CN102846596A - Jolkinolide B在制备细胞免疫抑制药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了JolkinolideB在制备细胞免疫抑制药物中的应用,JolkinolideB是中药狼毒大戟中的一种活性成分。经药效学表明,其能显著抑制PMA与Ionomycin诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖,具有细胞免疫抑制和体液免疫抑制作用。在临床上可望治疗各种自身免疫性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种中草药中活性成分的新的适应症,具体的说是中药狼毒大戟中活性成分Jolkinolide B在制备细胞免疫抑制药物中的应用。
背景技术
狼毒大戟又名“东北狼毒”,为大戟科植物狼毒大戟(Euphorbia fischeriana Steud)的干燥根,是中药狼毒的主流商品,分布于东北、河北和河南等省区,资源丰富,药源充足。狼毒始载于≤神农本草经≥,其性辛、味平,有大毒,具有逐水祛痰和破积杀虫的功效,主治水肿腹胀、痰食虫积、心腹疼痛、慢性气管炎、咳嗽、气喘,淋巴结、皮肤、骨、附睾等结核,疥廯,痔瘘等。制农药为杀虫、杀菌剂,能防治大豆蚜虫,小麦杆锈病,马铃薯晚疫病。近年临床多用于治疗肿瘤、皮肤病和结核病等恶性肿瘤,且效果显著,未发现对心、肝、肾等造血系统的不良反应。
在正常情况下,人体的免疫系统保护机体有三个方面的作用,即抵抗外来因子的防御作用,维持自身平衡和稳定作用,消除突变细胞的监视作用。一旦免疫反应异常,均能引起组织损害而致病,称免疫性疾病。免疫性疾病有两种,一种是免疫功能低下引起的,称免疫缺陷病;另一种是免疫功能超常引起的称自身免疫性疾病(自身免疫、超敏反应等)。自身免疫性疾病又分器官特异性和系统性自身免疫病两种,前者病变限于某一特定器官,后者病变危及多种器官和组织,如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、多肌炎等。(≤病理学≥、第三版、武忠弼主编,人民卫生出版社1995年4月出版)。
自身免疫病(Autoimmunity disease,AID)是严重危害人类健康的常见难治性疾病之一,目前尚无满意的治疗药物。长期以来,现代医学实施的标准治疗是激素非特异性免疫抑制疗法,但只能改善症状,却无法消除病根,且副作用较大。
关于大戟属植物化学成分的研究始于19世纪末,其主要生理活性成分为二萜酯类成分。狼毒大戟所公开的多是抗肿瘤活性。如≤狼毒对小鼠移植性肿瘤的影响≥一文指出狼毒大戟的水和醇提取物对小鼠移植性肝癌、肺癌细胞的生长均有一定抑制作用。腹腔注射、静脉注射和灌胃等不同给药方式,在一定剂量下均能抑制肿瘤生长,但以腹腔和静脉作用较强,灌胃给药作用较差(≤中西医结合杂志≥,1984,4(1):46~47.)。≤狼毒抗肿瘤作用的实验研究≥一文指出狼毒大戟醇提乙酸乙酯萃取物对S
180
、Lewis肺癌、艾氏腹水癌EAC、大鼠瓦克癌W256等多种动物移植性肿瘤有显著抑制作用,挥发油对S
180
、移植性Heps肝癌、艾氏腹水癌EAC等肿瘤细胞有较强抑制活性,对白血病模型无效(≤哈尔滨医科大学学报≥,1986,(4):66.)。≤狼毒大戟对L
615
白血病患鼠细胞增殖及肝肾中SOD,GSH-Px活性的回复作用≥一文表明狼毒大戟对L
615
白血病细胞体内增殖有较强的抑制作用,且与剂量相关,但不能完全阻止其增殖,并且受细胞攻击的小鼠肝中SOD和GSH-Px的活力也得以修复(≤山东医科大学学报≥,1998,36(4):289~292.)。≤狼毒大戟活性成分体外抗瘤研究≥一文指出狼毒大戟的活性成分体外处理人恶性组织细胞淋巴瘤U937细胞、子宫癌Hela细胞和肝癌QRH-7701细胞,均有不同程度的抑制作用(≤辽宁中医杂志≥.2002,29(1):53:54.)。
近年来,有关天然药物治疗自身免疫性疾病的相关研究是药学界的研究热点。从目前对天然药物治疗自身免疫病的相关药理学研究来看,天然药物比目前临床使用的西药有着明显的优势,其主要是通过免疫抑制、免疫调节、抗氧化、诱导细胞凋亡及影响神经递质而发挥治疗自身免疫疾病的作用。天然药物的免疫药理作用不是独立于其他功能的单一作用,而是紧密与神经、内分泌、免疫调节网络相联系的统一的功能体系。因此,国内外把从自然界中寻找治疗自身免疫性疾病的药物作为此类药物研究的首选方法。
辽宁中医学院刘桂芳等对狼毒大戟干燥根的抗癌活性成分进行过系统研究,从中分离出D、E、H均为Jolkinolide型二萜内酯,系首次从国产大戟属植物中得到。通过测定熔点、鉴别反应和波谱数据与文献比对后,确认其中D就是Jolkinolide B(≤狼毒大戟抗癌活性成分二萜内酯的分离鉴定≥.中药通报. 1988年5月,第13卷第5期.p35~36,39.)。
,中文名称为岩大戟内酯 B,化学结构为:
中国药科大学天然药物化学教研室潘勤等首次运用2D NMR技术和选用高灵敏度低噪音的二维脉冲序列、反式梯度场探头对狼毒大戟中的4种Jolkinolide型二萜NMR谱中
1
H、
13
C信号进行了准确归属(≤狼毒大戟中4种Jolkinolide型二萜的二维核磁共振研究≥.Journal of China Pharmaceutical University.2004,35(1):16~19.)。
等进一步发展Jolkinolides类化合物的合成技术,采用分子内Witting-Horner反应的策略,实现了A,B,C,E的全合成。作者先设计合成Jolkinolide E,然后通过环氧化Jolkinolide E实现Jolkinolide A的合成。Jolkinolide A通过mCPBA的氧化生成有双环氧结构的Jolkinolide B( Katsumura,S.;Sachihiko,I.Chem.Lett.1982,10,1689.)
发明内容
有实验证明狼毒大戟水浸液可能通过恢复T细胞免疫作用,增强免疫应答能力而产生抗白血病作用,并非通过增强巨噬细胞产生肿瘤坏死因子而起作用。邢氏观察了复方狼毒(ScL.co)对L1210、K562和Raji细胞系的作用,结果显示ScL.co能明显抑制L1210、K562和Raji细胞线粒体对MTT的代谢,且能明显抑制上述细胞系的增殖。同时发现以5g/kg剂量腹腔注射时,可使荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数升高(p<0.05),而在以10g/kg注射时,可使两项指标降低,说明ScL.co在适当剂量是有一定的免疫促进作用。鉴于此基础上,申请人对狼毒大戟提取液采用药效学的实验方法追踪活性部位,最终寻找到Jolkinolide B是狼毒大戟免疫抑制作用的有效成分。
研究结果表明,Jolkinolide B能显著抑制PMA 与Ionomycin诱导的小鼠脾淋巴细胞、血淋巴细胞增殖,可抑制细胞免疫及体液免疫,具有较强的免疫抑制作用,可作为免疫抑制剂使用。
附图说明
附图1为各组小鼠的脾脏细胞总数量图;
附图2为通过膜抗体指示血液中T细胞含量的流式结果对比图一;
附图3为通过膜抗体指示血液中T细胞含量的流式结果对比图二;
附图4为通过膜抗体指示血液中激活型CD8+T细胞含量的流式结果对比图;
附图5为通过膜抗体指示脾脏中T细胞含量的流式结果对比图一;
附图6为通过膜抗体指示脾脏中T细胞含量的流式结果对比图二;
附图7指示了小鼠血液中Th1、Th2细胞含量的流式结果对比图。
具体实施方式
一、制备Jolkinolide B单体:
能够采用下述两种方法:
方法一:狼毒大戟根的粗粉用乙醇回流提取得醇浸膏,浸膏用水混悬,以乙酸乙酯萃取,萃取物通过硅胶柱层析用石油醚-丙酮梯度洗脱,然后用石油醚-丙酮和甲醇重结晶得白色针状结晶Jolkinolide B。
方法二:狼毒大戟的干燥根,用蒸馏水浸泡过夜后,加入提取器加热回流提取约6小时左右,冷却后用纱布过滤。所得滤液静置沉降,上清液离心后,减压浓缩成一定体积后用乙醚萃取,采用硅胶柱层析,石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,其中石油醚-乙酸乙酯(17:3)得到目标产物Jolkinolide B粗品,采用无水乙醇和乙醚反复重结晶得针状目标化合物Jolkinolide B单体。
二、用Jolkinolide B进行免疫抑制作用的药效学实验如下:
1 实验材料
1.1 实验动物 C57小鼠,雌性;6-8W,18~20g/只。(上海斯莱克实验动物有限公司)
1.2 主要药品及试剂 Jolkinolide B由上述方法制备;无血清培养基:北京毕特博生物技术有限责任公司;小鼠的淋巴细胞分离液:北京冬歌生物科技有限公司;固定液:上海佳和生物科技有限公司;PMA 与Ionomycin:碧云天生物技术研究所。
实验方法
2.1 药物的配制与给药
1)称取115mg Jolkinolide B药物,用PBS溶液溶解,滴加NaOH使其溶解,并用HCl调PH至7.4,接着定容至46mL ;并用0.22um 的无菌小滤器过滤至无菌的EP管中,药物浓度为2.5mg/ml ,4℃保存备用;
2)将C57小鼠(6-8W,雌性)分成3组,每组5只:分别是Jolkinolide B (25mg/kg)、Jolkinolide B (50mg/kg)、PBS组;
3)腹腔注射给药物时,称取每只小鼠体重,并根据体重调整给药量(使得其终浓度是25mg/kg、50mg/kg)。
流式细胞仪检测
1)摘眼球取血,收集小鼠的全部血液,直至其死亡,在收集的血液中加小鼠淋巴细胞分离液1ml,2000rpm,25min离心,取PBMC(外周血单核细胞),并用PBS清洗1遍后,用细胞计数仪计数;
2)将小鼠放置在75%酒精中浸泡几分钟,消毒处理;
3)解剖小鼠,取其脾脏,加适量的无血清完全培养基,用磨砂玻片研磨成细胞悬液,于200目尼龙膜过滤,1200rpm,5min离心,去上清,并用PBS清洗1遍后,用细胞计数仪计数;
5)将计数好的血淋巴细胞、脾脏细胞以每孔10
5
-10
6
分别种于6孔板中,用PMA 与Ionomycin刺激,放置37℃,5%CO
2
的培养箱培养4~6小时;
6)收集细胞,PBS洗涤后,染色膜抗体,将膜抗体用荧光标记物标记:
CD3-PE、CD4-FITC、CD8-Percep;
CD4-PE、CD8- Percep、CD69-FITC
CD3-PE、NK1.1
CD11b-PE、CD11c- FITC
CD11b-PE、Gir-1- Percep
染色30min 之后,用PBS洗涤后上流式细胞仪(型号:BD CALIBUR)分析,观测染色情况:
7)等刺激的时间到,收集细胞,PBS洗涤,先染色CD4-FITC,膜染色,然后用固定液固定20min 后,破膜处理,然后胞内染色:INF-r-PE,IL-4-APC,染色,之后洗涤抗体,然后上流式分析;
3 实验结果:
3.1计数结果:
各组小鼠的脾脏细胞总数量如图1所示。
流式结果统计图:(*代表统计学有意义;**代表统计学有显著意义)
图2和图3表明:Jolkinolide B能降低小鼠血液中T细胞的含量,具有免疫抑制作用。
图4表明:Jolkinolide B能刺激小鼠血液中激活型CD8+T细胞,并使之其百分比上调。
图5和6表明:Jolkinolide B能降低了小鼠脾脏中T细胞含量,具有免疫抑制作用;但其上调了DC细胞的含量。
图7表明:Jolkinolide B能降低了小鼠血液中Th1、Th2细胞含量,具有免疫抑制作用。
综上所述:Jolkinolide B能总体上对免疫系统有抑制作用,也能上调CD8+T细胞以及DC的百分比,调节免疫系统发挥更强的抗肿瘤效应。
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