망막 분석 영역에서 형질도입되고 cOBC를 발현하는 백분율을 나타낸다. 따라서, 도 3의 B에 표시된 결과 백분율은 cOBC가 형질도입될 가능성을 나타낸다.
분자 공학에 사용되는 소프트웨어
본 발명자들은 캘리포니아 산타 크루즈 대학의 게놈 연구소의 게놈 브라우저(UCSC Genome Browser, https://genome.ucsc.edu/)를 사용하여[문헌[Kent et al., Genome Res, 2002. 12(6): p. 996-1006]; 문헌[Kuhn et al., Brief Bioinform, 2013. 14(2): p. 144-61]] 게놈 프로모터 서열 및 게놈 주석을 연구하였다.
신규 GRM6-기반 프로모터에 의해 생성된 유전자 발현의 조절에 관여할 가능성이 있는 전사 인자 및 전사 인자 결합 부위를 확인하기 위해, 본 발명자들은 유전자 전사 조절 데이터베이스(Gene Transcription Regulation Database (GTRD, gtrd.biouml.org/))로부터의 ChIP-seq 데이터를 사용하였다[문헌[Yevshin et al., Nucleic Acids Res, 2017. 45(D1): p. D61-D67]].
플라스미드 맵은 Vector NTI Advance (버전 11.5.2)에서 생성되었다.
항체
[표 3]
Figure pct00007
공초점 이미징 하드웨어 및 소프트웨어
Airyscan 및 ZEN 2.1 소프트웨어와 함께 ZEISS LSM 880을 사용하여 20x 또는 40x 대물 렌즈로 공초점 이미지를 촬영하였다. 이미지는 Fiji에서 처리 및 평가하였다[문헌[Schindelin et al., Nat Methods, 2012. 9(7): p. 676-82.]]. 세포 카운팅을 위해 세포 계수기 플러그인을, 및 이미지 처리를 위해 표준 Fiji 도구를 사용하였다. 스티치 플러그인[문헌[Preibisch et al., Bioinformatics, 2009. 25(11): p. 1463-5.]]은 Fiji가 타일 스캔 사진을 자동으로 결합하지 못한 경우에 사용하였다.
통계
달리 명시되지 않은 경우, 값을 양측 스튜던트 t-검정과 비교하고, 이 작업 전반에 걸쳐 생물학적 샘플 전반에 걸친 평균 값± 표준 편차를 제공하였다. 유의 수준은 별표로 표시된다: *는 P≤0.05를 나타내고, **는 P≤0.01을 나타내고, ***은 P≤0.001을 나타낸다.
기타 방법
상기 및 실시예 1 및 2에 기술되지 않은 나머지 방법은 [문헌[van Wyk, M., et al., Front Neurosci, 2017. 11(161): p. 161.]]에서 찾아볼 수 있다.
서열
[표 4]
Figure pct00008
서열번호 1: 407En(h GRM6 )
Figure pct00009
서열번호 2: 770En(h GRM6 )
Figure pct00010
서열번호 3: 444En(h GRM6 )
Figure pct00011
서열번호 4: 429En(m Grm6 ), 407En(hGRM6)에 상응하는 뮤린 서열
Figure pct00012
서열번호 5: 792En(m Grm6 ), 770En(hGRM6)에 상응하는 뮤린 서열
Figure pct00013
서열번호 6: 460En(m Grm6 ), 444En(hGRM6)에 상응하는 뮤린 서열
Figure pct00014
서열번호 7: 454P(h GRM6 )
Figure pct00015
서열번호 8: 566P(h GRM6 )
Figure pct00016
서열번호 9: 454P(m Grm6 ), 454P(hGRM6)에 상응하는 뮤린 서열
Figure pct00017
서열번호 10: 566P(m Grm6 ), 566P(hGRM6)에 상응하는 뮤린 서열
Figure pct00018
서열번호 11: 407En _454P( h GRM6 )
Figure pct00019
서열번호 12: 407En _566P( h GRM6 )
Figure pct00020
서열번호 13: 770En _454P( h GRM6 )
Figure pct00021
서열번호 14: 770En _566P( h GRM6 )
Figure pct00022
서열번호 15: 444En _454P( h GRM6 )
Figure pct00023
서열번호 16: MWOPN _ mGluR6
Figure pct00024
서열번호 17: IRES2
Figure pct00025
서열번호 18: mCitrine
Figure pct00026
서열번호 19: TurboFP635
Figure pct00027
서열번호 20: WPRE
Figure pct00028
서열번호 21: BGH pA
Figure pct00029
서열번호 22: sNRP - 1 pA
Figure pct00030
서열번호 23: WT 캡시드 AAV2
Figure pct00031
서열번호 24
Figure pct00032
서열번호 25
Figure pct00033
SEQUENCE LISTING <110> Universitaet Bern <120> ON-bipolar cell-specific promoters for ocular gene delivery <130> uz375wo <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 407 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctctgatttt aaaggaagta gatacttcaa ataattcatc atggagtgca atattttctg 60 taggctttta gtagataact tcatcagttt aaagaagatc cttagattat gaaacattta 120 caattatgaa tgaatattag atgttatcaa atgctttttc tgcatccatt tagataatca 180 tgtttttcct ttaatctgtt aatgcggtga attacattaa tagatttcct aagtcattaa 240 tctgctaaag tgcatttctg ggacaaacca gacttggtta tgacattgta tgtatttcag 300 tttgcaaata ttggactagg atttttgtat ctatattcct tagtttgacc tgtaaatttt 360 atttcttgta ctaagtatta gcctcacgaa aggcattgtc aaatgtt 407 <210> 2 <211> 770 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gggtctccaa cttgccaact gtagatcttg gaacctttca tccttcataa ctgcataagc 60 caattccttc taataaatct gtataatata tctgtctata taataaatat gtacttacat 120 aactctgtat gttacatcta tctattctat ctatctatct atctatctat ctatctatct 180 atctatcatc tatctatcta tttatctatt ctctgtgtct 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480 gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540 gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccaca 585 <210> 18 <211> 726 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 18 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgatg tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagct accagtccaa gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720 ggataa 726 <210> 19 <211> 708 <212> DNA <213> Entacmaea quadricolor <400> 19 atggtgggtg aggatagcgt gctgatcacc gagaacatgc acatgaaact gtacatggag 60 ggcaccgtga acgaccacca cttcaagtgc acatccgagg gcgaaggcaa gccctacgag 120 ggcacccaga ccatgaagat caaggtggtc gagggcggcc ctctcccctt cgccttcgac 180 atcctggcta ccagcttcat gtacggcagc aaaaccttta tcaaccacac ccagggcatc 240 cccgacttct ttaagcagtc cttccctgag ggcttcacat gggagaggat caccacatac 300 gaagacgggg gcgtgctgac cgctacccag gacaccagcc tccagaacgg ctgcctcatc 360 tacaacgtca agatcaacgg ggtgaacttc ccatccaacg gccctgtgat gcagaagaaa 420 acactcggct gggaggccag caccgagatg ctgtaccccg ctgacagcgg cctgagaggc 480 catagccaga tggccctgaa gctcgtgggc gggggctacc tgcactgctc cctcaagacc 540 acatacagat ccaagaaacc cgctaagaac ctcaagatgc ccggcttcta cttcgtggac 600 aggagactgg aaagaatcaa ggaggccgac aaagagacct acgtcgagca gcacgagatg 660 gctgtggcca ggtactgcga cctgcctagc aaactggggc acagctga 708 <210> 20 <211> 542 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE sequence <400> 20 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cg 542 <210> 21 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGH pA signal <400> 21 gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 60 ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 120 cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 180 gaggattggg aagacaatag caggcatgct 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Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Phe Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr 580 585 590 Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 24 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 24 gccgccacca ugg 13 <210> 25 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 25 gccgccgcca ugg 13

Claims (13)

  1. 850 염기쌍(bp) 내지 1500 bp 길이의 단리된 핵산 분자로서,
    a. 서열번호 1 내지 3으로부터 선택된 인핸서 서열 요소, 및
    b. 서열번호 7의 프로모터 서열 요소
    를 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  2. 850 염기쌍(bp) 내지 1500 bp 길이의 단리된 핵산 분자로서,
    a. 서열번호 1 내지 3으로부터 선택된 서열과 적어도 70% (이상), 특히 75% 이상, 80% 이상, 더욱 특히 85% 이상, 더욱 특히 90% 이상, 더욱 특히 95% 이상, 더욱더 특히 98% 이상, 가장 특히 100% 동일한 인핸서 서열 요소; 및
    b. 서열번호 7의 서열과 70% 이상, 특히 75% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱 특히 85% 이상, 더욱 특히 90% 이상, 더욱 특히 95% 이상, 더욱더 특히 98% 이상, 가장 특히 100% 동일한 프로모터 서열 요소를 포함하며;
    상기 단리된 핵산 분자는 서열번호 13의 서열로부터의 원뿔형 ON 양극성 세포-특이성의 40% 이상, 특히 50% 이상, 더욱 특히 60% 이상, 더욱더 특히 70% 이상, 더욱 특히 80% 이상, 더욱더 특히 90% 이상, 가장 특히 100%를 가지며, 20% 이상, 특히 25% 이상, 더욱 특히 30% 이상, 더욱더 특히 35% 이상, 더욱 특히 40% 이상, 가장 특히 50% 이상의 원뿔형 ON 양극성 세포 선호도를 갖는, 단리된 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단리된 분자는 상기 인핸서 서열 요소 중 하나 및 단 하나, 상기 프로모터 서열 요소들 중 하나 및 단 하나 및 선택적으로, 프로모터 서열 요소로부터 인핸서 서열 요소를 분리하는 스페이서로 구성된, 단리된 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 15로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 구성되거나, 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 15로부터 선택된 서열에 대해 98% 이상의 동일성을 특징으로 하는 서열을 포함하거나 이로 구성된, 단리된 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 11 또는 서열번호 13의 서열을 포함하거나 이로 구성되거나, 서열번호 11 또는 서열번호 13에 대해 98% 이상의 동일성을 특징으로 하는 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 특히 서열번호 13의 서열을 포함하거나 이로 구성되거나, 서열번호 13에 대해 98% 이상의 동일성을 특징으로 하는 서열을 포함하거나 이로 구성된, 단리된 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 핵산 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 핵산 발현 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 재조합 아데노-연관 벡터(rAAV)이며, 특히 상기 핵산 발현 벡터는 재조합 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAV12 벡터이며, 더욱 특히 상기 핵산 발현 벡터는 재조합 AAV2 벡터인, 핵산 발현 벡터.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    a. 캡시드 단백질을 암호화하는 서열, 및
    b. 이식유전자
    를 추가로 포함하는, 핵산 발현 벡터.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 이식유전자는 서열번호 16의 서열을 포함하는, 핵산 발현 벡터.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산 분자 또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 핵산 발현 벡터를 포함하는 아데노-연관 비리온 입자.
  11. 의약으로 사용하기 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산 분자 또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 핵산 발현 벡터, 및 제10항에 따른 아데노-연관 비리온 입자로부터 선택된 제제.
  12. 선천성 정지성 야맹증(CSBN1) 또는 간상체 및 원추체 이영양증, 특히 색소성 망막염 및 황반 변성의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산 분자, 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 핵산 발현 벡터, 및 제10항에 따른 아데노-연관 비리온 입자로부터 선택된 제제.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산 분자, 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 핵산 발현 벡터, 및 제10항에 따른 아데노-연관 비리온 입자로부터 선택된 제제로서, 상기 제제는
    a. 유리체내 투여, 특히 유리체내 주사 또는
    b. 망막하 주사
    에 의해 투여되는, 제제.
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