KR100411828B1

KR100411828B1 - 항 염증 효과가 있는 새로운 합성 펩타이드

Info

Publication number: KR100411828B1
Application number: KR10-2001-0021598A
Authority: KR
Inventors: 손준홍; 김수열
Original assignee: 김수열; 손준홍
Priority date: 2001-04-21
Filing date: 2001-04-21
Publication date: 2003-12-24
Also published as: WO2002085927A1; US7037502B2; US20020192780A1; KR20020081955A

Abstract

본 발명은 항 염증 효과가 있는 새로운 합성 펩타이드에 관한 것으로, 서열번호 1(리신(K)-발린(V)-루이신(L)-아스파르트산(D)-프롤린(P)-발린(V)-리신(K)-글리신(G)), 서열번호 2(리신(K)-발린(V)-루이신(L)-아스파르트산(D)-글리신(G)-글루타민(Q)-아스파르트산(D)-프롤린(P)) 또는 서열번호 3(아스파르트산(D)-프롤린(P)-발린(V)-리신(K)-글리신(G))의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 합성 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 합성 펩타이드 및 덱사메타손과 같은 소염제에 비해 강력한 소염작용을 나타낸다.

Description

항 염증 효과가 있는 새로운 합성 펩타이드{Novel anti-inflammatory synthetic peptides}

본 발명은 항 염증 효과가 있는 새로운 합성 펩타이드에 관한 것이다.

염증반응은 조직에 부종, 동통 및 백혈구 침윤(infiltration) 등을 수반하는 생화학적 및 세포적으로 복잡한 현상이다. 염증에 대해 대표적으로 효과적인 약은 글루코코티코이드(glucocorticoid)이다. 항 염증 약물로 통상 사용되는 글루코코티코이드 계통의 스테로이드성 항 염증 약물은 류마티스성 관절염 등에 우수한 효과를 나타내며, 방사성, 기계적, 화학적, 감염성 및 면역자극을 포함한 여러가지 염증 반응을 억제 혹은 예방한다.

상기 스테로이드성 항 염증 약물이 널리 사용됨에 따라 최근에는 남용으로인한 각종 부작용이 심각한 문제로 대두되고 있다. 스테로이드성 항 염증 약물은 임상적으로 두가지 범주의 부작용이 생기는데, 첫째는 장기간 사용후 갑자기 투약을 중지할 때와, 둘째는 장기간 과잉 사용으로 나타나는 증상이다. 부신 피질 호르몬을 장기간 투여하다가 갑자기 중단하면 급성 부신 기능 부전으로 전신 쇠약감, 발열, 근육통, 관절통 및 식욕감퇴 등의 증상이 나타난다. 또한 세균, 바이러스 등에 대한 감염의 위험성이 증가하고, 체중이 늘고 체형이 변하며, 불면증이 잘 동반된다. 이와 같은 부작용때문에 그 사용상 문제점이 많아, 이같은 문제점이 없는 항 염증제가 요구되고 있다.

글루코코티코이드는 포스포리페이즈 A₂(phospholipase A₂:PLA₂)의 억제 단백질인 리포코틴(lipocortin)과 같은 많은 단백질을 유도한다. 많은 연구에 있어, 상기와 같이 리포코틴 및 유테로글로빈(uteroglobin)의 유도를 경유하여 항 염증 효과를 나타냄이 밝혀졌다(Miele 등,Endocr. Rev. 8, 474∼490(1987)). 리포코틴(아넥신(annexin))은 구조적 및 기능적 특성을 공유하는 단백질 군이다. 상기 기능적 특성으로는, Miele 등은 유테로글로빈 및 리포코틴-1 사이에서 서열 유사 영역을 확인하였다. 또한 Miele 등은 유테로글로빈 및 리포코틴-1의 매우 유사성이 높은 영역에 대응하는 몇가지 합성 펩타이드를 제조하였다. 이와 같이 유테로글로빈의 39∼47 잔기 및 리포코틴-1 246∼254 잔기에 대응하는 노나펩타이드(nonapeptide)를 소위, 안티플라민(antifammin)이라 한다. 상기 펩타이드는 인 비트로(in vitro)에서는 포스포리페이즈 A₂억제를 나타냈고,캐라지난(carrageenan)에 의한 래트 발바닥의 부종에 대한 급성 염증 모델에서 효과적이었다. 그러나, 생체(in vivo)에서는 포스포리페이즈 A₂에 대한 억제 효과 뿐만 아니라 항 염증 활성을 갖는 것에 대해서는 논란이 있다. 또한 기존의 안티플라민 또는 PLA₂억제제 단독으로는 덱사메타손과 같이 강력한 항 염증 효과를 나타내지 못하고 있다.

리포코틴의 구조적 특성에서, 리포코틴의 대부분은 외부 막 단백질로 작용하여, 칼슘 이온에 의존하는 방법으로 포스포리피드 막에 가역적으로 결합한다. 또한 상피조직 세포 분화중에, 리포코틴-1(아넥신-1)은 트랜스글루타미네이즈 (transglytaminase:TGase)와 교차결합을 통해 각질화된(cornified) 세포 인벨로프(envelop)내로 주입되고, SDS에 의해 추출되지 않는다. 또한 구강 상피에 있어, 리포코틴-1(아넥신-1)은 단백질 시퀀싱에 의해 전체 배리어(barrier) 인벨로프 단백질의 약 10%로 구성된다. 이와 같이 리포코틴-1(아넥신-1)은 항 염증 작용을 포함하는 주 성분으로서 배리어 형성에 관여한다.

본 발명자들은 예의 연구한 결과, 안티플라민 및 엘라핀(elafin)의 TGase의 기질 도메인 사이의 서열 유사성을 발견하였다. 안티플라민의 KVLD 는, 엘라핀에서 잘 알려진 TGase 기질도메인 서열 KVPD(역방향 순서로)와 아주 유사한 테트라 펩타이드 서열을 갖는다. SKALP(skin-derived antileukoproteinase)라고도 알려진, 엘라핀은 단백질 분해에 의한 3kDa 활성 형태로 활성화 될 수 있는, 6kDa 프리프로폼(preproform)이며, 엘라스테이즈(elastase) 및 프로테이네이즈-3(proteinase-3)과 같은 폴리모포뉴글리어(PMN) 세포-유도 세린 프로테이네이즈의 선택적이고 강력한 억제제이다. 흥미롭게도 TGase가 PLA₂를 활성화시킨다는 사실도 밝혀졌다. 비록 KVLD는 PLA₂억제제로서는 작용하지 않지만, TGase 억제제로는 작용할 수 있다. 또한 본 발명자들은 안티플라민이 아실 억셉터로서 리신(lysine)을 포함할 때, TGase 기질과 경쟁한다는 것을 발견하였고, 본 발명자는 이에 기초하여 엘라핀, 안티플라민으로부터 본 발명에 따른 새로운 펩타이드를 합성하였다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하여, 종래의 안티플라민에 비해 임상적으로 적용할 수 있는 월등한 항 염증효과를 갖고, 스테로이드 계통의 항 염증제 등의 부작용이 없는 새로운 합성 펩타이드를 제공하는 것이다. 즉, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 합성 펩타이드를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 합성 펩타이드에 대한 TGase 활성의 억제효과를 나타낸 그래프이고,

도 2는 본 발명의 합성 펩타이드에 관한 면역실험에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명의 합성 펩타이드는, 서열번호 1(리신(K)-발린-(V)-루이신(L)-아스파르트산(D)-프롤린(P)-발린(V)-리신(K)-글리신(G)), 서열번호 2(리신(K)-발린(V)-루이신(L)-아스파르트산(D)-글리신(G)-글루타민(Q)-아스파르트산(D)-프롤린(P)) 또는 서열번호 3(아스파르트산(D)-프롤린(P)-발린(V)-리신(K)-글리신(G))의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 펩타이드는 이 분야에서 통상의 방법, 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의해 생산할 수도 있다.

본 발명에 따른 펩타이드는 강력한 항 염증 활성을 나타내며, 생물학적으로 활성이 있는 다른 제제, 예를 들어 생물학적으로 활성이 있는 화합물, 다른 펩타이드 등과 같이 투여될 수 있으며, 다른 계통의 항 염증제와 병용투여할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 합성 펩타이드를 유효 성분으로 하는 항 염증 효과가 있는 약제학적 조성물을 특징으로 한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 통상의 용매, 계면활성제, 오일, 화학적 안정성을 위한 항 산화제 등을 적어도 하나 이상 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 상기 합성 펩타이드를 조성물 총 중량의 0.00001∼ 50중량%, 바람직하게는 0.001∼30중량%를 포함한다. 상기 합성 펩타이드가 0.00001중량% 미만인 경우 본 발명의 효과가 미약하며, 50중량%를 초과할 경우 효과의 증대가 없어 바람직하지 못하다.

본 발명의 조성물은 경구, 점안, 주사 등의 경로로 투입될 수 있으며, 상기 펩타이드 0.001∼2000mg/kg의 용량으로 투입하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.

알라닌 A 아르기닌 R

아스파라긴 N 아스파르트 산 D

시스테인 C 글루타민 산 E

글루타민 Q 글리신 G

히스티딘 H 아이소루이신 I

루이신 L 리신 K

메티오닌 M 페닐알라닌 F

프롤린 P 세린 S

트레오닌 T 트립토판 W

타이로신 Y 발린 V

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

펩타이드 제조

표 1에 기재된 서열에 따라, 자동 펩타이드 합성기를 이용하여 본 발명에 따른 펩타이드를 합성하였고, 이들 합성된 펩타이드를 C8 역상 고속액체 크로마토그래피를 이용하여 순수 분리하였다.

표 1

펩타이드	아미노산 서열
서열번호 1	KVLDPVKG
서열번호 2	KVLDGQDP
서열번호 3	DPVKG

비교예

상기 실시예의 방법으로 공지의 안티플라민 등의 펩타이드를 제조하였고, 그서열을 하기 표 2에 나타내었다.

표 2

펩타이드	아미노산 서열
서열번호 4(PLA₂저해제)	PKLMEI
서열번호 5(PLA₂저해제)	GTLAKKLT
서열번호 6(안티플라민)	SHLRKVFDK
서열번호 7(안티플라민)	HDMNKVLDL
서열번호 8(안티플라민)	MQMKKVLDS
서열번호 9(안티플라민)	KVLD
서열번호 10(TGase 저해제)	PVKG
서열번호 11(TGase 저해제)	GQDP

실험예 1

TGase는 PLA₂를 활성화시키기 때문에 최대 항 염증 효과(maximum anti-inflammatory effect)를 얻기 위해서는 TGase의 활성을 억제해야 된다. 따라서 본 실험예에서는 숙시닐화 카제인(succinylated casein)내로의 [1,4]¹⁴C-퓨트레신 (putrescine) 의 도입을 측정함으로써 효소 활성을 측정하여 TGase 활성을 검사하였다. TGase로는 정제한 기니피그 간(liver) TGase(gpTGase 2, 시그마사 제품)를 사용하였다. 상기 실시예 및 비교예의 펩타이드 각각을 0.1M 트리스-아세테이트(Tris-acetate) pH 7.5, 1% 숙시닐화 카제인, 1 mM EDTA, 10 mM CaCl₂, 0.5% 루브롤(lubrol) PX, 5 mM DTT, 0.15 M NaCl 및 0.5 mCi¹⁴C-퓨트레신 (듀퐁-뉴 잉글랜드 뉴클리어사 제품, 윌밍톤, 독일 (118 Ci/mole))을 포함하는 반응 혼합물(0.5 ml)에 혼합하였다. 이후 37℃에서 1시간 인큐베이션하고, 찬(4℃) 7.5% TCA 4.5 ml를 첨가하여 반응을 종료하였다. TCA-불용성 침전물을 GF/A 글래스 화이버 필터로 모아, 찬 5% TCA로 세척하고, 건조한 후, TGase 활성에 대한 억제효과를 측정하였고, 이를 도 1에 나타내었다.

억제 활성을 측정하기 위해, TGase/펩타이드 혼합물을 기질에 첨가하기 전에 gpTGase 2를 합성 펩타이드(1×10^-6M)와 함께 37℃에서 15분간 프리-인큐베이트(pre-incubate)하였다. 콘트롤(control)은 버퍼와 함께 프리-인큐베이트하였다.

도 1에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 서열번호 1, 2 및 3의 펩타이드가 비교예의 펩타이드에 비해 TGase 활성을 현저히 감소시켰다.

실험예 2

200∼250g의 암컷 하틀리(Hartley) 기니피그(아산 생명과학 연구소)를 대상으로, 상기 기니피그의 콧구멍 및 하부 결막 포니스(conjunctival fornice)에 자이언트 돼지풀(giant ragweed) 꽃가루(Ambrosia trifida, 시그마사 제품) 1.0∼1.5mg을 1∼5일 및 8∼12일에 걸쳐 에펜도르프 마이크로 피렛으로 10㎕ 주입하여 면역화하였다.

15일째, 면역화된 기니피그를 6마리씩 14그룹으로 나누고, 상기 실시예 및 비교예의 펩타이드와 덱사메타손 점안액(Maxidex, 0.1% 덱사메타손, 알콘사 제품), 리보스틴(항히스타민제 점안액)의 항 염증효과를 비교 실험하였다. 모든 면역화한 기니피그의 하부 결막 포니스에 1.0∼1.5mg의 상기 자이언트 돼지풀 꽃가루를 주입하였다. 상기 펩타이드, 덱사메타손 점안액 및 항히스타민 점안액은 100μ몰/40㎕ 농도로 멸균 식염수에 용해하여, 15일째 마지막으로 꽃가루를 적용하기 3시간 전및 꽃가루 적용 후 10분후 주입하고, 3시간 간격으로 4회 주입하였다.

상기 실험에 대한 임상적 염증반응에 대한 결막부종(chemosis) 및 발적(redness)의 수는 통상의 현미경(Zeiss, 독일)으로 관찰하였고, 또한 상기 실험에 대한 조직학적 관찰은 통상의 광현미경으로 측정하였다. 절개된 샘플들은 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)으로 염색하였고, 결막 상피조직, 하부 상피조직 및 스트로마의 호산구 수를 400배율에서 측정하였다.

상기 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 서열번호 1, 2 및 3의 펩타이드가 비교예의 펩타이드에 비해 강력한 항 염증 효과를 나타내었다. 또한 본 발명에 따른 서열번호 2 및 3의 펩타이드는 강력한 스테로이드계 항 소염제인 덱사메타손 (dexamethasone)보다 우수한 항 염증 효과를 나타내었다.

이상에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1, 2 및 3의 펩타이드는 종래의 안티플라민 및 각종 소염제에 비해 월등한 항 염증효과를 나타내며, 여러종류의 염증성 질환에서 안전하고 강력한 소염제로서 사용 가능하다.

Claims

항 염증 효과가 있는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드.
항 염증 효과가 있는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드.
항 염증 효과가 있는, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드.
제1항 및 제3항중 어느 한항의 합성 펩타이드를 유효 성분으로 하는 항 염증 효과가 있는 약제학적 조성물.