CN101594861A - 前列腺素/环加氧酶代谢途径的调节 - Google Patents

Abstract

通过使用选择性增强15－脱氧－前列腺素J2的产生的药剂可以治疗或预防多种与涉及环加氧酶和前列腺素合成活性的代谢途径有关的疾病和病征，例如，2型糖尿病及其后遗症、缺血性血管病、与炎症相关的疼痛、炎性皮肤病症、脊髓损伤、外周神经病、多发性硬化病、炎性肠病和类风湿性关节炎、以及多种类型的癌症。所述化合物是7－羟基－类固醇或缩合的吲哚。

Description

前列腺素/环加氧酶代谢途径的调节

本发明涉及我们已经发现的一系列化合物，这些化合物调节涉及环加氧酶和前列腺素合酶活性和前列腺素合成的代谢途径，并且因此可以用于治疗和预防多种疾病和病症，所述疾病和病症中的一些已经被证明对于以前的治疗方案非常顽固。

前列腺素(PG)，也称作前列腺素类，是一组广泛分布的氧合脂类，其调节生理和病理条件下的细胞功能。PG的生物合成是通过从细胞膜释放一种主要的脂肪酸花生四烯酸(AA)开始的，其是一种由磷脂酶A2(PLA2)催化的反应。所释放的AA被环加氧酶(COX)转化为不稳定的氧合中间体(PGH₂)。PGH₂中间体一旦形成，就被称作前列腺素合酶的一系列特定酶(例如，PGE合酶或PGE-S，PGD合酶或PGD-S等等)转化为多种前列腺素类，如前列腺素E2(PGE2)、前列环素(PGI2)、前列环素F2α(PGF2α)或前列腺素D2(PGD2)。

COS以三种同种型存在：COX-1、COX-2和COX-1剪接变体COX-3。COX-1在大多数组织中组成型表达，而COX-2通常应答促炎细胞因子和应激而被诱导。这些发现导致如下的直接观点：COX-2负责前列腺素类的不利的促炎性影响。因此，COX-2的抑制已经被认为是研发治疗炎性疾病的药物的主要靶标。然而，研究人员已经表明COX-2在基本的器官和组织内稳态中也起重要作用。

近期的临床试验揭示用COX-2抑制剂长期治疗增加了中风和心肌梗死的发病率，它们是由COX-2衍生的PGI2的血管保护作用阻断导致的并发症。然而，COX酶的阻断也减少了PGD2的产生。在外周组织中，PGD2促进血管扩张并抑制血小板聚集。在脑中，它是最丰富的前列腺素，并且最近的研究表明PGD2介导海马神经元中的神经保护作用。因此，COX-2衍生的PGD2的阻断可促进在用COX-2抑制剂进行的临床试验中观察到的中风和心肌梗死发病率的增加。

PGD2是非常短命的，并且在体内和体外经历脱水以产生J2系列的生物活性前列腺素，包括前列腺素15-脱氧-前列腺素J2(15d-PGJ2)。该前列腺素是PGD2的天然的化学稳定的抗炎衍生物。15d-PGJ₂是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)亚型PPAR_Y的高亲和力配体，PPAR_Y是配体依赖型核转录因子，其已经涉及多种细胞功能，包括抗炎作用。15d-PGJ2通过PPAR_Y-依赖型以及PPAR_Y-不依赖型的机理抑制几种炎症基因，如一氧化氮合酶、前列腺素E合酶(PGES)和肿瘤坏死因子α(TNFα)基因。在大鼠软骨细胞中，15d-PGJ2几乎完全降低了细胞因子刺激的PGE2合成和PGES表达，这表明15d-PGJ2是一种抗炎信使，其在这些细胞中关闭促炎性前列腺素PGE2的产生。不管机理如何，在炎症的消退期中在体内存在15d-PGJ2，这再次表明它可能作为炎症反应的反馈调节子发挥功能。也已经表明，施用15d-PGJ2减少了大鼠中实验性结肠炎的发展，该实验性结肠炎是炎性肠病的模型。打破前列腺素产生的平衡有利于PGD2和15d-PGJ2的药剂和条件因此将预期具有抗炎作用。

在中枢神经系统中，15d-PGJ2的抗炎作用将有利于神经变性病症，如阿尔茨海默氏病、帕金森病和多发性硬化病，以及中风、脊髓损伤、脑外伤，其中炎症促进脑损伤和细胞死亡。在所有这些状况中，脑损伤与过度的小神经胶质活化有关。在中枢神经系统中，小神经胶质细胞——固有的先天免疫细胞，在炎症过程中起主要作用。小神经胶质细胞的不受控制的活化通过释放多种物质如炎性细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)、NO、PGE₂和超氧化物而直接对脑细胞有毒。一些研究表明15d-PGJ2可能抑制活化的小神经胶质细胞和星形细胞产生炎性细胞因子和NO，提示前列腺素类可能在防止与过度神经胶质细胞活化相关的脑损伤中起重要作用。在实验性自体免疫性脑炎(EAE)，即多发性硬化的动物模型，的发作之前和发作之时施用15d-PGJ2显著降低EAE的严重性，这一发现进一步提示15d-PGJ2可有效预防炎性神经变性疾病中的脑损伤。

最近的实验研究表明，在中风实验模型中15d-PGJ2减少了大鼠中脑内出血后的脑组织炎症和行为功能障碍和神经元损失，并且保护脑免于缺血-再灌注损伤。15d-PGJ2的心室内输注以PPAR_Y-依赖型方式减小脑梗死体积，抑制脑和神经元细胞程序性死亡，抑制NF-κB活化，并且上调血加氧酶-1(HO-1)(一种有效的内源抗氧化剂)。这些结果提示15d-PGJ2在缺血性中风中的神经保护效果，得到近期研究的进一步确证，该研究表明急性缺血性中风患者具有比正常受试者更高的血浆15d-PGJ2水平并且升高的血浆15d-PGJ2与更好的早期和晚期神经学结果相关。升高的血浆15d-PGJ2也与减小的梗死体积相关，并且该效果独立于其他重要的预后变量的影响。偏移前列腺素产生的平衡而有利于15d-PGJ2的药剂和条件将因此预期在如下疾病中具有有益效果：慢性炎性神经变性病症，如阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森病(PD)和多发性硬化病，和急性病症，如中风、脊髓损伤和外伤性脑损伤。

AD是进行性且致命的神经变性病症，其特征是细胞外Aβ(淀粉状蛋白β)斑的沉积和在脑中形成细胞内缠结。Aβ斑主要由淀粉状蛋白β和Aβ肽组成。Aβ积累引起炎症反应，已经提出其促进AD的发病和增加神经元损伤。也认为可溶性Aβ肽的升高的脑水平远在斑沉积发生前就引起神经元功能异常和认知损伤。因此，脑中Aβ肽的形成是AD发病的引发性因素。

Aβ的产生由一种蛋白酶启动，该蛋白酶在Aβ肽的N-末端分裂较大的前体蛋白β-淀粉状蛋白前体蛋白(βAPP)。该蛋白酶也称作β-分泌酶或β位点APP分裂酶(BACE1)，是跨膜天冬氨酰蛋白酶。BACE1蛋白质水平和β-分泌酶产物(β-C-末端片段)在偶发性AD患者的脑中增加。减少AD脑中Aβ的产生因此成为主要的治疗目标。

已经报导BACE1mRNA和蛋白质水平通过促炎调控剂升高并且被作为过氧化物酶体增殖物激活受体-Y(PPAR_Y)的激动剂的药物下调。最近，已经表明PPAR_Y的耗尽通过增强BACE1基因启动子活性增强β-分泌酶mRNA水平，而PPAR_Y的表达以及PPAR_Y活化剂通过抑制BACE1基因启动子活性而特异性调节BACE1转录，这表明PPAR_Y可能是BACE1的抑制剂。此外，用PPAR_Y激动剂治疗转基因hAPP-小鼠降低了皮质神经元中的BACE1mRNA和细胞内β-淀粉状蛋白水平。

也已经表明PPAR_Y的过表达通过遍在蛋白化的活化和前体蛋白βAPP的蛋白酶体介导的降解而减少培养的细胞中Aβ的分泌，并且据报道PPAR_Y的活化直接影响外部加入培养的细胞中的Aβ的稳定性。该稳定性的降低提示PPAR_Y活化可能针对淀粉状蛋白肽诱导快速细胞清除机理。

这些数据一起支持PPAR_Y在调节淀粉状蛋白-β产生的调节中的主要作用，并且提示了一种保护性机理，通过该机理PPAR_Y的活化减少了脑中淀粉状蛋白-β肽的产生。

15d-PGJ₂是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)亚型PPAR_Y的高亲和力配体，通过PPAR_Y-依赖型以及PPAR_Y-不依赖型的机理抑制几种炎症基因。增加15d-PGJ2的内源产生的条件因此将预期抑制脑炎症过程，并且减少AD脑中淀粉状蛋白肽的形成。因此，增加内源产生15d-PGJ2的药剂和条件将预期在阿尔茨海默氏病的治疗中具有有益的效果。

J2系列的前列腺素是神经生长因子(NGF)和脑源性神经生长因子(BDNF)生产的有力诱导剂，并且通过NGF促进细胞培养物中神经突增生(neurite outgrowth)。15d-PGJ2的神经突促进能力不是通过PPAR_Y发生的，因为合成的PPAR_Y激动剂和拮抗剂不改变15-脱氧PGJ₂的神经突促进效果。在动物研究中，已经表明脑室内施用NGF挽救了胆碱能神经元，刺激轴突生长并且改善胆碱能功能。类似地，脑室内注射NGF减弱了经受脑缺血的沙鼠海马中的神经元死亡。已经表明BDNF在体外促进发育的神经元的存活和生长，并且改善动物模型中的运动神经元功能。在受到暂时性前脑缺血的动物中，BDNF减弱了缺血性神经元损伤。不幸的是，由于这些神经营养素穿过血脑屏障的弱穿透力，临床实验不能显示显著效果。然而，提高15d-PGJ2的内源水平的条件或治疗将预期均促进局部产生这些生长因子并且促进神经元生长并且因此促进脊髓和脑中的神经元修复。

升高的炎症标记水平与缺血性血管疾病有关，并且炎症越来越被认为与急性冠状动脉综合征的发病机理有关。炎症在动脉粥样硬化的启动和发展中具有相关作用，但是它也可以通过活化凝血过程而在血栓形成发展中起主要作用。减轻血管炎症的条件和试剂因此在其中炎症促进细胞死亡或损伤的心血管病症，如冠心病中是有益的。

前列腺素D合酶(PGDS)mRNA在心脏中表达。从而局部产生的PGD₂可以在肌细胞和周围细胞中导致15d-PGJ₂。PPAR_Y也存在于心肌细胞中并在其中发挥功能。最近的研究表明PGD₂的天然代谢物15d-PGJ₂以PPAR-依赖型方式调节IL-1β刺激的COX-2、PGE-S和iNOS而在心肌细胞中发挥抗炎作用。15d-PGJ₂阻断PGE₂产生的IL-1β刺激但是不改变PGI₂或PGF_2α的IL-1β刺激，这表明PPAR_Y配体效应是PGE-S特异性的。15d-PGJ₂对IL-1β-诱导的PGE-S的阻断将预期减少心脏组织中促炎前列腺素PGE2的产生。也表明15d-PGJ₂上调心肌细胞中血加氧酶-1(HO-1)的表达，并减少区域性缺血-再灌注诱导的心肌梗死的大鼠模型中的心肌梗死尺寸。在所研究的不同的PPAR_Y配体中，15d-PGJ2引起梗死尺寸的迄今为止最显著的减小。尽管该效果通过PPAR_Y介导，但是抗氧化剂和细胞保护蛋白HO-1的增加的表达是PPAR_Y-不依赖性的。这些结果一起表明增加内源15d-PGJ2水平的条件和药剂可以减轻血管炎症并且因此在心血管病症中是有益的。

越来越多的证据将脂肪组织鉴定为循环的炎性因子的主要来源，尤其存在肥胖症时。脂肪产生促炎脂肪细胞因子，其包括TKF-α、瘦蛋白、PAI-1、IL-6和血管紧张素原。TNF-α是NFκB的主要活化剂。TNF-α也抑制胰岛素信号转导，从而引起胰岛素耐受性。PAI-1水平预测CAD和糖尿病，并且它们是肥胖症中的前血栓形成状态的主要贡献者。IL-6刺激肝脏产生C-反应蛋白(CRP)并且促进肥胖受试者血清中升高的高敏感性(hs)CRP水平。HsCRP预测心肌梗死、中风、外周动脉疾病，和突然死亡。血管紧张素原是Ang II的前体，已知Ang II活化血管损伤的多种机理。通常，所有这些脂肪因子在具有增加的内脏肥胖的胰岛素耐受性受试者中都升高，产生促炎环境。因此，2型糖尿病(T2D)和肥胖症是炎性病症。

与其他组织相比，脂肪组织表达最高水平的PPAR_Y。PPAR_Y配体促进脂肪细胞分化和游离脂肪酸向脂肪组织的摄入。它们通过降低TNF-α、PAI-1和IL-6表达和增加脂肪中脂连蛋白表达而对于减弱促炎性环境也具有重要效果。从而，PPAR_Y活化直接抑制血管细胞中的炎症并且通过调节脂肪组织中的基因表达间接抑制炎症。

T2D和代谢综合征的特征是对外周组织中胰岛素的作用的抗性，所述外周组织包括骨骼肌、肝脏和脂肪组织。T2D啮齿动物模型中，某些合成配体，如噻唑啉二酮类对PPAR_Y的活化提高胰岛素的敏感性并且降低了葡萄糖、甘油三酯和游离脂肪酸的循环水平，而不刺激胰岛素分泌。PPAR_Y激动剂也减轻人类中的外周胰岛素抗性并且被有效用于治疗T2D患者。

15-脱氧-前列腺素J2(15d-PGJ2)是天然的、化学稳定的抗炎前列腺素，其似乎是过氧化物酶体增殖物激活受体亚型PPAR_Y的内源性高亲和力配体。因此，增加15d-PGJ2的内源产生的药剂和条件将预期抑制血管炎症和提高2型糖尿病患者中的胰岛素敏感性。

促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)-α在银屑病和特应性皮炎中过表达。TNF-α在炎症的起始和持续中都起重要作用，并且最近的实验数据表明银屑病的实验模型中损伤的发展是通过TNF-α介导的。这些发现提示TNF-α在银屑病的发病机理中的作用，得到最近的临床试验结果的支持，所述结果表明施用抗TNF-α的单克隆抗体(mAb)(英夫利昔单抗)或者可溶性TNF受体融合蛋白(依那西普)导致银屑病患者中的疾病改善。

15d-PGJ₂是前列腺素PGD2的化学稳定的代谢物，是过氧化物酶体增殖物激活受体Y(PPAR_Y)的高亲和力配体。

15d-PGJ₂在活化的巨噬细胞、在小神经胶质细胞和人类星形细胞中抑制几种促炎基因，包括诱导型NO合酶(iNOS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因，并且该抑制至少部分依赖于PPAR_Y的表达。此外，已经表明，合成的PPAR_Y配体，如胰岛素敏化性噻唑啉二酮类改善人类受试者中的银屑病。这些发现一起提示增加15d-PGJ₂的内源产生的药剂和条件在银屑病的治疗中可以是有效的。

最近的证据表明某些合成的PPAR_Y激动剂显示出对许多上皮来源的人类癌细胞系的适度抗增殖活性。此外，最近的数据表明正常的前列腺上皮细胞和T淋巴细胞更抗这些PPAR_Y配体的细胞凋亡诱导作用。根据该癌症特异性效果，PPAR_Y激动剂作为化学预防剂的潜在用途得到了很多关注。

已经表明15d-PGJ₂——PPAR_Y的天然配体，具有抗肿瘤活性。例如，15d-PGJ₂在一些类型的癌细胞，包括结肠直肠、胃、乳腺和肝癌细胞中显著抑制细胞生长和诱导细胞细胞程序性死亡。机理研究提示这些生长抑制效果通过依赖于PPAR_Y的机理介导。然而，不管所涉及的机理，预期提高15d-PGJ₂的内源水平的药剂或条件将抑制肿瘤生长和发展。

已经在多种恶性肿瘤中检测到升高的前列腺素E₂(PGE₂)水平。除了发现肿瘤中升高水平的PGE₂外，一些证据表明PGE₂在癌症的发生和进展中起作用。例如，PGE₂可以刺激细胞增殖和运动性而抑制细胞程序性死亡和免疫监视。重要的是，PGE₂也可以诱导血管发生，其至少部分是通过增强促血管发生因子(包括血管内皮生长因子)的产生实现的。与这些发现一致的是，已经表明癌组织样品中较高水平的PGE₂与转移性疾病和增加的肿瘤血管化的发生显著相关。

在实验动物中的最近工作也提示PGE₂可以促进癌发生。发现PGE₂受体EP₂的遗传破坏减小了实验肿瘤的数目和大小，并且其他研究表明用抗PGE₂单克隆抗体治疗抑制了可移植的肿瘤的生长。考虑到该背景，可以预期，抑制导致癌中增加量的PGE₂的酶促途径的药剂和条件也抑制肿瘤生长的进展。

从花生四烯酸合成PGE₂需要两种顺序作用的酶：环加氧酶(COX)和前列腺素E合酶(PGES)。已经在一些人类恶性肿瘤中检测到PGES的增加的表达，引起了如下可能性：异常的PGES表达驱动增加的PGE₂产生，其促进细胞增殖和肿瘤生长。也已经报道15d-PGJ2几乎完全抑制细胞因子诱导的PGE₂合成和膜PGE-合酶表达。因此，预期增加15d-PGJ2的内源水平的药剂和条件将减少PGE₂合成并因此减少细胞增殖和肿瘤生长，因此在癌症的治疗中具有有益效果。

我们以前已经表明一种内源性7-羟基类固醇7β-羟基表雄酮(7β-hydroxy-EPIAndrosterone)(7β-OH-EPIA)具有神经保护和心脏保护作用(WO 02/00224，WO 02/00225和WO 03/015791)。这些类固醇在体外(器官特征海马切片培养物(OTHSC)和PC12细胞)保护神经元细胞免于死亡，并在许多体内实验模型中保护免于脑损伤，并且在灌注的大鼠心脏中保护免于区域性缺血诱导的心肌梗死中是有效的。这些发现一起提示7β-OH-EPIA在预防和治疗神经变性病症，如中风、脊髓损伤、外伤性脑损伤和AD，以及在心血管病症如心肌梗死(MI)中可以具有有益效果。

近来，我们已经表明PC 12细胞与一种环加氧酶(COX)抑制剂吲哚美辛温育完全钝化了7β-OH-EPIA-诱导的对缺血的保护作用。这些结果提示COX活性是7β-OH-EPIA的神经保护作用所需的。

我们现在表明用纳摩尔浓度7β-OH-EPIA温育人单核血细胞(hMBC)引起前列腺素15脱氧-Δ12，14-J2(15d-PGJ2)产生的几乎升高10倍。该7-羟基类固醇的效果似乎是15d-PGJ2特异性的，因为该类固醇不显著改变这些细胞中前列腺素E2(PGE2)的产生。相反，hMBC与促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNPα)的温育使两种前列腺素的产生都提高了约3倍。此外，TNF-α和7β-OH-EPIA的共同温育引起15d-PGJ2的增加类似于仅用7β-OH-EPIA观察到的增加，而加入纳摩尔浓度的7β-OH-EPIA完全消除了TNFα引起的PGE2的增加。

已经报道15d-PGJ2几乎完全抑制大鼠软骨细胞中细胞因子诱导的PGE2合成和膜PGE-合酶(mPGES)的表达，这表明15d-PGJ2是一种抗炎信使，其关闭这些细胞中促炎性前列腺素PGE2的产生。我们的发现因此可以表明通过7β-OH-EPIA抑制TNFα-诱导的促炎性前列腺素PGE2的产生是由15d-PGJ2的增加的释放介导的。

15d-PGJ2是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)亚型PPAR_Y的高亲和力配体，PPAR_Y是一种配体依赖性核转录因子，已经表明其参与多种细胞功能，包括抗炎、神经保护、心脏保护、代谢和抗肿瘤作用。我们现在发现诸如7β-OH-EPIA的药剂可以选择性促进15d-PGJ₂的产生，因此可以在炎症和皮肤病症，如炎性肠病和银屑病，以及神经、心血管和代谢病症如中风、脊髓损伤、外伤性脑损伤、AD、PD、冠心病和2型糖尿病(其中炎症促进功能异常和细胞死亡)和多种类型的癌症(其中增加的PGE2产生促进细胞增殖和肿瘤生长)中是有益的。

从而，一方面，本发明在于增强15-脱氧前列腺素J2的产生的药剂用于制备这样的药物的用途，所述药物用于治疗或预防由增强水平的前列腺素E2或者环加氧酶和前列腺素合酶活性的其他代谢物介导的病症、或者治疗或预防由于降低水平的15-脱氧前列腺素J2或减少的15-脱氧前列腺素J2的可用性而恶化的病症。

另一方面，本发明在于促进15-脱氧前列腺素J2的产生并在引起癌症的试剂存在下选择性抑制前列腺素E2的产生的药剂的用于制备这样的药物的用途，所述药物用于治疗或预防增强水平的前列腺素E2或者环加氧酶-2的其他代谢物介导的病症、或者治疗或预防由于降低水平的15-脱氧前列腺素J2或减少的15-脱氧前列腺素J2的可用性而恶化的病症。

另一方面，本发明在于增强15-脱氧前列腺素J2的产生的药剂用于制备促进神经突增生或治疗外周神经病的药物的用途。

外周神经病可以是由于化学治疗剂，如顺铂的治疗引起的，或者它可以由于其他原因，如糖尿病性神经病变引起的。

在再一方面，本发明在于增强15-脱氧前列腺素J2的产生并又活化PPARγ的药剂用于制备治疗需要活化PPARγ的病症的药物的用途。

在再一方面，本发明提供了增强15-脱氧前列腺素J2的产生的化合物用于制备治疗或预防癌症的药物的用途。

此外，本发明提供了增强15-脱氧前列腺素J2的产生的化合物用于制备抑制癌细胞增殖、在癌细胞中诱导凋亡或抑制肿瘤生长和进展的药物的用途。

本发明的该方面尤其有用的癌细胞包括结肠直肠的、胃、乳腺、肝脏、前列腺、膀胱、甲状腺乳头状的和食管的癌细胞。

此外，本发明的化合物可以用于治疗和预防：

与炎症相关的疼痛；

外周动脉病(包括损害流向四肢的血流的病症和由外周动脉粥样硬化引起的病症)，以及它们的后遗症，如严重四肢缺血；

冠状动脉病及其后遗症，如缺血性心脏病(如稳定和不稳定型心绞痛)和心肌梗死(MI)；

脑血管疾病及其后遗症，如中风和短暂性缺血发作(TIA)；

肝脏和肾脏缺血，如动脉粥样硬化性肾动脉狭窄；

代谢疾病，如2型糖尿病及其后遗症，如外周动脉病、冠状动脉病、肾的血管病和糖尿病性神经病变；

肥胖症及其后遗症，如2型糖尿病、外周动脉病和冠状动脉病；

炎性呼吸道疾病，如哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)，例如，慢性支气管炎；

慢性神经变性疾病，如阿尔茨海默氏病、帕金森病、多发性硬化和外周神经病；

急性神经变性病症，如外伤性脑损伤和脊髓损伤；

炎性肠病；

特征是关节软骨变性的炎性疾病，如类风湿性关节炎以及原发性和继发性骨关节炎和它们的后遗症；和

伤口愈合；和

由化学治疗剂引起的毒性或外周神经病。

优选地，这些试剂可以用于治疗糖尿病及其后遗症；缺血性血管病；与炎症相关的疼痛；炎性皮肤病症；脊髓损伤；外周神经病；多发性硬化病；炎性肠病；类风湿性关节炎；代谢综合征X；肥胖症；肢端肥大症和伤口愈合。

此类试剂也可以用于治疗或预防如下病症，如外周器官如肝脏和肾脏的炎性疾病，例如，由肝脏和肾脏局部缺血引起的炎性疾病。

这些试剂可以治疗的其他炎性病症包括炎性呼吸道疾病，如哮喘、鼻炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)。

本发明通过附图阐明，其中和下文中，7β-羟基表雄酮在下文中被称作7β-OH EPIA。在所述附图中：

图1显示了来自实施例1中4个单独实验的平均细胞死亡百分比组合数据，数据以平均值±sem表示；

图2显示了实施例1中报告的单独实验中的平均细胞死亡百分比；

图3显示了实施例1中报告的单独实验中的平均细胞死亡百分比；

图4显示了实施例1中报告的单独实验中的平均细胞死亡百分比；

图5(a)和5(b)显示了如实施例2中报告，在TNF-α存在和不存在下，与7β-OH-EPIA温育的外周血单核细胞的细胞上清液中检测的升高浓度的7β-OH-EPIA对PGD₂水平的影响；

图6(a)和6(b)显示了如实施例2中报告，在TNF-α存在和不存在下，与7β-OH-EPIA温育的外周血单核细胞的细胞上清液中检测的升高浓度的7β-OH-EPIA对PGE₂水平的影响；

图7(a)和7(b)显示了如实施例2中报告，在TNF-α存在和不存在下，与7β-OH-EPIA温育的外周血单核细胞的细胞上清液中检测的升高浓度的7β-OH-EPIA对15d-PGJ₂水平的影响；

图8显示了7β-羟基-EPIA处理对结肠组织中(A)髓过氧化物酶(MPO)和氧化胁迫标记即(B)Prot CO，(C)Tbars和(D)抗氧化标记GSH的影响，如实施例4中更详细描述。

图9显示了在实施例4中在7β-羟基-EPIA处理期间不同时刻结肠5d-PGJ₂水平(A)和COX-2、mPGES-1和H-PGDS的相对mRNA表达的定量(B)。

图10显示了在实施例4中在DSS施用期间，7β-羟基-EPIA对前列腺素E₂、D₂和15d-PGJ₂的结肠合成的影响。

图11显示了在实施例4中的结肠炎诱导期间COX-2、mPGES-1和H-PGDS mRNA的结肠表达。

可以用于本发明的化合物包括下式(I)的那些化合物及其药用盐和酯：

其中：

虚线环形表示含有其的环可以是完全饱和的或者可以具有1、2或3个碳-碳双键；

虚线表示该键可以是碳-碳单键或者双键；

R¹表示氢原子或者甲基基团；和

R²、R³和R⁴相互相同或不同并且每个代表氧代基团、羟基基团、巯基基团、氢原子、卤原子、烷氧基基团、芳氧基基团或者酰基基团。

上式中的数字(3)和(7)仅用于指导，以指出所用的编号体系。当然，当R²代表氧代基团时，虚线环形可以仅仅代表完全饱和的环(在这种意义上，该环中没有双键)，或者一个或两个双键。

在这些化合物中，优选的化合物包括下式(II)的那些化合物(其中R¹、R²、R³和R⁴如上文定义)及其酯：

这些化合物的另一优选类别是下式(III)的那些化合物(其中R^2a代表氧代基团、羟基基团、巯基基团或者卤原子；R¹、R³和R⁴如上文定义)及其酯：

这些化合物的另一优选类别是下式(IV)的那些化合物(其中R¹、R²、R³和R⁴如上文定义)及其酯：

这些化合物的另一优选类别是式(V)的那些化合物：

其中R²、R³和R⁴如上文定义。

式(II)的化合物的实例包括7-羟基睾酮及其酯，7-羟基睾酮具有式(IIa)：

该化合物中的7-羟基基团可以为α或β构型，或者可以使用两种异构体的混合物。

式(III)的化合物的实例包括7α-羟基-脱氢表雄酮(7α-羟基-DHEA)，及其酯，7α-羟基-脱氢表雄酮具有式(IIIa)：

并且包括和7β-类似物及其酯，7β-类似物具有式(IIIb)：

并且包括7β-羟基-孕烯醇酮及其酯，7β-羟基-孕烯醇酮具有式(IIIc)：

并且包括7α-羟基类似物及其酯。

式(IV)化合物的实例包括7-羟基表雄酮及其酯，所述7-羟基表雄酮可以为其7α或7β异构体的形式。下文中称作7β-OH EPIA的7-羟基表雄酮具有式(IVa)：

而下文中称作7α-OH EPIA的7α-羟基表雄酮具有式(IVb)：

式(V)的化合物的实例是7β-羟基-17β-雌二醇，其具有式(Va)：

及其酯，及其7α-类似物和酯，和7β-羟基-雌酮，其具有式(Vb)：

及其酯，及其7α-类似物和酯.

在本发明的化合物中，当R²、R^2a、R³或R⁴代表卤原子时，其可以是氟、氯、溴或碘原子，优选是氯原子。

当R²、R^2a、R³或R⁴代表烷氧基基团时，其可以是直链或支链基团，优选具有1到6个碳原子。此类基团的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基基团。

当R²、R^2a、R³或R⁴代表芳氧基基团时，其优选是苯氧基或萘氧基基团。

当R²、R^2a、R³或R⁴代表酰基基团时，其可以是例如脂族酰基基团或者芳族酰基基团。脂族酰基基团的实例包括具有1到6个碳原子的基团，如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基和己酰基。芳族酰基基团的实例包括苯甲酰基、萘甲酰基和甲苯酰基基团。

应该理解，当该化合物含有式-OR的基团，其中R是如上关于R²等定义的任一基团和原子时，活性种类可能是含有自由羟基基团的化合物。因此，可以在体内被转化为羟基基团的任一基团可以用于代替羟基基团。

通过自身公知的多种方法，从亲本类固醇开始，可以制备这些化合物。例如，它们可以通过EP 1294382中描述的方法制备。

式(I)的化合物公开于EP 1294382、WO2002/000224和WO2002/000225中，用于治疗或预防慢性和急性神经变性疾病或者病症，并且公开于WO2002/015791中用于治疗或预防慢性和急性心脏变性疾病或病症，并且当然，此类治疗或预防仅在对于式(I)化合物的情况下从本权利要求书中排除。

可以用于本发明的另一类化合物包括式(VI)的那些化合物：

其中：

X代表式＞CR⁵R⁶的基团，或当R¹⁰不代表氢原子时，X代表式＞SO₂的基团；

Y代表式＞NH或者＞CR⁵R⁶的基团；

Z代表式＞C＝O的基团、式＞CH₂的基团或者直接键；

R⁵代表氢原子并且R⁶代表氢原子、羧基基团或者羟基基团；

或

R⁵和R⁶一起代表氧代基团、亚甲二氧基基团或者羟基亚氨基基团；

R⁷代表氢原子或者低级烷基基团；

R⁸代表两个氢原子，或者氧代基团或者羟基亚氨基基团；

R⁹代表氢原子、低级烷基基团或者卤原子；

R¹⁰代表氢原子、低级烷基基团或者羧基基团；

R¹¹和R¹²彼此相同或不同并且各自代表氢原子、低级烷基基团或者卤原子；

并且当该化合物含有羧基时，包括其盐和酯。

在式(VI)的化合物中，Z可以是直接键，在该情况下它形成与5元含氮杂环稠合的5元环的部分，或者它可以是式＞CH₂或＞C＝O的基团，在该情况下它形成6元环。

当R⁷、R⁹、R¹¹或R¹²代表低级烷基基团时，这可以是直链或支链低级烷基基团，其具有1到10个，优选1到6个碳原子。此类基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、2-甲基丁基、1-乙基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、己基、异己基、庚基、辛基、壬基和癸基，其中甲基、乙基、丙基、丁基和己基基团是优选的，甲基和乙基基团更优选，并且甲基基团是最优选的。

当R⁹、R¹¹或R¹²代表卤原子时，这可以是氟、氯、溴或碘原子，其中氟和氯原子是优选的。

当R¹⁰代表低级烷氧基基团时，这可以是直链或支链低级烷氧基基团，其具有1到10个，优选1到6个碳原子。此类基团的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、2-甲基丁氧基、1-乙基丙氧基、4-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、1-甲基戊氧基、3，3-二甲基丁氧基、2，2-二甲基丁氧基、1，1-二甲基丁氧基、1，2-二甲基丁氧基、1，3-二甲基丁氧基、2，3-二甲基丁氧基、2-乙基丁氧基、己氧基、异己氧基、庚氧基、辛氧基、壬氧基和癸氧基基团，其中甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和己氧基基团是优选的，甲氧基和乙氧基基团是更优选的，并且甲氧基基团是最优选的。

在本发明的化合物中，我们尤其优选这些化合物，及其盐和酯，在所述化合物中：

X代表式＞CR⁵R⁶的基团，其中R⁵代表氢原子并且R⁶代表氢原子、羟基基团或羧基基团，或者R⁵和R⁶一起代表氧代基团或者亚甲二氧基己基；

Y代表式＞CR⁵R⁶的基团，其中R⁵代表氢原子并且R⁶代表氢原子或羧基基团；

R⁷代表氢原子；

R⁸代表两个氢原子或者氧代基团；

R⁹代表氢原子；

R¹⁰代表氢原子、C₁-C₄烷氧基基团或者羧基基团；R¹¹和R¹²彼此相同或不同并且各自代表氢原子或者C₁-C₄烷基基团。

本发明的化合物的特定实例在下面的表1中给出：

表1

式(VI)的最优选的化合物是上表中编号为4、6、7、8、10、14、15、16、17、20、21、22和23的那些化合物。

当本发明的化合物含有羧基基团，例如，当R⁵或R¹⁰代表羧基基团时，本发明的化合物可以形成酯，其可以通过常规酯化技术制备。对于酯的性质没有特别限制，条件是当所得的化合物用于医用时，该化合物是可药用的，即它不比亲本化合物的活性更低，或者具有不可接受的更低的活性，也不会更具毒性，或者具有不更接受的更高毒性。然而，当该化合物用于非医学用途时，例如，作为制备其他化合物的中间体，甚至不应用该限制，并且则对可以形成的酯的性质没有限制。

酯基的实例包括：

具有1到20个碳原子，更优选1到10个碳原子的烷基，如关于R⁷，R⁹，R¹¹或R¹²所示例的那些和如本领域公知的高级烷基，如十二烷基、十三烷基、十五烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基基团；

具有3到7个碳原子的环烷基基团，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基基团；

芳烷基基团，其中烷基部分具有1到3个碳原子并且芳基部分是具有6到14个碳原子的碳环芳基基团，其可以是取代或未取代的；此类芳烷基基团的实例包括苯甲基、苯乙基、1-苯乙基、3-苯丙基、2-苯丙基、1-萘甲基、2-萘甲基、2-(1-萘基)乙基、2-(2-萘基)乙基、二苯甲基(benzhydryl)(即，二苯基甲基(diphenylmethyl))、三苯甲基、双(邻-硝基苯基)甲基、9-蒽基甲基、2，4，6-三甲基苄基、4-溴代苄基、2-硝基苄基、4-硝基苄基、3-硝基苄基、4-甲氧基苄基和胡椒基基团；

具有2到6个碳原子的链烯基基团，如乙烯基、烯丙基、2-甲基烯丙基、1-丙烯基和异丙烯基；

具有1到6、优选1到4个碳原子的卤代烷基基团，如2，2，2-三氯乙基、2-卤代乙基(例如，2-氯乙基、2-氟乙基、2-溴乙基或2-碘乙基)、2，2-二溴乙基和2，2，2-三溴乙基基团；

取代的甲硅烷基烷基基团，例如，2-三(C₁-C₄)烷基甲硅烷基乙基基团，特别是2-三甲基甲硅烷基乙基基团；

取代的和未取代的苯基基团，例如，苯基、甲苯基和苯甲酰氨基苯基基团；

取代的和未取代的苯甲酰甲基基团，例如，苯甲酰甲基基团自身或者对-溴苯甲酰甲基基团；

环状和非环萜烯基基团，例如，香叶基、橙花基、里哪基、植基、

基(特别是间-和对-

基)、苧基、蒈烷基、蒎烷基、龙脑基、降蒈烷基、降蒎烷基、降冰片基、松油基、莰烯基和降冰片烯基基团；

烷氧基甲基基团，其中烷氧基部分具有1到6个、优选1到4个碳原子并且可以自身被单个未取代的烷氧基基团取代，如甲氧基甲基、乙氧基甲基、丙氧基甲基、异丙氧基甲基、丁氧基甲基和甲氧基乙氧基甲基基团；

脂族酰氧基烷基基团，其中所述酰基基团优选为烷酰基基团并且更优选为具有2到6个碳原子的烷酰基基团，并且所述烷基部分具有1到6个，优选1到4个碳原子，如乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基、异丁酰氧基甲基、新戊酰氧基甲基、1-新戊酰氧基乙基、1-乙酰氧基乙基、1-异丁酰氧基乙基、1-新戊酰氧基丙基、2-甲基-1-新戊酰氧基丙基、2-新戊酰氧基丙基、1-异丁酰氧基乙基、1-异丁酰氧基丙基、1-乙酰氧基丙基、1-乙酰氧基-2-甲基丙基、1-丙酰氧基乙基、1-丙酰氧基丙基、2-乙酰氧基丙基和1-丁酰氧基乙基基团；

环烷基取代的脂族酰氧基烷基基团，其中酰基优选为烷酰基并且更优选为具有2到6个碳原子的烷酰基，环烷基取代基具有3到7个碳原子，并且烷基部分具有1到6个、优选1到4个氮原子，如环己基乙酰氧基甲基、1-(环己基乙酰氧基)乙基、1-(环己基乙酰氧基)丙基、2-甲基-1-(环己基乙酰氧基)丙基、环戊基乙酰氧基甲基、1-(环戊基-乙酰氧基)乙基、1-(环戊基乙酰氧基)丙基和2-甲基-1-(环戊基乙酰氧基)-丙基基团；

烷氧基羰基氧基烷基基团，特别是1-(烷氧基羰基氧基)乙基，如1-甲氧基羰基氧基乙基、1-乙氧基羰基氧基乙基、1-丙氧基羰基氧基-乙基、1-异丙氧基羰基氧基乙基、1-丁氧基羰基氧基乙基、1-异丁氧基羰基-氧基乙基、1-仲丁氧基羰基氧基乙基、1-叔-丁氧基羰基氧基乙基、1-(1-乙基-丙氧基羰基氧基)乙基和1-(1，1-二丙基丁氧基羰基氧基)乙基，和其他烷氧基羰基烷基基团，其中烷氧基和烷基基团都具有1到6个、优选1到4个碳原子，如2-甲基-1-(异丙氧基-羰基氧基)丙基、2-(异丙氧基羰基氧基)丙基、异丙氧基羰基氧基甲基、叔丁氧基羰基氧基甲基、甲氧基羰基氧基甲基和乙氧基羰基氧基甲基基团；

环烷基羰基氧基烷基和环烷基氧基羰基氧基烷基基团，例如，1-甲基环己基羰基氧基甲基、1-甲基环己氧基羰基氧基甲基、环戊氧基羰基氧基甲基、环戊基羰基氧基甲基、1-(环己氧基-羰基氧基)乙基、1-(环己基羰基氧基)乙基、1-(环戊氧基羰基氧基)-乙基、1-(环戊基羰基氧基)乙基、1-(环庚氧基羰基氧基)乙基、1-(环庚基羰基氧基)乙基、1-甲基环戊基羰基氧基甲基、1-甲基-环戊氧基羰基氧基甲基、2-甲基-1-(1-甲基环己基羰基氧基)-丙基、1-(1-甲基环己基羰基氧基)丙基、2-(1-甲基环己基羰基-氧基)丙基、1-(环己基羰基氧基)丙基、2-(环己基羰基氧基)丙基、2-甲基-1-(1-甲基环戊基羰基氧基)丙基、1-(1-甲基环戊基-羰基氧基)丙基、2-(1-甲基环戊基羰基氧基)丙基、1-(环戊基-羰基氧基)丙基、2-(环戊基羰基氧基)丙基、1-(1-甲基环戊基-羰基氧基)乙基、1-(1-甲基环戊基羰基氧基)丙基、金刚烷基氧基-羰基氧基甲基、金刚烷基羰基氧基甲基、1-金刚烷基氧基羰基氧基乙基和1-金刚烷基羰基氧基乙基基团；

环烷基烷氧基羰基氧基烷基基团，例如，环丙基甲氧基-羰基氧基甲基、环丁基甲氧基羰基氧基甲基、环戊基甲氧基-羰基氧基甲基、环己基甲氧基羰基氧基甲基、1-(环丙基甲氧基-羰基氧基)乙基、1-(环丁基甲氧基羰基氧基)乙基、1-(环戊基甲氧基-羰基氧基)乙基和1-(环己基甲氧基羰基氧基)乙基基团；

萜烯基羰基氧基烷基和萜烯基氧基羰基氧基烷基基团，例如1-(

基氧基羰基氧基)乙基、1-(基羰基氧基)乙基、基氧基羰基-氧基甲基、

基羰基氧基甲基、1-(3-蒎烷基氧基羰基氧基)乙基、1-(3-蒎烷基羰基氧基)乙基、3-蒎烷基氧基羰基氧基甲基和3-蒎烷基羰基-氧基甲基基团；

5-烷基-或5-苯基-(2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)烷基基团，例如，(5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基、(5-苯基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基、(5-异丙基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基、(5-叔丁基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基和1-(5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)乙基基团；和

其他基团，特别是在体内容易去除的基团，如2-苯并[c]呋喃酮基、2，3-二氢化茚基和2-氧代-4，5，6，7-四氢-1，3-苯并二氧杂环戊烯-4-基基团。

而且，如果本发明的化合物含有羧基基团，那么它们可以通过常规方法用碱转化为盐。对于此类盐的性质没有特别限制，条件是当化合物用于医用时，所述化合物是可药用的。然而，当化合物用于非医用用途时，如作为制备其他化合物的中间体时，甚至不应用该限制，并且则对于可以形成的盐的性质没有限制。此类盐的实例包括：与碱金属，如钠、钾或锂形成的盐；与碱土金属如钡或钙形成的盐；与其他金属如镁或铝形成的盐；铵盐；有机碱盐，如与甲胺、二甲胺、三乙胺、二异丙胺、环己胺或二环己胺形成的盐；和与碱性氨基酸如赖氨酸或精氨酸形成的盐。我们优选可药用的盐。

本发明的化合物也可以通过常规方法用酸转化为盐。对于此类盐的性质没有特别限制，条件是当化合物用于医用时，所述化合物是可药用的。然而，当化合物用于非医用用途时，如作为制备其他化合物的中间体时，甚至不应用该限制，并且对于可以形成的盐的性质没有限制。此类盐的实例包括：与无机酸，特别是与氢卤酸(如氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸或氢氯酸)、硝酸、高氯酸、碳酸、硫酸或磷酸形成的盐；与低级烷基磺酸如甲磺酸、三氟甲磺酸或乙磺酸形成的盐；与芳基磺酸，如苯磺酸或对-甲苯磺酸形成的盐；与有机羧酸，如与乙酸、富马酸、酒石酸、草酸、马来酸、苹果酸、琥珀酸、苯甲酸、扁桃酸、抗坏血酸、乳酸、葡糖酸或柠檬酸形成的盐；和与氨基酸，如与谷氨酸或天冬氨酸形成的盐。我们优选可药用的盐。

式(VI)的化合物公开于WO2006/082409中，用于治疗或预防慢性和急性神经变性疾病或病症，并且当然地，此类治疗和预防仅在式(VI)的化合物的情况下从本权利要求书中排除。

本发明的化合物因此可以用于治疗或预防多种慢性和急性疾病或病症，并且对于这些目的，可以配制为常规的药物制剂，如本领域公知。从而，化合物可以口服施用，例如，以片剂、胶囊剂、粒剂、粉剂、糖浆剂、喷雾剂形式或其他这样公知的形式施用，或者肠胃外施用，例如，通过注射、喷雾、眼滴剂、橡皮膏或栓剂等等施用。

这些药物制剂可以通过常规方法制备，并且可以含有本领域常用类型的已知佐剂，例如赋形剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味剂等等，这取决于预期的用途和制剂形式。剂量将取决于患者的状况、年龄和体重以及被治疗的病症的性质和严重性，但是给成年人患者在口服施用的情况下，我们将通常建议总的日剂量为0.01到50mg/kg体重(更优选0.05到20mg/kg体重)，其可以以单次剂量或者分份剂量施用，例如每天1次到3次。

通常，本发明的化合物可以用于治疗或预防多种炎性病症或者由导致炎症的代谢途径引起的病症。这些化合物的用途实例包括：促进神经突生长；治疗或预防糖尿病(特别是2型糖尿病)及其后遗症；治疗和预防缺血性血管病；治疗与炎症相关的疼痛；和治疗和预防炎性皮肤病症，包括银屑病和伤口愈合。通过使用本发明的化合物可以治疗或预防，或者缓和其效果的其他炎症状况包括脊髓损伤、外周神经病、多发性硬化病、炎性肠病、类风湿性关节炎；和由化学治疗剂如顺铂、或其他原因如糖尿病性神经病变引起的外周神经病或毒性。最后，通过使用本发明的化合物可以治疗或预防，或者缓和其效果的病症也包括多种类型的癌症。

通过下面的非限制性实施例进一步阐明本发明。

实施例1

7β-羟基-表雄酮对PC-12细胞中的局部缺血的保护作用：通过环加氧酶 (COX)抑制剂吲哚美辛的抑制

该实施例的目的是研究在通过吲哚美辛减弱前列腺素合成的缺氧模型中，7β-OH-EPIA是否保持其神经保护功效。使用的主要的实验系统是PC12细胞中局部缺血诱导的细胞毒性。测量的实验终点是细胞死亡。

局部缺血诱导的PC-12细胞死亡始终被7β-OH-EPIA减少。阻断前列腺素合成的吲哚美辛(10μM)对于局部缺血诱导的细胞死亡没有直接影响，但是完全拮抗1μM和10uM 7β-OH-EPIA的神经保护作用，这支持如下假说：前列腺素合成是7β-OH-EPIA的神经保护作用所必需的。

方法

PC-12细胞培养

PC-12细胞保持在用1型胶原包被的烧瓶中的PC-12培养基中，该培养基具有下面的组成：没有L-谷氨酰胺的RPMI 1640，与2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，1mM丙酮酸钠、额外的葡萄糖以得到终浓度4.5g/L(RPMI通常具有2g/L)，10％热灭活的马血清，5％胎牛血清和50单位的青霉素/链霉素。培养基每2天更换。

PC-12细胞测定

PC-12细胞的汇合培养物通过在没有血清但是有50ng/ml NGF的PC-12培养基(PC-12NGF培养基)中培养7天进行分化。收获细胞，洗涤，计数并以1×10⁵个PC-12细胞/孔过夜接种在微量滴定板中没有葡萄糖的PC-12NGF培养基中。然后将培养基更换为含有待测化合物的没有葡萄糖的PC-12NGF培养基，并将平板在含氧量正常的条件下放置30分钟。

在该阶段，缺氧暴露的培养基和测试物质都置于室中并用95％N₂/5％CO₂脱氧。平板中的培养基用脱氧的培养基更换并将平板置于充有95％N₂5％CO₂的无氧室中10分钟后密封并在37℃过夜温育(18小时)。对于含氧量正常对照，细胞用缺血处理进行相同处理，只是所有培育都在5％CO₂/95％空气中进行。

使用锥虫蓝排阻测定存活力。

结果

PC-12相对抗缺氧。为此，我们使用更严格的组合氧-葡萄糖耗尽(i局部缺血)方案来引起毒性(图1)。7β-OH-EPIA在该测定中是剂量依赖性细胞保护的，在1uM(细胞死亡减少26％)和10uM(细胞死亡减少53％)下观察到显著的神经保护。图1给出了来自四个实验的组合数据，显示了该效果。图1显示了来自四次独立实验的组合数据的平均细胞死亡百分比。该数据表示为平均值±sem。仅用局部缺血观察到76％±2.2％细胞死亡。用1μM 7β-OH-EPIA(细胞死亡减少26％，p＜0.001)，10μM7β-OH-EPIA(细胞死亡减少53％，p＜0.001)观察到细胞死亡的统计学显著减少，相对于仅局部缺血^＊＊＊＝p＜0.001。

NMDA受体拮抗剂MK-801也降低了PC-12细胞的局部缺血(ischaemia)-诱导的毒性(图2)。环加氧酶抑制剂吲哚美辛在100μM下具有适度的保护效果(细胞死亡减少29％)，但是在更低浓度下没有保护效果(图2)。图2显示了平均细胞死亡百分比。数据表示为平均值±sem。仅用局部缺血观察到79％±5.3％细胞死亡。用100μM吲哚美辛(IM)(细胞死亡减少29％，p＜0.05)、10μM MK801(细胞死亡减少62％，p＜0.001)观察到细胞死亡的统计学显著减少，相对于仅局部缺血^＊＊＝p＜0.01，^＊＊＊＝p＜0.001。

7β-OH-EPIA的神经保护作用被10-100μM吲哚美辛(IM)完全拮抗(图3)，这些培养基的毒性与仅仅暴露于局部缺血(ischaemia)的培养物不可区分。图3显示了平均细胞死亡百分比。数据表示为平均值±sem。仅用局部缺血观察到76％±4.2％的细胞死亡。用10μM 7β-OH-EPIA(细胞死亡减少50％，p＜0.001)，10μM MK801(细胞死亡减少42％，p＜0.001)观察到细胞死亡的统计学显著减少，相对于仅局部缺血^＊＊＊＝p＜0.001。

如图4中所见，10μM吲哚美辛完全拮抗了1μM和10μM7β-OH-EPIA的保护效果。图4显示了平均细胞死亡百分比。数据表示为平均值±sem。仅用局部缺血观察到76％±4.8％的细胞死亡。用1μM 7β-OH-EPIA(细胞死亡减少25％，p＜0.05)，10μM  7β-OH-EPIA(细胞死亡减少50％，p＜0.001)观察到细胞死亡的统计学显著减少，相对于仅局部缺血^＊＝p＜0.05，^＊＊＊＝p＜0.001。

结论

局部缺血诱导的PC-12细胞死亡总是被7β-OH-EPIA减少。阻断前列腺素合成的吲哚美辛在高达10μM的浓度下不直接影响PC-12细胞死亡。然而，当浓度进一步升高到100μM时，观察到适度的神经保护作用。

吲哚美辛(10μM)对局部缺血诱导的细胞死亡没有直接影响，但是显著减弱了7β-OH-EPIA的神经保护作用，支持如下假说：前列腺素合成是7β-OH-EPIA的神经保护作用所必需的。

实施例2

7β-羟基-表雄酮对人单核细胞产生前列腺素D ₂ 、E ₂ 和15-脱氧-Δ ^12，14 -J ₂ 的影响

该实施例的目的是确定7β-OH-EPIA是否可以诱导人单核细胞中花生四烯酸的特定代谢物的生物合成，所述代谢物即前列腺素D₂(PGD₂)，前列腺素E₂(PGE₂)和15-脱氧-Δ^12，14-前列腺素J₂(15d-PGJ2)。

在不存在或存在促炎刺激物肿瘤坏死因子α(TNF-α)的条件下，将单核细胞血细胞暴露于一定浓度范围的7β-OH-EPIA，并通过酶免疫测定法(EIA)测量产生的PGD₂、PGE₂和15d-PGJ₂的量。

7β-OH-EPIA(0.1nM-1000nM)诱导从正常人外周血单核细胞产生PGD₂的浓度依赖性增加。TNF-α与对照相比增加了PGD₂产生并且这在最高浓度的7β-OH-EPIA下增强。7β-OH-EPIA(1nM-1000nM)似乎对正常人外周血单核细胞中PGD₂生物合成没有显著影响，但是完全抑制了PGE₂产生中的TNF-α诱导的增加。发现7β-OH-EPIA(0.1nM-1000nM)与各自的对照相比，在不存在TNF-α时使正常人外周血单核细胞中的15d-PGJ₂产生增加约9-12倍，并且在存在TNF-α时增加2-2.5-倍。

方法

外周血单核细胞

通过将48ml人全血进行Ficoll/hypaque密度离心制备单核细胞(单核细胞和淋巴细胞)。血液在ficoll的顶部分层(密度＝1.077g/ml)并且以400g离心1小时(22℃)，之后在界面处的细胞通过移液器取出并转移到新管中。将管装入RPMI 1640培养基(2体积)，充分混合并以400g离心5分钟(22℃)。丢弃上清液并将细胞沉淀重悬浮在RPMI 1640培养基中，并调节体积得到每次培育合适数目的细胞，如下述结果部分中指出的。细胞在1.5ml无菌塑料管中在1ml终体积的RPMI 1640培养基中于37℃、空气中的5％CO₂和100％湿度下培育18小时。然后加入7β-OH-EPIA并进一步在37℃培养细胞，之后加入重组的人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)并继续培养3小时。在二甲亚砜(DMSO)中制备7β-OH-EPIA，所有剩余的药剂在RPMI 1640培养基中制备。必需的对照含有培养基或者相同浓度的DMSO，其总是＜0.1％v/v。通过以11,000g在22℃下离心管30秒终止培养，并将上清液转移到新的1.5ml管中。然后立即处理样品用于下述的PGD₂估计，或者在PGE₂或15d-PGJ₂测量前在-20℃下保持。

前列腺素酶免疫测定(EIA)

通过使用可商购EIA试剂盒测量类二十烷酸的细胞外水平测定在不用或用TNF-α刺激下人单核细胞应答7β-OH-EPIA的前列腺素产生。

PGD₂ EIA

PGD₂不能直接从细胞上清液测定，因为它是化学上不稳定的并且快速降解成许多J系列的前列腺素，包括PGJ₂、Δ¹²-PGJ₂和5-脱氧-Δ^12，14-pGJ₂。为了克服该问题，将不稳定的PGD₂化学处理以得到稳定衍生物，在该情况下得到D₂-甲氧明(PGD₂-MOX)，将其保存用于随后的分析。培养结束后，立即将100μl样品上清液加入1.5ml管中，该管含有100μl甲基肟化试剂(甲氧基胺盐酸盐(MOX-HCl)和溶解在10∶90v/v乙醇/水中的乙酸钠溶液。将试管置于水浴中并让反应在60℃下进行30分钟。在该阶段结束时，将样品在-80℃保存。随后使用Cayman化学品(CaymanChemical)的前列腺素D₂-MOX EIA试剂盒(货号512011)估计PGD₂的水平。

PGE₂ EIA

使用R&D系统(R&D Systems)的参量PGE₂EIA(ParameterPGE₂ EIA)试剂盒根据生产商的关于高灵敏性方案的说明书估计PGE₂的细胞外水平。

15d-PG₂ EIA

使用测定法设计(Assay Designs)的相关性EIA前列腺素15-脱氧-Δ^12，14-前列腺素J₂ EIA试剂盒(货号900-023)根据生产商的说明书估计5d-PGJ₂的细胞外水平。

统计学分析

对于n＝3次培育，结果表示为平均值±s.d.。用非配对斯氏t检验确定两个数据集彼此不同的概率(P)。当P＜0.05时认为差异是显著的。在苹果)麦金托什(Apple Macintosh)计算机上用来自Abacus Concepts公司的软件包Statview进行统计学计算。

结果

7β-OH-EPIA对人单核细胞的PGD₂产生的影响

图5(a)显示了在与7β-OH-EPIA培育4小时的1×10⁷个外周血单核细胞/ml的细胞上清液中检测到的升高浓度的7β-OH-EPIA(0.1nM-1000nM)对PGD₂水平的影响。7β-OH-EPIA似乎在PGD₂产生中诱导浓度依赖性增加，在100nM 7β-OH-EPIA(102±24pg/ml PGD₂)时达到最大值，其显著大于对照(40±13pg/ml PGD₂；P＝0.01)。

图5(b)显示了在TNF-α(0.5μg/ml)存在下培育的单核细胞的细胞上清液中检测到的升高浓度的7β-OH-EPIA(0.1nM-1000nM)对PGD₂水平的影响。与DMSO赋形剂对照相比，TNF-α刺激PDG₂增加2.3倍(P＜0.05)。在0.1nM-100nM浓度下，7β-OH-EPIA似乎对TNF-α诱导的PGD₂生物合成没有影响。在该实验中使用的最高浓度的7β-OH-EPIA(1000nM)下，PGD₂水平升高到164±31pg/ml(与仅仅TNF-α相比P＝0.03)。

7β-OH-EPIA对人单核细胞的PGE₂产生的影响

图6(a)显示了在与7β-OH-EPIA培育4小时的6×10⁵个外周血单核细胞/ml的细胞上清液中检测到的升高浓度的7β-OH-EPIA(1nM-1000nM)对PGE₂水平的影响。与DMSO对照相比，7β-OH-EPIA似乎增加PGE₂水平，然而，这些增加不是统计学上显著不同的。

图6(b)显示了在TNF-α(10ng/ml)存在下培育的单核细胞的细胞上清液中检测到的升高浓度的7β-OH-EPIA(1nM-1000nM)对PGE₂水平的影响。与DMSO对照相比，TNF-α刺激PDE₂显著增加1.97倍(P＝0.001)。在1nM-100nM浓度下，7β-OH-EPIA显著抑制TNF-α诱导的PGE₂生物合成，从仅应答TNF-α的167±6pg/ml到分别为1nM，10nM和100nM 7β-OH-EPIA的75±25pg/ml，82±23pg/ml和74±12pg/ml(所有均与仅TNF-α相比P＜0.02)。在该实验中使用的最高浓度7β-OH-EPIA(1000nM)下，没有观察到对TNF-α诱导的PGE₂产生的影响。

7β-OH-EPIA对人单核细胞的15d-PGJ₂产生的影响

图7(a)显示了在与7β-OH-EPIA培育4小时的单核细胞的细胞上清液中检测到的升高浓度的7β-OH-EPIA(0.1nM-1000nM)对15d-PGJ2水平的影响。7β-OH-EPIA在所有使用的浓度下显著增加了15d-PGJ2水平约9-12倍。水平从DMSO对照的51±6pg/ml升高到关于0.1nM、1nM、10nM、100nM和1000nM 7β-OH-EPIA的分别为506±101pg/ml、539±51pg/ml、520±45pg/ml、450±133pg/ml和590±84pg/ml(与DMSO对照相比，所有的P＜0.05)。

图7(b)显示了在与TNF-α(10ng/ml)培育的单核细胞的细胞上清液中检测到的升高浓度的7β-OH-EPIA(0.1nM-1000nM)对15d-PGJ2水平的影响。在该实验中使用的细胞因子浓度下，TNF-α似乎刺激15d-PGJ2小幅升高，然而，这与DMSO对照不是显著不同的。在所有使用的浓度下，7β-OH-EPIA在TNF-α存在下提高的15d-PGJ2水平。15d-PGJ2水平从仅在TNF-α存在下的157±39pg/ml升高到在TNF-α分别加上0.1nM、1nM、10nM、100nM和1000nM 7β-OH-EPIA存在下的348±48pg/ml、334±24pg/ml、356±85pg/ml、406±30pg/ml和318±100pg/ml(与仅TNF-α相比所有的P＜0.05)。

实施例3

7α-羟基-DHEA、7β-羟基-DHEA和7β-羟基-EPIA是脱氢表雄酮(DHEA)和表雄酮(EPIA)的天然代谢物。因为据报道许多类固醇干扰炎症和免疫过程，所以我们的目标是检测这些羟基类固醇对PG产生和相关酶基因表达的影响。人外周血单核细胞(PMBC)在每种类固醇(1-100nM)存在下，加入和不加入促炎细胞因子TNF-α(10ng/mL)的条件下培养4小时和24小时。测量培养基中PGE₂、PGD₂和15-脱氧-Δ^12，14-PGJ₂(15d-PGJ₂)的水平，并通过定量RT-PCR评估环加氧酶(COX-2)和PGE合酶(m-PGES1)的mRNA的细胞含量。加入TNF-α导致升高的PG产生和提高的COX-2和m-PGES1mRNA水平。在测试的三种类固醇中，仅仅7β-羟基-EPIA降低了COX-2和m-PGES 1的表达，同时显著降低了PGE₂并增加了15d-PGJ₂产生。这些结果表明7β-羟基-EPIA具有抗炎效果。

1.1.人PBMC制备和培养

在Etablissement Francais du Sang(Brest，法国)，从供者收集全血，收集在补充了EDTA的小袋中。然后在收集后36小时内在无菌条件下从全血分离PBMC。在Ficoll(Eurobio)上进行密度梯度离心。在RPMI 1640培养基(Eurobio)中洗涤后，将细胞悬浮在补充了10％热灭活的胎牛血清(Eurobio)，2mM谷氨酰胺(D.Dutscher)，100U青霉素/ml(D.Dutscher)，和100μg链霉素/ml(D.Dutscher)的RPMI 1640培养基中。通过塑料贴壁1小时选择单核细胞，并将约10⁷个细胞接种在6孔组织培养板(每孔3ml培养基)中。所有培育都在湿润的培养箱中37℃和5％CO₂下进行。回收细胞并将其分散在补充了7β-羟基EPIA、7β-羟基-DHEA或7α-羟基-DHEA(在20μL乙醇中)、存在或不存在0.01μg/mL TNF-α(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))的2ml新鲜培育培养基中。对照培育含有20μl乙醇但是不含类固醇。4小时和24小时培育后收集上清液用于测量它们的PG含量，并将细胞用于随后的RNA分离。使用Trizol试剂(Invitrogen，Cergy-Pontoise，法国)的单步提取方法提供总RNA。

1.2实时逆转录酶PCR

使用Superscript第一链合成系统试剂盒(Invitrogen)从TURBO DNA酶1处理的RNA(Ambion，Huntingdon，英国)合成cDNA。RT-PCR扩增混合物(50μL)含有2，5x RealMaster Mix/20x SYBR溶液(11，25μL)(Eppendorf，Le Pecq，法国)和200nM正向和反向引物。反应在RealPlex ep梯度S mastercycler(Eppendorf)上进行。循环条件为95℃下10分钟和45个循环的：在95℃、55℃和68℃下分别15秒、30秒和30秒。每个测定包括对照cDNA的四次连续稀释液点的标准曲线。HPRT1持家基因用于定量。所有寡核苷酸引物(表2)由Genecust/Distribio(Evry，法国)合成。通过检查产物的解链曲线监测扩增产生的特异性，并通过在琼脂糖凝胶电泳上分析进行验证。

1.3.PG测量

可商购EIA试剂盒用于测定培养基中的PGE₂水平(牛津生物医学研究(Oxford Biomedical Research)，英国)和15d-PGJ₂水平(测定法设计(Assay designs)，Euromedex，法国)。使用前列腺素D₂-MOX EIA试剂盒(Cayman化学品，Euromedex)得到PGD₂水平的测量。在该情况下，并且在测定前，立即用MOX-HCl试剂处理新鲜样品，该试剂将PGD₂转化为PGD₂-MOX，从而防止了任何进一步的化学降解。

1.4.数据的统计学分析

所有测定以一式三份进行并且结果作为平均值±S.E.M作图。通过邓肯多差距检验进行单向方差分析以便比较组间的差异。当p＜0.05时认为差异是统计学显著的。

2.1.7α-羟基-DHEA的效果

人PMBC在加入和不加入TNF-α的情况下培养4或24小时。测量培养基中PGE₂、PGD₂和15d-PGJ₂水平并测量细胞中相关基因(COX-2，m-PGES1)的mRNA产生。所得的数据在表2中显示。不存在TNF-α并且补充三种不同浓度的7α-羟基-DHEA在培养4小时后没有引起PGE₂、PGD₂和15d-PGJ₂水平的显著改变。仅仅15d-PGJ₂在24小时培养后显示出适度增加。与7α-羟基-DHEA的培育在培养24小时后显著提高了m-PGES1mRNA水平。

TNF-α的存在在24小时后引起所有PG水平的预期提高。与7α-羟基-DHEA培育4小时在任何测试的浓度下没有改变PG水平。相反，当与仅仅TNF-α相比时，在与7α-羟基-DHEA和TNF-α共同培养24小时后PGE₂和PGD₂-15d-PGJ₂对的水平分别显著提高和降低。此外，与TNF-α(即炎症活化)培养导致COX-2和m-PGES 1mRNA产生的显著增加。当与仅仅TNF-α相比时，与7α-羟基-DHEA共同培养没有导致mRNA水平的一致改变。

2.2.7β-羟基-DHEA的效果

将人PBMC在加入和不加入TNF-α的情况下培养4或24小时。测量培养基中的PGE₂，PGD₂和15d-PGJ₂水平，并测量细胞中相关基因(COX-2，m-PGES1)的mRNA产量。所得的数据在表3中显示。不存在TNF-α时与三种浓度的7β-羟基-DHEA培育4小时没有引起培养基中PGE₂，PGD₂和15d-PGJ₂水平的显著改变。然而，在与7β-羟基-DHEA培养24小时后，在培养物中PGD₂和15d-PGJ₂以及m-PGES1mRNA水平提高了。

TNF-α的存在在24小时时引起所有PG的预期增加。与7β-羟基-DHEA共培育4小时在任何测试的浓度下没有改变PG水平。相反，当与仅仅TNF-α相比时，在与7β-羟基-DHEA和TNF-α共同培养24小时后PGD₂和15d-PGJ₂的水平显著降低。此外，与TNF-α(即炎症活化)培养导致COX-2和m-PGES1mRNA产生的显著增加。当与仅仅TNF-α相比时，与7β-羟基-DHEA共同培养没有导致mRNA水平的一致改变。

2.3.7β-羟基-EPIA的效果

将人PBMC在加入和不加入TNF-α的情况下培养4或24小时。测量培养基中的PGE₂，PGD₂和15d-PGJ₂水平，并测量细胞中相关基因(COX-2，m-PGES1)的mRNA产量。所得的数据在表4中显示。不存在TNF-α时与三种浓度的7β-羟基-EPIA培育4小时没有引起培养基中PGE₂，PGD₂和15d-PGJ₂水平的显著改变。然而，在细胞培养物与7β-羟基-EPIA培养24小时后，PGD₂和15d-PGJ₂显著增加了。在4或24小时时，该类固醇没有显著改变COX-2表达，但是m-PGES1mRNA水平分别在4和24小时时显示出显著降低和提高。

TNF-α的存在在24小时时引起所有PG的预期增加。与7β-羟基-EPIA共同培育4小时在任何测试的浓度下没有改变PG水平。相反，当与仅仅TNF-α相比时，在24小时时，两个较低剂量的7β-羟基-EPIA降低了PGD₂并且提高了15d-PGJ₂水平。与TNF-α(即炎症活化)培养也导致COX-2和m-PGES1mRNA的显著增加。当细胞培养物与10和100nM 7β-羟基-EPIA培养24小时时，TNF-α对COX-2和m-PGES1mRNA产量的增加被钝化。

这些结果一起清楚地表明7β-羟基-EPIA令人惊奇地具有显著的抗炎效果。

实施例4

7β-OH-EPIA对结肠炎实验模型的作用

对大鼠连续6天施用置于饮用水中的葡聚糖硫酸钠(DDS)导致结肠炎症(结肠炎)，其特征是结肠长度缩短、升高的MPO活性、杯状细胞中粘液耗尽、和COX-2和mPGES-1合酶的增加的表达以及产生前列腺素E2(PGE₂)。施用DSS也增加了氧化胁迫标记，如内脏中的蛋白质羰基(ProtCO)和Tbars。我们现在提供了证据表明在施用DSS前用7β-羟基-EPIA每天治疗一次持续7天可以防止发生DSS诱导的结肠炎。施用0.01mg/kg7β-羟基-EPIA完全防止了结肠损害和组织炎症，并且7β-羟基-EPIA的该效果与氧化胁迫标记和PGE₂产生的显著减少有关，与COX-2表达的早期但是暂时的增加和抗炎前列腺素15d-PGJ₂的产生的持续增加相关。这些结果表明，7β-羟基-EPIA在该接受的炎性肠病(IBD)实验模型中在极低剂量水平下具有显著的抗炎效果。

实验步骤

动物

所有实验方案和步骤都符合欧共体关于使用实验动物的规则86/609/CEE。从查尔斯河(Charles River)(L′Arbresle，法国)购买的雄性Wistar大鼠(180-200g)喂饲啮齿动物实验室食物并且随意地给予水。

药物治疗和结肠炎诱导

7天的适应期后，将动物分成两个对照组(假对照和7β-羟基-EPIA-处理的对照组)和两个结肠炎组(结肠炎和7β-羟基-EPIA-处理的结肠炎)。7β-羟基-EPIA(溶于DMSO中的0.01、0.1和1mg/kg体重)或仅仅DMSO(赋形剂)腹膜内施用，每天一次，为期7天，即从第0天到第7天。通过向饮用水中加入DSS(分子量36-50kDa；MP生物医学(MP Biomedicals)，法国)从第7到第14天诱导结肠炎。两个对照组仅仅接受自来水。

结肠损伤的宏观评估

在第9、11、13、14天，记录体重、结肠长度、粪便稠度并通过视觉检查评估新鲜直肠出血。如Mabley等，2001，炎症研究(Inflamm.Res.)；50：561-569所述通过盲法记录结肠损伤的严重性(0：良好成形的球团并且没有结肠损伤；1：结肠有少量与粪便混合存在的血液；2：结肠有大量与粪便存在的血液；3：结肠充满血液并且没有粪便)。

组织学检查

一部分近侧结肠(1cm)在4％甲醛(Labonord，Templemars，法国)中固定并包埋在石蜡中。制备组织切片(5μm)，之后透明化(clear)、水合化并用苏木精/伊红或者用爱茜蓝根据标准方案染色分别用于组织学评估结肠损伤和粘膜杯状细胞含量。

制备组织匀浆

结肠沿着肠系膜边缘打开，并用载玻片的钝端刮除上皮细胞，然后称重，洗涤并离心。将沉淀物在9体积的TKE缓冲液(10mM Tris-HCl；150mM KCl；1mM EDTA；0.25mM PMSF，pH 7.4)中匀浆，然后在-80℃冷冻备用。根据Lowry等(生物化学杂志(J Biol Chem)1951；193：265-74)测量匀浆的蛋白质含量。

MPO活性

使用Krawisz等(肠胃病学(Gastroenterology)1984；87(6)：1344-50)的邻-联茴香胺方法用Pelissier等(类固醇(Steroids)2006；71(3)：240-8)的改良方案评估MPO活性。使用关于氧化的邻-联茴香胺的消光系数(1.13×10⁴mol^-1.cm^-1)，将MPO活性表示为每分钟在460nm下的吸光度产生改变所需的酶的量。

氧化胁迫的生物化学测定

通过Albrecht等对Ohkawa等(生物化学年刊(Anal Biochem)1979；95：315-58)所述方法的改良方法(1992，毒物学通信(Toxicol.Lett)；63：91-96)测量脂质过氧化作用(Tbars)。在532nm下测量红色1∶2加合物丙二醛-硫代巴比土酸(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，StQuentin-Fallavier，法国)的吸光度(使用的消光系数：0.156μmol^-1cm^-1)。通过Levine等(酶学方法(Methods Enzymol)1990；186：464-78)的方法评估氧化的蛋白质中的羰基含量(Prot CO)。非蛋白质巯基基团含量(主要为GSH)考虑为匀浆中的抗氧化防御标记，并且通过Sedlak和Lindsay(生物化学年刊(Anal Biochem)1968；25(I)：192-205)的方法测定。

前列腺素免疫测定

可商购的EIA试剂盒用于测定从新鲜匀浆得到的结肠上清液中的PGE₂水平(牛津生物医学研究(Oxford Biomedical Research)，英国)和15d-PGJ₂水平(测定法设计(Assay designs，Euromedex)，法国)。使用前列腺素D₂-MOX EIA试剂盒(Cayman化学品，Euromedex)得到PGD₂水平的测量。在该情况下，并且在测定前，新鲜样品立即用MOX-HCl试剂处理，其将PGD₂转化为PGD₂-MOX，从而防止任何进一步的化学降解。

实时逆转录酶PCR

用Trizol试剂(Invitrogen，Cergy-Pontoise，法国)从新鲜结肠样品(300mg)提取总RNA。用MicroPoly(A)Purist试剂盒(Ambion，Huntingdon，英国)从总RNA纯化多聚(A)RNA。使用Superscript第一链合成系统试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。使用含有2.5x RealMaster Mix/20x SYBR溶液(11.25μL)(Eppendorf，Le Pecq，法国)和300nM正向和反向引物的混合物(25μL)进行实时PCR。反应在RealPlex ep梯度Smastercycler(Eppendorf)上运行。循环条件为95℃下10分钟和40个循环的：在95℃、55℃和68℃下分别15秒、30秒和30秒。每个测定包括对照cDNA的四次连续稀释液点的标准曲线。寡核苷酸引物由Genecust/Distribio(Evry，法国)合成。通过检查产物的解链曲线监测扩增产物的特异性，并通过在琼脂糖凝胶电泳上分析进行验证。对HPRT1标准化后，mRNA水平相对于DMSO对照表示。

统计学分析

对于每只动物，所有测定以一式三份进行并且结果作为平均值±S.E.M作图。通过邓肯多差距检验进行单向方差分析以便比较组间的差异。当p＜0.05时认为差异是统计学显著的。

结果

结肠炎诱导的时间过程研究

用饮用水中的5％DSS处理大鼠7天(从D7-D14)导致结肠炎的临床和组织学病征，但是没有死亡。通常，所有大鼠在结肠炎诱导后5天(第12天)显示出严重腹泻，并且在次日发生直肠出血。当与假对照比较时，在所有DSS处理的大鼠中在第11天记录到体重、附睾脂肪组织质量和肝脏重量的减轻(分别为-5％，-17％，-8％；p＜0.05)。在第14天时也观察到这些减轻(表5)。没有观察到脾脏重量的改变。当与假对照组比较时，DSS处理的大鼠从第11天(-14％，p＜0.05)到第14天(-26％；p＜0.05)也表现出结肠的显著缩短，见表5，其与增厚的结肠组织和粪便损失有关。测量结肠粘膜中的MPO活性作为嗜中性粒细胞浸润的指数。在第13和14天，当与假对照比较时，观察到结肠炎组中粘膜MPO活性增加9倍到7倍(p＜0.05)(图8A)。在第13天前没有观察到MPO活性的改变。这些结果与组织学分析相一致。实际上，当与假对照组相比时，结肠炎症的主要标志，即隐窝扭曲、嗜中性粒细胞向粘膜组织的浸润和含有较少粘蛋白的杯状细胞的丧失，在结肠炎组中在第13天时是明显的，并且在第14天时更明显(数据未显示)。

如图8所示，在具有结肠炎的动物的结肠粘膜中，两种氧化胁迫标记，即Prot CO、Tbars，和抗氧化防御参数GSH水平在第13和14天时显著增加到高于对照水平。

7β-羟基EPIA对结肠炎的保护作用

如通过在第14天时对腹泻和直肠出血的抑制所示，两种低剂量的7β-羟基-EPIA(0.01，0.1mg/kg)阻止了DSS诱导的结肠损害。在施用DSS之前腹膜内注射0.01mg/kg 7β-羟基-EPIA每天一次，为期7天，将体重恢复到对照水平，而没有改变附睾的重量(表5)。在第9到第14天之间，结肠长度减少在通过两个较低剂量的类固醇(0.01，0.1mg/kg)治疗的组中没有在结肠炎组中的明显(对于第9天的数据未显示，表5)。7β-羟基-EPIA在所有剂量水平，即0.01、0.1和1mg/kg下，在第14天防止了杯状细胞中的粘液耗尽，和组织学改变，如隐窝异常和嗜中性粒细胞浸润(数据未显示)，并且显著降低了MPO活性(图8A)。氧化胁迫参数(Prot CO，Tbars)和GSH水平在所有组，即假对照、结肠炎和7β-羟基-EPIA-处理(0.01，0.1和1mg/kg)的结肠炎组中在第9天(未显示)和11天时是相似的(图8B，C和D)。氧化胁迫的所有标记和抗氧化防御标记在已经用7β-羟基-EPIA(从第0到第7天)处理的动物中保持不变，而这些参数在结肠炎组中显著升高(p＜0.05)。这些结果表明在该炎性肠病(IBD)的实验模型中，7β-羟基-EPIA在极低剂量水平下具有显著的抗炎效果。

结肠组织中的前列腺素(PG)产生：β-羟基-EPIA的效果

7β-羟基-EPIA处理没有改变无结肠炎的对照大鼠中PGE₂和PGD₂结肠组织水平(数据未显示)。相反，在第0到第7天施用7β-羟基-EPIA导致从第2天到第14天15d-PGJ₂水平显著提高到高于基础水平。施用0.1mg/kg 7β-羟基-EPIA导致在第2天升高51倍，其从第4天到第14天逐渐降低(增量范围从44倍到5倍)(图9A，图10C)。

从第7到第14天施用炎性试剂DSS导致在第14天时促炎性前列腺素PGE₂的产生显著增加，而抗炎性前列腺素15d-PGJ₂的水平急剧降低(图10)。

从D0到D7用0.01mg/kg 7β-羟基-EPIA处理完全防止了DSS诱导的结肠PGE₂的产生，而显著提高了15d-PGJ2水平(图10)。

在假的和结肠炎组中的COX-2和PG合酶表达：7β-羟基-EPIA预处理的效果

因为用DSS施用和7β-羟基-EPIA处理观察到前列腺素水平的显著改变，所以我们通过用实时RT-PCR定量特定的mRNA来测试类固醇预处理是否改变COX-2、mPGES-1和H-PGDS的表达。检查这些基因的转录并将其与HPRT1持家基因的转录相关联。在没有结肠炎的对照大鼠中，施用0.1mg/kg 7β-羟基-EPIA在15小时时诱导COX-2mRNA水平显著提高1.5倍，接着在第2和第4天显著降低，之后返回到基础值(图9B)。mPGES-1mRNA表达在第6小时和第15小时之间短暂增加，在第2天时向基础水平返回。H-PGDS mRNA合成在实验期间保持不变。

通过DSS诱导结肠炎后，在第13和14天观察到COX-2mRNA表达的2.5倍提高(图11A)，而mPGES-1mRNA仅在第13天时显著增加(图11B)。DSS施用没有改变H-PGDS。

用7β-羟基-EPIA预处理(从第0天到第7天)抑制了DSS引起的COX-2和mPGES-1mRNA合成的这些增加(图11)。

这些发现一起表明7β-羟基-EPIA的抗炎效果是通过相伴的PGE₂的降低和15d-PGJ2产生的提高所介导的。在该研究中发现的7β-羟基-EPIA对15d-PGJ2产生的长效效果提示7β-羟基-EPIA引起涉及炎症及其消退的基因的表达的持续改变。

在附图中，图8显示了7β-羟基-EPIA处理对结肠组织中(A)髓过氧化物酶(M PO)和氧化胁迫标记即(B)Prot CO、(C)Tbars和(D)抗氧化标记GSH的影响。生物标记水平表明DSS处理的大鼠在第13和14天与对照显著不同(p＜0.05)。7β-羟基-EPIA在所有剂量水平下与结肠炎组相比在第13和14天显著降低了MPO活性(p＜0.05)，并且在第13和14天将氧化胁迫参数(B、C和D)恢复到对照水平。值为平均值±SEM(A)和相对于假品组(B、C和D)的百分比，每组3-23只大鼠。在图8A-8D中，黑色条形＝假品-对照；白色条形＝DSS-结肠炎组；深灰色条形＝DSS+0.01mg/kg7β-羟基-EPIA；中等灰色条形＝DSS+0.1mg/kg 7β-羟基-EPIA；浅灰色条形＝DSS+1.0mg/kg 7β-羟基-EPIA。

DSS-结肠炎对假品-对照组(p＜0.05)；§7β-羟基-EPIA处理组对DSS-结肠炎组(p＜0.05)。

图9显示了在7β-羟基-EPIA处理期间不同时间的结肠15d-PGJ₂水平(A)和COX-2、mPGES-1和H-PGDS的相对mRNA表达的定量。值为平均值±SEM(n＝3到15)(A)并且在对HPRTI归一化后，mRNA相对于假品对照表示(B)。在图9A中，黑色条形＝假品-对照组；深灰色条形＝0.01mg/kg 7β-羟基-EPIA；中等灰色条形＝0.1mg/kg 7β-羟基-EPIA；和浅灰色条形＝1.0mg/kg 7β-羟基-EPIA。在图9B中，具有白点的深灰色条形＝COX-2；具有黑色点的浅灰色条形＝mPGES-1；和具有黑色点的白色条形＝H-PGDS。

图10显示了在DSS施用期间7β-羟基-EPIA对结肠合成前列腺素E2、D2和15d-PGJ2的影响。施用DSS在第13和14天显著提高了PGE2(A)，D2(B)和15d-PGJ2(C)的合成(p＜0.05)。在施用DSS前用7β-羟基-EPIA处理7天在第13和14天降低了PGE₂合成(A)，而在所有剂量下显著增加了15d-PGJ2的产生(C)。数据表示为平均值±SEM，n＝3到23。在图10A-10C中，黑色条形＝假品-对照；白色条形＝DSS-结肠炎组；具有白点的深灰色条形＝DSS+0.01mg/kg 7β-羟基-EPIA；具有黑色点的浅灰色条形＝DSS+0.1mg/kg 7β-羟基-EPIA；和具有黑色点的白色条形＝DSS+1.0mg/kg 7β-羟基-EPIA。

图5显示了在结肠炎诱导期间COX-2、mPGES-1和H-PGDS mRNA的结肠表达。结肠炎导致在第13和14天显著增加的COX-2mRNA合成(A)，而mPGES-1仅在第13天时增加(B)。在所有剂量的7β-羟基-EPIA下观察到基因表达向基础水平的返回。在图10A-10C中，白色条形＝DSS-结肠炎组；深灰色条形＝DSS+0.01mg/kg 7β-羟基-EPIA；中等灰色条形＝DSS+0.1mg/kg 7β-羟基-EPIA；和浅灰色条形＝DSS+1.0mg/kg 7β-羟基-EPIA。

实施例5

1.7β-OH-EPIA在胶原诱导的关节炎中的作用

该研究测试了7β-OH-EPIA在控制与胶原诱导的关节炎模型相关的炎性和病理改变中的有效性。鼠模型表明暗示人类关节炎的疾病。

在第0天通过尾巴根部注射对雄性DBA/1小鼠(10-12周龄)给予在完全弗氏佐剂中乳化的100μg鸡II型胶原(CII/CFA)。从第20到第50天通过皮下注射(第2、3和4组)并且从第0到30天通过皮下注射(第5组)按下述每天给予治疗：

实验组(n＝10/组)

组1：第0天CII/CFA，未处理的-假品处理的，第20-50天；

组2：第0天CII/CFA，7β-羟基-EPIA 1μg/kg处理，第20-50天；

组3：第0天CII/CFA，7β-羟基-EPIA 10μg/kg处理，第20-50天；

组4：第0天CII/CFA，7β-羟基-EPIA 100μg/kg处理，第20-50天；

组5：第0天CII/CFA，7β-羟基-EPIA 10μg/kg处理，第0-30天；

组6：第0天CII/CFA，未处理的-假品处理的，第0-30天。

结束时，去除后腿并收集膝盖匀浆物用于前列腺素测量(仅组1和4)，并且固定爪子用于通过标准方法进行病理性检查。每个爪子在纵向上半切开，解剖并脱钙以允许制作切片。对脱钙的样品进行常规处理，制作切片，并制备一个染色对切片用于检查。这包括每个样品的两个半份样品。根据标准评分系统对每个爪打分。在对实验方案或组的身份不知情的条件下，以盲法形式对样品打分。

从第21到50天，每周对临床关节肿胀打分两次。在每个情况下，根据下面对评分系统(结合对临床疾病得分)对四个四肢的每一个给予得分。

0正常

1整个关节轻微肿胀或者单个趾头炎症

2整个关节中等肿胀和多于一个趾头的发红和/或炎症

3严重关节炎症并且发红扩散到多个趾头

4严重关节炎症并且发红扩散到多个趾头，明显的骨重建迹象。

结果在表6中显示。可以看出，当与对照组(已经合并当假品对照组1或6)比较时，用7β-OH-EPIA处理导致关节肿胀的显著减轻，如通过上述临床疾病评分方法测量。通过爪肿胀减轻的病理学证据证实了该发现(表7)。从表7可以看到，最低的病理学得分，其中10只动物中的9只在爪关节中完全没有病理学改变，在该情形中7β-羟基EPIA治疗与胶原的给予(以诱导关节炎)在同时(第0天)开始并且治疗持续到第30天。从而，诸如类风湿性关节炎的疾病用7β-羟基EPIA的早期治疗可以具有有益效果。

2.测量膝盖匀浆物中的前列腺素

使用标准测定技术测量如上述制备的膝盖匀浆物中的15d-PGJ2和PGE₂的水平。从表8可以看出当与对照未处理组相比时，用0.1mg/kg7β-OH-EPIA处理的组中PGE₂水平较低。与未处理的对照相比，用0.1mg/kg 7β-OH-EPIA处理的组具有较高水平的15d-PGJ2。

结论：

7β-羟基-EPIA具有明显的抗炎效果。在诱导时的治疗具有最大的效果。这与该模型中的其他测试化合物(包括类固醇)保持一致，并且反映了与逆转现有的改变相比防止关节损伤相对容易。已经说了这些，当治疗延迟到第20天时，用较高剂量的7β-羟基-EPIA治疗的那些动物中疾病水平是相似的。该疾病保护水平对于治疗方案是有益的。最低剂量的7β-羟基-EPIA似乎对疾病水平具有较小的影响，尽管将需要统计学分析来研究这是否是明显的剂量效应。

前列腺素E2和15d-J2水平的分析表明了清楚的治疗效果。与未治疗的对照相比，在经治疗的小鼠中PGE₂水平较低。相反，治疗后15d-PGJ2水平升高了。

综合考虑临床疾病观察和组织病理学为该关节炎模型中7β-羟基-EPIA的抗炎效果提供了有力的证据。在疾病发作前的治疗是最有效的，如在该模型中的情况下几乎是不变的。然而，7β-羟基-EPIA当在发作时给予时可以抑制疾病的进展，这一发现使该化合物从许多其他竞争者中脱颖而出并且是非常鼓舞人心的。

表6

在CIA大鼠中，7β-羟基-EPIA对组织病理学的影响

治疗从第20到第50天

组	n	组织病理学得分(在第50天两只爪)
			假品-未处理的	10	1.35
7β-羟基-EPIA 1.0μg/kg	10	0.60
			7β-羟基-EPIA 10.0μg/kg	9	0.44
7β-羟基-EPIA 100.0μg/kg	10	0.85

从这些结果可以推断7β-羟基-EPIA在低至1.0μg/kg的剂量下就能够减轻关节损伤。

表7

在CIA大鼠中，7β-羟基-EPIA对组织病理学的效果

治疗从第0到第30天

组	n	组织病理学得分(在第50天两只爪)
			假品-未处理的	9	1.22
7β-羟基-EPIA 10.0μg/kg	10	0.2＊

^＊10只动物中的9只的病理学改变完全消失。

从这些结果可以推断7β-羟基-EPIA在10.0μg/kg的剂量下几乎完全防止了疾病即关节炎损伤的发展。

表8

在CIA大鼠中在第50天时7β-羟基-EPIA(0.1μg/kg天，D 20-50)对关节肿胀和前列腺素含量的影响

	未处理的	处理的
			临床得分	7.50±2.51	3.10±2.96
PEG2(pg/ml)	177.09±70.08	95.61±34.65
			15d-PGJ2(pg/ml)	19.12±6.43	78.96±22.18
PEG2/15d-PGJ2	9.26	1.21

从这些结果，可以推断7β-羟基-EPIA减轻了胶原诱导的关节炎的临床症状的严重性，并且改变了组织前列腺素产生，有利于炎症的消退、细胞保护和组织修复。

实施例6

7β-OH EPIA对顺铂诱导的外周神经病模型的影响

顺铂是用于癌症治疗的抗有丝分裂化合物。然而，其用途受到几种不利作用的限制，其中外周神经病尤其令人苦恼。顺铂诱导的神经病主要是感觉性神经病。患者患有远端感觉性丧失了，接着是感觉性共济失调。组织学研究显示出轴突变性。在细胞培养物中，通过顺铂处理感觉性神经元诱导了神经突网络密度的降低，接着细胞体变性。感觉性神经元的一种特定生长因子神经生长因子(NGF)保护神经元抵抗该中毒性。顺铂对培养物中感觉神经元的中毒性从而是足够用于研究化合物在外周神经病中的神经保护作用的模型。

在外周神经病的模型中对大鼠感觉神经元评估了7β-OH EPIA的神经保护作用。

将与背根神经节感觉神经元相关的原代培养物与3μg/ml顺铂，在有和无7β-OH EPIA的条件下培养48小时和72小时，并且评估下面的参数：

-用抗MAP 2抗体(微管结合的蛋白2)染色的神经元细胞体，

-用抗β-微管蛋白抗体染色的神经突网络密度。

神经元的培养

根据Hall等1997[Hall等，神经科学杂志(J.Neurosci).1997年4月15日；17(8)；2775-84]所述的方法制备大鼠感觉神经元。简言之，通过颈椎脱位术杀死雌性大鼠(妊娠15日)(Rats Wistar；Janvier，LeGenest-St-Isle，法国)并从子宫取出胎儿。将它们的具有背根神经节(DRG)的脊髓取出并置于冰冷的Leibovitz(L15，Fisher 11415-049)培养基中，该培养基含有青霉素50Ul/ml-链霉素50μg/ml(PS，1％)和牛血清白蛋白(BSA 1％，西格玛(Sigma)A6003)。回收DRG并通过在37℃下胰蛋白酶化(胰蛋白酶EDTA 10X，10％，Fisher 15400054，在没有钙和镁的PBS中稀释(Fisher 2007-03))20分钟进行解离。通过加入含有II级DNA酶I(0.1mg/ml罗氏诊断(Roche diagnostic)104159)和胎牛血清(FBS 10％，Fisher 10270-098)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Fisher21969-035)中止反应。细胞悬浮液用10ml移液器捣碎并在室温下以350xg离心10分钟。然后将解离的细胞的沉淀物重悬浮在确定的细胞培养基中。

活细胞用锥虫蓝排阻试验(西格玛(Sigma))在Neubauer细胞计数器中计数，并以30000个细胞/孔的密度接种在96孔板(Nunc)中。将孔用在超纯无菌水(Merck Eurolab 60759.01)中的聚L-赖氨酸(10μg/ml，西格玛(Sigma)P2636)预包被。

让细胞贴壁2小时并保持在湿润培养箱中在37℃下5％CO₂/95％空气中。

用7β-OH EPIA培育神经元培养物

培养5天后，按照下述不同条件将培养基改变为确定的细胞培养基中：

·赋形剂(DMSO 0.1％)

·赋形剂(DMSO 0.1％)+顺铂(3μg/ml，西格玛(Sigma)ref：p4394)

·测试化合物7β-OH EPIA(1nM，10nM和100nM)+顺铂(3μg/ml)

·参考化合物NGF(10ng/ml)+顺铂(3μg/ml)

每个条件进行6个孔以评估神经元的存活。培育48和72小时后，神经元细胞在乙醇/乙酸溶液(95％/5％)中在-20℃下固定5分钟并用PBS冲洗3次。

为了控制化合物的神经营养性效应，在48小时和72小时期间温育NGF(10ng/ml)和7β-OH EPIA(1nM，10nM和100nM)。温育结束时，细胞在乙醇/乙酸溶液(95％/5％)中在-20℃下固定5分钟并用PBS冲洗3次。

分析每个视野的细胞体和神经突网络数目

将感觉神经元的细胞体用单克隆抗MAP-2抗体(西格玛(Sigma)M4403)标记，并将感觉神经元的神经突用单克隆β-微管蛋白抗体(西格玛(Sigma)T8660))标记。这些抗体用温育溶液(含有5％FCS和0.1％皂苷的PBS，西格玛(Sigma)S-7900)以1∶400稀释。这些抗体分别特异标记神经元细胞体和神经突。

温育2小时后，细胞用PBS洗涤并用以1∶300稀释在温育溶液中的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(分子探针(Molecular Probes)A 11001)培育，以显示MAP-2和β-微管蛋白抗体。在1小时内细胞核用荧光标记(Hoechst染色溶液，西格玛(SIGMA)H6024，在温育溶液中1μg/ml)染色。

对于每种条件，用在细胞内分析仪1000(In Cell Analyzer 1000)(安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences))每孔拍摄两张图片(每种条件12张图片)，该细胞分析仪受到计算机软件在细胞内分析仪10003.2(InCell Analyzer 10003.2)的控制。对于MAP-2标记，放大倍数为10倍，对于β-微管蛋白标记，放大倍数为20倍。对于每种标记，在相同条件下拍摄所有图像。

使用In Cell Analyzer 10003.2.Workstation软件进行用抗MAP-2抗体标记的细胞体的数目和用抗β-微管蛋白抗体标记的神经突的总长度的分析。结果表示为与赋形剂相比较的百分比。用不成对T检验进行每组的比较。

结果

7β-OH EPIA保护免于顺铂诱导的神经突密度损失

与3μg/ml顺铂温育48小时

轴突密度表示为感觉神经元与培养基(“赋形剂”)，即没有顺铂的条件下温育48小时后每个视野中平均5459μm的总神经突长度。与顺铂温育48小时将每个视野的总神经突长度缩短到约4585μm。当与赋形剂相比较时，顺铂对神经突网络密度的这种降低是统计学显著性的(-16％，p＜0.001)。

与仅与培养基温育的培养物相比较时，与10ng/ml NGF温育48小时防止了顺铂诱导的神经突损失并且引起神经突长度的显著增长。

与1nM和10nM 7β-OH EPIA温育在48小时时保护了感觉神经元免于顺铂诱导的神经突损失。该效应是统计学显著性的。在分别与1nM和10nM 7β-OH EPIA培育48小时后，总神经突长度分别为5378μm和5549μm，其代表顺铂诱导的毒性分别减小90.7％和101％。

与3μg/ml顺铂温育72小时

在没有顺铂的培养基“赋形剂”中的感觉神经元表达每个视野平均5320μm的总神经突长度。与顺铂温育72小时将每个视野的总神经突长度缩短到约4046μm。在与赋形剂相比时，顺铂对神经突网络密度的这种减小是统计学显著性的(-24％，p＜0.001″)。

与仅与培养基培育的培养物相比，与10ng/ml NGF温育72小时防止了顺铂诱导的神经突损失并且导致神经突长度的显著增加。

在72小时时，与1nM 7β-OH EPIA培育保护了感觉神经元免于顺铂诱导的神经突损失。该效应是统计学显著性的。与1nM 7β-OH EPIA培育72小时后，总神经突长度为4948μm，其代表顺铂诱导的毒性减小70.8％。

表9

在顺铂(3μg/ml)存在下温育48小时后，赋形剂(0.1％DMSO)，NGF(10ng/ml)和7β-OH EPIA(1nM，10nM和100nM)对感觉神经元的神经突长度的影响。

表10

在顺铂(3μg/ml)存在下温育72小时后赋形剂(0.1％DMSO)，NGF(10ng/ml)和7β-OH EPIA(1nM，10nM和100nM)对感觉神经元的神经突长度的影响

7β-OH EPIA保护免于顺铂诱导的神经元细胞死亡(神经元细胞体的损失)

与3μg/ml顺铂温育48小时

在没有顺铂时，在具有“赋形剂”的培养基中培育48小时后观察到每个视野中平均61个感觉神经元。与3μg/ml顺铂温育将神经元数目减少到每个视野平均41个感觉神经元。与没有顺铂时，即仅存在含有赋形剂的培养基时48小时后评估的细胞体数目相比，顺铂对神经元细胞体的减少是统计学显著性的(-33％，p＜0.001)。

与10ng/ml NGF温育48小时几乎完全防止了顺铂诱导的细胞体损失。

与1nM、10nM和100nM 7β-OH EPIA温育在48小时时保护感觉神经元免于顺铂诱导的细胞死亡。该效果是统计学显著性的。分别与1nM、10nM和100nM 7β-OH EPIA温育48小时后每个视野感觉神经元的总数分别为51、45和50个，其分别代表顺铂诱导的细胞死亡减少53.1％、18.7％和43.8％。

与3μg/ml顺铂温育72小时

在没有顺铂时，具有“赋形剂”的培养基中培育72小时后观察到每个视野中平均54个感觉神经元。与3μg/ml顺铂温育将神经元数目减少到每个视野平均33个感觉神经元。与没有顺铂时，即仅存在含有赋形剂的培养基时72小时后评估的细胞体数目相比，顺铂对神经元细胞体的减少是统计学显著性的(-39％，p＜0.001)。

与10ng/ml NGF温育48小时几乎完全防止了顺铂诱导的细胞体损失

与1nM、10nM和100nM 7β-OH EPIA温育在72小时时保护感觉神经元免于顺铂诱导的细胞死亡。该效果是统计学显著性的。分别与1nM、10nM和100nM 7β-OH EPIA温育72小时后每个视野感觉神经元的总数分别为52、55和52个，其分别代表顺铂诱导的细胞死亡减少93％、104％和93％。

表11

在顺铂(3μg/ml)存在下温育48小时后赋形剂(0.1％DMSO)，NGF(10ng/ml)和7β-OH EPIA(1nM，10nM和100nM)对每视野细胞体数目的影响

表12

在顺铂(3μg/ml)存在下温育72小时后赋形剂(0.1％DMSO)，NGF(10ng/ml)和7β-OH EPIA(1nM，10nM和100nM)对每视野细胞体数目的影响

实施例7

本研究评估了7β-OH EPIA对原代培养物中解离的脊髓运动神经元和感觉神经元的神经突生长的促进效果。将神经元用抗β-微管蛋白抗体染色，并用″细胞内分析器(In Cell Analyzer)″进行总神经元长度的分析。将神经元细胞培养物与10^-9M-10^-4M 7β-OH EPIA温育，并在温育6、12和24小时后评估神经元网络密度。一种运动神经元的特定生长因子，即脑来源的神经生长因子(BDNF)，和一种感觉神经元的特定生长因子，即神经生长因子(NGF)，用作参考化合物。我们的数据表明7β-OH EPIA对运动神经元和感觉神经元二者都具有显著的神经营养效果。这些效果与BDNF和NGF的效果相当，在纳摩尔浓度的羟基类固醇下尤其显著。我们的发现一起支持使用7-羟基类固醇用于促进神经突生长和治疗外周神经病。

1.材料和方法

1.1制备大鼠脊髓运动神经元细胞培养物

根据Martinou等，1992(Martinou JC，Martinou I，Kato AC胆碱能分化因子(CDF/LIF)在体外促进分离的大鼠胚胎运动神经元的存活(Cholinergic differentiation factor(CDF/LIF)promotes survival ofisolated rat embryonic motoneurons in vitro).神经元(Neuron).1992年4月；8(4)：737-44)所述的方法制备大鼠脊髓运动神经元。简言之，颈椎脱位术将15天妊娠的怀孕雌性Wistar大鼠处死并从子宫取出胎儿。取出它们的脊髓并置于含有1％牛血清白蛋白(无脂肪酸的BSA，Eurobio，Les Ulis，法国，GXXBSAO 1-65)的冰冷的Leibovitz(L15，I nvitrogen，11415-049)培养基中。小心取出脑膜。

通过在37℃下胰蛋白酶化(胰蛋白酶EDTA 10X，Invitrogen15400054)20分钟进行解离，所述胰蛋白酶稀释在没有钙和镁的PBS中(Fisher 2007-03))。通过加入含有II级DNA酶I(0.1mg/ml罗氏诊断(Roche diagnostic)104159)和10％胎牛血清(FCS，Invitrogen10270098)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Fisher 21969-035)中止反应。然后，悬浮液通过穿过10ml移液器3次进行机械解离。然后细胞在室温下以580xg离心10分钟。然后将解离的细胞的沉淀物重悬浮在L15培养基中，并通过室温下以180xg离心10分钟将所得的悬浮液的运动神经元富集在L15培养基中BSA溶液(3.5％)层上。

丢弃上清液并将沉淀物重悬浮在补充DNA酶I(1％)的L15培养基中。然后悬浮液在Optiprep(d：1.06g/ml；Abcys，巴黎，法国；1030061)垫上分层并在室温下以335xg离心15分钟。收集含有纯化的运动神经元的上层相，用L15培养基重悬浮并在室温下以800xg离心10分钟。最后将细胞沉淀重悬浮在确定的培养基中，该培养基由补充2％B27，2mM L-谷氨酰胺和青霉素50Ul/ml-链霉素50μg/ml的神经基底培养基组成。用锥虫蓝排阻试验(西格玛(Sigma)T8154)在Neubauer细胞计数器中对活细胞计数，然后以30000个细胞/孔接种在96孔板(用聚L-赖氨酸预包被；Nunclon，Invitrogen P5899)中，并在湿润的空气(95％)CO₂(5％)氛围中37℃下培养。

1.2制备大鼠感觉神经元细胞培养物

根据Hall等1997(Hall AK，Ai X，Hickman GE，MacPhedran SE，Nduaguba CO，Robertson CP.在大鼠感觉神经节中神经元异质的产生(The generation of neuronal heterogeneity in a rat sensory ganglion).神经科学杂志(J.Neurosci).1997年4月15日；17(8)：2775-84)所述的方法制备大鼠感觉神经元。简言之，通过颈椎脱位术(Wistar大鼠；Janvier，Le Genest-St-Isle，法国)处死雌性大鼠(15天妊娠)，并从子宫取出胎儿。将它们的具有背根神经节(DRG)的脊髓取出并置于冰冷的Leibovitz(L15，Fisher 11415-049)培养基中，该培养基含有青霉素50Ul/ml-链霉素50μg/ml(PS，1％)和牛血清白蛋白(BSA 1％，西格玛(Sigma)A6003)。回收DRG并通过在37℃下20分钟胰蛋白酶化(胰蛋白酶EDTA 10X，10％，Fisher 15400054)解离，该胰蛋白酶稀释在没有钙和镁的PBS中(Fisher2007-03))。通过加入含有II级DNA酶I(0.1mg/ml罗氏诊断(Rochediagnostic)104159)和胎牛血清(FBS 10％，Fisher 10270-098)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Fisher 21969-035)中止反应。细胞悬浮液用10ml移液器捣碎并在室温下以350xg离心10分钟。然后将解离细胞的沉淀物重悬浮在确定的细胞培养基中。

活细胞用锥虫蓝排阻试验(西格玛(Sigma))在Neubauer细胞计数器中计数，并以25000个细胞/孔的密度接种在96孔板(Nunc)中。将孔用在超纯无菌水(Merck Eurolab 60759.01)中的聚L-赖氨酸(10μg/ml，西格玛(Sigma)P2636)预包被。

让细胞贴壁2小时并保持在湿润培养箱中37℃下5％CO₂/95％空气气氛中。

1.3用活性化合物温育脊髓运动神经元细胞培养物

培养12小时后，按照下述条件将培养基改变为确定的培养基：

对照(赋形剂，0.1％DMSO 0.1％)

7β-OH EPIA 10^-4M、10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M和10^-9M(在0.1％DMSO中)

BDNF 50ng/ml和10ng/ml(在0.1％DMSO中)。

6小时、12小时和24小时温育后，细胞在乙醇/乙酸溶液(95/5％)中-20℃下固定5分钟，并用PBS冲洗3次。

1.4用活性化合物温育感觉神经元细胞培养物

培养12小时后，按照下述条件将培养基改变为确定的培养基：

对照(赋形剂，0.1％DMSO 0.1％)

7β-OH EPIA 10^-4M、10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M和10^-9M(在0.1％DMSO中)

NGF 50ng/ml和10ng/ml(在0.1％DMSO中)。

与7β-OH EPIA的6小时、12小时和24小时温育后，细胞在乙醇/乙酸溶液(95％/5％)中-20℃下固定5分钟，并用PBS冲洗3次。

1.5神经突生长的分析

通过用温育溶液(含有5％FCS和0.1％皂苷的PBS，西格玛(Sigma)S-7900)以1∶400稀释的单克隆抗β-微管蛋白抗体(西格玛(Sigma)T8660)标记运动神经元和感觉神经元。该抗体特异标记神经元细胞体和神经突。

温育2小时后，细胞用PBS洗涤并用以1∶300稀释在温育溶液中的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(分子探针(Molecular Probes)AI 1001)培育以显示β-微管蛋白III抗体。

使用In Cell Analyzer 10003.2.工作站软件进行用抗β-微管蛋白抗体(神经元)标记的神经元的总长度的分析。

结果表示为相对于赋形剂的百分比。用不成对T检验进行组的比较。

2结果

2.1药物处理对运动神经元的神经突生长的影响

对细胞延伸总长度的分析表明了测试化合物的神经营养性质。

a)温育6小时后

结果在表13中显示。与赋形剂相比，用50ng/ml和10ng/ml的BNDF处理分别将运动神经元形成的神经突网络密度显著增加180％和193％(p＜0.001)。

与赋形剂相比，用10^-8M和10^-9M 7β-OH EPIA温育6小时分别将运动神经元形成的神经突网络密度显著增加150％和188％(p＜0.001)。

b)温育12小时后

结果在表14中显示。与赋形剂相比，用50ng/ml和10ng/ml的BNDF处理分别将运动神经元形成的神经突网络密度显著增加152％和173％(p＜0.001)。

与赋形剂相比，用10^-4M到10^-9M 7β-OH EPIA温育6小时将运动神经元形成的神经突网络密度显著增加226％到137％。

c)温育24小时后

结果在表15中显示。与赋形剂相比，用10ng/ml BDNF处理显著增加神经突网络密度(170％，p＜0.01)。然而，用50ng/ml BDNF温育没有显著改变轴突网络密度。

与赋形剂相比，用10^-8M 7β-OH EPIA温育24小时将神经突网络密度增加174％(p＜0.005)。

2.2药物处理对感觉神经元的神经突长度的影响

a)6小时温育后

结果在表16中显示。用50ng/ml和10ng/ml的NGF处理分别将感觉神经元形成的神经突网络密度显著增加273％(p＜0.001)和191％(p＜0.01)。

与对照相比，用10^-7M、10^-8M和10^-9M 7β-OH EPIA温育6小时使感觉神经元的神经突网络密度分别增加171％(p＜0.001)、176％(p＜0.005)和149％(p＜0.05)。

b)12小时温育后

结果在表17中显示。与赋形剂相比，用50ng/ml和10ng/ml的NGF温育分别将感觉神经元形成的神经突网络密度显著增加216％(p＜0.001)和128％(p＜0.05)。

与赋形剂相比，用10^-9M和10^-7M 7β-OH EPIA温育使神经突网络密度分别增加145％(p＜0.001)和134％(p＜0.05)。

b)24小时温育后

结果在表18中显示。与赋形剂相比，24小时温育后，用50ng/ml和10ng/ml的NGF温育分别将感觉神经元形成的神经突网络密度显著增加309％和371％(p＜0.001)。

与赋形剂相比，用10^-7M、10^-8M和10^-9M 7β-OH EPIA温育24小时(持续24小时)后，使神经突网络密度分别增加173％(p＜0.005)、174％(p＜0.01)和147％(p＜0.05)。

表13

温育6小时后每个视野中的运动神经元-神经突长度

处理	浓度	平均值(μm)	sem	n	％赋形剂	P
							赋形剂(0.1％DMSO)	-	254.3	19.0	12	100	-
BDNF	50ng/ml10ng/ml	457.2489.5	19.419.0	1212	180193	p＜0.001p＜0.001
							7β-OH-EPIA	10-4M10-5M10-6M10-7M10-8M10-9M	315.9293.3354.5350.5382.4479.3	18.922.833.734.325.840.8	121212121212	124115139138150188	p＜0.05p＜0.05p＜0.05p＜0.05p＜0.001p＜0.001

表14

温育12小时后每个视野中的运动神经元-神经突长度

处理	浓度	平均值(μm)	sem	n	％赋形剂	P
							赋形剂(0.1％DMSO)	-	423.8	38.3	12	100	-
BDNF	50ng/ml10ng/ml	643.7731.3	34.134.8	1212	152173	p＜0.001p＜0.001
							7β-OH-EPIA	10-4M10-5M10-6M10-7M10-8M10-9M	602.4680.9580.3956.7759.0764.9	24.830.855.554.661.659.9	121212121212	142161137137179180	p＜0.001p＜0.001p＜0.05p＜0.001p＜0.001p＜0.001

表15

温育24小时后每个视野中的运动神经元-神经突长度

处理	浓度	平均值(μm)	sem	n	％赋形剂	P
							赋形剂(0.1％DMSO)	-	215.8	39.6	12	100	-
BDNF	50ng/ml10ng/ml	293.6366.1	20.129.6	1212	136170	p＜0.001p＜0.001
							7β-OH-EPIA	10-4M10-5M10-6M10-7M10-8M10-9M	188.4200.9224.8271.7374.6265.9	23.320.736.734.022.326.2	121212121212	8793104126174123	p＜0.05p＜0.05p＜0.05p＜0.05p＜0.005p＜0.05

表16

温育6小时后每个视野中的感觉神经元-神经突长度

处理	浓度	平均值(μm)	sem	n	％赋形剂	P
							赋形剂(0.1％DMSO)	-	102.2	14.1	12	100	-
NGF	50ng/ml10ng/ml	279.1195.2	31.828.8	1212	273191	p＜0.001p＜0.01
							7β-OH-EPIA	10-4M10-5M10-6M10-7M10-8M10-9M	103.2114.897.7151.8179.3174.2	10.78.211.411.716.09.1	121212121212	10111296149176171	p＜0.05p＜0.05p＜0.05p＜0.05p＜0.005p＜0.001

表17

温育12小时后每个视野中的感觉神经元-神经突长度

处理	浓度	平均值(μm)	sem	n	％赋形剂	P
							赋形剂(0.1％DMSO)	-	298.4	12.8	12	100	-
NGF	50ng/ml10ng/ml	644.3381.3	40.031.4	1212	216128	p＜0.001p＜0.05
							7β-OH-EPIA	10-4M10-5M10-6M10-7M10-8M10-9M	290.3321.0287.0398.4368.3431.8	32.318.424.335.832.224.2	121212121212	9710896134123145	p＜0.05p＜0.05p＜0.05p＜0.05p＜0.05p＜0.001

表18

温育24小时后每个视野中的感觉神经元-神经突长度

处理	浓度	平均值(μm)	sem	n	％赋形剂	P
							赋形剂(0.1％DMSO)	-	220.7	12.4	12	100	-
NGF	50ng/ml10ng/ml	682.1819.9	64.261.5	1212	309371	p＜0.001p＜0.001
							7β-OH-EPIA	10-4M10-5M10-6M10-7M10-8M10-9M	228.6244.8189.9380.8384.3324.9	38.828.224.445.852.245.1	121212121212	10411186173174147	p＜0.05p＜0.05p＜0.05p＜0.005p＜0.01p＜0.05

Claims (30)

1.增强15-脱氧-前列腺素J2的产生的药剂用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防由升高水平的前列腺素E2或环加氧酶和前列腺素合酶活性的其他代谢物介导的病症，或用于治疗或预防由降低水平的15-脱氧-前列腺素J2或降低的15-脱氧-前列腺素J2可用性而恶化的病症。

2.促进产生15-脱氧-前列腺素J2并且在引起炎症的药剂存在下选择性抑制前列腺素E2的产生的药剂用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防由升高水平的前列腺素E2或环加氧酶活性的其他代谢物介导的病症，或用于治疗或预防由于降低水平的15-脱氧-前列腺素J2或降低的15-脱氧-前列腺素J2可用性而恶化的病症。

3.增强15-脱氧-前列腺素J2的产生的药剂用于制备促进神经突增生或治疗外周神经病的药物用途。

4.增强15-脱氧-前列腺素J2的产生并且又活化PPARγ的药剂用于制备治疗需要活化PPARγ的病症的药物的用途。

5.按照权利要求1到4任一项的用途，其中所述药剂是下式(I)的化合物或其药用盐或酯：

其中：

虚线环形表示含有其的环可以是完全饱和的或者可以具有1、2或3个碳-碳双键；

虚线表示该键可以是碳-碳单键或者双键；

R¹表示氢原子或者甲基基团；和

R²、R³和R⁴相互相同或不同并且每个代表氧代基团、羟基基团、巯基基团、氢原子、卤原子、烷氧基基团、芳氧基基团或者酰基基团。

6.按照权利要求5的用途，其中所述化合物具有下式(II)(其中R¹、R²、R³和R⁴如权利要求5所定义)或是其酯：

7.按照权利要求5的用途，其中所述化合物具有下式(III)(其中R^2a代表氧代基团、羟基基团、巯基基团或者卤原子；且R¹、R³和R⁴如权利要求5所定义)或是其酯：

8.按照权利要求5的用途，其中所述化合物具有下式(IV)(其中R¹、R²、R³和R⁴如权利要求5所定义)或是其酯：

9.按照权利要求5的用途，其中所述化合物具有式(V)：

其中R²、R³和R⁴如权利要求5所定义。

10.按照权利要求5的用途，其中所述化合物是7-羟基睾酮。

11.按照权利要求5的用途，其中所述化合物是7α-羟基-脱氢表雄酮或7β-羟基-脱氢表雄酮。

12.按照权利要求5的用途，其中所述化合物是7β-羟基-孕烯醇酮或7α-羟基-孕烯醇酮或其酯。

13.按照权利要求5的用途，其中所述化合物是7α-或7β-羟基表雄酮或其酯。

14.按照权利要求5的用途，其中所述化合物是7α-或7β-羟基-17β-雌二醇或其酯。

15.按照权利要求5的用途，其中所述化合物是7α-或7β-羟基-雌酮或其酯。

16.按照权利要求1到4任一项的用途，其中所述药剂是式(VI)的化合物：

其中：

X代表式＞CR⁵R⁶的基团，或当R¹⁰不代表氢原子时，X代表式＞SO₂的基团；

Y代表式＞NH或者＞CR⁵R⁶的基团；

Z代表式＞C＝O的基团、式＞CH₂的基团或者直接键；

R⁵代表氢原子并且R⁶代表氢原子、羧基基团或者羟基基团；或

R⁵和R⁶一起代表氧代基团、亚甲二氧基基团或者羟基亚氨基基团；

R⁷代表氢原子或者低级烷基基团；

R⁸代表两个氢原子，或者氧代或者羟基亚氨基基团；

R⁹代表氢原子、低级烷基或者卤原子；

R¹⁰代表氢原子、低级烷基或者羧基基团；

R¹¹和R¹²彼此相同或不同并且各自代表氢原子、低级烷基或者卤原子；

或者，当该化合物含有羧基基团时，所述药剂为其盐或酯。

17.按照权利要求16的用途，其中所述化合物是下述化合物1-23中之一：

18.如权利要求5-17任一项定义的化合物用于制备用于治疗或预防下列各项的药物的用途：糖尿病及其后遗症、缺血性血管病、与炎症相关的疼痛、炎性皮肤病症、脊髓损伤、外周神经病、多发性硬化病、炎性肠病、类风湿性关节炎、代谢综合征X、肥胖症、肢端肥大症和伤口愈合。

19.增强15-脱氧-前列腺素J2的产生的药剂用于制备治疗或预防癌症的药物的用途。

20.增强15-脱氧-前列腺素J2的产生的药剂用于制备药物的用途，所述药物用于抑制癌细胞增殖、在癌细胞中诱导程序性细胞死亡，或者抑制肿瘤生长和发展。

21.按照权利要求19和20任一项的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、甲状腺乳头状癌或食管癌。

22.按照权利要求19、20和21任一项的用途，其中所述化合物如权利要求5到17任一项中定义。

23.按照权利要求1或2的药剂的用途，其中所述病症包括外周器官的炎症或炎性疾病。

24.按照权利要求23的用途，其中所述外周器官包括肝脏或肾脏。

25.按照权利要求1或2的用途，其中所述病症包括炎性呼吸道疾病。

26.按照权利要求25的用途，其中所述炎性呼吸道疾病包括哮喘、鼻炎、支气管炎或慢性阻塞性肺病。

27.按照权利要求1到4任一项的用途，其用于治疗和预防：

与炎症相关的疼痛；

外周动脉病，以及它们的后遗症，如严重四肢缺血；

冠状动脉病及其后遗症；

脑血管疾病及其后遗症；

肝脏和肾脏缺血；

代谢疾病；

肥胖症及其后遗症；

炎性呼吸道疾病；

慢性神经变性疾病；

急性神经变性病症；

炎性肠病；

特征是关节软骨变性的炎性疾病；和

伤口愈合。

28.按照权利要求1到4任一项的用途，其用于治疗和预防：

与炎症相关的疼痛；

严重四肢缺血；

诸如缺血性心脏病和心肌梗死；

中风和短暂性缺血发作；

动脉粥样硬化肾动脉狭窄；

2型糖尿病及其后遗症、外周动脉病、冠状动脉病、肾的血管病和糖尿病性神经病变；

哮喘和慢性阻塞性肺病；

阿尔茨海默氏病、帕金森病、多发性硬化病和外周神经病；

外伤性脑损伤和脊髓损伤；

炎性肠病；和

类风湿性关节炎以及原发性和继发性骨关节炎和它们的后遗症。

29.按照权利要求3或权利要求18的用途，其中所述外周神经病由化学治疗剂引起。

30.按照权利要求29的用途，其中所述化学治疗剂是顺铂。

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