CN107536992A - 山姜提取物的应用及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种山姜提取物的应用,其特征在于,所述山姜提取物含有山姜总苯丙素,所述山姜提取物用于制备降尿酸和抗痛风的药物。本发明研究发现:山姜总苯丙素、山姜总黄酮和山姜总苯丙素的混合物、山姜醇提物及山姜总酚酸提取物具有极显著的降尿酸效果,比所有已知的降尿酸植物提取物均要明显,甚至远超阳性药别嘌醇的效果,且还有较好的保护肾功能和抗痛风的作用,真正达到了安全有效的目的,极具开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于中药提取物领域,具体涉及一种山姜提取物的应用及其制备方法。
背景技术
高尿酸血症最有代表性的特点是循环血液中的尿酸高出正常水平(大于7.0mg/dl)并长时间维持。人体嘌呤代谢合成尿酸以及尿酸从体内排出这两者的代谢速度之间的动态关系决定了循环血液中的尿酸含量多少。人体循环血液的尿酸的积聚一般来说,可以归于下面几种原因:①体外的嘌呤摄入过多,也就是人体大量进食嘌呤含量比较丰富的食品;②体内的嘌呤代谢生成升高,其大部分是因为人体嘌呤代谢的一系列生化作用中的相关酶类异常而发生的,这种异常直接引起核酸分解的速度加快以及嘌呤代谢生成尿酸的反应异常;③尿酸的排出量下降,循环血液中的尿酸主要经肾脏过滤后随尿液排出体外,肾脏过滤过程中如果对尿酸的重吸收增多,则血尿酸排出减少,血尿酸积累可上升。
随着社会经济与科技水平不断发展,人类寿命平均水平也比过去有所提高,随之而来的是社会老龄化的问题。经济发展,人们饮食状况的提高已经到了过犹不及过的水平,营养摄入过剩,造就了诸多老年性疾病,如高血压、动肪粥样硬化、糖尿病、高脂血症等。这些疾病的高度流行无一不对人们的生活质量和社会的发展带来负担。大量的流行病学分析报道指出,高尿酸血症并不是孤立单一的疾病,除了进一步诱发成痛风,它还与前面所提及的疾病有不可分割的联系。高尿酸血症是常见的慢性疾病,它在发病初期可以长期保持无症状状况,因而不易被患者所注意,直到发展到痛风发作,疼痛剧烈才被觉察。因此,长期的体内高尿酸状况可能导致身体出现上述的诸多老年性的疾病,疾病发展下去,有可能演变为肾功能不全等病危症状,危害生命。
高尿酸血症与痛风的治疗包括饮食疗法与药物治疗两部分。对于无症状的高尿酸血症患者,多数学者主张采用饮食疗法,即限制嘌呤摄入。而痛风则应严格在饮食疗法的基础上,加用有针对性的药物治疗。
秋水仙碱治疗目的是迅速终止痛风的发作。主要用于治疗和预防痛风和家族性地中海热,它的作用机制包括对化学因子的调控,前列腺素的合成和中性粒细胞粘附分子的抑制作用,而这些粘附分子参与了关节炎症的发生和发展。秋水仙碱对控制痛风有非常显著的疗效,适用于痛风性关节炎的急性发预防复发性痛风性关节炎的急性发作,为痛风急性关节炎期的首选药。
不良反应有:①胃肠道症状:腹泻、腹痛、呕吐及食欲减退为常见的早期不良反应,发生率可达80%,严重者可造成脱水及电解质紊乱等表现。长期服用者可出现严重的出血性胃肠炎和吸收不良综合症。②肌肉、周围神经病变。③骨髓抑制:出现血小板减少,中性白细胞下降,甚至再生障碍性贫血。④休克。⑤静脉炎、蜂窝织炎。⑥致畸。⑦其他致死、脱发、皮疹及发热等,比较少见。
非甾体类抗炎药主要为解热镇痛类药物,它们不仅是抗风湿药物中的一个主要部分,亦用于各种原因引起的骨骼系统或该系统以外的急性至中等度疼痛,甚至对一些癌症性疼痛亦有一定的作用。主要有:阿司匹林(Aspirin)、吡罗昔康(炎痛喜康piroxicam)、萘普生(naproxen)、吲哚美辛(消炎痛indomethacin)、阿西美辛(acemetacin)、布洛芬(异丁苯丙酸ibuprofen)、酮洛芬(酮基布洛芬etoprofen)、非诺洛芬钙(苯氧布洛芬钙fenoprofen calcium)、芬不芬(fellbufell)、奥沙普秦(oxaprozin)、双氯芬酸钠(diclofenac sodium)、萘丁美酮(nabumetone)等。
它们的主要副作用包括过敏反应、消化道出血等。故有消化性溃疡病史、肾脏疾病、肝脏疾病、心功能不全以及服用抗凝药物的患者慎用。老年患者用药后副作用相对明显,也应当慎用。
糖皮质激素对秋水仙碱和非甾体类消炎镇痛药物治疗无效或有禁忌证者可考虑短期使用。
主要副作用有:①皮质功能亢进综合征。满月脸、水牛背、高血压、多毛、糖尿、皮肤变薄等。为GCS引起的代谢紊乱所致。②诱发或加重感染。③诱发或加重溃疡病。④诱发高血压和动脉硬化。⑤骨质疏松、肌肉萎缩、伤口愈合延缓。⑥诱发精神病和癫痫。
抑制尿酸合成的药物现在上市的抑制尿酸生成的药有别嘌呤醇,适用于尿酸生成过多,排尿酸药可导致变态反应或无效,以及不适宜使用排尿酸药的患者。Cardiome公司研制的奥昔嘌醇(Oxypurinol)是别嘌呤醇的活性代谢物,适用于别嘌呤醇治疗无效的患者。该类药物的作用机制是通过抑制XO的活性来减少尿酸生成,作用靶点为XO,此靶点一直是制药企业降尿酸药研发关注的目标。主要毒副作用有:肝、肾功能损害(如间质性肾炎)及骨髓抑制等。过去认为适用于肾功能减退的痛风患者,但近年来对其严重的毒副作用认识更加深刻,限制了它在痛风缓解期的应用。
促进尿酸排泄药物适用于血尿酸增高,肾功能尚好,每日尿酸排出不多的患者。有磺酰类化合物丙磺舒、苯磺唑酮;苯溴香豆酮类苯溴马隆。
此类药最大的缺点是排泄的尿酸盐晶体易在尿路沉积,引发肾绞痛和肾功能损害。最近欧洲临床研究发现,苯溴马隆有引起爆发性肝炎的危险,已从部分欧洲市场撤出。有报道称非诺贝特、洛沙坦也可以促进尿酸排泄。该类药物的作用机制是抑制肾近曲小管对尿酸的重吸收而促进尿酸排泄,作用靶点为肾近曲小管上尿酸盐转运体,现已成为降尿酸药研发的重要目标。
尿酸氧化酶因人体内缺乏此酶,不能将嘌呤代谢产生的尿酸氧化分解为极易溶于水的尿囊素随尿排出体外。通过补充尿酸氧化酶将体内尿酸分解为尿囊素排出体外而降尿酸,这是高尿酸血症治疗的又一策略。将黄曲霉菌的cDNA克隆通过酵母菌生物合成得到的重组尿酸氧化酶具有作用迅速、持久,变态反应发生率低的特点,用于治疗白血病和淋巴瘤化疗患者的高尿酸血症。
此酶是一种黄曲霉菌培养的非重组性酶,降尿酸的作用强于别嘌呤醇,但因其潜在的免疫原性,现正在尝试用甲氧基聚乙二醇共价结合,以改变其免疫原性。
中药及天然产物有研究报道,一些中药通过抑制XO的活性而发挥作用,如肉桂细枝甲醇提取物(IC50为18g·L-1)、野菊花(IC50为22g·L-1)、泽兰(IC50为26g·L-1)、虎杖水提取物(IC50为38g·L-1)等。黄柏与二妙丸的水提物和秦皮素苷对氧嗪酸钾盐诱导的高尿酸血症模型小鼠有明显的降尿酸作用。从葡萄籽提取的原花青素,植物提取的黄酮类、槲皮素、紫槲皮苷,从蜂蜜提取的蜂胶可抑制肝脏的XO,降低高尿酸血症模型小鼠血液尿酸水平。
另有报道称雌激素具有促进肾脏排出尿酸的作用,患高尿酸血症的绝经后妇女应用激素替代治疗,亦可降低血尿酸水平。
在使用排尿酸药和抑制尿酸药期间,尚可诱发痛风急性发作,可加用秋水仙碱或非甾体抗炎药,排尿酸药和抑制尿酸药不必停用。此外,缓解期对痛风患者肾功能的保护应引起足够的重视(应注意避免使用对肾功能有损害的药物)。目前对缓解期的治疗,现代医学尚未发现既能控制尿酸,又能保护肾功能的有效药物和方法。
总之,西药机理明确,但毒副作用明显,若大量或长期服用,极易对人体造成较为严重的毒副作用;中药有明确疗效,毒副作用小,但有效成分与作用机理急需阐明。
山姜为姜科多年生草本植物山姜属(Alpinia)的根茎,如我国常见的Alpiniaofficinarum Hance、Alpinia galanga(Linnaeus)Willdenow、Alpinia aquatica(Koen.)Rosc.、Alpinia chinensis(Retz.)Rosc.、Alpinia chinghsiensis D.Fang、Alpiniapolyantha D.Fang、Alpinia psilogyna D.Fang、Alpinia intermedia Gagnep.、Alpiniatonkinensis Gagnep.或Alpinia japonica(Thunb.)Miq.)等。繁殖能力很强,比较适宜在温暖湿润的环境中生长,在亚热带地区的分布比较广泛,我国主要分布在云南、广东、广西、福建、台湾等省。山姜属植物常作为调味料在食品和烹调中使用,比较有名的菜肴如南姜鸡、南姜酱料、卤味拼盘等就是用它作调味料;同时山姜属植物也是重要的中药材,有暖胃散寒,止痛等功效,主要用于治疗胃院冷痛,伤食吐泻等症,现代药理研究表明,山姜属植物很多具有祛痰、抗溃疡、抗菌、抗肿瘤等功效。化学成分研究表明,山姜属植物主要含有苯丙素类、姜酚类、黄酮类及植物色素等成分。
但尚未见有文献报道山姜属植物具有降尿酸与抗痛风的药理作用。我们在前期的药物筛选过程中,发现山姜属植物的醇提物及其总酚酸部位具有极显著的降尿酸效果,比所有已知的降尿酸植物提取物均要明显,甚至远超阳性药别嘌醇的效果,且还有较好的保护肾功和抗痛风的作用,真正达到了安全有效的目的,极具开发应用前景,本发明以姜科多年生草本植物Alpinia galanga(Linnaeus)Willdenow的根茎作为研究对象,对本发明做一说明,但不仅限于Alpinia galanga(Linnaeus)Willdenow,而以山姜属植物作为大的保护范围。
发明内容
本发明提供了一种山姜提取物的应用,所述山姜提取物含有山姜总苯丙素,所述山姜提取物用于制备降尿酸和抗痛风的药物。
本发明还提供了另一种山姜提取物的应用,所述山姜提取物含有山姜总黄酮和山姜总苯丙素的混合物,所述山姜提取物用于制备降尿酸和抗痛风的药物。
优选地,所述山姜提取物为山姜总黄酮和山姜总苯丙素质量比为3:1~1:3的混合物。
优选地,所述山姜提取物为山姜总黄酮和山姜总苯丙素质量比为2:1~1:2的混合物。
本发明还提供另一种山姜提取物的应用,所述山姜提取物含有具有式1~3结构的化合物中的一种或其组合,所述山姜提取物用于制备降尿酸和抗痛风的药物。
式1中,R1为-H,R2为-CHO;或者,R1为-AC,R2为-CH2OH;或者,
R1为-AC,R2为-CH2OAC
本发明还提供另一种山姜提取物的应用,所述山姜提取物为山姜总酚
酸提取物;所述山姜总酚酸提取物用于制备降尿酸和抗痛风的药物;
其中,所述山姜总酚酸提取物含有山姜总黄酮和山姜总苯丙素,且该两类化合物的质量之和应不低于山姜总酚酸提取物质量的50%。
优选地,所述山姜总酚酸提取物中山姜总黄酮和山姜总苯丙素的质量比为2:1~1:2。
优选地,所述山姜提取物为山姜醇提物,所述山姜醇提物用于制备降尿酸和抗痛风的药物;其中,所述山姜醇提物的制备方法为:干燥山姜药材粉碎后,用体积百分比浓度为30%-60%的乙醇水溶液提取,提取液过滤并回收乙醇后,得山姜醇提物。更优选地,所述山姜醇提物的制备方法为:干燥山姜药材粉碎后,用体积百分比浓度为30%-60%的乙醇水溶液提取2次,所用乙醇水溶液的质量依次为山姜药材质量的12倍,10倍,每次提取的回流时间依次为2h,1.5h,将2次提取液过滤后合并,回收乙醇,得山姜醇提物。
所述山姜提取物是指姜科山姜属多年生草本植物的根茎提取物。所述姜科山姜属多年生草本植物为:Alpinia officinarum Hance、Alpinia galanga(Linnaeus)Willdenow、Alpinia aquatica(Koen.)Rosc.、Alpinia chinensis(Retz.)Rosc.、Alpiniachinghsiensis D.Fang、Alpinia polyantha D.Fang、Alpinia psilogyna D.Fang、Alpinia intermedia Gagnep.、Alpinia tonkinensis Gagnep.或Alpinia japonica(Thunb.)Miq.)
本发明提供制备山姜总酚酸提取物的方法,包括如下步骤:
(1)干燥山姜药材粉碎后,用体积百分比浓度为30%-60%的乙醇水溶液提取,提取液过滤并回收乙醇后,得山姜醇提物;
(2)山姜醇提物加水调节浓度,上HPD100大孔吸附树脂柱吸附后,以水洗脱,然后以体积百分比浓度为5~15%的乙醇水溶液洗脱,再以体积百分比浓度为50~70%的乙醇水溶液洗脱,收集50-70%的乙醇水溶液洗脱液,减压回收至无醇味,得到HPD100树脂洗脱液,干燥,即得山姜总酚酸提取物。
优选地,所述山姜总酚酸提取物的制备方法包括如下步骤:
(1)干燥山姜药材粉碎后,用体积百分比浓度为30%-60%的乙醇水溶液提取2次,所用乙醇水溶液的质量依次为山姜药材质量的12倍,10倍,每次提取的回流时间依次为2h,1.5h,将2次提取液过滤后合并,回收乙醇,得山姜醇提物;
(2)将山姜醇提物加水调节浓度为0.01g药材/mL,同时调节液体的pH为3-4,上HPD100树脂柱吸附,先用2-4倍量的纯水洗脱,再用1-3倍量柱体积的体积百分比浓度为5-15%的乙醇水溶液洗脱,再用2-4倍量柱体积的体积百分比浓度50-70%的乙醇水溶液洗脱。收集50-70%的乙醇水溶液洗脱液,减压回收至无醇味,得到HPD100树脂洗脱液,该树脂液喷雾干燥即得山姜总酚酸提取物。
本发明还提供制备山姜总苯丙素和山姜总黄酮的方法,包括如下步骤:
(1)干燥山姜药材粉碎后,用体积百分比浓度为30%-60%的乙醇水溶液提取,提取液过滤并回收乙醇后,得山姜醇提物;
(2)山姜醇提物加水调节浓度,上HPD100大孔吸附树脂柱吸附后,以水洗脱,然后以体积百分比浓度为5~15%的乙醇水溶液洗脱,再以体积百分比浓度为50~70%的乙醇水溶液洗脱,收集50-70%的乙醇水溶液洗脱液,减压回收至无醇味,得到HPD100树脂洗脱液;
(3)HPD100树脂洗脱液调节浓度后,上100目聚酰胺柱吸附,先用水洗脱,再分别以体积百分比浓度为5-15%乙醇水溶液、体积百分比浓度为20-40%的乙醇水溶液及体积百分比浓度为60-80%的乙醇水溶液洗脱;收集20-40%的乙醇洗脱液,减压回收,再冷冻干燥,得山姜总苯丙素;收集60-80%%的乙醇洗脱液,减压回收,再冷冻干燥,得山姜总黄酮。
优选地,所述山姜总黄酮与总苯丙素的制备方法包括如下步骤:
(1)干燥山姜药材粉碎后,用体积百分比浓度为30%-60%的乙醇水溶液提取2次,所用乙醇水溶液的质量依次为山姜药材质量的12倍,10倍,每次提取的回流时间依次为2h,1.5h,将2次提取液过滤后合并,回收乙醇,得山姜醇提物;
(2)将山姜醇提物加水调节浓度为0.01g药材/mL,同时调节液体的pH为3-4,上HPD100树脂柱吸附,先用2-4倍量的纯水洗脱,再用1-3倍量柱体积的体积百分比浓度为5-15%的乙醇水溶液洗脱,再用2-4倍量柱体积的体积百分比浓度50-70%的乙醇水溶液洗脱。收集50-70%的乙醇水溶液洗脱液,减压回收至无醇味,得到HPD100树脂洗脱液,该树脂液喷雾干燥即得山姜总酚酸提取物。
(3)将上述HPD100树脂洗脱液调节至浓度为0.02g药材/mL,上80-150目聚酰胺柱,先用1-3倍柱体积的纯水洗脱,再分别用2-4倍柱体积的5-15%乙醇、4-6倍柱体积的20-40%乙醇及3-5倍柱体积的60-80%乙醇洗脱。收集20-40%的乙醇洗脱液,减压回收至少量体积后,再冷冻干燥,得山姜总苯丙素部位;收集60-80%的乙醇洗脱液,减压回收至少量体积后,再冷冻干燥,得山姜总黄酮部位。所述山姜药材为姜科山姜属多年生草本植物的根茎。姜科山姜属多年生草本植物为Alpinia officinarum Hance、Alpinia galanga(Linnaeus)Willdenow、Alpinia aquatica(Koen.)Rosc.、Alpinia chinensis(Retz.)Rosc.、Alpinia chinghsiensis D.Fang、Alpinia polyantha D.Fang、Alpinia psilogynaD.Fang、Alpinia intermedia Gagnep.、Alpinia tonkinensis Gagnep.或Alpiniajaponica(Thunb.)Miq.。
本发明的有益效果:本发明研究发现,山姜总苯丙素、山姜总黄酮和山姜总苯丙素的混合物、山姜醇提物及山姜总酚酸提取物具有极显著的降尿酸效果,比所有已知的降尿酸植物提取物均要明显,甚至远超阳性药别嘌醇的效果,且还有较好的保护肾功能和抗痛风的作用,真正达到了安全有效的目的,极具开发应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1山姜醇提物的制备
山姜购于亳州药材市场,经鉴定为姜科多年生草本植物山姜(Alpinia galanga(Linnaeus)Willdenow)的根茎。药材干燥后,粉碎机粉碎,过20目筛,用体积百分浓度为50%的乙醇水溶液提取2次,所用乙醇溶液的质量依次为山姜药材质量的12倍,10倍,每次提取的回流时间一次为2h,1.5h,将2次提取液过滤后合并,回收乙醇,得山姜醇提物。
(下文中所提到的“X%的乙醇”均是指体积百分比浓度为X%的乙醇水溶液)
实施例2山姜总酚酸的制备
实施例1中的山姜醇提物依次经HPD100大孔吸附树脂富精制获得山姜总酚酸;
HPD100大孔吸附树脂纯化流程为:将山姜醇提物加纯水调节浓度为0.01g药材/mL,同时用1%的硫酸水溶液调节液体的pH为4,上HPD100树脂柱吸附,先用3倍柱体积的纯水洗脱,再用2倍量柱体积的20%乙醇洗脱,再用3倍量柱体积的60%乙醇洗脱。收集60%的乙醇洗脱液,减压回收至无醇味,得到HPD100树脂洗脱液,该树脂液喷雾干燥即得山姜总酚酸;
实施例3山姜总黄酮部位与总苯丙素部位的制备
将实施例2中的HPD100树脂洗脱液调节至浓度为0.02g药材/mL,上100目聚酰胺柱,先用2倍柱体积的水洗脱,再分别用3倍柱体积的10%乙醇、5倍柱体积的30%乙醇及4倍柱体积的70%乙醇洗脱。收集30%的乙醇洗脱液,减压回收至少量体积后,再冷冻干燥,得山姜总苯丙素部位;收集70%的乙醇洗脱液,减压回收至少量体积后,再冷冻干燥,得山姜总黄酮部位。
实施例4山姜总苯丙素类化合物的分离纯化与鉴定
称取实施例3中山姜总苯丙素200g,经反复硅胶和Sephadex LH-20柱色谱纯化,从氯仿-甲醇(95:5)洗脱部分分离得到化合物1(1.5g),2(5.1g),3(3.8g),4(1.1g),5(0.8g)。经波谱鉴定及与文献比对,确定化合物1-5分别为trans-p-hydroxy-cinnamaldehyde(TC),(E)-4-acetoxy cinnamyl alcohol(EA),4-acetoxy cinnamyl acetate(AC),4,4’[(2E,2'E)-bis(prop-2-ene)-1,1'-oxy]-diphenyl-7,7'-diacetate(DD),p-hydroxybenzaldehyde(HD)结构式如下:
化合物1~3
化合物1中,R1为-H,R2为-CHO;
化合物2中,R1为-AC,R2为-CH2OH;
化合物3中,R1为-AC,R2为-CH2OAC
实施例5山姜总酚酸、总黄酮与总苯丙素部位的纯度测定
准确称取4mg芦丁标准品,用60%的乙醇溶解定容至25mL容量瓶中,摇匀,即得芦丁标准品溶液,其浓度大小为0.16mg/mL。用60%的乙醇溶解适量山姜总酚酸和山姜总黄酮,吸取两者的溶解液和芦丁标准对照品溶液各0.5mL,置于10mL的具塞试管中,加入0.3mL5%的亚硝酸钠溶液,振荡摇匀静置6min后,再滴加0.3mL10%的硝酸铝溶液,摇匀,放置6min后,加入5mL 1mol/L的氢氧化钠溶液,最后用蒸馏水定容至刻度,15min后,以不加样品为对照在510nm波长下测定吸光度值,通过芦丁标准曲线计算黄酮提取率。经测定,山姜总酚酸部位中总黄酮的含量为48%,总黄酮部位中总黄酮的含量为76%。
准确称取10.0mg化合物1作为对照品,用甲醇溶解定容至25mL容量瓶中,摇匀,即得化合物1对照品溶液,其浓度大小为0.4mg/mL。用甲醇溶解适量山姜总酚酸和山姜总苯丙素,吸取两者的溶解液和化合物1对照品溶液各0.5mL,置于10mL的具塞试管中,用甲醇定容,振荡摇匀,紫外分光光度计260nm波段测定,用甲醇做空白对照液。经测定,山姜总酚酸部位中总苯丙素的含量为32%,总苯丙素部位中总苯丙素的含量为70%。
实施例6山姜醇提物、总酚酸、总黄酮、总苯丙素、不同配比的总黄酮和总苯丙素及化合物1-5降尿酸实验研究
1仪器、材料与试药
1.1仪器和材料
Tissue-Tearor型手持高速组织匀浆机(北京市世安科兴科技开发有限公司),TDL80-2B型台式离心机(上海安亭科技仪器厂),BS124S型电子天平(SartoriusCorporation,Germany),KD-160型鼠称(TANITA公司),Mni shaker培养板振荡器(Kylin-Bell Lab Instruments,海门市其林贝尔仪器制造有限公司),WH-2型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂),DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科技术有限公司),DG5033A型酶标仪(华东电子),96孔细胞培养板(Corporation,USA),50μL、200μL、1000μL移液器(Thermo Electron Corporation,USA),HH-4型恒温水浴锅(常州国华电器有限公司),MILLI-Q Biocel型超纯水装置(Millipore,USA),其它常用器具(手术器械、温度计、离心管、离心管架、烧杯、移液枪头、注射剂、小鼠灌胃针和量筒等)。
1.2试药
别嘌醇片(批号:20150908,江苏方强制药厂有限责任公司),氧嗪酸钾(AR,批号:120202,纯度≥99%,Amresco公司),羧甲基纤维素钠(CMC-Na,分子量300-800,中国医药集团上海化学试剂公司),食用级乙醇(南京鼎新化工轻工有限公司),氯化钠(AR,南京化学试剂有限公司),尿酸测定试剂盒(南京建成生物科技有限公司,批号:20160108)。
1.3实验动物
昆明种雄性小鼠,体重18~22g(华中科技大学实验动物中心提供,动物生产许可证SCXK(鄂)2010-0009)。
2.实验溶液配制
2.1 0.5%的CMC-Na溶液配制
称取CMC-Na 2.5g加入500mL纯净水中,加热,超声使其溶解,静置过夜。
2.2生理盐水的配制
称取NaCl 4.5041g,溶于500mL纯净水中即得。
2.3山姜醇提物供试液制备
称取实施例1中的山姜醇提物适量,用CMC-Na溶液稀释至浓度为0.1g生药材/mL浓度样品液。山姜醇提物的得率为20%(与生药材比较)。
2.4山姜总酚酸供试液制备
称取实施例2中的山姜总酚酸提取物适量,用CMC-Na溶液稀释至浓度为0.1g生药材/mL浓度样品液。山姜总酚酸提取物的得率为10%(与生药材比较)。
2.5山姜总黄酮与总苯丙素供试液制备
称取实施例3中的山姜总黄酮与总苯丙素部位适量,用CMC-Na溶液稀释至浓度为0.1g生药材/mL浓度样品液。山姜总黄酮与总苯丙素的得率分别为4.2%与3.5%(与生药材比较)。
2.6不同配比的总黄酮和总苯丙素供试液制备
称取实施例3中的山姜总黄酮与总苯丙素部位适量,使两者的质量总和为154mg。按照山姜总黄酮:山姜总苯丙素质量比分别为3:1,2:1,1:1,1:2,1:3分别组合而成,上述5种不同配比的药物分别154mg溶解于20mL CMC-Na溶液中,即得。
2.7山姜苯丙素类化合物1-5的供试液制备
称取实施例4中的化合物1-5各30mg,分别加入20mL CMC-Na溶液稀释,配制成浓度为1.5mg/mL的化合物1-5供试品溶液。
2.8别嘌醇溶液的制备(规格为1片100mg)
取别嘌醇片1片,研碎后加入100mL 0.5%的CMC-Na混悬,配制成浓度为1mg/mL的别嘌醇溶液。
2.9槲皮素与芦丁供试液制备
称取槲皮素与芦丁各30mg,分别加入20mL CMC-Na溶液稀释,配制成浓度为1.5mg/mL的槲皮素与芦丁供试液。
2.10氧嗪酸钾溶液的配制
称取适量,以0.5%CMC-Na混悬,配制成12.5mg/mL的造模液。
3实验方法
3.1动物饲养
昆明种小鼠,分笼饲养于室内,室温(20~22℃),相对湿度35%~50%,自由饮食、饮水。适应性饲养三天后,开始给药。
3.2动物分组及造模
190只昆明种小鼠,按体重随机分为19组,每组10只,分别设为空白组,模型组,别嘌醇组,槲皮素组、芦丁组、山姜醇提物组,山姜总酚酸组,山姜总黄酮组,山姜总苯丙素组,3:1~1:3比例5组,化合物1~5的5组。上述19组动物,置于代谢笼中,自由饮食、饮水。空白及模型组灌胃给予0.5%CMC-Na,其它各组每日灌胃给予相应的药物,给药剂量均为0.2mL/10g,连续给药7天。于第6天给药前1h,空白组腹腔注射0.2mL/10g的0.5%CMC-Na溶液,其它各组腹腔注射氧嗪酸钾溶液0.2mL/10g,收集24h的尿液;末次给药前1h,空白组腹腔注射0.2mL/10g的0.5%CMC-Na溶液,其它各组腹腔注射氧嗪酸钾溶液0.2mL/10g,1h后,眼内眦取血0.1mL左右。
3.3样品处理及测定
按照尿酸与肌酐测定试剂盒进行操作,分别测定血清与尿液中的尿酸和肌酐值,并计算尿酸清除率(EFUA)=([尿尿酸]/[血尿酸])/([尿肌酐]/[血肌酐])
4实验结果
所得数据用SPSS11.5统计分析软件进行统计分析,分析结果以表示。
表一、不同浓度的山姜纯化物对高尿酸小鼠血清尿酸的影响
###p<0.001与空白组比较;*p<0.05;**p<0.01and***p<0.001与模型组比较。
5结论
本实验结果表明:首先,山姜醇提物组,山姜总酚酸组,山姜总黄酮组,山姜总苯丙素组,3:1~1:3比例5组,化合物1~5的5组均有显著的降低高尿酸小鼠的血清尿酸值,且部分组的效果要优于一线降尿酸药物别嘌醇和降尿酸天然产物槲皮素与芦丁;其次,含有山姜总苯丙素的部位及苯丙素类化合物1~5均有明显的促进尿酸排泄的作用,而总黄酮部位促进尿酸排泄的作用不明显,这也从侧面表明山姜中的总黄酮可能是通过抑制黄嘌呤氧化酶而起到降尿酸的作用,而山姜中的苯丙素类成分主要是通过促进尿酸排泄而起到降尿酸的作用;再次,山姜总黄酮与山姜总苯丙素的比例在2:1~1:2之间,降尿酸最为明显,而我们实施例2中制备的山姜总酚酸刚好落在这个范围内,所以其降尿酸非常显著;最后,化合物1、2、3具有非常显著的降尿酸作用。总之,本次实验结果是非常鼓舞人心的,表明山姜具有极大的开发成降高尿酸产品的应用前景。
实施例7山姜醇提物、总酚酸、总黄酮、总苯丙素、不同配比的总黄酮和总苯丙素及化合物1-5抗痛风实验研究
1仪器、材料与试药
1.1仪器和材料
Tissue-Tearor型手持高速组织匀浆机(北京市世安科兴科技开发有限公司),TDL80-2B型台式离心机(上海安亭科技仪器厂),BS124S型电子天平(SartoriusCorporation,Germany),KD-160型鼠称(TANITA公司),Mni shaker培养板振荡器(Kylin-Bell Lab Instruments,海门市其林贝尔仪器制造有限公司),WH-2型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂),DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科技术有限公司),DG5033A型酶标仪(华东电子),96孔细胞培养板(Corporation,USA),50μL、200μL、1000μL移液器(Thermo Electron Corporation,USA),HH-4型恒温水浴锅(常州国华电器有限公司),MILLI-Q Biocel型超纯水装置(Millipore,USA),其它常用器具(手术器械、游标卡尺、温度计、离心管、离心管架、烧杯、移液枪头、注射剂、小鼠灌胃针和量筒等)。
1.2试药
吲哚美辛(批号:20151001,昆明振华制药有限公司),尿酸钠结晶(AR,批号:150912,纯度≥99%,Sigma公司),羧甲基纤维素钠(CMC-Na,分子量300-800,中国医药集团上海化学试剂公司),食用级乙醇(南京鼎新化工轻工有限公司),氯化钠(AR,南京化学试剂有限公司),IL-1βELISA试剂盒(R&D,US,批号:20160201)。
1.3实验动物
SD雄性大鼠,体重180~220g(华中科技大学实验动物中心提供,动物生产许可证SCXK(鄂)20050008)。
2.实验溶液配制
2.1 0.5%的CMC-Na溶液配制
称取CMC-Na 2.5g加入500mL纯净水中,加热,超声使其溶解,静置过夜。
2.2生理盐水的配制
称取NaCl 4.5041g,溶于500mL纯净水中即得。
2.3槲皮素、芦丁、山姜醇提物、总酚酸、总黄酮、总苯丙素、不同配比的总黄酮和总苯丙素及化合物1-5供试品溶液的制备同实施例6中的“2.3~2.9”项下。
2.4吲哚美辛的制备(规格为1片100mg)
取别吲哚美辛片1片,研碎后加入100mL 0.5%的CMC-Na混悬,配制成浓度为1mg/mL的吲哚美辛溶液。
2.5尿酸钠结晶溶液的配制
称取适量尿酸钠结晶,以生理盐水混悬,配制成1mg/mL的造模液。
3实验方法
3.1动物饲养
SD大鼠,分笼饲养于室内,室温(20~22℃),相对湿度35%~50%,自由饮食、饮水。适应性饲养三天后,开始给药。
3.2动物分组及造模
190只SD大鼠,按体重随机分为19组,每组10只,分别设为空白组,模型组,吲哚美辛组,槲皮素组,芦丁组,山姜醇提物组,山姜总酚酸组,山姜总黄酮组,山姜总苯丙素组,3:1~1:3比例5组,化合物1~5的5组。上述19组动物,自由饮食、饮水,空白及模型组灌胃给予0.5%CMC-Na,其它各组每日灌胃给予相应的药物,给药剂量均为0.2mL/10g,连续给药7天。于第5天给药后1h,固定大鼠,,将右踝关节弯曲,局部消毒后,用6号注射针自两骨突之间进针,除空白组大鼠注射生理盐水0.05mL外,其余各组大鼠在右关节腔内注射尿酸钠生理盐水混悬液0.05mL,以关节囊对侧鼓起为注入标准,诱导痛风性关节炎的发生。
3.3样品处理及测定
检测指标:(1)关节肿胀度:分别用游标卡尺测量致炎前及致炎后4、12、24、48h大鼠右踝关节的厚度,以致炎前后的差值除以致炎前的厚度×100%作为痛风性关节炎的肿胀度。(2)对大鼠关节及周围软组织中IL-1β的影响:致炎48h取血后,处死动物,取关节滑膜及周围软组织,称质量,在冰浴中制成匀浆,按1∶20比例加生理盐水稀释,4000r/min离心5min,取上清液,分装于Ep管中,于-80℃冰箱保存,按双抗体夹心ELISA法试剂盒说明书进行IL-1β定量检测。
4实验结果
所得数据用SPSS11.5统计分析软件进行统计分析,分析结果以表示。
表二、不同浓度的山姜纯化物对痛风大鼠关节肿胀的影响
###p<0.001与空白组比较;*p<0.05;**p<0.01and***p<0.001与模型组比较。
表三、不同浓度的山姜纯化物对痛风大鼠关节组织中IL-1β水平的影响
###p<0.001与空白组比较;*p<0.05;**p<0.01and***p<0.001与模型组比较。
5结论
本实验结果表明:首先,吲哚美辛组,槲皮素组、芦丁组、山姜醇提物组,山姜总酚酸组,山姜总黄酮组,山姜总苯丙素组,3:1~1:3比例5组,化合物1~5的5组均有显著的改善大鼠痛风性关节肿胀及降低组织中IL-1β水平的效果;其次,含有山姜总黄酮的部位改善大鼠痛风性关节肿胀及降低组织中IL-1β水平的效果更为明显,这也从侧面表明山姜中的总黄酮可能是抗痛风起效的主要成分;最后,山姜总黄酮与山姜总苯丙素的比例在3:1~1:2之间,抗痛风效果最为明显,而我们实施例2中制备的山姜总酚酸刚好落在这个范围内,所以其抗痛风效果非常显著;总之,本次实验结果是非常鼓舞人心的,表明山姜具有极大的开发成抗痛风产品的应用前景。
综合实施例6与实施例7,我们发现,本案例中的山姜醇提物与山姜总酚酸提取物有确切的降尿酸与抗痛风的作用,且其降尿酸效果尤其明显。另外,山姜作为一种传统的调味品,安全无副作用,如果能够开发成抗痛风与降尿酸的药物,将具有极好的应用前景。
实施例8颗粒剂制备
称取实施例1或2中的最佳工艺制备的山姜醇提物或山姜总酚酸提取物,加入适量的辅料糊精,混合均匀,过60目筛,加入适量的无水乙醇,过20目筛挤压制粒,60℃干燥后,得颗粒剂。
实施例9片剂制备
称取实施例1或2中的最佳工艺制备的山姜醇提物或山姜总酚酸提取物,加入适量的辅料淀粉和硬脂酸镁,混匀,打片,即得片剂。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (13)
1.一种山姜提取物的应用,其特征在于,所述山姜提取物含有山姜总苯丙素,所述山姜提取物用于制备降尿酸和抗痛风的药物。
2.一种山姜提取物的应用,其特征在于,所述山姜提取物含有山姜总黄酮和山姜总苯丙素的混合物,所述山姜提取物用于制备降尿酸和抗痛风的药物。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述山姜提取物为山姜总黄酮和山姜总苯丙素质量比为3:1~1:3的混合物。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述山姜提取物为山姜总黄酮和山姜总苯丙素质量比为2:1~1:2的混合物。
5.一种山姜提取物的应用,其特征在于,所述山姜提取物含有具有式1~3结构的化合物中的一种或其组合,所述山姜提取物用于制备降尿酸和抗痛风的药物。
式1中,R1为-H,R2为-CHO;或者,R1为-AC,R2为-CH2OH;或者,
R1为-AC,R2为-CH2OAC
6.一种山姜提取物的应用,其特征在于,所述山姜提取物为山姜总酚酸提取物;所述山姜总酚酸提取物用于制备降尿酸和抗痛风的药物;
其中,所述山姜总酚酸提取物含有山姜总黄酮和山姜总苯丙素,且该两类化合物的质量之和应不低于山姜总酚酸提取物质量的50%。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述山姜总酚酸提取物中山姜总黄酮和山姜总苯丙素的质量比为2:1~1:2。
8.一种山姜提取物的应用,其特征在于,所述山姜提取物为山姜醇提物,所述山姜醇提物用于制备降尿酸和抗痛风的药物;其中,所述山姜醇提物的制备方法为:干燥山姜药材粉碎后,用体积百分比浓度为30%-60%的乙醇水溶液提取,提取液过滤并回收乙醇后,得山姜醇提物。
9.根据权利要求1~8任一项所述的应用,其特征在于,所述山姜提取物是指姜科山姜属多年生草本植物的根茎提取物。
10.一种制备山姜总酚酸提取物的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)干燥山姜药材粉碎后,用体积百分比浓度为30%-60%的乙醇水溶液提取,提取液过滤并回收乙醇后,得山姜醇提物;
(2)山姜醇提物加水调节浓度,上HPD100大孔吸附树脂柱吸附后,以水洗脱,然后以体积百分比浓度为5~15%的乙醇水溶液洗脱,再以体积百分比浓度为50~70%的乙醇水溶液洗脱,收集50-70%的乙醇水溶液洗脱液,减压回收至无醇味,得到HPD100树脂洗脱液,干燥,即得山姜总酚酸提取物。
11.一种制备山姜总苯丙素和山姜总黄酮的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)干燥山姜药材粉碎后,用体积百分比浓度为30%-60%的乙醇水溶液提取,提取液过滤并回收乙醇后,得山姜醇提物;
(2)山姜醇提物加水调节浓度,上HPD100大孔吸附树脂柱吸附后,以水洗脱,然后以体积百分比浓度为5~15%的乙醇水溶液洗脱,再以体积百分比浓度为50~70%的乙醇水溶液洗脱,收集50-70%的乙醇水溶液洗脱液,减压回收至无醇味,得到HPD100树脂洗脱液;(3)HPD100树脂洗脱液调节浓度后,上100目聚酰胺柱吸附,先用水洗脱,再分别以体积百分比浓度为5-15%乙醇水溶液、体积百分比浓度为20-40%的乙醇水溶液及体积百分比浓度为60-80%的乙醇水溶液洗脱;收集20-40%的乙醇洗脱液,减压回收,再冷冻干燥,得山姜总苯丙素;收集60-80%的乙醇洗脱液,减压回收,再冷冻干燥,得山姜总黄酮。
12.根据权利要求10或11任一项所述的方法,其特征在于,所述山姜药材为姜科山姜属多年生草本植物的根茎。
13.根据权利要求10或11任一项所述的方法,其特征在于,姜科山姜属多年生草本植物为Alpinia officinarum Hance、Alpinia galanga(Linnaeus)Willdenow、Alpiniaaquatica(Koen.)Rosc.、Alpinia chinensis(Retz.)Rosc.、Alpinia chinghsiensisD.Fang、Alpiniapolyantha D.Fang、Alpiniapsilogyna D.Fang、Alpinia intermediaGagnep.、Alpinia tonkinensis Gagnep.或Alpiniajaponica(Thunb.)Miq.。
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