CN102319291A - 一种构树叶总酚酸提取物及其在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种构树叶总酚酸提取物及其在制备抗癌药物中的应用。按照下述(1)或(2)中的方法制备：(1)用乙醇水溶液对构树叶进行提取至少一次得提取液；浓缩所述提取液得浓缩液；所述浓缩液经正丁醇萃取后得萃取液即为所述构树叶总酚酸提取物；(2)用乙醇水溶液对构树叶进行提取至少一次得提取液；浓缩所述提取液得浓缩液；所述浓缩液用吸附树脂柱分离，洗脱剂依次为水、30％-70％乙醇水溶液和95％乙醇水溶液；收集30％-70％乙醇水溶液的洗脱液即为所述构树叶总酚酸提取物；所述吸附树脂为HPD100、HPD300和HPD700大孔吸附树脂中任一种。本发明提供的构树叶总酚酸提取物的抗癌活性大于其中的主要单体成分。

Description

一种构树叶总酚酸提取物及其在制备抗癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种构树叶总酚酸提取物及其在制备抗癌药物中的应用。

背景技术

构树(Broussonetia papyrifera(L.)Ven.t)为桑科构树属植物，在我国大部分地区有分布，日本、越南、印度等国亦有分布，资源十分丰富。构树的成熟果实，称为“楮实子”，收载于历版《中国药典》，为常见中药，具有补肾清肝、明目利尿的功效。构树叶又称为楮叶，性凉味甘，无毒，能清热利湿，凉血止血，杀虫解毒，可用于治疗吐血、衄血、血崩、外伤出血、水肿、疝气、痢疾和癣疮等。

从20世纪80年代开始，人们即开始对构树的化学和药理作用进行研究。如高允生等(高允生，邱玉芳，高聆，等.构叶醇提取物与黄酮苷对离体心房的抑制作用[J].中国药理学通报，1988，4(2)：122-123)。另外Lee等从构树的整株植物中分离得到了多个黄酮类化合物(Lee D，Bhat K，Fong H et al.Aromatase inhibitors fromBroussonetia papyrifera[J].J.Nat.Prod，2001，64(10)：1286-1293)，对构树叶的乙醇提取物(BPAE)与总黄酮苷(BPF)对家兔和豚鼠离体心房的作用进行了研究，发现BPAE和BPF均有抑制家兔和豚鼠心房收缩的作用，且BPF的效价强度远大于BPAE，证明了BPF是构树抑制心房收缩的主要有效成分，同时也说明了构树叶具有类似钙拮抗剂的作用。

由于环境污染等原因，癌症目前已成为严重威胁人类健康的疾病之一，为了更好地开发和利用构树叶资源，有必要对构树叶的成分进行活性研究。研究表明除黄酮类化合物外，一些木脂素类成分也具有较强活性，这些物质可统称为总酚酸类物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种构树叶总酚酸提取物及其在制备抗癌药物中的应用。

本发明提供的构树叶总酚酸提取物，按照下述(1)或(2)中的方法制备：

(1)用乙醇水溶液对构树叶进行提取至少一次得提取液；浓缩所述提取液得浓缩液；所述浓缩液经正丁醇萃取后得萃取液，即为所述构树叶总酚酸提取物；

(2)用乙醇水溶液对构树叶进行提取至少一次得提取液；浓缩所述提取液得浓缩液；所述浓缩液用大孔吸附树脂分离，洗脱剂依次为水、体积百分含量为30％-70％乙醇水溶液和体积百分含量为95％乙醇水溶液洗脱；收集30％-70％乙醇水溶液的洗脱液即为所述构树叶总酚酸提取物；所述大孔吸附树脂为HPD100、HPD300和HPD700大孔吸附树脂中任一种。

上述的提取物中，(1)中所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量可为40％-90％，优选40％-70％，如60％；(1)和(2)中所述提取可为回流提取；(1)和(2)中所述提取可为2次；(1)和(2)中所述提取的时间可为0.5小时-2小时，优选1小时。

上述的提取物中，(1)和(2)中所述浓缩液与所述提取液的体积份数比可为1∶(10-30)，最佳比例为1∶17；所述构树叶可为粉末状，其粒度可为2目-60目，优选2目-20目，便于有效成分的提取。

上述的提取物中，(1)和(2)中还可包括用石油醚对所述浓缩液进行脱脂的步骤；所述石油醚与所述浓缩液的体积份数比可为1∶(1-2)，优选1∶2。

上述的提取物中，(1)中所述正丁醇与所述浓缩液的体积份数比可为1∶(1-3)，优选1∶2，所述正丁醇萃取可为1-4次，优选3次。

上述的提取物中，(1)中还可包括将所述萃取液进行浓缩和干燥的步骤；(2)中还可包括将所述洗脱液进行浓缩和干燥的步骤。

上述的提取物中，所述提取物包括式(I)(大波斯菊苷)、式(II)(木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、式(III)(黑立脂素苷)、式(IV)(松脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖-4″-O-β-D-芹糖苷)、式(V)(R＝Glc(2-1)Rha，芹菜素-8-C-α-L-鼠李糖-(1→2)-O-β-D-葡萄糖碳苷)、式(VI)(木犀草素-6-C-β-D-葡萄糖碳苷)和式(VII)(R’＝Glc(2-1)Glc木犀草素-8-C-β-D-葡萄糖苷(1-2)-O-β-D-葡萄糖碳苷)，结构式如下：

其中，Glc代表β-D-葡萄糖；Rha代表α-L-鼠李糖；Api代表β-D-芹糖。

本发明还提供了上述提取物在制备抗癌药物中的应用；具体可为在抗肝癌、白血病和/或肿瘤药物中的应用。

本发明提供的构树叶总酚酸提取物的抗癌活性大于其中的主要单体成分(式(I)-式(VII)所示化合物)。由于酚酸具有较强的抗氧化和免疫增强作用，本发明提取物中的总酚酸将在多种机制上发挥其抗癌作用。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、构树叶总酚酸提取物的制备

将目数为20目的构树叶(含叶柄)粉末1kg，用乙醇的体积百分含量为60％的乙醇水溶液回流提取2次，每次用10倍药材体积量的上述乙醇水溶液回流提取2小时，合并提取液；回收乙醇水溶液，浓缩得浓缩液，浓缩液与回收的乙醇水溶液的体积份数比为1∶17；先用石油醚对上述浓缩液进行脱脂，其中，石油醚与浓缩液的体积份数比为1∶2；然后经水饱和的等量体积的正丁醇萃取三次(正丁醇与浓缩液的体积份数比为1∶2)，合并萃取液，减压浓缩回收正丁醇得到浸膏；将上述浸膏经减压干燥得构树叶总酚酸提取物135.2g。测得总酚酸为64.8g，在浸膏中重量百分比为47.9％。

采用比色法对上述构树叶总酚酸提取物的总酚酸进行含量测定，测定方法采用下述文献报道的比色法对总酚酸的含量进行测定：石玉媛，何凡，李莹莹，窦德强，康廷国，董锋.不同产地亚贡叶中总酚酸的含量测定.中华中医药学刊，2010，28(7)：1475-1477。该方法的简要操作过程如下：精密称取一定量的总酚酸提取物，制备样品溶液。精密量取1ml供试品溶液，于25ml量瓶中，加甲醇5ml，加0.3％十二烷基硫酸钠2ml后，然后加0.6％FeCl₃.6H₂O：0.9％K₃[Fe(CN)₆](1∶1，体积比)混合溶液2ml，在暗处放置5min，加0.1mol/l HCl溶液至刻度，在暗处放置20min，以显色剂为空白，以绿原酸为对品，在746nm处测定吸光度。

经核磁鉴定，提取物中包括式(I)、式(II)、式(III)、式(V)、式(VI)和式(VII)六种已知物质。

式(IV)所示化合物为新化合物，其核磁共振氢谱和碳谱数据如表1所示：

表1式(IV)所示化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR数据(DMSO-d₆，500MHz)

实施例2、构树叶总酚酸提取物的制备

将目数为20目的构树叶粉末1kg，乙醇的体积百分含量为60％的乙醇水溶液回流提取2次，每次用10倍体积量的上述60％乙醇水溶液提取2小时，合并提取液；回收乙醇溶液，浓缩得浓缩液，浓缩液与回收的乙醇水溶液的体积份数比为1∶17；先用石油醚对上述浓缩液进行脱脂得脱脂液，其中，石油醚与浓缩液的体积份数比为1∶2；脱脂液经已预先处理过的HPD700大孔吸附树脂柱，依次用水、60％的乙醇水溶液和95％的乙醇水溶液进行洗脱，60％的乙醇水溶液洗脱液减压回收乙醇，干燥得总酚酸提取物98.6g，测得总酚酸为57.1g，占所述干燥后的总酚酸提取物的重量百分比为57.9％。

经核磁鉴定，提取物中包括式(I)、式(II)、式(III)、式(V)、式(VI)和式(VII)六种已知物质。

式(IV)的核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。

实施例3、构树叶总酚酸提取物的体外抗癌活性研究

1、构树叶抗癌活性部位及活性成分的确定。

抗癌活性研究采用体外试验，试验中采用的HEPG-2肝癌细胞和HL-60白血病细胞均购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞生物学研究所。

活性成分：对实施例1中的石油醚层提取物、正丁醇层提取物和水层提取物(为正丁醇萃取后剩下的提取物)、实施例2制备的构树叶总酚酸提取物以及式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)和式(VI)所示化合物进行体外抗癌活性研究。

2、抗癌活性评价方法：

(1)试验用主要试剂：RMPI1640培养基(美国GIBCO公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；胰酶(美国Sigma公司)；噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司)；台盼蓝(宝泰克生物科技公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国AMRESCO公司)；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)。

(2)试验用主要仪器：日本SANYO CO₂培养箱、日本OLYMPUS倒置显微镜CKX31、Haier药品保存箱，酶标仪。

(3)MTT检测

待细胞培养至对数生长期后，贴壁细胞用0.25％的胰酶消化液消化约5min，加入10％胎牛血清RMPI1640培养基终止消化，吹打成细胞悬液，移入15ml离心管，1000转/min，离心5min(悬浮生长细胞无需消化，直接将细胞悬液移入15ml离心管，1000转，离心5min)弃上清，加入10％胎牛血清DMEM培养基，吹打混匀，制备成单细胞悬液，调整细胞悬液浓度为5.0×10⁴个/ml，将上述细胞悬液铺于96孔板中，每孔200μl，每组设3个孔；另留3个孔，各加入10％胎牛血清RMPI1640培养基200μl作为空白对照孔。继续培养24h后，实验组各组加入不同浓度的受试药物2ul，阴性对照组加入DMSO 2μl，阳性对照组加入对应的阳性药物2ul；继续培养24h，结束培养前4h取出培养板，每孔加入6mg/ml的MTT 15ul(避光)，继续培养，结束后，吸弃培养基，每孔加入DMSO 200μl，震荡摇匀，在酶标仪上以570nm的波长测定吸光度值。重复3次。计算生长抑制率，绘制量效曲线。

(4)数据处理：细胞生长抑制率计算公式

量效曲线绘制：取各组n(n≥3)次试验刺激指数的平均值

并计算标准差(s)，以牛蒡子苷元溶液各组终浓度为横坐标，癌细胞生长抑制率为纵坐标，绘制量效曲线，计算IC₅₀。

(5)结果：结果如下表1和表2所示，表明黄酮类成分和木脂素类成分都是抗癌活性成分，并且木脂素类成分活性较强。

表2不同提取物为10μg/ml的癌细胞增殖抑制率(％)

表3单体化合物抑制肿瘤细胞增殖作用的IC₅₀研究结果(μg/ml)

实施例4、构树叶总酚酸提取物的体内抗癌活性研究

用实施例2制备的构树叶总酚酸提取物对活性部位进一步采用S-180小鼠实验模型进行了抗癌药效试验。

1、供试品溶液的制备：按照实施例2制备所得构树叶总酚酸提取物。

2、阳性对照药物：5-氟尿嘧啶(购自Sigma公司，F6627-1G)，其配制方法为：50℃水浴助溶，加灭菌蒸馏水至浓度即为4mg/ml。

3、试验动物：6-8周龄健康昆明系小鼠，体重20～25g，雌性，由大连医科大学动物室提供。清洁级环境下进行饲养及试验操作，试验动物不限食水。试验室温度20～25℃，相对湿度40～70％，昼夜明暗交替时间12h/12h(执行标准：中华人民共和国国家标准试验动物环境及设施(GB 14925-2001)。

4、试验用主要试剂：RPMI-1640培养液、生理盐水等。

5、小鼠S180肉瘤细胞的培养和制备：取小鼠S180肉瘤细胞，应用RPMI-1640培养基在37℃恒温条件下培养，取对数生长期细胞用0.25％胰酶消化，制成细胞浓度为1×10⁶个/ml的细胞悬液，经体积分数为0.2％的台盼蓝染色，细胞存活率＞95％。

6、S180皮下移植瘤小鼠模型的建立：小鼠腹腔接种S180肉瘤细胞一周后，无菌条件下抽取小鼠腹水(乳白色)中的S180细胞，用无菌生理盐水按体积比1∶4的比例进行稀释，调整细胞浓度至1×10⁶个/ml的瘤细胞悬液，于小鼠右前肢腋下行无菌皮下接种，按常规每只小鼠接种0.2ml细胞悬液，细胞总数为2×10⁶个，以制备S180皮下移植瘤小鼠模型。

7、试验动物分组及处理：于接种当天将S180皮下移植瘤小鼠分为5组，每组8只。分别为：模型组、阳性对照组、构树叶总酚酸提取物高、中、低剂量组。模型组接种后第二天开始给予相同剂量0.5％CMC溶液，阳性对照组于接种第二天灌胃给予40mg/Kg的5-氟尿嘧啶。实验组于接种第二天开始分别灌胃给予30、60、120mg/Kg构树叶提取物。

8、S180皮下移植瘤小鼠瘤体积、瘤重及瘤重抑瘤率的计算方法：停药次日处死小鼠，分别取出肿瘤瘤体，剥离干净后，以滤纸拭净血污，用游标卡尺测量各组肿瘤体积，肿瘤体积公式为：V＝1/2×a×b²(a：长径，b：短径)。电子天平称取瘤重，计算肿瘤瘤重生长抑制率(瘤重抑瘤率)，抑瘤率(％)＝(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。

9、统计分析与结果评价：试验数据采用SPSS 16.0统计分析软件包进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两两比较采用student-Newman-Keuls法；设定α＝0.05为检验水准，P＞0.05差异无显著性，P＜0.05差异具有显著性。比较各组间肿瘤体积、相对肿瘤体积和相对肿瘤增值率，分析评价牛蒡苷元及牛蒡苷抑制肿瘤生长作用及量效关系。

10、结果：由表4可见，与模型组比，各组小鼠的体重增长速度未见明显的差异；除低剂量组外，5-氟尿嘧啶阳性对照组、构树叶提取物的中、高剂量组对S180皮下移植瘤小鼠的平均瘤体积、瘤重有明显的抑制作用，显示出较高的瘤重抑瘤率(P＜0.05或p＜0.01)，且提取物对S180皮下移植瘤小鼠的平均瘤体积、瘤重的抑制作用显示出一定的剂量依赖关系；构树叶提取物高剂量组对S180皮下移植瘤小鼠的瘤重抑瘤率略高于5-氟尿嘧啶阳性对照组，但无显著性差异；提取物低剂量组尽管对S180皮下移植瘤小鼠的平均瘤体积、瘤重的抑制作用无明显的统计学差异(p＞0.05)，但从数值上看，提取物中、高剂量组比对移植瘤小鼠的瘤重抑瘤率影响差异不显著。

表4牛蒡苷元及牛蒡苷对S180皮下移植瘤小鼠体重、瘤体积、瘤重及瘤重抑瘤率的影响

注：与模型组比：^*P＜0.05，^**P＜0.01方法与结果。

实施例5、构树叶总酚酸抗癌制剂的研究

1、仪器和试剂：仪器有TDP-5T单冲压片机(上海冠联制药装备有限公司)；FA-1004型电子天平(上海精科天平厂)；水浴锅(巩义市予化仪器有限责任公司)；DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱。试验中所用试剂均为分析纯，购于禹王试剂公司。

2、片剂制备：按照实施例2所得构树叶总酚酸提取物2g，CMS-Na 1g，乳糖和淀粉(1∶1，质量比)17g共计20g，用25％乙醇制软材，以捏之成团，搓之即散做为成型标准，将制好的颗粒于60℃烘干，10目筛整粒，备用；

将制好的颗粒按照称重好的质量加入0.5％的硬脂酸镁，以不同规格的压片机压片，分别制备片重为400毫克/片、200毫克/片和100毫克/片的片剂，压力在16～18kg/片。片剂中每400毫克含提取物40毫克。结合症状，每次2-3片(400毫克片)，每日3次。

3、胶囊剂的制备若以上述制备好的颗粒采用胶囊机装胶囊，可制备400毫克/囊的胶囊剂。结合症状，每次2-3片，每日3次。

4、口服液的制备：以上述构树叶总酚酸提取物20克，加水300毫升溶解，加橙皮苷4毫升，加单糖浆至1000毫升得糖浆剂。结合症状，每次6毫升，每日3次。

Claims (10)

1.一种构树叶总酚酸提取物，按照下述(1)或(2)中的方法制备：

(1)用乙醇水溶液对构树叶进行提取至少一次得提取液；浓缩所述提取液得浓缩液；所述浓缩液经正丁醇萃取后得萃取液即为所述构树叶总酚酸提取物；

(2)用乙醇水溶液对构树叶进行提取至少一次得提取液；浓缩所述提取液得浓缩液；所述浓缩液用大孔吸附树脂分离，洗脱剂依次为水、体积百分含量为30％-70％乙醇水溶液和体积百分含量为95％乙醇水溶液；收集体积百分含量为30％-70％乙醇水溶液的洗脱液即为所述构树叶总酚酸提取物；所述大孔吸附树脂为HPD100、HPD300和HPD700大孔吸附树脂中任一种。

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：(1)和(2)中所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量均为40％-90％；(1)和(2)中所述提取为回流提取；(1)和(2)中所述提取为2次；(1)和(2)中所述提取的时间为0.5小时-2小时。

3.根据权利要求1或2所述的提取物，其特征在于：(1)和(2)中所述浓缩液与所述提取液的体积份数比为1∶(10-30)；所述构树叶为粉末状，其粒度为2目-60目。

4.根据权利要求1-3中任一所述的提取物，其特征在于：(1)和(2)中还包括用石油醚对所述浓缩液进行脱脂的步骤；所述石油醚与所述浓缩液的体积份数比为1∶(1-2)。

5.根据权利要求1-4中任一所述的提取物，其特征在于：(1)中所述正丁醇与所述浓缩液的体积份数比为1∶(1-3)；所述正丁醇萃取为3次。

6.根据权利要求1-5中任一所述的提取物，其特征在于：(1)中还包括将所述萃取液进行浓缩和干燥的步骤；(2)中还包括将所述洗脱液进行浓缩和干燥的步骤。

7.根据权利要求1-6中任一所述的提取物，其特征在于：所述提取物包括式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)和式(VII)所示化合物：

其中，R为Glc(2-1)Rba；R’为Glc(2-1)Glc；Glc代表β-D-葡萄糖；Rba代表α-L-鼠李糖；Api代表β-D-芹糖。

8.权利要求1-7中任一所述提取物在制备抗癌药物中的应用。

9.一种抗癌药物，其活性成分为权利要求1-7中任一所述提取物。

10.一种抗癌药物，其包括权利要求1-7中任一所述提取物和医药上可接受的载体或赋形剂。