PT2097079E - Modulação dos caminhos metabólicos de prostaglandina/ciclo-oxigenase - Google Patents

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ΡΕ2097079 1 DESCRIÇÃO "MODULAÇÃO DOS CAMINHOS METABÓLICOS DE PROSTAGLANDINA/CICLO-OXIGENASE" A invenção presente diz respeito a diversos compostos que verificámos modularem os caminhos metabólicos envolvidos nas actividades da ciclo-oxigenase sintase e da prostaglandina sintase e na sintese das prostaglandinas, e que, em resultado, podem ser utilizados no tratamento e na profilaxia de diversas doenças e patologias tal como se especificam nas reivindicações, algumas das quais têm provado ser muito refractárias aos regimes de tratamento anteriores.

As prostaglandinas (PG), também referidas como prostanóides, são um conjunto de lípidos oxigenados largamente distribuídos, que modulam funções celulares tanto num contexto fisiológico como num contexto patológico. A biossíntese das PG inicia-se através da libertação do ácido araquidónico (AA), um ácido gordo principal, das membranas celulares, uma reacção catalisada pela fosfolipase A2 (PLA2). 0 AA libertado é transformado pela ciclo-oxigenase (COX) num intermediário oxigenado instável (PGH2). Uma vez formado, o intermediário PGH2 pode ser transformado em diversas prostaglandinas, tais como a prostaglandina E2 (PGE2), a prostaciclina (PGI2) , a prostaciclina F2oí (PGF2oí) 2 ΡΕ2097079 ou a prostaglandina D2 (PGD2) , por uma série de enzimas específicos denominados prostaglandina sintases (por exemplo a PGE sintase ou PGE-S, a PGD sintase ou PGD-S, etc.)· A COX está presente sob três isoformas: COX-1, COX-2 e a variante emendada de COX-1, COX-3. A COX-1 está constitutivamente expressa na maior parte dos tecidos, enquanto a COX-2 é em geral induzida em reacção a cito-quinas pró-inflamatórias e a stress. Estes factos levaram à opinião lógica de que a COX-2 é responsável pelos efeitos adversos pró-inflamatórios dos prostanóides. Portanto, tem-se considerado a inibição da COX-2 como um alvo principal no desenvolvimento de fármacos para o tratamento de doenças inflamatórias. No entanto, investigadores já demonstraram que a COX-2 também desempenha um papel importante na homeostase de base de órgãos e de tecidos.

Ensaios clinicos recentes revelaram que um tratamento de longo prazo com inibidores de COX-2 aumenta a incidência de apoplexia e de enfarte do miocárdio, complicações atribuídas ao bloqueio dos efeitos protectores dos vasos por parte da PGI2 derivada da COX-2. No entanto, o bloqueio dos enzimas COX também diminui a produção de PGD2. Em tecidos periféricos, a PGD2 promove a dilatação dos vasos e inibe a agregação das plaquetas. No cérebro, ela é a prostaglandina mais abundante, e um estudo recente mostrou que a PGD2 media efeitos neuroprotectores dos neurónios do hipocampo. 0 bloqueio da PGD2 derivada de COX-2 pode portanto contribuir para o aumento da incidência da 3 ΡΕ2097079 apoplexia e do enfarte do miocárdio observados em ensaios clinicos com inibidores de COX-2. A PGD2 tem uma vida curta, e sofre desidratação in vivo e in vitro para originar prostaglandinas biologicamente activas da série J2, incluindo a prostaglandina 15-desoxi-prostaglandina J2 (15d-PGJ2). Esta prostaglandina é um derivado natural, quimicamente estável, de PGD2. A 15d-PGJ2 é um ligando com uma forte afinidade para o receptor activado do proliferador do peroxissoma (PPAR) do subtipo PPARy, que é um factor de transcrição nuclear dependente do ligando que tem sido implicado numa larga gama de funções celulares, incluindo actuações anti-inflamatórias. A 15d-PGJ2 reprime diversos genes inflamatórios, tais como os da óxido nítrico sintase, da prostaglandina E sintase (PGES) e do factor α de necrose tumoral (TNFa), através de mecanismos dependentes de PPARy, bem como independentes de PPARy. Nos condrócitos de rato, a 15d-PGJ2 diminui quase completamente a síntese de PGE2 estimulada por citoquinas bem como a expressão de PGES, indicando que a 15d-PGJ2 é um mensageiro anti-inflamatório que desliga a produção da prostaglandina PGE2 pró-inflamatória nestas células. Independentemente do mecanismo, a 15d-PGJ2 está presente in vivo durante a fase de resolução da inflamação, sugerindo mais uma vez que ela possa actuar a título de reguladora da informação proveniente da resposta inflamatória. Demonstrou-se também que a administração da 15d-PGJ2 diminui o desenvolvimento da colite experimental no rato, um modelo de doença inflamatória dos intestinos. É portanto 4 ΡΕ2097079 expectável que os agentes e as circunstâncias que desviem o equilíbrio na produção de prostaglandinas a favor da PGD2 e da 15d-PGJ2 tenham efeitos anti-inflamatórios.

No sistema nervoso central, as actuações anti-inf lamatórias da 15d-PGJ2 poderiam beneficiar as patologias neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a esclerose múltipla, mas também a apoplexia, as lesões na medula espinal e os traumatismos cranianos em que a inflamação contribui para as lesões cerebrais e a morte das células. Em todos estes estados, as lesões cerebrais estão associadas a uma activação microglial excessiva. No sistema nervoso central, as microglias, células imunológicas residentes nativas, desempenham um papel fundamental no processo inflamatório. Uma activação descontrolada das microglias pode ser directamente tóxica para as células cerebrais por libertar substâncias tais como as citoquinas inflamatórias (IL-Ιβ, TNF-cx, IL-6) , NO, PGE2, e superóxido. Diversos estudos mostram 15d-PGJ2 conseguem reprimir a produção de citoquinas inflamatórias e de NO por células microgliais activadas e por astrócitos, sugerindo que as prostaglandinas conseguem desempenhar um papel importante na prevenção dos danos celulares associados a uma activação excessiva das células gliais. Quando se verificou que a administração da 15d-PGJ2 antes e no despoletar da encefalite auto-imune experimental (EAE), um modelo animal para a esclerose múltipla, diminuía significativamente a severidade da EAE, isto constituiu uma sugestão adicional 5 ΡΕ2097079 de que a 15d-PGJ2 podia ser eficaz na prevenção das lesões inflamatórias neurodegenerativas.

Estudos experimentais recentes demonstraram que a 15d-PGJ2 diminui a inflamação do tecido cerebral e tanto a disfunção comportamental como as perdas neuronais após uma hemorragia intra-cerebral em ratos, e que protege o cérebro das lesões provenientes da isquémia-reperfusão no modelo experimental da apoplexia. A infusão intra-ventricular da 15d-PGJ2 diminuia o volume do enfarte cerebral, inibia a apoptose cerebral e neuronal, suprimia a activação de NF-kB, e regulava em alta a heme oxigenase-1 (HO-1), poderoso antioxidante endógeno, de um modo dependente de PPARy. Estes resultados, que sugerem um efeito neuroprotector da 15d-PGJ2 na apoplexia isquémica, são ainda corroborados por um estudo recente mostrando que os pacientes de apoplexia isquémica aguda exibem teores mais elevados da 15d-PGJ2 no plasma do que os sujeitos normais, e de que os teores maiores de 15d-PGJ2 no plasma estão associados a consequências neurológicas melhores, tanto imediatas como a termo. Um maior teor em 15d-PGJ2 no plasma também está associado a um menor volume do enfarte, e este efeito era independente do efeito de outras variáveis de prognóstico importantes. Esperar-se-ia portanto que os agentes e as condições que desviam o equilíbrio da produção de pros-taglandina a favor da 15d-PGJ2 denotassem efeitos beneficiais nas patologias inflamatórias neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD) e a esclerose múltipla, e em estados agudos tais como 6 ΡΕ2097079 a apoplexia, as lesões da medula espinal e os traumatismos cranianos. A AD é uma patologia neurodegenerativa progressiva e fatal caracterizada pela deposição de placas extra-celulares Αβ (amilóide-β) e pela formação de ligações intracelulares no cérebro. As placas Αβ são sobretudo constituídas por amilóide-β e péptidos Αβ. A acumulação de Αβ provoca uma reacção inflamatória que foi proposto contribuir para a patogénese da AD e para aumentar as lesões neuronais. Os maiores teores de péptidos solúveis Αβ no cérebro também se supõe provocarem disfunção neuronal e diminuição do conhecimento muito antes de ocorrer a deposição das placas. A formação de péptidos Αβ no cérebro é portanto uma causa principal da patogénese da AD. A geração de Αβ é iniciada por uma protease que cliva uma proteína precursora maior, a proteína precursora β-amilóide (βΑΡΡ), no lado do terminal N do péptido Αβ. Esta protease, também denominada β-secretase ou enzima de clivagem do local β de APP (BACE1) , é uma protéase de aspartilo transmembranar. Os teores na proteína BACE1 e no produto β-secretase (fragmento terminal β-C) estão incrementados no cérebro de pacientes esporádicos com AD. Diminuindo a produção de Αβ no cérebro AD é portanto um objectivo terapêutico principal.

Foi descrito que o mARN de BACE1 bem como os teores proteicos são aumentados por mediadores pró- 7 ΡΕ2097079 inflamatórios e regulados em baixa por fármacos que sejam agonistas para o receptor-γ activado pelo proliferador do peroxissoma (PPARy) . Mais recentemente, também foi demonstrado que a diminuição de PPARy potência os teores em mARN de β-secretase ao aumentar a actividade do gene promotor de BACE1, enquanto a sobre-expressão de PPARy, bem como de activadores de PPARy, modula especificamente a transcrição de BACEl ao reprimir a actividade do promotor do gene de BACEl, sugerindo que o PPARy poderia ser um repressor de BACEl. Além disto, o tratamento de murganhos transgénicos hAPP com agonistas de PPARy agonistas diminuia tanto os teores em mARN de BACEl como os de β-amilóide intracelulares nos neurónios corticais.

Demonstrou-se também que a sobre-expressão de PPARy diminui a secreção de Αβ em células cultivadas por activação da ubiquitinação e da degradação mediada pelo proteassoma, da proteina precursora βΑΡΡ, bem como foi relatada a activação de PPARy como afectando directamente a estabilidade de Αβ externamente adicionado a células em cultura. Esta diminuição da estabilidade sugere que a activação de PPARy pode induzir um mecanismo celular rápido d eliminação do péptido amilóide.

Em conjunto, estes dados suportam um papel principal para o PPARy na modulação da geração de amilóide β, e sugerem um mecanismo de protecção através do qual a activação de PPARy diminui a produção de péptidos amilóides β no cérebro. ΡΕ2097079 A 15d-PGJ2, ligando com uma elevada afinidade para o receptor activado pelo proliferador do peroxissoma (PPAR) do subtipo PPARy, reprime diversos genes inflamatórios por intermédio de mecanismos dependentes de PPARy, bem como independentes de PPARy. Seriam portanto de esperar condições aumentando a produção endógena de 15d-PGJ2 tanto para suprimir os processos de inflamação no cérebro, como para diminuir a formação de péptido amilóide no cérebro AD. Em consequência, esperar-se-ia que os agentes e as condições que aumentam a produção endógena de 15d-PGJ2 tivessem efeitos beneficiais no tratamento da doença de Alzheimer.

As prostaglandinas da série J2 são indutores poderosos da produção do factor de crescimento dos nervos (NGF) e da do factor de crescimento dos nervos derivado do cérebro (BDNF), e promovem o crescimento dos neuritos NGF em cultura celular. A capacidade de promoção de neuritos da 15d-PGJ2 não ocorre através de PPARy porque os agonistas e os antagonistas sintéticos de PPAR-γ não alteram o efeito promotor de neuritos da 15-desoxi-PGJ2. Em estudos em animais, demonstrou-se que a administração intra-cerebro-ventricular de NGF resgata os neurónios colinérgicos, estimula o crescimento de axónios e melhora a função coli-nérgica. De forma semelhante, a injecção intra-cerebro-ventricular de NGF atenuava a morte neuronal nos hipocampos de cobaias submetidas a isquémia cerebral. Demonstrou-se que a BDNF promove a sobrevivência e o crescimento dos 9 ΡΕ2097079 neurónios em desenvolvimento in vitro, e melhora ad funções neuronais motrizes em modelos em animais. Nos animais submetidos a isquémia temporária da parte frontal do cérebro, a BDNF atenuava as lesões isquémicas neuronais. Infelizmente, devido às insuficientes penetrações destas neurotrofinas através da barreira sangue-cérebro, os ensaios clínicos não conseguiram demonstrar efeitos significativos. No entanto, é de esperar que as condições ou os tratamentos que aumentam os teores endógenos em 15d-PGJ2 facilitem a produção local destes factores de crescimento e promovam o crescimento neuronal, facilitando portanto a reparação neuronal na medula espinal e no cérebro.

Teores aumentados de marcadores inflamatórios estão associados com doença vascular isquémica, e a inflamação é cada vez mais considerada como estando envolvida na patogénese de síndromes coronárias agudas. A inflamação tem um papel relevante na iniciação e na progressão da ateros-clerose, mas também pode desempenhar um papel proeminente no desenvolvimento de tromboses ao activar o processo da coagulação. As condições e os agentes diminuindo a inflamação vascular poderiam portanto ser benéficas nas patologias cardiovasculares nas quais a inflamação contribui para a morte ou as lesões celulares, tal como na doença cardíaca coronária. 0 mARN da prostaglandina D sintase (PGDS) é expresso no coração. Deste modo, a PGD2 localmente 10 ΡΕ2097079 produzida pode resultar na presença de 15d-PGJ2 nos miócitos ou nas células circundantes. Também está presente e funcional nos miócitos cardíacos o PPARy. Um estudo recente mostrou que a 15d-PGJ2, metabolito natural da PGD2, exerce efeitos anti-inflamatórios nos miócitos cardíacos através da modulação de COX-2, PGE-S e iNOS estimulados por IL-Ιβ, de uma forma dependente de PPAR. A 15d-PGJ2 bloqueava a estimulação por IL-Ιβ da produção de PGE2 mas não modificava a estimulação por IL-Ιβ de PGI2 nem de PG2F2a, indicando que os efeitos dos ligandos de PPARy são específicos para a PGE-S. Seria de esperar que o bloqueio de PGE-S induzido por IL-Ιβ, por parte da 15d-PGJ2, diminuísse a produção da prostaglandina pró-inflamatória PGE2 no tecido cardíaco. Também se demonstrou que a 15d-PGJ2 regula em alta a expressão da heme-oxigenase-1 (HO-1) nos miócitos cardíacos e diminui a dimensão do enfarte do miocárdio num modelo em ratos de enfarte do miocárdio induzido por isquémia e reperfusão regional. Entre os diversos ligandos de PPARy estudados, a 15d-PGJ2 provocava de longe a diminuição mais pronunciada das dimensões do enfarte. Embora este efeito fosse mediado através de PPARy, uma expressão aumentada da proteína antioxidante e citoprotectora HO-1 era independente de PPARy. No seu conjunto, estes resultados sugerem que as condições e os agentes que aumentam os teores endógenos da 15d-PGJ2 podiam diminuir a inflamação vascular e portanto podem ser benéficas em patologias cardiovasculares.

Cada vez há mais provas identificando o tecido 11 ΡΕ2097079 adiposo como uma fonte proeminente de factores inflamatórios, em especial em casos de obesidade. A gordura origina adipocitoquinas pró-inflamatórias, nas quais se incluem TNF-α, leptina, PAI-1, IL-6, e angiotensinogénio. 0 TNF-α é um activador principal de NFkB . 0 TNF-α também inibe a sinalização insulínica, provocando deste modo resistência à insulina. Os teores em PAI-1 permitem prever CAD e diabetes, e são um contributor principal para o estado pró-trombótico na obesidade. A IL-6 estimula a produção de proteína reactiva C (CRP) no fígado e contribui para a teores elevados de CRP altamente sensível (hs) no soro dos sujeitos obesos. 0 valor de HsCRP prevê enfarte do miocárdio, apoplexia, doença arterial periférica, e morte súbita. 0 angiotensinogénio é o precursor da Ang II, que se sabe bem activar diversos mecanismos de lesão vascular. Em geral, todas estas adipoquinas são elevadas em sujeitos resistentes à insulina com adiposidade visceral aumentada, criando um ambiente pró-inflamatório. A diabetes mellitus de Tipo 2 (T2D) e a obesidade constituem portanto um estado inflamatório. 0 tecido adiposo expressa os teores mais elevados em PPARy, em comparação com os outros tecidos. Os ligandos PPARy promovem a diferenciação das células gordas e a absorção de ácidos gordos livres pelo tecido adiposo. Eles também têm um efeito importante para atenuar o ambiente pró-inflamatório diminuindo a expressão de TNF-α, PAI-1, e IL-6 e aumentando a expressão de adiponectina na gordura. Deste modo, a activação de PPARy suprime a inflamação 12 ΡΕ2097079 directamente nas células vasculares e indirectamente através da regulação da expressão de genes no tecido adiposo. A T2D e a sindrome metabólica são caracterizadas por resistência à acção da insulina nos tecidos periféricos, incluindo o músculo esquelético, o figado e o tecido adiposo. A activação de PPARy por determinados ligandos sintéticos, tais como as tiazolidinadionas, melhora a sensibilidade à insulina e diminui os teores circulantes em glucose, triacilgliceróis e ácidos gordos sem estimular a secreção de insulina em modelos de T2D em roedores. Os agonistas de PPARy também aliviam a resistência periférica à insulina nos seres humanos, e têm sido eficazmente utilizados no tratamento de pacientes com T2D. A 15-desoxi-prostaglandina J2 (15d-PGJ2) é uma prostaglandina natural, quimicamente estável e anti-inflamatória que aparentemente é um ligando endógeno putativo, com alta afinidade para o subtipo PPARy do receptor activado pelo proliferador do peroxissoma. É portanto de esperar que os agentes e as condições que aumentam a produção endógena de 15d-PGJ2 suprimam a inflamação vascular e melhorem a sensibilidade à insulina na dibetes do Tipo 2.

As citoquinas pro-inflamatórias, tais como o factor de necrose tumoral (TNF)-alfa, estão sobre-expressos na psoriase e na dermatite atópica. 0 TNF-α desempenha um papel importante tanto na iniciação como na persistência da 13 ΡΕ2097079 inflamação, e dados experimentais recentes mostram que o desenvolvimento de lesões no modelo experimental da psoriase é mediado pelo TNF-α. Estes factos, que sugerem um papel para o TNF-cx na patogénese da psoriase, são corroborados por resultados de ensaios clínicos recentes, mostrando que a administração de um anticorpo monoclonal (mAb) contra TNF-α (infliximab) ou de uma proteína de fusão solúvel receptora de TNF (etanercept), resultava em melhoras na doença dos pacientes com psoriase. A 15d-PGJ2, metabolito quimicamente estável da prostaglandina PGD2, é um ligando com alta afinidade para o receptor y activado pelo proliferador do peroxissoma (PPARy) . A 15d-PGJ2 reprime diversos macrófagos pró-inflamatórios em macrófagos activados, na células micro-gliais e nos astrócitos humanos, incluindo os genes da NO sintase indutível (iNOS) e do factor de necrose tumoral a (TNF-α), e esta repressão é pelo menos parcialmente dependente da expressão de PPARy. Além disto, os ligando sintéticos PPARy, tais como as tiazolidinadionas sensibili-zantes à insulina, têm demonstrado melhorar a psoriase em sujeitos humanos. Em conjunto, estes factos sugerem que os agentes e as condições que aumentam a produção endógena de 15d-PGJ2 poderiam ser eficazes no tratamento da psoriase.

Dados recentes indicam que determinados agonistas sintéticos de PPARy exibem actividades anti-proliferativas 14 ΡΕ2097079 moderadas contra muitas linhas de células cancerosas derivadas epiteliais. Além disto, dados recentes indicam que as células epiteliais normais da próstata e os linfócitos T são mais resistentes à indução da apoptose por estes ligandos de PPARy. à luz deste efeito especifico contra o cancro, a utilização potencial de agonistas de PPARy como agentes químicos preventivos tem recebido muita atenção. A 15d-PGJ2, ligando natural para PPARy, também tem demonstrado possuir actividade anti-tumoral. Por exemplo, a 15d-PGJ2 inibe significativamente o crescimento celular e induz a apoptose em diversos tipos de células cancerosas, incluindo as células de cancro colo-rectal, gástrico, da mama, e hepático. Os estudos mecanísticos sugerem que estes efeitos de inibição do crescimento são mediados através de mecanismos independentes de PPARy. No entanto, independentemente do mecanismo envolvido, é de esperar que os agentes ou condições que aumentam os teores endógenos em 15d-PGJ2, inibam o crescimento de tumores e a sua progressão.

Foram detectados teores incrementados em prosta-glandina E2 (PGE2) numa série de lesões malignas. Diversos tipos de dados, independentes da observação e teores elevados de PGE2 em tumores, sugerem que a PGE2 desempenha um papel no desenvolvimento e na progressão do cancro. Por exemplo, a PGE2 consegue estimular a proliferação e a mobilidade enquanto inibe a apoptose e a vigilância imuno- 15 ΡΕ2097079 lógica. De uma forma importante, a PGE2 também consegue induzir a angiogénese, pelo menos em parte, por aumentar a produção de factores pró-angiogénicos incluindo o factor de crescimento endotelial vascular. De uma forma consistente com estes factos, demonstrou-se que a presença de teores mais elevados de PGE2 em amostras de tecidos cancerosos se correlacionam de uma forma significativa com a ocorrência de doença metastásica e com o aumento da vascularização tumoral.

Trabalho recente em animais experimentais também sugere que a PGE2 consegue promover a carcinogénese. Verificou-se que a quebra genética do receptor de PGE2 EP2 diminui o número e a dimensão dos tumores experimentais, e noutros estudos demonstrou-se que o tratamento com anticorpo monoclonal anti-PGE2 inibia o crescimento de tumores transplantáveis. Atentos estes factos, poderia esperar-se que os agentes e as condições que inibam os caminhos enzimáticos que levam a quantidades maiores de PGE2 no cancro também inibem a progressão do crescimento tumoral. A sintese de PGE2 a partir do ácido araquidónico necessita de dois enzimas que actuam sequencialmente, a ciclo-oxigenase (COX) e a prostaglandina E sintase (PGES). Um aumento da expressão de PGES tem sido detectado em diversas lesões malignas em seres humanos, dando origem à possibilidade de que uma expressão aberrante de PGES leva a uma produção incrementada de PGE2 que contribui para a 16 ΡΕ2097079 proliferação celular e o crescimento de tumores. Foi reportado que a 15d-PGJ2 inibe quase por completo a síntese de PGE2 induzida por citoquinas e a expressão de sintase de PGE na membrana. Em consequência, é de esperar que os agentes e as condições que aumentam os teores endógenos em 15d-PGJ2 diminuam a síntese de PGE2 e portanto a proliferação celular e o crescimento de tumores, e tenham portanto um efeito positivo no tratamento do cancro. A FR 2.829.697 descreve a utilização de derivados 7-hidroxilo e 7-ceto de hormonas esteróides hidroxiladas em 3-beta para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças inflamatórias e/ou funcionais dos intestinos, em especial para a doença de Crohn, a recto-colite hemorrágica e a síndrome de cólon irritável. 0 WO 2005/079.810 relaciona-se com a utilização de esteróides hidroxilados em 7 capazes de modular o receptor beta de estrogénios para a preparação de um medicamento para a prevenção e/ou o tratamento de cancros dependentes de hormonas, tais como os cancros da mama e da próstata, e outras patologias proliferativas, tais como as patologias da próstata, incluindo as patologias do desenvolvimento e do envelhecimento da próstata. O NL 7.100.213 descreve um processo para preparar uma formulação anti-inflamatória incluindo derivados de tetrahidrocarbazole, isenta de efeitos colaterais ulcero-génicos, sob uma forma adequada para uma administração terapêutica. 17 ΡΕ2097079 0 WO 01/60.375 relaciona-se com a utilização de um esteróide substituído com hidroxilo em 7-alfa, tal como os 7-alfa-hidroxi-estradióis, as 7-alfa-hidroxi-desidro-epiandrosteronas, as 7-alfa-hidroxi-pregnenolonas, para a manufactura de um medicamento para o tratamento da degeneração celular aguda devida aos compromissos metabólicos provocados, por exemplo, pela apoplexia, pelo coma e pelos traumatismos cranianos ou espinais. 0 WO 02/00.224 descreve a utilização, para o fabrico de um medicamento para a protecção contra as lesões neuronais, de um 3-hidroxi-7-beta-hidroxiesteróide ou de um 3-oxo-7-beta-hidroxiesteróide e dos seus ésteres aceitáveis do ponto de vista farmacêutico; as lesões neuronais são, por exemplo, provocadas por uma patologia crónica, tal como a doença de Alzheimer, a Doença de Parkinson ou A Deficiência Cognitiva Sem Demência (CIND), ou por uma patologia aguda provocada, por exemplo, por uma apoplexia, traumatismo craniano, lesões na medula espinal ou lesões dos nervos periféricos. A GB 2.378.898 descreve a utilização de 3-hidroxi-7-beta-hidroxiesteróides, em particular os seus isómeros 7-beta e os seus ésteres aceitáveis do ponto de vista farmacêutico para a protecção contra as lesões induzidas por isquémia nos órgãos periféricos, tais como o coração ou os rins, bem como o tratamento de lesões na medula espinal. 18 ΡΕ2097079 Já demonstrámos que a 7p-hidroxi-EPI-Androsterona (7β-0Η-ΕΡΙΑ), um 7-hidroxiesteróide endógeno, possui efeitos neuroprotectores e cardioprotectores (WO 02/00.224, WO 02/00.225 e WO 03/015.791). O esteróide protege contra a morte de células neuronais in vitro (culturas de fatias organotipicas de hipocampo (OTHSC) e de células PC12) e contra os danos cerebrais e numerosos modelos experimentais in vivo, e é eficaz na protecção contra enfarte do miocárdio induzido por isquémia regional em corações de rato sob perfusão. Em conjunto, estes factos sugerem que a 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ poderia ter efeitos positivos na prevenção e no tratamento de estados neurodegenerativos tais como a apoplexia, as lesões da medula espinal, as lesões traumáticas no cérebro e a AD, e em estados cardiovasculares tais como o enfarte do miocárdio (MI).

Mais recentemente, mostrámos que a incubação de células PC12 com indometacina, um inibidor de ciclo-oxigenase (COX), prejudica por completo a protecção contra a isquémia induzida por 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ. Estes resultados sugerem que a actividade do COX é indispensável para os efeitos neuroprotectores da 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ.

Mostramos agora que a incubação de células monociticas humanas (HMBC) com concentrações nanomolares de 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ, provoca um aumento de quase 10 vezes da produção da prostaglandina 15-desoxi-A12,14-J2 (15d-PGJ2). Este efeito do 7-hidroxiesteróide parece ser especifico 19 ΡΕ2097079 para a 15d-PGJ2, uma vez que o esteróide não alterou significativamente a produção da prostaglandina E2 (PGE2) nestas células. Em contraste, a incubação de hMBC com a citoquina pró-inflamatória factor α de necrose tumoral (TNF-α) aumentava a produção, tanto de ambas as prostaglan-dinas aproximadamente para o triplo. Além disto, uma co-incubação com TNF-α e 7β-0Η-ΕΡΙΑ provocava um aumento da 15d-PGJ2 semelhante ao aumento observado com a 7β-0Η-ΕΡΙΑ apenas, enquanto a adição de concentrações nanomolares de 7β-0Η-ΕΡΙΑ abolia por completo os aumentos de PGE2 devidos ao TNF-a.

Foi reportado que a 15d-PGJ2 inibia quase por completo a síntese de PGE2 induzida por citoquinas bem como a expressão da PGE-sintase na membrana (mPGES) nos condrócitos de rato, indicando que a 15d-PGJ2 é um mensageiro anti-inflamatório que desactiva a produção da prostaglandina pró-inflamatória PGE2 nestas células. As nossas observações podem portanto indicar que a inibição da produção da prostaglandina pró-inflamatória PGE2 induzida por TNFa conseguida pela 7β-0Η-ΕΡΙΑ, é mediada por um aumento da produção de 15d-PGJ2. A 15d-PGJ2 é um ligando com alta afinidade para o receptor activado pelo proliferador do peroxissoma (PPAR) do subtipo PPARy, um factor de transcrição dependente do ligando que tem sido implicado numa larga gama de funções celulares, incluindo actuações anti-inflamatórias, neuro-protectoras, cardioprotectoras, metabólicas e anti-tumo- 20 ΡΕ2097079 rais. Verificámos agora que agentes tais como a 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ podem facilitar selectivamente a produção de 15d-PGJ2 e portanto poderiam ser benéficos na inflamação e em patologias da pele, por exemplo em doenças inflamatórias do intestino e na psoriase, bem como em patologias neurológicas, cardiovasculares e metabólicas tais como a apoplexia, as lesões da medula espinal, os traumatismos cranianos, AD, PD, na doença cardiaca coronária e na diabetes de Tipo 2 em que a inflamação contribua para a disfunção e a morte celular, bem como em diversos tipos de cancro nos quais o incremento da produção da PGE2 contribua para a proliferação celular e para o crescimento tumoral.

Portanto, num aspecto, a invenção presente consiste na utilização de um agente que aumenta a produção da 15-desoxi-prostaglandina J2 para o fabrico de um medicamento para o tratamento ou a profilaxia de estados mediados por teores incrementados em prostaglandina E2 ou outros metabolitos da ciclo-oxigenase e por actividade da prostaglandina sintase, para o tratamento ou para a profilaxia de estados tornados piores devido a um teor diminuido ou a uma disponibilidade reduzida da 15-desoxi-prostaglandina J2, tal como se especifica nas reivindicações .

Num aspecto adicional, a invenção presente consiste na utilização de um agente que facilite a produção da 15-desoxi-prostaglandina J2 e iniba selectivamente a produção da prostaglandina E2 na presença de um agente que 21 ΡΕ2097079 provoque uma inflamação, para o fabrico de um medicamento para o tratamento ou para a profilaxia de estados mediados por teores elevados em prostaglandina E2 ou noutros metabolitos da ciclo-oxigenase-2 ou para o tratamento ou a profilaxia de estados tornados piores devido a um teor diminuído ou a uma disponibilidade reduzida da 15-desoxi-prostaglandina J2, tal como se especifica nas reivindicações .

Num aspecto adicional, a invenção presente consiste a invenção presente consiste na utilização de um agente que facilite a produção da 15-desoxi-prostaglandina J2 e por sua vez active a PPARy para a manufactura de um medicamento para tratar um estado que necessite da acti-vação da PPAR γ, tal como se especifica nas reivindicações.

Os compostos da invenção presente podem ser utilizados no tratamento e na profilaxia de: doenças inflamatórias das vias respiratórias tais como a asma e a doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), por exemplo bronquite crónica.

Incluem-se em outros estados inflamatórios que se podem tratar com estes agentes, as doenças inflamatórias das vias respiratórias, tais como a asma, a rinite, a bronquite e a e a doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD). 22 ΡΕ2097079 A invenção é ilustrada pelos desenhos que acompanham este documento, nos quais, e doravante, a 7β-hidroxi-EPI-Androsterona é referida como 7β-0Η ΕΡΙΑ, nos desenhos: A Figura 1 mostra os dados combinados sobre a percentagem média de morte celular, obtidos a partir de 4 experiências separadas no Exemplo 1, com os dados expressos sob a forma de média ± erro padrão da média; A Figura 2 mostra os dados sobre a percentagem média de morte celular em experiências separadas reportadas no Exemplo 1; A Figura 3 mostra os dados sobre a percentagem média de morte celular em experiências separadas reportadas no Exemplo 1; A Figura 4 mostra os dados sobre a percentagem média de morte celular em experiências separadas reportadas no Exemplo 1;

As Figuras 5 (a) e 5 (b) mostram o efeito de concentrações crescentes de 7β-0Η-ΕΡΙΑ sobre os teores em PGD2 detectados nos sobrenadantes de células mononucleares de sangue periférico incubadas com 7β-0Η-ΕΡΙΑ, na presença e na ausência de TNF-α, tal como se reporta no Exemplo 2;

As Figuras 6 (a) e 6 (b) mostram o efeito de concentrações crescentes de 7β-0Η-ΕΡΙΑ sobre os teores em PGE2 detectados nos sobrenadantes de células mononucleares de sangue periférico ΡΕ2097079 23 incubadas com 7β-0Η-ΕΡΙΑ, na presença e na ausência de TNF-α, tal como se reporta no Exemplo 2;

As Figuras 7 (a) e 7 (b) mostram o efeito de concentrações crescentes de 7β-0Η-ΕΡΙΑ sobre os teores em 15d-PGJ2 detectados nos sobrenadantes de células mononucleares de sangue periférico incubadas com 7β-0Η-ΕΡΙΑ, na presença e na ausência de TNF-α, tal como se reporta no Exemplo 2; A Figura 8 mostra os efeitos do tratamento com 7β-1ι1άηοχ1-ΕΡΙΑ sobre (A) marcadores de mielo-peroxidase (MPO) e de stress oxidativo, nomeadamente (B) Prot CO, (C) Tbars e (D) o marcador antioxidante GSH em tecido do cólon, tal como se descreve em mais pormenor no Exemplo 4; A Figura 9 mostra o teor em 15d-PGJ2 no cólon (A) e a quantificação da expressão relativa de mARN de COX-2, mPGES-1 e H-PGDS (B) , em diversas alturas durante o tratamento com 7β- hidroxi-EPIA no Exemplo 4; A Figure 10 mostra o efeito de 7β-hidroxi-EPIA sobre a sintese no cólon, de prostaglandina E2, da D2 e dal5d-PGJ2, durante a administração de DSS no Exemplo 4; A Figura 11 mostra a expressão no cólon, de mARN de COX-2, mPGES-1 e H-PGDS, durante a indução de colite no Exemplo 4. 24 ΡΕ2097079

Incluem-se nos compostos que se podem utilizar na invenção presente, aqueles compostos com a fórmula (II):

em que: R1 represente um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo; e R2, R3 e R4 sejam iguais ou diferentes e cada um deles represente um grupo oxo, um grupo hidroxilo, um grupo mercapto, um átomo de hidrogénio, um átomo de halogéneo, um grupo alcoxilo, um grupo ariloxilo ou um grupo acilo; e um seu sal ou éster aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Inclui-se nos exemplos dos compostos com a fórmula (II) a 7-hidroxitestosterona, que tem a fórmula (Ha) : ΡΕ2097079 25

(Ua) e os seus ésteres. 0 grupo 7-hidroxilo neste composto pode estar nas configurações alfa ou beta, ou pode utilizar-se uma mistura dos dois isómeros.

Nos compostos da invenção presente, em que R2 represente um átomo de halogéneo, ele pode ser um átomo de flúor, de cloro, de bromo ou de iodo, preferivelmente um átomo de cloro.

Quando R2 representar um grupo alcoxilo, pode tratar-se de um grupo com uma cadeia linear ou ramificada, preferivelmente contendo entre 1 e 6 átomos de carbono. Incluem-se nos exemplos destes grupos os grupos metoxilo, etoxilo, propoxilo, isopropoxilo, butoxilo, sec-butoxilo, isobutoxilo, t-butoxilo, pentiloxilo e hexiloxilo.

Quando R2 representar um grupo ariloxilo, ele será preferivelmente um grupo fenoxilo ou um grupo naftiloxilo.

Quando R2 representar um grupo acilo, ele pode ser por exemplo, um grupo acilo alifático ou um grupo acilo 26 ΡΕ2097079 aromático. Incluem-se nos exemplos de grupos acilo alifáticos os grupos contendo entre 1 e 6 átomos de carbono, tais como os grupos formilo, acetilo, propionilo, butirilo, valerilo, isovalerilo, pivaloílo e hexanoílo. Incluem-se nos exemplos de grupos acilo aromáticos os grupos benzoilo, naftoilo e toluoilo.

Entender-se-á que, quando o composto contiver um grupo com a fórmula -0R, em que R seja qualquer um dos grupos ou átomos definidos acima em relação a R2, etc., a espécie activa será provavelmente o composto contendo o grupo hidroxilo livre. Portanto, qualquer grupo que possa ser transformado in vivo num grupo hidroxilo pode ser utilizado em vez do grupo hidroxilo.

Estes compostos podem ser preparados por uma série de processos, bem conhecidos por si próprios, a partir dos esteróides correspondentes. Por exemplo, eles podem ser preparados pelos métodos descritos na EP 1.294.382.

Os compostos com a fórmula (I) foram descritos na EP 1.294.382, no WO 2002/000.224 e no WO 2002/000.225, para utilização no tratamento ou na profilaxia de doenças ou de estados neurodegenerativos crónicos e agudos, e no WO 2002/015.791 para utilização no tratamento ou na profilaxia de doenças ou de estados cardiodegenerativos agudos e, evidentemente, estes tratamentos e estas profilaxias estão excluídos das reivindicações presentes. 27 ΡΕ2097079

Quando os compostos da invenção presente contiverem um grupo carboxilo, os compostos da invenção podem formar ésteres, que se podem preparar por técnicas convencionais de esterificação. Não existe nenhuma limitação especifica da natureza do éster, desde que, quando o composto resultante se destine a uma utilização medicinal, o composto seja aceitável do ponto de vista farmacêutico, isto é, não seja menos activo, ou inaceitavelmente menos activo, nem mais tóxico, ou inaceitavelmente mais tóxico, do que o composto de que provém. No entanto, quando o composto se destina a uma utilização não medicinal, por exemplo como intermediário na preparação de outros compostos, mesmo estas restrições não se aplicam, e então não existe nenhuma restrição da natureza dos ésteres que se podem formar.

Incluem-se nos exemplos de grupos éster: os grupos alquilo contendo entre 1 e 20 átomos de carbono, mais preferivelmente entre 1 e 10 átomos de carbono, tais como os exemplificados em relação a R7, R9, R11 ou R12 e a grupos alquilo maiores são tal como bem conhecidos na técnica, tais como os grupos dodecilo, tridecilo, pentadecilo, octadecilo, nonadecilo e eicosilo; os grupos cicloalquilo contendo entre 3 e 7 ΡΕ2097079 28 átomos de carbono, por exemplo os grupos ciclo-propilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexi-lo e ciclo-heptilo; os grupos aralquilo, cuja parte alquilo contenha 1 a 3 átomos de carbono e cuja parte arilo seja um grupo carbocíclico aromático contendo entre 6 e 14 átomos de carbono, que possa ser substituído ou não substituído; incluem-se nos exemplos de tais grupos aralquilo, os grupos benzilo, fenetilo, 1-fenil-etilo, 3-fenilpropilo, 2-fenilpropilo, 1-naftilmetilo, 2-naftilmetilo, 2-(1-naftil)eti-lo, 2-(2-naftil)etilo, benzidrilo (isto é, difenilmetilo), trifenilmetilo, bis(o-nitrofe-nil)metilo, 9-antrilmetilo, 2,4, 6-trimetil-benzilo, 4-bromobenzilo, 2-nitrobenzilo, 4-nitrobenzilo, 3-nitrobenzilo, 4-metoxibenzilo e piperonilo; grupos alcenilo contendo entre 2 e 6 átomos de carbono, tais como os grupos vinilo, alilo, 2-metilalilo, 1-propenilo e isopropenilo; grupos alquilo halogenados contendo entre 1 e 6, preferivelmente entre 1 e 4, átomos de carbono, tais como os grupos 2,2,2-tricloroetilo, 2-haloetilo (por exemplo 2-cloroetilo, 2-fluoroetilo, 2-bromoetilo ou 2-iodoetilo), 2,2-dibromoetilo e 2,2,2-tribromoetilo; ΡΕ2097079 29 grupos sililalquilo substituídos, por exemplo os grupos 2-tri(alquil Ci-C4)sililetilo, em particular um grupo 2-trimetilsililetilo; grupos fenilo substituídos e não substituídos, por exemplo os grupos fenilo, toluílo e ben-zamidofenilo ; grupos fenacilo substituídos e não substituídos, por exemplo o grupo fenacilo ele próprio ou o grupo p-bromofenacilo; grupos terpenilo cíclicos e acíclicos, por exemplo os grupos geranilo, nerilo, linalilo, fitilo, mentilo (em particular m- e p-mentilo), tujilo, carilo, pinanilo, bornilo, norcarilo, norpinanilo, norbornilo, mentenilo, canfenilo e norbornenilo; grupos alcoximetilo, nos quais a parte alcoxilo tenha entre 1 e 6, preferivelmente entre 1 e 4, átomos de carbono, e possa ela própria ser substituída por um único grupo alcoxilo não substituído, tais como os grupos metoximetilo, etoximetilo, propoximetilo, isopropoximetilo, butoximetilo e metoxietoximetilo;

Grupos aciloxialquilo alifáticos, nos quais o ΡΕ2097079 30 grupo acilo seja preferivelmente um grupo alcanoílo e seja mais preferivelmente um grupo alcanoilo contendo entre 2 e 6 átomos de carbono, e a parte alquilo contenda entre 1 e 6, e preferivelmente entre 1 e 4, átomos de carbono, tais como os grupos acetoximetilo, propioniloximetilo, butiriloximetilo, isobuti-riloximetilo, pivaloiloximetilo, 1-pivaloiloxietilo, 1-acetoxietilo, 1-isobuti-riloxietilo, 1-pivaloiloxipropilo, 2-metil-l-pivaloiloxipropilo, 2-pivaloiloxipropilo, 1-isobutiriloxietilo, 1-isobutiriloxipropilo, 1-acetoxipropilo, l-acetoxi-2-metilpropilo, 1-propioniloxietilo, 1-propioniloxipropilo, 2-acetoxipropilo e 1-butiriloxietilo; grupos aciloxialquilo alifáticos substituídos com cicloalquilo, nos quais o grupo acilo seja preferivelmente um grupo alcanoílo e mais preferivelmente um grupo alcanoílo contendo entre 2 e 6 átomos de carbono, o substituinte cicloalquilo contenha entre 3 e 7 átomos de carbono, e a parte alquilo contenha entre 1 e 6, preferivelmente entre 1 e 4, átomos de carbono, tais como os grupos ciclo-hexilacetoxi-metilo, 1-(ciclo-hexilacetoxi)etilo, 1-(ciclo-hexilacetoxi)propilo, 2-metil-l-(ciclo-hexilacetoxi) propilo, ciclopentilacetoximetilo, 1-(ciclopentil-acetoxi)etilo, 1-(ciclopentilace- ΡΕ2097079 31 toxi)propilo e 2-metil-l-(ciclopentilacetoxi)-propilo; grupos alcoxicarboniloxialquilo, em particular grupos 1-(alcoxicarboniloxi)etilo, tais como os grupos 1-metoxicarboniloxietilo, 1-etoxicarbo-niloxietilo, 1-propoxicarboniloxietilo, 1-iso-propoxicarboniloxietilo, 1-butoxicarboniloxi-etilo, 1-isobutoxicarboniloxietilo, 1-sec-buto-xicarboniloxietilo, 1-t-butoxicarboniloxietilo, 1-(1-etilpropoxicarboniloxi)etilo e 1-(1,1-dipropilbutoxicarboniloxi)etilo, e outros grupos alcoxicarbonilalguilo, nos guais tanto os grupos alcoxilo como alquilo tenham entre 1 e 6, preferivelmente entre 1 e 4, átomos de carbono, tais como os grupos 2-metil-l-(iso-propoxicarboniloxi)propilo, 2-(isopropoxicar-boniloxi)propilo, isopropoxicarboniloximetilo, t-butoxicarboniloximetilo, metoxicarboniloxi-metilo e etoxicarboniloximetilo; grupos cicloalquilcarboniloxialquilo e ciclo-alquiloxicarboniloxialquilo, por exemplo os grupos 1-metilciclo-hexilcarboniloximetilo, 1-metilciclo-hexiloxicarboniloximetilo, ciclo-pentiloxicarboniloximetilo, ciclopentilcarbo-niloximetilo, 1- (ciclo-hexiloxi-carboniloxi)-etilo, 1-(ciclo-hexilcarboniloxi)etilo, 1-(ci-clopentiloxicarboniloxi)-etilo, 1- (ciclopen- ΡΕ2097079 32 tilcarboniloxi)etilo, 1- (ciclo-heptiloxicar-boniloxi)etilo, 1- (ciclo-heptilcarboniloxi)etilo, 1-metilciclopentilcarboniloximetilo, 1-me-tilciclopentiloxicarboniloximetilo, 2-metil-l-(1-metilciclo-hexilcarboniloxi)-propilo, 1- (1-metilciclo-hexilcarboniloxi)propilo, 2-(1-me-tilciclo-hexilcarboniloxi)propilo, 1-(ciclo-hexilcarboniloxi)propilo, 2- (ciclo-hexilcarbo-niloxi)propilo, 2-metil-l-(1-metilciclopentil-carboniloxi)propilo, 1-(1-metilciclopentilcar-boniloxi)propilo, 2- (1-metilciclopentilcarbo-niloxi)propilo, 1-(ciclopentilcarboniloxi)propilo, 2-(ciclopentilcarboniloxi)propilo, 1-(1-metilciclopentilcarboniloxi)etilo, 1-(1-metil-ciclopentilcarboniloxi)propilo, adamantiloxi-carboniloximetilo, adamantilcarboniloximetilo, 1-adamantiloxicarboniloxietilo e 1-adamantil-carboniloxietilo; grupos cicloalquilalcoxicarboniloxialquilo, por exemplo os grupos ciclopropilmetoxicarboniloxi-metilo, ciclobutilmetoxicarboniloximetilo, ci-clopentilmetoxicarboniloximetilo, ciclo-hexil-metoxicarboniloximetilo, 1-(ciclopropilmetoxi-carboniloxi)etilo, 1-(ciclobutilmetoxicarbo-niloxi)etilo, 1-(ciclopentilmetoxicarboniloxi)-etilo e 1-(ciclo-hexilmetoxicarboniloxi)etilo; grupos terpenilcarboniloxialquilo e terpenilo- 33 ΡΕ2097079 xicarboniloxialquilo, por exemplo os grupos 1-(mentiloxicarboniloxi)etilo, 1-(mentilcarbo-niloxi)etilo, mentiloxicarboniloximetilo, men-tilcarboniloximetilo, 1-(3-pinaniloxicarbonilo-xi)etilo, 1- (3-pinanilcarboniloxi)etilo, 3-pinaniloxicarboniloximetilo e 3-pinanilcarbo-niloximetilo; grupos 5-alquil- ou 5-fenil- (2-oxo-l,3-dioxol-en-4-il)alquilo, por exemplo os grupos (5-metil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo, (5-fenil-2-oxo-l,3-dioxolen-4-il)metilo, (5-isopropil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo, (5-t-butil-2-oxo- 1.3- dioxolen-4-il)metilo e 1-(5-metil-2-oxo- 1.3- dioxolen-4-il)etilo; e outros grupos, em particular grupos que sejam facilmente removidos in vivo tais como o grupo ftalidilo, o grupo indanilo e o grupo 2-oxo-4,5, 6, 7-tetrahidro-l,3-benzodioxolen-4-ilo .

Além disto, quando os compostos da invenção presente contiverem um grupo carboxilo, eles podem ser transformados em sais, com uma base, por métodos convencionais. Não existe nenhuma limitação especifica da natureza destes sais, desde que, quando os compostos se destinarem a ser utilizados medicinalmente, os compostos sejam aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. No entanto, quando o composto se destina a ser utilizado em aplicações não farmacêuticas, 34 ΡΕ2097079 por exemplo a título de intermediário na preparação de outros compostos, nem esta limitação se aplica, e então não existe nenhuma limitação da natureza dos sais que se podem formar. Incluem-se nos exemplos desses sais: sais com um metal alcalino, tal como sódio, potássio ou lítio; sais com um metal alcalino-terroso, tais como bário ou cálcio; sais com outro metal, tal como magnésio ou alumínio; sais de amónio; sais de bases orgânicas, tais como um sal com metilamina, dimetilamina, trietilamina, di-isopropilamina, ciclo-hexilamina ou diciclo-hexilamina; e sais com um aminoácido básico, tal como lisina ou arginina. Preferem-se os sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

Também se podem transformar os compostos da invenção presente em sais com ácidos, pelos métodos convencionais. Não existe nenhuma limitação específica da natureza destes sais, desde que, quando os compostos se destinam a ser utilizados medicinalmente, os compostos sejam aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. No entanto, quando o composto se destina a ser utilizado em aplicações não medicinais, por exemplo sob a forma de um intermediário na preparação de outros compostos, mesmo esta limitação não é aplicável, e portanto não existe nenhuma limitação da natureza dos sais que se podem formar. Incluem-se nos exemplos desses sais: os sais com ácidos minerais, em particular ácidos hidrohalogénicos (tais como ácido fluorídrico, ácido clorídrico, ácido bromídrico e ácido iodídrico), ácido nítrico, ácido perclórico, ácido carbónico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico; sais com os 35 ΡΕ2097079 ácidos alquilsulfínicos inferiores, tais como o ácido metanossulfónico, o ácido etanossulfónico e o ácido tri-fluorometanossulfónico; os sais com ácidos arilsulfónicos, tais como o ácido benzenossulfónico ou o ácido p-tolue-nossulfónico; os sais com ácidos carboxilicos orgânicos, tais como o ácido acético, o ácido fumárico , o ácido tartárico, o ácido oxálico, o ácido maleico, r o ácido málico, o ácido succínico, o ácido benzóico, o ácido man- délico, o ácido ascórbico, o ácido láctico, o ácido glucónico ou o ácido cítrico; e sais com aminoácidos, tais como o ácido glutâmico ou o ácido aspártico. São preferidos os sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

Podem portanto utilizar-se os compostos da invenção presente no tratamento ou na profilaxia de uma série de doenças ou estados, agudos ou crónicos, tal como se especificam nas reivindicações, e, para estes objectivos, podem ser formulados como preparações farmacêuticas convencionais, tal como são conhecidas na técnica. Deste modo, podem administrar-se os compostos por via oral, por exemplo sob a forma de comprimidos, cápsulas, grânulos, pós, xaropes, aspersões, ou outras formas destas bem conhecidas, ou por via parenteral, por exemplo por injecções, aspersões, gotas oculares, pensos adesivos ou supositórios, etc.

Podem preparar-se estas preparações farmacêuticas por meios convencionais, e podem conter adjuvantes conhecidos, de um tipo habitualmente utilizado neste domínio, 36 ΡΕ2097079 por exemplo veículos, aglomerantes, desintegrantes, lubrificantes, estabilizantes, correctores, etc., consoante a utilização pretendida e a forma de preparação. A dose dependerá do estado, da idade, e da massa corporal do paciente bem como da natureza e da severidade da patologia a ser tratada, mas no caso da administração por via oral a um paciente humano adulto, sugerir-se-ia normalmente uma dose diária total de entre 0,01 e 50 mg/kg de massa corporal (mais preferivelmente entre 0,05 e 20 mg/kg de massa corporal), que podem ser administrados numa única dose ou em doses divididas, por exemplo entre uma e três vezes ao dia.

Em geral, podem utilizar-se os compostos da invenção presente para o tratamento ou a profilaxia de uma série de estados ou condições inflamatórias provenientes dos caminhos metabólicos que levam à inflamação, tal como se especifica nas reivindicações. A invenção é ilustrada em mais pormenor pelos seguintes Exemplos. EXEMPLO 1 (referência)

Efeitos protectores da 7p-hidroxi-EPI-Andros-terona contra a isquémia em células PC-12: inibição pelo inibidor da ciclo-oxigenase (COX) indometacina O objectivo deste Exemplo era investigar se a 7β- 37 ΡΕ2097079 OH-EPIA mantém a sua eficácia neuroprotectora num modelo de hipoxia, quando a síntese de prostaglandinas está atenuada pela indometacina. 0 principal sistema experimental que se utilizou foi a citotoxicidade induzida pela isquémia nas células PC12. 0 ponto final experimental medido foi a morte celular. A morte celular de PC-12 induzida por isquémia era consistentemente diminuída por 7β-0Η-ΕΡΙΑ. A indometacina (10 μΜ) , que bloqueia a síntese de prostaglandinas, não tinha qualquer efeito directo sobre a morte celular induzida por isquémia, mas antagonizava por completo o efeito neuroprotector de 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 1 μΜ e 10 μΜ, suportando a hipótese de que a síntese de prostaglandinas é necessária para o efeito protector da 7β-ϊιίάΓθχί-ΕΡΙΑ.

Metodologia

Cultura de células PC-12

Mantiveram-se as células PC-12 em frascos revestidos com Colagénio de tipo 1, em meio para PC-12 que tinha a seguinte composição; RPMI 1640 sem L-glutamina com L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, Piruvato de sódio 1 mM, glucose adicional para assegurar uma concentração final de 4,5 g/L (o RPMI tem, normalmente, 2 g/L), 10 % de soro de cavalo termicamente inactivado, 5 % de soro fetal de vitelo e 50 unidades de penicilina/estreptomicina. Mudou-se o meio de dois em dois dias. 38 ΡΕ2097079

Ensaios com células PC-12

Diferenciaram-se culturas confluentes de células PC-12 cultivando-as durante 7 dias em meio PC-12 sem soro mas contendo 50 ng/mL de NGF (meios PC-12 NGF). Separaram-se as células, lavaram-se, contaram-se e plaquearam-se 1 x 105 células PC-12 células/poço de um dia para o outro numa microplaca de titulação em meio PC-12 NGF isento de glucose. Mudou-se então o meio para meio PC-12 NGF contendo os compostos a testar e deixaram-se as placas em condições normóxicas durante 30 minutos.

Durante este estádio, colocaram-se os meios e as substâncias em teste para a exposição anóxica numa câmara e desoxigenou-se com 95% de N2/5 % de C02. Mudaram-se os meios nas placas para os meios desoxigenados e depois colocaram-se as placas numa câmara anaeróbica que se havia passado por 95% de N2/5 % de C02 durante 10 minutos antes de se selar, e incubou-se a 37°C de um dia para o outro (18 horas). Para os controlos normóxicos, trataram-se as células identicamente com tratamentos isquémicos, excepto que todas as incubações foram feitas em 5% de C02/95 % de ar.

Determinou-se a viabilidade utilizando exclusão com Azul de Tripano.

Resultados

As células PC-12 eram relativamente resistentes à 39 ΡΕ2097079 hipóxia. Por causa disto, utilizámos um protocolo de privação mais severa combinada de oxigénio e glucose (isquémia) para iniciar a toxicidade (Figura 1). A 7β-0Η-EPIA era citoprotectora de uma forma dependente da dose neste teste, observando-se uma neuroprotecção significativa a 1 μΜ (26 % de diminuição da morte celular) e a 10 μΜ (53 % de diminuição da morte celular). A Figura 1 apresenta dados combinados de 4 experiências demonstrando este efeito. A Figura 1 mostra a percentagem média da morte celular dos dados combinados para as 4 experiências separadas. Os dados estão expressos sob a forma de média ± erro padrão da média. Observou-se uma morte celular de 76 % ± 2,2 % após a isquémia por si só. Observou-se uma diminuição estatisticamente significativa da morte celular com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 1 μΜ (2 6 % de diminuição da morte celular, p<0,001), com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10 μΜ (53 % de diminuição da morte celular, p<0,001), ***=p<0,001 em relação á isquémia por si só. O antagonista MK-801 do receptor de NMDA também diminuia a toxicidade induzida pela isquémia nas células PC-12 (Figura 2). O inibidor de ciclo-oxigenase, indometacina, apresentava um efeito protector moderado a 100 μΜ (29 % de diminuição da morte celular), mas não à menor concentração (Figura 2). A Figura 2 mostra a percentagem média de morte celular. Os dados estão expressos sob a forma de média ± erro padrão da média. Observou-se uma morte celular de 79 % ± 5,3 % com a isquémia por si só. Observou-se um decréscimo estatis- 40 ΡΕ2097079 ticamente significativo da morte celular com Indometacina 100 μΜ (IM) (29 % de diminuição da morte celular, p<0,05), com MK801 10 μΜ (62 % de diminuição da morte celular, p<0,001), **= p<0,01, ***=p<0,001 em relação á isquémia por si só. O efeito neuroprotector da 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ era completamente antagonizado por indometacina 10-100 μΜ (IM) (Figura 3) sendo a toxicidade nestas culturas indistinguível da observada nas culturas expostas apenas a isquémia. A Figura 3 mostra a percentagem média de morte celular. Os dados são expressos sob a forma de média ± erro padrão da média. Observou-se com isquémia apenas uma morte celular de 76 % ± 4,2 %. Uma diminuição estatisticamente significativa da morte celular foi observada com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10 μΜ (50 % de diminuição da morte celular, p<0,001), com MK801 10 μΜ (42 % de diminuição da morte celular, p<0,001), ***=p<0,001 em relação à isquémia por si só.

Tal como se pode ver na Figura 4, a indometacina 10 μΜ antagonizava por completo o efeito protector de 7β-OH-EPIA, tanto 1 μΜ como 10μΜ. A Figura 4 mostra a percentagem média de morte celular. Os dados estão expressos sob a forma de média ± erro padrão da média. Observou-se uma morte celular de 76 % ± 4,8 % em consequência da isquémia por si só. Observou-se um decréscimo da morte celular estatisticamente significativo com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 1 μΜ (25 % de diminuição da morte celular, p<0,05), 7 β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10 μΜ (50 % de diminuição da morte 41 ΡΕ2097079 celular, p<0,001), * = p<0,05, ***=p<0,001 em relação à isquémia por si só.

Conclusões A morte de células PC-12 induzida por isquémia era consistentemente diminuída por 7β-0Η-ΕΡΙΑ. A indo-metacina, que bloqueia a síntese das prostaglandinas, não influenciava directamente a morte das células PC-12 a concentrações de até 10 μΜ. No entanto, quando se aumentava a concentração mais até 100 μΜ, observava-se um efeito neuroprotector moderado. A indometacina (10 μΜ) não tinha nenhum efeito directo sobre a morte celular induzida por isquémia, mas atenuava significativamente o efeito neuroprotector da 7β-OH-EPIA, suportando a hipótese de que a síntese das prostaglandinas é indispensável para o efeito neuroprotector da 7 β-ΟΗ-ΕΡΙΑ. EXEMPLO 2 O efeito da 73-hidroxi-EPI-Androsterona sobre a produção das Prostaglandinas D2, E2 e 15-desoxi-A12,14-J2 por células mononucleares humanas O objectivo deste Exemplo era averiguar se a 7β-OH-EPIA conseguia induzir a biossíntese de metabolitos 42 ΡΕ2097079 específicos do ácido araquidónico em células monocíticas humanas, nomeadamente, a prostaglandina D2 (PGD2) , a prostaglandina E2 (PGE2) e a 15-desoxi-A12,14-prostaglandina J2 (15d-PGJ2) .

Expuseram-se células monocíticas do sangue a uma gama de concentrações de 7β-0Η-ΕΡΙΑ, quer na ausência, quer na presença de Factor de Necrose Tumoral α (TNF-α), um estímulo pró-inflamatório, e mediram-se as quantidades de PGD2, de PGE2 e de 15d-PGJ2 produzidas por imunoensaios enzimáticos (EIA). A 7β-0Η-ΕΡΙΑ (entre 0,1 nM e 1.000 nM) induzia um aumento dependente da concentração, da produção de PGD2 a partir de células mononucleares de sangue periférico humano normal. O TNF-α incrementava a produção de PGD2 em comparação com o controlo, e este efeito era mais importante à maior concentração em 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ. A 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ (1 nM-1-000 nM) não aparentava qualquer efeito significativo sobre a biossíntese de PGE2 em células mononucleares de sangue periférico humano normal, mas suprimia por completo os aumentos da produção de PGE2 induzidos por TNF-a. Verificou-se que a 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ (0,1 nM-1.000 nM) incrementava a produção de 15d-PGJ2 em células mononucleares de sangue periférico humano normal, cerca de 9 a 12 vezes na ausência de TNF-α e cerca de 2 a 2,5 vezes na presença de TNF-α, em comparação com os controlos respectivos. 43 ΡΕ2097079

Metodologia Células Mononucleares de Sangue Periférico

Prepararam-se células mononucleares (monócitos e linfócitos) submetendo 48 mL de sangue humano inteiro a uma centrifugação por densidades Ficoll/hypaque. Colocaram-se camadas de sangue sobre a ficoll (densidade = 1,077 g/mL) e centrifugou-se a 400 g durante cerca de 1 hora (22°C), e em seguida removeram-se as células da interface com uma pipeta e transferiram-se para novos tubos. Encheram-se os tubos com meio de cultura RPMI 1640 (2 volumes) misturaram-se bem e depois centrifugou-se a 400 g durante 5 minutos (22°C). Descartou-se o sobrenadante e voltou a suspender-se a pastilha de células em meio de cultura RPMI 1640 e depois ajustou-se o volume para se obter o número apropriado de células por incubação, tal como indicado na secção dos resultados adiante. Incubaram-se as células em tubos plásticos estéreis com 1,5 mL, a um volume final de 1 mL de meio RPMI 1640, durante 18 horas a 37°C, sob 5 % de CO2 em ar e 100 % de humidade. Adicionou-se então 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ e incubaram-se as células durante mais uma hora a 37°C antes de se adicionar Factor de Necrose Tumoral α (TNF-cx) continuando as incubações durante mais 3 horas. Preparou-se a 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ em sulfóxido de dimetilo (DMSO), e prepararam-se todos os outros agentes em meio RPMI 1640. Os controlos indispensáveis continham quer meio, quer a mesma concentração em DMSO, que era sempre < 0,1 % em volume.

Terminaram-se as incubações centrifugando os tubos a 11.000 44 ΡΕ2097079

g durante 30 segundos a 22°C e transferindo os sobrenadantes para novos tubos de 1,5 mL. Em seguida, ou se processaram de imediato as amostras para se estimar PGD2 tal como se descreve adiante, ou se armazenaram a -20°C antes de se determinarem PGE2 ou 15d-PGJ2.

Imunoensaios Enzimáticos de Prostaglandinas (EIA)

Determinou-se a produção de prostaglandinas por células monocíticas humanas em reacção a 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ, quer na presença, quer na ausência de estimulação com TNF-a, medindo os teores extracelulares de eicosanóides utilizando estojos de EIA comercialmente disponíveis. EIA de PGD2 Não se pode determinar directamente a PGD2 a partir dos sobrenadantes das células porque ela é quimicamente instável e degrada-se rapidamente a diversas prostaglandinas da série J incluindo PGJ2, A12-PGJ2, e 15-desoxi-Δ12,14-PGJ2. Para se resolver este problema, tratou-se quimicamente a PGD2 instável de modo a ser obter um derivado estável, neste caso prostaglandina D2-Metoxamina (PGD2-MOX) , que se pode armazenar para uma análise subsequente. Logo após o final das incubações, adicionaram-se amostras de 100 pL de sobrenadante a tubos de 1,5 mL contendo 100 pL de um Reagente de Preparação de Metiloximas (cloridrato de metoxilamina (MOX-HC1) , e acetato de sódio, dissolvidos numa mistura volumétrica a 10:90 de 45 ΡΕ2097079 etanol/água. Colocaram-se então os tubos em banho-maria e deixou-se prosseguir a reacção durante 30 minutos a 60°C. No final deste período, armazenaram-se as amostras a -80°C. Estimaram-se subsequentemente os teores em PGD2 utilizando o estojo de EIA da Cayman Chemical para Prostaglandina D2-MOX (N°. de Cat°. 512011). EIA de PGE2

Estimaram-se os teores extracelulares em PGE2 utilizando um estojo de EIA de Parâmetros da R & D Systems, para PGE2, de acordo com as instruções do fabricante para o protocolo de alta sensibilidade. EIA de 15d-PG2

Estimaram-se os teores extracelulares em 15d-PGJ2 utilizando um estojo de Correlação de EIA da Assay Designs para a Prostaglandina 15-desoxi-A12' 14-prostaglandina J2 (N°. de Cat°. 900-023) e seguindo as instruções do fabricante.

Análise Estatística

Exprimem-se os resultados em média ± desvio padrão para n = 3 incubações. Utilizou-se um teste t de Student desemparelhado para se determinar a probabilidade (P) de que dois conjuntos de dados sejam diferentes entre si. Considerou-se a diferença significativa quando P < 0,05. Levaram-se a cabo cálculos estatísticos num 46 ΡΕ2097079 computador da Apple Macintosh utilizando o conjunto de programas Statview, da Abacus Concepts, Inc.

Resultados

Efeito da 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ sobre a produção de PGD2 por células mononucleares humanas A Figura 5(a) mostra o efeito de se aumentarem as concentrações em 7β-0Η-ΕΡΙΑ (entre 0,1 nM e 1.000 nM) , sobre os teores em PGD2 detectados nos sobrenadantes das células de 1 x 107 células mononucleares de sangue perifé-rico/mL, incubadas durante 4 horas com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ. A 7β-ΟΗ-EPIA parecia induzir um aumento dependente da concentração na produção de PGD2, atingindo um máximo a 100 nM de 7β-ΟΗ-EPIA (102 ± 24 pg/mL de PGD2) que era significativamente maior do que a do controlo (40 ± 13 pg/mL de PGD2; P = 0,01) . A Figura 5 (b) mostra o efeito de se aumentarem as concentrações em 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ (de 0,1 nM a 1.000 nM) sobre os teores em PGD2 detectados nos sobrenadantes das células mononucleares incubadas na presença de TNF-a (0,5 yg/mL). O TNF-a estimulava um aumento de 2,3 vezes da PGD2 em comparação com o controlo em DMSO, veiculo (P < 0,05). A concentrações de entre 0,1 nM e 100 nM, a 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ parecia não ter qualquer efeito sobre a biossintese de PGD2 induzida por TNF-α. À maior concentração em 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ que se utilizou nesta experiência, (1.000 nM) , os teores em 47 ΡΕ2097079 PGD2 aumentaram para 164 ± 31 pg/mL (P = 0,03 em comparação com TNF-oí por si só) .

Efeito da 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ sobre a produção de PGE2 por células mononucleares humanas A Figura 6 (a) mostra o efeito de concentrações crescentes de 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ (de 1 nM a 1.000 nM) sobre os teores em PGE2 detectados nos sobrenadantes celulares de 6 x 105 células mononucleares de sangue periférico/mL, incubadas durante 4 horas com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ. A 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ parecia aumentar os teores em PGE2 em comparação com os controlos de DMSO, no entanto, estes aumentos não representavam diferenças estatisticamente significativas. A Figura 6 (b) mostra o efeito de concentrações crescentes de 7β-0Η-ΕΡΙΑ (de 1 nM a 1.000 nM) sobre os teores em PGE2 detectados nos sobrenadantes de incubações de células mononucleares na presença de TNF-α (a 10 ng/mL). O TNF-a estimulava um aumento significativo de 1,97 vezes de PGE2 em comparação com o controlo em DMSO (P = 0,001) . A concentrações de 1 nM a 100 nM, a 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ suprimia significativamente a biossintese de PGE2 induzida por TNF-oí, de 167 ± 6 pg/mL em reacção a TNF-α por si só, para 75 ± 25 pg/mL, 82 ± 23 pg/mL e 74 1 12 pg/mL, respectivamente, para concentrações de 1 nM, 10 nM e 100 nM em 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ (todos os P < 0,02 em comparação com TNF-α por si só) . À concentração mais elevada de 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ que se utilizou nesta experiência, (1.000 nM) não se observou nenhum efeito sobre a produção de PGE2 induzida por TNF-a. 48 ΡΕ2097079

EfeitO de 7β-ΟΗ-ΕΡΙ4 sobre a produção de 15d-PGJ2 por células mononucleares humanas A Figura 7(a) mostra o efeito de aumentos da concentração em 7β-0Η-ΕΡΙΑ (de 0,1 nM a 1.000 nM) sobre os teores em 15d-PGJ2 detectados nos sobrenadantes de culturas de células mononucleares incubadas durante 4 horas com 7β-OH-EPIA. A 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ aumentava significativamente os teores em 15d-PGJ2, de cerca de 9 a 12 vezes, a todas as concentrações testadas. Os teores aumentaram de 51 ± 6 pg/mL para os controlos em DMSO até, respectivamente, 506 ± 101 pg/mL, 539 ± 51 pg/mL, 520 ± 45 pg/mL, 450 ± 133 pg/mL e 590 ± 84 pg/mL, para concentrações em 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ de 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM e 1.000 nM (todos os P < 0,05 em comparação com os controlos em DMSO). A Figura 7(b) mostra o efeito de se aumentarem as concentrações em 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ (de 0,1 nM a 1.000 nM) sobre os teores em 15d-PGJ2 detectados em sobrenadantes de culturas de células mononucleares incubadas com TNF-α (a 10 ng/mL). à concentração em citoquina que se utilizou nesta experiência, o TNF-α parecia estimular um pequeno aumento da 15d-PGJ2, no entanto, o aumento não era significativamente diferente dos valores para os controlos em DMSO. A todas as concentrações em 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ utilizadas, observava-se um aumento dos teores em 15d-PGJ2 na presença de TNF-α. Os teores em 15d-PGJ2 forma aumentados desde 157 ± 39 pg/mL na presença de TNF-α por si só, para, respectivamente, 348 ± 48 pg/mL, 334 ± 24 pg/mL, 356 ± 85 49 ΡΕ2097079 pg/mL, 406 ± 30 pg/mL e 318 ± 100 pg/mL na presença de TNF-α mais 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM e 1.000 nM (todos os P < 0,05, em comparação com TNF-α por si só). EXEMPLO 3 A 7a-hidroxi-DHEA, a 7β-hidroxi-DHEA e a 7β-hidroxi-EPIA são metabolitos nativos da desidroepiandros-terona (DHEA) e da epiandrosterona (ΕΡΙΑ) . Uma vez que se encontra descrito que numerosos esteróides interferem com os processos inflamatórios e imunológicos, o nosso objectivo era de testar os efeitos destes hidroxiesteróides sobre a produção de PG e a expressão de genes de enzimas relacionados. Cultivaram-se monócitos de sangue periférico humano (PBMC) durante 4 h e durante 24 horas na presença de cada um dos esteróides (1-100 nM) , com e sem adição da citoquina pró-inflamatória TNF-α (a 10 ng/mL). Mediram-se os teores em PGE2, PGD2 e 15-desoxi-A12,14-PGJ2 (15d-PGJ2) no meio de incubação, e avaliou-se o conteúdo em mARN da ciclo-oxigenase (COX-2) e da PGE sintase (m-PGESl) nas células por RT-PCR quantitativa. A adição de TNF-a originava uma produção elevada de PG e maiores teores em mARN de COX-2 e de m-PGESl. De entre os três esteróides testados, só a 73-hidroxi-EPIA diminuía a expressão de COX-2 e de m-PGESl enquanto diminuía marcadamente a produção de PGE2 e aumentava a produção de 15d-PGJ2. Estes resultados indicam que a 7β-1ιίάηοχί-ΕΡΙΑ tem efeitos anti-inflamatórios. 50 ΡΕ2097079 1.1. Preparação e cultura de PBMC humanas

Obteve-se sangue inteiro de doadores, em sacos com suplemento de EDTA, no Etablissement Français du Sang (Brest, França). Isolaram-se então as PBMC do sangue inteiro em condições de esterilidade, nas primeiras 36 horas após a obtenção do sangue. Levou-se a cabo uma centrifugação por gradiente de densidade sobre Ficoll (Eurobio) . Depois de se lavarem com meio RPMI 1640 (Eurobio), suspenderam-se as células em meio RPMI 1640 suplementado com 10 % de soro fetal de vitelo termicamente inactivado (Eurobio), 2 mM em glutamina (D. Dutscher), com 100 U de penicilina/mL (D. Dutscher), e com 100 pg de estreptomicina/mL (D. Dutscher). Seleccionaram-se os monócitos por aderência a plástico durante lhe plaquearam-se cerca de 107 células em placas de cultura de tecidos com 6 poços (3 mL de meio por poço) . Todas as incubações foram levadas a cabo numa incubador humidificada a 37 °C e sob 5 % de CO2. Recuperaram-se as células e dispersaram-se em 2 mL de meio de incubação fresco suplementado quer com 7p-hidroxi-EPIA, com 7p-hidroxi-DHEA, ou com 7a-hidroxi-DHEA (em 20 pL de etanol) na presença ou na ausência de 0,01 pg/mL de TNF-α (Sigma-Aldrich) . As incubações de controlo continham 20 pL de etanol mas não continham nenhum esteróide. Recolheram-se os sobrenadantes passadas 4 h e utilizaram-se incubações de 24 horas para a medição dos seus conteúdos em PG, utilizando-se em seguida as células para isolar o ARN. Obteve-se o ARN total por um método de extracção num só passo utilizando o Reagente

Trizol (Invitrogen, Cergy-Pontoise, França). 51 ΡΕ2097079 1.2. PCR de transcriptase reversa em tempo real

Sintetizaram-se cADN com ARN tratado por TURBO DNase I (Ambion, Huntingdon, Reino Unido) utilizando o estojo Superscript de síntese da primeira cadeia (Invitrogen). As misturas de amplificação por RT-PCR (50 pL) continham uma solução de 2,5x RealMaster Mix/20x SYBR (11,25 pL) (Eppendorf, Le Pecq, França) e 200 nM de iniciadores de sentido directo e reverso. As reacções foram corridas num ciclizador mestre RealPlex ep gradient S (Eppendorf). As condições de ciclização foram 10 minutos a 95°C e 45 ciclos a 95°C, 55°C e 68°C, respectivamente durante 15 segundos, 30 segundos e 30 segundos. Cada ensaio incluía uma curva padrão com quatro pontos de diluição em série de cADN de controlo. Utilizou-se gene HPRT1 de limpeza para quantificação. Todos os oligonucleótidos iniciadores (Tabela 2), foram sintetizados pela Genecust/Distribio (Evry, França). A especificidade do produto amplificado foi monitorizada examinando a curva de fusão do produto e confirmada pela análise de electroforese sobre gel de agarose.

1.3. Medições de PG

Utilizaram-se estojos comercialmente disponíveis de EIA para a determinação dos teores em PGE2 (Oxford Biomedical Research, Reino Unido) e de 15d-PGJ2 (Assay designs, Euromedex, França) nos meios de cultura. A determinação dos teores em PGD2 foi conseguida utilizando o 52 ΡΕ2097079 estojo de EIA de prostaglandinas D2-MOX (Cayman Chemical, Euromedex). Neste caso, e antes da determinação, trataram-se imediatamente as amostras com o reagente M0X-HC1, que transformava a PGD2 em PGD2-MOX, impedindo deste modo qualquer degradação quimica adicional. 1.4. Análise estatística dos dados

Levaram-se a cabo todas as determinações em triplicado e representaram-se os resultados sob a forma de média ± E.P.M. Levou-se a cabo uma análise de variância num sentido e em seguida fez-se o teste de Duncan para gamas múltiplas para se compararem as diferenças entre os diferentes grupos. Consideraram-se estatisticamente significativas as diferenças quando p<0,05.

2.1. Efeitos da 7a-hidroxi-DHEA

Cultivaram-se PBMC humanas com e sem a adição de TNF-α, durante 4 e durante 24 24 horas. Determinaram-se os teores em PGE2, PGD2 e 15d-PGJ2 nos meios de cultura bem como a produção do mARN dos genes respectivos (COX-2, m-PGES1) nas células. Mostram-se os dados obtidos na Tabela 2. A ausência de TNF-α e suplementação com três concentrações diferentes de 7cx-hidroxi-DHEA não provocaram diferenças significativas nos teores em PGE2, PGD2 e 15d-PGJ2 nas culturas nas primeiras 4 horas. Só se observou um aumento moderado de 15d-PGJ2 após 24 h de cultura. Uma incubação com 7a-hidroxi-DHEA aumentava de forma significativa os teores em mARN de m-PGESl ao fim de 24 horas. 53 ΡΕ2097079 A presença de TNF-α originava o aumento esperado dos teores em todas as PG ao fim de 24 h. A incubação com 7a-hidroxi-DHEA durante 4 h não alterava os teores em PG em nenhuma das concentrações testadas. Em contraste, os teores em PGE2 e no conjunto de PGD2-15d-PGJ2 eram significativamente incrementadas após co-incubação com 7a-hidroxi-DHEA e com TNF-α durante 24 h, quando comparadas com a cultura com TNF-α por si só. Além disto, a incubação com TNF-a (isto é, a activação inflamatória) levava a um aumento marcado da produção de mARN de COX-2 e de m-PGESl. Uma co-incubação com 7cx-hidroxi-DHEA não provocava nenhumas alterações consistentes dos teores em mARN, quando comparada com a feita com TNF-α por si só.

2.2. Efeitos de 7β-hidroxi-DHEA

Cultivaram-se PBMC humanas com e sem adição de TNF-α, durante quer 4, quer 24 horas. Determinaram-se os teores em PGE2, PGD2 e 15d-PGJ2 nos meios de cultura e a produção de mARN dos genes relacionados (COX-2, m-PGESl) na célula. Os dados obtidos constam da Tabela 3. A incubação com três concentrações de 7β-hidroxi-DHEA durante 4 horas na ausência de TNF-α não provocou alterações significativas dos teores em PGE2, PGD2 e 15d-PGJ2 no meio de cultura. No entanto, ao teores em PGD2 e em 15d-PGJ2, bem como os dos mARN de m-PGESl, haviam aumentado ao fim das 24 horas de incubação em cultura com 7p-hidroxi-DHEA. 54 ΡΕ2097079 A presença de TNF-α provocava o aumento esperado de todas as PG às 24 h. Uma co-incubação com 7β-1ιίά^χί-DHEA durante 4 horas não alterava mais os teores em PG a nenhuma das concentrações testadas. Em contraste, tanto os teores e PGD2 como em 15d-PGJ2 diminuíam significativamente após co-incubação com 7β-hidroxi-DHEA e TNF-α durante 24 h, quando comparados com TNF-α por si só. Além disto, uma incubação com TNF-α (isto é, uma activação inflamatória) levava a um aumento notável da produção de mARN de COX-2 e de m-PGESl. Uma co-incubação com 7β-hidroxi-DHEA não originou quaisquer alterações consistentes nos teores em mARN, em comparação com os observados com TNF-α por si só. 2.3. Efeitos da 7β-hidroxi-ΕΡΙΑ

Cultivaram-se PBMC humanas com e sem adição de TNF-α durante 4 ou 24 horas. Mediram-se os teores em PGE2, PGD2 e 15d-PGJ2 nos meios de cultura e a produção de mARN para os genes relacionados (COX-2, m-PGESl) na célula. Listam-se os resultados obtidos na Tabela 4. A incubação com três concentrações de 7β-ΜάΓθχϊ-ΕΡΙΑ durante 4 horas na ausência de TNF-α não originou alterações significativas dos teores em PGE2, PGD2 e 15d-PGJ2 no meio de cultura. No entanto, observaram-se aumentos notáveis de PGD2 e de 15d-PGJ2 quando as culturas de células foram incubadas com 7β-hidroxi-EPIA durante 24 h. A expressão do COX-2 não se alterou notavelmente em função do esteróide nem às 4 nem às 24 horas, mas os teores nos mARN de m-PGESl denotaram diminuição e aumento significativos, respectivamente às 4 e às 24 horas. 55 ΡΕ2097079 A presença de TNF-α provocava o aumento esperado de todas as PG às 24 h. Uma co-incubação com 7β-1ιίά^χί-EPIA durante 4 horas não alterava mais os teores em PG a nenhuma das concentrações testadas. Em contraste, às 24 h, as duas doses inferiores de 7β-hidroxi-EPIA diminuíram o teor em PGD2 e aumentaram o teor em 15d-PGJ2, em comparação com o TNF-α por si só. Uma incubação com TNF-α (isto é, uma activação inflamatória) também levava a um aumento marcado dos mARN de COX-2 e de m-PGESl. Os aumentos da produção de mARN de COX-2 e de m-PGESl pelo TNF-α eram menores quando as culturas celulares foram incubadas com 7β-1ιίάηοχί-ΕΡΙΑ 10 nM e 100 nM durante 24 horas.

Em conjunto, estes resultados indicam claramente que a 7β-1ιίόηοχί-ΕΡΙΆ tem, de forma surpreendente, efeitos anti-inflamatórios.

Tabela 2: Efeito das três doses de 7cx-hidroxi-DHEA sobre os teores em PG e a expressão dos genes em PBMC humanas cultivadas com e sem TNF-α. * produção de mARN em relação à dos controlos; a incrementada significativamente acima das dos controlos (p<0,05); b diminuída significativamente abaixo das dos controlos (p<0,05); 0 incrementada significativamente acima das observadas para TNF-α por si só (p<0,05); diminuída significativamente abaixo das observadas para TNF-α por si só (p<0,05). 56 ΡΕ2097079

Ensaio Controlo 7 α-hidroxi-DHEA 7 α-hidroxi-DHEA 7a-hidroxi-DHEA (1 nM) (10 nM) (100 nM) Duração da cultura 4 h 24 h 4 h 24 h 4 h 24 h 4 h 24 h PGE2 (ng/mL) 0,24 ± 0,21 ± 0,22 ± 0,23 ± 0,22 ± 0,30 ± 0,22 ± 0,25 ± 0,012 0,015 0,006 0,003 0,006 0,006 0,005 0,012 PGD2 (ng/mL) 0,15 ± 0,16 0,17 ± 0,13 0,18 ± 0,17 ± 0,17 ± 0,13 ± 0,008 ±0,019 0,004 ±0,001 0,002 0,003 0,003 0,002 15d-PGJ2 0,38 ± 0,40 ± 0,46 ± 0,51 0,42 ± 0,59 ± 0,41 ± 0,58 ± (ng/mL) 0,015 0,048 0,004 0,013a 0,010 0, 003a 0,004 0, 024a COX-2 1,00 ± 1,00 ± 0,56 ± 0,82 ± 0,94 ± 1,66 ± 1,10 ± 1,05 ± (mARN*) 0,006 0,003 0,072b 0,27b 0,048 0,408a 0,108 0,214 mPGESl 1,00 ± 1,00 ± 0,76 ± 1,77 ± 0,94 ± 3,61 ± 0,71 ± 2,63 ± (mARN*) 0,030 0,019 0,053 0,324a 0,067 0,662a 0,058 0,4758 Ensaio TNF-a 7a-hidroxi-DHEA 7 α-hidroxi-DHEA 7a-hidroxi-DHEA (10 ng/mL) (1 nM) + TNF-a (10 ng/mL) (10 nM) t TNF-a (10 ng/mL) (100 nM) ± TNF-a (10 ng/mL) Duração da cultura 4 h 24 h 4 h 24 h 4 h 24 h 4 h 24 h PGE2 (ng/mL) 0,43 ± 1,26 ± 0,43 ± 1,53 ± 0,45 ± 1,75 ± 0,39 ± 1,40 ± 0,018a 0,161a 0,003 0, 048c 0,012 0,052c 0,009 0,037c PGD2 (ng/mL) 0,20 ± 0,63 ± 0,20 ± 0,17 ± 0,17 ± 0,18 ± 0,18 ± 0,18 ± 0,006 0, 029a 0,003 0,01d 0,006 0, 008d 0,001 0,004d 15d-PGJ2 0,40 ± 1,10 ± 0,37 ± 0,63 ± 0,40 ± 0,71 ± 0,41 ± 0,51 ± (ng/mL) 0,013 0,082a 0,020 0,007d 0,004 0,012d 0,021 0,012d COX-2 4,49 ± 1,70 ± 4,72 ± 3,02 ± 3,70 ± 2,04 ± 3,30 ± 3,13 ± (mARN*) 1,178a 0,347a 1,229a 0,594a 1,246a 0,631a 0,655a 1,218a mPGESl 1,57 ± 16,1 ± 0,87 ± 21,5 ± 0,76 ± 24,9 ± 0,62 ± 25,4 ± (mARN*) 0,148a 3,82a 0,187 6,66a 0,118 10,30a 0,066 6,96a

Tabela 3: Efeito das três doses de 7a-hidroxi-DHEA sobre os teores em PG e a expressão dos genes em PBMC humanas cultivadas com e sem TNF-oí. * produção de mARN em relação à dos controlos; a incrementada significativamente acima das dos controlos (p<0,05); b diminuída significativamente abaixo das dos con- 57 ΡΕ2097079 trolos (p<0,05); c incrementada significativamente acima das observadas para TNF-α por si só (p<0,05); diminuida significativamente abaixo das observadas para TNF-α por si só (p<0,05).

Ensaio Controlo 7 β-hidroxi-DHEA 7β-hidroxi-DHEA 7β-ΜάΓοχί-ϋΗΕΑ d nM) (10 nM) (100 nM) Duração da cultura 4 h 24 h 4 h 24 h 4 h 24 h 4 h 24 h pge2 0,24 ± 0,21 ± 0,22 ± 0,22 ± 0,22 ± 0,24 ± 0,22 ± 0,24 ± (ng/mL) 0,012 0,015 0,003 0,003 0,013 0,002 0,002 0,004 pgd2 0,15 ± 0,16 ± 0,18 ± 0,21 ± 0,14 ± 0,24 ± 0,19 ± 0,34 ± (ng/mL) 0,008 0,019 0,002 0,009° 0,001 0,001a 0,008 0,025a 15d-PGJ2 0,38 ± 0,40 ± 0,45 ± 0,66 ±: 0,40 ± 0,62 ± 0,42 ± 0,56 ± (ng/mL) 0,015 0,048 0,016 0,013a 0,014 0, 008a 0,030 0, 020a COX-2 1,00 ± 1,00 ± 1,20 ± 1,76 ± 1,33 ± 1,54 ± 5,09 2,78 ± (mARN*) 0,006 0,003 0,179 0,672 0,039 0,630 ±1,166a 0,580a mPGESl 1,00 ± 1,00 ± 0,43 ± 1,94 ± 0,67 ± 1,64 ± 0,82 ± 1,64 ± (mARN*) 0,030 0,019 0, 057b 0,422a 0, 071b 0,338a 0, 085b 0,322a Ensaio TNF-a 7β-hidroxi-DHEA 7β-hidroxi-DHEA 7β-1ιίάΓθχί-ΟΗΕΑ (10 ng/mL) (1 nM) + TNF-a 10 ng/mL) (10 nM) + TNF-a 10 ng/mL) (100 nM) + TNF-a 10 ng/mL) . Duração da cultura 4 h 24 h 4 h 24 h 4 h 24 h 4 h 24 h PGE2 0,43 + 1,26 ± 0,34 ± 1,19 ± 0,35 ± 1,2 ± 0,30 ± 1,18 ± (ng/mL) 0,018a 0,161a 0,030 0,003b 0,002 0,08b 0,006 0,010b pgd2 0,20 ± 0,63 ± 0,16 ± 0,47 ± 0,21 ± 0,42 ± 0,16 ± 0,40 ± (ng/mL) 0,006 0, 029a 0,006 0,011c 0,007 0, 006c 0,012 0, 041c 15d-PGJ2 0,40 ± 1,10 ± 0,44 ± 0,62 ± 0,43 ± 0,54 ± 0,39 ± 0,54 ± (ng/mL) 0,013 0, 082a 0,016 0,032c 0,003 0, 022c 0,042 0, 029C COX-2 4,49 ± 1,70 ± 4,81 ± 1,65 ± 2,67 ± 2,52 3,23 ± 3,07 ± (mARN*) 1,178a 0,347a 1,280a 0,331 0,229a ±0,580 0,242 1,117 mPGESl 1,57 ± 16,1 ± 0,60 ± 29,2 ± 1,01 ± 16,3 ± 0,78 ± 14,0 ± (mARN*) 0,148a 3,82a 0, 050d 5,19a 0,098d 3,80a 0, 055d 4,91a

Tabela 4: Efeito das três doses de 7a-hidroxi-DHEA sobre os teores em PG e a expressão dos genes em PBMC humanas cultivadas com e sem TNF-α. * produção de mARN em relação à 58 ΡΕ2097079 dos controlos; a incrementada significativamente acima das dos controlos (p<0,05); b diminuída significativamente abaixo das dos controlos (p<0,05); c incrementada significativamente acima das observadas para TNF-α por si só (p<0,05); diminuída significativamente abaixo das observadas para TNF-α por si só (p<0,05).

Ensaio Controlo 7p-hidroxi-EpiA 7β-hidroxi-EpiA 7 β-hidroxi-EpiA d nM) (10 nM) (100 nM) Duração da cultura 4 h 24 h 4 h 24 h 4h 24 h 4 h 24 h PGE2 0,24 ± 0,21 ± 0,26 ± 0,26 ± 0,23 ± 0,23 ± 0,22 ± 0,24 ± (ng/mL) 0,012 0,015 0,011 0,015 0,022 0,021 0,020 0,022 PGD2 0,15 ± 0,16 ± 0,18 ± 0,21 ± 0,19 ± 0,23 ± 0,20 ± 0,24 ± (ng/mL) 0,008 0,019 0,005 0,012a 0,020 0,001a 0,013 0,031a 15d-PGJ2 0,38 ± 0,40 ± 0,39 ± 0,85 ± 039 ± 0,91 ± 0,37 ± 1,70 ± (ng/mL) 0,015 0,048 0,080 0,014a 0,010 0, 032a 0,018 0,016a COX-2 1,00 ± 1,00 ± 0,56 ± 0,82 ± 0,94 ± 1,66 ± 1,10 ± 1,05 ± (mARN*) 0,006 0,003 0, 072b 0,27b 0,048 0,408 0,108 0,214 m-PGESl 1,00 ± 1,00 ± 0,76 ± 1,77 ± 0,94 ± 3,61 ± 0,71 ± 2,63 ± (mARN*) 0,030 0,131 0, 053b 0,324a 0,067 0, 662a 0, 058b 0,475a Ensaio TNF-a 7p-hidroxi-EpiA 7 β-hidroxi-EpiA 7 β-hidroxi-EpiA (10 ng/mL) (1 nM) + TNF-a (10 ng/mL) (10 nM) + TNF-a (10 ng/mL) (100 nM) + TNF-a (10 ng/mL) Duração da cultura 4 h 24 4 h 24 h 4 h 24 h 4 h 24 h PGE2 0,43 ± 1,26 ± 0,50 ± 0,70 ± 0,49 ± 0,80 ± 0,42 ± 0,71 ± (ng/mL) 0,018a 0,161a 0,012 0,001b 0,021 0, 012b 0,020 0,012b PGD2 0,20 ± 0,63 ± 0,22 ± 0,47 ± 0,22 ± 0,42 ± 0,23 ± 0,40 ± (ng/mL) 0,006 0,029a 0,082 0, 013d 0,010 0, 009d 0,007 0,030d 15d-PGJ2 0,40 ± 1,10 ± 0,37 ± 2,18 ± 0,40 ± 2,77 ± 0,37 ± 0,85 ± (ng/mL) 0,013 0,082a 0,029 0,183c 0,007 0, 021c 0,016 0,019 COX-2 4,49 ± 1,70 ± 7,39 ± 2,74 ± 2,75 ± 0,94 ± 5,76 ± 0,67 ± (mARN*) 1,178a 0,347a 0,282c 0,555c 0,147d 0,194d 0,660 0,132c m-PGESl 1,57 ± 16,1 ± 1,11 ± 21,6 ± 1,15 ± 6,29 ± 1,29 ± 6,19 ± (mARN*) 0,148a 3,82a 0,235 4,28 0,183 1,131d 0,323 2,898c 59 ΡΕ2097079 EXEMPLO 4 (de referência)

Efeito de 73-OH-EPIA sobre um modelo experimental de colite A administração de sulfato de sódio dextrano (DDS) a ratos, na água de beber, durante 6 dias consecutivos, provoca uma inflamação do cólon (colite) caracteri-zada pela diminuição do comprimento do cólon, por um aumento da actividade MPO, uma diminuição da mucosidade nas células caliciformes, e um aumento da expressão da COX-2 e da mPGES-1 sintase e da produção de prostaglandina E2 (PGE2) . A administração de DSS também aumenta os marcadores de tensão oxidativa, tais como proteina carbonilo (Prot CO) e Tbars, no intestino. Proporcionamos agora dados mostrando que o tratamento com 7β-hidroxi-EPIA uma vez ao dia durante 7 dias antes da administração de DSS consegue evitar o desenvolvimento da colite induzida por DSS. A administração de 0,01 mg/kg de 7β-hidroxi-EPIA evita por completo as lesões da colite e a inflamação dos tecidos, e este efeito da 7β-hidroxi-EPIA foi associado a uma diminuição marcada dos marcadores de tensão oxidativa e da produção de PGE2, associada a um aumento temporário durante o período inicial, da expressão de COX-2, bem como um aumento sustentável da produção da prostaglandina anti-inflamatória 15d-PGJ2. Estes resultados mostram que a 7β-hidroxi-EPIA apresenta efeitos anti-inflamatórios marcados a teores de dose pequenos no modelo experimental aceite de Doença Inflamatória dos Intestinos (IBD). 60 ΡΕ2097079

Procedimentos Experimentais

Animais

Todos os protocolos e procedimentos experimentais estavam de acordo com a directiva 86/609/CEE da Comunidade Europeia, para a utilização de animais de laboratório. Alimentaram-se ratos Wistar machos (180-200 g) , adquiridos à Charles River (L'Arbresle, França) com ração laboratorial para roedores e com água ad libitum.

Tratamento com drogas e incubação da colite

Depois de um periodo de adaptação de 7-dias, repartiram-se os animais por dois grupos de controlo (controlo de tratamento fingido e controlo tratado com 7β-hidroxi-EPIA, e dois grupos com colite (colite e colite tratada com 7p-hidroxi-EPIA). Dissolveu-se a 7p-hidroxi-EPIA (a 0,01, 0,1, e 1 mg/kg de massa corporal, em DMSO) ou administrou-se DMSO por si só (veiculo) por via i.p., foram administrados uma vez ao dia durante 7 dias, do dia 0 ao dia 7. Induziu-se a colite do dia 7 ao 14 por adição de DSS (massa molecular 36-50 kDa; MP Biomedicals, França) à água de beber. Os dois grupos de controlo bebiam apenas água.

Avaliação macroscópica de lesões no cólon

Nos dias 9, 11, 13, 14, registaram-se a massa 61 ΡΕ2097079 corporal, o comprimento do cólon, a consistência das fezes, e avaliou-se a hemorragia rectal fresca por inspecção visual. A severidade das lesões no cólon foi classificada cegamente tal co o descrito por Mabley et al., 2001, Inflamm. Res.; 50: 561-569) (0: pastilhas bem formadas e ausência de lesões no cólon; 1: cólon com uma pequena quantidade de sangue presente misturado com as fezes; 2: cólon com uma grande quantidade de sangue presente com as fezes; 3: cólon cheio de sangue e ausência de fezes).

Exame histológico

Fixou-se uma porção do cólon proximal (1 cm) em formaldeido a 4 % (Labonord, Templemars, França) e imergiu-se em parafina. Prepararam-se secções de tecido (5 μιη) , em seguida limparam-se, hidrataram-se e contrastaram.se quer com hematoxilina/eosina, quer com azul Alciano seguindo protocolos padrão, respectivamente para a avaliação histológica de lesões no cólon e para conteúdo em mucosidade nas células caliciformes.

Preparação de homogenados de tecido

Abriu-se o cólon ao longo da sua linha mesenté-rica, e rasparam-se células epiteliais usando a extremidade romba de uma lamela de vidro, depois pesou-se, lavou-se e centrifugou-se. Homogeneizou-se a pastilha com 9 volumes de tampão TKE (10 mM em Tris-HCl; 150 mM em KC1; 1 mM em EDTA; 0,25 mM em PMSF, pH 7,4) e em seguida congelou-se a -80°C 62 ΡΕ2097079 té ser utilizada. Determinou-se o conteúdo proteico nos homogenados de acordo com Lowry et ai. (J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-74).

Actividade de MPO

Avaliou-se a actividade de MPO nos homogenados recorrendo ao método da o-dianisidina de Krawisz et al. (Gastroenterology 1984; 87(6): 1344-50) com as modificações introduzidas por Pelissier et al. (Steroids 2006; 71(3): 240-8) . Exprimiu-se a actividade de MPO como a quantidade do enzima necessária par produzir uma alteração por minuto da absorvância a 460 nm, utilizando o coeficiente de extensão para a o-dianisidina oxidada (1.13><104 mol"1. cm’1) .

Determinação bioquímica da tensão oxidativa

A peroxidação de lipidos (Tbars) foi avaliada por uma modificação consoante Albrecht et al., (1992, Toxicol. Lett; 63: 91-96) do método descrito por Ohkawa et al. (Anal. Biochem. 1979; 95: 315-58). A absorvância do produto de adição vermelho a 1:2 do ácido malondialdeídotio-barbitúrico (Sigma-Aldrich, St Quentin-Fallavier, França) foi medida a 532 nm (o coeficiente de extinção utilizado foi 0,156 ymol_1cm_1) . Os conteúdos em carbonilo nas proteínas oxidadas (Prot CO) foram avaliados pelo método de Levine et al. (Methods Enzymol. 1990; 186: 464-78). O conteúdo em grupos sulfidrilo não proteicos (sobretudo GSH) foi tomado como sendo o marcador de defesa antioxidante nos 63 ΡΕ2097079 homogenados, e foi determinado pelo método de Sedlak e Lindsay (Anal. Biochem. 1968; 25(1): 192-205).

Imunoensaios de prostaglandinas

Utilizaram-se estojos comercialmente disponíveis de EIA para a determinação dos teores em PGE2 (Oxford Biomedical Research, Reino Unido) e em 15d-PGJ2 (Assay

Designs, Euromedex, França) no sobrenadantes do cólon obtidos dos homogenados em fresco. Obteve-se a determinação dos teores em PGD2 utilizando o estojo de EIA para prostaglandina D2-MOX (Cayman Chemical, Euromedex). Neste caso, e antes do ensaio, as amostras frescas foram imediatamente tratadas com o reagente MOX-HC1 que transforma a PGD2 em PGD2-MOX, evitando assim qualquer degradação química adicional. PCR de transcriptase reversa em Tempo Real

Extraiu-se a totalidade do ARN de amostras frescas de cólon (300 mg) utilizando o Reagente Trizol (Invitrogen, Cergy-Pontoise, França). Purificou-se o poli(A) ARN do ARN total usando um estojo Micro-

Poly(A)Purist (Ambion, Huntingdon, Reino Unido). Sinte tizou-se cADN utilizando estojo do sistema sintético Superscript para a cadeia de sentido directo (Invitrogen). Levou-se a cabo PCR em tempo real utilizando misturas (25 pL) contendo solução 2.5x RealMaster Mix/20x SYBR (11,25 pL) (Eppendorf, Le Pecq, França) e iniciadores de sentido directo e de sentido reverso 300 nM. Levaram-se a cabo as 64 ΡΕ2097079 reacções num ciclizador mestre RealPlex ep gradient S (Eppendorf). As condições dos ciclos foram a 95°C durante 10 minutos e 40 ciclos, a 95°C, 55°C e 68°C e respectivamente durante 15 segundos, 30 segundos e 30 segundos, cada ensaio incluia uma curva padrão para quatro pontos de uma diluição em série de cADN de controlo. Sintetizaram-se os iniciadores oligonucleotidicos na Genecust/Distribio (Evry, França). A especificidade do produto amplificado foi monitorizada pelo exame da curva de fusão do produto e confirmada por uma análise por electroforese sobre gel de agarose. Exprimiram-se os teores em mARN em relação aos do controlo em DMSO, depois de uma normalização em relação a HPRT1.

Análise estatística

Todos os ensaios forma levados a cabo em triplicado para cada animal e os resultados estão representados sob a forma de média ± E.P.M. Levou-se a cabo uma análise de variância num sentido utilizando os testes de gamas múltiplas de Duncan para comparar as diferenças entre grupos. Consideraram-se estatisticamente significativas as diferenças para as quais p<0,05.

RESULTADOS

Estudo do decurso temporal da indução da colite

Por tratamento de ratos com 5 % de DSS na água de 65 ΡΕ2097079 beber durante 7 dias (entre D7 e D14) resultaram sinais clinicos e histológicos de colite sem mortalidade. Tipicamente, todos os ratos exibiam diarreia severa 5 dias após a indução da colite (dia 12) e no dia seguinte ocorria hemorragia rectal. Registou-se uma diminuição de massa corporal, de massa de tecido adiposo do epididimo e da massa do figado no dia 11 em todos os ratos tratados com DSS, em comparação com os controlos tratados sem DSS ( respectivamente -5 %, -17 %, -8 %; p<0,05). estes decréscimos também foram observados no dia 14 (Tabela 5). Não se observou qualquer alteração da massa do baço. Em comparação com o grupo de controlo falsamente tratado, os ratos tratados com DSS também demonstravam um encurtamento significativo do cólon a partir do dia 11 (-14 %, p<0,05) ao dia 14 (-26 %; p<0,05), veja-se a Tabela 5, associado a tecido colónico mais espesso, e a perda de fezes. A actividade de MPO na mucosa do cólon foi determinada a titulo de indice de infiltração de neutrófilos. No dia 13 e no dia 14, observaram-se aumentos de respectivamente 9 vezes e 7 vezes da actividade mucosal de MPO no grupo com colite, em comparação com o grupo de controlos falsamente tratados (p<0,05) (Fig. 8A). Não se observou qualquer modificação da actividade de MPO antes do dia 13. Estes resultados são consistentes com uma análise histológica. De facto, as principais características da inflamação do cólon, nomeadamente a distorção críptica, a infiltração de neutrófilos no tecido da mucosa e as perdas das células caliciformes que continham menos mucinas como era aparente no grupo com colite no dia 13, e que eram mais pronunciadas 66 ΡΕ2097079 no dia 14, em comparação com o grupo de controlo falsamente tratado (dados não apresentados).

Tal como se ilustra na Fig. 8, os dois marcadores de tensão oxidativa, nomeadamente Prot CO e Tbars, bem como o parâmetro de defesa antioxidante, teores em GSH, aumentavam significativamente acima dos valores para os grupos de controlo nos dias 13 e 14, na mucosa do cólon dos animais com colite.

Efeito protector da 7|5-hidroxi-EPIA em relação à colite

As duas pequenas doses de 7p-hidroxi-EPIA (0,01, 0,1 mg/kg) evitavam as lesões induzidas por DSS no cólon, tal como indicado pela supressão da diarreia e da hemorragia rectal no dia 14. Uma injecção intraperitoneal de 0,01 mg/kg de 7β-hidroxi-EPIA uma vez ao dia durante 7 dias antes da administração da DSS restaurava a massa corporal aos valores observados nos controlos sem alterar a massa do epididimo (Tabela 5) . Entre os dias 9 e 14, a diminuição do comprimento do cólon era menos era menos pronunciada nos grupos tratados com as duas doses mais pequenas de esteróide (0,01, 0,1 mg/kg), do que para o grupo com colite (dados não apresentados para o dia 9, Tabela 5) . A 7β-Ηύάηοχύ-ΕΡΙΑ evitava parte da perda de mucosidades nas células caliciformes no dia 14 e as alterações histológicas tais como a anormalidade das criptas e a infiltração dos neutrófilos (dados não 67 ΡΕ2097079 apresentados) e diminuía significativamente a actividade de MPO a todos os teores de dose, 0,01, 0.1 e 1 mg/kg (Fig. 8A) . Os parâmetros de tensão oxidativa (Prot CO, Tbars) e os teores em GSH eram semelhantes nos dias 9 (não apresentados) e 11 para todos os grupos, nomeadamente os controlos falsamente tratados, os de colite e os tratados com 7β-1^ηοχϊ-ΕΡΙΑ (a 0,01, 0,1 e 1 mg/kg) (Fig. 8B, C e D) . Todos os marcadores de tensão oxidativa e de defesa antioxidante permaneceram sem alterações nos animais que haviam sido tratados com 7β-hidroxi-EPIA (entre os Dia 0 e Dia 7) enquanto estes parâmetros aumentavam significativamente no grupo com colite (p<0,05). Estes resultados mostram que a 7β-hidroxi-EPIA tem efeitos anti-inflamatórios notáveis a teores de dose muito pequenos, neste modelo experimental da Doença inflamatória dos intestinos (IBD).

Tabela 5: Massa finais dos corpos e de órgãos, comprimento do cólon, avaliação macroscópica e classificação das lesões no cólon em ratos com colite induzida por DSS (administrou-se-lhes DSS (a 5 %) em água da torneira (Dia 7 a Dia 14). Os dados foram obtidos no final da experiência (dia 14) e estão expressos como média ± DPM. Os valores que não partilham a mesma letra como índice (a-c), numa mesma linha, são significativamente diferentes (p<0,05). Fez-se a classificação das lesões no cólon de acordo com Mabley et al. (2001, Inflamm. Res., 50, 561-569) (0: pastilhas bem formadas e ausência de lesões no cólon; 1: cólon com uma pequena quantidade de sangue 68 ΡΕ2097079 presente com as fezes; 2: cólon com uma grande quantidade de sangue presente com as fezes; 3: cólon cheio de sangue e ausência de fezes). * mg/kg de massa corporal.

Grupo Controlo Colite Grupos previamente tratados com 7 β-Hidroxi-ΕΡΙΑ e colite 0 0 0,01* 0,1* 1* Número de ratos (n) 15 23 3 12 12 Massa corporal (g) 304,6±6a 279,6+6,5b 297,5+9,5a 272, l±6b 267,3+7,7b Massa do epidídimo (g) 2,5±0,08a 2,1+0, lb 2,5+0, 03a 1,9+0,14b 1, 9+0, lb Massa do Fígado (g) 12,7+0,4a 11,1+0,3b 12,1+0,3a 12,3+0,6a 11, 9+0,4a Massa do baço (g) 0,9+0,05a 0,9+0,08a 0, 8+0, 02a 1,03+0,2a 0,82+0,06a Comprimento do cólon (cm) 18,4+0, 6a 13, 7+0,4b 16+0, 01c 15, 6+0,3C 14,2+0,6b

Produção de prostaglandina (PG) em tecido do cólon: efeitos da β-hidroxi-EPIA

Ao tratamentos com 7p-Hidroxi-EPIA não alteraram os teores em PGE2 e em PGD2 no tecido do cólon dos ratos de controlo sem colite (dados não apresentados). Em contraste, a administração de 7p-hidroxi-EPIA desde o dia 0 ao dia 7 levou a um aumento significativo acima dos valores de base dos teores em 15d-PGJ2 entre o dia 2 e o dia 14. A administração de 0,1 mg/kg de 7p-hidroxi-EPIA originou um aumento de 51 vezes no dia 2, que diminuiu progressivamente do dia 4 ao dia 14 (observando-se incrementos de entre 44 vezes e 5 vezes) (Fig. 9A, Fig. 10C). A administração do agente inflamatório DSS entre o dia 7 e o dia 14 originou aumentos marcados da produção da prostaglandina pró-inflamatória PGE2 no dia 14, enquanto 69 ΡΕ2097079 os teores em prostaglandina anti-inflamatória 15d-PGJ2 foram fortemente diminuídos (Fig. 10). O tratamento com 0,01 mg/kg de 7p-Hidroxi-EPIA entre o DO e o D7 evita por completo a produção de induzida por DSS de PGE2 no cólon, enquanto aumenta de forma notável o teor em 15d-PGJ2 (Fig. 10).

Expressão de COX-2 e de PG sintase nos grupos com colite induzida e falsamente induzida: efeito do tratamento prévio com 7|5-hidroxi-EPIA

Uma vez que se observaram modificações significativas dos teores em prostaglandina para a administração de DSS e os tratamentos com 7p-hidroxi-EPIA, testou-se se a expressão de COX-2, mPGES-1 e H-PGDS eram alteradas devido a um tratamento prévio com esteróide, quantificando-se os mARN específicos por RT-PCR em tempo real. A transcrição destes genes foi examinada e relacionada com a do gene de limpeza HPRT1. Nos ratos de controlo sem colite, a administração de 0,1 mg/kg de 7β-hidroxi-EPIA induziu um aumento significativo de 1,5 vezes nos teores de mARN de COX-2 após 15 h, seguindo-se um decréscimo significativo no dia 2 e no dia 4 depois de haverem voltado aos valores de base (Fig. 9B) . A expressão do mARN de mPGES-1 aumentou de forma transitória entre 6 h e 15 h, voltando aos teores de base no dia 2. A síntese de mARN de H-PGDS continuou sem modificações durante o decurso da experiência. 70 ΡΕ2097079

Depois da indução da colite pela DSS, observou-se um aumento de 2,5 vezes da expressão do mARN de COX-2 no dia 13 e no 14 (Fig. 11A) enquanto o mARN de mPGES-1 denotou aumentos significativos apenas no dia 13 (Fig. 11B). A administração de DSS não alterou H-PGDS.

Um tratamento prévio com 7β-1η.ίάηοχί-ΕΡΙΑ (entre o dia 0 e o dia 7) suprimiu estes aumentos da sintese dos mARN de COX-2 e de mPGES-1, devidos a DSS (Fig. 11).

Em conjunto, estes factos indicam que os efeitos anti-inflamatórios de 7β-hidroxi-EPIA são mediados por uma diminuição concomitante das produção de PGE2 e um aumento da de 15d-PGJ2. O efeito de longa duração da 7β-ϊιίάηοχί-EPIA sobre a produção de 15d-PGJ2 que se observa neste estudo sugere que a 7β-1ιίάηοχί-ΕΡΙΑ provoca aumentos sustentáveis na expressão de genes envolvidos na inflamação e na sua resolução.

Nos desenhos, a Figura 8 mostra os efeitos do tratamento com 7β-hidroxi-EPIA sobre (A) a mieloperoxidase (MPO) e os marcadores da tensão oxidativa, nomeadamente (B) Prot CO, (C) Tbars e (D) o marcador antioxidante GSH no tecido do cólon. Os teores em biomarcadores mostram que os ratos tratados com DSS diferem de forma significativa dos controlos nos dias 13 e 14 (p<0,05) . A 7β-hidroxi-EPIA diminuía de forma significativa a actividade de MPO nos dias 13 e 14 em comparação com o grupo com colite (p<0,05) e restaurava os parâmetros da tensão oxidativa (B, C e D) 71 ΡΕ2097079 aos valores de controlo nos dias 13 e 14, a todos os teores de dose. Apresentam-se os valores como média ± DPM (A) e em percentagem do grupo falsamente tratado (B, C e D) contendo 3-23 ratos por grupo. Nas Figuras 8A a 8D, as barras negras = controlo-falsamente tratado; as barras brancas = grupo com colite devido a DSS; as barras cinzento-escuras = DSS + 0,01 mg/kg de 7β-hidroxi-EPIA; as barras cinzentas médias = DSS + 0,1 mg/kg de 7β-hidroxi-EPIA; e as barras cinzento-claras = DSS + 1,0 mg/kg de 7β-ϊιίάηοχί-ΕΡΙΑ.

Na comparação do grupo de colite devido a DSS com o grupo de controlo falsamente tratado, (p<0,05); § na comparação entre os grupos tratados com 7p-hidroxi-EPIA e o grupo com colite induzida por DSS, (p<0,05). A Figura 9 mostra o teor em 15d-PGJ2 no cólon (A) e a quantificação da expressão relativa dos mARN de COX-2, mPGES-1 e H-PGDS (B) a diversas alturas durante o tratamento com 7β-ϊιίάηοχί-ΕΡΙΑ. Os valores são apresentados como média ± EPM (n=3 a 15) (A) e os mARN são expressos em relação dos do controlo falsamente tratado, após normalização em relação a HPRT1 (B). Na Figura 9A, a barra preta = grupo de controlo falsamente tratado; a barra a cinzento-escuro = 0,01 mg/kg de 7β-hidroxi-EPIA; a barra a cinzento intermédio = 0,1 mg/kg de 7β-hidroxi-EPIA; e a barra a cinzento-claro = 1,0 mg/kg de 7β-1ιίά^χί-ΕΡΙΑ. Na Figura 9B, a barra a cinzento escuro com pontos brancos = COX-2; a barra a cinzento claro com pontos pretos = mPGESl; e a barra branca com pontos pretos = H-PGDS. 72 ΡΕ2097079 A Figura 10 mostra o efeito da 7β-hidroxi-EPIA sobre a sintese no cólon das prostaglandinas E2, D2 e 15d-PGJ2, durante a administração de DSS. A administração de DSS aumentava as sínteses de PGE2 (A) , D2 (B) e 15d-PGJ2 (C) de uma forma significativa (p<0,05) nos dias 13 e 14 (p<0,05). O tratamento com 7p-hidroxi-EPIA durante 7 dias antes da administração de DSS diminuía a síntese de PGE2 nos dias 13 e 14 (A) enquanto aumentava a produção de 15d-PGJ2 significativamente , a todos os teores de dose (C) . Exprimem-se os resultados como média ± DPM, com n=3 a 23. Nas Figuras 10A a 10C, a barra preta = controlo, falsamente tratado; a barra branca = grupo com colite por DSS; a barra cinzenta com pontos brancos = DSS + 0,01 mg/kg de 7β- hidroxi-EPIA; a barra cinzento-clara com pontos pretos = DSS + 0,1 mg/kg de 7β-hidroxi-EPIA; e a barra branca com pontos pretos = DSS + 1,0 mg/kg de 7β-ϊιίάηοχί-ΕΡΙΑ. A Figura 5 mostra a expressão dos mARN de COX-2, mPGES-1 e H-PGDS no cólon durante a indução de colite. A colite levava a uma síntese significativamente mais forte do mARN de COX-2 nos dias 13 e 14 (A) enquanto o de mPGES-1 só aumentava no dia 13 (B) . Observou-se um retorno em relação aos valores de base da expressão dos genes a todas as doses de 7β-ϊιίάηοχί-ΕΡΙΑ. Nas Figuras 10A a 10C, a barra branca = grupo com colite por DSS; a barra cinzenta escura = DSS + 0,01 mg/kg de 7β-ϊιίά^χ1-ΕΡΙΑ; a barra cinzenta média = DSS + 0,1 mg/kg de 7 β-hidroxi-EPIA; e a barra cinzenta clara = DSS + 1,0 mg/kg de 7β-ϊιίά^χί-ΕΡΙΑ. 73 ΡΕ2097079 EXEMPLO 5 (de referência) 1. O efeito da 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ na artrite induzida por colagénio

Este estudo testava a eficácia da 7β-0Η-ΕΡΙΑ no controlo das alterações inflamatórias e patológicas associadas a um modelo de artrite induzida por colagénio. Este modelo murino demonstra uma doença clinicamente reminiscente da artrite humana.

Administrou-se a murganhos machos DBA/1 (com 10-12 semanas de idade) 100 yg de colagénio de frango de tipo II emulsionado em adjuvante completo de Freund (CII/CFA), no dia 0, por injecção na base da cauda. Os tratamentos foram administrados diariamente do dia 20 ao 50 por injecção subcutânea (Grupos 2, 3 e 4) , e do dia 0 ao 30 por injecção subcutânea (Grupo 5) tal como se descreve adiante:

Grupos experimentais (n=10/grupo)

Grupo 1: dia 0 CII/CFA, não ou falsamente tratados, tratados nos dias 20 a 50

Grupo 2: dia 0 CII/CFA, tratamento com 7p-hidroxi-EPIA a 1 yg/kg, dias 20 a 50

Grupo 3: dia 0 CII/CFA, tratamento com 7p-hidroxi-EPIA a 10 yg/kg, dias 20 a 50 74 ΡΕ2097079

Grupo 4: dia 0 CII/CFA, tratamento com 7β-hidroxi-EPIA a 100 yg/kg, dias 20 a 50

Grupo 5: dia 0 CII/CFA, tratamento com 7β-hidroxi-EPIA a 10 yg/kg, dias 0 a 30

Grupo 6: dia 0 CII/CFA, não ou falsamente tratados, tratados nos dias 0 a 30

No final, removeram-se as patas traseiras e prepararam-se homogenados dos joelhos para determinação de prostaglandinas (só para os grupos 1 & 4), fixando-se as patas para exames patológicos pelos métodos padrão. Seccionou-se cada pata a meio longitudinalmente, dissectou-se e descalcificou-se para se conseguir seccionar. Processaram-se rotineiramente as amostras descalcifiçadas, seccionaram-se e preparou-se uma secção contrastada para o exame. Isto incluía ambas as metades de cada espécimen. Classificou-se cada pata de acordo com um sistema de classificação padrão. Classificaram-se as amostras de um modo cego, sem se conhecer o protocolo experimental nem a identidade do grupo de proveniência.

Classificaram-se os inchaços clínicos das articulações duas vezes por semana entre os dias 21 e 50. Em cada uma destas alturas, atribuiu-se uma classificação a cada um dos quatro membros seguindo o seguinte esquema de classificação (classificação clínica combinada da doença): 75 ΡΕ2097079 0 normal 1 ligeira inflamação da articulação ou inflamação de um dedo individualmente 2 inflamação intermédia da articulação toda com vermelhidão e/ou inflamação em mais do que um dedo 3 inflamação severa das articulações e vermelhidão presente em diversos dedos 4 inflamação severa das articulações e vermelhidão presente em diversos dedos, sinais claros de remodelação óssea.

Os resultados estão listados na Tabela 6. Pode verificar-se que com a 7β-0Η-ΕΡΙΑ se conseguia uma diminuição notável dos inchaços articulares, tal como classificados pelo método clinico acima, em comparação com os dos grupos de controlo (combinaram- se os grupos de controlo 1 e 6 falsamente tratados). Este facto foi confirmado por dados patológicos de uma menor inflamação nas patas (Tabela 7) . Pode verificar-se da Tabela 7 que a menor classificação patológica em que 9 de 10 animais estavam completamente isentos de alterações histopatoló-gicas nas articulações das patas, quando o tratamento com 7β-1ιίάηοχ1-ΕΡΙΑ se iniciou no mesmo dia (dia 0) em que o colagénio foi administrado para induzir a artrite, e o 76 ΡΕ2097079 tratamento continuou até ao dia 30. Deste modo, um tratamento precoce de doenças tais como a artrite reuma-tóide com 7p-hidroxi-EPIA pode ter efeitos positivos. 2. Determinação de prostaglandinas nos homoge-nados de joelho

Determinaram-se os teores em 15d-PGJ2 e em PGE2 nos homogenados de joelho, tal como preparados acima, utilizando técnicas padrão de determinação. Pode verificar-se na Tabela 8 que os teores em PGE2 eram menores no grupo tratado com 0,1 mg/kg de 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ, em comparação com os do grupo de controlo, não tratado. O grupo tratado com 0,1 mg/kg de 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ apresentava maiores valores de 15d-PGJ2, quando comparado com o controlo não tratado.

Conclusão:

Existia um efeito anti-inflamatório claro da 7β-hidroxi-EPIA. Um tratamento na altura da indução parecia ter o maior efeito. Isto concorda com o que se verificou com outros compostos em teste incluindo esteróides, neste modelo, e reflecte a facilidade relativa para se evitarem lesões nas articulações e não a de reverter alterações já observadas. Tendo afirmado isto, os niveis de doença nos animais tratados com as maiores doses de 7β-1ιίά^χί-ΕΡΙΑ eram semelhantes quando se atrasava o inicio do tratamento até ao 20. Este nivel de protecção em relação à doença é adequado para um regime terapêutico. A menor dose de 7β- 77 ΡΕ2097079 hidroxi-EPIA parecia ter menos efeitos sobre o nivel da doença, embora seja necessária uma análise estatística para se investigar que se tratava de um claro efeito de dose.

Uma análise dos teores nas prostaglandinas E2 e 15d-J2 denotava um efeito claro do tratamento, os teores em PGE2 eram menores nos murganhos tratados, em comparação com os controlos não tratados. Em contraste, os teores em 15d-PGJ2 aumentavam após o tratamento.

Tomadas em conjunto, as observações clinicas da doença e os resultados histopatológicos proporcionam provas fortes de um efeito anti-inf lamatório da 7β-ϊιίάηοχί-ΕΡΙΑ neste modelo da artrite. Um tratamento anterior ao início da doença apresentava eficácia máxima, tal como é invariavelmente o caso neste modelo. No entanto, o facto de se verificar que a 7β-ϊιίάηοχί-ΕΡΙΑ consegue suprimir a progressão da doença, quando ela é administrada na altura do seu início, distingue este composto em relação a muitos seus competidores, e é muito encorajante.

Tabela 6 Efeito da 7β-ϊιί0ηοχί-ΕΡΙΑ sobre a Histopatologia no tratamento de Ratos com CIA, nos Dias 20 a 50

Grupo n Classificação histopatológica (ambas as patas no Dia 50) Falsamente ou não tratados 10 1,35 7p-hidroxi-EPIA a 1,0 pg/kg 10 0,60 7p-hidroxi-EPIA a 10,0 pg/kg 9 0,44 7β-1ηχΙτοχί-ΕΡΙΑ a 100,0 pg/kg 10 0,85 78 ΡΕ2097079

Pode concluir-se a partir destes resultados que a 7p-hidroxi-EPIA, a doses tão pequenas como 1,0 yg/kg, é capaz de diminuir as lesões nas articulações.

Tabela 7 Efeito da 7β-1ιίά^χί-ΕΡΙΑ sobre a Histopatologia no Tratamento de Ratos com CIA, entre os Dias 0 e30

Grupo n Classificação histopatológica (ambas as patas no Dia 50) Não ou falsamente tratados 9 1,22 7p-hidroxi-EPIA a 10,0 yg/kg 10 0,2 * 9 de 10 animais estavam completamente isentos de alterações histopatológicas A partir destes resultados, pode concluir-se que a 7p-hidroxi-EPIA a 10,0 yg/kg evita quase completamente o desenvolvimento da doença, isto é, lesões articulares.

Tabela 8 Efeito da 7β-ύίά^χί-ΕΡΙΑ (a 0,1 yg/kg e dia, Dias 20 a 50) sobre o inchaço das articulações e o conteúdo em prostaglandina, em Ratos com CIA no Dia 50 Não tratado Tratado Classificação clinica 7,50 ± 2,51 3,10 ± 2,96 PGE2 (pg/mL) 177,09 ± 70,08 95,61 ± 34,65 15d-PGJ2 (pg/mL) 19,12 ± 6,43 78,96 ± 22,18 PGE2/15d-PGJ2 9,26 1,21 A partir destes resultados, pode concluir-se que a 7β-ύϊάΓθχϊ-ΕΡΙΑ diminui a severidade dos sintomas 79 ΡΕ2097079 clínicos da artrite induzida por colagénio e altera a produção de prostaglandinas no tecido a favor da resolução da inflamação, da protecção das células e da reparação dos tecidos. EXEMPLO 6 (de referência)

Efeito da 7β-ΟΗ ΕΡΙΑ num modelo de neuropatia periférica induzida por cisplatina A cisplatina é um composto antimitótico utilizado no tratamento de cancros. No entanto, a sua utilização é limitada por diversos efeitos adversos, entre os quais as neuropatias periféricas são especialmente angustiantes. As neuropatia induzidas por cisplatina são predominantemente sensoriais. Os pacientes sofrem de perdas de sensibilidade nas extremidades distais, seguindo-se ataxia sensorial. Demonstrou-se por estudos histológicos a degeneração dos axónios: Em culturas de células, tratando-se neurónios sensoriais com cisplatina induzia-se uma diminuição da densidade da rede de neuritos e em seguida uma degeneração dos corpos da células. 0 Factor de Crescimento de Nervos (NGF), factor específico de crescimento para os neurónios sensoriais, tem efeitos protectores sobre os neurónios contra esta intoxicação. A intoxicação dos neurónios sensoriais pela cisplatina é portanto um modelo adequado para o estudo dos efeitos neuroprotectores de compostos nas neuropatias periféricas. 80 ΡΕ2097079

Avaliaram-se os efeitos neuroprotectores da 7β-ΟΗ ΕΡΙΑ nos neurónios sensoriais de ratos num modelo de neuropatia periférica.

As culturas primária das raizes dorsais dos neurónios sensoriais de gânglios dissociados incubadas com 3 yg/mL de cisplatina, foram conduzidas com e sem 7β-ΟΗ ΕΡΙΑ durante 48 horas e durante 72 horas, avaliando-se os seguintes parâmetros: • corpos celulares de neurónios contrastados com um anticorpo anti MAP 2 (proteina 2 associada aos microtúbulos) • densidade da rede de neuritos contrastada com um anticorpo anti β-Tubulina

Culturas de neurónios

Prepararam-se neurónios sensoriais de ratos de acordo com o método descrito por Hall et al. 1997 [Hall et al. (J. Neurosci. 1997, 15 de Abril; 17(8); 2775-84]. Em suma, sacrificou-se um rato fêmea (aos 15 dias de gestação) deslocando-lhe as vértebras cervicais (Ratos Wistar; Janvier, Le Genest-St-Isle, França) e removeram-se os fetos do útero. Removeram-se as suas medulas espinais com os gânglios de raizes dorsais (DRG), os guais se colocaram em meio de Leibovitz arrefecido com gelo (L15, Fisher 11415-049) contendo Penicilina a 50 UI/mL - Estreptomicina a 50 yg/mL (PS, 1 %) e albumina de soro bovino (BSA a 1 %, Sigma 81 ΡΕ2097079 Α6003). Recuperaram-se os DRG e dissociaram-se por tripsinisação durante 20 minutos a 37°C (tripsina EDTA 10X, 10 %, Fisher 15400054), diluíram-se em PBS isenta de cálcio e de magnésio (Fisher 2007-03) . Parou-se a reacção por adição de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM, Fisher 21969-035) contendo DNase I de grau II (0,1 mg/mL, Roche diagnósticos 104159) e soro fetal de bovino (FBS a 10 %, Fisher 10270-098). Triturou-se a suspensão de células com uma pipeta de 10 mL e centrifugou-se a 350 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Voltou então a suspender-se a pastilha de células dissociadas no meio de cultura definido.

Contaram-se as células viáveis num citómetro Neubauer utilizando o teste de exclusão com azul de tripano (Sigma) e semearam-se a uma densidade de 30.000 células/poço em placas de 96 poços (Nunc). Revestiram-se previamente os poços com poli-L-lisina (a 10 yg/mL, Sigma P2636) em água estéril ultra pura (Merck Eurolab 60759.01).

Deixaram-se as culturas celulares aderir durante 2 h e mantiveram-se numa incubadora humidificada a 37°C sob uma atmosfera de 5 % de CO2/95 % de ar.

Incubação de culturas de neurónios com 7β-ΟΗ ΕΡΙΑ

Ao fim de 5 dias de cultura, mudou-se o meio de cultura para um meio de cultura definido cumprindo as diversas condições enumeradas adiante: 82 ΡΕ2097079 . Veículo (DMSO a 0,1 %) • Veículo (DMSO a 0,1 %) + cisplatina (a 3 yg/mL, Sigma ref: p4394) • Composto em teste 7β-ΟΗ ΕΡΙΑ (1 nM, 10 nM e 100 nM) + cisplatina (a 3 yg/mL) • Composto NGF de referência (a 10 ng/mL) + cisplatina (a 3 yg/mL)

Para avaliar a sobrevivência dos neurónios, testaram-se seis poços em cada uma das condições experimentais. Passadas 48 horas e 72 horas de incubação, fixaram-se as células neuronais durante 5 minutos numa solução de etanol/ácido acético (a 95 %/5 %) a -20°C e lavaram-se 3 vezes em PBS.

Para o controlo do efeito neurotrófico dos compostos, incubaram-se NGF (10 ng/mL), e 7β-ΟΗ ΕΡΙΑ (1 nM, 10 nM e 100 nM) durante 4 8 horas e durante 72 horas. No final da incubação, fixaram-se as células durante 5 minutos numa solução em etanol/ácido acético (a 95 %/5 %) e a -20°C e lavaram-se 3 vezes em PBS.

Análise do número de corpos celulares e da rede de neuritos por campo

Marcaram-se os corpos celulares de neurónios 83 ΡΕ2097079 sensoriais com anticorpo monoclonal anti MAP-2 (Sigma M4403) e marcaram-se os neuritos dos neurónios sensoriais com anticorpo monoclonal anti β-Tubulina (Sigma T8660). Diluíram-se estes anticorpos a 1:400 em solução de incubação (PBS com 5 % de FCS e 0,1 % de saponina, Sigma S-7900). Estes anticorpos marcam específica e respectivamente os corpos celulares e os neuritos.

Passadas 2 horas de incubação, lavaram-se as células em PBS e incubaram-se com Alexa Fluor 488, IgG de cabra anti murganho (Molecular Probes A 11001) diluído a 1:300 em solução de incubação para revelar os anticorpos anti MAP-2 e anti β-Tubulina. Contrastaram-se os núcleos das células com um marcador fluorescente (solução de contrastação da Hoechst, SIGMA H6024, a 1 yg/mL em solução de incubação, durante 1 hora).

Obtiveram-se para cada uma das condições experimentais duas fotografias de cada poço (12 fotografias para cada conjunto de condições) , utilizando o In Cell Analyzer 1000 (Amersham Biosciences), controlado pelo programa de computador do In Cell Analyzer 1000 3.2. Para a marcação do MAP-2, a ampliação foi de xlO, para a marcação da β-Tubulina a ampliação foi de x20. Para cada marcação, obtiveram-se todas as imagens nas mesmas condições.

Uma análise do número de corpos celulares marcados com anticorpos anti MAP-2, e do comprimento total 84 ΡΕ2097079 dos neuritos marcados com os anticorpos anti β-Tubulina, foram levadas a cabo utilizando os programas do servidor do In Cell Analyzer 1000 3.2. Exprimiram-se os resultados em percentagem, em comparação com o veículo, levaram-se a cabo as diversas comparações em cada grupo utilizando o teste T desemparelhado

RESULTADOS

Protecção pela 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ contra a perda de densidade de neuritos Induzida pela cisplatina

Incubação com 3 pg/mL de cisplatina durante 48 horas A densidade dos neuritos exprimia em média 5.459 ym de comprimento total de neuritos por campo, depois da incubação dos neurónios sensoriais com meio ("veículo"), isto é, sem cisplatina, durante 48 horas. Uma incubação com cisplatina durante 48 horas diminuía o comprimento total de neuritos por campo para cerca de 4.585 ym. Esta diminuição de uma densidade de uma rede de neuritos pela cisplatina era estatisticamente significativa (-16 %, p<0,001) em comparação com o veículo. A incubação com 10 ng/m; de NGF durante 48 horas evitou a perda de neuritos induzida por cisplatina e provocou um aumento significativo do comprimento de 85 ΡΕ2097079 neuritos em comparação com os das culturas incubadas apenas com meio. A incubação com 7β-0Η-ΕΡΙΑ 1 nM, e 10 nM, protegia os neurónios sensoriais contra a perda de neuritos induzida por cisplatina, às 48 horas, este efeito era estatisticamente significativo. O comprimento total dos neuritos era de 5.378 ym e de 5.549 ym, passadas 48 horas de incubação, respectivamente com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 1 nM e 10 nM, o que representa uma diminuição da toxicidade induzida pela cisplatina, respectivamente em 90,7 % e em 101 %.

Incubação com 3 yg/mL de cisplatina durante 72 horas

Os neurónios sensoriais em meio "veiculo" sem cisplatina expressavam em média 5.320 ym de comprimento total de neuritos por campo. Uma incubação com cisplatina durante 72 horas diminuiu o comprimento total de neuritos por campo para cerca de 4.046 ym. Esta diminuição na densidade da rede de neuritos pela cisplatina era estatisticamente significativa (-24 %, p<0,001) em comparação com o veiculo.

Uma incubação com 10 ng/mL de NGF durante 72 horas evitava a perda de neuritos induzida pela cisplatina e provocava um aumento significativo do comprimento de neuritos em comparação com os observados em culturas incubadas apenas em meio. 86 ΡΕ2097079

Uma incubação com 7β-0Η-ΕΡΙΑ 1 nM protegia os neurónios sensoriais contra a perda de neuritos induzida pela cisplatina às 72 horas. 0 efeito era estatisticamente significativo. 0 comprimento total de neuritos era de 4.948 ym passadas 72 horas de incubação com 7β-0Η ΕΡΙΑ 1 nM, o que representa uma diminuição da toxicidade induzida pela cisplatina de 70,8 %.

Tabela 9 Efeitos do veiculo (0,1 % de DMSO), de NGF (a 10 ng/mL) e de 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ (1 nM, 10 nM e 100 nM), sobre o comprimento de neuritos dos neurónios sensoriais passadas 48 horas de incubação na presença de cisplatina (a 3 yg/mL).

Tratamento Cone. Comprimento médio de neuritos (ym) EEM n % do controlo sem cisplatina p (comparação com veículo + cisplatina) Veículo (DMSO a 0,1 %) - 5459,72 184 12 100 p<0,001 Veículo (DMSO a 0,1 %) intoxicação com 3 yg/mL de cisplatina 4585,52 133 12 84 NGF intoxicação com 3 yg/mL de cisplatina 10 ng/ml 6362,44 297 12 117 P<0,001 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ into- 100 nM 4442,51 125 12 81 P>0,05 xicação com 3 10 nM 5549,41 146 12 102 P<0,001 yg/mL de cisplatina 1 nM 5377,89 106 12 99 P<0,001 87 ΡΕ2097079

Tabela 10 Efeitos do veículo (DMSO a 0,1 %), do NGF (a 10 ng/mL) e do 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ (1 nM, 10 nM e 100 nM) sobre o comprimento de neuritos dos neurónios sensoriais passadas 72 horas de incubação na presença de cisplatina (a 3 yg/mL)

Tratamento Cone. Comprimento médio de neuritos (ym) EPM n % do controlo sem cisplatina p (comparação com veículo + cisplatina) Veículo (DMSO a 0,1 %) - 5320,43 156,74 12 100 P<0,001 Veículo (DMSO a 0,1 %) intoxicação com 3 yg/mL de cisplatina 4046,14 138,52 12 76 NGF intoxicação com 3 yg/mL de cisplatina 10 ng/mL 6000,30 221,31 12 113 p<0,001 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 100 nM 4080,89 172,07 12 77 p>0,05 intoxicação com 10 nM 4275,04 125,14 12 80 P>0,05 3 yg/mL de cisplatina lnM 4947,99 130,81 12 93 p<0,001

Protecção conferida pela 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ, contra a morte de células neuronais induzida por cisplatina (perda dos corpos das células neuronais).

Incubação com 3 pg/mL de cisplatina durante 48 horas.

Observaram-se em média 61 neurónios sensoriais por campo, depois de uma incubação em meio contendo o "veículo" sem cisplatina, às 48 horas. Uma incubação com 3 yg/mL de cisplatina diminuiu o número de neurónios a uma média de 41 neurónios sensoriais por campo. Esta perda de ΡΕ2097079 corpos celulares neuronais devida à cisplatina era estatisticamente significativa (-33 %, p<0,001), quando comparada com o número de corpos celulares avaliados após 48 horas sem cisplatina, isto é em meio contendo apenas veiculo. A incubação com 10 ng/mL de NGF durante 48 horas impediu quase completamente a perda de corpos celulares induzida pela cisplatina.

Uma incubação com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 1 nM, 10 nM e 100 nM protegia os neurónios celulares contra a morte celular induzida pela cisplatina, às 48 horas. Este efeito era estatisticamente significativo. O número total de neurónios celulares por campo era de 51, 45 e 50 passadas 48 horas de incubação, respectivamente com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 1 nM, 10 nM e 100 nM, o que representa uma diminuição da morte celular induzida pela cisplatina de, respectivamente, 53,1 %, 18,7 % e 43,8 %.

Incubação com 3 μg/mL de cisplatina durante 72 horas

Observaram-se em média 54 neurónios sensoriais por campo depois de uma incubação em meio, em conjunto com "veiculo", sem cisplatina, às 72 horas. Uma incubação com 3 yg/mL de cisplatina diminuia o número de neurónios, em média para 33 neurónios sensoriais por campo. Esta perda de corpos neuronais devida à cisplatina era estatisticamente significativa (-39 %, p<0,001) quando comparada com o 89 ΡΕ2097079 número de corpos celulares avaliados passadas 72 horas sem cisplatina, isto é, em meio contendo apenas veiculo.

Uma incubação com 10 ng/ml de NGF durante 4 8 horas evitava por completo a perda de corpos celulares induzida pela cisplatina.

Uma incubação com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 1 nM, 10 nM e 100 nM protegia quase completamente os neurónios sensoriais contra a morte celular induzida pela cisplatina às 72 horas, este efeito era estatisticamente significativo. O número total de neurónios sensoriais por campo era de 52, 55 e 52 passadas 72 horas de incubação com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ respectivamente 1 nM, 10 mM e 100 nM, o que representa uma diminuição da morte celular induzida por cisplatina em, respectivamente, 93 %, 104 % e 93 %.

Tabela 11 Efeitos do veiculo (DMSO a 0,1 %), do NGF (a 10 ng/mL), e de 7β-0Η-ΕΡΙΑ (1 nM, 10 nM e 100 nM), sobre o número de corpos de células por campo, passadas 48 horas de incubação com cisplatina (a 3 yg/mL).

Tratamento Cone. Média EPM N % do Controlo sem cisplatina p (em comparação com veículo+ cisplatina) Veículo (DMSO a 0,1 %) - 60,83 1,59 12 100 P<0,001 Veículo ( DMSO a 0,1 %) intoxicação com 3 yg/mL de cisplatina 40,75 1,88 12 67 NGF intoxicação com 3 yg/mL de cisplatina 10 ng/ml 58,33 1,38 12 96 p<0,001 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ intoxicação 100 nM 49,58 1,12 12 82 P<0,001 com 3 yg/mL de 10 nM 45,50 1,26 12 75 P<0,05 cisplatina lnM 51,42 \—1 i—1 CM 12 85 p<0,001 90 ΡΕ2097079

Tabela 12 Efeitos do veículo (DMSO a 0,1 %) , do NGF (a 10 ng/mL), e de 7β-0Η-ΕΡΙΑ (1 nM, 10 nM e 100 nM), sobre o número de corpos de células por campo, passadas 72 horas de incubação com cisplatina (a 3 yg/mL).

Tratamento Cone. Média EPM N % do Controlo sem cisplatina p (em comparação com veículo+ cisplatina) Veículo (DMSO a 0,1 %) - 53,75 1,29 12 100 P<0,001 Veículo ( DMSO a 0,1 %) intoxicação com 3 gg/mL de cisplatina 32,83 1,47 12 61 NGF intoxicação com 3 pg/mL de cisplatina 10 ng/ml 54,92 1,41 12 1,2 p<0,001 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ intoxicação 100 nM 52,25 1,24 12 97 p<0,001 com 3 pg/mL de 10 nM 54,58 1,37 z 1,2 p<0,001 cisplatina 1 nM 52,42 1,65 12 98 P<0,001 EXEMPLO 7 (de referência) O estudo presente avalia os efeitos promotores do crescimento de neuritos manifestados pelo 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ, sobre neurónios motrizes da medula espinal dissociados e sobre neurónios sensoriais, em culturas primárias. Contrastaram-se os neurónios com um anticorpo anti β-Tubulina e a análise do comprimento neuronal total foi levada a cabo utilizando um "In Cell Analyzer". Incubaram-se culturas de células neuronais com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10~9 M a 10~4 M, e avaliou-se a densidade da rede neuronal ao fim de 6 horas, 12 horas e 24 horas de incubação. Utilizou-se factor de crescimento 91 ΡΕ2097079 de nervos derivado do cérebro (BDNF), um factor de crescimento especifico para os neurónios motrizes, bem como factor de crescimento de nervos (NGF), factor de crescimento especifico para os neurónios sensoriais, a titulo de compostos de referência. Os dados obtidos mostram que a 7β-0Η-ΕΡΙΑ tem efeitos neurotróficos notáveis, tanto sobre os neurónios motrizes como sobre os neurónios sensoriais. Estes efeitos, que eram comparáveis aos efeitos de BDNF e de NGF, eram especialmente pronunciados a concentrações nanomolares do hidroxiesteróide. Em conjunto, estes factos suportam as utilizações de 7-hidroxiesteróides para promover o crescimento de neuritos e para tratar neuropatias periféricas. 1. Materiais e Métodos 1.1. Preparação de culturas de células neuronais motrizes da medula espinal de rato

Prepararam-se neurónios motrizes da medula espinal de acordo com o método descrito por Martinou et al., 1992 (Martinou JC, Martinou I, Kato AC, Cholinergic differentiation factor (CDF/LIF) promotes survival of isolated rat embryonic motoneurons in vitro. Neuron. 1992 Abril; 8(4):737-44). Em suma, sacrificaram-se ratos fêmea Wistar aos 15 dias de gestação deslocando-lhes as vértebras cervicais, e removeram-se os fetos dos úteros. Removeram-se os cordões espinais dos fetos e colocaram-se em meio de Leibovitz arrefecido em gelo (L15, Invitrogen, 11415-049) 92 ΡΕ2097079 contendo 1 % de albumina de soro bovino (BSA, isento de ácidos gordos, Eurobio, Les Ulis, França, GXXBSA01-65). Removeram-se cuidadosamente as meninges.

Dissociaram-se os neurónios motrizes espinais por tripsinisação durante 20 minutos a 37°C (tripsina EDTA 10X Invitrogen 15400054), diluiu-se em PBS isento de cálcio e de magnésio (Invitrogen 2007-03). Parou-se a reacção por adição de meio Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM, Invitrogen 21969-035) contendo DNase I de grau II (0,1 mg/mL, Roche diagnósticos 104159) e 10 % de soro fetal de vitelo (FCS, Invitrogen 10270098). Dissociaram-se então mecanicamente as suspensões por 3 passagens através de uma pipeta de 10 mL. Centrifugaram-se então as células a 580 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Voltou a suspender-se a pastilha de células dissociadas em meio L 15 e enriqueceu-se a suspensão resultante em neurónios motrizes centrifugando-a a 180 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente sobre uma camada de solução de BSA (a 3,5 %) em meio L 15. Descartou-se o sobrenadante e voltou a suspender-se a pastilha em meio L15 suplementado com DNase I (1 %) . Em seguida distribuiu-se uma camada da suspensão sobre uma almofada de Optiprep (d: 1,06 g/mL; Abcys, Paris, França; 1030061) e centrifugou-se a 335 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Recolheu-se a fase superior, contendo os neurónios motrizes purificados, que se viltou a suspender em meio L15 e a centrifugar a 800 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Por último suspendeu-se a pastilha de células num meio de cultura 93 ΡΕ2097079 definido constituído por meio neurobasal suplementado com 2 % de B27, 2 mM em L-Glutamina e com Penicilina a 50 UI/mL -Estreptomicina a 50 yg/mL. Contaram-se as células viáveis Contaram-se as células viáveis num citómetro de Neubauer utilizando o teste de exclusão de azul de tripano (Sigma T8154) e depois plaqueou-se a 30.000 células/poço em placas de 96 poços (previamente revestidas com poli-L-lisina; Nun-clon, Invitrogen P5899) e cultivou-se a 37°C numa atmosfera constituída por ar humidificado (95 %) e CO2 (5 %) . 1.2. Preparação de culturas de neurónios sensoriais de ratos

Prepararam-se neurónios sensoriais de ratos de acordo com o método descrito por Hall et al. 1997 (Hall AK, Ai X, Hickman GE, MacPhedran SE, Nduaguba CO, Robertson CP. The generation of neuronal heterogeneity in a rat sensory ganglion. J. Neurosci. 1997, 15 de Abril; 17(8): 2775-84). Em suma, sacrificaram-se ratos fêmea (aos 15 dias de gestação) deslocando-lhes as vértebras cervicais (Ratos Wistar; Janvier, Le Genest-St-Isle, França) (aos 15 dias de gestação) deslocando-lhe as vértebras cervicais (Ratos Wistar; Janvier, Le Genest-St-Isle, França) e removeram-se os fetos do útero.

Removeram-se as suas medulas espinais com os gânglios de raízes dorsais (DRG), os quais se colocaram em meio de Leibovitz arrefecido com gelo (L15, Fisher 11415-049) contendo Penicilina a 50 UI/mL - Estreptomicina a 50 94 ΡΕ2097079 yg/mL (PS, 1 %) e albumina de soro bovino (BSA a 1 %, Sigma A6003). Recuperaram-se os DRG e dissociaram-se por tripsinisação durante 20 minutos a 37°C (tripsina EDTA 10X, 10 %, Fisher 15400054), diluiram-se em PBS isenta de cálcio e de magnésio (Fisher 2007-03) . Parou-se a reacção por adição de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM, Fisher 21969-035) contendo DNase I de grau II (0,1 mg/mL, Roche diagnósticos 104159) e soro fetal de bovino (FBS a 10 %, Fisher 10270-098) . Triturou-se a suspensão de células com uma pipeta de 10 mL e centrifugou-se a 350 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Voltou então a suspender-se a pastilha de células dissociadas no meio de cultura definido.

Contaram-se as células viáveis num citómetro Neubauer utilizando o teste de exclusão com azul de tripano (Sigma) e semearam-se a uma densidade de 25.000 células/poço em placas de 96 poços (Nunc). Revestiram-se previamente os poços com poli-L-lisina (a 10 pg/mL, Sigma P2636) em água estéril ultra pura (Merck Eurolab 60759.01).

Deixaram-se as culturas celulares aderir durante 2 h e mantiveram-se numa incubadora humidificada a 37°C sob uma atmosfera de 5 % de CO2/95 % de ar. 1.3. Incubação de culturas celulares de neurónios motrizes do cordão espinal com compostos activos

Modificou-se o meio de cultura a um meio de 95 ΡΕ2097079 cultura definido, após um período de 12 horas de incubação, seguindo-se as condições descritas adiante:

Controlo (veículo, DMSO a 0,1 %)

7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ ΙΟ-4 Μ, ΙΟ-5 Μ, ΙΟ-6 Μ, 10'7 Μ, IO-8 M e 10'9 M (em DMSO a 0,1 %) BDNF a 50 ng/mL e a 10 ng/mL (em DMSO 0,1 %)

Passadas 6 horas, 12 horas e 24 horas de incubação, fixaram-se as células durante 5 minutos numa solução de etanol/ácido acético (a 95 %/5 %) a -20°C, e lavaram-se 3 vezes em PBS. 1.4. Incubação de culturas de células neuronais sensórias com compostos activos

Modificou-se o meio de cultura a um meio de cultura definido, após um período de 12 horas de incubação, seguindo-se as condições descritas adiante:

Controlo (veículo, DMSO a 0,1 %)

7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10-4 Μ, ΙΟ'5 Μ, ΙΟ'6 Μ, 10'7 Μ, 10~8 M e IO-9 M (em DMSO a 0,1 %) BDNF a 50 ng/mL e a 10 ng/mL (em DMSO 0,1 %) 96 ΡΕ2097079

Passadas 6 horas, 12 horas e 24 horas de incubação, fixaram-se as células durante 5 minutos numa solução de etanol/ácido acético (a 95 %/5 %) a -20°C, e lavaram-se 3 vezes em PBS. 1.5. Análise do crescimento dos neuritos

Marcaram-se os neurónios motrizes com anticorpo monoclonal anti β-Tubulina (Sigma T8660) diluído a 1:400 em solução de incubação (PBS com 5 % de FCS e 0,1 % de sapo-nina, Sigma S-7900). Este anticorpo marca especificamente os corpos das células neuronais, e os neuritos.

Passadas 2 horas de incubação, lavaram-se as células com PBS e incubaram-se com Alexa Fluor 488 IgG de cabra anti murganho (Molecular Probes A11001) diluído a 1:300 em solução de incubação, para revelar os anticorpos anti β-Tubulina III.

Uma análise do comprimento total de neurónios marcados com anticorpos anti β-Tubulina (neurónios) foi levada a cabo utilizando os programas num servidor In Cell Analyzer 1000 3.2.

Exprimiram-se os resultados em percentagem, em comparação com os obtidos com veículo. As comparações entre grupos foram levadas a cabo utilizando o teste T desemparelhado. 97 ΡΕ2097079

2- RESULTADOS 2.1. Efeito de um tratamento com fármaco sobre o comprimento dos neuritos dos neurónios motrizes A análise do comprimento total das extensões celulares proporciona uma indicação das propriedades neurotróficas dos compostos em teste. a) Passadas 6 horas de incubação

Listam-se os resultados na Tabela 13. 0 tratamento com BDNF a 50 ng/mL e a 10 ng/mL aumentava significativamente a densidade da rede de neuritos formada pelos neurónios motrizes, em respectivamente 180 % e 193 %, em comparação com o valor obtido em veiculo apenas (p<0,001).

Uma incubação com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10“8 M, e outra com 10”9 M, durante 6 horas, aumentavam significativamente a densidade da rede de neuritos dos neurónios motrizes, respectivamente a 150 % e a 188 %, em comparação com o valor obtido em veiculo apenas (p<0,001). b) Passada 12 horas de incubação

Listam-se os resultados na Tabela 14. O tratamento com BDNF a 50 ng/mL e a 10 ng/mL aumentava significativamente a densidade da rede de neuritos formada 98 ΡΕ2097079 pelos neurónios motrizes, em respectivamente 152 % e em 173 %, em comparação com o valor obtido em veículo apenas (p<0,001).

Uma incubação com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10~4 M a 10~9 M, durante 12 horas, aumentava significativamente a densidade da rede de neuritos dos neurónios motrizes, de 226 % a 137 %, em comparação com o valor obtido em veículo. c) Passadas 24 horas de incubação

Listam-se os resultados na Tabela 15. A incubação com BDNF a 10 ng/mL durante 24 horas aumentava significativamente a densidade da rede de neuritos formada pelos neurónios motrizes (170 % p<0,01). No entanto, a incubação com BDNF a 50 ng/mL não modificava significativamente a densidade da rede de neuritos.

Uma incubação com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10~8 M durante 24 horas, aumentavam significativamente a densidade da rede de neuritos dos neurónios motrizes, de 174 %, em comparação com o valor obtido em veículo apenas (p<0,005). 2.2. Efeito de um tratamento com fármaco sobre o comprimento de neuritos dos neurónios sensoriais a) Passadas 6 horas de incubação

Listam-se os resultados na Tabela 16. 0 99 ΡΕ2097079 tratamento com 50 ng/mL e com 10 ng/mL de NGF durante 6 horas aumentava significativamente a densidade da rede de neuritos formada pelos neurónios sensoriais, respectiva-mente em 273 % (p<0,001) e em 191 % (p<0,01), em comparação com o veiculo.

Por incubação com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10'7 M, 10'8 M e 1 O \—1 M durante 6 horas a densidade da rede de neuritos de neurónios sensoriais aumenta respectivamente em 171 o o (p<0,001), em 176 %, (p<0,005) e em 149 % (p<0,05), em comparação com o controlo. b) Passadas 12 horas de incubação.

Listam-se os resultados na Tabela 17. O tratamento com 5 0 ng/mL e com 10 ng/mL de NGF aumentava significativamente a densidade da rede de neuritos formada pelos neurónios sensoriais, respectivamente em 216 % (p<0,001) e em 128 % (p<0,05), em comparação com o veiculo.

Incubações com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10"9 M e 10“7 M aumentavam significativamente a densidade da rede de neuritos, quando comparadas com o veiculo, em respectivamente 145 % (p<0,001) e 134 % (p<0,05). c) Passadas 24 horas de incubação

Listam-se os resultados na Tabela 18. Passadas 24 100 ΡΕ2097079 horas de Incubação, com 50 ng/mL e com 10 ng/mL de NGF, aumentava significativamente a densidade da rede de neuritos formada pelos neurónios sensoriais, respectiva-mente em 309 % e em 371 %, em comparação com o veículo (p<0,001).

Passadas 24 horas de Incubação com 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10’ 7 Μ, 10’8 M e 10”9 M durante 24 horas, aumentava a densidade da rede de neuritos em comparação com a do veículo, respectivamente em 173 % (p<0,005), em 174 % (p<0,01 ) e em 147 % (p<0,05).

Tabela 13

Neurónios motrizes - C< omprimento dos neuritos por campo após 6 tioras de incubação Tratamento Cone. Média (pm) epm n % de veículo P Veículo (DMSO a 0,1 %) _ 254,3 19,0 12 100 - BDNF 50 ng/mL 457,2 19,4 12 180 p<0, 001 10 ng/mL 489,5 19,0 12 193 p<0, 001 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10'4 M 315, 9 18, 9 12 124 p<0, 05 10'5 M 293,3 22,8 12 115 p<0, 05 10'6 M 354,5 33,7 12 139 p<0, 05 10'7 M 350,5 34,3 12 138 p<0, 05 10'8 M 382,4 25,8 12 150 p<0, 001 10'9 M 479,3 40,8 12 188 p<0, 001 ΡΕ2097079 101

Tabela 14

Neurónios motrizes - Comprimento dos neuritos por campo após _12 horas de incubação_ _

Tratamento Cone. Média (ym) epm n % de veículo P Veículo (DMSO a 0,1 %) - 423,8 38,3 12 100 - BDNF 50 ng/mL 643,7 34,1 12 152 p<0, 001 10 ng/mL 731,3 34,8 12 173 p<0, 001 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ IO'4 M 602,4 24,8 12 142 p<0, 001 IO'5 M 680, 9 30,8 12 161 p<0, 001 IO'6 M 580,3 55,5 12 137 p<0, 03 10'7 M 956,7 54,6 12 137 p<0, 001 IO'8 M 759, 0 61, 6 12 179 p<0, 001 IO'9 M 764, 9 59, 9 12 180 p<0, 001

Tabela 15

Neurónios motrizes - Comprimento dos neuritos por campo após 24 horas de incubação___

Tratamento Cone. Média (ym) epm n % de veículo P Veículo (DMSO a 0,1 %) 215, 8 39, 6 12 100 - BDNF 50 ng/mL 293, 6 20, 1 12 136 p< 0,001 10 ng/mL 366,1 29, 6 12 170 p< 0, 0 01 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10"4 M 188,4 23, 3 12 87 p<0, 05 10"5 M 200, 9 20,7 12 93 p<0r 05 10'6 M 224, 8 36,7 12 104 p<0, 05 10"7 M 271,7 34, 0 12 126 p<0f 05 10"8 M 374, 6 22, 3 12 174 p<0, 005 10"9 M 265, 9 26,2 12 123 p<0r 05 ΡΕ2097079 102

Tabela 16

Neurónios sensoriais - Comprimento dos neuritos por campo após 6 horas de incubação____ Tratamento Cone. Média (ym) epm n % de veículo P Veículo (DMSO a 0,1 %) _ 102,2 14,1 12 100 - NGF 50 ng/mL 279,1 31, 8 12 273 p<0, 001 10 ng/mL 195,2 28, 8 12 191 P<0, 01 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10-4 M 103,2 10,7 12 101 p<0, 05 10-5 M 114,8 8,2 12 112 p<0, 05 IO-6 M 97,7 11,4 12 96 p<0, 05 10-7 M 151,8 11, 7 12 149 p<0, 05 10'8 M 179,3 16, 0 12 176 p<0, 005 10'9 M 174,2 9,1 12 171 p<0, 001

Tabela 17

Neurónios sensoriais - Comprimento dos neuritos por campo após _ 12 horas de incubação______ Tratamento Cone. Média (ym) epm n % de veículo P Veículo (DMSO a 0,1 %) _ 298,4 12, 8 12 100 - NGF 50 ng/mL 644,3 40, 0 12 216 p< 0,001 10 ng/mL 381,3 31, 4 12 128 p<0, 05 7β-ΟΗ-ΕΡΙΑ 10-4 M 290,3 32,3 12 97 p<0, 05 10-5 M 321, 0 18,4 12 108 p<0, 05 IO-6 M 287, 0 24,3 12 96 p<0, 05 IO-7 M 398,4 35, 8 12 134 p<0, 05 IO-8 M 368,3 32,2 12 123 p<0, 05 IO-9 M 431, 8 24,2 12 145 p<0, 001 ΡΕ2097079 103

Tabela 18

Neurónios sensoriais - Comprimento dos neuritos por campo após 24 horas de incubação

Tratamento Cone. Média (ym) epm n % de veículo P Veículo (DMSO a 0,1 %) - 220,7 12, 4 12 100 — NGF 50 ng/mL 682, 1 64,2 12 309 p<0, 001 10 ng/mL 819, 9 LO \—1 LO 12 371 p<0, 001 7β-0Η-ΕΡΙΑ 10"4 M 228, 6 38, 8 12 104 p<0, 05 10"5 M 244, 8 28,2 12 111 p<0, 05 10"6 M 189, 9 24, 4 12 86 p<0, 05 10"7 M 380, 8 45, 8 12 173 p<0, 005 10'8 M 384,3 52,2 12 174 p<0, 01 10"9 M 324, 9 45, 1 12 147 p<0, 05

Lisboa, 17 de Setembro de 2012

Claims (4)

1. ΡΕ2097079 1 REIVINDICAÇÕES

   na qual: R1 represente um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo; e R2, R3 e R4 sejam iguais ou diferentes uns dos outros e cada um deles represente um grupo oxo, um grupo hidroxilo, um grupo mercapto, um átomo de hidrogénio, um átomo de halogénio, um grupo alcoxilo, um grupo ariloxilo ou um grupo acilo; ou um seu sal ou éster aceitável do ponto de vista farmacêutico, para o fabrico de um medicamento para o tratamento ou a profilaxia de doenças inflamatórias das vias respiratórias. 2 ΡΕ2097079
2. 2. A utilização consoante a reivindicação 1, na qual a doença das vias respiratórias inclua asma, rinite, bronquite, ou doença crónica obstrutiva pulmonar.
3. 3. A utilização consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 2 para o tratamento e a profilaxia de: asma e doença crónica obstrutiva pulmonar.
4. 4. A utilização consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 3, na qual o referido composto com a fórmula (II) seja a 7-hidroxitestosterona. Lisboa, 17 de Setembro de 2012