CN1731973A - 皮肤代谢的生物活化剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种美容组合物,其含有的一种生物活性系统包括(i)水溶液稳定形式的ATPC(三磷酸腺苷)和任选的ATP前体,如Gp4g(四磷酸二鸟苷)或Ap4A(四磷酸二腺苷);(ii)至少一种含有最多6个氨基酸的生物拟肽,其能模拟皮肤多肽或皮肤蛋白质的作用,或上述多肽或蛋白质的激动剂或拮抗剂的生物分子。本发明的组合物采取油包水或水包油乳剂形式,所述生物活性系统包含在水相中。
Description
本发明主要涉及美容组合物。
本发明的目的是术语“代谢性生物活化”所指的经美容途径实现皮肤细胞活化和/或刺激的新概念。更具体说,本发明涉及一种皮肤代谢活化剂。
个人的生活方式、强烈的环境刺激、以及时间退化性生物学发展可导致皮肤组织生物学功能和生命能力随时间而弱化。因此,看来必须重建或维持皮肤细胞(角质形成细胞、朗格汉斯细胞、黑素细胞、成纤维细胞等等)的正常代谢和分解功能,以使其能与外界环境交换外部能量和功能性信息。
因此,本发明的一个目标是通过外部能量的提供和细胞间信号的刺激相结合自然地提高或纠正皮肤的多种能力。能量提供和刺激之间的协同可使皮肤能通过活化皮肤中已有的代谢机制(分子的、细胞的、组织的机制)对任何皮肤攻击或功能紊乱作出反应及在适当的时候通过表皮护理或治疗来优化皮肤和美容活性物质之间的相互作用。
为此,本发明提供了一种含有生物活化系统的美容组合物,该系统包括:第一,在水溶液中呈稳定形式的ATP(三磷酸腺苷)与任选的ATP前体(例如四磷酸二鸟苷Gp4G或四磷酸二腺苷Ap4A)和,第二,至少一种能模拟皮肤多肽或皮肤蛋白质的最多含6个氨基酸的生物拟肽,或作为所述肽或所述蛋白质的激动剂或拮抗剂的生物分子。
术语“美容组合物”是指其功能可维持、恢复或改善人体表面部分(主要是皮肤)外观的组合物,而不论所述组合物的给予方法(即经局部表面给予或体内口服给予)。
术语“ATP前体”是指作为ATP的活体内生物合成中间体的任何生化化合物;优选该ATP前体是Gp4G(四磷酸二鸟苷)或Ap4A(四磷酸二腺苷)。
术语“生物拟肽”是指含有能模拟皮肤肽或皮肤蛋白的含最多6个氨基酸的任何肽或作为所述肽或所述蛋白的激动剂或拮抗剂的生物分子,所述肽或蛋白参与或在皮肤生物合成或皮肤信息传递中发挥作用。
所选择的拟肽宜包括能调节皮肤性质和免疫力的肽或蛋白质。作为本发明属于生物活化系统的肽所模拟的皮肤肽或蛋白质的实例选择以下物质:
1)神经递质,包括儿茶酚胺(多巴胺、肾上腺素、去肾上腺素)、内啡肽(例如β-内啡肽)和脑啡肽(例如met-脑啡肽);作为实例,选择以下物质:
促生长素抑制素;参见SEQ ID No.3,
β-CGRP肽;参见SEQ ID No.6,
β-内啡肽;参见SEQ ID No.9,
leu-脑啡肽;参见SEQ ID No.10,
met-脑啡肽;参见SEQ ID No.11。
2)神经肽,例如:
物质P;参见SEQ ID No.1,
神经肽Y;参见SEQ ID No.2,
神经降压素;参见SEQ ID No.4,
α-CGRP肽(降钙素基因相关肽);参见SEQ ID No.5,
神经激肽A和B,
GRP肽(胃泌素释放肽);参见SEQ ID No.7,
缓激肽;参见SEQ ID No.8。
3)神经激素,例如:
α-MSH(黑素细胞刺激激素)肽;参见SEQ ID No.12,
ACTH(肾上腺皮质激素)肽;参见SEQ ID No.13,
“泌乳刺激素释放”肽;参见SEQ ID No.14。
作为实例,本发明所用的生物拟肽所模拟的肽,是物质P的拮抗剂或CGRP肽拮抗剂。
作为实例,本发明所用的生物拟肽所模拟的肽,是促生长素抑制素的激动剂。
作为实例,本发明所用的生物拟肽所模拟的肽,是神经肽Y的拮抗剂或调节剂。
作为实例,本发明所用的生物拟肽的模拟的肽,是缓激肽受体的拮抗剂。
作为实例,本发明所用的生物拟肽所模拟的肽,是α-MSH的激动剂或拮抗剂。
术语“模拟”或“模仿”是指认为所述肽的特征在体外(具体在本发明的组合物中)表现出与参比生物分子(例如肽或蛋白质)体内(例如在皮肤中)生物学功能相似或相近的生物学作用。
在整个说明书和权利要求书中,术语“肽”应当理解为指多个未取代氨基酸构成的序列以及序列中有些氨基酸(例如N末端氨基酸及/或C末端氨基酸)被可能有功能也可能无功能的基团或取代物所取代的氨基酸序列。
这些肽可以通过常规的化学合成(在固相或均相液中)或从组成的氨基酸或其衍生物通过酶法合成(Kullman等,J.Biol.Chem.1980,255,8234)获得。
这些肽也可以通过发酵经或未经遗传工程改造的细菌菌株获得从而产生需要的序列或其多种片段。
最后,这些肽可以通过提取动植物(优选植物来源的)蛋白质,随后通过产生受控水解所述肽而获得。植物中发现的许多蛋白质往往在其结构中包含有益的序列。受控水解使其能释放这些肽片段。
按照本发明和第一种方案所述,美容组合物中所选择的生物活化系统本身由该组合物的有效成分构成。
在这种情况下,所选的生物拟肽使得“功能化”该美容组合物成为可能;例如:
通过选择模仿α-MSH的拟肽获得着色活性;相反地,通过选择模仿α-MSH拮抗剂的拟肽获得褪色活性;
通过选择模仿物质P拮抗剂的拟肽获得了舒缓作用;
通过选择模仿CGRP肽拮抗剂的拟肽获得了抑制神经起源兴奋的作用;
通过选择模仿缓激肽拮抗剂的拟肽获得了抑制耐受不良或致敏的作用。
如第二种方案所述,美容组合物中所选的生物活化系统增强了所述组合物中一种或多种有效成分的效力。
按照本发明,该生物活化系统的特征使其能够恢复和/或维持表皮的天然活力。如果该美容组合物也包含皮肤营养物和/或能保证皮肤细胞活力的水相物质,这一点尤其得以证实。
本发明也提供了以下实施方式:
ATP的稳定形式是钠盐,例如ATP的二钠盐,
该生物拟肽在皮肤结构分子或皮肤中存在的酶的生物合成中具有功能性活性,
该生物拟肽在皮肤的信息传递中具有功能性活性,并且,例如是皮肤中存在的激素或细胞因子的生物活性组份,
该生物拟肽选自:组氨酸-β-丙氨酰基肽(模拟过氧化物歧化酶)、肽段R-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser、肽段Tyr-Arg、肽段R-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser以及N-乙酰基-Tyr-Arg-R(模拟内啡肽);R是任一氨基酸;肽段Lys-Thr-Thr-Lys-Ser、肽段Ala-Arg-His-Leu-Phe-Tyr(模拟α-MSH)以及肽段Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys(模拟抑弹性酶蛋白),
该生物拟肽是例如一种二肽;在这种情况下,该二肽可以对应于分子式Arg R或His-R,其中R是任一氨基酸;或另外该二肽可以是寡聚体形式,其分子式为(R-R)n,其中1<n<3;例如,该二肽对应于分子式(Arg-Lys)n,其中1<n<3,
该生物拟肽是三肽,例如对应于分子式Gly-His-Lys、Gly-Glu-Pro或Lys-Pro-Val,
该生物拟肽是四肽,例如对应于分子式Leu-Pro-Thr-Val、Lys-Thr-Ser-R或Gly-Glu-Pro-R;R是任一氨基酸,
该生物拟肽是五肽,例如Val-Ala-Lys-Leu-R;R是任一氨基酸,
该生物拟肽是六肽,例如该生物拟肽是Ala-R1-R2-R3-Phe-Try,其中R1、R2和R3各对应于任一氨基酸,
该美容组合物除生物活化系统之外可以包含氨基酸,所述氨基酸选自例如肌氨酸、脱羧肌肽和谷氨酰胺例如N-乙酰谷酰胺,
本发明的美容组合物除生物活化系统之外可以包含蛋白质,例如选自过氧化物歧化酶、核酸内切酶、光分解酶以及牛奶的细胞因子,
该生物活化系统最多占所述组合物重量的10%,优选占1%到10-7%之间,
本发明的美容组合物包含至少一种可由本发明生物活化系统增强的美容活性成分,
该美容组合物的常规形式是油包水或水包油乳剂,所述生物活化系统包含在溶液或水相中,
本发明的生物活化系统中,ATP以及任选的ATP前体最多占重量的10%,优选在0.01%和5%之间。
本发明组合物中存在的活性物质的有效量,对应于获得期望结果所需的用量,并且本发明的组合物的组成取决于这些组合物的用途。
第一类物质包括用于健康皮肤以改进美观及舒适度的美容组合物。健康皮肤可定义为消除病理变化但不一定处于完美状态。这种皮肤可具有干燥症状、刺激症状、与年龄或光化学老化相关的皱纹、皮脂分泌过多区域或色素减退或色素沉着过度区域。此外,健康皮肤可能需要暂时或长期避光保护以更好地抵挡阳光。
另一类包括用于因疾病或药物治疗而变得脆弱的皮肤的组合物,用作预防手段或作为医药治疗的延伸治疗。
本发明的美容组合物也可以包含至少一种选自抗氧化剂、自由基清除剂、α-羟酸、女维生素、遮光剂或过滤剂、驱虫药和消炎药的美容活性物质。
当然,本领域技术人员应小心选择这种或这些任选的活性物质和/或其用量,使得本发明的生物活化系统的有益性质不会被或基本上不会被所设想的添加物质所改变。优选地,考虑应当寻求本发明生物活化系统与活性物质之间具有协同作用。
本发明的组合物可以按照本领域技术人员熟知的技术进行制备,尤其是那些用于制备水包油(O/W)或油包水(W/O)类型乳剂的技术。
这些组合物具体可以单一乳剂或复合乳剂(双重(O/W或W/O)或三重(W/O/W或O/W/O)乳剂,例如乳膏、乳液、胶体或乳膏-胶体)、粉末或固体管的形式提供,并可任选地包装成气雾剂以摩丝或喷雾形式提供。
当本发明所的容组合物用于保护或护理人的表皮或用作防晒组合物时,可以悬浮液或溶剂或脂质分散液形式、或非离子泡囊分散液形式、或其它乳液形式(优选水包油类,如乳膏或乳液)、以油膏、胶体、乳膏-胶体、固体管、粉末、化妆棒、气雾摩丝或喷雾形式提供。
当本发明的美容组合物用于保护毛发时,可以是香波、洗液、胶体、乳液、或非离子泡囊分散液形式,并可以包含例如可洗去组分,在洗发前后、染发或漂白前后、卷发或头发拉直过程中或前后应用;该组合物也可以发型设计或护理洗液或胶体、吹干或头发定型洗液或胶体或用于卷发、拉直、染发或头发漂白成分的形式提供。
当该组合物用作指甲、睫毛、眉毛或皮肤的化妆品(如表皮处理霜、粉底、唇膏、眼影、胭脂、眉毛膏或眼线膏)时,可以以固体或糊状、无水或有水形式提供,例如水包油或油包水乳剂、非离子泡囊分散液或其他悬浮液。
对于本发明组合物而言,pH是生理值,介于4-7之间。当其局部使用时,该组合物含有至少一种ATP和任选的与至少一种生物拟肽偶联的前体,可将该组合物用于面部、颈部、头皮、黏膜、指甲、躯干、胸部、足部、腿部或任何其他身体部位。
本发明的组合物也可以包括传统的化妆品佐剂,尤其是选自脂肪物质、本发明上下文中具体所用以外的有机溶剂、乳化剂、离子或非离子增稠剂、柔软剂、遮光剂、稳定剂、润肤剂、硅氧烷、防泡剂、保湿液、维生素、芳香剂、防腐剂、表面活性剂、填充剂、聚合体、推进剂、碱化或酸化剂、染料或任何其他化妆品中(尤其是生产乳剂形式的组合物)通常使用的成分。作为实例,在用于户外环境和阳光下的产品中,本发明的组合物包含屏蔽或反射物质。
脂肪物质可以由油或蜡或其混合物构成,也包含脂肪酸、脂肪醇和脂肪酸酯。油可以选自动物、植物、矿物或合成油,尤其是来自液体石油冻胶、石蜡油、挥发性或不挥发的硅氧烷油、异链烷烃、聚烯烃以及氟油和全氟油。类似地,蜡可以选自顾名思义的动物、化石、植物、矿物或合成蜡。
在极性油中,可以提及称为“Finsolv TN”的油、偏苯三酸十三酯(tridecyltrimellitate)、异壬酸异壬酯(isononyl isononanoate)、肉豆蔻酸异丙酯(isopropyl myristate)、decaprylyl carbonate、或Guerbet苯甲酸醇酯和苯甲酸羟酯,诸如CP Hall公司名为“Hallbrite BHB”的产品。
作为说明,对于本发明具有水包油乳剂类型载体的防晒配方而言,水相(具体包含亲水性屏蔽物质)通常占相对于整个配方重量的50%到95%,优选占重量的70%到90%,油相(具体包含亲油性屏蔽物质)占相对于整个配方重量的5%到50%,优选占重量的10%到30%,并且乳化剂占相对于整个配方重量的0.5%到20%,优选占重量的2%到10%。
具体而言,本发明的组合物可获得的形式,是完全值得注意的透明和半透明性质的无水组合物。
利用本发明的美容组合物生产皮肤护理产品、针对皮肤、嘴唇和/或体表的化妆品、防晒产品、以及用于皮肤护理和/或治疗的皮肤病学组合物也是本发明的一个主题。
本发明的组合物可以是用于例如皮肤、嘴唇和/或体表等角蛋白材料染色的皮肤病学或护理组合物的形式,防晒组合物或身体清洁组合物的形式,尤其是除臭产品或卸妆产品形式,棒状形式。它尤其可以用作皮肤、体表或嘴唇护理的基础(用以保护嘴唇免受寒冷和/或阳光和/或风侵害的唇膏,或皮肤、指甲或头发的护理霜)。
本发明的组合物也可以是皮肤染色化妆品形式,尤其是任选地具有护理或治疗性质的粉底、腮红、化妆口红、眼影、遮瑕产品、眼线膏、身体化妆品;如任选地具有护理或治疗性质的唇膏等嘴唇化妆品;用于例如指甲或睫毛等体表部位的化妆品,尤其是睫毛膏形式,或用于眉毛和头发的化妆品,特别是铅笔形式。本发明的组合物具体可以是含该生物活化系统之外化妆和/或皮肤病学活性物质的美容产品。
本发明的美容组合物也可以含珠光物质、色素或其他的可以包裹的或不包裹金属氧化物的纳米色素(主要颗粒的平均大小通常在5-100纳米之间,优选在10-50纳米之间),例如氧化钛(无定形或结晶金红石和/或锐钛矿形式)、氧化铁、氧化锌、氧化锆或氧化铈或其混合物的纳米色素,它们都是熟知的紫外线光保护物质。此外,常规包裹物质是氧化铝和/或硬脂酸铝。这种包裹的或未包裹的金属氧化物纳米色素在专利申请EP-A-0518772和EP-A-0518773中有具体描述。
当然,本发明的组合物应当是美容学或皮肤病学上可以接受的,即应当包含无毒的生理学可接受的介质并应当能用于人类皮肤、体表或嘴唇。对于本发明的目的而言,术语“美容学可接受的”是指具有令人愉快的外观、气味和感觉的组合物。
试验
试验1
对L-瓜氨酰胺-L-精氨酸与或不与二钠盐形式的ATP联合对正常人角质形成细胞的细胞代谢的生物刺激活性进行了评价。
1.原理
该过程包括测量血清缺乏(2%)培养基中成纤维细胞培养物中ATP的量,与以下情况进行比较:
富含不同浓度瓜氨酰胺-精氨酸的培养基,
富含不同浓度ATP的培养基,
富含不同浓度瓜氨酰胺-精氨酸和ATP的培养基,
本试验的目的是评价所研究混合物与或不与二钠盐ATP联合对于正常人角质形成细胞ATP合成的激活作用。
2.方法
细胞培养
本试验在每孔105个细胞密度接种的6孔板上正常人角质形成细胞体外培养物上进行。
L-瓜氨酰胺-L-精氨酸
为了确定本试验中应用的浓度,对正常人角质形成细胞先进行了细胞活力检测。
将L-瓜氨酰胺-L-精氨酸溶于水终浓度固定为0.1%。
使从10-4%到10-2%的6个稀释度的L-瓜氨酰胺-L-精氨酸与细胞接触24小时和48小时。将“水”环境作为对照。
对于本试验将测定接触,L-瓜氨酰胺-L-精氨酸的两个最高浓度(即0.0001%和0.01%)48小时后,细胞活力保持在高于80%的水平。
紫外线B照射
将以105个细胞/每孔的密度接种在6孔板中的角质形成细胞在标准培养基(Epilfe Sigma)中培养48小时。在照射之前,去除培养基,细胞用PBS清洗,留下1毫升PBS与细胞接触用于照射。使角质形成细胞经受20mJ/cm2紫外线B照射(312纳米)。平行进行相同的未照射条件作为对照。
照射以后(以及未照射的对照),去除PBS并将细胞置于不同研究条件下:
培养基含水的对照,
培养基含0.001%L-瓜氨酰胺-L-精氨酸,
培养基含0.01%L-瓜氨酰胺-L-精氨酸。
每种条件一式三份。
照射后接触24小时或48小时后,回收条件培养物上清液。通过ELISA技术(R&DSystems,Abingdon,UK)测量了100微升上清液中角质形成细胞分泌的内皮素1的量。内皮素-1水平用合成的人内皮素-1制备的标准曲线进行计算。结果用蛋白浓度标准化的内皮素-1的皮克数表示(pg ET-l/mg蛋白质)。
3.结果
使用最低检测浓度(0.0001%)的L-瓜氨酰胺-L-精氨酸接触24小时导致与“水”对照相比,角质形成细胞(未照射条件)内皮素-1基础性分泌提高了20%。在更高浓度下(0.01%),这一激活作用明显增强,达到70%。
UV B照射导致在“水”对照条件下的角质形成细胞50%的内皮素-1分泌刺激。与0.0001%L-瓜氨酰胺-L-精氨酸接触24小时后,内皮素-1的分泌与照射的“水”对照相比提高了6%。在0.001%浓度下,L-瓜氨酰胺-L-精氨酸的激活作用显著提高到28%。
使用最低检测浓度(0.0001%)的L-瓜氨酰胺-L-精氨酸接触48小时导致与“水”对照相比,角质形成细胞(未照射条件)内皮素-1基础性分泌提高了26%。在更高浓度下(0.01%),此激活作用更为明显,达到了82%。
UV B照射导致在“水”对照条件下的角质形成细胞40%的内皮素-1分泌刺激。与0.0001%L-瓜氨酰胺-L-精氨酸接触48小时后,内皮素-1的分泌与照射的“水”对照相比提高了4%。在0.01%浓度下,L-瓜氨酰胺-L-精氨酸的激活作用显著提高到63%。
4.结论
在这样确定的实验条件下,针对所选择的稀释度和培育时间,发现:
浓度为0.01%的L-瓜氨酰胺-L-精氨酸对正常人角细胞的内皮素-1分泌具有显著的激活作用。
在存在0.01%ATP时,该激活作用增加20%。显然ATP分子和L-瓜氨酰胺-L-精氨酸肽分子之间存在协同作用。
单用ATP进行相同研究没有显示对内皮素-1合成有任何作用。
试验2
研究了ATP和二肽组合对正常人成纤维细胞生长的作用。
研究的产品是:
二钠盐形式的ATP,
β-丙氨酰胺-L-组氨酸(肌肽),
瓜氨酰胺-精氨酸(exsy algine)。
1.研究目的
本试验的目的是评价添加到培养基中的ATP和肽的组合对人成纤维细胞永生细胞系HaCaT细胞生长的作用。
在本试验中,两种肽(β-丙氨酰胺-L-组氨酸(Dragoco)和L-瓜氨酰胺-L-精氨酸(Exsymol))同时和/或相伴随地与ATP组合。
本研究在HaCaT细胞用标准培养基(含2%或10%胎牛血清(SVF)的DMEM(Sigma))制备的培养物中进行。
2.技术
将HaCaT细胞以低密度接种于96孔板的标准培养基(DMEM+10%SVF)中并在接种后于该培养基中生长24小时。
第2天将细胞置于不同的研究条件下。
ATP、β-丙氨酰胺-L-组氨酸(肌肽)和L-瓜氨酰胺-L-精氨酸(exsy algine)的检测浓度在预先进行的细胞毒性研究后确定。
准备了以下条件:
对照条件:单独培养基+SVF,
仅含0.5%β-丙氨酰胺-L-组氨酸的条件,
仅含0.5%L-瓜氨酰胺-L-精氨酸的条件,
仅含1μg/ml ATP的条件,
含ATP(1μg/ml)+β-丙氨酰胺-L-组氨酸(0.5%)的条件,
含ATP(1μg/ml)+L-瓜氨酰胺-L-精氨酸(0.5%)的条件,
含ATP(1μg/ml)+β-丙氨酰胺-L-组氨酸(0.5%)+L-瓜氨酰胺-L-精氨酸(0.5%)的条件。
这些不同条件用含2%SVF的DMEM和含10%SVF的DMEM进行制备。
每种条件一式三份。在实验过程中不更换培养基。
细胞接种24小时后,在细胞与不同研究条件接触之前对细胞密度进行了评价(=T0),随后在培养的第2天、第5天和第7天通过WST-1转化法(450纳米处读取)评价了HaCaT细胞的生长。
3.结果
细胞生长通过测量不同实验时间的细胞活力得以体现。所获得的结果给出了关于T0时间初始细胞密度(将该值估计为等于100%)计算的细胞活力百分比。分析了不同产品在不同实验时间点对细胞生长的作用,与相同实验时间点未处理对照相比。
培养2天后,对照条件观察到相对于T0对照,细胞缺乏生长和活力的维持,这可用用转移到缺乏生长因子的培养基(2%SVF)来解释。
单加浓度为0.5%的β-丙氨酰胺-L-组氨酸显著刺激了细胞的生长(相对未处理的对照提高了22%)。但在0.1%浓度下没有观察到对生长的影响。
单加ATP大大降低了细胞活力。
在β-丙氨酰胺-L-组氨酸中加入ATP导致对ATP细胞活力抑制作用的抑制,并刺激细胞在β-丙氨酰胺-L-组氨酸所检测的2种浓度下超过了其单用时的水平。
单加浓度0.1%和0.5%的L-瓜氨酰胺-L-精氨酸与未处理对照相比没有刺激细胞生长(提高了5%)。
培养5天后,与T0相比,观察到细胞活力有轻微降低,这是由于培养物保持在缺乏生长因子的培养基中。
再次观察到浓度为0.5%的β-丙氨酰胺-L-组氨酸对细胞生长的刺激作用(提高12%)。
单加ATP大大降低了细胞活力,这一影响在加入0.5%的β-丙氨酰胺-L-组氨酸后消失。
不论所使用的浓度,L-瓜氨酰胺-L-精氨酸单独仍不能刺激细胞生长。
4.结论
在这样确定的实验条件和检测浓度下,看来单加ATP在接触2到5天后大大降低了正常人成纤维细胞的活力(降低5%到10%)。
ATP和β-丙氨酰胺-L-组氨酸组合消除了ATP的细胞活力抑制作用并激活后者超过了单用β-丙氨酰胺-L-组氨酸所获得的水平,这表明浓度0.5%时对细胞生长有刺激作用。
不论所使用的浓度,ATP与L-瓜氨酰胺-L-精氨酸组合对细胞生长没有刺激作用。
试验3
1.细胞培养
从患包茎的婴儿和新生儿的包皮制备正常人黑素细胞(MHN)培养物。将从皮肤片段获得的黑素细胞置于补充了30微克/毫升牛垂体提取物(BPE)(LifeTechnologies,Paisley,England)、2%胎牛血清(SVF)(Dominique Dutscher,Brumath,France)、16nM佛波醇-12-豆蔻酸-13-醋酸酯(Sigma)、5微克/毫升胰岛素和1.1μM氢化可的松(Sigma)的MCDB 153培养基(Sigma,St Louis,MO,USA)中。培养物保持在37℃含5%CO2的培养箱中。2到3周后获得了黑素细胞的纯培养物。
2.接触时间、细胞和载玻片制剂的照射
将所有待测组合物以最大允许浓度溶于DMSO中。进行预试验以确定对角质形成细胞的亚毒浓度。DMSO终浓度总是低于2%。
使黑素细胞与该产物37℃接触30分钟,随后用UV A辐射照射。UV a幅射光通过Bio-Sun UV-辐射器(Vilbert Lourmat,Marne la Vallee)产生。该装置配备有发射312纳米和/或365纳米波长的单频灯泡。该灯泡通过RMW-365/312辐射计输出计算的能量。对于UV A区间所释放的能量是0.8J/cm2。照射后立即进行“彗星”检测。这些实验中包括两种对照:
阴性对照:未经组合物处理但用UV A辐射照射的黑素细胞;用待测组合物处理30分钟但没受照射的黑素细胞。
阳性对照:没经组合物处理但受照射的黑素细胞。
用胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.02%)混合物处理2到3分钟后,离心回收培养物并置于不含Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液中(Sigma)。第二次离心后,将细胞(4.5-5.0×104个细胞)悬浮在0.5%低熔点(LMP)琼脂糖(Sigma)中。将该混合物直接置于环境温度干燥过夜的琼脂糖(1.6%)层预光包被并用第2层琼脂糖(0.8%)新鲜预包被的显微镜载玻片上。
3.“彗星”试验检测(干载玻片技术)和酶处理
彗星试验方案是掺入了“干载玻片”技术[2]的De Mao等[1]的方案。
照射后,将载玻片置于裂解池(2.5M NaCl,100mM Na2EDTA,10mM Tris-HCl,pH10,1%的肌氨酸钠,1%的triton X-100和10%DMSO)中。4℃裂解细胞60分钟,随后使DNA在强碱溶液中(1mM Na2EDTA和300mM NaOH,pH>13.0)室温变性20分钟。电泳(25V,300mA)20分钟后,载玻片用Tris-HCl缓冲液(0.4M;pH 7.4)中和并在无水乙醇或甲醇中脱水。
4.显微镜观察和影像分析
载玻片用溴化乙锭溶液(75微升,2ng/ml)染色用配备了20BG-W二色滤片(激发波长:515-560纳米;发射波长:590纳米)和Apo D-Plan 20×物镜的BH2-RFL荧光显微镜(Olympus,Japan)进行观察。用与Matrox IP-8获得板相连的高灵敏度单色CCD摄像机(Cohu 4912-5000)进行影像分析。全套装置由Fenestra Komet软件(KineticImaging,Liverpool,UK,3.1版)控制。
每个样品共分析了100个细胞(每张载玻片50个细胞)。使用的参数是定义为“彗星”尾中DNA百分比的“尾巴DNA”。每组实验包含阴性对照(未照射细胞)和阳性对照(不含待测组合物的照射细胞)。
5.统计学分析
直接计算了每个样品TM(尾矩)分布频率基于x2函数的非线性回归。具体说,Bauer等[3]最近证明这些分布遵循x2函数。这一方法是建立在按照x2定律的分布的分析基础上的。
代表该函数自由度的因子n(也称为x2TM)与损害程度(平均TM)直接相关。因子n在2(完整细胞)到15(极端损害的细胞,具有高斯分布频率)之间变化。
自由度(n)可以用作DNA损伤的指标。分布频率用Excel 97电子表格(Microsoft)计算,非线性回归用Table Curve 2D软件(Jandel Scientific,5.0版)计算。
6.参考文献
[1]De Meo M,M.Laget M,Castegnaro M,Dumenil G.Genotoxic activityof potassium permanganate acidic sodium.Mutation Res.1991;260;295-306.
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7.待测组合物的保护程度
获得了下表结果。
组合物 | OTM-x2 | 保护程度(%) |
NI | 2.08±0.02 | - |
NI+ATP(4mM) | 2.08±0.02 | - |
NI+Citru(4tnM) | 2.06±0.02 | - |
NI+ATP(4triM)+Citru(4mM) | 2.07±0.02 | - |
UVA | 9.16±0.32 | 0.00% |
UVA+ATP(4mM) | 6.31±0.38 | 14.6%(NS) |
UVA+Citru(4mM) | 2.22±0.20 | 67.7% |
UVA+ATP(4mM)+Citru(4mM) | 2.11±0.04 | 99.6% |
OTM-x2=尾矩x2:通过OTM分布的标准化频率的非线性回归,计算该函数的自由度。在所有情况下该模式的概率是P<0.001。
NI:未照射的黑素细胞。
NI+ATP:用ATP(4mM)预处理30分钟的未照射黑素细胞。
NI+Citru:用瓜氨酰胺-精氨酸(4mM)预处理30分钟的未照射的黑素细胞。
UV A:用UV A辐射(0.8J/cm2)照射的黑素细胞。
UV A+ATP:用UV A辐射(0.8J/cm2)照射并用ATP(4mM)预处理30分钟的黑素细胞。
UVA+Citru:用UV A辐射(0.8J/cm2)照射并用瓜氨酰胺-精氨酸(4mM)预处理30分钟的黑素细胞。
NS:UVA+Citru和UVA+ATP之间的差异不显著。
瓜氨酰胺-精氨酸的保护程度比ATP的高得多。ATP分子和所述肽之间的协同作用非常明显。
以下的实施例用以举例说明本发明,但不是对本发明范围的限制。
实施例
实施例1:抗皱霜
蔗糖硬脂酸酯 0.5-6%
蔗糖双硬脂酸酯 0.5-6%
ATP二钠盐 0.01-0.05%
四磷酸二鸟苷(Gp4G) 0.5-1%
辛酸/癸酸甘油三酯 3-15%
辛酸/癸酸/琥珀酸甘油三酯 3-15%
神经酰胺 30.05-1%
棕榈酸维生素C酯 0.01-0.1%
维生素E醋酸酯 0.05-1%
尿素 0.5-2%
氯化钙 0.05-0.5%
氯化镁 0.05-0.5%
β-丙氨酰胺-L-组氨酸 0.5-1%
Gly-His-Lys(肽粉) 10-5ppm
丝氨酸 0.2-2%
甘油 0.5-3%
柠檬酸 0.1-0.5%
柠檬酸三钠 0.5-1.5%
维生素A棕榈酸酯 0.1-0.5%
磷脂 0.1-0.4%
过氧化物歧化酶 0.5-2%
透明质酸钠 0.5-3%
山梨酸钾 0.2-0.5%
菌类植物胶 0.1-0.5%
黄原胶 0.1-0.5%
水 加至100%
芳香剂 qs
防腐剂 qs
实施例2:保湿乳
四磷酸二鸟苷(Gp4G) 0.5-1%
磷脂 3%
神经酰胺 30.1%
维生素A棕榈酸酯 0.15%
Steareth-20 0.2%
Steareth-2 1-3%
对羟基苯甲酸甲脂 0.25%
氯化钙 0.01%
氯化镁 0.01%
水 qs 100%
十八十六醇(Cetostearyl alcohol) 2-4%
肉豆蔻酸肉豆蔻酯 2-4%
肉豆蔻酸异丙酯 4%
甘油 1%
L-瓜氨酰胺-L-精氨酸 0.1-2%
二甲基硅氧烷 0.5%
羊毛脂醇 0.5%
对羟基苯甲酸丙酯 0.25%
实施例3:保湿霜
ATP二钠盐 0.01-0.05%
山梨聚糖油酸酯 3.5%
聚山梨醇酯80 2-4%
小麦胚芽油 3%
甜杏仁油 5%
肉豆蔻酸异丙酯 12%
磷脂 0.5%
神经酰胺3 0.1%
聚丙烯酰胺C14-13异链烷烃&Laureth-7 2-3.5%
维生素A棕榈酸酯 0.1%
维生素E 0.05%
PCA钠 0.5%
四磷酸二鸟苷(Gp4G) 0.5-1%
透明质酸钠 0.1%
水 qs 100%
L-瓜氨酰胺-L-精氨酸 0.1-2%
防腐剂 qs
芳香剂 qs
实施例4:防晒黑霜
ATP二钠盐 0.01-0.05%
辛基甲氧基肉桂酸(Neo Heliopan AV) 6.00%
丁基甲氧基二苯甲酰甲烷 3.00%
(Butylmethoxydibenzoylmethane)(Parsol 1789)
辛基三嗪酮 2.00%
(Uvinul T150)
二(C12-13)烷基酒石酸酯 8.00%
(Cosmacol ETI)
十六烷基醇 0.50%
二甲基硅氧烷 0.50%
Coco辛酸盐/癸酸盐 8.00%
PVP/二十烯共聚物(PVP/eicosene copolymer) 2.00%
十六烷基磷酸钾 2.00%
对羟基苯甲酸甲酯和丙酯 0.25%
EDTA二钠 0.10%
BHT 0.05%
卡波姆(Carbomer) 10.00%
四磷酸二鸟苷(Gp4G) 0.5-1%
丙氨酰胺-L-组氨酸(肌肽) 0.8-1%
丙二醇 5.00%
氢氧化钾 4.05%
苯基苯并咪唑磺酸(Eusolex 232) 2.00%
维生素E醋酸酯 2.50%
泛酰醇 1.00%
MSH(Ala-His-Lys-Phe-Tyr) 0.0001-0.00001%
光解酶 0.1%
水 qs 100%
芳香剂 qs
实施例5:防晒修复日霜
ATP二钠盐 0.01-0.05%
乙氧二醇和黄瓜素 8.00%
Di-C12-13烷基酒石酸酯(Cosmacol ETI) 5.00%
辛基甲氧基肉桂酸(Parsol MCX) 5.00%
丁基甲氧基二苯甲酰甲烷 2.00%
(Butylmethoxydibenzoylmethane)(Parsol 1789)
二甲基硅氧烷和三甲基硅氧硅酸盐 3.00%
维生素E醋酸酯 0.20%
蔗糖双硬脂酸酯 5.00%
己二醇 5.00%
对羟基苯甲酸丁酯、甲酯、丙酯+苯氧乙醇 0.40%
L-瓜氨酰胺-L-精氨酸 0.1-2%
水 qs 100%
四磷酸二鸟苷(Gp4G) 1-1.5%
MSH(Ala-His-Lys-Phe-Tyr) 0.0001-0.00001%
核酸内切酶 0.2%
丙氨酰胺-L-组氨酸(肌肽) 0.5-1%
芳香剂 qs
实施例6:柔软光修复乳液
矿物油 2.00%
四磷酸二鸟苷(Gp4G) 0.5-1%
Di-C12-13烷基酒石酸酯(Cosmacol ETI) 4.00%
辛基硬脂酸酯 3.00%
异戊基-对-甲氧基肉桂酸(Parsol MCX) 5.00%
丁基甲氧基二苯甲酰甲烷 1.00%
(Butylmethoxydibenzoylmethane)(Parsol 1789)
3-二异硬脂酰聚甘油酯 4.00%
PEG-20月桂酸甘油酯 1.00%
卡波姆(Carbomer) 0.4%
丙二醇 2.00%
防腐剂 0.50%
黄原胶 0.30%
三乙胺 0.85%
苯基苯并咪唑磺酸(Neo Heliopan Hydro) 2.5%
乙酰酪氨酸 2.00%
丙氨酰胺-L-组氨酸(肌肽) 0.5-1%
Gly-His-Lys(肽粉) 10-5ppm
水 qs 100%
芳香剂 qs
实施例7:脱过敏脸霜
辛酸/癸酸/琥珀酸甘油三酯 1-10%
维生素C棕榈酸酯 0.01-0.1%
甘油硬脂酸酯 1-5%
硬脂酸 1-5%
维生素E醋酸酯 0.1-1%
辛酸/癸酸甘油三酯 1-15%
ATP二钠盐 0.01-0.05%
维生素B6 0.01-0.05%
柠檬酸 0.1-0.5%
葡萄糖酸锌 0.1-1%
柠檬酸三钠 1-2.5%
L-瓜氨酰胺-L-精氨酸 0.1-2%
四磷酸二鸟苷(Gp4G) 0.5-1%
甘油 1-4%
维生素A棕榈酸酯 0.01-1%
d-泛酰醇 0.1-1%
鼠李糖 0.1-1%
L-岩藻糖 0.01-1%
乳铁传递蛋白/乳过氧化物酶 0.01-1%
过氧化物歧化酶 0.01-1%
聚丙烯酰胺/C13-14异链烷烃/laureth-7 0.2-1%
水 qs 100%
实施例8:柔软身体乳液
丙烯酸聚合物 0.1-1.5%
甘草次酸 0.1-1%
乙三胺 0.1-2%
丁烯乙二醇 0.5-4%
ATP二钠盐 0.01-0.05%
维生素C棕榈酸酯 0.01-0.1%
维生素E棕榈酸酯 0.1-1%
维生素B6 0.01-0.05%
柠檬酸 0.1-0.5%
葡萄糖酸锌 0.1-1%
柠檬酸三钠 1-2.5%
L-精氨酸 0.1-2%
维生素A棕榈酸酯 0.01-1%
d-泛酰 0.1-1%
L-岩藻糖 0.1-1%
乳铁传递蛋白/乳过氧化物酶 0.01-1%
丙氨酰胺-L-组氨酸(肌肽) 0.5-1%
R-Gly-Gln-Pro-Arg 15-20ppm
过氧化物歧化酶 0.01-1%
山梨酸钾 0.1-0.6%
防腐 qs
水 qs 100%
实施例9:油性皮肤舒缓霜
丙二醇 1-8%
山梨聚糖单月桂酸酯 0.5-5%
二甲基硅氧烷共聚多元醇(Dimethicone copolyol) 0.1-5%
水杨酸 0.01-0.5%
EDTA二钠 0.05-0.5%
四磷酸二鸟苷(Gp4G) 0.5-1%
ATP二钠盐 0.01-0.05%
葡萄糖酸锌 0.01-1%
维生素C棕榈酸酯 0.01-0.1%
维生素E棕榈酸酯 0.1-1%
维生素B6 0.01-0.05%
柠檬酸 0.1-0.5%
氯化钠 0.1-1.5%
柠檬酸三钠 1-2.5%
L-精氨酸 0.1-2%
维生素A棕榈酸 0.01-1%
d-泛酰醇 0.1-1%
鼠李糖 0.1-1%
L-岩藻糖 0.01-1%
乳铁传递蛋白/乳过氧化物酶 0.01-1%
Gly-His-Lys(肽粉) 10-5ppm
过氧化物歧化酶 0.01-1%
防腐剂 qs
水 qs 100%
实施例10:卸装洗液
四磷酸二鸟苷(Gp4G) 1-2%
ATP二钠盐 0.1-0.5%
柠檬酸三钠 1-2.5%
甘油 0.5-3%
己烯乙二醇 45%
d-泛酰醇 0.1-1%
丙氨酰胺-L-组氨酸(肌肽) 0.5-1%
防腐剂(对羟基苯甲酸甲酯和苯氧乙醇) qs
水 qs 100%
序列描述
SEQ ID No.1:H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Mer-H2(11A)
SEQ ID No.2:H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-
Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-
Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2(36AA)
SEQ ID No.3:H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-
Cys-OH(14AA)
SEQ ID No.4:pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH
(13AA)
SEQ ID No.5:H-Ala-Cys-Asp-Thr-Ala-Thr-Cys-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-
Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Val-Val-Lys-Asn-Asn-Phe-
Val-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2(37AA)
SEQ ID No.6:H-Ala-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-
Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lys-Ser-Asn-Phe-
Val-Pro-Thr-Asn-V al-Gly-Ser-Lys-Ala-Phe-NH2(37AA)
SEQ ID No.7:H-Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr-Lys-
Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-val-Gly-His-Leu-Met-
NH2(27AA)
SEQ ID No.8:H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH(9AA)
SEQ ID No.9:H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-
Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-
Lys-Gly-Glu-OH(31AA)
SEQ ID No.10:H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH(5AA)
SEQ ID No.11:H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH(5AA)
SEQ ID No.12:Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-
NH2(13AA)
SEQ ID No.13:H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-
Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-
Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH(39AA)
SEQ ID No.14:H-Ser-Arg-Thr-His-Arg-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-
Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-
Arg-Phe-NH2(31AA)
Claims (22)
1.一种美容组合物,其特征在于,所述组合物包括一种生物活化系统,该系统包括,第一,水溶液中稳定形式的ATP(三磷酸腺苷)与任选的例如Gp4G(四磷酸二鸟苷)或Ap4A(四磷酸二腺苷)等ATP前体,以及第二,至少一种含有最多6个氨基酸的能模拟皮肤多肽或皮肤蛋白质的生物拟肽,或所述皮肤多肽或所述皮肤蛋白质的激动剂或拮抗剂的生物分子。
2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述稳定形式是ATP钠盐,例如二钠盐。
3.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述生物拟肽在皮肤的结构性分子或皮肤中存在的酶的生物合成中具有功能性活性。
4.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述生物拟肽在皮肤的信息传递中具有功能性活性并且是例如皮肤中存在的激素或细胞因子的生物学活性组分。
5.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述生物拟肽选自:组氨酸-β-丙氨酰胺肽、R-Gly-Gln-Pro-Arg肽、Tyr-Arg肽、R-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser肽、N-乙酰-Tyr-Arg-R、Lys-Thr-Thr-Lys-Ser肽、Ala-Arg-His-Leu-Phe-Tyr肽(或α-MSH)以及Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys肽(或抑弹性酶蛋白);其中R是任何一种氨基酸。
6.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述生物拟肽是一种二肽。
7.如权利要求6所述的组合物,其特征在于,所述二肽对应于分子式Arg-R或His-R,其中R是任何一种氨基酸。
8.如权利要求6所述的组合物,其特征在于,所述二肽具有分子式为(R-R)n的寡聚物形式,其中1<n<3。
9.如权利要求8所述的组合物,其特征在于,所述二肽对应于分子式(Arg-Lys)n,其中1<n<3。
10.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述生物拟肽是一种三肽。
11.如权利要求10所述的组合物,其特征在于,所述三肽是Gly-His-Lys或Gly-Glu-Pro。
12.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述生物拟肽是一种四肽。
13.如权利要求12所述的组合物,其特征在于,所述四肽是Leu-Pro-Thr-Val或Lys-Thr-Ser-R或Gly-Glu-Pro-R;其中R是任何一种氨基酸。
14.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述生物拟肽是一种五肽,例如Val-Ala-Lys-Leu-R;其中R是任何一种氨基酸。
15.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述生物拟肽是一种六肽。
16.如权利要求15所述的组合物,其特征在于,所述生物拟肽是Ala-R1-R2-R3-Phe-Try,其中R1、R2和R3各自等于任何一种氨基酸。
17.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物包含一种氨基酸,例如选自肌氨酸、脱羧肌肽和谷氨酰例如N-乙酰谷氨酰胺。
18.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物包含一种蛋白质,例如选自过氧化物歧化酶、核酸内切酶、光解酶和牛奶的细胞因子。
19.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述生物活化系统最多构成所述组合物重量的10%,优选在1%和10-7%之间。
20.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物包含至少一种可由所述生物活化系统增效的美容活性成分。
21.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物是油包水或水包油形式,所述生物活化系统包含在水相中。
22.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述生物活化系统、ATP和任选的ATP前体构成最多10%的重量,优选在0.01%和5%之间。
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