CN111434768A - 用于改善呼吸道健康的益生菌株及其组合物与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，尤其是关于一用于改善呼吸道健康的益生菌株及其组合物与用途。本发明提供的用于改善呼吸道健康的益生菌株为瑞士乳杆菌(编号为DSM 33107)，其本身以及其代谢产物具有抑制细菌生长、提升肺脏上皮细胞的修复、以及促进巨噬细胞的吞噬的能力，而能够有效减少呼吸道的感染机率、提升呼吸道的修复能力、以及促进排除人体内PM2.5，并能移除呼吸道的异物。其中本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物中具有1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸的效性成分。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其是关于一用于改善呼吸道健康的益生菌株及其组合物与用途。
背景技术
工业活动的发达，及现代生活对能源重度需求，而能量的取得过程中却造成了严重的空气污染。哈佛大学针对亚洲与东南亚地区的空气污染问题研究结果指出，燃煤电厂除了直接排放PM2.5，还会排放硫化物(SO2)、氮氧化物(NOX)、煤烟与粉尘等会间接促进PM2.5形成的物质。PM2.5粒子很小，为可呼吸性(Respirable)微粒，能轻易突破人体鼻腔绒毛及气管纤毛黏液等呼吸道防御机制，进入支气管以及肺泡，而对健康造成严重影响，包括引发呼吸道疾病、慢性支气管炎、肺癌和心血管疾病，对于孕妇更可能造成新生儿早产和影响认知系统的发展，及诱发慢性病的发病率，严重者将导致死亡。
然而，目前仅能透过消极的方法减缓吸入PM2.5，来预防或减缓PM2.5对人体造成的伤害。其中，大气环境的PM2.5可藉由减少户外活动时间及配带个人防护用具如口罩等以降低暴露风险，但是PM2.5会经由通风空调系统、门窗及建筑物隙缝处渗入室内环境，增加室内空气污染及暴露风险。且许多研究发现大部分情况下室内环境中会因为烹饪油烟、打扫的扬尘、以及生物性来源包括飞沫中的病毒及细菌、霉菌孢子和尘蹒的排泄物等原因，而使其PM2.5浓度远比室外来的高。因此对于大环境的问题，除了大家携手改善能源使用习惯、干净能源的开发外，在问题尚未得到缓解之际则必须对自身的呼吸道进行保护，以避免空气污染对人体产生的伤害。另外，除了人为的污染之外，空气中还有会对人体产生威胁生物性因子，例如细菌或病毒等病原体对呼吸道造成的感染。
综合上面所述，为了能有效达到减缓PM2.5对人体肺脏的伤害，开发一种能有效促进巨噬细胞的吞噬能力，以增加人体排除PM2.5的能力，并同时能有效抑制肺脏细菌生长、及提升肺脏上皮细胞的修复能力的组合物，着实有其必要性。
发明内容
缘此，本发明的一目的在提供一种用于改善呼吸道健康的益生菌株，其中该益生菌株是一瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，其寄存编号是DSM33107。
本发明的又一目的在提供一种如前所述的益生菌株用于制备一改善呼吸道健康的组合物的用途。
本发明的又一目的在提供一种如前所述的益生菌株的代谢产物用于制备一改善呼吸道健康的组合物的用途。
本发明的又一目的在提供一种1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸用于制备一改善呼吸道健康的组合物的用途，其中该1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸具有下列化学式(I)：
本发明的另一目的在提供一种用于改善呼吸道健康的组合物，包含选自上述技术方案所述的益生菌株、该益生菌株的代谢产物、及1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸中任一项或其任意的组合。
在本发明的一实施例中，该益生菌株的浓度至少为1x108cfu/mL。
在本发明的又一实施例中，该益生菌的代谢产物的浓度至少为1ppm，且该益生菌株的代谢产物是该益生菌株的分泌物，包含培养该益生菌的培养液。
在本发明的又一实施例中，该益生菌株的代谢产物中包含1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)，且该1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸具有下列化学式(I)：
在本发明的又一实施例中，该1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的浓度至少为1ppm。
在本发明的另一实施例中，该改善呼吸道健康是抑制细菌生长、提升肺脏细胞的修复能力及/或提升巨噬细胞的吞噬能力。
本发明的瑞士乳杆菌以及其代谢产物能有效抑制细菌生长、有效提升肺脏上皮细胞的修复能力、以及有效促进巨噬细胞的吞噬能力，而能够减少呼吸道的感染机率、提升呼吸道的修复能力、以及促进排除人体内PM2.5，并能移除呼吸道的异物。其中本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物中具有1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)的效性成分，经功效再验证能有效提升肺脏上皮细胞的修复能力。因此，本发明的瑞士乳杆菌、其代谢产物、以及纯化自其代谢产物的1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸可用于制备改善呼吸道健康的组合物的用途，该组合物该组合物是一医药品、或一食品，可藉由口服等方式给予一个体。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物抑制细菌生长的照片；
图2A是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物促进肺脏上皮细胞修复的照片；
图2B是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物促进肺脏上皮细胞修复的直方图；**p值<0.01；
图3是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物促进巨噬细胞吞噬PM2.5的柱形图与照片；
图4是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物的乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、及水层萃取物促进肺脏上皮细胞修复的柱形图；**p值<0.01；***p值<0.001；
图5是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中所纯化TCI-TCI357-01的核磁共振氢光谱图；
图6是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中所纯化TCI-TCI357-01的核磁共振碳光谱图；
图7是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中所纯化TCI-TCI357-01的核磁共振二维COSY光谱图；
图8是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中所纯化TCI-TCI357-01的核磁共振二维HSQC光谱图；
图9是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中所纯化TCI-TCI357-01的核磁共振二维HMBC光谱图；
图10是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中所纯化TCI-TCI357-01的质谱图；
图11是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中所纯化TCI-TCI357-02的质谱图；
图12是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中所纯化TCI-TCI357-02的核磁共振氢光谱图；
图13是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中所纯化TCI-TCI357-02的核磁共振碳光谱图；
图14是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中所纯化TCI-TCI357-02的核磁共振二维COSY光谱图；
图15是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中所纯化TCI-TCI357-02的核磁共振二维HSQC光谱图；
图16是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中所纯化TCI-TCI357-02的核磁共振二维HMBC光谱图；
图17是本发明的一实施例的瑞士乳杆菌的代谢产物TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02的HPLC指纹图谱；
图18是为本发明实施例的瑞士乳杆菌代谢产物中活性成分TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02促进肺脏上皮细胞修复的柱形图；**p值<0.01。
具体实施方式
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，个组之间的差异以学生t检验(student's t-test)分析。
定义
本发明的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)是一种能改善呼吸道健康的益生菌株(Probiotic bacteria)。本发明是一新颖的瑞士乳杆菌，实验编号TCI357，于2019年5月2日寄存于DSMZ-德国微生物保藏中心，寄存编号DSM 33107，本发明经由体外实验证实本发明的瑞士乳杆菌以及其代谢产物可抑制细菌生长，以达到减少呼吸道的感染机率；经由细胞实验证实本发明的瑞士乳杆菌以及其代谢产物可提升肺脏上皮细胞的修复能力、促进巨噬细胞的吞噬能力，以提升呼吸道的修复能力、促进排除人体内PM2.5，并移除呼吸道异物的功效。显示本发明的瑞士乳杆菌以及其代谢产物可用于制备改善呼吸道健康的组合物的用途，且该组合物是一医药品、或一食品，可藉由口服等方式给予一个体。
益生菌株(probiotic或probiotic bacteria)是一微生物，其菌体、混合菌株、萃取物或代谢产物对于宿主本身是具有正面影响，通常源自于人体内、有益于肠道健康的活菌，亦可指外来补充、对身体可能有益的某些微生物，其中该益生菌株的代谢产物是该益生菌株的分泌物，包含培养该菌的培养液。
依据本发明，以管柱层析法(Column chromatography)及薄层层析法(Thin layerchromatography,TLC)自本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物中，所纯化出的二种化合物1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)、以及Flazin，将于本文分别命名为TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02。
依据本发明，有关细菌培养的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
如本文中所使用的，用语「代谢产物」意为培养细菌时，经该细菌代谢后所分泌至细菌培养液中的物质，包含培养该菌的培养液。
依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)以及类似物。
依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。
依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。
依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。
依据本发明，该外部制剂是藉由将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。
依据本发明，该基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如
974P(
974P)、微结晶纤维素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。
依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。
化学分析材料
正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、正丁醇(n-butanol)、乙腈(acetonitrile)、氯仿-d1(氘化程度99.5％)、甲醇-d6(氘化程度99.5％)、重水(deuterium oxide，氘化程度大于99.8％)、及二甲基亚砜-d6(dimethyl sulfoxide-d6，氘化程度＞99.9％)购自中国台湾默克公司。
化学分析仪器
化合物的分离是利用管柱层析法(Column chromatography)及薄层层析法(Thinlayer chromatography，TLC)。中压液相层析(Medium pressure liquid chromatography，MPLC)系统是
Rf+(Teledyne ISCO)；管柱是选用自Sephadex LH-20(AmershamBiosciences)、Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical)、Merck Kieselgel 60(40-63μm，Art.9385)、及Merck
RP-18(40-63um，Art.0250)。高效液相层析(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)系统装配Hitachi L-2310系列泵、HitachiL-2420 UV-VIS侦测器(侦测波长为200nm至380nm)、及D-2000Elite资料处理软件；管柱是选用自分析级
HS C18(250×4.6mm，5μm；SUPELCO)与Mightysil RP-18 GP 250(250×4.6mm，5μm；Kanto Chemical)，以及半制备级
HS C18(250×10.0mm，5μm；SUPELCO)与制备级
HS C18(250×21.0mm，5μm；SUPELCO)。层析系统配备紫外灯UVP UVGL-25(波长为254nm及365nm)。薄层层析片是涂覆硅胶60F254(0.25mm；Merck)或RP-18F254S(0.25mm；Merck)的铝片。
化合物的化学结构是以质谱法(Mass spectrometry，MS)及核磁共振光谱法(Nuclear magnetic resonance spectrometry,NMR)进行分析。具体而言，使用二维离子阱串联傅里叶变换质谱(Bruker amaZon SL system)及电喷洒离子化串联质谱(ESI-MS/MS，Thermo Scientific Orbitrap Elite system)；并使用400MHz Varian 400FT-NMR取得一维与二维NMR光谱，以δ表示化学位移(Chemical shift)，其中单位为ppm；以四甲基硅烷(Tetramethylsilane，TMS)作为内部标准品；偶合常数(J)以Hz为单位，并以s窗体峰(Singlet)，d表二重峰(Doublet)，d表三重峰(Triplet)，q表四重峰(Quartet)，p表五重峰，m表多重峰(Multiplet)，brs则表宽峰。
依据本发明，有关混合物的化学分离及化学结构分析的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
本发明提供一种瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、其代谢产物或纯化自其代谢产物的1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸用于制备改善呼吸道健康的组合物的用途，本发明瑞士乳杆菌代谢产物是取该瑞士乳杆菌的培养液所获得，其中含有活性成分1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)，该瑞士乳杆菌、其代谢产物、及纯化自其代谢产物的1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸可用于抑制细菌生长、提升肺脏上皮细胞的修复能力、以及促进巨噬细胞的吞噬能力。
同时，本发明用于改善呼吸道健康的组合物，亦可包含一有效量的本发明的瑞士乳杆菌、其代谢产物、或纯化自其代谢产物的1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸，以及一医药上可接受的载体，该组合物是一医药品、或一食品。
以下将详细说明本发明的瑞士乳杆菌代谢产物的详细制备方法，与该瑞士乳杆菌于抑制细菌生长的功效测试、于修复肺脏上皮细胞的功效测试、于提升巨噬细胞吞噬能力的功效测试、从本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物中分离出活性物质1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的详细方法、验证1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸为本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物、以及再验证1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸具有修复肺脏上皮细胞的功效测试。以证实本发明的瑞士乳杆菌、其代谢产物、以及纯化自其代谢产物的1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸具有抑制细菌生长、提升肺脏上皮细胞的修复能力、以及促进巨噬细胞的吞噬的能力，而能用于制备改善呼吸道健康的组合物。
实施例1本发明的瑞士乳杆菌代谢产物的制备方法
在本发明实施例中，将本发明的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的冷冻菌种保存管经一次培养以活化后，以百分之一的殖菌量培养在MRS(de Man,Rogosa andSharpe,BD DifcoTMLactobacilli MRS Broth)培养基中，优选为于10mL的MRS中加入0.1mL的经活化菌种，于37℃培养16-18小时后，将该培养菌液以5000rpm离心10-20分钟后，搜集该上清液即为本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物。
实施例2本发明的瑞士乳杆菌代谢产物于抑制细菌生长的功效
本发明的一实施例为了测试本发明的瑞士乳杆菌代谢产物于抑制细菌生长的功效，使用抑菌圈法试验其抑菌功效，其中抑菌圈法又称扩散法，是利用待测物在洋菜胶中扩散使其周围的细菌生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈，并根据抑菌圈的大小以判定待测物的抑菌效用的方法，常用于抗生素产生菌的分离筛选。首先，将本发明的瑞士乳杆菌培养于MRS培养基中，于37℃培养16小时后，将菌液以5000rpm离心10分钟后，取上清液作为试验样品。接着，将1x108cfu/mL的大肠杆菌(E.coli)培养于5mL的LB(Lysogeny broth)培养液中，作用于37℃下8小时后，取100μL该培养液涂满至LB agar(LA)上，并挖洞预备后，取本发明的瑞士乳杆菌的50μL代谢产物于已涂满E.coil的LA洞中，培养于37℃下24小时后，观察是否产生抑菌圈。
本发明的瑞士乳杆菌代谢产物抑制细菌生长的实验结果如图1所示。在含有本发明的瑞士乳杆菌7代谢产物的LA洞周围形成一明显的抑菌圈，此结果显示本发明的瑞士乳杆菌可产生抑制细菌生长的物质，能有效抑制细菌生长，以减少呼吸道的感染机率。
实施例3本发明的瑞士乳杆菌及其代谢产物于修复肺脏上皮细胞的功效
本发明的一实施例以人类支气管上皮细胞BEAS-2b(购自美国典型培养物保藏中心，编号CRL-9609)藉由细胞划痕损伤修复实验，测试本发明的瑞士乳杆菌及其代谢产物于修复肺脏上皮细胞的功效。该细胞是培养于Bronchial epithelial cell basal Medium(BEBM，购自Lonza，瑞士)，其中，细胞划痕损伤修复实验是通过观察细胞重新填满一人为所制造出划痕，以得知细胞的愈合能力。首先，将1.5x105个BEAS-2b细胞培养于24孔培养盘的每孔中，于37℃培养16-18小时使细胞平铺一层于培养盘孔底，接着使用一200μL的微量吸量管于该单层细胞上轻划一道以制造一伤痕，并移除培养液后以磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline,PBS)清洗后，将细胞分成以下二组(n＝3)混入不含血清(Serum-free)的上述培养液中，且最终体积为1mL：(1)MRS、及(2)1％本发明的瑞士乳杆菌或其代谢产物，并以仅加入不含血清的培养液的细胞作为空白控制组。接着以显微镜观察并拍照做纪录，以此时间点的伤痕大小作为基准点，并于37℃、含有5％的CO2的培养箱中作用16小时后，移除培养液并加入同体积的不含血清的培养液，于37℃培养24小时后，以同样手法以显微镜观察伤痕并拍照记录，最后以Image J软件分析各组图像，再利用Excel软件进行Student t-test以决定变异系数与是否在统计上具有显著差异。
本发明的瑞士乳杆菌及其代谢产物促进肺脏上皮细胞修复实验结果如图2A及图2B所示，其中以空白控制组作为100％。经本发明的瑞士乳杆菌或其代谢产物作用后，能使肺脏上皮细胞的划痕损伤修复218.2％，分别显著高于空白控制组及MRS组，其中MRS组则仅有115.7％的话痕损伤修复。此结果显示本发明的瑞士乳杆菌及其代谢产物能有效提升肺脏上皮细胞的修复能力，能提升呼吸道的修复能力。
实施例4本发明的瑞士乳杆菌及其代谢产物提升巨噬细胞吞噬能力的功效
本发明的一实施例将人类单核球细胞THP-1(购自美国典型培养物保藏中心，编号TIB202)分化成巨噬细胞，并藉由观察巨噬细胞吞噬与PM2.5大小相同的荧光颗粒的能力，测试本发明的瑞士乳杆菌及其代谢产物于促进人体排除细悬浮微粒PM2.5的功效，其中人体肺脏中具有巨噬细胞，其可参与肺脏中吞噬和清除外来的尘粒或病原体。该THP-1细胞培养于RPMI-1640细胞培养液中(购自Gibco，美国)，其中含有10％的胎牛血清(Fetal BovineSerum)、0.05mM的2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)、100units/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。首先，将1.5x105个THP-1细胞培养于6孔培养盘的每孔中，每孔细胞的培养液中皆加入500nM的佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA，购自Sigma，编号P8139)，并于37℃、含有5％的CO2的培养箱中作用48小时后，替换成新鲜的细胞培养液，并在监控下继续培养48小时，以将THP-1细胞分化为巨噬细胞，接着将细胞分成以下两组：(1)加入1％本发明的瑞士乳杆菌或其代谢产物的实验组、及(2)仅加入细胞培养液的空白控制组，分别反应24小时后，加入0.5％的荧光颗粒(Fluorescent particles,yellow high intensity,1％w/w,1.7-2.2μm，购自Spherotech，美国，编号FH-2052-2)作用4小时，接着将培养液移除后使用1xPBS清洗细胞三次后，以显微镜观察并拍照做纪录，并以流式细胞仪通过FL1光电倍增管(发射波长为515-545nm)检测来自巨噬细胞的荧光讯号，其中以细胞培养液(空培液)的荧光讯号作为背景读值。再利用Excel软件进行Student t-test以决定变异系数与是否在统计上具有显著差异。
本发明的瑞士乳杆菌及其代谢产物促进巨噬细胞吞噬细悬浮微粒PM2.5的实验结果如图3所示。经本发明的瑞士乳杆菌或其代谢产物作用后，能明显观察到巨噬细胞吞噬的荧光颗粒数量多于控制组，且荧光讯号也较控制组高3.5％。此结果显示本发明的瑞士乳杆菌及其代谢产物能有效促进巨噬细胞的吞噬能力，使促进排除人体内PM2.5，并帮助呼吸道异物的清除。
实施例5分析本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物中活性成分
本发明的一实施例为分析本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物中的活性成分。首先，取5L本发明的瑞士乳杆菌代谢产物，将其与乙酸乙酯(Ethyl acetate)以1:1等比例与水混合，分成3次进行液相分配萃取，将3次的乙酸乙酯层萃取液混合后并经减压浓缩干燥，得到乙酸乙酯层萃取物共8.28g。其余水层萃取液则继续以正丁醇与水等比例1:1的液相分配萃取方式共萃取3次，合并萃取液经减压浓缩干燥，得到正丁醇层萃取物共18.20g、及水层萃取物共255.0g。接着，分别将乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、及水层萃取物初步地进行修复肺脏上皮细胞损伤的功效测试。
接着，以人类支气管上皮细胞BEAS-2b(购自美国典型培养物保藏中心，编号CRL-9609)藉由细胞划痕损伤修复实验，进行该上述三种萃取物于修复肺脏上皮细胞的功效分析。该细胞是培养于Bronchial epithelial cell basal Medium(BEBM，购自Lonza，瑞士)中。首先，将1.5x105个BEAS-2b细胞培养于24孔培养盘的每孔中，于37℃培养16-18小时使细胞平铺一层于培养盘孔底，接着使用一200μL的微量吸量管于该单层细胞上轻划一道以制造一伤痕，并移除培养液后以磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline,PBS)清洗后，将细胞分成以下四组(n＝3)混入不含血清(Serum-free)的上述培养液中，且最终体积为1mL：(1)1％本发明的瑞士乳杆菌代谢产物原液、(2)1％的乙酸乙酯层萃取物、(3)1％的正丁醇层萃取物、及(4)1％的水层萃取物，并以仅加入不含血清的培养液的细胞作为空白控制组。接着以显微镜观察并拍照做纪录，以此时间点的伤痕大小作为基准点，并于37℃、含有5％的CO2的培养箱中作用16小时后，移除培养液并加入同体积的不含血清的培养液，于37℃培养24小时后，以同样手法以显微镜观察伤痕并拍照记录，最后以Image J软件分析各组图像，再利用Excel软件进行Student t-test以决定变异系数与是否在统计上具有显著差异。
本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物的乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、及水层萃取物结果如图4所示。其中该瑞士乳杆菌的代谢产物原液显著地较空白控制组高出179.2％倍，显示本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物确实具有良好的修复肺脏上皮细胞的功效，其中乙酸乙酯层萃取物较空白控制组高出22％、正丁醇层萃取物则为116.7％、水层萃取物则为20.3％。此些结果显示本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物原液、乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、及水层萃取物皆具有良好地修复肺脏上皮细胞的功效，特别是正丁醇层萃取物表现出修复肺脏上皮细胞的最佳功效。因此，进一步自正丁醇萃取物中分离出具有改善呼吸道健康的成分。
接着，依据生物活性导引分离方法(Bioassay guided fractionation)追踪正丁醇萃取物中的活性成分。首先，将正丁醇层萃取物共18.2g以Diaion HP-20(购自Mitsubishi Chemical，日本)为层析材料，以3:2比例混合的水与甲醇作为冲提液，经管柱层析后共分离得到3个划分层(F1-F3)。再将第二个划分层(F2)以9:1比例混合的二氯甲烷与甲醇作为冲提液，经硅胶管柱进行管柱层析后，共分离后得到7个次划分层(F2-1-F2-7)。再将该次划分层F2-7以4:1比例混合的二氯甲烷与甲醇作为冲提液，经硅胶管柱进行管柱层析后，共分离得到共20.0mg的TCI-TCI357-01。另外，将第三个划分层(F3)以二氯甲烷与甲醇渐增极性梯度为冲提液，经硅胶管柱进行管柱层析后，共分离得到7个次划分层(F3-1-F3-7)，将F3-5以高效能液相层析仪(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)进行纯化，其中以3:7比例混合的水与甲醇作为冲提液，分离得到共5.2mg的TCI-TCI357-02。
TCI-TCI357-01为一个白色粉末化合物，其核磁共振氢光谱图如图5所示，由该分析可知此化合物具有一组ABCD系统的芳香环质子吸收讯号δH 7.40(1H,d,J＝8.0Hz)、δH7.30(1H,d,J＝8.0Hz)、δH 7.03(1H,t,J＝8.0Hz)、δH6.95(1H,t,J＝8.0Hz)、以及与异原子相接的CH2吸收讯号δH 4.15(2H,d,J＝15.6Hz)。而核磁共振碳光谱图如图6所示，由该分析可知此化合物具有12个碳讯号，其中包含1个羰基的吸收讯号。为了确认此化合物构造，以核磁共振进行分析，其二维光谱图COSY如图7所示、HSQC如图8所示、及HMBC如图9所示，另外其质谱图如图10所示，由该些结果可确认此化合物为1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)，其构造式如下表1所示，并命名为TCI-TCI357-01。
TCI-TCI357-02为一个黄色粉末化合物，其质谱图如图11所示，其中可发现一分子离子峰为331[M+Na]+，推测此化合物分子量为308。另外，其核磁共振氢光谱图如图12所示，由该分析可知此化合物具有一组ABCD芳香环质子吸收讯号δH 8.40(1H,d,J＝8.0Hz)、δH7.78(1H,d,J＝8.0Hz)、δH 7.62(1H,t,J＝8.0Hz)、及δH 7.32(1H,t,J＝8.0Hz)、一组芳香环质子互相耦合讯号δH7.39(1H,d,J＝3.2Hz)、δH 6.59(1H,d,J＝3.2Hz)、一组芳香环单峰质子吸收讯号δH 8.81(1H,s)、以及一组与异原子相接的单峰质子CH2吸收讯号δH4.65(1H,s)。而其核磁共振碳光谱图如图13所示，由该分析可知此化合物共有17个碳，包含一个羰基吸收讯号。为了确认此化合物构造，以核磁共振进行分析，其二维光谱图COSY如图14所示、HSQC如图15所示、及HMBC如图16所示，由该些结果连接出此化合物结构式，并与文献比对后，确认此化合物为Flazin，其结构如下表1所示，并命名为TCI-TCI357-02。
藉由质谱仪与核磁共振光谱仪等分析确定化合物TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02的化学结构，其名称及结构式如下表1所示。
表1.化合物TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02的化学结构式
实施例6 TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02是本发明瑞士乳杆菌的代谢产物
本发明的一实施例为验证化合物TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02为本发明瑞士乳杆菌所产生的代谢产物，比较细菌培养基空白液以及本发明的瑞士乳杆菌的培养液中成分。首先，分别取20μL的50mg/mL本发明的瑞士乳杆菌上清液的正丁醇层萃取物、以及20μL的50mg/mL细菌培养基空白液的正丁醇层萃取物进行HPLC指纹图谱分析，其中使用十八烷基硅烷(Octadecylsilyl,Mightysil RP-18GP 250)日本关东化学公司管柱(内径(I.D.)为10mm、长度(L)为250mm、颗粒大小为5μm，流速为1.0mL/min)，且流动相组成为甲醇(Methanol)与水的混合溶液，冲提条件如下表2所示，并侦测波长280nm的信号。
表2.流动相A为水+0.1％甲酸；流动相B为甲醇+0.1％甲酸
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 85 | 15 |
| 5 | 85 | 15 |
| 30 | 30 | 70 |
| 40 | 0 | 100 |
| 45 | 0 | 100 |
| 47 | 85 | 15 |
| 55 | 85 | 15 |
本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物的正丁醇层萃取物与培养基空白液的正丁醇层萃取物的HPLC指纹图谱如图17所示，其中可见空白培养液中皆无TCI-TCI357-01与TCI-TCI357-02化合物存在，此二化合物仅出现在有接种本发明瑞士乳杆菌的培养液中，此结果证明此二化合物确实为本发明瑞士乳杆菌所产生的代谢产物，为需透过培养该瑞士乳杆菌后才会生成的代谢物。
实施例7本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物中活性成分于修复肺脏上皮细胞的功效
本发明的一实施例为再验证从本发明瑞士乳杆菌的代谢产物中分离出的TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02具有修复肺脏上皮细胞功效的效性成分，以人类支气管上皮细胞BEAS-2b进行细胞划痕损伤修复实验。首先，将1.5x105个BEAS-2b细胞培养于24孔培养盘的每孔中，于37℃培养16-18小时使细胞平铺一层于培养盘孔底，接着使用一200μL的微量吸量管于该单层细胞上轻划一道以制造一伤痕，并移除培养液后以磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline,PBS)清洗后，将细胞分成以下二组(n＝3)混入不含血清(Serum-free)的上述培养液中，且最终体积为1mL：(1)1％的TCI-TCI357-01及(2)1％的TCI-TCI357-02，并以仅加入不含血清的培养液的细胞作为空白控制组。接着以显微镜观察并拍照做纪录，以此时间点的伤痕大小作为基准点，并于37℃、含有5％的CO2的培养箱中作用16小时后，移除培养液并加入同体积的不含血清的培养液，于37℃培养24小时后，以同样手法以显微镜观察伤痕并拍照记录，最后以Image J软件分析各组图像，再利用Excel软件进行Student t-test以决定变异系数与是否在统计上具有显著差异。
从本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物中分离出的化合物TCI-TCI357-01及TCI-TCI357-02促进肺脏上皮细胞修复能力的实验结果如图18所示。经化合物TCI-TCI357-01作用后，相较于空白控制组能显著地使肺脏上皮细胞的划痕损伤修复率提升38％，而经化合物TCI-TCI357-02作用后，与控制组相比其肺脏细胞的划痕损伤修复并无显著差异性。此结果显示本发明的瑞士乳杆菌代谢产物中含有护肺功效的化合物为正丁醇层中的TCI-TCI357-01(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)。
综上所述，本发明的瑞士乳杆菌以及其代谢产物能有效抑制细菌生长、有效提升肺脏上皮细胞的修复能力、以及有效促进巨噬细胞的吞噬能力，而能够减少呼吸道的感染机率、提升呼吸道的修复能力、以及促进排除人体内PM2.5，并能移除呼吸道的异物。其中本发明的瑞士乳杆菌的代谢产物中具有1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)的效性成分，经功效再验证能有效提升肺脏上皮细胞的修复能力。因此，本发明的瑞士乳杆菌、其代谢产物、以及纯化自其代谢产物的1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸可用于制备改善呼吸道健康的组合物的用途，该组合物该组合物是一医药品、或一食品，可藉由口服等方式给予一个体。
【生物材料寄存】
本发明涉及的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，寄存编号是DSM33107；于2019年5月2日寄存于DSMZ-德国微生物保藏中心，地址为德国布伦瑞克市38124因霍芬大街7B。
Claims (12)
1.一种用于改善呼吸道健康的益生菌株，其中该益生菌株是为一瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，其寄存编号是DSM 33107。
2.一种权利要求1所述的益生菌株用于制备一改善呼吸道健康的组合物的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述益生菌株的浓度至少为1x108cfu/mL。
4.一种根据权利要求1所述的益生菌株的代谢产物用于制备一改善呼吸道健康的组合物的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述益生菌的代谢产物的浓度至少为1ppm。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述益生菌株的代谢产物是所述益生菌株的分泌物，包含培养所述益生菌的培养液。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述益生菌株的代谢产物中包含1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid)，且所述1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸具有下列化学式(I)：
8.一种1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸用于制备一改善呼吸道健康的组合物的用途，其特征在于，所述1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸具有下列化学式(I)：
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的浓度至少为1ppm。
10.根据权利要求2、4、或8任一项所述的用途，其特征在于，所述改善呼吸道健康是抑制细菌生长、提升肺脏细胞的修复能力及/或提升巨噬细胞的吞噬能力。
11.一种用于改善呼吸道健康的组合物，包含选自权利要求1所述的益生菌株、所述益生菌株的代谢产物、及1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸中任一项或其任意的组合。
12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述改善呼吸道健康是抑制细菌生长、提升肺脏细胞的修复能力及/或提升巨噬细胞的吞噬能力。
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