EA045729B1 - Промоторы, специфические в отношении on-биполярных клеток, для внутриглазной доставки генов - Google Patents
Промоторы, специфические в отношении on-биполярных клеток, для внутриглазной доставки генов Download PDFInfo
- Publication number
- EA045729B1 EA045729B1 EA202291525 EA045729B1 EA 045729 B1 EA045729 B1 EA 045729B1 EA 202291525 EA202291525 EA 202291525 EA 045729 B1 EA045729 B1 EA 045729B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- nucleic acid
- seq
- sequence
- acid molecule
- isolated nucleic
- Prior art date
Links
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 title 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 128
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 127
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 127
- 210000001743 on-bipolar cell Anatomy 0.000 claims description 82
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 55
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 50
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 36
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 25
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 19
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 claims description 17
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 10
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 8
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 claims description 7
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 7
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 6
- 208000006623 congenital stationary night blindness Diseases 0.000 claims description 6
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 claims description 4
- 201000006754 cone-rod dystrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 claims description 3
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 claims description 3
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 claims description 3
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 claims description 3
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 claims description 3
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 claims description 3
- 241000649045 Adeno-associated virus 10 Species 0.000 claims description 3
- 241000649046 Adeno-associated virus 11 Species 0.000 claims description 3
- 241000649047 Adeno-associated virus 12 Species 0.000 claims description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 69
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 39
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 35
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 34
- 101150020891 PRKCA gene Proteins 0.000 description 29
- 101150027545 GRM6 gene Proteins 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 210000002508 rod bipolar cell Anatomy 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 19
- 102100038300 Metabotropic glutamate receptor 6 Human genes 0.000 description 17
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 108010038450 metabotropic glutamate receptor 6 Proteins 0.000 description 15
- 239000013644 scAAV2 vector Substances 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 14
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 14
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 13
- 101100176593 Homo sapiens GRM6 gene Proteins 0.000 description 11
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 11
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 10
- 108050001704 Opsin Proteins 0.000 description 9
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 101100176594 Mus musculus Grm6 gene Proteins 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 6
- 101001032837 Homo sapiens Metabotropic glutamate receptor 6 Proteins 0.000 description 6
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 6
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000010175 Opsin Human genes 0.000 description 5
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 5
- 210000003994 retinal ganglion cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000026269 optomotor response Effects 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 108010035848 Channelrhodopsins Proteins 0.000 description 3
- 108010003730 Cone Opsins Proteins 0.000 description 3
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 206010034960 Photophobia Diseases 0.000 description 3
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 3
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 3
- 210000000411 amacrine cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 208000013469 light sensitivity Diseases 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 210000003569 retinal bipolar cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001121709 Homo sapiens Nyctalopin Proteins 0.000 description 2
- 101000844510 Homo sapiens Transient receptor potential cation channel subfamily M member 1 Proteins 0.000 description 2
- 208000032578 Inherited retinal disease Diseases 0.000 description 2
- 102100025469 Nyctalopin Human genes 0.000 description 2
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 2
- 102100021191 Probable G-protein coupled receptor 179 Human genes 0.000 description 2
- 108091011158 Probable G-protein coupled receptor 179 Proteins 0.000 description 2
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 description 2
- 102000004330 Rhodopsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 2
- 102000003617 TRPM1 Human genes 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004258 retinal degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N (aminomethyl)phosphonic acid Chemical compound NCP(O)(O)=O MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 102100035931 60S ribosomal protein L8 Human genes 0.000 description 1
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 1
- 108010082845 Bacteriorhodopsins Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 206010010559 Congenital night blindness Diseases 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000242771 Entacmaea quadricolor Species 0.000 description 1
- 102100030334 Friend leukemia integration 1 transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000018899 Glutamate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010027915 Glutamate Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010050754 Halorhodopsins Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101001062996 Homo sapiens Friend leukemia integration 1 transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 101000893493 Homo sapiens Protein flightless-1 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000596772 Homo sapiens Transcription factor 7-like 1 Proteins 0.000 description 1
- VLSMHEGGTFMBBZ-OOZYFLPDSA-M Kainate Chemical compound CC(=C)[C@H]1C[NH2+][C@H](C([O-])=O)[C@H]1CC([O-])=O VLSMHEGGTFMBBZ-OOZYFLPDSA-M 0.000 description 1
- 235000000421 Lepidium meyenii Nutrition 0.000 description 1
- 240000000759 Lepidium meyenii Species 0.000 description 1
- 101150005609 MED20 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025912 Melanopsin Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101001032836 Mus musculus Metabotropic glutamate receptor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101100476480 Mus musculus S100a8 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000001140 Night Blindness Diseases 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 108090000431 Proteorhodopsin Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000356457 Salticidae Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100035097 Transcription factor 7-like 1 Human genes 0.000 description 1
- 241001492404 Woodchuck hepatitis virus Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000007451 chromatin immunoprecipitation sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000004456 color vision Effects 0.000 description 1
- 201000008615 cone dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000887 face Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000004886 head movement Effects 0.000 description 1
- 201000007500 hereditary night blindness Diseases 0.000 description 1
- 230000004371 high visual acuity Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 210000001153 interneuron Anatomy 0.000 description 1
- 235000012902 lepidium meyenii Nutrition 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108010005417 melanopsin Proteins 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- -1 photopsins Proteins 0.000 description 1
- 210000000608 photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108010013519 rat ribosomal protein L8 Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000000790 retinal pigment Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 101150027142 rpl8 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011816 wild-type C57Bl6 mouse Methods 0.000 description 1
Description
Настоящее изобретение относится к синтетическим промоторным последовательностям, специфическим в отношении ON-биполярных клеток сетчатки, и к их применению в терапевтической доставке трансгенов в глаз для улучшения и/или восстановления зрения. Настоящее изобретение предусматривает промоторы гена метаботропного глутаматного рецептора 6 (mGluR6) для повышенной и более специфической экспрессии в ON-биполярных клетках. В частности, для эффективной экспрессии в ONбиполярных клетках, представляющих собой колбочки, присутствующих исключительно в макуле человека.
Описание
Предпосылки изобретения
Многие причины слепоты имеют лишь ограниченные возможности лечения или вообще не лечатся. Наиболее распространенными среди них являются возрастная макулярная дегенерация (AMD) и наследственные заболевания сетчатки (IRD), такие как пигментный ретинит (RP). Эти дегенеративные заболевания характеризуются прогрессирующей потерей фоторецепторов (PR), что в конечном итоге приводит к полной слепоте. Средства генной терапии, доставляющие лечебную ДНК или РНК, заменяющие или подвергающие сайленсингу дефектные гены или кодирующие экзогенный лечебный ген, направлены на замедление прогрессирования заболевания, снижение степени тяжести симптомов или восстановление утраченной функции.
Оптогенетическая генная терапия является одной из наиболее многообещающих новых технологий, которые могут быть использованы для лечения слепоты, вызванной дегенерацией сетчатки. Текущие клинические испытания средств оптогенетической терапии неспецифически нацеливаются на ганглиозные клетки сетчатки (RGC) с канальными родопсинами для восстановления чувствительности сетчатки к свету. В будущем оптогенетические средства генной терапии следующего поколения, адаптированные по отношению к клеткам, докажут свое превосходство над этими неспецифическими средствами терапии. В этих средствах терапии следующего поколения применяются промоторы, специфические в отношении типа клеток, для доставки новых и эффективных оптогенетических инструментов к определенным типам клеток сетчатки. Среди мишеней из типов клеток наиболее многообещающими являются биполярные клетки сетчатки (BC), первые интернейроны сетчатки, которые естественным образом получают прямой входной сигнал от PR. BC делятся на BC ON- и OFF-типа, реагирующие либо на повышение освещенности, либо на снижение освещенности соответственно, и экспрессирующие либо mGluR6, либо AMPA/каинатные глутаматные рецепторы. ON-биполярные клетки (OBC) являются особенно интересными мишенями для генной терапии. Все мутации в специфических генах OBC, таких как NYX, GRM6, GPR179 или TRPM1, приводят к полной слепоте (врожденной стационарной ночной слепоте), поскольку эти гены участвуют в сигнальном каскаде mGluR6, и, следовательно, OBC становятся нефункциональными. Совсем недавно было доказано, что экспрессия оптогенетических белков в OBC восстанавливает зрение у мышей, представляющих собой модели фоторецепторной дегенерации, страдающих от поздних стадий дегенерации. Канальный родопсин-2 (Lagali et al., Nat Neurosci 2008. 11:p. 667-675), родопсин (Cehajic-Kapetanovic et al., Curr Biol 2015. 25 : p. 2111-2122) и химерный Opto-mGluR6 (van Wyk et al., PLoS Biol 2015. 13: p. e1002143) были успешно экспрессированы в OBC слепых мышей и восстановили функциональное зрение на уровнях сетчатки, коры, а также на поведенческом уровне. Для всех вышеупомянутых подходов необходимо специфически нацеливаться на тип OBC, в частности в случае оптогенетических подходов, чтобы избежать противоречивой передачи сигнала от нецелевых клеток, искажающей код сетчатки. Кроме того, специфическое нацеливание на OBC также позволяет снизить и таким образом сделать более безопасной дозировку AAV. Отсутствие функционального и OBCспецифического промотора до сих пор препятствовало клиническому применению средств генной терапии, нацеливающихся на OBC.
Короткие энхансерные промоторные последовательности обычно использовались в данной области для достижения OBC-специфического нацеливания в комбинации со средством генной терапии на основе AAV. Это связано с тем, что способность AAV к упаковке ограничена 4,7 т.п.о. и обычно не позволяет вместить эндогенные промоторы длиной несколько т.п.о. В этом отношении наиболее успешными оказались энхансерные промоторные последовательности, полученные из OBC-специфического глутаматного рецептора mGluR6, экспрессируемого исключительно в OBC сетчатки. До недавнего времени стандартно использовали энхансерную последовательность длиной 200 п.о., полученную из мышиного гена Grm6, и в комбинации с вирусным основным промотором SV40 (Kim et al. J Neurosci, 2008. 28: p. 7748-7764.), сокращенно обозначенную 200En-SV40. Однако недавно авторы настоящего изобретения показали, что ее вариант, 4x200En-SV40, который несет четыре повтора энхансерной последовательности (Cronin et al. EMBO Mol Med 2014. 6: p. 1175-1190), не является ни OBC-специфическим, ни функциональным при дегенерации сетчатки поздней стадии (van Wyk et al. Front Neurosci 2017. 11: p. 161). Совсем недавно был сконструирован короткий энхансер/промотор на основе полноразмерного мышиного гена Grm6 (200EnmGluR500P), который экспрессируется в сетчатке мышей C57BL/6 дикого типа с относительно хорошей специфичностью в отношении OBC (Lu et al. Gene Ther, 2016. 23: p. 680-9.). Тем не менее, экспрессия в OBC дегенерирующей сетчатки не была показана, и экспрессия была практически исключительно обусловлена OBC типа палочек. Следовательно, OBC типа колбочек, обнаруженные исключительно в маку
- 1 045729 ле сетчатки фовеальных животных, включая человека, и соединяющиеся с фовеальными колбочками, опосредующими цветовое зрение высокой остроты, практически не являются мишенями для 200EnmGluR500P, что делает данный промотор непригодным для восстановления центрального зрения человека высокой остроты. Кроме того, предпочтителен промотор на основе человеческого гена GRM6, поскольку он будет полностью контролироваться транскриптомным механизмом человека, регулирующим экспрессию генов, т.е. экспрессию уровней белков, опосредующих функцию, но будет лишен индукции цитотоксичности.
Основываясь на вышеупомянутом уровне техники, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить средства и способы получения новых синтетических OBC-специфических человеческих промоторов. Данная цель достигается с помощью объекта изобретения согласно независимым пунктам формулы настоящего изобретения.
Сущность изобретения
Первый аспект настоящего изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты длиной от 850 пар оснований (п.о.) до 1500 п.о., содержащей:
a) элемент энхансерной последовательности, выбранный из SEQ ID NO 1-6, и
b) элемент промоторной последовательности, выбранный из SEQ ID NO 7-10.
Альтернатива первому аспекту настоящего изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты длиной от 850 пар оснований (п.о.) до 1500 п.о., содержащей:
a) элемент энхансерной последовательности, который на по меньшей мере 70% (или больше), в частности на 75% или больше, более конкретно на 80% или больше, более конкретно на 85% или больше, более конкретно на 90% или больше, более конкретно на 95% или больше, еще более конкретно на 98% или больше, наиболее конкретно на 100% идентичен последовательности, выбранной из SEQ ID NO 1 и 2, и
b) элемент промоторной последовательности, который на 70% или больше, в частности на 75% или больше, более конкретно на 80% или больше, более конкретно на 85% или больше, более конкретно на 90% или больше, более конкретно на 95% или больше, еще более конкретно на 98% или больше, наиболее конкретно на 100% идентичен последовательности под SEQ ID NO 7, и при этом указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты характеризуется специфичностью к ON-биполярным клеткам, представляющим собой колбочки, составляющей 40% или больше, в частности 50% или больше, более конкретно 60% или больше, еще более конкретно 70% или больше, более конкретно 80% или больше, еще более конкретно 90% или больше, наиболее конкретно 100%, характерной для последовательности под SEQ ID NO 13, и предпочтительностью в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки, составляющей 20% или больше, в частности 25% или больше, более конкретно 30% или больше, еще более конкретно 35% или больше, более конкретно 40% или больше, наиболее конкретно 50% или больше.
Второй аспект настоящего изобретения относится к вектору экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту.
Третий аспект настоящего изобретения относится к трансгену, управляемому промотором.
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к вирионной частице аденоассоциированного вируса, содержащей выделенную молекулу нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, вектор экспрессии нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту или трансген согласно третьему аспекту.
Пятый аспект настоящего изобретения относится к средству, выбранному из выделенной молекулы нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, вектора экспрессии нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту, трансгена согласно третьему аспекту и вирионной частицы аденоассоциированного вируса согласно четвертому аспекту, для применения в качестве лекарственного препарата.
Формы для введения, содержащие средства по настоящему изобретению, являются дополнительными аспектами настоящего изобретения.
Термины и определения.
Термин OBC в контексте настоящего описания относится к ON-биполярной клетке.
Термин RBC в контексте настоящего описания относится к биполярной клетке, представляющей собой палочку.
Термин cOBC в контексте настоящего описания относится к ON-биполярной клетке, представляющей собой колбочку.
Термин RGC в контексте настоящего описания относится к ганглиозной клетке сетчатки.
Термин PR в контексте настоящего описания относится к фоторецептору.
Аббревиатура AAV в контексте настоящего описания относится к аденоассоциированному вирусу. Если не указано иное, AAV относится ко всем подтипам или серотипам, а также к обеим из способных к репликации и рекомбинантных форм.
Термины вирион AAV и вирусная частица AAV в контексте настоящего описания относятся к вирусной частице, состоящей из по меньшей мере одного капсидного белка AAV и инкапсулированной нуклеиновой кислоты.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту средней квалификации в области техни
- 2 045729 ки (например, в культивировании клеток, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, методиках гибридизации и биохимии). Стандартные методики используются для молекулярных, генетических и биохимических способов (см. в общем Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y . и Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.), а также химических способов.
Термин капсид AAV в контексте настоящего описания относится к синтетическим генам, кодирующим капсидные белки (cap). Описанный в данном документе термин капсид AAV можно использовать в отношении упаковки в рекомбинантные аденоассоциированные вирусы для генной терапии.
Термин гомологичный в контексте настоящего описания относится к последовательностям, большая часть которых является идентичной, но отличается в некоторых положениях наличием вставки, делеции или замены нуклеиновых кислот или аминокислот.
Термин трансген в контексте настоящего описания относится к гену или генетическому материалу, который был перенесен из одного организма в другой. В контексте настоящего изобретения данный термин также может относиться к переносу природного или физиологически интактного варианта генетической последовательности в ткань пациента, где она отсутствует. Это может дополнительно относиться к переносу природной кодированной последовательности, экспрессия которой управляется промотором, отсутствующим или подвергнутым сайленсингу в целевой ткани. Используемый в данном документе термин трансген относится к полинуклеотиду, кодирующему представляющий интерес полипептид, который при экспрессии в поврежденной или пораженной заболеванием сетчатке может быть пригоден для улучшения или восстановления зрения. Трансгены, представляющие особый интерес для восстановления светочувствительности или зрения, предусматривают светочувствительные белки, такие как гены опсинов, т.е. канальных родопсинов, опсинов позвоночных и их вариантов.
Термин рекомбинантный в контексте настоящего описания относится к нуклеиновой кислоте, которая является продуктом одной или нескольких стадий клонирования, рестрикции и/или лигирования и которая отличается от встречающейся в природе нуклеиновой кислоты. Рекомбинантная вирусная частица содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту.
Термин интравитреальное введение в контексте настоящего описания относится к пути введения фармацевтического средства, например, вируса, при котором средство доставляется в стекловидное тело глаза. Интравитреальное введение представляет собой процедуру помещения лекарственного препарата непосредственно в пространство в задней части глаза, называемое полостью стекловидного тела, которая заполнена желеобразной жидкостью, называемой гелем стекловидного тела.
Термин субретинальное введение в контексте настоящего описания относится к пути введения фармацевтического средства, в частности вируса в контексте данного описания, в пространство между клетками пигментного эпителия сетчатки (RPE) и фоторецепторами.
Нуклеотиды в контексте настоящего описания представляют собой строительные блоки нуклеиновой кислоты или аналогов нуклеиновой кислоты, олигомеры которых способны к образованию селективных гибридов с олигомерами РНК или ДНК на основе спаривания оснований. Термин нуклеотиды в данном контексте включает классические строительные блоки рибонуклеотидов, представляющие собой аденозин, гуанозин, уридин (и рибозилтимин), цитидин, классические дезоксирибонуклеотиды, представляющие собой дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, тимидин, дезоксиуридин и дезоксицитидин.
В контексте настоящего описания термины идентичность последовательностей и процент идентичности последовательностей относятся к значениям, определенным посредством сравнения двух выровненных последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны из уровня техники. Выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить с помощью алгоритма поиска локальной гомологии Смита и Уотермана, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981),алгоритма глобального выравнивания Нидлмана и Вунша, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), способа поиска сходства Пирсона и Липмана, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988) или посредством реализаций этих алгоритмов с помощью компьютера, включая без ограничения CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA и TFASTA. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST является общедоступным, например, через Национальный центр биотехнологической информации:
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
Одним таким примером сравнения последовательностей нуклеиновых кислот является алгоритм BLASTN, использующий настройки по умолчанию: ожидаемый порог: 10; размер слова: 28; максимальное количество совпадений в запрашиваемом диапазоне: 0; баллы за совпадение/несовпадение: 1.-2; стоимость гэпов: линейная. Если не указано иное, приведенные в данном документе значения идентичности последовательностей относятся к значениям, полученным с применением пакета программ BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)) с применением идентифицированных выше установленных по умолчанию параметров для сравнения белков и нуклеиновых кислот соответственно.
В контексте настоящего описания термин расположенный выше относится к направлению к 5'концу. Для энхансерных и промоторных последовательностей в данной заявке приведены одноцепочечные последовательности, и если энхансер расположен выше промотора, это означает, что энхансер расположен в 5'-направлении от промотора. Аналогично, термин расположенный ниже относится к на
- 3 045729 правлению к З'-концу.
В контексте настоящего описания термин спейсерная последовательность относится к нуклеиновой кислоте переменной длины, которая используется для соединения энхансера и промотора с целью получения одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. Иллюстративными вариантами осуществления линкеров, пригодных для реализации настоящего изобретения на практике, являются цепи олигонуклеиновой кислоты, состоящие из 1-1000 нуклеиновых кислот.
Специфичность в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки (cOBC), в эксплантатах сетчатки человека измеряется с применением следующего протокола.
Во-первых, промотор объединяется с репортерным трансгеном mCitrine и упаковывается в самокомплементарный (sc) вектор scAAV2(7m8) на основе AAV (Dalkara et al. Sci Transl Med 2013. 5: p. 189ra76). Примерно 1010 vg (векторных геномов) добавляют к стороне RGC культивируемых посмертных эксплантатов сетчатки человека в день 0, как подробно описано в (van Wyk et al. Front Neurosci 2017. 11: p.161). Сетчатки фиксируются в день 7 культивирования с помощью 4% PFA и затем подвергаются криозащите (10/20/30% сахарозы в PBS) и замораживаются. Криосрезы сетчатки три раза обрабатываются антителами к трансгену mCitrine (Invitrogen, A11122, 1:500), антителами к повсеместно встречающемуся маркеру OBC Gao (EMD, MAB3073, 1:750) и специфическим в отношении RBC антителом к PKCa (Santa Cruz, sc8393, 1:750). Экспрессирующие RBC идентифицируются как [mCitrine(+), PKCa(+)], тогда как клетки [mCitrine(+), PKCa(-), Gao(+)] идентифицируются как экспрессирующие cOBC. Специфичность типа cOBC определяется по соотношению экспрессирующих cOBC и всех экспрессирующих ОВС: [.N(mCitrinc(+),PKCa(-),Cao(+)}. .
N[mCitrme(+),Gao(+)} ' ’ где N представляет собой количество клеток с характеристиками окрашивания, указанными в скобках.
Предпочтительность в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки, затем определяется следующим образом.
Количество RBC и cOBC неодинаково и варьируется в разных областях сетчатки. Эксплантаты получают из средней части и периферии сетчатки, где соотношение RBC и cOBC
N{PKCa(+)} LN{PKCa(-),Gao(+)}J k ’ является примерно постоянным на небольшом участке эксплантата. Следовательно, соотношение экспрессирующих cOBC и экспрессирующих RBC
I|-N[mCitrine(-),PKCa(-),Gao(+)}. ,., N(mCitrine(—),PKCa(+),Gao(+)} 1 можно считать постоянным и в эксплантате. Это позволяет рассчитать коэффициент предпочтительности cOBC по сравнению с RBC
N{PKCa(+)} * N{mCitrine(+),PKCa(-),Gao(+))
X —---------------------------------------------------(J)
N{PKCa( —),Gao(+)} * N{mCitrine(+),PKCa(+],Gao(+)} ' '' что позволяет определить специфическое распределение cOBC и RBC в эксплантате посредством умножения (3) на (4). Затем предпочтительность cOBC в процентах рассчитывается с помощью юо%« , „ --------(6)
1+Х
Используемый в данном документе термин осуществление лечения или лечение любого заболевания или нарушения (например, потери зрения) относится в одном варианте осуществления к снижению степени тяжести заболевания или нарушения (например, к замедлению, или остановке, или снижению развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте осуществления осуществление лечения или лечение относятся к облегчению или снижению степени тяжести по меньшей мере одного физического параметра, включая параметры, которые могут быть неявными для пациента. В еще одном варианте осуществления осуществление лечения или лечение относятся к модулированию заболевания или нарушения либо физически (например, стабилизации явного симптома), либо физиологически (например, стабилизации физического параметра), либо к им обоим. В еще одном варианте осуществления осуществление лечения или лечение относятся к введению экзогенной терапевтической функции в клетки определенного типа. Способы оценки лечения и/или предупреждения заболевания, как правило, известны из уровня техники, если только они специально не опи саны в данном документе ниже.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении раскрыты энхансерные промоторные последовательности человеческого гена GRM6 с повышенной специфичностью в отношении OBC и значительно усиленной индуцируемой в cOBC экспрессией белка по сравнению с 200En-mGluR500P в посмертной сетчатке мыши и человека. Промоторы, описанные в данном документе, состоят из промотора гена модифицированного метаботропного глутаматного рецептора 6 (mGluR6), который содержит последовательности из регуляторных элементов, которые направляют экспрессию белка mGluR6 в OBC, в частности RBC и cOBC. Настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты или вектору экспрессии нуклеино
- 4 045729 вой кислоты, содержащим энхансер гена mGluR6 или его вариант и промотор гена mGluR6 или его вариант. Эта новая энхансерная промоторная последовательность из гена GRM6 впервые обеспечивает эффективную экспрессию трансгена в cOBC сетчатки человека, в частности в парафовеа человека. Кроме того, новые энхансерные промоторные последовательности из человеческого гена GRM6 в комбинации с оптогеном (MWOPN_mGluR6, SEQ ID NO: 16) приводили к широкому распространению OBCспецифической экспрессии в дегенерирующей мышиной (rd1, C3HHe/OuJ) сетчатке и восстановлению функционального зрения (оптомоторный ответ) у в ином случае слепых мышей с дегенерацией фоторецепторов. Новый энхансер/промотор человеческого гена GRM6 продемонстрировал высокоэффективное, обширное и специфическое нацеливание на OBC в сетчатке мыши и человека.
Первый аспект настоящего изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей:
a) элемент энхансерной последовательности, выбранный из SEQ ID NO 1-6, и
b) элемент промоторной последовательности, выбранный из SEQ ID NO 7-10.
Альтернатива первому аспекту настоящего изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты длиной от 850 пар оснований (п.о.) до 1500 п.о., содержащей:
a) элемент энхансерной последовательности, выбранный из SEQ ID NO 1-6, и элемент промоторной последовательности, выбранный из SEQ ID NO 7-10.
Другая альтернатива первому аспекту настоящего изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей:
a) элемент энхансерной последовательности, который на 70% или больше, в частности на 75% или больше, более конкретно на 80% или больше, более конкретно на 85% или больше, более конкретно на 90% или больше, более конкретно на 95% или больше, еще более конкретно на 98% или больше, наиболее конкретно на 100% идентичен последовательности, выбранной из SEQ ID NO 1 и 2, и
b) элемент промоторной последовательности, который на 70% или больше, в частности на 75% или больше, более конкретно на 80% или больше, более конкретно на 85% или больше, более конкретно на 90% или больше, более конкретно на 95% или больше, еще более конкретно на 98% или больше, наиболее конкретно на 100% идентичен последовательности под SEQ ID NO 7, и при этом указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты характеризуется специфичностью к ON-биполярным клеткам, представляющим собой колбочки, составляющей 40% или больше, в частности 50% или больше, более конкретно 60% или больше, еще более конкретно 70% или больше, более конкретно 80% или больше, еще более конкретно 90% или больше, наиболее конкретно 100%, характерной для последовательности под SEQ ID NO 13, и предпочтительностью в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки, составляющей 20% или больше, в частности 25% или больше, более конкретно 30% или больше, еще более конкретно 35% или больше, более конкретно 40% или больше, наиболее конкретно 50% или больше.
Другая альтернатива первому аспекту настоящего изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты длиной от 850 пар оснований (п.о.) до 1500 п.о., содержащей:
a) элемент энхансерной последовательности, который на 70% или больше, в частности на 75% или больше, более конкретно на 80% или больше, более конкретно на 85% или больше, более конкретно на 90% или больше, более конкретно на 95% или больше, еще более конкретно на 98% или больше, наиболее конкретно на 100% идентичен последовательности, выбранной из SEQ ID NO 1 и 2, и
b) элемент промоторной последовательности, который на 70% или больше, в частности на 75% или больше, более конкретно на 80% или больше, более конкретно на 85% или больше, более конкретно на 90% или больше, более конкретно на 95% или больше, еще более конкретно на 98% или больше, наиболее конкретно на 100% идентичен последовательности под SEQ ID NO 7, и при этом указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты характеризуется специфичностью к ON-биполярным клеткам, представляющим собой колбочки, составляющей 40% или больше, в частности 50% или больше, более конкретно 60% или больше, еще более конкретно 70% или больше, более конкретно 80% или больше, еще более конкретно 90% или больше, наиболее конкретно 100%, характерной для последовательности под SEQ ID NO 13, и предпочтительностью в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки, составляющей 20% или больше, в частности 25% или больше, более конкретно 30% или больше, еще более конкретно 35% или больше, более конкретно 40% или больше, наиболее конкретно 50% или больше.
Специфичность в отношении cOBC и уровень экспрессии в cOBC измеряются, как описано выше.
Авторы настоящего изобретения показали, что комбинация SEQ ID NO 1 или 2 с SEQ ID NO 7 приводит к высокой специфичности в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки, и к высокому уровню экспрессии в ON-биполярных клетках, представляющих собой колбочки. Специалист в данной области техники способен найти сходные последовательности с эквивалентной специфичностью в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки, и уровнем экспрессии в ON-биполярных клетках, представляющих собой колбочки, на основе раскрытия настоящего изобретения.
В определенных вариантах осуществления элемент энхансерной последовательности расположен
- 5 045729 выше элемента промоторной последовательности.
В определенных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит спейсерную последовательность длиной 1-1000 пар оснований, в частности 1-394 пар оснований. В определенных вариантах осуществления спейсер расположен между энхансером и промотором. В определенных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит спейсерную последовательность длиной 1-1000 пар оснований, в частности 1-394 пар оснований, и спейсер расположен между энхансером и промотором.
В определенных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO 11 - SEQ ID NO 15.
В определенных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность под SEQ ID NO 11 или под SEQ ID NO 13.
Второй аспект настоящего изобретения относится к вектору экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту.
В определенных вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой вирусный геном.
В определенных вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса или рекомбинантный вектор на основе аденоассоциированного вируса (rAAV).
В определенных вариантах осуществления вектор на основе AAV представляет собой либо одноцепочечный вектор (ssAAV), либо самокомплементарный вектор (scAAV).
В определенных вариантах осуществления вектор представляет собой рекомбинантный вектор на основе AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 или AAV12. В определенных вариантах осуществления вектор представляет собой рекомбинантный вектор на основе AAV2.
В определенных вариантах осуществления вектор экспрессии нуклеиновой кислоты дополнительно содержит:
а) последовательность, кодирующую капсидный белок, и
b) трансген.
От 5'-конца к 3'-концу выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит в первую очередь энхансер, затем необязательно спейсер и затем промотор. Трансген расположен в 3'-направлении от промотора. В определенных вариантах осуществления трансгену предшествует оптимизированная последовательность КОЗАК.
Последовательность Козак содержит консенсус (gcc)gccAccAUGG (SEQ ID NO 24) или (gcc)gccGccAUGG (SEQ ID NO 25) и важна для инициации трансляции.
В определенных вариантах осуществления вектор экспрессии нуклеиновой кислоты также содержит регуляторную последовательность WPRE (посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков). WPRE представляет собой последовательность ДНК, которая при транскрипции создает третичную структуру, усиливающую экспрессию. В определенных вариантах осуществления вектор экспрессии нуклеиновой кислоты также содержит поли(А)-хвост, встроенный ниже трансгена. Поли(А)хвост способствует трансляции трансгена.
В определенных вариантах осуществления капсидный белок представляет собой AAV2, AAV2(7m8) или AAV8(BP2).
Третий аспект настоящего изобретения относится к трансгену, управляемому промотором.
В определенных вариантах осуществления трансген представляет собой NYX, GRM6, GPR179 или TRPM1 для восстановления светочувствительности или зрения при врожденной стационарной ночной слепоте.
В определенных вариантах осуществления трансген содержит последовательность под SEQ ID NO 16 или существенным образом состоит из нее.
В определенных вариантах осуществления трансген представляет собой ген опсина, восстанавливающий восприятие света или зрение.
В определенных вариантах осуществления ген опсина выбран из группы, состоящей из канального родопсина, меланопсина, родопсина, опсинов колбочек, пинеального опсина, фотопсинов, галородопсина, бактериородопсина, протеородопсина, опсина медузы, опсина паука-скакуна или любого их функционального варианта или фрагмента.
В определенных вариантах осуществления ген опсина представляет собой химерный белок, полученный из опсина и метаботропного глутаматного рецептора mGluR6 из OBC сетчатки.
В определенных вариантах осуществления химерный белок представляет собой Opto-mGluR6.
В определенных вариантах осуществления химерный белок представляет собой мышиный или человеческий MWOPN_mGluR6 (SEQ ID NO: 16).
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к вирионной частице аденоассоциированного вируса, содержащей выделенную молекулу нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту или вектор экспрессии нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту.
Пятый аспект настоящего изобретения относится к средству, выбранному из выделенной молекулы нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту или вектора экспрессии нуклеиновой кислоты согласно
- 6 045729 второму аспекту и вирионной частицы аденоассоциированного вируса согласно третьему и четвертому аспектам, для применения в качестве лекарственного препарата.
Дополнительный аспект относится к средству, выбранному из выделенной молекулы нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, вектора экспрессии нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту, трансгена согласно третьему аспекту и вирионной частицы аденоассоциированного вируса согласно четвертому аспекту для применения в лечении состояния, поражающего биполярную клетку сетчатки.
Дополнительный аспект относится к средству, выбранному из выделенной молекулы нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, вектора экспрессии нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту, трансгена согласно третьему аспекту и вирионной частицы аденоассоциированного вируса согласно четвертому аспекту, для применения в лечении врожденной стационарной ночной слепоты или палочкоколбочковых и колбочко-палочковой дистрофий, в частности пигментного ретинита и макулярной дегенерации.
Дополнительный аспект относится к средству, выбранному из выделенной молекулы нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту, вектора экспрессии нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту, трансгена согласно третьему аспекту и вирионной частицы аденоассоциированного вируса согласно четвертому аспекту, где средство вводится посредством:
a) интравитреального введения, в частности посредством интравитреальной инъекции, или посредством
b) субретинальной инъекции.
Дополнительный аспект относится к способу лечения, при котором средство по настоящему изобретению вводят нуждающемуся в этом пациенту.
Там, где альтернативы отдельных разделяемых признаков, таких как, например, промоторная последовательность или медицинское показание, представлены в данном документе как варианты осуществления, следует понимать, что такие альтернативы можно свободно комбинировать для получения отдельных вариантов осуществления раскрытого в данном документе настоящего изобретения. Таким образом, любой из альтернативных вариантов осуществления промоторной последовательности можно комбинировать с любым медицинским показанием, подвергающим риску функцию OBC, и любой средой-носителем для доставки ДНК или способом доставки ДНК, включая альтернативные вирусы, наночастицы, липосомы или доставку голой ДНК с применением, например, генной пушки или электропорации.
Неограничивающий перечень заболеваний сетчатки, при которых могут принести пользу описанные в данном документе способы, включает врожденную ночную слепоту, макулярную дегенерацию, возрастную макулярную дегенерацию, врожденные колбочковые дистрофии и большую группу нарушений, связанных с пигментным ретинитом (RP).
Абзацы.
1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты длиной от 850 пар оснований (п.о.) до 1500 п.о., содержащая:
a) элемент энхансерной последовательности, выбранный из SEQ ID NO 1-6, и
b) элемент промоторной последовательности, выбранный из SEQ ID NO 7-10.
2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты длиной от 850 пар оснований (п.о.) до 1500 п.о., содержащая:
a) элемент энхансерной последовательности, который на по меньшей мере 70% (или больше), в частности на 75% или больше, на 80% или больше, более конкретно на 85% или больше, более конкретно на 90% или больше, более конкретно на 95% или больше, еще более конкретно на 98% или больше, наиболее конкретно на 100% идентичен последовательности, выбранной из SEQ ID NO 1 и 2, и
b) элемент промоторной последовательности, который на 70% или больше, в частности на 75% или больше, более конкретно на 80% или больше, более конкретно на 85% или больше, более конкретно на 90% или больше, более конкретно на 95% или больше, еще более конкретно на 98% или больше, наиболее конкретно на 100% идентичен последовательности под SEQ ID NO 7, и при этом указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты характеризуется специфичностью к ON-биполярным клеткам, представляющим собой колбочки, составляющей 40% или больше, в частности 50% или больше, более конкретно 60% или больше, еще более конкретно 70% или больше, более конкретно 80% или больше, еще более конкретно 90% или больше, наиболее конкретно 100%, характерной для последовательности под SEQ ID NO 13, и предпочтительностью в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки, составляющей 20% или больше, в частности 25% или больше, более конкретно 30% или больше, еще более конкретно 35% или больше, более конкретно 40% или больше, наиболее конкретно 50% или больше.
3. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно абзацу 1 или абзацу 2, где выделенная молекула состоит из одного и только одного из указанных элементов энхансерной последовательности, одного и только одного из указанных элементов промоторной последовательности и необязательно спейсера, отделяющего элемент энхансерной последовательности от элемента промоторной последовательности.
- 7 045729
4. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно любому из предыдущих абзацев, содержащая последовательность, выбранную из SEQ ID NO 11 - SEQ ID NO 15, или состоящая из нее, или содержащая последовательность, характеризующуюся 98% или большей идентичностью с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 11 - SEQ ID NO 15, или состоящая из нее.
5. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно любому из предыдущих абзацев, содержащая последовательность под SEQ ID NO 11 или под SEQ ID NO 13 или состоящая из нее, или содержащая последовательность, характеризующуюся 98% или большей идентичностью с SEQ ID NO 11 или SEQ ID NO 13, или состоящая из нее, в частности содержащая последовательность под SEQ ID NO 13 или состоящая из нее, или содержащая последовательность, характеризующуюся 98% или большей идентичностью с SEQ ID NO 13, или состоящая из нее.
6. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из предыдущих абзацев.
7. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты согласно абзацу 6, где вектор экспрессии нуклеиновой кислоты представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса или рекомбинантный вектор на основе аденоассоциированного вируса (rAAV), в частности где вектор экспрессии нуклеиновой кислоты представляет собой рекомбинантный вектор на основе AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 или AAV12, более конкретно где вектор экспрессии нуклеиновой кислоты представляет собой рекомбинантный вектор на основе AAV2.
8. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты согласно любому из абзацев 6-7, дополнительно содержащий:
а) последовательность, кодирующую капсидный белок, и
b) трансген.
9. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты согласно абзацу 8, где трансген содержит последовательность под SEQ ID NO 16.
10. Вирионная частица аденоассоциированного вируса, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты согласно любому из абзацев 1-5 или вектор экспрессии нуклеиновой кислоты согласно любому из абзацев 6-9.
11. Средство, выбранное из выделенной молекулы нуклеиновой кислоты согласно любому из абзацев 1-5 или вектора экспрессии нуклеиновой кислоты согласно любому из абзацев 6-9 и вирионной частицы аденоассоциированного вируса согласно абзацу 10, для применения в качестве лекарственного препарата.
12. Средство, выбранное из выделенной молекулы нуклеиновой кислоты согласно любому из абзацев 1-5, вектора экспрессии нуклеиновой кислоты согласно любому из абзацев 6-9 и вирионной частицы аденоассоциированного вируса согласно абзацу 10 для применения в лечении состояния, поражающего биполярную клетку сетчатки, в частности в лечении врожденной стационарной ночной слепоты (CSBN1) или палочко-колбочковой и колбочко-палочковой дистрофий, более конкретно пигментного ретинита и макулярной дегенерации.
13. Средство, выбранное из выделенной молекулы нуклеиновой кислоты согласно любому из абзацев 1-5, вектора экспрессии нуклеиновой кислоты согласно любому из абзацев 6-9 и вирионной частицы аденоассоциированного вируса согласно абзацу 10, где средство вводится посредством:
a) интравитреального введения, в частности посредством интравитреальной инъекции, или посредством
b) субретинальной инъекции.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами и графическими материалами, из которых можно извлечь дополнительные варианты осуществления и преимущества. Эти примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, но не для ограничения его объема.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Вид последовательностей человеческого гена GRM6, выбранных для конструирования промотора, в геномном браузере. (A) Дистальная энхансерная область гена GRM6 человека (расположена на расстоянии примерно - 14 т.п.о. относительно сайта начала трансляции (TLSS)), указывающая на три выбранных энхансерных элемента, включая консервативную область размером 310 п.о. между мышиным геном Grm6 и человеческим геном GRM6 (заштрихована горизонтальными линиями), а также синтетическая область размером 188 п.о., соответствующая участку 200En(Grm6) в мышиной модели согласно Kim (часть, которая заштрихована горизонтальными линиями и затемнена). (B) Промоторная последовательность человеческого гена GRM6, включая сайт начала транскрипции (TSS) и сайт начала трансляции (TLSS), последний определен авторами настоящего изобретения как положение 0. Два выбранных промотора также указаны, и консервативная область размером 167 п.о. между мышиным и человеческим генами показана в виде части, заштрихованной горизонтальными линиями. Графики были загружены из геномного браузера UCSC по адресу https://genome.ucsc.edu/ и изменены. Отрезки, показанные серым цветом, иллюстрируют потенциально важные цис-регуляторные области, включая сайты связывания факторов транскрипции, межвидовые консервативные области (области, консервативные у позвоночных)
- 8 045729 и кластеры с гиперчувствительностью к ДНКазе (кластеры с сайтами распознавания ДНКазы). Кроме того, также рассматривались сигнальный пик метки H3K27Ac и пики Chip-seq.
Фиг. 2. Интенсивность экспрессии mCitrine, управляемой промотором, в OBC из посмертных эксплантатов сетчатки человека. Эксплантаты сетчатки человека трансдуцировали с помощью scAAV2(7m8)-407En_566P(hGRM6)-mCitrine (n равняется 3), scAAV2(7m8)-444En_454P(hGRM6)mCitrine (n равняется 3), scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine (n равняется 5), scAAV2(7m8)407En_454P(hGRM6)-mCitrine (n равняется 3) и scAAV(7m8)-200En-mGluR500P-mCitrine (n равняется 4). mCitrine был иммуногистохимически помечен, и интенсивность флуоресценции в экспрессирующих ONбиполярных клетках определяли как меру интенсивности экспрессии трансгена. Промоторный элемент 566P опосредовал гораздо более слабую экспрессию mCitrine в OBC по сравнению с комбинациями промоторов с проксимальным элементом 454P. Поэтому для всех последующих экспериментов был выбран 454P. 770En_454P(hGRM6) (F равняется 5,42 ± 0,9; среднее значение ± s.d.) и 444En_454P(hGRM6) (F равняется 5,59 ± 0,51; среднее значение ± s.d.) проявляли одинаковую эффективность в отношении интенсивности экспрессии трансгена и значительно более высокую эффективность, чем 200En-mGluR500P, полученный из мышиного генома (F равняется 3,94 ± 0,45; среднее значение ± s.d.). * означает, что P равняется 0,05 или меньше, ** означает, что P равняется 0,01 или меньше, *** означает, что P равняется 0,001 или меньше, и n.s. означает незначимые различия (однофакторный ANOVA с критерием значимости Тьюки).
Фиг. 3. Специфичность промотора в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки (cOBC), в эксплантатах сетчатки человека. Эксплантаты сетчатки человека трансдуцировали с помощью scAAV2(7m8)-444En_454P(hGRM6)-mCitrine, scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine, scAAV2(7m8)-407En_454P(hGRM6)-mCitrine или scAAV(7m8)-200En-mGluR500P-mCitrine. Вертикальные криосрезы метили антителом к mCitrine, PKCa (для биполярных клеток, представляющих собой палочки (RBC) и антителом к Ga0 (повсеместно встречающемуся маркеру OBC) и осуществляли подсчет клеток, экспрессирующих mCitrine. (A) Исходя из подсчета клеток, 770En_454P(hGRM6) вызывал экспрессию в значительно большем количестве cOBC, чем 200En-mGluR500P. (B) Нормализация количества целевых cOBC и RBC к их общему количеству в пределах определенных областей сетчатки, в которых были проведены подсчеты, демонстрирует, что 770En_454P(hGRM6) и 407En_454P(hGRM6) намного более эффективно управляют экспрессией в cOBC, чем 200En-mGluR500P, который характеризуется явной предпочтительностью в отношении RBC. 770En_454P(hGRM6) даже демонстрирует одинаковую предпочтительность в отношении cOBC и RBC, составляющую 50% для каждых из них, что является важным отличительным признаком фовеального средства генной терапии, где существуют только cOBC. (C) Предпочтительность промотора 444En_454P(hGRM6) в отношении типа cOBC (n равняется 5) существенно не отличалась от предпочтительности промотора 770En_454P(hGRM6). Показаны средние значения ± s.d., * означает, что P равняется 0,05 или меньше, ** означает, что P равняется 0,01 или меньше (однофакторный ANOVA с критерием значимости Тьюки). Указаны только значимые различия.
Фиг. 4. Эффективность и специфичность экспрессии mCitrine в OBC, управляемой с помощью 770En_454P(hGRM6), в эксплантатах сетчатки человека (A) Сравнение экспрессии mCitrine, управляемой с помощью 770En_454P(hGRM6), с экспрессией mCitrine, управляемой с помощью 200En-mGluR500P, при упаковке в scAAV2(7m8). 770En_454P(hGRM6) демонстрирует гораздо более высокую предпочтительность в отношении OBC по сравнению с 200En-mGluR500P, и последний, кроме того, характеризуется значительно более высокой нецелевой экспрессией в амакриновых клетках. Показаны % экспрессирующих клеток определенного типа клеток в виде средних значений ± s.d., ** означает, что P равняется 0,01 или меньше, и *** означает, что P равняется 0,001 или меньше (Т-критерий Стьюдента).
Фиг. 5. Промотор 770En_454P(hGRM6) надежно и широко управляет экспрессией трансгена в дегенерирующей сетчатке мыши rd1. Мышам rd1 путем инъекции вводили 3x109 vg AAV, несущего трансген MWOPN_mGluR6_IRES2_TurboFP635 (SEQ ID NO: 16, плазмидная карта (фиг. 9), в возрасте 22 недель. На схемах A-D серым цветом представлены трансдуцированные участки сетчатки в тотальных препаратах сетчатки. А) ssAAV2(7m8) в комбинации с 200En-mGluR500P также экспрессируется в сетчатке rd1, но только в ограниченных участках (в отличие от 4xGrm6-SV40). B) ssAAV(7m8) в комбинации с 770En_454P(hGRM6) приводит к более обширной и распространенной трансдукции дегенерирующей сетчатки по сравнению с 200En-mGluR500P, вероятно вследствие повышенной интенсивности экспрессии, которая преодолевает порог экспрессии, если имеет место подавление Grm6, вызванное дегенерацией. C) Пример микрофотографии тотального препарата обработанной сетчатки мыши rd1, подвергающейся OKR-тестированию, полученной посредством лазерной сканирующей микроскопии (см. пример 7 и фиг. 6), где TurboFP635 был помечен иммуноцитохимически (изображено на схеме B). (D) Средняя специфичность (% экспрессирующих OBC от всех экспрессирующих клеток, 66,6 ± 8,5%) и эффективность экспрессии (% экспрессирующих OBC от всех OBC, 54,7 ± 8,3) в дегенерирующей сетчатке rd1. Среднее значение ± s.d., N равняется 9 (Т-критерий Стьюдента).
Фиг. 6. Восстановление зрения, определенное по оптомоторному рефлексу, у мышей rd1 с полным отсутствием фоторецепторов, которые были интравитреально и билатерально обработаны с помощью
- 9 045729 ssAAV(7m8)-MWOPN_mGluR6_IRES2_TurboFP635 в возрасте 22 недель. Остроту зрения измеряли через 41, 47, 55, 82 и 112 дней после трансдукции посредством определения порога пространственных частот, при котором оптокинетический ответ все еще вызывался в виртуальной оптомоторной системе. Обработанные мыши (N равняется 3) продемонстрировали значительное повышение остроты зрения по сравнению с контрольными однопометниками rd1, которым не вводили вектор (N равняется 7), но все еще характеризовались значительно более низкой остротой зрения, чем контрольные мыши дикого типа (C57BL/6J, N равняется 10). Показано среднее значение (по всем испытаниям и особям) ± s.d., ** означает, что P равняется 0,01 или меньше, и *** означает, что P равняется 0,001 или меньше (Т-критерий Стьюдента).
Фиг. 7. Высокоэффективная экспрессия mCitrine в cOBC эксплантированной макулы человека под контролем промотора 770En_454P(hGRM6). Пример эксплантата макулы человека, трансдуцированного с помощью scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine и иммуногистохимически помеченного антителом к трансгену mCitrine, а также антителом к OBC (Gao) и красителем, окрашивающим ядра клеток (DAPI). (A) представляет собой схему макулы человека и участков, где были сделаны микрофотографии, изображенные на фигурах B и C. Фовеола содержит только фоторецепторы M- и L-колбочек и не содержит ни OBC, ни RGC, поскольку их клеточные тела вытеснены в сторону, чтобы свет мог проходить без дифракции к фоторецепторам. Фовеа содержит только колбочки (M, L и S) и является участком наибольшей остроты зрения с системой карликовых клеток, где каждая колбочка соединяется с одной BPC и одной RGC. На фигуре (B) показан срез через парафовеа с DAPI (верхняя микрофотография), демонстрирующий четкое наслоение фоторецепторов (ONL), BPC и амакриновых клеток (INL), а также 3-мерное наслоение RGC (GCL), указывающее на макулу. На нижней микрофотографии показано только мечение с применением трансгена, указывающее на экспрессию mCitrine исключительно в INL, где расположены OBC. На фигуре (C) показан срез через фовеа. На микрофотографии слева показано только мечение Gao в клетках OBC, все из которых не помечены антителом к PKC (не показано) и поэтому четко идентифицируются как cOBC. На правой микрофотографии дополнительно изображено мечение с помощью mCitrine в цитоплазме, что указывает на то, что практически каждая cOBC из фовеа экспрессирует mCitrine (показано стрелками). Это очень четкое доказательство того, что 770En_454P(hGRM6) обеспечивает превосходную экспрессию в cOBC, в частности в cOBC макулы человека, и, следовательно, хорошо подходит для восстановления остроты зрения у пациентов-людей.
Фиг. 8. Плазмидная карта плазмиды AAV, кодирующей опсин колбочек и химерный оптогенетический белок mGluR6, MWOPN_mGluR6-IRES2-TurboFP635, под контролем нового промотора 770En_454P(hGRM6). TurboFP635 представляет собой маркер, представляющий собой красный флуоресцентный белок, для идентификации экспрессии, WPRE и BGHpA представляют собой регуляторные последовательности, и 5'- и 3'-ITR (внутренние повторы) представляют собой области, используемые AAV для упаковки трансгена (между ITR) в капсид. Данную плазмиду использовали для трансдукции дегенерирующих сетчаток мышей rd1 (фигуры и примеры 5 и 6). Также приведены праймеры для слияния для клонирования.
Фиг. 9 Пример специфичности экспрессии в OBC и эффективности 770En_454P(hGRM6) и 444En_454P(hGRM6), управляющих экспрессией mCitrine в эксплантатах сетчатки человека. Вертикальные криосрезы через эксплантаты сетчатки человека, трансдуцированные с помощью scAAV2(7m8)770En_454P(hGRM6)-mCitrine (A) и scAAV2(7m8)-444En_454P(hGRM6)-mCitrine (B) соответственно. Криосрезы были помечены ядерным красителем DAPI (серый цвет, показан только в дальнем левом углу микрофотографий для ориентации) и маркером, представляющим собой трансген mCitrine (белый цвет). 770En_454P(hGRM6) характеризуется эффективностью в отношении OBC (процент светлых клеток в INL), составляющей 85,2% ± 12,3% (n равняется 4), и 444En_454P(hGRM6) характеризуется эффективностью, составляющей 87,9% ± 6,5% (n равняется 5). ONL: наружный ядерный слой, INL: внутренний ядерный слой, GCL: слой ганглиозных клеток. Биполярные клетки расположены на периферии INL.
Примеры
Пример 1. Анализ изменений экспрессии гена Grm6 в мышиной модели rd1.
Авторы настоящего изобретения выбрали ген (Grm6 у мыши и GRM6 у человека), кодирующий метаботропный глутаматный рецептор 6 (mGluR6), селективно экспрессируемый в ON-биполярных клетках (OBC) сетчатки, в качестве матрицы для конструирования промотора. Это произошло потому, что экспрессия mGluR6 является селективной в отношении OBC, что недавно было подтверждено посредством транскриптомных анализов одной клетки сетчатки взрослой мыши (Siegert et al. Nat Neurosci 2012. 15: p. 487-95), и также явно проявляется в линии трансгенных мышей, ранее созданной авторами настоящего изобретения, где полноразмерный промотор гена Grm6 управляет экспрессией трансгена, в частности в OBC сетчатки (van Wyk et al., PloS Biol 2015. 13: p. e1002143). Кроме того, были успешно сконструированы короткие варианты промотора, полученные из мышиного гена Grm6, и было показано, что они обеспечивают предпочтительную экспрессию в OBC (Cronin et al., EMBO Mol Med, 2014. 6(9): p. 11751190; Kim et al. J Neurosci 2008. 28: p. 7748-7764; Lagali et al. Nat Neurosci 2008. 11 p: 667-675). Kim et al. первоначально выбрали дистальную энхансерную последовательность размером 200 п.о. в промоторе
- 10 045729 мышиного гена Grm6, которая усиливала OBC-специфическую экспрессию в сетчатке мышей дикого типа. Эта энхансерная последовательность впоследствии использовалась в промоторе 4xGRM6-SV40 [Cronin, T., et al., EMBO Mol Med, 2014. 6(9): p. 1175-1190], который содержит четыре эти энхансерные последовательности размером 200 п.о. в тандеме. Однако недавно авторы настоящего изобретения показали, что промотор 4xGRM6-SV40 [Cronin, T., et al., EMBO Mol Med, 2014. 6(9): p. 1175-1190] был полностью подавлен в дегенерирующей сетчатке мыши rd1 (C3H/HeOu), даже когда генная терапия проводилась в возрасте 3,5 недель до полной дегенерации фоторецепторов (van Wyk et al. Front Neurosci 2017. 11: p. 161). Это делает 4xGRM6-SV40 (и в равной степени GRM6-SV40) непригодным для лечения дегенерирующей сетчатки. Кроме того, базальный вирусный промотор SV40 сталкивается с такими проблемами, как сайленсинг при постоянной активации и сверхэкспрессия белка, приводящая к клеточной цитотоксичности. Чтобы сконструировать более подходящие OBC-специфические промоторы, авторы настоящего изобретения сначала исследовали, остается ли экспрессия Grm6 повышенной в ходе процесса дегенерации в мышиной модели дегенерации rd1. Авторы настоящего изобретения использовали мышиную модель rd1 на том основании, что промоторы, активные в данной модели тяжелой и быстрой дегенерации, вероятно, будут активны при большинстве менее тяжелых дегенеративных заболеваний сетчатки. Ранее это было продемонстрировано авторами настоящего изобретения, сравнивающими экспрессию трансгена в мышиной модели rd10 с более медленной дегенерацией (B6.CXB1-Pde6brd10), где 4xGRM6SV40 все еще был способен управлять некоторой экспрессией [van Wyk, M., et al., Front Neurosci, 2017. 11(161): p. 161.]. Авторы настоящего изобретения проводили количественную оценку экспрессии гена Grm6 в сетчатках мышей rd1 посредством количественной ПЦР в режиме реального времени во временных точках P14, P21, P28 и P54 и сравнивали уровни экспрессии с уровнями экспрессии в сетчатках мышей C57BL/6J дикого типа. Для нормализации уровней экспрессии использовали экспрессию рибосомного белка L8 (Rpl8). Экспрессия Grm6 оставалась постоянной в ходе дегенерации (P равняется 0,8795), за исключением небольшого подавления (в 0,59 раза) между P21 и P28. Из этого авторы настоящего изобретения сделали вывод, что серьезное подавление, наблюдаемое в случае промотора 4xGRM6-SV40 [van Wyk, M., et al., Front Neurosci, 2017. 11(161): p. 161.], вероятно не было связано с подавлением энхансерных элементов Grm6, а вероятно было следствием пониженной функциональности базального промотора SV40 с прогрессирующей дегенерацией. Следовательно, ген Grm6 был использован авторами настоящего изобретения в качестве матрицы для конструирования OBC-специфического промотора.
Пример 2. Конструирование промоторов на основе GRM6.
Для согласования с механизмом транскрипции человека в свете будущего применения в терапии человека авторы настоящего изобретения использовали в качестве матрицы последовательность человеческого гена GRM6, а не последовательность мышиного гена Grm6.
Авторы настоящего изобретения использовали Основной инструмент для поиска локального выравнивания (BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), оптимизированный для частично сходных последовательностей (blastn) [Altschul et al., J Mol Biol, 1990. 215(3): p. 403-10; Coordinators, Nucleic Acids Res, 2018. 46(D1): p. D8-D13], для выравнивания последовательностей мышиного гена Grm6 и человеческого гена GRM6. Для определения характеристик энхансера авторы настоящего изобретения выравнивали 1500 п.о. слева и справа от мышиной энхансерной последовательности 200En, идентифицированной Kim et al. [Kim et al., J Neurosci, 2008. 28(31): p. 7748-64.]. Авторы настоящего изобретения обнаружили консервативную последовательность длиной 310 п.о. между геномами мыши и человека [от -13819 до 13510 отн. сайта начала трансляции (TLSS) из гена GRM6], выходящую за пределы последовательности 200En, определенной Kim et al. как в 3', так и в 5'-направлении (фиг. 1А, участки, заштрихованные горизонтальными полосами). Чтобы идентифицировать промоторные последовательности, авторы настоящего изобретения сосредоточились на последовательностях гена GRM6, расположенных в 5'-направлении от сайта начала трансляции (TLSS, определен авторами настоящего изобретения как положение 0) (фиг. 1B). После выравнивания авторы настоящего изобретения использовали геномный браузер Института геномики Калифорнийского университета в Санта-Круз (геномный браузер UCSC) [Church et al., PloS Biol, 2011. 9(7): p. e1001091.], [Kent et al., Genome Res, 2002. 12(6): p. 996-1006.; Kuhn et al. Brief Bioinform, 2013. 14(2): p. 144-61.] [https://genome.ucsc.edu/; сборка генома, февраль 2009 г. (GRCh37/hg19] для идентификации потенциальных регуляторных последовательностей гена GRM6, таких как межвидовые консервативные последовательности, области с активным хроматином (кластеры с гиперчувствительностью к ДНКазе или фрагменты метки H3K27Ac) или сайты связывания факторов транскрипции. Базу данных регуляции транскрипции генов (GTRD) [Yevshin et al., Nucleic Acids Res, 2017. 45(D1): p. D61-D67] дополнительно использовали для идентификации пиков иммунопреципитации хроматина и секвенирования ДНК (ChIP-seq), обеспечивая экспериментальное подтверждение сайтов связывания факторов транскрипции. В совокупности данная информация позволила авторам настоящего изобретения определить последовательности в идентифицированных выше областях с вероятной функциональной важностью в отношении экспрессии гена GRM6.
Затем авторы настоящего изобретения выбрали три возможные энхансерные области [407En(hGRM6), 444En(hGRM6) и 770En(hGRM6)] и две возможные промоторные области [566P(hGRM6) и 454P(GRM6)] (фиг. 1 и табл. 1) согласно следующему обоснованию: 407En(hGRM6)
- 11 045729 (от -13873 до -13467 отн. TLSS из гена GRM6) состоит из консервативной последовательности размером 300 п.о. между мышиным и человеческим геномами (заштрихована горизонтальными линиями на фиг. 1А). 770En(hGRM6) (от -14236 до -13467 отн. TLSS из гена GRM6) в дополнение к 407En(hGRM6) также содержит 3'-пики ChIP-seq и кластер с гиперчувствительностью к ДНКазе (от -13990 до -13816 отн. TLSS из гена GRM6). 444En(hGRM6) (от -14033 до -13590 отн. TLSS из гена GRM6) представляет собой усеченный на 3'- и 5'-концах вариант 770En(hGRM6), содержащий только 3' и 5' пики ChiP-seq.
При выравнивании последовательностей от -1000 до -1 (отн. TLSS) из гена GRM6 авторы настоящего изобретения идентифицировали консервативную область размером 167 п.о. (от -425 до -259 отн. TLSS из гена GRM6) (фиг. 1B, заштрихована горизонтальными линиями на фиг. 1B). Включив эту консервативную последовательность авторы настоящего изобретения сконструировали два промотора: 566P(hGRM6) (от -691 до -126 отн. TLSS из гена GRM6), дополнительно содержащий 5'-сайт начала транскрипции (TSS, -179 отн. TLSS из гена GRM6) и сигнальный 5'-пик метки H3K27Ac (от -656 до -405 отн. TLSS из гена GRM6), а также второй 3'-пик ChiP-Seq ERG. ERG известен как активатор, который взаимодействует с FLI1, содержащейся в 770En и 444En. Вторая выбранная промоторная последовательность 454P(hGRM6) (от -453 до +1 отн. TLSS из гена GRM6) простирается дальше 5'-конца по сравнению с 566P(hGRM6), включая TLSS и дополнительные потенциально регуляторные последовательности, расположенные между TLSS и TSS, такие как пики ChiP-Seq TCF7L1 и MYC.
Пять возможных комбинаций энхансерных и промоторных последовательностей (табл. 1), предшествующих репортерному трансгену, клонировали между последовательностями ITR вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV), как подробно описано в приведенных ниже примерах с применением стандартных методов молекулярной биологии:
Таблица 1
Выбранные комбинации энхансер/промотор
| Название | Длина | № последовательности |
| 407En_454P(hGRM6) | 867 π. о. | 11 |
| 444En_454P(hGRM6) | 917 π. о. | 15 |
| 407En_566P(hGRM6) | 978 π. о. | 12 |
| 770En_454P(hGRM6) | 1243 π. о. | 13 |
| 770En_566P(hGRM6) | 1354 π. о. | 14 |
Пример 3. Оценка функционального промотора в сетчатке человека.
Имея промотор, сконструированный для гена GRM6 человека в свете терапевтического применения у пациентов-людей, все промоторы оценивали в посмертных эксплантатах сетчатки человека. Для этого промоторы объединяли с трансгеном mCitrine и упаковывали в самокомплементарные (sc) капсиды AAV, в частности scAAV2(7m8) (Dalkara et al. Sci Transl Med 2013. 5: p. 189ra76).
Примерно 5x106 vg (векторных геномов) добавляли к стороне RGC культивируемых посмертных эксплантатов сетчатки человека в день 1, как подробно описано в [van Wyk, M., et al., Front Neurosci, 2017. 11(161): p. 161.]. Сетчатки замораживали на 7-й день культивирования, когда была визуально заметна экспрессия трансгена из scAAV. Авторы настоящего изобретения окрашивали криосрезы в отношении репортерного белка mCitrine и маркера OBC Goa, чтобы визуализировать локализацию экспрессии и сравнить значения интенсивности экспрессии. До 85% OBC экспрессировали mCitrine в хорошо трансдуцированных участках (фиг. 9). Чтобы сравнить производительность с современным уровнем техники, промотор Lu 200En-mGluR500P (Lu et al. Gene Ther, 2016. 23: p. 680-9.) был также упакован в scAAV2 (7m8) и использован для трансдукции эксплантата сетчатки человека. Для каждого промотора культуры из трех глаз человека трансдуцировали конструкциями промоторов и криосрезы по всей сетчатке гистологически окрашивали и анализировали. Для контроля различий между экспериментами обработку и иммуногистохимический анализ проводили для всех образцов параллельно. Флуоресцентные изображения получали с помощью ZEISS LSM 880 с программным обеспечением Airyscan и ZEN 2.1. Микрофотографии, полученные посредством конфокальной микроскопии (z-стеки), были сделаны под 20x объективом с идентичными настройками микроскопа. Для определения средней эффективности трансдукции определяли цитоплазматическую флуоресценцию Alexa488 (вторичное антитело к mCitrine) в трансдуцированных клеточных телах OBC [mCitrine(+) и Goa(+)]. В частности, произвольные значения флуоресценции в соматическом участке OBC диаметром 4,15 мкм определяли с применением функции яркость программного обеспечения Fiji для обработки изображений. Анализы изображений, включая количественную оценку флуоресценции и подсчет клеток, выполняли с помощью Fiji ulfils. (версия 2.0.0, https://fiji.sc/, Schindelin et al., Nat Methods, 2012. 9(7): p. 676-82). Для нормализации значение флуоресценции каждой экспрессирующей OBC [mCitrine(+) и Goa(+)] делили на среднее значение фоновой флуоресценции, определенное посредством измерений в неэкспрессирующих OBC [mCitrine(-) и Goa(+)]. Как видно из фиг. 2, базальный промотор 566P опосредовал самую слабую экспрессию mCitrine в OBC, тогда как экспрессия под контролем 454P всегда была значительно интенсивнее, чем экспрессия под контролем промотора Lu 200En-mGluR500P, независимо от используемого энхансерного элемента. Поэтому
- 12 045729 для всех последующих экспериментов был выбран 454P. 770En_454P(hGRM6) (F равняется 6,03 ± 1,53; среднее значение ± s.d.) и 407En_454P(hGRM6) (F равняется 5,65 ± 0,09; среднее значение ± s.d.) проявляли одинаковую эффективность и были значительно лучше, чем 200En-mGluR500P, полученный из мыши Lu (F равняется 4,49 ± 0,22; среднее значение ± s.d.), и поэтому оба были проанализированы более подробно.
Пример 4. Значительно повышенная предпочтительность в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки, в эксплантатах сетчатки человека
На следующей стадии срезы анализировали в отношении специфичности экспрессии типа клеток OBC. С этой целью срезы окрашивали с помощью антител к трансгену mCitrine, антител к повсеместно встречающимся маркерам OBC Gao и специфического антитела к PKCa в биполярных клетках, представляющих собой палочки. Клетки [mCitrine(+), PKCa(+), Gao(+)] были четко идентифицированы как экспрессирующие ON-биполярные клетки, представляющие собой палочки (RBC), тогда как клетки [mCitrine(+), PKCa(-),Gao(+)] были четко идентифицированы как экспрессирующие ON-биполярные клетки, представляющие собой колбочки (cOBC). Соответственно, клетки [mCitrine(-), PKCa(+)] были идентифицированы как неэкспрессирующие RBC, и клетки [mCitrine(-), PKCa(-), Gao(+)] были определены как неэкспрессирующие cOBC. Результаты, показанные на фиг. 3, ясно указывают, что как 770En_454P(hGRM6), так и 407En_454P(hGRM6) опосредуют значительно более высокую экспрессию трансгена в cOBC по сравнению с 200En-mGluR500P. Меру предпочтительности в отношении cOBC (фиг. 3B) определяли посредством нормализации количества экспрессирующих cOBC и RBC к общему количеству cOBC и RBC в анализируемом участке сетчатки. Такая нормализация продемонстрировала, что 770En_454P(hGRM6) (предпочтительность в отношении cOBC составляет 49,5%) и 407En_454P(hGRM6) (предпочтительность в отношении cOBC составляет 36,4%) обладают значительно повышенной способностью к управлению экспрессией в типе клеток cOBC по сравнению с 200EnmGluR500P (предпочтительность в отношении cOBC составляет 16,3%). Следует особо отметить, что 770En_454P(hGRM6) демонстрирует эквивалентную предпочтительность в отношении RBC и cOBC (~50% в каждом случае, фиг. 3B).
Также с помощью scAAV2(7m8)-770En_454P(hGRM6)-mCitrine трансдуцировали макулы эксплантированных сетчаток человека. Иммуномечение с помощью mCitrine, PKCa и Gao ясно продемонстрировало, что фовеа содержит только cOBC, и что 770En_454P(hGRM6) управляет экспрессией mCitrine практически во всех cOBC (фиг. 7). Способность эффективно управлять экспрессией трансгена в cOBC фовеа человека имеет большое значение для терапии человека, поскольку фовеа опосредует высокую остроту зрения и таким образом представляет собой первичную мишень для генной терапии сетчатки, восстанавливающей зрение, - фовеа содержит только cOBC.
Пример 5. Специфичность 770En_454P(hGRM6) в отношении OBC по сравнению с 200EnmGluR500P.
Высокая предпочтительность в отношении OBC необходима, чтобы избежать нецелевых эффектов, таких как искаженная передача сигнала в сетчатке. Срезы сетчатки человека метили антителами к mCitrine (трансгену), Goa (общему маркеру OBC) и ядерным красителем DAPI для различения слоев клеток. Это позволяет идентифицировать тип экспрессирующих клеток: фоторецепторные клетки (PR, mCitrine(+), расположены во внешнем ядерном слое), OBC [mCitrine(+), Goa(+) и расположены во внутреннем ядерном слое], амакриновые клетки [AC, mCitrine(+),Goa(-) и расположены во внутреннем ядерном слое] и ганглиозные клетки (GC, mCitrine(+), расположены в слое ганглиозных клеток). На фигуре 4А четко показано, что новый промотор 770En_454P(hGRM6) характеризуется значительно повышенной предпочтительностью в отношении OBC (88,3 ± 7,8%) по сравнению с 200En-mGluR500P (70,1 ± 12,2%). Кроме того, нецелевая экспрессия под контролем 200En-mGluR500P в целом была выше, в частности в AC (16,9 ± 9,1%), по сравнению с новым промотором 770En_454P(hGRM6) (4,1 ± 3,2%). Последнее имеет особенное значение для оптогенетического восстановления зрения, когда нецелевая экспрессия искажает передачу сигнала в сетчатке.
Пример 6. Оценка промотора в дегенерирующей сетчатке мыши.
Важным для терапии сетчатки является доступность ткани для лечения. Это может быть сложной задачей при дегенеративном процессе с анатомическими, функциональными и транскрипционными изменениями. Авторы настоящего изобретения ранее показали, что мышиный промотор Kim 200En-SV40 больше не функционирует в мышиной модели быстрой дегенерации rd1 (van Wyk et al. Front Neurosci 2017. 11: p. 161). Таким образом, эффективность 770En_454P(hGRM6) [и для сравнения его мышиного аналога 200En-mGluR500P [Lu et al. Gene Ther 2016. 23 p: 680-689] тестировали в мышиной модели дегенерации rd1. Промоторы объединяли с оптогенетическим MWOPN_-mGluR6-IRES2-TurboFP635 (SEQ ID NO: 16, плазмидная карта на фиг. 8) трансгеном и упаковывали в ssAAV2(7m8) (Dalkara et al. Sci Transl Med 2013. 5: p. 189ra76). 3x109 vg вводили посредством интравитреальной инъекции, как описано в (van Wyk et al. Front Neurosci 2017. 11: p. 161; van Wyk et al., PloS Biol 2015. 13: p. e1002143), в глаза мышей rd1 в возрасте 22 недель на поздней стадии дегенерации. Через 4 недели после инъекций мышей подвергали эвтаназии и извлекали сетчатки для иммуногистохимического анализа, как описано ранее [van Wyk,
- 13 045729
M., et al., Front Neurosci, 2017. 11(161): p. 161 ;van Wyk et al., PloS Biol 2015. 13: p. e1002143]. Авторы настоящего изобретения помечали срезы антителом к трансгену TurboFP635, антителом к OBCспецифическому маркеру Goa и ядерным красителем DAPI. В отличие от 200En-SV40, 770En_454P(hGRM6), а также 200En-mGluR500P, полученный из гена Grm6 мышей Lu, функционировали в OBC сетчатки rd1 (фиг. 5). Однако 200En-mGluR500P приводил к экспрессии только в ограниченных областях сетчатки, как в качестве примера показано на фигуре 5A, тогда как 770En_454P(hGRM6) приводил к гораздо более обширной и широко распространенной трансдукции дегенерирующей сетчатки (фиг. 5B), вероятно вследствие его повышенной интенсивности экспрессии, которая преодолевает порог экспрессии, если имеет место некоторое подавление Grm6 . Чтобы проанализировать специфичность и эффективность экспрессии трансгена (mCitrine), управляемой промотором 770En_454P(hGRM6) в дегенерирующей сетчатке, авторы настоящего изобретения осуществляли инъекции еще 9 мышам rd1 в еще более поздние временные точки (в возрасте 29-33 недель). Через 4 недели животных подвергали эвтаназии, глаза замораживали и делали срезы. Криосрезы снова метили антителами к mCitrine и Goa и анализировали под конфокальным микроскопом. Даже в данном случае, в этих полностью дегенерированных сетчатках ~67% всех клеток, экспрессирующих трансген [mCitrine (+), Goa (-)], представляли собой OBC [mCitrine (+), Goa (+)]. Аналогичным образом, ~55% всех OBC [mCitrine (-), Goa (+)] экспрессировали трансген [mCitrine (+), Goa (+)] (фиг. 5D). Широко распространенная и специфическая экспрессия терапевтического трансгена в дегенерирующей сетчатке имеет фундаментальное значение для эффективной генной терапии.
Пример 7. Оптогенетическая генная терапия и восстановление зрения у мышей rd1.
Чтобы увидеть, поддерживают ли благоприятные свойства 770En_454P(hGRM6) функциональное оптогенетическое восстановление зрения, нацеленное на OBC, авторы настоящего изобретения проводили доказательный эксперимент с мышиной моделью дегенерации rd1. Авторы настоящего изобретения путем инъекции билатерально вводили 3x109 vg ssAAV(7m8)-770En_454P(hGRM6)-MWOPN_mGluR6IRES2-TurboFP635-WPRE-BGHpA (плазмидная карта, фиг. 8) трем мышам rd1, полностью лишенным фоторецепторов, в возрасте 22 недель. MWOPN_mGluR6 (SEQ ID NO 16) представляет собой химерный белок, полученный из опсина из мышиных колбочек, чувствительного к средней длине волны (MWOPN), и мышиного mGluR6, который функционирует аналогично Opto-mGluR6, опосредуя активность OBC, и, исходя из этого, восстановление зрения (van Wyk et al., PloS Biol 2015. 13: p. e1002143). Авторы настоящего изобретения измеряли остроту зрения посредством выявления оптомоторных ответов (OMR) (согласно [Prusky et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 2004. 45(12): p. 4611-6.]) в разные временные точки (дни 41, 47, 55, 82 и 112) после введения в автоматизированный виртуальный барабан OptoDrum (Striatech®), содержащий небольшую камеру (54x54x30 см) с четырьмя экранами (Full-HD IPS-панели с диагональю 23,8), окружающими платформу, на которой может быть размещено животное. Яркость экранов доводили до 250 кд/м2, а дно и верх камеры закрывали зеркалами. С помощью компактной камеры для технической съемки (IR-чувствительный CMOS-датчик размером 1/3 с глобальным затвором и широкоугольным объективом, F1,6) отслеживали движения головы мышей сверху, при этом на экране на разных пространственных частотах отображался вращающийся паттерн из черных и белых несинусоидальных вертикальных полос. С помощью программного обеспечения Optodrum анализировали записанные движения головы и контролировали толщину, контрастность и скорость применяемых стимулов. Скорость движущихся полос была установлена на 12°/с, а контрастность на 100%. Как показано на фигуре 6, медианную остроту зрения каждой мыши определяли на основе всех измеренных значений остроты зрения в различных испытаниях. Медианная острота зрения обработанных мышей составляла 0,29 ± 0,03 циклов/0 (n равняется 3, ± s.d., P равняется 0,0048), что значительно лучше, чем у контрольных мышей rd1 без инъекций с 0,15 ± 0,06 циклов/0 (n равняется 7, P равняется 194 или больше), но все же хуже, чем у мыши C57BL/6 для положительного контроля с нормальным зрением, которая характеризовалась средней остротой зрения 0,43 ± 0,05 циклов/° (n равняется 10, s.d., P равняется 0,0006). Однако оптогенетическое средство терапии, нацеливающееся на OBC, привело к заметному улучшению оптомоторного ответа. В совокупности результаты доказывают, что 770En_454P(hGRM6) удовлетворяет всем требованиям для генной терапии человека, нацеливающейся на OBC, представляя собой короткий (1243 п.о.) промотор на основе человеческого гена, который при дегенерации по-прежнему является высокоэффективным и специфическим в отношении OBC, включая cOBC.
Материалы и способы.
Анализы биоактивности.
Анализы биоактивности описаны в приведенных выше разделах примеров. Культивирование и трансдукция эксплантатов сетчатки человека с помощью AAV, а также интравитреальная инъекция AAV в глаза мышей и последующая иммуногистохимическая обработка замороженных срезов сетчатки подробно описаны в другом месте [van Wyk, M., et al., Front Neurosci, 2017. 11(161): p. 161.].
Определение специфичности в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки.
С этой целью криосрезы сетчатки три раза обрабатывали антителами к трансгену mCitrine (Invitrogen, A11122, 1:500), антителами к повсеместно встречающемуся маркеру OBC Gao (EMD,
- 14 045729
MAB3073, 1:750) и специфическим в отношении RBC антителом к PKCa (Santa Cruz, sc8393, 1:750). Клетки [mCitrine(+), PKCa(+), Gao(+)] были четко идентифицированы как экспрессирующие RBC, тогда как клетки [mCitrine(+), PKCa(-),Gao(+)] были четко идентифицированы как экспрессирующие cOBC. Предпочтительность в отношении типа OBC, как изображено на фиг. 3A, определяли по соотношениям экспрессирующих cOBC и всех OBC [mCitrine(+), PKCa(-), Gao(+)]/[Gao(+)] и предпочтительность в отношении типа RBC определяли по соотношению экспрессирующих RBC и всех OBC [mCitrine(+), PKCa(+), Gao(+)]/[Gao(+)]. Чтобы получить меру предпочтительности экспрессии в cOBC, другими словами, вероятность того, что экспрессия в cOBC происходит, авторы настоящего изобретения определяли соотношение количества экспрессирующих cOBC и RBC соответственно и количества cOBC и RBC в данном конкретном анализируемом участке сетчатки. Эта нормализация была возможной, поскольку клетки [mCitrine(-), PKCa(+),Gao(+)] можно четко идентифицировать как неэкспрессирующие RBC, а клетки [mCitrine(-), PKCa(-), Gao(+)] как неэкспрессирующие cOBC. Таким образом, соотношение [mCitrine(+), PKCa(+), Gao13(+)]/[mCitrine(-), PKCa(+),Gao(+)] представляет собой процент трансдуцированных и экспрессирующих RBC, тогда как соотношение [mCitrine(+), PKCa(-),Gao(+)]/[mCitrine(-), PKCa(-), Gao(+)] представляет собой процент трансдуцированных и экспрессирующих cOBC в соответствующем анализируемом участке сетчатки. Поэтому результирующие проценты, показанные на фиг. 3B, указывают на вероятность того, что cOBC является трансдуцированной.
Программное обеспечение, использованное для молекулярной инженерии.
Авторы настоящего изобретения использовали геномный браузер Института геномики Калифорнийского университета в Санта-Круз (геномный браузер, https://genome.ucsc.edu/) [Kent et al., Genome Res, 2002. 12(6): p. 996-1006; Kuhn et al., Brief Bioinform, 2013. 14(2): p. 144-61] для изучения геномных последовательностей промоторов и аннотаций генома.
Для идентификации факторов транскрипции и сайтов связывания факторов транскрипции, которые, вероятно, участвуют в регуляции экспрессии генов, контролируемой новыми промоторами на основе GRM6, авторы настоящего изобретения использовали данные ChIP-seq из базы данных регуляции транскрипции генов (GTRD, gtrd.biouml.org/) [Yevshin et al., Nucleic Acids Res, 2017. 45(D1): p. D61-D67].
Плазмидные карты создавали с помощью программного обеспечения Vector NTI Advance (версии 11.5.2).
Антитела.
Таблица 3
| Антитела, использованные для иммуногистохимического анализа | ||||||
| 1_1 | Антитело к GFP | Кролик | Invitrogen | A-11122 | 1:500 | |
| 1_2 | Антитело к GFP | Курица | Abeam | abl3970 | 1:500 | |
| Первичные антитела | 1_3 1_4 | Антитело к tRFP Антитело к РКСа | Кролик Мышь | Evrogren Santa Cruz Biotechnology EMD | AB234 sc-8393 | 1:500 1:750 |
| 1_5 | Антитело к Goa | Мышь | Millipore Santa Cruz | MAB3073 | 1:750 | |
| 1_6 | Антитело к Gy 13 Антитело к кроличьему антителу, | Кролик | Biotechnology | sc-368324 | 1:500 | |
| Вторичные антитела | 2_1 | конъюгированно е с Alexa Fluor доо | Коза | Invitrogen | A-11008 | 1:400 |
| 2_2 | 400 Антитело к | Коза | Invitrogen | A-10521 | 1:400 |
- 15 045729 мышиному антителу, конъюгированно е с цианином 3
Антитело к кроличьему антителу,
2_3 Осел Invitrogen А-21206 1:400 конъюгированно е с Alexa Fluor
488
Антитело к куриному Jackson
703-1752_4 антителу, Осел Imm.Research 1:400
155 конъюгированно Laboratories е с цианином 5
Аппаратное и программное обеспечение для визуализации посредством конфокальной микроскопии.
ZEISS LSM 880 с детектором Airyscan и программным обеспечением ZEN 2.1 использовали для получения изображений посредством конфокальной микроскопии с 20x или 40x объективом. Изображения обрабатывали и оценивали в Fiji [Schindelin et al., Nat Methods, 2012. 9(7): p. 676-82.]. Плагин счетчика клеток использовали для подсчета клеток и стандартные инструменты Fiji использовали для обработки изображений. Плагин Stitch [Preibisch et al., Bioinformatics, 2009. 25(11): p. 1463-5.] использовали в случаях, когда Fiji не удавалось автоматически объединить расположенные рядом изображения, полученные посредством сканирования.
Статистические анализы.
Если не указано иное, значения сравнивали с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента и приводили средние значения ± стандартное отклонение для биологических образцов на протяжении всей данной работы. Уровни значимости обозначены звездочками: * означает, что P равняется 0,05 или меньше, ** означает, что P равняется 0,01 или меньше, и *** означает, что P равняется 0,001 или меньше.
Другие способы.
Остальные способы, не описанные выше и в примерах 1 и 2, можно найти в [van Wyk, M., et al., Front Neurosci, 2017. 11(161): p. 161.].
- 16 045729
Последовательности.
Таблица 4
Последовательности, использованные в данном исследовании
| Название | SEQ ID | Тип | Происхождение |
| NO. | |||
| 407En(hGRM6) | 1 | Нуклеиновая кислота | Человек |
| 770En(hGRM6) | 2 | Нуклеиновая кислота | Человек |
| 444En(hGRM6) | 3 | Нуклеиновая кислота | Человек |
| 429En(mGrm6) | 4 | Нуклеиновая кислота | Мышиная |
| 792En(mGrm6) | 5 | Нуклеиновая кислота | Мышиная |
| 460En(mGrm6) | 6 | Нуклеиновая кислота | Мышиная |
| 454P(hGRM6) | 7 | Нуклеиновая кислота | Человек |
| 566P(hGRM6) | 8 | Нуклеиновая кислота | Человек |
| 454P(mGrm6) | 9 | Нуклеиновая кислота | Мышиная |
| 566P(mGrm6) | 10 | Нуклеиновая кислота | Мышиная |
| 407En_454P(hGRM6) | 11 | Нуклеиновая кислота | Человек |
| 407En_566P(hGRM6) | 12 | Нуклеиновая кислота | Человек |
| 770En_454P(hGRM6) | 13 | Нуклеиновая кислота | Человек |
| 770En_566P(hGRM6) | 14 | Нуклеиновая кислота | Человек |
| 444En_454P(hGRM6) | 15 | Нуклеиновая кислота | Человек |
| MWOPN_mGluR6 | 16 | Нуклеиновая кислота | Мышиная |
| IRES2 | 17 | Нуклеиновая кислота | Пикорнавирус |
| mCitrine | 18 | Нуклеиновая кислота | Aequorea victoria |
| TurboFP635 | 19 | Нуклеиновая кислота | Entacmaea quadricolor |
| WPRE | 20 | Нуклеиновая кислота | Вирус гепатита В сурков |
| pABGH | 21 | Нуклеиновая кислота | Крупный рогатый скот |
| pA sNRP-1 | 22 | Нуклеиновая кислота | Человек |
| Капсид AAV2 WT | 23 | Аминокислота | Вирус |
| Последовательность KOZAK a) | 24 | Нуклеиновая кислота | Эукариоты |
| Последовательность KOZAK b) | 25 | Нуклеиновая кислота | Эукариоты |
- 17 045729
SEQ ID NO. 1: 407En(hG7?A/6) ctctgatttt aaaggaagta gatacttcaa ataattcatc atggagtgca 50 51 atattttctg taggctttta gtagataact tcatcagttt aaagaagatc 100 101 cttagattat gaaacattta caattatgaa tgaatattag atgttatcaa 150 151 atgctttttc tgcatccatt tagataatca tgtttttcct ttaatctgtt 200 201 aatgcggtga attacattaa tagatttcct aagtcattaa tctgctaaag 250 251 tgcatttctg ggacaaacca gacttggtta tgacattgta tgtatttcag 300 301 tttgcaaata ttggactagg atttttgtat ctatattcct tagtttgacc 350 351 tgtaaatttt atttcttgta ctaagtatta gcctcacgaa aggcattgtc 400 401 aaatgtt 407
SEQ ID NO . 2: 770En(hG7?A/6) gggtctccaa cttgccaact gtagatcttg gaacctttca tccttcataa 50 51 ctgcataagc caattccttc taataaatct gtataatata tctgtctata 100 101 taataaatat gtacttacat aactctgtat gttacatcta tctattctat 150 151 ctatctatct atctatctat ctatctatct atctatcatc tatctatcta 200 201 tttatctatt ctctgtgtct ttggagaacc ctgacatagt aagcaatcat 250 251 atcacctgca aatgatgaaa gctgtgtatt ttccaaatca gtcgttttat 300 301 gtcttttttt cttgcactga ctagtgcccc ctagagggaa tgataattgg 350 351 aattattgtc ttgctctgat tttaaaggaa gtagatactt caaataattc 400 401 atcatggagt gcaatatttt ctgtaggctt ttagtagata acttcatcag 450 451 tttaaagaag atccttagat tatgaaacat ttacaattat gaatgaatat 500 501 tagatgttat caaatgcttt ttctgcatcc atttagataa tcatgttttt 550 551 cctttaatct gttaatgcgg tgaattacat taatagattt cctaagtcat 600 601 taatctgcta aagtgcattt ctgggacaaa ccagacttgg ttatgacatt 650 651 gtatgtattt cagtttgcaa atattggact aggatttttg tatctatatt 700 701 ccttagtttg acctgtaaat tttatttctt gtactaagta ttagcctcac 750 751 gaaaggcatt gtcaaatgtt 770
- 18 045729
SEQ ID NO 3: 444En(hG7?M6) atctattctc tgtgtctttg gagaaccctg acatagtaag caatcatatc 50 acctgcaaat gatgaaagct gtgtattttc caaatcagtc gttttatgtc 100
101 tttttttctt gcaclgacta gtgcccccta gagggaatga taattggaat 150
151 tattgtcttg ctctgatttt aaaggaagta gatacttcaa ataattcatc 200
201 atggagtgca atattttctg taggctttta gtagataact tcatcagttt 250
251 aaagaagatc cttagattat gaaacattta caattatgaa tgaatattag 300
301 atgttatcaa atgctttttc tgcatccatt tagataatca tgtttttcct 350
351 ttaatctgtt aatgcggtga attacattaa tagatttcct aagtcattaa 400
401 tctgctaaag tgcatttctg ggacaaacca gacttggtta tgac 444
SEQ ID NO 4: 429En(mGrm6), мышиная последовательность, соответствующая 407En(hGW6) aaaacatacc actttagttt aaggactata gtgattccac actaggtaag 50 gtgctttctg taggctttta gttaatagtt ttgtcaagct aaagaagatc 100
101 tccagatggc taaactttta aatcatgaat gaagtagata ttaccaaatt 150
151 gctttttcag catccattta gataatcatg ttttttgcct ttaatctgtt 200
201 aatgtagtga attacagaaa tacatttcct aaatcattac atcccccaaa 250
251 tcgttaatct gctaaagtac atctctggct caaacaagac tggttgtgac 300
301 aggtttgtct ctgtcagttt gtgactgttg ggctggctct tcctacccct 350
351 ctgcttcttg gtttggcctg aacattaatt ttattttatt tttttaattt 400
401 tacctacaat caatttcaca atgtgtgtt 429
SEQ ID NO. 5: 792En(mGrm6), мышиная последовательность, соответствующая 770En(hGW6) ggtctcaaca agatacaaat tatgttctct aggtagcaat taacacaagg 50 aacgccttga ggtatgggag gggtgaggaa gctcacaaga tagaccctgg 100
101 tgcctggaag gaagacagcc aactaaaggt catatcacag tgtcccggga 150
151 accaacttga agggcttctg ctgtacaaat gtgggagaat ttcatcgtca 200
201 gaaggctctg caaaggtctg aaagtcaccg aactctgtaa gattctatcc 250
251 tgcttctatt cctgtcaaaa tataccagaa ggaatggaac taccccctcc 300
301 aaaaaataaa taaacaaaca aaccaccaaa ccacgcacag acaaagcatt 350
- 19 045729
351 caatacacat gctaaaacat accactttag tttaaggact atagtgattc 400
401 cacactaggt aaggtgcttt ctgtaggctt ttagttaata gttttgtcaa 450
451 gctaaagaag atctccagat ggctaaactt ttaaatcatg aatgaagtag 500
501 atattaccaa attgcttttt cagcatccat ttagataatc atgttttttg 550
551 cctttaatct gttaatgtag tgaattacag aaatacattt cctaaatcat 600
601 tacatccccc aaatcgttaa tctgctaaag tacatctctg gctcaaacaa 650
651 gactggttgt gacaggtttg tctctgtcag tttgtgactg ttgggctggc 700
701 tcttcctacc cctctgcttc ttggtttggc ctgaacatta attttatttt 750
751 atttttttaa ttttacctac aatcaatttc acaatgtgtg tt 792
SEQ ID NO. 6: 460En(mGr»i6), мышиная последовательность, соответствующая 444En(hC;W6) ggctctgcaa aggtctgaaa gtcaccgaac tctgtaagat tctatcctgc 50 ttctattcct gtcaaaatat accagaagga atggaactac cccctccaaa 100
101 aaataaataa acaaacaaac caccaaacca cgcacagaca aagcattcaa 150
151 tacacatgct aaaacatacc actttagttt aaggactata gtgattccac 200
201 actaggtaag gtgctttctg taggctttta gttaatagtt ttgtcaagct 250
251 aaagaagatc tccagatggc taaactttta aatcatgaat gaagtagata 300
301 ttaccaaatt gctttttcag catccattta gataatcatg ttttttgcct 350
351 ttaatctgtt aatgtagtga attacagaaa tacatttcct aaalcattac 400
401 atcccccaaa tcgttaatct gctaaagtac atctctggct caaacaagac 450
451 tggttgtgac 460
SEQ ID NO 7: 454P(hG7?M6) ggaggggtct ccaccctcgg agcggtctct catccctccc tagaatcctt 50 aaatcctctc tcgctcaggg cctcggccgc atctgtcaca gacttgtcct 100
101 gaaccgacag cggctggcgc aggtgactgg cttggggcgg gagcctgggt 150
151 gtgcgctggg gatggacccc gaggaagagg ggccaagctg tcgggaagcg 200
201 gcagggctgg aggggtggag gcagtggtcg ggcgggaccc cgggcgacag 250
251 ggttcggcgc ttgtaagagc gagacggagg cccgggcagg ccggctgagc 300
301 taactcccca gagccgaagt ggaaggcgcg ccccgagcgc cttctcccca 350
- 20 045729
351 ggaccccggt gtccctcccc gcgccccgag cccgcgctct ccttcccccg 400
401 ccctcagagc gctccccgcc cctctgtctc cccgcagccc gctagacgag 450
451 ccga
454
SEQ ID NO 8: 566P(hG®U6) ccaagaagag gacagaggca gaaagccagg gacagagact gagaaacaga 50 gacctagagg cagaagaaga ctgagataga gatggacaga gattgtgtca 100
101 gacacagccc cagagacagc cagacagtct gagtcagacg caaaccaaag 150
151 acaagaaaac aggaaaacag acccagagat tgggagaggg aggggaagga 200
201 gatgcgggga gagccagcac cgccaccccc cacactcagg aggggtctec 250
251 accctcggag cggtctctca tccctcccta gaatccttaa atcctctctc 300
301 gctcagggcc tcggccgcat ctgtcacaga cttgtcctga accgacagcg 350
351 gctggcgcag gtgactggct tggggcggga gcctgggtgt gcgctgggga 400
401 tggaccccga ggaagagggg ccaagctgtc gggaagcggc agggctggag 450
451 gggtggaggc agtggtcggg cgggaccccg ggcgacaggg ttcggcgctt 500
501 gtaagagcga gacggaggcc cgggcaggcc ggctgagcta actccccaga 550
551 gccgaagtggaaggcg 566
SEQ ID NO 9: 454P(mG'mtd), мышиная последовательность, соответствующая 454P(hGBA46) agagagaaga gagcccttcc tccactctca agctctggag ggggtctctg 50 ccctcaccct catccctccc cagaatcctt aaatcctcta gactgtagct 100
101 ctgattttac agctgtcaca gactcgtcct actagccaga ggttggctca 150
151 ggtaagcacc actggggagg tagcctaggg tgcgctgggg tgggtccaga 200
201 ggaagagctg cccagaactg tgggggaagg agcgggaccg accatcaaca 250
251 gggggacttt tcagggagaa tgagagcaat cctctggagg cctgggagag 300
301 gctgctgagt tgctggtgcg cgagtcacca acttttcctg cgctctcggt 350
351 gtccggccag aatcccgaag tggcagctga gcacggggtg gcagcttcgt 400
401 ccgccggctc tcaaggcgtc ccggtaactt cctttcccgc agtccaggag 450
451 caga 454
- 21 045729
SEQ ID NO. 10: 566P(mGrtn6), мышиная последовательность, соответствующая 566P(hGW6) gaccgaccag gggagtccct ggacttcttt gttcctcttc tcggggtggc 50 gggactgatt gtgtaaatct cttatctcca actttcactc ttatctgtct 100
101 ctttaatcgg catattgagg atgagtggcc aagcttattg gtgttgctgg 150
151 gtcagacaat ttaaaggcag tctaggggag aagcagaccc agggagtcag 200
201 agaggcagag agagaagaga gcccttcctc cactctcaag ctctggaggg 250
251 ggtctctgcc ctcaccctca tccctcccca gaatccttaa atcctctaga 300
301 ctgtagctct gattttacag ctgtcacaga ctcgtcctac tagccagagg 350
351 ttggctcagg taagcaccac tggggaggta gcctagggtg cgctggggtg 400
401 ggtccagagg aagagctgcc cagaactgtg ggggaaggag cgggaccgac 450
451 catcaacagg gggacttttc agggagaatg agagcaatcc tctggaggcc 500
501 tgggagaggc tgctgagttg ctggtgcgcg agtcaccaac ttttcctgcg 550
551 ctctcggtgt ccggcc 566
SEQ ID NO. 11: 407En 454P(hG7?V/6) ctctgatttt aaaggaagta gatacttcaa ataattcatc atggagtgca 50 atattttctg taggctttta gtagataact tcatcagttt aaagaagatc 150
101 cttagattat gaaacattta caattatgaa tgaatattag atgttatcaa 200
151 atgctttttc tgcatccatt tagataatca tgtttttcct ttaatctgtt 250
201 aatgcggtga attacattaa tagatttcct aagtcattaa tctgctaaag 300
251 tgcatttctg ggacaaacca gacttggtta tgacattgta tgtatttcag 350
301 tttgcaaata ttggactagg atttttgtat ctatattcct tagtttgacc 400
351 tgtaaatttt atttcttgta ctaagtatta gcctcacgaa aggcattgtc 450
401 aaatgttgct agcggagggg tctccaccct cggagcggtc tctcatccct 500
451 ccctagaatc cttaaatcct ctctcgctca gggcctcggc cgcatctgtc 550
501 acagacttgt cctgaaccga cagcggctgg cgcaggtgac tggcttgggg 600
551 cgggagcctg ggtgtgcgct ggggatggac cccgaggaag aggggccaag 650
601 ctgtcgggaa gcggcagggc tggaggggtg gaggcagtgg tcgggcggga 700
651 ccccgggcga cagggttcgg cgcttgtaag agcgagacgg aggcccgggc 750
701 aggccggctg agctaactcc ccagagccga agtggaaggc gcgccccgag 800
- 22 045729
751 cgccttctcc ccaggacccc ggtgtccctc cccgcgcccc gagcccgcgc 850
801 tctccttccc ccgccctcag agcgctcccc gcccctctgt ctccccgcag 900
851 cccgctagac gagccga 867
SEQ ID NO. 12: 407En 566P(hGZ?M6) ctctgatttt aaaggaagta gatacttcaa ataattcatc atggagtgca 50 atattttctg taggctttta gtagataact tcatcagttt aaagaagatc 100
101 cttagattat gaaacattta caattatgaa tgaatattag atgttatcaa 150
151 atgctttttc tgcatccatt tagataatca tgtttttcct ttaatctgtt 200
201 aatgcggtga attacattaa tagatttcct aagtcattaa tctgctaaag 250
251 tgcatttctg ggacaaacca gacttggtta tgacattgta tgtatttcag 300
301 tttgcaaata ttggactagg atttttgtat ctatattcct tagtttgacc 350
351 tgtaaatttt atttcttgta ctaagtatta gcctcacgaa aggcattgtc 400
401 aaatgttgct agccaagaag aggacagagg cagaaagcca gggacagaga 450
451 ctgagaaaca gagacctaga ggcagaagaa gactgagata gagatggaca 500
501 gagattgtgt cagacacagc cccagagaca gccagacagt ctgagtcaga 550
551 cgcaaaccaa agacaagaaa acaggaaaac agacccagag attgggagag 600
601 ggaggggaag gagatgcggg gagagccagc accgccaccc cccacactca 650
651 ggaggggtct ccaccctcgg agcggtctct catccctccc tagaatcctt 700
701 aaatcctctc tcgctcaggg cctcggccgc atctgtcaca gacttgtcct 750
751 gaaccgacag cggctggcgc aggtgactgg cttggggcgg gagcctgggt 800
801 gtgcgctggg gatggacccc gaggaagagg ggccaagctg tcgggaagcg 850
851 gcagggctgg aggggtggag gcagtggtcg ggcgggaccc cgggcgacag 900
901 ggttcggcgc ttgtaagagc gagacggagg cccgggcagg ccggctgagc 950
951 taactcccca gagccgaagt ggaaggcg 978
SEQ ID NO. 13: 770En 454P(hG7?A/6) gggtctccaa cttgccaact gtagatcttg gaacctttca tccttcataa 50 ctgcataagc caattccttc taataaatct gtataatata tctgtctata 100
101 taataaatat gtacttacat aactctgtat gttacatcta tctattctat 150
151 ctatctatct atctatctat ctatctatct atctatcatc tatctatcta 200
- 23 045729
201 tttatctatt ctctgtgtct ttggagaacc ctgacatagt aagcaatcat 250 251 atcacctgca aatgatgaaa gctgtgtatt ttccaaatca gtcgttttat 300 301 gtcttttttt cttgcactga ctagtgcccc ctagagggaa tgataattgg 350 351 aattattgtc ttgctctgat tttaaaggaa gtagatactt caaataattc 400 401 atcatggagt gcaatatttt ctgtaggctt ttagtagata acttcatcag 450 451 tttaaagaag atccttagat tatgaaacat ttacaattat gaatgaatat 500 501 tagatgttat caaatgcttt ttctgcatcc atttagataa tcatgttttt 550 551 cctttaatct gttaatgcgg tgaattacat taatagattt cctaagtcat 600 601 taatctgcta aagtgcattt ctgggacaaa ccagacttgg ttatgacatt 650 651 gtatgtattt cagtttgcaa atattggact aggatttttg tatctatatt 700 701 ccttagtttg acctgtaaat tttatttctt gtactaagta ttagcctcac 750
751 gaaaggcatt gtcaaatgtt caattgatat aatgctagcg gaggggtctc 800
801 caccctcgga gcggtctctc atccctccct agaatcctta aatcctctct 850
851 cgctcagggc ctcggccgca tctgtcacag acttgtcctg aaccgacagc 900 901 ggctggcgca ggtgactggc ttggggcggg agcctgggtg tgcgctgggg 950 951 atggaccccg aggaagaggg gccaagctgt cgggaagcgg cagggctgga 1000 1001 ggggtggagg cagtggtcgg gcgggacccc gggcgacagg gttcggcgct 1050 1051 tgtaagagcg agacggaggc ccgggcaggc cggctgagct aactccccag 1100 1101 agccgaagtg gaaggcgcgc cccgagcgcc ttctccccag gaccccggtg 1150 1151 tccctccccg cgccccgagc ccgcgctctc cttcccccgc cctcagagcg 1200 1201 ctccccgccc ctctgtctcc ccgcagcccg ctagacgagc cga 1243
SEQ ID NO. 14: 770Еп_566Р(Ь(ЖИ6) gggtctccaa cttgccaact gtagatcttg gaacctttca tccttcataa 50 51 ctgcataagc caattccttc taataaatct gtataatata tctgtctata 100 101 taataaatat gtacttacat aactctgtat gttacatcta tctattctat 150 151 ctatctatct atctatctat ctatctatct atctatcatc tatctatcta 200 201 tttatctatt ctctgtgtct ttggagaacc ctgacatagt aagcaatcat 250 251 atcacctgca aatgatgaaa gctgtgtatt ttccaaatca gtcgttttat 300 301 gtcttttttt cttgcactga ctagtgcccc ctagagggaa tgataattgg 350 3 51 aattattgtc ttgctctgat tttaaaggaa gtagatactt caaataattc 400 401 atcatggagt gcaatatttt ctgtaggctt ttagtagata acttcatcag 450 451 tttaaagaag atccttagat tatgaaacat ttacaattat gaatgaatat 500
- 24 045729
501 tagatgttat caaatgcttt ttctgcatcc atttagataa tcatgttttt 550
551 cctttaatct gttaatgcgg tgaattacat taatagattt cctaagtcat 600
601 taatctgcta aagtgcattt ctgggacaaa ccagacttgg ttatgacatt 650
651 gtatgtattt cagtttgcaa atattggact aggatttttg tatctatatt 700
701 ccttagtttg acctgtaaat tttatttctt gtactaagta ttagcctcac 750
751 gaaaggcatt gtcaaatgtt caattgatat aatgctagcc aagaagagga 800
801 cagaggcaga aagccaggga cagagactga gaaacagaga cctagaggca 850
851 gaagaagact gagatagaga tggacagaga ttgtgtcaga cacagcccca 900
901 gagacagcca gacagtctga gtcagacgca aaccaaagac aagaaaacag 950 951 gaaaacagac ccagagattg ggagagggag gggaaggaga tgcggggaga 1000 1001 gccagcaccg ccacccccca cactcaggag gggtctccac cctcggagcg 1050 1051 gtctctcatc cctccctaga atccttaaat cctctctcgc tcagggcctc 1100
1101 ggccgcatct gtcacagact tgtcctgaac cgacagcggc tggcgcaggt 1150
1151 gactggcttg gggcgggagc ctgggtgtgc gctggggatg gaccccgagg 1200
1201 aagaggggcc aagctgtcgg gaagcggcag ggctggaggg gtggaggcag 1250 1251 tggtcgggcg ggaccccggg cgacagggtt cggcgcttgt aagagcgaga 1300 1301 cggaggcccg ggcaggccgg ctgagctaac tccccagagc cgaagtggaa 1350 1351 ggcg 1354
SEQ ID NO. 15: 4441 η 454I’(hG7?.V/6) atctattctc tgtgtctttg gagaaccctg acatagtaag caatcatatc 50 acctgcaaat gatgaaagct gtgtattttc caaatcagtc gttttatgtc 100
101 tttttttctt gcactgacta gtgcccccta gagggaatga taattggaat 150
151 tattgtcttg ctctgatttt aaaggaagta gatacttcaa ataattcatc 200
201 atggagtgca atattttctg taggctttta gtagataact tcatcagttt 250
251 aaagaagatc cttagattat gaaacattta caattatgaa tgaatattag 300
301 atgttatcaa atgctttttc tgcatccatt tagataatca tgtttttcct 350
351 ttaatctgtt aatgcggtga attacattaa tagatttcct aagtcattaa 400
401 tctgctaaag tgcatttctg ggacaaacca gacttggtta tgaccaattg 450
451 atataatgct agcggagggg tctccaccct cggagcggtc tctcatccct 500
501 ccctagaatc cttaaatcct ctctcgctca gggcctcggc cgcatctgtc 550
551 acagacttgt cctgaaccga cagcggctgg cgcaggtgac tggcttgggg 600
601 cgggagcctg ggtgtgcgct ggggatggac cccgaggaag aggggccaag 650
- 25 045729
651 ctgtcgggaa gcggcagggc tggaggggtg gaggcagtgg tcgggcggga 700
701 ccccgggcga cagggtlcgg cgcttgLaag agcgagacgg aggcccgggc 750
751 aggccggctg agctaactcc ccagagccga agtggaaggc gcgccccgag 800
801 cgccttctcc ccaggacccc ggtgtccctc cccgcgcccc gagcccgcgc 850
851 tctccttccc ccgccctcag agcgctcccc gcccctctgt ctccccgcag 900
901 cccgctagac gagccga 917
SEQ ID NO. 16: MWOPN_mGluR6 atggcccaaa ggcttacagg tgaacagaca ctggaccact atgaggatag 50 cacccatgca agcatcttca cctataccaa cagcaacagc accaaaggtc 100
101 cctttgaagg ccccaattat cacattgctc ccaggtgggt gtaccacctc 150
151 accagcacct ggatgattct tgtggtcgtt gcatctgtct tcactaatgg 200
201 acttgtgctg gcagccacca tgagattcaa gaagctgcgc catccactga 250
251 actggattct ggtgaacttg gcagttgctg acctagcaga gaccattatt 300
301 gccagcactatcagtgttgt gaaccaaatc tatggctact tcgttctggg 350
351 acaccctctg tgtgtcattg aaggctacat tgtctcattg tgtggaatca 400
401 caggcctctg gtccctggcc atcatttcct gggagagatg gctggtggtc 450
451 tgcaagccct ttggcaatgt gagatttgat gctaagctgg ccactgtggg 500
501 aatcgtcttc tcctgggtct gggctgctat atggacggcc ccaccaatct 550
551 ttggttggag caggtactgg ccttatggcc tgaagacatc ctgtggccca 600
601 gacgtgttca gcggtacctc gtaccccggg gttcagtctt atatgatggt 650
651 cctcatggtc acgtgctgca tcttcccact cagcatcatc gtgctctgct 700
701 acctccaagt gtggctggcc atccgagcag tggcaaagca acagaaagaa 750
751 tctgagtcca ctcagaaggc cgagaaggag gtgacacgca tggtggtggt 800
801 gatggtcttc gcatactgcc tctgctgggg accctatact ttctttgcat 850
851 gctttgctac tgcccaccct ggctatgcct tccaccctct tgtggcctcc 900
901 ctaccatcct actttgccaa aagtgccact atctacaacc ccattatcta 950
951 tgtctttatg aaccggcagt ttcgaaactg catcttacat ctctttggaa 1000
1001 agaaggttga tgatagctct gaactttcca gcacctccaa gacagaagtc 1050
1051 tcatctgtct cttcagtgtc acctgcagag cagaacgtgc agaagcggaa 1100
1101 gcgcagcctc aagaagacct ccacgatggc ggccccgccc aagagcgaga 1150
1151 actcagagga cgccaagaca gagaccagcc aagtggcgcc tgccaagagc 1200
1201 aggatcacca gcgagggcga gtacatcccc ctggaccaga tcgacatcaa 1250
- 26 045729
1251 cgtgtaa 1257
SEQ ID NO 17: IRES2 gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa 50 taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc 100
101 ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca 150
151 ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat 200
201 gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc 250
251 tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
301 tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa 350
351 ccccagtgcc acgttgtgag ttggalagtt gtggaaagag tcaaatggct 400
401 ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc 450
451 attgtatggg atctgatctg gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt 500
501 tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt 550
551 tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccaca 585
SEQ ID NO. 18: mCitrine atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt 50 cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg 100
101 gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc 150
151 accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccttcggcta 200
201 cggcctgatg tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact 250
251 tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
301 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg 350
351 cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg 400
401 acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac 450
451 gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa 500
501 gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc 550
551 agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
601 tacctgagct accagtccaa gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga 650
651 tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca 700
701 tggacgagct gtacaagtcc ggataa 726
- 27 045729
SEQ ID NO. 19: TurboFP635 atggtgggtg aggatagcgt gctgatcacc gagaacatgc acatgaaact 50 gtacatggag ggcaccgtga acgaccacca cttcaagtgc acatccgagg 150
101 gcgaaggcaa gccctacgag ggcacccaga ccatgaagat caaggtggtc 200
151 gagggcggcc ctctcccctt cgccttcgac atcctggcta ccagcttcat 250
201 gtacggcagc aaaaccttta tcaaccacac ccagggcatc cccgacttct 300
251 ttaagcagtc cttccctgag ggcttcacat gggagaggat caccacatac 350
301 gaagacgggg gcgtgctgac cgctacccag gacaccagcc tccagaacgg 400
351 ctgcctcatc tacaacgtca agatcaacgg ggtgaacttc ccatccaacg 450
401 gccctgtgat gcagaagaaa acactcggct gggaggccag caccgagatg 500
451 ctgtaccccg ctgacagcgg cctgagaggc catagccaga tggccctgaa 550
501 gctcgtgggc gggggctacc tgcactgctc cctcaagacc acatacagat 600
551 ccaagaaacc cgctaagaac ctcaagatgc ccggcttcta cttcgtggac 650
601 aggagactgg aaagaatcaa ggaggccgac aaagagacct acgtcgagca 700
651 gcacgagatg gctgtggcca ggtactgcga cctgcctagc aaactggggc 750
701 acagctga 708
SEQ ID NO. 20: WPRE aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa 50 ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt 100
101 atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa 150
151 tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg 200
201 tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca 250
251 ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
301 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 350
351 ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat 400
401 cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg 450
451 acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc 500
501 ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt eg 542
- 28 045729
SEQ ID NO. 21: pA BGH gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 50 cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 100
101 aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 150 151 gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 200
201 caggcatgct gggga215
SEQ ID NO. 22: pA sNRP-1 aaataaaata cgaaatg17
SEQ ID NO. 23: Капсид AAV2 WT
MAADGYLPDW LEDTLSEGIR QWWKLKPGPP PPKPAERHKD DSRGLVLPGY KYLGPFNGLD60
KGEPVNEADA AALEHDKAYD RQLDSGDNPY LKYNHADAEF QERLKEDTSF GGNLGRAVFQ 120 AKKRVLEPLG LVEEPVKTAP GKKRPVEHSP VEPDSSSGTG KAGQQPARKR LNFGQTGDAD 180 SVPDPQPLGQ PPAAPSGLGT NTMATGSGAP MADNNEGADG VGNSSGNWHC DSTWMGDRVI 240 TTSTRTWALP TYNNHLYKQI SSQSGASNDN HYFGYSTPWG YFDFNRFHCH FSPRDWQRLI 300
NNNWGFRPKR LNFKLFNIQV KEVTQNDGTT TIANNLTSTV QVFTDSEYQL PYVLGSAHQG 360 CLPPFPADVF MVPQYGYLTL NNGSQAVGRS SFYCLEYFPS QMLRTGNNFT FSYTFEDVPF 420 HSSYAHSQSL DRLMNPLIDQ YLYYLSRTNT PSGTTTQSRL QFSQAGASDI RDQSRNWLPG 480 PCYRQQRVSK TSADNNNSEF SWTGATKYHL NGRDSLVNPG PAMASHKDDE EKFFPQSGVL 540
IFGKQGSEKT NVDIEKVMIT DEEEIRTTNP VATEQYGSVS TNLQRGNRQA ATADVNTQGV 600 LPGMVWQDRD VYLQGPIWAK IPHTDGHFHP SPLMGGFGLK HPPPQILIKN TPVPANPSTT 660 FSAAKFASFI TQYSTGQVSV EIEWELQKEN SKRWNPEIQY TSNYNKSVNV DFTVDTNGVY 720 SEPRPIGTRY LTRNL 735
Claims (17)
1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты длиной от 850 пар оснований (п.о.) до 1500 п.о., содержащая:
a) элемент энхансерной последовательности, выбранный из SEQ ID NO 1-3, и
b) элемент промоторной последовательности под SEQ ID NO 7.
2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты длиной от 850 пар оснований (п.о.) до 1500 п.о., содержащая:
a) элемент энхансерной последовательности, который на по меньшей мере 70% (или больше) идентичен последовательности, выбранной из SEQ ID NO 1-3, и
b) элемент промоторной последовательности, который на 70% или больше идентичен последовательности под SEQ ID NO 7, и при этом указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты характеризуется специфичностью к ON-биполярным клеткам, представляющим собой колбочки, составляющей 40% или больше, характерной для последовательности под SEQ ID NO 13, и предпочтительностью в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки, составляющей 20% или больше.
3. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, где элемент энхансерной последовательности на 75% или больше, на 80% или больше, более конкретно на 85% или больше, более конкретно на 90% или больше, более конкретно на 95% или больше, еще более конкретно на 98% или больше, наиболее конкретно на 100% идентичен последовательности, выбранной из SEQ ID NO 1-3.
4. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, где элемент промоторной последовательности на 75% или больше, более конкретно на 80% или больше, более конкретно на 85% или больше, более конкретно на 90% или больше, более конкретно на 95% или больше, еще более конкретно на 98% или
- 29 045729 больше, наиболее конкретно на 100% идентичен последовательности под SEQ ID NO 7.
5. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты характеризуется специфичностью к ON-биполярным клеткам, представляющим собой колбочки, составляющей 50% или больше, более конкретно 60% или больше, еще более конкретно 70% или больше, более конкретно 80% или больше, еще более конкретно 90% или больше, наиболее конкретно 100%, характерной для последовательности под SEQ ID NO 13.
6. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты характеризуется предпочтительностью в отношении ON-биполярных клеток, представляющих собой колбочки, составляющей 25% или больше, более конкретно 30% или больше, еще более конкретно 35% или больше, более конкретно 40% или больше, наиболее конкретно 50% или больше.
7. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-6, где выделенная молекула состоит из одного и только одного из указанных элементов энхансерной последовательности, одного и только одного из указанных элементов промоторной последовательности и необязательно спейсера, отделяющего элемент энхансерной последовательности от элемента промоторной последовательности.
8. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из предыдущих пунктов, содержащая последовательность, выбранную из SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13 и SEQ ID NO 15, или состоящая из нее, или содержащая последовательность, характеризующуюся 98% или большей идентичностью с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13 и SEQ ID NO 15, или состоящая из нее.
9. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из предыдущих пунктов, содержащая последовательность под SEQ ID NO 11 или под SEQ ID NO 13 или состоящая из нее, или содержащая последовательность, характеризующуюся 98% или большей идентичностью с SEQ ID NO 11 или SEQ ID NO 13, или состоящая из нее, в частности, содержащая последовательность под SEQ ID NO 13 или состоящая из нее, или содержащая последовательность, характеризующуюся 98% или большей идентичностью с SEQ ID NO 13, или состоящая из нее.
10. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из предыдущих пунктов.
11. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты по п.10, где вектор экспрессии нуклеиновой кислоты представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса или рекомбинантный вектор на основе аденоассоциированного вируса (rAAV), в частности, где вектор экспрессии нуклеиновой кислоты представляет собой рекомбинантный вектор на основе AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 или AAV12, более конкретно, где вектор экспрессии нуклеиновой кислоты представляет собой рекомбинантный вектор на основе AAV2.
12. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты по п.10 или 11, дополнительно содержащий:
a) последовательность, кодирующую капсидный белок, и
b) трансген.
13. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты по п.12, где трансген содержит последовательность под SEQ ID NO 16.
14. Вирионная частица аденоассоциированного вируса, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-9 или вектор экспрессии нуклеиновой кислоты по любому из пп.10-13.
15. Применение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-9, вектора экспрессии нуклеиновой кислоты по любому из пп.10-13 или вирионной частицы аденоассоциированного вируса по п.14 в качестве лекарственного препарата.
16. Применение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-9, вектора экспрессии нуклеиновой кислоты по любому из пп.10-13 или вирионной частицы аденоассоциированного вируса по п.14 для лечения врожденной стационарной ночной слепоты (CSBN1), палочко-колбочковой и колбочко-палочковой дистрофий, пигментного ретинита или макулярной дегенерации.
17. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-9, вектор экспрессии нуклеиновой кислоты по любому из пп.10-13 или вирионная частица аденоассоциированного вируса по п.14, где указанные выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, вектор экспрессии или вирионную частицу вводят посредством:
a) интравитреального введения,
b) интравитреальной инъекции, или
c) субретинальной инъекции.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP19209841.6 | 2019-11-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045729B1 true EA045729B1 (ru) | 2023-12-20 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240226326A9 (en) | Compositions and methods for treating sensorineural hearing loss using otoferlin dual vector systems | |
| JP2019519221A (ja) | 加齢関連疾患及び症状の遺伝子治療法 | |
| US20200030458A1 (en) | Gene Therapy for the Treatment of CNGB1-linked Retinitis Pigmentosa | |
| JP2018512125A (ja) | 多重ベクターシステム及びその使用 | |
| US20210395781A1 (en) | Compositions and methods for treating sensorineural hearing loss using otoferlin dual vector systems | |
| JP2021521842A (ja) | ミオシン１５プロモーター及びその使用 | |
| WO2020148913A1 (ja) | 網膜疾患の予防および進行抑制、視覚認知行動機能の改善、および視覚機能強化 | |
| JP2022529065A (ja) | 効率的なｒｎａトランススプライシングのための三重らせんターミネータ | |
| WO2022167009A1 (zh) | 靶向Aqp1 mRNA的sgRNA及其载体与应用 | |
| JP7380670B2 (ja) | Ｉｇｆ－１－暗号化ｄｎａ作製物及びｈｇｆ－暗号化ｄｎａ作製物を用いた神経病症治療 | |
| AU2019304569B2 (en) | Treatment of neuropathy with DNA constructs expressing IGF-1 isoforms | |
| AU2020385619B2 (en) | On-bipolar cell-specific promoters for ocular gene delivery | |
| EA045729B1 (ru) | Промоторы, специфические в отношении on-биполярных клеток, для внутриглазной доставки генов | |
| CN113710693A (zh) | Dna结合结构域反式激活因子及其用途 | |
| TW202221119A (zh) | Dna結合域轉活化子及其用途 | |
| US20210052742A1 (en) | Retinal Promoter and Uses Thereof | |
| CN118339290A (zh) | 包含基于小分子药物的可变剪接调节元件的核酸分子 | |
| WO2024069144A1 (en) | Rna editing vector | |
| WO2023212273A1 (en) | Treatments for age-related macular degeneration | |
| CA3218631A1 (en) | Vector system | |
| JP2023513211A (ja) | タンパク質合成を増強するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３による標的ＲＮＡ翻訳 | |
| CN117402875A (zh) | 利用rna剪接调节剂调控基因表达的核酸分子 |