KR20130109106A

KR20130109106A - 감염성 질환 치료용 항감염 분자의 폐로의 약물 운반을 위한 미세입자 제형

Info

Publication number: KR20130109106A
Application number: KR1020137005739A
Authority: KR
Inventors: 기탄자리 찬드라쉐카 치모테; 기리쉬 바드리나드 마하잔; 아라빈단 바슈데반; 시바라마크리쉬난 하리하란
Original assignee: 피라말 엔터프라이지즈 리미티드
Priority date: 2010-08-05
Filing date: 2011-08-04
Publication date: 2013-10-07
Also published as: EP2600842A1; AU2011287205A1; CN103442694A; WO2012017405A1; BR112013002641A2; MX2013001325A; TW201208716A; IN2013MN00329A; US8697653B2; ZA201301662B; CN103442694B; JP2013532722A; US20130125879A1; RU2013109384A; CA2807357A1

Abstract

본 발명은 PCT 출원 공보 WO 2011027290에 기재된 바와 같은, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 미생물(PM 0626271/MTCC5447)의 발효에 의해 수득되는 화학식 I의 화합물, 및 약물 운반용 생분해성 지질을 포함하며, 생분해성이고 흡입가능한 미세입자 제형 (여기서, 약물 (화학식 I의 화합물) 대 지질의 비는 1:15 내지 1:25이다)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료 유효량의 본 발명의 제형을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함으로써 폐결핵, 다제내성 결핵(MDRTB), 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (methicillin resistant Staphylococcus aureus: MRSA) 폐렴 및 메티실린 감응성 스태필로코커스 아우레우스 (MSSA) 폐렴을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 미세입자 제형을 이를 필요로 하는 포유동물에게 운반하는 방법에 관한 것으로, 상기 제형은 폐로의 운반을 위하여 흡입 또는 기관점적법에 의해 투여된다.

Description

감염성 질환 치료용 항감염 분자의 폐로의 약물 운반을 위한 미세입자 제형{MICROPARTICLE FORMULATION FOR PULMONARY DRUG DELIVERY OF ANTI-INFECTIVE MOLECULE FOR TREATMENT OF INFECTIOUS DISEASES}

본 발명은 PCT 출원 공보 WO 2011027290에 기재된 바와 같이, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 미생물의 발효에 의해 수득되며, 이후 화학식 I의 화합물로 언급되는 화합물, 및 약물 운반용 생분해성 지질을 포함하는, 생분해성이며 흡입가능한 미세입자 제형 (여기서, 약물 (화학식 I의 화합물) 대 지질의 비는 1:15 내지 1:25이다)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료 유효량의 본 발명의 제형을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함으로써 폐결핵, 다제내성 결핵(MDRTB), 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (methicillin resistant Staphylococcus aureus: MRSA) 폐렴 및 메티실린 감응성 스태필로코커스 아우레우스 (MSSA) 폐렴을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폐결핵, MDRTB, MRSA 폐렴 및 MSSA 폐렴의 치료를 위한 미세입자 제형의 용도에 관한 것이다.

결핵은 신체의 어느 기관에나 영향을 줄 수 있으며 여러가지 상이한 형태로 나타나지만, 1차 감염 부위는 폐이다. 폐에 영향을 주는 결핵은 폐결핵으로 알려져 있다. 폐결핵은 가장 우세하게 발병되는 형태의 결핵이다 (Tuberculosis, 2005, 85, 227-234). 폐결핵 치료를 위한 최근의 화학치료 요법은 4개월의 기간 동안 1차(front-line) 결핵치료 약물 (이소니아지드(isoniazid), 리팜피신(rifampicin), 에탐부톨(ethambutol), 및/또는 피리진아미드(pyrizinamide))에 이어 2개월 간의 이소니아지드, 리팜피신 및/또는 에탐부톨을 투여하는 병용-투여(co-administration) 방식으로 이루어져 있지만, 결핵의 종류에 따라서, 상기 치료를 추가로 9개월 부터 2년까지 범위의 기간까지 연장할 수 있다. 이런 최근의 화학치료 요법은 일단 일일 경구 투여의 형태로 제공되는데, 이는 불량한 혈장 반감기 (International Journal of Pharmaceutics, 2004, 276, 41-49) 및 과다 투여량 관련 부작용 (Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2004 54, 761-766)과 연관되어 있다. 이들 부작용은 바람직하지 못한 생체내분포 프로필에 기인한다. 또한, 경구적으로 투여된 약물의 경우, 작은 분획의 약물만이 작용 부위, 즉, 폐에 도달하고 수시간내에 소멸(cleared)되는 것으로 관찰되었다 (Tuberculosis, 2005, 85, 227-234). 이런 문제점들은 불량한 환자의 수용 상태와 관련있으며 다제내성 결핵(MDRTB)으로 발전된다.

MDRTB는 적어도 2종 이상의 최상의 결핵치료 약물인, 이소니아지드와 리팜피신에 대해 내성인 결핵의 형태이다 (Multidrug resistant tuberculosis fact sheet, Center for Disease Control, 2008). MDRTB는 플루오로퀴놀론, 아미카신(amikacin)과 같은 아미노글리코시드, 가나마이신(kanamycin), 카프레오마이신(capreomycin), 파라-아미노살리사이클산(para-aminosalicyclic acid) 및 티오아세타존(thioacetazone)과 같은 2차(second line) 결핵치료 약물로 치료한다 (Treatment of drug resistant tuberculosis, fact sheet, Center for Disease Control, 2007). 상기 2차 결핵치료 약물은 투여량 관련 부작용, 폐에서의 불량한 생체이용도와 관련있으며, 이는 질병을 근절하는데 있어 해롭다.

폐결핵의 문제점과 유사하게, 약물의 불량한 생체이용도 및 더 높은 투여량으로 유발되는 부작용에 관한 문제점을 MRSA 및 MSSA 폐렴의 치료에서도 직면하게 된다. MRSA로부터 발생하는 병원성 폐렴과 인공호흡기 관련 폐렴은 높은 사망율과 관련있으며 (International Journal of Antimicrobial Agents, 2007, 30, 19-24), 상기 언급한 것에 대한 이유는 부적합한 치료에 있다.

MRSA 폐렴을 치료하는데 사용되는 1차 약물로는 반코마이신(vancomycin)과 리네졸리드(linezolid)가 있다. MRSA 폐렴을 치료하기 위하여 선택되는 약물인 반코마이신은 폐조직에서 만족스럽지 못한 약동학적 프로필과 관련있으며 딱 20%의 혈장 농도인 폐농도를 갖는다 (Antimicrob. Agents Chemother., 1999, 37, 281-286). 또한, 장기간의 반코마이신 투여는 투여량-제한 인자인 신장독성과 관련있다 (Clin. Microbiol Infect., 2006, 12, 92-95). MRSA 폐렴에서의 요법으로 채택되는 리네졸리드는 양호한 경구적 생체이용도를 나타내지만 (일일 2회 600 ㎎으로 경구적으로 투여) 위장 부작용, 혈소판감소증, 및 가역성 빈혈과 관련있다 (Clinical Infect. Dis., 2003, 37, 1609-1616). 드물게, 리네졸리드 투여가 또한 눈 및 말초 신경병증과 관련있다 (J Antimivrob. Chemother., 2004, 53, 1114-1115).

베타 락탐제 (예로서, 암피실린 및 세폴로스포린)가 1차 치료제로서 MSSA 폐렴에 대해 매우 효과적이다. 반코마이신이 차세대 치료제로서 간주되지만, MSSA에 의해 유발되는 감염증에 있어서 베타 락탐제 만큼 효과적이진 못하다. 또한 반코마이신은 사구체 여과에 의해 오줌으로 배출되며 대사되지 않는다. 반코마이신의 폐조직 침투 또한 상대적으로 불량하다 (US Respiratory Disease, 2006, 62-64). 요약하면, MRSA/MSSA 폐렴용 치료법은 약물의 불량한 폐의 생체이용도, 약물 투여량 유발된 독성 등과 같은 몇몇 단점을 갖는다.

현재의 표준 치료 요법 및 환자의 비-수용도과 관련한 문제점을 극복하기 위해서는, 작용 부위에 직접 도달하고, 마이코박테리아가 존재하는 폐 대식세포를 표적으로 하는 포텐셜을 가지며 약물 관련 전신 독성을 감소시키는 약물 운반 시스템을 개발하는 것이 필수적이다.

본 발명은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 미생물 (PM0626271/MTCC5447)의 발효에 의해 수득되는, 화학식 I(본 명세서에 기재되는 바와 같은)의 화합물, 및 약물 운반용 생분해성 지질을 포함하는, 생분해성이며 흡입가능한 미세입자 제형 (여기서, 약물 (화학식 I의 화합물) 대 지질의 비는 1:15 내지 1:25이다)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 미세입자 제형의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 치료 유효량의 상기 미세입자 제형을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함으로써 폐결핵, MDRTB, MRSA 폐렴 및 MSSA 폐렴을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 미세입자 제형을 이를 필요로 하는 포유동물에게 운반하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 제형은 폐로 운반하기 위하여 흡입 또는 기관 점적법(intratracheal instillation)으로 투여한다.

본 발명은 또한 폐결핵, MDRTB, MRSA 폐렴 및 MSSA 폐렴을 치료하기 위한, 화학식 I의 화합물과 약물 운반용 생분해성 지질을 포함하는 미세입자 제형 (여기서 약물(화학식 I의 화합물) 대 지질의 비는 1:15 내지 1:25이다)의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 폐결핵, MDRTB, MRSA 폐렴 및 MSSA 폐렴 치료용 약제의 제조를 위한, 화학식 I의 화합물과 약물 운반용 생분해성 지질을 포함하는 미세입자 제형 (여기서 약물(화학식 I의 화합물) 대 지질의 비는 1:15 내지 1:25이다)의 용도에 관한 것이다.

본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 특정 양태로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 양태의 설명만을 목적으로 하는 것이며, 제한하고자 함이 아님을 알아야 한다.

본 명세서 및 특허청구의 범위에서 사용되는 바와 같은, 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 표시되지 않는 한 복수에 대한 언급을 포함하는 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

정의

포집효율(Entrapment Eefficiency): 포집효율은 용액중 초기의 약물의 총량에 대한 미세입자 제형중에 물리적으로 포집되어 있는 관련 약물의 분획이다.

약물(Drug): 약물은 질병의 진단, 치료, 완화, 처치 또는 예방에 사용하기 위한 또는 신체의 구조 또는 기능에 영향을 주고자 하는 물질 중 어느 하나로 정의된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 화학식 I의 화합물이 약물이다.

질량 수지(Mass Balance): 질량 수지 (물질 수지로도 불리움)는 물리적 시스템의 분석에 질량보전의 법칙을 적용시킨 것이다. 시스템에 들어가고 나오는 물질에 대해 계수함으로써, 미지의 것이거나, 또는 이 기술 없이 측정하기 어려울 수 있는 질량 흐름을 확인할 수 있다.

삼투질농도(Osmolality): 삼투질농도는 용매 킬로그램 당 용질의 오스몰 수(mOsm)로 정의되는, 용질 농도의 척도이다 (mosmol/㎏ 또는 mOsm/㎏).

상전이(Phase Transition): 상전이는 하나의 상 또는 물질의 상태가 다른 것으로 열역학적 시스템이 변형되는 것이다. 열역학적 시스템의 상 및 물질의 상태는 필수적으로 균일한 물리적 특성을 갖는다. 제시된 매질의 상전이 중에, 일부 외부적 조건, 예로서 온도, 압력 등의 결과로서, 매질의 특정한 특성이 흔히, 비연속적으로 변화된다. 변형이 일어나는 외부 조건의 측정치를 상전이점이라 칭한다.

에어로졸화(Aerosolization): 에어로졸화는 에어로졸(aerosol) - 미세 입자를 함유하는 미세 미스트 또는 스프레이의 생산이다.

분무화(Nebulization): 분무화는 액체 약제를 더욱 신속하게 작용하는 흡입된 미스트로 변형시키는 과정을 포함한다. 분무화는 호흡기 질환, 예로서 천식 또는 낭포성섬유증(cystic fibrosis)을 치료하는데 사용된다. 분무화기는 약물을 개체의 호흡관으로 직접 효과적으로 운반하여 폐에 신속하게 도달될 수 있도록 한다. 분무화기의 비-제한적 예로 압축기와 마우스피스 또는 안면 마스크가 장착되어 있는 기계가 있다.

입자 크기(Particle Size): 입자 크기는 고체 입자, 액체 입자(액적: droplets)의 치수를 비교하기 위하여 도입된 개념(notion)이다. 액적 및 에어로졸의 경우, "공기역학적 직경" 및 "질량 중위 공기역학적 직경(MMAD)"과 같은 용어가 사용된다. 정의는 하기에 제시되어 있다.

공기역학적 직경(Aerodynamic Diameter): 당해 입자와 동일한 종말침강속도(terminal settling velocity)를 갖는 유니트-밀도 구의 직경. 이는 그러한 입자가 침칙될 호흡기관을 예측하는데 사용된다.

질량 중위 공기역학적 직경(Mass Median Aerodynamic Diameter): 기하학적 평균 공기역학적 직경. 입자의 50 중량%가 MMAD 보다 더 작고, 50%는 더 크다.

입자 크기화 실험 중, 현탁액은 이동중에 변화되는 크기를 갖는, 헤아릴 수 없는 수의 입자를 함유한다. 입자-크기화 기계가 이들 입자를 분석할 때, 입자 분포 곡선이 형성되며, 이는 1 ㎚일 수 있는 최소의 입자에서부터 출발하여 최대 100 마이크론일 수 있는, 전체 입자 크기 범위를 커버한다. 입자 크기 분포 곡선에서, 누적도수를 입자에 대해 계산한다. D₁₀은 현탁액 중 입자의 10%가 특정 입자 작경 보다 더 작은 직경 또는 이와 대등한 직경을 갖는 특정 입자 직경을 언급한다.

D ₅₀ : D₁₀과 유사하게, D₅₀은 제형중 입자 집단의 50%에 대한 컷오프(cut off) 직경이며 현탁액 중 입자의 50%가 특정 입자 작경 보다 더 작은 직경 또는 이와 대등한 직경을 갖는 특정 입자 직경을 언급한다.

D ₉₀ : D₉₀은 제형중 입자 집단의 90%에 대한 컷오프 직경이며 현탁액 중 입자의 90%가 특정 입자 작경 보다 더 작은 직경 또는 이와 대등한 직경을 갖는 특정 입자 직경을 언급한다.

분무화시 포집된 약물 보유율(Entrapped drug retention on nebulization): 분무화 공정 중, 분무화기에 의해 유발된 힘에 기인하여 일부 리포좀이 파괴되고 약물이 제형으로부터 침출되어 분무화기 컵 자체에 보유된 상태가 된다. 분무화 공정 중 제형으로부터 침출되지 않은 약물이 분무화중 제형에 보유되어 있는 약물의 실제량이며 "포집된 약물 보유율"로 표시된다. 분무화 공정중에 소실되고/침출되는 약물은 분무화 컵으로부터 회수된다. 분무화 컵을 적합한 용매 (이 경우에는 메탄올)로 세척하고 컵에 보유된 약물을 HPLC 또는 LC-MS로 정량한다.

액정상(Liquid Crystalline Phase): 결정(고체)과 등방성(액체) 상태 사이에서 관찰되는 물질의 별개의 상이다.

리플드 겔 상(Rippled Gel Phase): 액정상과 겔상 사이의 준안정(metastable) 상태이다.

기관 점적법(Intratracheal Instillation): 약물을 기관내 튜브를 통하여 또는 피하 주사에 의해 폐로 약물을 운반하기 위하여 기관으로 투여하는 약물 투여 방법이다.

호흡 보조기(Ventilatory support): 의술에 있어서, 기계적 호흡은 자발적 숨쉬기를 기계적으로 보조하거나 대체하는 방법이다. 이는 질병에 걸린 환자의 기관내 튜브를 전술한 목적으로 고안된 호흡기(ventilator)에 부착시킴으로써 수행된다. 호흡기는 기관내 또는 기관절개관을 통하여 환자의 기도압을 변화시킴으로써 작동한다. MRSA 폐렴을 포함한 전격성 폐렴 환자는 기관절개술을 행하여 이들의 조직 산소화를 유지한다.

생분해성 지질(Biodegradable lipid): 생분해성 지질은 효소 작용에 의해서 또는 지질 분자가 이의 기본적인 구성 성분으로 분해되는 선천적인 생물학적 과정에 의해 생체내 (인체내에서)에서 화학적 분해될 수 있는 지질을 언급한다.

치료 유효량(Therapeutically effective amount): 치료 유효량은 생체내 조건하에서 당해 감염성 유기체를 치료하고 제거하기에 충분한 약물의 양을 언급한다. 본 발명의 미세입자 제형에 존재하는 화학식 I의 화합물의 치료량은 1% 내지 5%(w/w) 범위이다.

비-침습적 치료 방법(Non-invasive method of treatment): 비-침습적 치료 방법은 기관절개술 전의 개체에서의 분무화 또는 기관점적법과 같은 방법을 언급한다. 이 방법은 통증이 없으며 통증을 완화시키기 위하여 마취제 또는 이의 관련 성분의 투여를 포함한 추가적인 의료개입을 필요로 하지 않는다.

본 발명은 화학식 I의 화합물과, 약물 운반용 생분해성 지질을 포함하며 약물(화학식 I의 화합물) 대 지질의 비가 1:15 내지 1:25인 미세입자 제형에 관한 것으로 상기 미세입자 제형은 생분해성이며 흡입가능한 제형이다.

본 발명의 태양 중 하나에 따라서, 화학식 I의 화합물은 제형의 1% 내지 5%(w/w)를 차지한다.

화학식 I의 화합물은 다음식에 의해 구조적으로 나타낸다:

[화학식 I]

화학식 I의 화합물을 생산하기 위하여 사용할 수 있는 미생물은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종의 균주(PM0626271/MTCC5447)로, 이후 컬쳐 번호 PM0626271로 언급되며, 남극구의 Schirmacher Oasis로부터 수집한 토양 샘플로부터 단리되었다. 컬쳐 번호 PM0626271은 세계지적재산권기구 (World Intellectual Property Organization: WIPO)가 국제 기탁 기관(IDA)로 인정한, Microbial Type Culture Collection (MTCC), Institute of Microbial Technology, Sector 39-A, Chandigarh -160 036, India에 기탁되었으며 수탁번호는 MTCC 5447이다.

본 화합물은 컬쳐 번호 PM0626271, 이의 돌연변이종 및 변이체로부터 생산할 수 있으며, 다음 단계: 컬쳐 번호 PM0626271을 침지된 호기적 조건하에 탄소 공급원 1종 이상 및 질소 공급원 1종 이상 및 임의의 영양소 무기염 및/또는 미량원소를 함유하는 영양 배지에서 성장시키는 단계; 컬쳐 브로쓰로부터 화학식 I의 화합물을 단리시키는 단계; 및 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 정제 공법을 사용하여, 화학식 I의 화합물을 정제하는 단계를 포함한다.

본 명세서에 기재된 특정 미생물 외에, 이는 X-선, U.V.선 등을 포함한 화학적 또는 물리적 돌연변이 유발원을 사용하여 생산한 것들과 같은 미생물의 돌연변이종으로 이해되어야 하며 유전적 구성이 분자생물학 기술에 의해 개량된 유기체를 또한 배양시켜 본 화합물을 생산할 수 있다.

화학식 I의 화합물을 생산하는, 컬쳐 번호 PM0626271의 단리 및 배양을 위하여 사용되는 배지 및/또는 영양 배지는 바람직하게는 탄소, 질소 및 영양 무기염의 공급원을 함유한다. 탄소 공급원은 예를 들어, 녹말, 글루코오스, 슈크로오스, 덱스트린, 프럭토오스, 몰라세, 글리세롤, 락토오스, 또는 갈락토오스 중 1종 이상이다. 바람직한 탄소 공급원은 가용성 녹말 및 글루코오스이다. 질소 공급원은 예를 들어, 대두분, 피넛분(peanut meal), 효모 추출물, 소고기 추출물, 펩톤, 몰트 추출물, 옥수수 침지액, 젤라틴, 또는 카사미노산 중 1종 이상이다. 바람직한 질소 공급원은 펩톤 및 효모 추출물이다. 영양 무기염은 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화제이철, 염화스트론튬, 염화코발트, 브롬화칼륨, 불화나트륨, 인산수소나트륨, 인산수소칼륨, 인산수소이칼륨, 인산마그네슘, 탄산칼슘, 중탄산나트륨, 규산나트륨, 질산암모늄, 질산칼륨, 황산제일철, 황산나트륨, 황산암모늄, 황산마그네슘, 구연산철, 붕소산 또는 미량의 염용액, 예로서 황산구리, 염화망간 또는 황산아연 중 1종 이상이다. 탄산칼슘, 염화나트륨 및 염화마그네슘이 바람직한 영양 무기염이다.

컬쳐 번호 PM0626271의 유지는 22 ℃ 내지 36 ℃ 범위의 온도 및 약 7.5 내지 8.0의 pH에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 컬쳐 번호 PM0626271은 25 ℃ 내지 27 ℃에 약 7.4 내지 7.8의 pH에서 유지된다. 잘-성장한 컬쳐는 4 ℃ 내지 8 ℃의 냉장고에 보존할 수 있다.

컬쳐 번호 PM0626271의 씨드 컬쳐(seed culture) 배양은 25 ℃ 내지 36 ℃ 범위의 온도 및 약 7.5 내지 8.0의 pH에서 66시간 내지 75시간 동안 200 rpm (분당 회전수) 내지 280 rpm에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 컬쳐 번호 PM0626271 씨드는 29 ℃ 내지 31 ℃에 약 7.4 내지 7.8의 pH에서 72시간 동안 230 rpm 내지 250 rpm에서 배양시킨다.

화학식 I의 화합물의 생산은 26 ℃ 내지 36 ℃ 범위의 온도 및 약 6.5 내지 8.5의 pH에서, 24시간 내지 96시간 동안 60 rpm 내지 140 rpm 및 100 lpm (분당 리터) 내지 200 lpm 통기하에서의 발효에 의해 컬쳐 번호 PM0626271을 배양시킴으로써 수행될 수 있다. 전형적으로, 컬쳐 번호 PM0626271은 30 ℃ 내지 32 ℃ 및 pH 7.4 내지 7.8에서 40시간 내지 96시간 동안 90 rpm 및 110 lpm 통기하에서 배양시킨다.

발효 및 화합물 생산의 진척은 고성능 액체 크로마토그라피 (HPLC)에 의해서 및 스태필로코커스(Staphylococci) 및/또는 엔테로코커스(Enterococcus) 종에 대해 컬쳐액의 생체활성을 공지되어 있는 미생물 아가 플레이트 확산 검정법으로 측정함으로써 탐지할 수 있다. 바람직한 컬쳐는 문헌에 β-락탐 항생제로 보고된, 메티실린에 대해 내성 균주인 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) E710, 및 반코마이신에 대해 내성인 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) R2 (VRE)이다. 생성된 컬쳐액중에서, 본 발명의 화합물은 컬쳐 여액 뿐만 아니라 세포 매스중에 존재할 수 있으며 용매 추출법 및 컬럼 크로마토그라피와 같은 공지의 분리 기술을 사용하여 단리시킬 수 있다. 화학식 I의 화합물은 약 5 내지 9의 pH에서 석유 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 디에틸 에테르 또는 부탄올과 같은 수-비혼화성 용매로 추출하거나, 또는 폴리머성 수지, 예로서 "Diaion HP-20^®" (Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japan), "Amberlite XAD^®" (Rohm and Haas Industries U.S.A.), 활성탄을 사용한 소수성 상호반응 크로마토그라피에 의해서, 또는 pH 5 내지 9에서의 이온 교환 크로마토그라피에 의해 컬쳐 여액으로부터 회수할 수 있다. 활성 물질은 세포 매스로부터 수-혼화성 용매, 예로서 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, n-프로판올, 또는 이소-프로판올을 사용하거나 수-비혼화성 용매, 예로서 석유 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸 아세테이트 또는 부탄올을 사용한 추출에 의해 회수할 수 있다. 다른 선택적 방법은 전체 브로쓰를 석유 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, n-프로판올, 이소-프로판올, 또는 부탄올로부터 선택되는 용매로 추출하는 것이다. 전형적으로, 활성 물질은 전체 브로쓰로부터 에틸 아세테이트를 사용하여 추출한다.

추출물의 농축 및 동결로 활성 조 물질이 수득된다. 화학식 I의 화합물은 상기 조 물질로부터 다음 기술 중 어느 하나를 사용한 분별화에 의해 회수될 수 있다: 정상 크로마토그라피(normal phase chromatography; 정지상으로서 알루미나 또는 실리카겔을 사용하고; 석유 에테르, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 아세톤, 클로로포름, 메탄올, 또는 이들의 조합과 같은 용출제를 사용); 역상 크로마토그라피 (정지상으로서 디메틸옥타데실실릴 실리카겔, (RP-18) 또는 디메틸옥틸실릴 실리카겔 (RP-8)과 같은 역상 실리카겔; 및 물, 완충액[예를 들어, 인산염, 아세트산염, 시트르산염 (pH 2 내지 8)], 및 유기 용매 (예를 들어, 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 테트라히드로푸란, 또는 이들 용매의 조합)와 같은 용출제를 사용); 겔 투과 크로마토그라피 (Sephadex LH-20^® (Pharmacia Chemical Industries, Sweden), 메탄올, 클로로포름, 아세톤, 에틸 아세테이트, 또는 이들의 조합과 같은 용매 중 TSKgel^® Toyopearl HW (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japan), 또는 수중 Sephadex^® G-10 및 G-25와 같은 수지를 사용함); 또는 역류 크로마토그라피 (물, 메탄올, 에탄올, 이소-프로판올, n-프로판올, 테트라히드로푸란, 아세톤, 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 석유 에테르, 벤젠, 및 톨루엔과 같은 용매 2종 이상으로 구성된 2상(biphasic) 용출제 시스템을 사용). 이들 기술은 반복해서, 단독으로 또는 조합해서 사용할 수 있다. 전형적인 방법은 실리카겔을 사용하는 정상상에서의 크로마토그라피이다.

화학식 I의 화합물 및 이들의 이성체는 에스테르 및 에트르와 같은, 이들의 약제학적으로 허용되는 염 및 유도체로 전환시킬 수 있으며, 이들은 모두 본 발명에서 고려된다.

본 발명의 제형에 사용되는 생분해성 지질은 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)으로, 이는 내재성 폐 계면활성제 시스템의 천연 인지질이다. DPPC와 함께 사용될 수 있는 다른 생분해성 지질의 비-제한 예로는 DPPG (디팔미토일 포스파티딜 글리세롤), DPPE (디팔미토일포스파티딜에탄올아민), 콜레스테롤, 포스파티딜 이노시톨, 및 포스포티딜 세린이 있다.

본 발명의 다른 태양으로, 본 제형의 미세입자의 크기가 0.5 마이크론 내지 10 마이크론 사이의 범위에 있다.

본 발명의 또 다른 태양으로, 본 제형의 미세입자의 90%가 10 마이크론 미만의 크기를 갖는다.

본 발명의 또 다른 태양으로, 본 제형이 수성 리포좀 분산액(aqueous liposomal dispersion)이다.

본 발명의 다른 태양으로, 제형의 pH가 6 내지 7이다.

다른 태양으로, 본 제형의 삼투질농도가 300 mOsmol/㎏ 내지 400 mOsmol/㎏이다. 본 발명의 또 다른 태양으로, 본 제형의 상전이 온도가 41 ℃ 내지 43 ℃이다. 본 발명의 다른 태양으로, 본 제형은 분무화기(nebulizer)를 사용하여 1 ㎛ 내지 10 ㎛의 질량 중위 공기역학적 직경으로 에어로졸화할 수 있다.

사용할 수 있는 분무화기의 타입으로는 비제한적으로 제트 분무화기(Jet nebulizers), 초음파 분무화기(Ultrasonic wave nebulizer) 및 진동 메시 분무화기(Vibrating mesh nebulizer)가 있다.

본 발명의 태양으로, 본 제형의 제조 방법은 다음 단계를 포함하는 "용매 증발법(Solvent evaporation method)"을 사용한다:

(a) 클로로포름 3 ㎖ 내지 15 ㎖에 화학식 I의 화합물과 DPPC (1:15 내지 1:25 비율)을 용해시켜 용액을 수득하는 단계;

(b) 메탄올 20 ㎖ 내지 45 ㎖를 단계 (a)의 용액에 가하고 잘 혼합하여 균질한 용액을 수득하는 단계;

(c) 시뮬레이션화한 폐 유액(SLF) 20 ㎖ 내지 50 ㎖를 상기 단계 (b)의 용액에 가하는 단계;

(d) 용매를 증발시키는 단계;

(e) 상기 단계 (d)에서 수득한 용적을 SLF를 사용하여 30 ㎖로 만들고 15000 G 내지 35000 G에 4 ℃에서 10분간 원심분리시켜 펠릿을 수득하는 단계;

(f) 상기 단계 (e)에서 수득한 펠릿을 SLF에 다시 현탁시켜 농도가 0.5 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖인 현탁액을 수득하는 단계;

(g) 상기 단계 (f)에서 수득한 현탁액을 0.5 ㎛ 내지 5 ㎛ 폴리카보네이트 필터를 통하여 여과하여 균일한 입자 크기로 형성된 미세입자를 수득하는 단계.

본 명세서에서 사용되는 "용매 증발법"은 미국 특허 제4,877,561호에 보고된 방법의 개량법이다.

본 발명의 양태로, 상기 미세입자 제형의 제조 방법의 단계 (a)에서, 화학식 I의 화합물과 DPPC를 1:20의 비율로 용해시킨다.

본 발명의 다른 양태로, 상기 미세입자 제형의 제조 방법의 단계 (a)에서, 화학식 I의 화합물과 DPPC를 클로로포름 5 내지 10 ㎖에 용해시켜 용액을 수득한다.

본 발명의 양태로, 상기 미세입자 제형의 제조 방법의 단계 (b)에서, 메탄올 30 내지 40 ㎖를 가한다.

본 발명의 다른 양태로, 상기 미세입자 제형의 제조 방법의 단계 (c)에서, SLF 25 내지 35 ㎖를 가한다. 본 발명의 다른 양태로, 상기 미세입자 제형의 제조 방법의 단계 (e)에서, 원심분리를 20,000 내지 30,000G에서 수행한다.

본 발명의 다른 양태로, 상기 미세입자 제형의 제조 방법의 단계 (f)에서, 펠릿을 SLF에 다시 현탁시켜 농도가 1 내지 5 ㎎/㎖인 현탁액을 수득한다.

본 발명의 다른 양태로, 상기 미세입자 제형의 제조 방법의 단계 (g)에서, 상기 단계 (f)에서 수득한 현탁액을 2 ㎛ 내지 5 ㎛ 폴리카보네이트 필터를 통하여 여과한다.

본 발명의 다른 태양으로, 본 제형의 제조 방법이 다음 단계를 포함하는 "용매를 사용하지 않는 지질 자체 어셈블리 방법(Solvent free lipid self assembly method)"이다:

(i) SLF 20 ㎖ 내지 45 ㎖를 화학식 I의 화합물과 DPPC의 혼합물 (1:15 내지 1:25 비율)에 첨가하는 단계;

(ii) 상기 단계 (i)의 혼합물을 100 rpm 내지 200 rpm으로 42 ℃ 내지 45 ℃에서 1시간 동안 회전시켜 현탁액을 수득하는 단계;

(iii) 상기 단계 (ii)에서 수득한 현탁액을 15000 G 내지 35000 G에 4 ℃에서 10분간 원심분리시켜 펠릿을 수득하는 단계;

(iv) 상기 단계 (iii)에서 수득한 펠릿을 SLF에 다시 현탁시켜 농도가 0.5 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖인 현탁액을 수득하는 단계; 및

(v) 상기 단계 (iv)에서 수득한 현탁액을 0.5 ㎛ 내지 5 ㎛ 폴리카보네이트 필터를 통하여 여과하여 균일한 입자 크기로 형성된 미세입자를 수득하는 단계.

본 발명의 양태로, 본 발명의 미세입자 제형의 제조 방법의 단계 (i)에서, 30 ㎖ 내지 40 ㎖의 SLF를 화학식 I의 화합물과 DPPC의 혼합물에 가한다.

본 발명의 다른 양태로, 본 발명의 미세입자 제형의 제조 방법의 단계 (i)에서, 화학식 I의 화합물과 DPPC를 1:20의 비율로 용해시킨다.

본 발명의 양태로, 본 발명의 미세입자 제형의 제조 방법의 단계 (iii)에서, 상기 단계 (ii)에서 수득한 현탁액을 20,000G 내지 35,000G에 4 ℃에서 10분간 원심분리시켜 펠릿을 수득한다.

본 발명의 다른 양태로, 본 발명의 미세입자 제형의 제조 방법의 단계 (iv)에서, 상기 단계 (iii)에서 수득한 펠릿을 SLF에 다시 현탁시켜 농도가 1 ㎎/㎖ 내지 5 ㎎/㎖인 현탁액을 수득한다.

본 발명의 다른 양태로, 본 발명의 미세입자 제형의 제조 방법의 단계 (v)에서, 상기 단계 (iv)에서 수득한 현탁액을 2 ㎛ 내지 5 ㎛ 폴리카보네이트 필터를 통하여 여과시킨다.

본 발명은 또한 치료 유효량의 본 발명의 제형을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함으로써 폐결핵, MDRTB, MRSA 폐렴 및 MSSA 폐렴을 치료하는 방법에 있어서 본 제형의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 폐결핵, MDRTB, MRSA 폐렴 및 MSSA 폐렴의 치료용 약제의 제조를 위한, 화학식 I의 화합물과 약물 운반용 생분해성 지질을 포함하며 약물 대 지질 (화학식 I의 화합물)의 비가 1:15 내지 1:25인 미세입자 제형의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 태양으로, 본 발명의 치료 방법은 마이코박테리아 및 메티실린 내성 뿐만 아니라 메티실린 감응성 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)가 번식할 수 있는 폐포 대식세포를 표적으로 한다.

본 발명은 또한 미세입자 제형을 이를 필요로 하는 포유동물에게 운반하는 방법에 관한 것으로, 상기 제형은 폐로의 운반을 위하여 흡입 또는 기관점적법에 의해 투여된다.

본 발명이 태양으로, 미세입자 제형의 운반법은 흡입에 의한 것이다.

본 발명의 다른 태양으로, 흡입법은 화학식 I의 화합물이 미세입자에 포집되는 분무화(nebulization)이다.

본 발명의 미세입자 제형에 있어서 흡입에 의해 투여시 제형에 포함되어 있는 상당한 농도의 화학식 I의 화합물이 마우스의 폐에서 검출되는 것으로 관찰되었다. 그러나, 제형화되지 않은 화학식 I의 화합물을 공급한 마우스의 폐에서는 상당한 농도의 화학식 I의 화합물은 검출되지 않는다. 이는 미세입자 제형중의 화학식 I의 화합물의 증가된 생체이용도의 지표이다. 또한, 본 발명의 미세입자 제형이 흡입에 의해 투여될 때 약물 (화학식 I의 화합물)이 24시간의 기간에 걸쳐 폐에 보유되는 것으로 관찰되었다.

본 발명의 다른 태양으로, 포집된 화학식 I의 화합물의 보유율은 30% 보다 더 크다. 특히, 포집된 화학식 I의 화합물의 보유율은 30% 내지 70% 범위이다.

흡입의 경우 화학식 I의 화합물의 투여량 범위는 0.05 내지 10 ㎎/체중 ㎏/일이다.

본 발명의 다른 태양으로, 본 발명의 미세입자 제형의 운반법이 호흡보조기 시스템상 환자에서의 기관점적법이다.

본 발명의 다른 태양으로, 분무화에 의한 투여는 폐결핵, MDRTB, MRSA 폐렴 및 MSSA 폐렴의 치료에 요구되는 화학식 I의 화합물의 양을 감소시킨다.

본 발명의 또 다른 태양으로, 이 방법은 화학식 I의 화합물이 폐에 도달하는데 도움이 된다.

본 발명의 미세입자 제형의 효과는 후속되는 실시예에서 상세하게 설명되는 생물학적 검정법에 의해 입증되었다. 이들 실시예는 본 발명에서 설명만을 목적으로 제공되며 본 발명의 범주를 제한하고자 함이 아니다.

실시예

다음과 같은 용어/약어/화학식이 실시예에서 사용된다:

NaCl : 염화나트륨

CaCl₂ : 염화칼슘

NaOH : 수산화나트륨

SLF : 시뮬레이션화된 폐 유액

HPLC : 고성능 액체 크로마토그라피

DPPC : 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린

DMSO : 디메틸 술폭사이드

RB 플라스크: 환저 플라스크

rpm : 분당 회전수

DSC : 차동 주사 열량계

TSI : 이중 스테이지 임핀저(Twin Stage Impinger)

MSSA : 메티실린 감응성 S.aureus

MRSA : 메티실린 내성 S.aureus

VRE : 반코마이신 내성 엔테로코커스(Enterococci)

TSA : 트립토오스 소야 아가(Tryptose Soya Agar)

CFU : 콜로니 형성 유니트

HBSS : Hanks Buffered Salt Solution

MTS : (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페 닐)-2H-테트라졸륨)

GC-HS : 헤드 스페이스 부착물이 있는 가스 크로마토그라피

CPCSEA: 동물에 대한 실험의 제어 및 감독을 목적으로 하는 위원회 (Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animals)

IAEC : 실험동물 윤리 위원회(Institutional Animal Ethics Committee)

API : 활성 약제 성분

실시예 1

남극지역에서 수집한 토양으로부터 컬쳐 번호 PM0626271의 단리

a) 단리 배지의 조성

개질 인공 해수 아가(Modified artificial sea water agar): 펩톤 1.5 g, 이스트 추출물 0.5 g, 염화제이철 0.007 g, 1.0 L의 물(750 mL 인공해수 + 250 mL 탈염수), 아가 분말 15.0 g, 최종 pH (25℃) 7.4 내지 7.8.

인공해수의 조성: 염화나트륨 24.6 g, 염화칼륨 0.67 g, 염화칼슘.2H₂O 1.36 g, 황산마그네슘.7H₂O 6.29g,염화마그네슘.6H₂O 4.66g,중탄산나트륨 0.18 g, 탈염수 1.0 L, 최종 pH (25 ℃) 7.8-8.2.

b) 과정:

남극 지역 Schirmacher Oasis 지역으로부터, 수면 토양을 수집하여, 인도, Mumbai, Goregaon의 Piramal Life Sciences 회사로 가는 동안 -20℃에서 보관하였다. 시료를 -20℃ 내지 -22℃에서 보관한 후, 실온(25±2℃)에서 해동시켜 미생물을 단리하였다. 토양 시료(~1g)를 100 mL 멸균 플라스크 내의 25 mL의 멸균 1% 펩톤수에 현탁하였다. 플라스크를 30초동안 격렬하게 교반하였다. 멸균 1% 펩톤수에서 10^-5까지 계열희석액을 준비하였다. 100 ㎕의 10^- ⁵희석액을 개질 인공해수 아가 상에 표면 도말하였다. 콜로니가 관찰될 때가지 평판을 실온(25±2℃)에서 배양하였다. 한달 반 동안 배양한 후, 이 배지 상에 나타난 콜로니를 75% 인공해수[Accumix^Tm](AS-AIA)에 마련된 방선균(actinomycete) 단리 아가 [Hi Media]를 함유하는 페트리 평판에 스트리킹(streaking)하였다. 단리물을 정제하여 컬쳐 ID 번호 PM0626271을 얻었다. 이렇게 해서 생육 미생물 중에서 단일 단리물로서 컬쳐 번호 PM0626271을 단리하였다.

실시예 2

컬쳐 번호 PM0626271의 정제

a) 정제 배지의 조성 (방선균 단리 아가, 1.5% 아가 아가에 의하여 아가화됨(agarified))

글리세롤 5.0 mL, 카제인나트륨 2.0 g, L-아스파라긴 0.1 g, 프로피온산 나트륨 4.0 g, 인산이칼륨 0.5 g, 황산마그네슘 0.1 g, 황산철 0.001 g, 1.0 L의 물 (750 mL의 인공 해수 + 250 mL의 탈염수) , 아가분말 15.0 g, 최종 pH (25 ℃) 7.4-7.8.

b) 과정:

컬쳐 번호 PM0626271을 방선균 단리 아가 (75% 인공해수염 함유) 페트리 평판에 스트리킹(streaking)하였다. 페트리 평판을 25℃에서 10일 동안 배양하였다. 페트리 평판에서 단리된 콜로니 중 하나를 75% 인공해수에 마련된 방선균 단리 아가의 신선한 사면 배지로 옮겼다. 사면 배지를 25℃에서 10일 동안 배양하였다.

실시예 3

생산균주-컬쳐 번호 PM0626271의 관리

a) 배지의 조성 (방선균 단리 아가)

글리세롤 5.0 mL, 카제인나트륨 2.0 g, L-아스파라긴 0.1 g, 프로피온산 나트륨 4.0 g, 인산이칼륨 0.5 g, 황산마그네슘 0.1 g, 황산제일철 0.001 g, 1.0 L의 물 (750 mL의 인공 해수 + 250 mL의 탈염수) , 아가분말 15.0 g, 최종 pH (25 ℃) 7.4-7.8.

인공해수의 조성: 염화나트륨 24.6 g, 염화칼륨 0.67 g, 염화칼슘.2H₂O 1.36 g, 황산마그네슘.7H₂O 6.29 g, 염화마그네슘.6H₂O 4.66 g, 중탄산나트륨 0.18 g, 탈염수 1.0 L, 최종 pH (25 ℃) 7.8-8.2.

b) 가열하여 상기 성분들을 녹인 후, 결과의 용액을 시험관에 분배하고 121℃ 에서 30분간 멸균하였다. 시험관을 냉각하고 경사 위치 상태에서 고형화시켰다. 아가 사면 배지에 컬쳐 번호 PM0626271의 성장물을 와이어 루프를 이용하여 스트리킹(streaking)하고, 양호한 성장물이 관찰될 때까지 27℃ 내지 29℃에서 배양하였다. 양호하게 잘 자란 배양물을 4℃ 내지 8℃의 냉장고에 보관하였다.

실시예 4

진탕 플라스크 내의 컬쳐 번호 PM0626271의 발효

a) 종균 배지[AS-274 (1)]의 조성:

포도당 15 g, 옥수수 침지액 5g, 펩톤 7.5 g, 효모 추출액 7.5 g, 탄산칼슘 2.0 g, 염화나트륨 5.0 g, 부피는 750 mL 인공 해수 및 250 mL 탈염수로 만들었다.

b) 상기 배지를 500 mL 용량 엘렌마이서(Erlenmeyer) 플라스크에 40 mL의 양으로 분배하고 121℃ 에서 30분동안 가압멸균하였다. 플라스크를 실온(25℃±2℃)으로 냉각하고, 각 플라스크에 사면 배지 상에 잘 자란 생산주 (컬처 번호 PM0626271)를 루프 가득히 접종하고, 30℃±C에서 230 rpm 내지 250 rpm으로 72시간 동안 회전식 진탕기로 진탕하였다.

c) 조제 배지[AS 36P (1)]의 조성:

수용성 전분 20 g, 포도당 15 g, 효모 추출물 2 g, 펩톤 3 g, 탄산칼슘 2 g, 황산암모늄 0.5 g, 옥수수 침지액 2 g, 염화나트륨 2 g, 인산 마그네슘 5 g, 1 g/L의 스톡(stock)으로부터의 염화코발트 1mL/L, 염 용액(trace salt solution) 1 mL/L, 부피는 75 %는 인공해수와 25% 탈염수를 이용하여 1L로 하였다.

d) 500 mL 용량 엘렌마이서(Erlenmeyer) 플라스크 내의 40 mL의 조제 배지를 121℃ 에서 30분동안 가압멸균한 후, 29℃ 내지 30℃로 냉각하고, 실시예 4b에서 언급한 5 % (v/v)의 종균 배양액으로 접종하였다.

e) 발효 변수

조제 플라스크를 29℃에서 220 rpm의 진탕기에서 96시간 동안 배양하였다. 생산 플라스크를 회수하고 각 배지 플라스크에서 얻은 전발효액을 29℃ 및 1시간의 진탕조건 하에서 동일한 부피의 메탄올로 추출하고 1시간 반동안 3500 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 항균 한천확산법(antibacterial agar well diffusion assay)에 이용하여 활성을 살펴보았다.

실시예 5

발효용 진탕 플라스크에서 종균 배양액의 제조

a) 배지[AS-274 (1)]의 조성:

b) 상기 배지를 1000 mL 용량 엘렌마이서(Erlenmeyer) 플라스크에 200 mL의 양으로 분배하고 121℃ 에서 30분동안 가압멸균하였다. 플라스크를 실온(25+2℃)으로 냉각하고, 각 플라스크에 사면 배지 상에 잘 자란 생산주 (컬처 번호 PM0626271)를 루프 가득히 접종하고, 29℃ 내지 30℃에서 230 rpm 내지 250 rpm으로 70 내지 74시간 동안 회전식 진탕기로 진탕하였다.

실시예 6

발효조 내에서 컬쳐 번호 PM0626271의 배양

a) 조제 배지의 조성

인공 해수 (인공 해수 염 28.32 g) (75 %), 수용성 전분 20 g, 포도당 15 g, 효모 추출물 2 g, 펩톤 3 g, 탄산칼슘 2 g, 황산암모늄 0.05 g, 옥수수 침지액 2 g, 염화나트륨 2 g, 인산 마그네슘 5 g, 염화코발트 (염화코발트 1 g 탈염수 1.0 L) 1 mL/L, 염 용액(trace salt solution) (황산구리 7 g, 황산제일철 1 g, 염화망간 8 g, 황산아연 2 g, 탈염수 1.0 L) 1 mL/L, 탈염수 1.0 L, pH 6.5-7.5 (살균 전).

b) 소포제로서 30 mL의 데스모펜(desmophen)과 함께 150 L의 발효조 내의 100 L의 조제 배지를 121℃에서 30분 동안 현장에서(in situ) 살균한 후, 29℃ 내지 30℃로 냉각하고, 상기에서 얻은 종균 배양액 2.5 L 내지 3.5 L을 접종하였다 (실시예 5).

c) 발효 변수: 29℃ 내지 30℃의 온도에서 발효를 실시하고, 100 rpm으로 교반하고, 60 lpm 으로 통기하고, 70 시간 내지 74 시간 배양하였다. 발효액(broth) 내에서 생산된 화학식 I의 화합물을, 한천 확산법(agar well diffusion method)을 이용하여 S. aureus E710 (MRSA strain) 및/또는 Enterococcus faecium R2 (VRE)에 대한 생물활성(bioactivity)를 시험함으로써, 정성적으로 검출하였다. 배양 발효액의 회수 pH(harvest pH)는 7.5-8.0이었다. 회수 후, 전발효액을 용매추출하였다.

실시예 7

화합물의 단리 및 정제

상기 전발효액(10 L bath)을 에틸 아세테이트(1:1)로 추출하였다. 유기층과 수성층을 분리하였다. 유기층을 처리하여 용매를 증발시켜 조 에틸 아세테이트 추출물(1.5 g)을 얻었다. 조 추출물을 섬광 크로마토그래피(실리카겔, 30 g, 용매:메탄올/클로로포름 단계 구배(step gradient), 유속: 15 mL/분)를 이용하여 더 처리하였다. 클로로포름 내 1% 메탄올 내지 5% 메탄올로 용출시킨 활성 화합물을 농축하여 반순수(semipure) 화합물(250 mg)을 얻었다. 정상 (normal phase) preparative HPLC를 반복함으로써 추가로 정제하였다.

Preparative HPLC 조건:

컬럼 : Eurospher 실리카 (10m, 20x250 mm)

용리제 : 메탄올:클로로포름 (5:95)

유속 : 20 mL/분

검출 (UV) : 245 nm

정체 시간 : (5 내지 6 분)

분획물의 순도를 E. faecium R2 및/또는 S. aureus 3066에 대한 생물검정이나 분석 HPLC에 의하여 확인하였다. 용출액을 모아 감압조건에서 농축하여 용매를 제거하고 화합물을 얻었다.

분석 HPLC 조건:

컬럼 : Eurospher RP-18, (3μ, 4.6 x125 mm)

용매계 : 구배 (물에 대하여 15분 내에 0 %에서 100% 아세토니트릴,

이어서 5분 동안 100% 아세토니크릴)

유속 : 1 mL/분

검출 (UV) : 245 nm

정체 시간 : 화학식 I의 화합물 (12 내지 13 분)

화학식 I의 화합물의 물리적 및 스펙트럼 성질:

외형 : 백색 분말

녹는점 : 240℃ (분해)

용해도 : 클로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올에 가용성 물에 비수용성

HR-ESI : 1650.4858 (M+H)

분자량 (ESI) : 1650.5 (M+H)

분자식 : C₇₁H₈₃N₁₉O₁₈S₅

IR (KBr) : 3386, 2927, 1648, 1507, 1206, 756, 666 cm^-1

¹H NMR : 표 1 참조

¹³C NMR : 표 2 참조

500 MHz에서 CDCl₃: CD₃OD(4:1)내 화학식 I의 화합물의 ¹H NMR

피크	δ	피크	δ	피크	δ
1	0.7(d, 3H)	18	3.67(d, 1H)	35	6.91(s, 1H)
2	0.74(d, 3H)	19	3.7 (q, 1H)	36	6.94(s, 1H)
3	0.95(d, 3H)	20	4.33(d, 1H)	37	7.2(s, 1H)
4	1.04(s, 3H)	21	4.33(d, 1H)	38	7.43(s, 1H)
5	1.08(d, 3H)	22	4.62((q, 1H)	39	7.45(s, 1H)
6	1.2(d, 3H)	23	4.86(dd, 1H)	40	7.65(s, 1H)
7	1.28(d, 3H)	24	5.19 (s, 1H)	41	7.87(s, 1H)
8	1.34(d, 3H)	25	5.19(s, 1H), 5.67 (s, 1H)	42	8.05(s, 1H)
9	1.37(m, 1H)	26	5.2(t, 1H)	43	8.17(s, 1H)
10	1.5(d, 3H)	27	5.6(d, 1H)	44	8.2 (s, 1H)
11	1.6(d, 3H)	28	5.62(s, 1H), 6.44(s, 1H)	45	8.5 (s, 1H)
12	2.1(m, 1H)	29	5.65(d, 2H)	46	8.67 (s, 1H)
13	2.2 (m, 1H)	30	5.72(s, 1H), 6.61(s, 1H)	47	8.99 (s, 2H)
14	2.2(m, 1H) 3.99(m, 1H)	31	6.1(q, 1H)	48	9.72 (s, 1H)
15	2.8(d, 1H)	32	6.25(m, 1H)	49	9.8 (s, 1H)
16	3.05(t, 1H) 3.5(t, 1H)	33	6.28(d, 2H)
17	3.49(d, 2H)	34	6.8(d, 1H)

500 MHz에서 CDCl₃: CD₃OD(4:1)내 화학식 I의 화합물의 ¹³C NMR

신호	δ	신호	δ	신호	δ
1	12.11	25	64.45	49	144.61
2	13.74	26	64.73	50	148.17
3	14.1	27	65.69	51	148.45
4	14.8	28	65.95	52	151.89
5	16.48	29	70.27	53	152.76
6	17.11	30	77.1	54	155.45
7	17.27	31	101.45	55	157.9
8	17.55	32	101.45	56	159.0
9	20.9	33	102.6	57	160.04
10	23.13	34	116.52	58	160.36
11	27.56	35	120.63	59	161.01
12	27.56	36	121.59	60	163.75
13	29.04	37	123.28	61	164.46
14	33.24	38	123.87	62	164.5
15	46.17	39	123.87	63	166.6
16	50.14	40	125.48	64	167.13
17	51.3	41	126.03	65	167.95
18	53.91	42	126.69	66	168.47
19	53.91	43	128.24	67	168.67
20	55.8	44	130.34	68	170.35
21	57.32	45	130.98	69	170.35
22	58.8	46	131.14	70	171.63
23	62.42	47	132.39	71	172.0
24	62.73	48	141.85

실시예 8

SLF (pH 7.4) 내 화학식I의 화합물의 용해도 평가

사용 물질:

NaCl : RFCL Limited, 인도

CaCl₂ : RFCL Limited, 인도

NaOH : RFCL Limited, 인도

과정:

SLF를 Respiratory Physiology & Neurobiology, 2008, 162, 73-79에 기반하는 방법에 의하여 제조하였다.

SLF 제조

염화나트륨 9 g, 염화칼슘 0.220 g, 및 락토스 6.5 g을 1000 mL 물에 용해하였다. 그 결과의 용액의 pH를 7.4로 조정하였다.

SLF 내 화학식 I의 화합물을 45℃와 60℃의 두 온도에서 측정하였다. 이를 위하여, 화학식 I의 화합물 1 mg을 3 mL의 SLF (2벌)에 첨가하고, 수 초동안 격렬히 교반한 후, 필요한 온도로 셋팅된 수조에서 배양하였다. 용해도를 1시간 간격으로 3시간 동안 측정하였다. 용액을 0.22 ㎛ 필터로 여과한 후, 여과액을 HPLC에 주입하였다. 적절한 검량선을 이용하여 용해도를 계산하였다.

얻은 결과가 표 3에 보인다.

온도	용해도 (㎍/mL)
온도	1 시간	2 시간	3 시간
45℃	1.3	0.9	1.2
60℃	0.6	0.7	1.3

결론:

화학식 I의 화합물은 SLF 내에서는 45℃ 및 60℃에서 불량한 용해도를 나타냈다. 또한 용해도가 시간 의존적이지 않다. 화학식 I의 화합물이 비수용성 화합물이기 때문에, 용해도를 버퍼 SLF에서 측정하였다.

실시예 9

화학식 I의 화합물의 미세입자 제형의 제조

사용 물질:

DPPC : Avanti Polar Lipids, 캐나다

메탄올 : RFCL Limited, 인도

클로로포름 : RFCL Limited, 인도

DMSO : RFCL Limited, 인도

NaCl : RFCL Limited, 인도

CaCl₂ : RFCL Limited, 인도

NaOH : RFCL Limited, 인도

락토스 모노하이드레이트 : Signet Chemical Corporation Private Ltd, 미국

유리 용기 : Merck Limited, 인도

유리 비드 : N.M.Enterprises, 인도

폴리카보네이트 막 : ISOPORE^TM,Millipore,미국

필터

폴리프로필렌 필터 : SWINNEX®, Millipore, 미국

홀더

금속 루어(leur) 자물쇠가 있는 기밀 유리 주사기

: Hamilton Company, 미국

pH 미터 : Eutech instruments, 미국

과정:

방법 A

용매 증발법( Solvent Evaporation Method )

참증 US 4877561에 근거하여 분석을 실시하였다.

유리 비이커에 화학식 I의 화합물 및 DPPC를 1:1, 1:10 및 1:20 w/w로 하여, 5 mL 클로로포름에 녹였다. 30 mL의 메탄올을 첨가하고, 상기 혼합물을 250 mL 둥근 바닥 플라스크로 옮겼다. 30 mL의 SLF을 상기 혼합물에 천천히 부었다. 회전식 증발기 (Buchi GMBH, 스위스)를 이용하여 용매를 증발시켰다. 수조를 45℃에 셋팅하고 회전을 100 rpm으로 하였다. 진공 컨트롤러를 400 mBar의 압력으로 셋팅하였다. 증발된 용매를 유리 용매 수집기 내에 수집하였다. RB 플라스크 내에 남아있는 용액은 뿌옇게 되었는데, 이는 리포솜이 형성되었음을 알려주는 것이다. RB 플라스크로부터 일정 부피의 현탁액을 SLF를 이용하여 30 mL까지 만들고, 25,000G로 4℃에서 10분동안 원심분리하였다. 이렇게 해서 얻은 펠렛을 SLF에 재현탁하고, 강렬하게 교반하고, 1.2 ㎛ 폴리카보네이트 필터로 열 한번 여과하여, 균일한 크기를 확보하고, 4℃에 보관하였다. 미세입자 제형을 광학 현미경과 전자 현미경으로 분석하였다.

방법 B

무용매 지질 자기조립법 ( Solvent free lipid self assembly method )

제형을 위한 무용매 제조 공정을 개발하는 것이 목적이다.

20 mg의 화학식 I의 화합물 및 20 mg의 DPPC (1:20 w/w)을 20 내지 30개의 유리 비드와 30 mL의 SLF를 함유하는 RB 플라스크에 첨가하였다. 혼합물을 45℃의 온도에서 1시간 동안 100 rpm으로 회전시켰다. 이렇게 해서 얻은 제형을 방법 A에 기재한 바와 같이 원심분리하고 여과하였다.

제형을 광학 현미경으로 분석하였다.

의견:

방법 A에 의하여 제조된 제형의 미세입자

(i) 화학식 I의 화합물과 DPPC를 1:1 w/w 및 1:10 w/w의 비율로 함유하는 미세입자의 제형은, 광학 현미경으로 관찰하였을 때, 약물 응집체가 있는 비균질적 및 불안정한 현탁액을 나타냈다. 미세입자가 관의 바닥에 가라 앉아 있었다.

(ii) 화학식 I의 화합물과 DPPC를 1:20 w/w의 비율로 함유하는 미세입자의 제형은, 광학 현미경으로 관찰하였을 때, 약물 응집체 없이 균질한 현탁액을 나타냈다. 관에서 미세입자가 가라앉아 있지 않았다.

(iii) 화학식 I의 화합물과 DPPC를 1:20 w/w의 비율로 함유하는 미세입자의 제형은, 광학 현미경으로 관찰하였을 때, 2 ㎛ 내지 3 ㎛ 크기의 미세입자를 보였다.

결과:

화학식 I의 화합물과 DPPC를 함유하는 미세입자의 제형은, 1:20 w/w의 약물:지질 비율을 이용하는 경우, 최적으로 형성된다.

실시예 10

실시예 9의 방법 A 및 실시예 9의 방법 B에 의한 제형에서 화학식I의 화합물의 포집 효율 및 질량 수지 결정

사용 물질:

메탄올 : RFCL Limited, 인도

DMSO : RFCL Limited, 인도

유리 기구 : Merck Limited, 인도

자동피펫 : Eppendorf GMBH, 독일

과정:

실시예 9의 방법 A 및 실시예 9의 방법 B에 의한 제형에서의 화학식I의 화합물의 포집 효율을 HPLC (Agilent, 미국)를 이용하여 분석하였다. HPLC 조건은 다음과 같다:

컬럼 : Lichrosphere® 100, RP-18e, 150 x 4.6 mm, 5 ㎛

이동상 : (a) 1000 mL 물 중 0.01 M 암모늄 아세테이트 + 0.5 % 트리메틸아민; pH는 빙초산을 이용하여 6.5로 조정함

: (b) 아세토니트릴

조성 : (a):(b) : : 50:50

런타임 : 5 분

컬럼 온도 : 25℃

주입 부피 : 20 ㎕

정체 시간 : ~ 3.5 분

용매 : 메탄올 내 20 % DMSO

화학식I의 화합물을 20% DMSO에 녹여 200 ㎍/mL 농도를 얻고 이를 대조 물질(reference standard)로 사용하였다. 실시예 9의 방법 A에 의한 제형 100 ㎕와 실시예 9의 방법 B에 의한 제형 100 ㎕를 별도로 2 mL 원심분리관에 피펫으로 옮기고, 각 관에 20 % DMSO를 900 ㎕로 첨가하였다. 관을 격렬히 교반하여 미세입자 매트릭스를 파괴하고 상기 매트릭스 내에 포집된 화학식I의 화합물의 전량을 방출하였다. HPLC에 독립적으로 주입된 샘플은 다음과 같다: 대조 물질, 실시예 9의 방법 A에 의한 제형 (미세입자 매트릭스의 파괴 후), 및 실시예 9의 방법 B에 의한 제형 (미세입자 매트릭스의 파괴 후) 피크 면적의 평균을 계산에서 고려하였다.

포집 효율을 다음 식에 의하여 결정하였다:

% 포집 = W/w x 100 여기서:

W = 미세입자 내에 결합된/포집된 약물 (화학식I의 화합물)의 양

w = 화학식I의 화합물의 초기량

질량 수지 계산을 위하여, 유리 기구, 필터, 및 제형의 제조 공정(실시예 9의 방법 A 및 실시예 9의 방법 B)에 사용된 다른 모든 실험실 기구에서 화학식I의 화합물을 회수하여 그 함량을 평가하였다. 폴리카보네이트 필터 (실시예 9의 방법 A 및 실시예 9의 방법 B)를 5 mL의 메탄올 내 20% DMSO로 세정하였다. 이 시료를 '막 잔류물(memberane residue)'로서 HPLC에 주입하였다.

제형을 제조하는데 사용된 RB 플라스크를 10 mL의 메탄올 내 20 % DMSO로 세정하였다. 이 시료를 '플라스크 잔류물(flask residue)'로서 HPLC에 주입하였다.

대조 물질을 HPLC 상에 여섯 번 주입하고, 피크 면적을 기록하였다. 표준 물질의 여섯 번 주입에 대한 상대 표준편차는 2.0 % 미만이었다. 시료를 2벌로 하여 HPLC 상에 주입하고, 피크 면적의 평균을 계산에서 고려하였다.

얻은 결과가 표 4에 보인다.

제형	% 포집	% 질량 지수
실시예 9의 방법 A	90.8	100.3
실시예 9의 방법 B	76.6	94.8

결론:

제형의 포집 효율은 실시예 9의 방법 A에 의하여 제조된 경우가 실시예 9 의 방법 B에 의하여 제조된 경우보다 상대적으로 더 우수하였다.

실시예 11

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 미세입자의 입자 크기 결정

과정:

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 미세 입자의 유체역학적 직경 및 크기 분포를 광자상관 분광기(Photon Correlation Spectroscopy, DELSA Nano, Beckmann Coulter, 미국)을 이용하여 결정하였다. 1 mL의 제형을 SLF로 10 mL 로 희석하였다. 이 용액 1 mL를 사용하여 입자 크기를 결정하였다.

결과:

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 미세 입자의 평균 입자 크기는 2 ㎛ 내지 3 ㎛이다. 각 개별 개체에서, 평균 정도의 입자 크기의 분산도는 약 0.45 내지 0.47이다.

표 5는 세개의 컷-오프(cut-off) 직경을 제공한다. D₁₀, D₅₀ 및 D₉₀입자 개체군의 10%, 50%, 및 90%의 평균 직경을 각각 나타낸다.

제형	D₁₀	D₅₀	D₉₀
실시예 9의 방법 A	1.7	3.9	7.9

결론:

화학식 I의 화합물 지질계 미세입자를 위한 용매 증발법(실시예 9의 방법A)은 1 μm 내지 10 μm 범위(표 5에 기재된 바와 같음)의 미크론 크기 입자를 생성하며, 99% 이상의 입자가 10 μm 미만의 입자 크기를 가진다 (표 6에 기재됨).

입자의 %	직경 (㎛)
90	5.6
99.4	6.1

실시예 12

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 pH 결정

과정:

pH 계기(Eutech, 미국)를 pH 4, 7 및 9의 표준 pH 버퍼에 대하여 전자적으로 표준화하였다. 실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 pH를 동일한 pH 계기를 이용하여 결정하였다.

결과:

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 pH는 6.14이다.

결론:

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 pH는 한 번의 분무화 또는 기관 점적의 30분까지의 짧은 기간 동안 약물 (화학식I의 화합물)의 투여와 생리학적으로 관련이 있다.

실시예 13

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 삼투질농도 결정

물질:

표준액 : Wheecon Instruments Private Limited

삼투압계(Osmometer) : Wheecon Instruments Private Limited

과정:

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 삼투질농도를 삼투압계를 이용하여 결정하였다. 대조 용액 290 mOsmol/kg을 이용하여 삼투압계를 표준화하였다.

결과:

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 삼투질농도는 340 mOsmol/kg.

결론:

체액의 생리학적 삼투질농도는 300 mOsmol/kg이다. 이 삼투질농도에 유의한 변화가 일어나면 질병이 발생한다. 다량의 고장성 용액(hypertonic solutions, 상당히 높은 삼투질농도) 또는 저장성 용액(hypotonic solutions, 상당히 낮은 삼투질농도)을 투여하면, 체액을 과도하게 잃거나 얻게 되어 폐동맥 및 조직의 부종 또는 탈수라는 병적 증상을 유발한다. 정상 삼투질 농도에서 에어로졸 타입으로 소량의 체액을 도입하게 되면 앞서 언급한 질환이 발전될 수 없다. 실시예 9의 방법 A에 의한 제형은 340 mOsmol/kg의 삼투질농도를 가지며 따라서 안전 한계(safe limits) 내에 있게 된다.

실시예 14

실시예 9의 방법 A에 의한 제형에서 화학식 I의 화합물의 첨가제 적합성 평가

물질:

O-링이 있는 밀봉 실링팬 : Perkin Elmer India Limited

DSC : Perkin Elmer, 미국

과정:

실시예 9의 방법 A에 의한 제형 50 ㎕를 DSC 팬에 피펫으로 주입하였다. 시료와 비어 있는 대조 팬(reference pan, 대조 표준)을 밀봉하고 Hyper DSC에 위치시켰다. 온도 프로그램은 다음과 같이 동작한다:

온도 프로그램 : 0℃ 내지 50℃

가열 속도 : 5℃/분

퍼지 가스 : 질소

유속 : 30 mL/분

결과:

화학식 I의 화합물 없이 제조된 리포좀은 41.1℃에서 흡열을 시작했다. 이러한 흡열은 리플드 겔(ripped gel)을 액정상으로 전환시키는데 기여할 수 있다. 미세입자 제형은 약 42.5℃에서 흡열을 나타냈다. 이러한 개시온도의 변화는 화학식I의 화합물과 DPPC 리포좀의 물리적 상호작용에 기인할 수 있다. 주요한 전환의 변화는 고도의 장애적 및 잘 조직된 탄수화물 사슬이 팩킹된 상태(a highly hindered well-organized hydrocarbon chain packed state)에서 일부 아실 사슬이 킹크의 존재를 보여주는 상태(a state in which some acyl chains show presence of kinks)로의 인지질 이중층의 전환을 나타낸다.

결론:

결과는 화학식I의 화합물과 DPPC 사이의 약물-첨가제 적합성 관계를 보여주었다. 버리는 피크가 없음은 물론이고 흡열 시작 온도의 유의한 변화도 없다.

실시예 15

실시예 9의 방법 A에 의한 제형에서 용매 함량의 평가

물질:

메탄올 (HPLC grade) : RFCL Limited, 인도

클로로포름 (HPLC grade) : RFCL Limited, 인도

DMSO (HPLC grade) : RFCL Limited, 인도

유리 GC-HS 비알 : Perkin Elmer India Limited

유리 기구 : Merck Limited, 인도

과정:

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 잔여 유기물 함량을 확인하기 위하여 GC-HS를 이용하여 실험을 하였다. 이 실험은 용매 증발법 (실시예 9의 방법 A)이 실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 상업적 대규모 생산에 이용될 수 있는지를 평가하였다.

블랭크(Blank) 준비 5 mL의 DMSO를 20 mL GC-HS 유리 비알에 첨가하였다. 테플론 스톱퍼(stopper)와 알루미늄 캡을 이용하여 비알을 크림핑(crimping)하였다. 그러한 비알 두개를 블랭크 주입을 위하여 준비하였다.

표준 준비: 100 mL 표준 용적 플라스크에서 10 mg의 클로로포름 및 100 mg의 메탄올의 무게를 정확하게 측정하였다. 용매를 용해하고 부피를 DMSO를 이용하여 100 mL까지 만들었다. 20 mL GC-HS 유리 비알에서 5 mL의 스톡 용액(stock solution)을 피펫으로 빼냈다. 테플론 스톱퍼(stopper)와 알루미늄 캡을 이용하여 비알을 크림핑(crimping)하였다. 그러한 비알 여섯개를 블랭크 주입을 위하여 준비하였다.

시료 준비: 5 mL의 DMSO를 20 mL GC-HS 유리 비알에 첨가하였다. 비알을 전자 저울 위에 놓고 용기의 무게를 달았다. 실시예 9의 방법 A에 의한 제형 500 ㎕를 유리 비알에 첨가하고 그 무게를 정확하게 기록하였다. 테플론 스톱퍼(stopper)와 알루미늄 캡을 이용하여 비알을 크림핑(crimping)하였다. 그러한 비알 세 개를 시료 주입을 위하여 준비하였다.

표 7은 실시예 9의 방법 A에 의한 제형에서 용매 함량을 평가하기 위한 크로마토그래프 조건 및 방법을 제공한다.

계기	가스 크로마토그래프 : 제조: Perkin Elmer 모델 번호: Clarus 500 Head space Sampler: 제조: Perkin Elmer 모델 번호: Turbo Matrix 40
컬럼	DB-1 (30 미터 X 0.53 mm, 5 μ 제조: Agilent
오븐 온도 프로그래밍:	초기 온도 40℃ (7분간 유지)에서 200℃ (5 분 유지) 20℃/분의 비율.
주입 온도	220℃
Detector	Flame Ionization Detector
Detector 온도	250℃
Detector 범위	1
Detector 감쇠(Attenuation):	5
캐리어 가스	헬륨
캐리어 유량	2.3 psi
분리비(Split ratio)	1 : 10
런 타임	20 분
정체 시간	클로로포름 ~ 3 분 메탄올 ~ 11 분 DMSO ~ 14 분
온도 제어 온도 (Thermo stating Temperature)	90℃
바늘 온도	95℃
이송 라인 온도	100℃
가압 시간	1.0 분
온도 제어 시간 (Thermo stating time)	15 분
GC Cycle 시간	30 분
주입 시간	0.07 분
인출 시간	0.20 분

결과:

표 8은 실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 용매 함량 및 포집에 대한 증발 시간의 효과를 세분화하여 보여준다.

시간	메탄올 (ppm)	클로로포름 (ppm)	% 포집	% 질량 지수
1 시간 증발	9734.1	0.0	92.1	100.1
2 시간 증발	2742.0	0.0	91.7	99.1
3 시간 증발	1464.7	0.0	85.0	92.4

의견:

2시간의 증발 시간은 실시예 9의 방법 A에 의한 제형에서의 용매 함량, 원하는 포집 및 질량 수지 특성을 낮춘다는 것을 관찰하게 하였다. 또한, API 용매 함량 약학적 제품을 위한 API 용매 함량 및 허용가능한 일일 노광 한도에 있어서, GC-HS에 의하여 검출된 잔여 용매 함량은 각 개별 용매를 위한 허용 한도(허용된 일일 노광 한도는 클로로포름은 60 ppm이고 메탄올은 3000 ppm (ICH 품질 가이드라인, 불순물: 잔여 용매의 가이드 라인, Q3C(R5), Feb 2011 ) 보다 작다.

결론:

용매 증발법 (실시예 9의 방법 A)을 이 제형을 개발하기 위한 적절한 방법으로 고려할 수 있다.

실시예 16

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 분무화

물질:

트윈 스테이지 집진기 유닛(Twin Stage Impinger Unit)

: Copley Scientific, 영국

분무기 : DeVILBISS® Sunrise Medical, 미국

메탄올 : RFCL Limited, 인도

DMSO : RFCL Limited, 인도

HPLC : Agilent, 미국

전자 저울 : Denver Instruments, 미국

과정:

본 연구에서 TSI 유닛을 사용하였으며, 이는 사용 설명서에 따라 조립하였다. TSI는 인간 폐 기관의 시험관내 유리 모델 이며, 폐로의 약물 증착 가능성을 시험관내에서 수량화하는데 이용된다.

TSI의 진공 펌프를 켜고, 유량계를 사용하여 시스템의 유량을 정확하게 체크하였다. 진공 펌프 상의 유량 밸브를 조정하여 유량 사양(28.3 L/min)을 정확히 한다. 공기 흐름을 보정한 후, 전체 유닛을 분해하였다. 7 mL의 메탄올을 상부 집진기로 첨가하고 20 mL 메탄올을 하부 집진기로 첨가하였다. TSI 유닛을 사용 설명서에 따라 다시 조립하였다.

실시예 9의 방법 A에 의한 제형 5mL를 분무기의 약물 컵(medication cup)에 첨가하였다. 분무기의 입구를 TSI의 입구에 붙였다. 모든 부분을 꼭 맞게 하여 진공 손실이 없도록 하였다.

TSI의 진공 펌프를 작동시켜 공기 흐름을 균일하게 하였다. 30초 후에, 분무기를 작동시켰으며, 작동 시작 시간을 기록하였다. 정확히 5분 후, 분무기를 중지시켰다. 펌프를 끈 후 30초동안 펌프를 더 작동시키게 했다. 상부 집진 챔버는 목구멍과 상부 기도를 모방하고 하부 집진 챔버를 폐포를 모방한다.

메탄올을 세정 용매로 사용하였으며, 상부 및 하부 집진 챔버의 내용물을 적절한 표준 용적 플라스크에 수집하였다. 20% DMSO를 첨가하여 화학식 I의 화합물을 용해시키도록 하였다. 용적 플라스크의 최종 부피는 메탄올로 만들었다. 상기 실험을 여섯 조(bath)의 제형 및 두 조(bath)의 제형화되지 않은 화학식I의 화합물을 이용하여 반복 실시하였다.

시료를 다음에서 시작하는 여러 농도에서 평가하였다:

실시예 9의 방법 A에 의한 제형 5 mL 내의 화학식 I의 화합물 0.5 mg - 시료 1;

실시예 9의 방법 A에 의한 제형 5 mL 내의 화학식 I의 화합물 1 mg - 시료 2;

실시예 9의 방법 A에 의한 제형 5 mL 내의 화학식 I의 화합물 2.5 mg - 시료 3;

실시예 9의 방법 A에 의한 제형 5 mL 내의 화학식 I의 화합물 5 mg - 시료 4; 및

제형화되지 않은 화학식 I의 화합물 100 ㎍/mL (화학식 I의 화합물만) - 시료 5.

본 연구를 실시하여 시험관내 약물 증착에 대한 농도의 효과를 알아보았다. 본 연구를 추가로 계속하여 분무화 공정에서 손실되어 분무기 내에 남겨진 약물(화학식 I의 화합물)의 양을 평가하였다.

TSI의 상부 및 하부 집진 챔버 내에 증착된 화학식 I의 화합물을 구배 펌프 및 자동 샘플러가 설치된 HPLS에 의하여 분석하였다. HLPC 분석에서 이용된 크로마토그래피 조건은 표 9에 제공되어 있다.

컬럼	Lichrosphere® 100, RP-18e, 150 x 4.6 mm, 5 ㎛
이동상	A) 1000 mL 물 내의 0.01M 암모늄 아세테이트 + 0.5 % 트리에틸아민; pH는 빙초산을 이용하여 6.5로 조정함 B) 아세토니트릴
조성	A : B :: 50 : 50 (등용매성)
런 타임	5 분
컬럼 온도	25℃
주입 부피	20 ㎕
정체 시간	~ 3.5 분
용매	메탄올 내 20 % DMSO

화학식 I의 화합물 100 ㎍/mL (화학식 I의 화합물 2.5 mg을 메탄올 내 20% DMSO에 녹임)을 표준 물질로 사용하였다.

표준 물질을 HPLC 상에 여섯 번 주입하고, 피크 면적을 기록하였다. 표준 물질의 여섯 번 주입에 대한 상대 표준편차는 2.0 % 미만이었다. 시료를 2벌로 하여 HPLC 상에 주입하고, 피크 면적의 평균을 계산을 위하여 고려하였다.

결과:

TSI의 상부 및 하부 집진기 내에서 다양한 시료(시료 1 내지 6)에 의하여 증착된 화학식 I의 화합물 백분율(%)이 표 10에 제공되어 있다.

시료	화학식 I의 화합물 증착 백분율(%)
	상부 집진기	하부 집진기	계
시료 1	4.5	13.4	17.9
시료 2	5.8	10.4	16.2
시료 3	2.6	7.8	10.5
시료 4	1.4	3.7	5.1
시료 5	0.0	0.0	0.0

(B) 분무화 컵 내에서 (분무화 공정 중에) 손실된 화학식 I의 화합물의 양(㎍)이 표 11에 제공되어 있다.

시료	분무화 컵 내에서 손실된 화학식 I의 화합물 (㎍)	포집된 화학식 I의 화합물의 보유 백분율(%)
시료 1	222.9	56
시료 2	580.9	42
시료 3	1706.2	32
시료 4	3146.7	37
시료 5	5000.0	0

의견:

1 mg/mL 및 2.5 mg/mL의 농도로 분무화될 때의 상기 제형은 분무화 컵 내로 도입된 화학식 I의 화합물의 초기량의 약 16% 및 10% 증착하였다. 화학식 I의 화합물의 최소 저해 농도는 0.125 μg/mL 내지 5 μg/mL 범위 내에 있다 (PCT 공개 WO2011027290). 증착된 화학식 I의 화합물의 양은 충분하며, 시험관내 모델에서 상기 최저 저해 농도보다 높다. 이러한 결과는 화학식 I의 화합물 제형 농도 1 mg/mL 및 2.5 mg/mL가 생체내 연구에서 평가받아야 하는 농도일 수 있다는 것을 알려준다. 1 mg/mL보다 낮은 농도에서는, 증착된 화학식 I의 화합물의 퍼센트가 더 높으나, 그 양은 크지 않으며, 반면에 5 mg/mL의 농도에서는, 상당한 양의 화학식 I의 화합물이 분무화 컵 내에서 다시 보유되어 화학식 I의 화합물을 낭비하게 된다.

결론:

상기 결과는, 실시예 9의 방법 A에 의한 제형이 시험관내 폐 모델에서 TSI내에 상당한 양의 화학식 I의 화합물을 증착시킬 수 있으며, 반면에 비제형화된 화학식 I의 화합물은 분무화시 TSI 내에 증착되지 않는다는 것을 확실히 알려준다. 따라서, 실시예 9의 방법 A에 의한 제형은 화학식 I의 화합물의 흡입-기반 운반용(for inhalation-based delivery)으로 이용될 수 있다.

미세입자 제형의 생물학적 평가

시험관내 평가

실시예 17

미생물 분석

참증 (Nathan P et al, 1978, Laboratory Methods for Selection of Topical antimicrobial Agents to treat infected Burn Wounds, Burns 4: 177-187)을 기반으로 하여 분석을 실시하였다.

(A) 분석에 사용된 세균 테스트 모델:

Staphylococcus aureus 209P (MSSA)

Staphylococcus aureus ATCC 33591 (MRSA)

Enterococcus faecium R-2 (VRE)

(B) 접종 준비

크리오바이알에서의 배양액을 TSA 사면 배지에 스트리킹(streaking) 하고, 37℃ 에서 18 내지 24 시간 동안 배양하였다. 사면 식염성 현탁물 상의 성장물을 이용하여 준비하였으며, 광학 밀도를 560 nm에서 0.3 units으로 조정하였다 (~10⁸CFU/ml).

(C) 시료 준비

분석에서 시험한 시료는 다음과 같다:

(i) 시료 1: 실시예 9의 방법 B에 의한 제형의 비여과된 현탁액

(ii) 시료 2: 실시예 9의 방법 B에 의한 제형의 여과된 현탁액 (0.22 ㎛ 필터로 여과한 후)

(iii) 시료 3: 메탄올 균열법(methanol disruption method)에 의하여 제조된 시료: 시료 2를 동량의 메탄올과 혼합하고 1시간 동안 배양하였다. 이 용액의 희석액을 메탄올 내에서 제조하여, 방출된 화학식 I의 화합물의 효능을 평가하기 위하여 사용하였다.

(iv) 시료 4: 비제형화된 화학식 I의 화합물 (1:80의 비율로 메탄올 클로로포름에 녹인 화학식 I의 화합물)

본 분석에서 평가된 시료 1, 2, 3, 및 4의 농도는 다음과 같다: 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56, 0.78, 0.39 및 0.195 ㎍/mL.

(D) 분석 과정:

(B)에서 얻은 시험 배양액의 접종 현탁액 40 ㎕을 100 mL 용적 멸균 원뿔 플라스크 내의 40 mL의 용융된 TSA 버트(butt) (38℃ 내지39℃에서 유지) 각각 넣고, 균일한 혼합을 위하여 와류교반하였다. 접종시킨 버트를 페트리 평판(150 mm 외경)에 부어 약 30분동안 고정시켰다. 완전한 고정을 위하여 평판을 4℃ 내지 8℃에서 보관하였다. 필요한 수의 웰(직경 6 mm)을 상기 고정된 배지에서 펀칭하였다. 50 ㎕의 시료 1, 시료 2, 및 시료 3을 평판에서 해당 웰에 첨가하였다. 확산을 위하여 저온 (2℃-8℃)에서 약 30분 동안 예비-배양하였다. 이어서 평판을 37℃에서 18 내지 24 시간 동안 배양하였다. 반코마이신 20 ㎍/mL을 표준 항생제로 사용하였다. 다양한 시료의 활성 결과를 mm 단위의 저지 존(inhibition zone)의 크기로 해석하였다.

결과:

시료 3은 100 ㎍/mL 내지 0.78 ㎍/mL에서 클리어 존(clear zone)을 보였으며, 시료 4는 100 ㎍/mL 내지 0.39 ㎍/mL에서 클리어 존을 보였다.

시료 2의 (존 크기에 관함) 활성은 시료 1보다 우수한데, 이는 시료 2가 12.5㎍/ml에서 저지 클리어 존을 보인 반면에 시료 1은 25㎍/ml에서 클리어 존을 보였기 때문이다.

시료 3에서, 화학식 I의 화합물의 존 크기는 비제형화된 화학식 I의 화합물 (시료 4)보다 작다. 이는 지질 제형으로부터 화학식 I의 화합물의 방출이 느린 것에 기인한다.

결론:

실시예 9의 방법 B에 의한 제형 (시료 3)로부터 방출되는 화학식 I의 화합물의 활성은 비제형화된 화학식 I의 화합물(시료 4)에 비교되고, 따라서 체내 시험 및 평가를 위하여 이용할 수 있다.

실시예 18

체내 세포적합성(cytocompatibility) 평가

참증 Journal of Biomedical Materials Research, 2009, 89A, 281-292에 기반하여 분석을 실시하였다.

본 분석을 실시하여 관련 세포주 및 조절 기관에 의하여 특정화된 표준 세포에 대한 실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 세포적합성을 평가하였다.

평가 세포주

MRC5 (폐 섬유아세포 세포주)

A549 (악성 종양에서 단리한 유형 II 폐포 세포주)

L929 (마우스 섬유아세포 세포주, ASTM 표준)

실험 세부사항:

세포 밀도: MRC 5 및 L292 에서 10,000/웰과 A549에서 3000/웰

시간: 24 시간과 48시간.

평가 농도:

실시예 9의 방법 B에 의한 제형의 미세입자는 1, 0.7, 0.3, 0.1 mg/mL - 시료 1

화학식 I의 화합물, DPPC가 없는 미세입자는 0.3, 0.1 mg/mL - 시료 2

화학식 I의 화합물만 있는 경우에 0.1, 0.01 mg/mL - 시료 3

과정:

Promega의 CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay Cat.no: G3582)을 이용하여 세포독성(toxicological) 평가를 실시하였다. 분석법은 증식 또는 세포독성 분석에서 생균수를 결정하기 위한 표준 비색 방법이다. 분석에 이용된 MTS는 조직 배양 배지에 용해된 채색된 포르마잔(formazan) 생성물 내의 세포에 의하여 생체환원된다. 490 nm 흡광도에 의하여 측정된 포르마잔 생성물의 양은 배양액의 생균수에 정비례한다.

간단하게는, 세포주를 96-웰 플레이트에 세 벌로(in triplet) 하여 도말하고, 24시간 동안 부착하여 증식하게 했다. 세포 부착 24시간 후, 화합물을 첨가하였다. 세포 도말(plating) 후 48시간에, 배지를 100 μL의 신선한 배지로 교환하여 분석을 종료하고, 20 μL의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (Promega, Cat.no: G3582)을 첨가하였다. 또한 100 μL의 배양 배지 및 20 μL의 "One Solution"을 함유하는 "비-세포" 대조군을 세 벌(in triplet)을 설정하여 분석에 있어서 대조군으로서 유지하였다. 색을 전개시기키 위하여 평판을 30분 내지 4 시간 동안 배양하였다. 이어서, ELISA 96-웰을 96-웰 평판 리더(reader)로 490 nm (450-540 nm)에서 흡광도 기록을 하였다. 다른 모든 흡광도 값들에서 "비-세포" 대조군의 490 nm 평균 흡광도를 감산하였고, 추가 계산을 위하여 보정된 흡광도를 이용하였다. "비-세포" 대조군에서의 배경 흡광도(background absorbance)는 4시간 배양 후 일반적으로 0.2 내지 0.3의 흡광도 (absorbance unit)이다.

결과:

시료 1의 존재하에 평가한 모든 세포주의 생존도(Viability)는 98% 이상이었다. 세포주의 형태는 변하지 않았고 단일층 컨플루언스(monolyer confluence)가 존재했다. 이것은 시료 1의 평가 농도가 세포-기반 분석에서 어떠한 독성도 나타내지 않았음을 보여준다. 그러나 이의 비제형화된 화학식 I의 화합물은 모든 상이한 평가주에서 세포독성을 나타냈다. 따라서, 제형은 화학식 I의 화합물에 의하여 명백해진 독성을 제한하는 추가 장점을 가진다. 결과가 표 12에 정리되어 있다.

시료	% 세포 생존도
시료	MRC5		L929		A549
	24 시간	48 시간	24 시간	48 시간	24 시간	48 시간
시료 1	96	100	96	100	100	93
시료 2	100	100	100	100	100	100
시료 3	70	0	73	0	95	0

결론:

시료 3은 체내 부작용 및 독성을 생기게 하거나 발현시킬 가능성을 가지고 있다. 그러나, DPPC의 사용을 포함하는 시료 1에서는, 화학식 I의 화합물의 독성 가능성이 저지되고, 독성의 부재 하에서 생물학적 효능이 관찰된다.

실시예 19

시험관내 대식세포 흡수 분석

참증 Respiratory Research, 2009.10.44에 근거하여 분석을 실시하였다.

래트(rat)의 폐포 대식세포의 단리 및 배양

정당하게 윤리적 허가를 받은 후 래트에서 기관지 폐포 세척액을 채취했다. 멸균한 따뜻한 식염수를 폐에 주입한 후, 흡입(suction)하여 제거하였다. 기관지 폐포 세척액을 아이스팩(보통 도너(donor) 당 100 내지 200 mL의 기관지 폐포 세척액이 바람직함) 상으로 옮겼다. 상기 액을 250g로 10분 동안 원심분리하고 세포를 모았다. 총 10 mL의 HBSS에 세포를 재현탁하여 세포 펠렛을 모았다. 100 μL 분액을 제거하고 Wright-Giemsa 염색약으로 염색하여 세포 감별 계수(differential cell count)를 하였다. 세포 계수를 조정하고 대식세포 배양 배지 (HAM F12 medium, Amimed, 스위스)에 세포를 도말하였다. 세포 현탁액 0.5 mL를 0.5 mL의 대식세포 배양 배지를 함유하는 6-웰 조직 배양 평판 각각에 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5 % CO₂에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 부착과 세포 성장을 평가하고, 설포르다민(sulforhodamine)으로 태그된 실시예 9의 방법 A에 의한 제형으로 처리하였다. 세포를 처리한 후, 형광도를 평가하였다. 이 형광도는 폐포 대식세포에 의한 제형의 선택적 흡수에 대한 결과이다.

결과:

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 미세입자를, 처리한지 1시간 후부터 시작하여, 폐포 대식세포로 하여금 선택적으로 흡수하게 하였다. 염색은 3시간 후에는 강도가 점진적으로 포화하는 것을 보여준다. 이는 활성 흡수 및 흡수의 포화점을 나타낸다. 폐포 대식세포에 미코박테리아가 잔류하고 생존하므로, 약물이 대식세포에 도달하는 것을 확실하게 하는 것은 매우 중요하다. 설계된 실시예 9의 방법 A에 의한 미세입자 제형에 의하여, 화학식 I의 화합물이 대식세포에 도달하는 것 뿐만 아니라 대식세포에 활발하게 흡수되는 것이 분명하며, 이는 치료가 생체내에서 성공적이 될 수 있게 하므로 바람직하다.

표 12의 값으로부터 명백하듯이, 대식세포는 실시예 9의 방법 A에 의한 제형을 활발하게 흡수(화합물 농도의 점진적 증가)하고 대사(화합물 농도의 감소)한다. 유리 약물 (화학식 I의 화합물)은 활발한 흡수가 나타나지 않는다 (유리 약물의 포화 농도에서 분명함).

결론:

화학식 I의 화합물은, 지질계 미세입자 제형으로 개발되는 경우, 치료의 타겟이 되는 폐포 대식세포에 의하여 활발하게 흡수된다. 치료요법은 타겟 및 관련 세포에 활발하게 도달하는 능력을 가진다.

생체내 분석

인도, 타밀 나두(Tamil Nadu)의 CPCSEA에 의하여 출판된 현행 가이드라인에 따라, 실험에 사용되는 동물을 수용하고 사육하였다. 실험실 동물을 이용하는 과정은 인도, Mumbai, Goregaon의 Piramal Life Sciences Limited의 IAEC에 의하여 승인받았다.

실시예 20

폐 증착 연구

AAPS Journal, 2005, 7 (1), E20-E41에 보고된 바와 같이 분석을 행하였다.

언급된 참증에 따라 파일럿(pilot) 생체내 폐 증착 연구를 실시하였다. 기니아(Guinea) 돼지들을 세 그룹으로 나누었다. 그룹 1은 실시예 9의 방법 A에 의한 제형을 받았고, 그룹 2는 비제형화된 화학식 I 의 화합물을 받았고, 그룹 3는 비처리되었다(나이브(naive) 그룹). 10 mg/kg의 제형을 에어로졸화하고, 동물이 수동적으로 숨쉬게 하였다. 실시예 9의 방법 A에 의한 제형을 투여한 후에, 30분 시점에 동물을 도살시켰다. 폐를 수거하고 HPLC로 분석하였다. HPLC 조건이 표 13에 보인다.

HPLC 계	Waters Alliance HPLC
컬럼	BDS Hypersil, C18 (250 x 4.6 mm) 5㎛
이동상	A - 아세토니트릴, B - 0.5 % 포름산 pH 3.5, TEA포함
Flow	1 mL/min
구배 프로그램 (시간/%A)	0.01/20, 10/80, 13/80, 15/20, 17/20
주입 부피	50 L
컬럼 온도	25℃
파장	240 nm
정체 시간	화학식 I의 화합물 - 10.21 분

얻은 결과가 표 14에 정리되어 있다.

그룹	증착된 화학식 I의 화합물 (ng/g)
그룹 1	320 ±0.05
그룹 2	0
그룹 3	0

의견:

분무 시에, 비제형화된 화학식 I의 화합물은 폐에 도달할 수 없다. 실시예 9의 방법 A에 의한 제형은 수동적인 호흡으로 폐에 도달할 수 있었다. 동물을 더 노출하면 폐 내의 화학식 I의 화합물의 수준을 증가시킬 수 있다.

결론:

실시예 9의 방법 A에 의한 제형은 폐에 도달할 수 있다.

실시예 21

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 폐 생체이용률 결정

언급된 참증에 따라 비부 노출법(nose-only exposure)으로 인한 생체내 폐 증착 연구를 실시하였다. 기니아(Guinea) 돼지들을 두 그룹으로 나누었다. 그룹 1은 비제형화된 화학식 I의 화합물 (3 mg/kg)을 받았고, 그룹 2는 실시예 9의 방법 A에 의한 제형(3 mg/kg)를 받았다. 비제형화된 화학식 I의 화합물과 실시예 9의 방법 A에 의한 제형을 에어로졸화시키고, 분사 분무기를 이용하여 비부 노출(nose-only exposure)를 하였으며, 이 경우 분무 시간을 1시간이었다. 에어로졸 투여 후에, 동물을 에어로졸 노출 후 1시간, 2시간, 6시간, 12시간, 및 24시간에 도살하였다. 폐를 수집하고 분석하여 LC-MS에 의하여 폐에 증착된 화학식 I의 화합물 (ng/g)의 양을 평가하였다. LC-MS 조건은 아래에 구체적으로 제시되어 있다.

크로마토그래프 조건:

LC-MS 계:	Shimadzu UFLC XR - AB Sciex API4000
컬럼:	Thermo BDS, C18, 100 x 4.6 mm, 5 ㎛
이동상:	A: 5mM 암모늄 포르메이트 (pH 3.5) + 0.1 % 아세트산 B: 아세토니트릴 A: B :: 20:80 % v/v
유속:	1.0 Ml/분
주입 부피:	5.0 ㎕
극성:	양성
런 타임:	3.00 분
정체 시간:	화학식 I의 화합물: 2.11 분
추출 용매	에틸 아세테이트
재구성 용액	200 ㎕ 메탄올

소스/가스 변수:

변수	값
충돌 가스(CAD)	7.00
커튼 가스 (CUR)	25.00
이온 소스 가스 1 (GS1)	50.00
이온 소스 가스 2 (GS2)	55.00
이온 스프레이 전압 (ISV)	5500.00
캐필리(capillary) 온도	500.00

MS-MS 변수:

모 질량	생성물 질량	디클러스터링 포텐셜 (Declustering potential, DP)	입구 포텐셜 (Entrance potential, EP)	충돌 세포 출구 포텐셜 (Collision cell exit potential, CXP)	충돌 에너지 (Collision energy, CE)
1650.400 (화학식 I의 화합물)	1247.400	120.00	10.00	28.00	75.00

얻은 결과가 표 18에 정리되어 있다.

시간 간격	증착된 화학식 I의 화합물 ( ng /g)
	그룹 1	그룹 2
1 시간	1	361.89
2 시간	1	213.74
6 시간	1	217.13
12 시간	1	176.86
24 시간	1	147.55

의견:

분무 시에, 비제형화된 화학식 I의 화합물은 폐에 도달할 수 없었다. 실시예 9의 방법 A에 의한 제형은 폐에 도달할 수 있었고 24시간 동안 보유되어 있었다.

결론:

실시예 9의 방법 A에 의한 제형은 비제형화된 화학식 I의 화합물의 빈약한 생체활용도 프로파일을 극복할 수 있었다. 또한, 실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 폐 보유율 프로파일(lung retention profile)은 상기 제형을 매일 한번 흡입하기에 적절하도록 만들 수 있다.

실시예 22

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 누적 축적 평가를 하루에 한번 5일간 1 시간/일의 분무 노출 시간 동안 투여하였다.

언급된 참증에 따라 비부 노출법(nose-only exposure)에 의한 생체내 폐 증착 연구를 실시하였다. 기니아(Guinea) 돼지들을 두 그룹으로 나누었다. 그룹 1은 비제형화된 화학식 I의 화합물 (3 mg/kg)을 받았고, 그룹 2는 실시예 9의 방법 A에 의한 제형(3 mg/kg)를 받았다. 비제형화된 화학식 I의 화합물과 실시예 9의 방법 A에 의한 제형을 에어로졸화시키고, 비부 노출(nose-only exposure)을 분사 분무기를 이용하여 실시하였으며, 이 경우 분무 시간은 매일 1시간씩 5일 연속 하였으며, 여섯째날 동물을 도살하였다. 폐를 수집하고 분석하여 LC-MS에 의하여 폐에 증착된 화학식 I의 화합물 (ng/g)의 양을 평가하였다. LC-MS 조건은 실시예 21의 표 15, 16, 및 17에 제시되어 있는 바와 같다.

얻은 결과가 표 19에 정리되어 있다.

그룹	증착된 화학식 I의 화합물 ( ng /g)
그룹 1	1
그룹 2	885.59

의견:

분무 시에, 비제형화된 화학식 I의 화합물은 폐에 도달할 수 없었다. 실시예 9의 방법 A에 의한 제형은 폐에 도달할 수 있었고 24시간 동안 보유되어 있었으며, 또한 정기적인 일일 노출을 5일간 실시한 후에는 화학식 I의 화합물을 보였다.

결론:

5일간 제형(실시예 9의 방법 A에 의한 제형)로서 화학식 I의 화합물을 보유하는 폐의 능력은 치료 요법으로서 5일간 분무함으로써 이용할 수 있다.

실시예 23

실시예 9의 방법 A에 의한 제형의 투여 스케쥴을 평가

언급된 참증에 따라 비부 노출법(nose-only exposure)에 의한 생체내 폐 증착 연구를 실시하였다. 기니아(Guinea) 돼지들을 세 그룹으로 나누었다. 그룹 1은 비제형화된 화학식 I의 화합물(3 mg/kg)을 받았고; 그룹 2는 실시예 9의 방법 A에 의한 제형(3 mg/kg)를 하루에 한번 하루 동안 받았고, 그룹 3는 실시예 9의 방법 A에 의한 제형(3 mg/kg)를 하루에 두번 하루 동안 받았다. 비제형화된 화학식 I의 화합물과 실시예 9의 방법 A에 의한 제형을 에어로졸화시키고, 분사 분무기를 이용하여 비부 노출(nose-only exposure)을 하였다. 동물을 도살하고, 폐를 수집하고 분석하여 LC-MS에 의하여 폐에 증착된 화학식 I의 화합물 (ng/g)의 양을 평가하였다. LC-MS 조건은 실시예 21의 표 15, 16, 및 17에 제시되어 있는 바와 같다.

얻은 결과가 표 20에 정리되어 있다.

그룹	증착된 화학식 I의 화합물 ( ng /g)
그룹 1	0
그룹 2	361.89
그룹 3	1210.8

의견:

분무 시에, 비제형화된 화학식 I의 화합물은 폐에 도달할 수 없었다. 실시예 9의 방법 A에 의한 제형은 폐에 도달할 수 있었고, 폐에 의하여 흡수된 화학식 I의 화합물의 양은 하루에 투여량이 2배가 됨에 따라 증가하였다.

Microbial Type Culture Collection

MTCC5447

20080915

Claims

화학식 I의 화합물과 약물 운반용 생분해성 지질을 포함하며 약물(화학식 I의 화합물) 대 지질의 비가 1:15 내지 1:25이고; 생분해성이며 흡입가능한 미세입자 제형:
[화학식 I]
제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 제형의 1% 내지 5%(w/w)를 차지하는 미세입자 제형.
제1항 또는 2항에 있어서, 상기 생분해성 지질이 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)인 미세입자 제형.
제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세입자의 입자 크기가 0.5 내지 10 마이크론 사이의 범위에 있는 것인 미세입자 제형.
제4항에 있어서, 미세입자의 적어도 90%가 10 마이크론 미만의 입자크기를 갖는 것인 미세입자 제형.
제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 수성 리포좀 분산액(aqueous liposomal dispersion)인 미세입자 제형.
제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형의 pH가 6 내지 7 범위에 있는 것인 미세입자 제형.
제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형의 상전이 온도의 범위가 41℃ 내지 43℃인 미세입자 제형.
제1항에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물과 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)을 포함하며, 약물(화학식 I의 화합물) 대 DPPC의 비가 1:1 내지 1:20인 미세입자 제형의 제조 방법으로서, 다음 단계:
(a) 클로로포름 3 ㎖ 내지 15 ㎖에 화학식 I의 화합물과 DPPC (1:1 내지 1:20 비율)을 용해시켜 용액을 수득하는 단계;
(b) 메탄올 20 ㎖ 내지 45 ㎖를 단계 (a)의 용액에 가하고 균질성이 보장되도록 잘 혼합하는 단계;
(c) 시뮬레이션화한 폐 유액(SLF) 20 ㎖ 내지 50 ㎖를 상기 단계 (b)의 용액에 가하는 단계;
(d) 용매를 증발시키는 단계;
(e) 상기 단계 (d)에서 수득한 용적을 SLF를 사용하여 30 ㎖로 만들고 15000 G 내지 35000 G에 4 ℃에서 10분간 원심분리시켜 펠릿을 수득하는 단계;
(f) 상기 단계 (e)에서 수득한 펠릿을 SLF에 다시 현탁시켜 농도가 0.5 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖인 현탁액을 수득하는 단계; 및
(g) 상기 단계 (f)에서 수득한 현탁액을 0.5 ㎛ 내지 5 ㎛ 폴리카보네이트 필터를 통하여 여과하여 균일한 입자 크기로 형성된 미세입자를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 미세입자의 입자 크기의 범위가 0.5 내지 10 마이크론인 방법.
제10항에 있어서, 상기 미세입자의 적어도 90%가 10 마이크론 미만의 크기를 갖는 것인 방법.
제1항에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물과 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)을 포함하며, 약물(화학식 I의 화합물) 대 DPPC의 비가 1:1 내지 1:20인 미세입자 제형의 제조 방법으로서, 다음 단계:
(i) 시뮬레이션화한 폐 유액(SLF) 20 ㎖ 내지 45 ㎖를 화학식 I의 화합물과 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)의 혼합물 (1:1 내지 1:20 비율)에 첨가하는 단계;
(ii) 상기 단계 (i)의 혼합물을 45 ℃에서 1시간 동안 100 rpm 내지 200 rpm 회전시켜 현탁액을 수득하는 단계;
(iii) 상기 단계 (ii)에서 수득한 현탁액을 15000 G 내지 35000 G에 4 ℃에서 10분간 원심분리시켜 펠릿을 수득하는 단계;
(iv) 상기 단계 (iii)에서 수득한 펠릿을 SLF에 다시 현탁시켜 농도가 0.5 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖인 현탁액을 수득하는 단계; 및
(v) 상기 단계 (iv)에서 수득한 현탁액을 0.5 ㎛ 내지 5 ㎛ 폴리카보네이트 필터를 통하여 여과하여 균일한 입자 크기로 형성된 미세입자를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 청구된 바와 같은 미세입자 제형을 이를 필요로 하는 포유동물에게 흡입에 의해 투여함을 특징으로 하여, 폐결핵, 다제내성 결핵, 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (methicillin resistant Staphylococcus aureus) 폐렴 또는 메티실린 감응성 스태필로코커스 아우레우스 폐렴을 치료하는 방법
제13항에 있어서, 상기 방법이 폐포 대식세포를 표적으로 하는 것인 방법.
제1항에 청구된 바와 같은 미세입자 제형을 이를 필요로 하는 포유동물에게 운반하는 방법으로서, 제형을 폐로의 운반을 위하여 흡입 또는 기관점적법에 의해 포유동물에게 투여하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 제형을 흡입에 의해 투여하는 방법.
제16항에 있어서, 흡입에 의한 제형의 투여가 약물(화학식 I의 화합물)이 미세입자에 포집되는 분무화(nebulization)에 의해 수행되는 방법.
제17항에 있어서, 상기 포집된 화학식 I의 화합물의 보유율 범위가 30% 내지 70%인 방법.
제16항에 있어서, 상기 흡입에 의해 투여되는 제형중에 포함되어 있는 약물(화학식 I의 화합물)이 24시간의 기간에 걸쳐 폐에 보유되는 방법.
제16항에 있어서, 상기 흡입용 투여량 범위가 0.05 내지 10 ㎎/체중 ㎏/일인 방법.
제13항에 있어서, 상기 방법이 비-침습적인(non-invasive) 방법.
폐결핵, 다제내성 결핵, 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (methicillin resistant Staphylococcus aureus) 폐렴 또는 메티실린 감응성 스태필로코커스 아우레우스 폐렴을 치료하기 위한, 화학식 I의 화합물과 약물 운반용 생분해성 지질을 포함하며 약물(화학식 I의 화합물) 대 지질의 비가 1:15 내지 1:25인 미세입자 제형의 용도.
폐결핵, 다제내성 결핵, 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (methicillin resistant Staphylococcus aureus) 폐렴 및 메티실린 감응성 스태필로코커스 아우레우스 폐렴 치료용 약제의 제조를 위한, 화학식 I의 화합물과 약물 운반용 생분해성 지질을 포함하며 약물(화학식 I의 화합물) 대 지질의 비가 1:15 내지 1:25인 미세입자 제형의 용도.
폐결핵, 다제내성 결핵, 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (methicillin resistant Staphylococcus aureus) 폐렴 또는 메티실린 감응성 스태필로코커스 아우레우스 폐렴의 치료를 위한, 화학식 I의 화합물과 약물 운반용 생분해성 지질을 포함하며 약물(화학식 I의 화합물) 대 지질의 비가 1:15 내지 1:25인 미세입자 제형.