CN117899020A - 一种载抗生素黏液渗透型脂质体粉雾剂的制备方法及其应用 - Google Patents

一种载抗生素黏液渗透型脂质体粉雾剂的制备方法及其应用 Download PDF

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本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种载抗生素黏液渗透型脂质体粉雾剂的制备方法及其应用。本发明提供了一种黏液渗透型脂质体，包括脂质体材料和药物。通过添加保护剂并通过USFD制得干粉，其呈多孔球形结构，密度低，易于分散，细粒子分数高，空气动力学中位粒径(MMAD)＜5μm，有着较好的肺部沉积率。载药黏液渗透型脂质体通过嵌入于USFD干粉中，可以有效的沉积于下呼吸道。在细菌生物膜感染位点，载药脂质体可以吸附并中和细菌生物膜释放的毒素，减少毒素对于机体细胞(如巨噬细胞，上皮细胞，内皮细胞等)的毒性。与此同时，生物膜毒素能引起脂质体结构被破坏使得药物在生物膜处精准释放，从而发挥清除细菌生物膜的作用。

Description

一种载抗生素黏液渗透型脂质体粉雾剂的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种载抗生素黏液渗透型脂质体粉雾剂的制备方法及其应用。
背景技术
囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺病(COPD)等慢性肺疾病引起的气道黏液功能障碍和免疫防御功能受损会增加肺部细菌感染的发病率，增加细菌在肺部定植形成生物膜的概率。生物膜中的细菌生活在自身产生的高分子胞外基质中，这种基质主要由蛋白质、多糖、核酸和脂质组成，能够保护嵌入的细菌免受恶劣环境和抗生素治疗的影响。与游离菌相比，生物膜中的细菌由于抗生素渗透减少、合成降解酶、产生低代谢或持久性细菌等原因，对抗生素的耐药性提高1000倍。因此，用于控制游离细菌感染的传统抗生素疗法通常很难根除细菌生物膜。
临床常用的口服或静脉注射抗生素治疗肺部感染的疗法通常需要高剂量才能在感染位点达到有效的药物浓度，并伴有严重的副作用。经口吸入疗法可将抗生素直接输送到肺感染部位，在低剂量下仍能取得较好的疗效。雾化吸入剂和干粉吸入剂(DPI)是两种常用的给药方式，后者具有良好的理化稳定性、便携性、给药装置简单易操作以及无需严格消毒等优点，对患者更为友好。遗憾的是，干粉气溶胶在呼吸道的沉积量较低，尤其是在下呼吸道，大部分气溶胶颗粒沉积在咽喉部或被呼出。因此，减少干粉在咽喉部的损失并改善其在肺部的沉积是一项挑战。超声波喷雾冷冻干燥(USFD)是一种很有前景的干燥技术，与传统干粉气溶胶相比，USFD生产的干粉具有相对较大的几何粒径、较低的粉体密度和多孔的球形结构，因此具有良好的分散性、雾化效果和较高的肺部沉积率。
尽管USFD干粉在肺部的沉积效果令人满意，但沉积在肺上皮表层气道黏液上的气溶胶微粒容易被黏液纤毛清除或咳嗽排除，大大降低了沉积微粒在肺部的滞留率。此外，肺部的生物膜通常嵌入于肺黏液或痰液中，因此除了生物膜屏障外，气道黏液也是抗生素到达感染位点的重要阻碍。气道黏液的屏障特性源于黏液网络的物理阻碍以及颗粒与黏液成分的相互作用，可以通过疏水和静电相互作用与纳米颗粒接触，抑制其深入黏液。黏液渗透性纳米粒(MPP)通常有着电荷中性的、高度亲水的表面，从而最大限度地减少了静电和疏水相互作用，从而改善黏液渗透。因此，含有黏液渗透性纳米粒的干粉气溶胶可以快速渗透肺黏液，在感染位点释放发挥疗效，使其成为抗生素载体以清除肺部生物膜感染的有效策略。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种载药脂质体。
本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的载药脂质体的制备方法。
本发明第三方面的目的，在于提供一种黏液渗透型脂质体干粉。
本发明第四方面的目的，在于提供本发明第三方面的黏液渗透型脂质体干粉的制备方法。
本发明第五方面的目的，在于提供一种应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种药物。
为了实现本发明的目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种载药脂质体，包括以下原料：脂质体材料和药物。
优选地，所述脂质体材料包括聚乙二醇、磷脂、胆固醇中的至少一种。
优选地，所述聚乙二醇包括磷脂酰胆碱-聚乙二醇(PC-PEG)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(PE-PEG)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、二硬脂酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇(DSPC-PEG)中的至少一种。
优选地，所述磷脂包括蛋黄卵磷脂(EPC)、卵磷脂酰甘油(EPG)、卵磷脂酰肌醇(EPI)、卵磷脂酰丝氨酸(EPS)、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、氢化卵磷脂酰甘油(HEPG)、氢化卵磷脂酰肌醇(HEPI)、氢化卵磷脂酰丝氨酸(HEPS)、氢化磷脂酰乙醇胺(HEPE)、磷脂酸(HEPA)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、氢化大豆磷脂酰甘油(HSPG)、氢化大豆磷脂酰丝氨酸(HSPS)、氢化大豆磷脂酰肌醇(HSPI)、氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)、氢化大豆磷脂酸(HSPA)中的至少一种。
优选地，所述磷脂包括氢化大豆卵磷脂(HSPC)、蛋黄卵磷脂(EPC)中的至少一种。
优选地，所述固醇包括胆固醇、羊毛固醇、谷甾醇、豆固醇、麦角固醇中至少一种；优选地，所述脂质体材料包括：氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、胆固醇、和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
优选地，所述氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、胆固醇、和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的摩尔比为(20-55)：(15-35)：(40-60)：(5-8)。
优选地，所述药物包含亲水性药物和疏水性药物。
优选地，所述药物包括抗生素。
优选地，所述抗生素包括青霉素、头孢酶素、阿莫西林、克拉维酸、红霉素、吉他霉素、麦迪霉素、罗红霉素、螺旋霉素、克拉霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、泰拉霉素、替米考星、克林霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、安普霉素、新霉素、大观霉素、阿米卡星、奈替霉素、杆菌肽、多粘菌素、金霉素、土霉素、四环素、多西环素、氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、万古霉素、培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星、二氧沙星、磺胺嘧啶中的至少一种。
优选地，所述抗生素包括多粘菌素和环丙沙星中的至少一种。
优选地，所述抗生素包括多粘菌素和环丙沙星。
优选地，所述药物的用量为每mg脂质体材料载0.1mg-1mg药物。
优选地，所用PEG为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
优选地，所用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000在总脂质体材料中的摩尔比例为5-8％。
优选地，所述载药脂质体表面采用高密度PEG修饰。
优选地，所述高密度PEG修饰具体为黏液渗透型脂质体干粉的RF/D＞2。
优选地，所述RF为PEG的Flory半径。
优选地，所述D为载药脂质体表面上两个最接近的PEG链之间的平均分离距离。
优选地，所述载药脂质体的粒径为50-150nm。
优选地，所述载药脂质体的电位为-25～0mV。
优选地，所述载药脂质体的载药量为2-15％。
优选地，所述载药脂质体的包封率为50-95％。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面的载药脂质体的制备方法，其特征在于：
若负载药物为疏水性药物时，包括以下步骤：
1)将脂质体材料和疏水性药物加入至有机溶剂，使其完全溶解；
2)除去有机溶剂形成薄膜；
3)加入水化介质水化薄膜；
4)超声处理水化后溶液，过滤；
5)去除游离药物，得到载药脂质体。
若负载药物为亲水性药物时，包括以下步骤：
1)将脂质体材料入至有机溶剂，使其完全溶解；
2)除去有机溶剂形成薄膜；
3)加入水化介质和亲水性药物水化薄膜；
4)超声处理水化后溶液，过滤；
5)去除游离药物，得到载药脂质体。
若负载药物为疏水性药物和亲水性药物时，包括以下步骤：
1)将脂质体材料和疏水性药物加入至有机溶剂，使其完全溶解；
2)除去有机溶剂形成薄膜；
3)加入水化介质和亲水性药物水化薄膜；
4)超声处理水化后溶液，过滤；
5)去除游离药物，得到载药脂质体。
若通过主动载药或膜吸附原理负载药物时，包括以下步骤：
1)将脂质体材料入至有机溶剂，使其完全溶解；
2)除去有机溶剂形成薄膜；
3)加入水化介质和水化薄膜；
4)超声处理水化后溶液，过滤；
5)去除外水相的介质，与药物孵育得到载药脂质体。
优选地，步骤1)中有机溶剂选自乙醇、甲醇、乙醚、氯仿、二氯甲烷、乙腈、丙酮、含3-20个碳原子的链状、环状或者芳香类烃、醇、胺、醚、酯、酮、醛、酸中的一种或者多种。
优选地，步骤1)中有机溶剂包括氯仿。
优选地，步骤3)中水化介质选自水、葡萄糖水溶液、葡萄糖氯化钠水溶液、磷酸盐水溶液、醋酸盐水溶液、蔗糖水溶液、硫酸铵水溶液中的至少一种。
优选地，步骤3)中水化的温度为50～65℃，时间为20～60分钟。
优选地，步骤4)中超声功率为100～200w，超声工作时间为2～5分钟。
优选地，步骤5)中除去游离药物和/或外水相的介质的方法包括透析；
优选地，所述透析的时间为2-5小时，透析袋分子截留率为8-14kDa。
本发明第三个方面的目的，提供一种黏液渗透型脂质体干粉，包括本发明第一个方面的载药脂质体。
优选地，所述黏液渗透型脂质体干粉还包括保护剂。
优选地，所述保护剂选自海藻糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、棉籽糖、果糖、木糖醇、山梨醇、甘露醇、乙醇、甘油、丙二醇、肌醇、硫酸钠、乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、醋酸铵、氯化铵、柠檬酸、硼酸、磷酸、酒石酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、赖氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸、乙二胺四乙酸、聚乙二醇、葡聚糖、聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、明胶、果胶、阿拉伯胶、淀粉、糊精、二甲亚砜、维生素C、维生素E、抗坏血酸、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和茶多酚中的一种或多种的混合物。
优选地，所述保护剂包括蔗糖、海藻糖、L-亮氨酸、甘露醇中的至少一种。
优选地，所述保护剂包括蔗糖、甘露醇、L-亮氨酸中的至少一种。
优选地，所述保护剂的总质量在黏液渗透型脂质体干粉的质量比50-90％；
优选地，所述保护剂包括占黏液渗透型脂质体干粉的质量比为20-40％的蔗糖、和/或40-60％的甘露醇、和/或4-20％的L-亮氨酸。
优选地，所述黏液渗透型脂质体干粉的颗粒为球形或椭球形。
优选地，所述黏液渗透型脂质体干粉的粒径为15～25μm。
优选地，所述黏液渗透型脂质体干粉的密度为0.07～0.35g/cm3。
优选地，所述黏液渗透型脂质体干粉的细粒子分数为40～50％。
优选地，所述黏液渗透型脂质体干粉的空气动力学中位粒径为3～5μm。
本发明第四个方面的目的，提供本发明第三个方面的粘液渗透型脂质体干粉的制备方法，包括以下步骤，向所述载药脂质体中加入保护剂，混匀，超声喷雾冷冻干燥，得到。
优选地，超声喷雾冷冻干燥的注射泵推进速度为0.25～2mL/min，超声频率为80-120k，超声振幅可为20～80％，干燥时间为12～24小时。
本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面的载药脂质体、和/或本发明第三个方面的黏液渗透型脂质体干粉在制备治疗肺部疾病药物中的应用。
优选地，所述肺部疾病包括细菌感染、真菌感染、肺癌、肺炎、肺纤维化中的至少一种。
优选地，所述肺部相关疾病包括细菌感染。
优选地，所述细菌感染包括生物膜感染。
本发明的第六个方面，提供一种药物，包括本发明第一个方面的载药脂质体、和/或本发明第三个方面的黏液渗透型脂质体干粉。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料；
优选地，所述辅料包括填充剂、粘合剂、矫味剂、干燥剂、稳定剂、保护剂、着色剂、抗氧化剂、和缓冲剂中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种黏液渗透型脂质体，包括脂质体材料、药物。将该黏液渗透型脂质体加入保护剂，通过USFD法制得干粉后，其呈多孔球形结构，密度低，易于分散，细粒子分数高，空气动力学中位粒径(MMAD)＜5μm，有着较好的肺部沉积率。载药黏液渗透型脂质体通过嵌入于USFD干粉中，可以有效的沉积于下呼吸道。在细菌生物膜感染位点，载药脂质体可以吸附并中和细菌生物膜释放的毒素，减少毒素对于机体细胞(如巨噬细胞，上皮细胞，内皮细胞等)的毒性。与此同时，生物膜毒素能引起脂质体结构被破坏使得药物在生物膜处精准释放，从而发挥清除细菌生物膜的作用。
由于USFD干粉的多孔结构可促进黏液渗透型脂质体迅速溶解，扩散并穿透肺黏液，并在细菌生物膜感染位点响应释放抗生素，因此增加了药物递送至生物膜的效率，大大减少药物用量，在远低于临床应用药物剂量的情况下，也能够达到较好肺部生物膜感染治疗效果。
附图说明
图1为实施例中所制备的黏液渗透型空白Lips和Cipro-Col-Lips的粒径图。
图2为实施例中所制备的黏液渗透型Cipro-Col-Lips的透射电镜图。
图3为实施例中所制备的黏液渗透型Cipro-Col-Lips的储存稳定性图。
图4为实施例中所制备的黏液渗透型ANTS-DPX-Lips与细菌生物膜上清液(A)和Rhl(B)孵育后的脂质体渗漏。
图5为实施例中所制备的黏液渗透型Cipro-Col-Lips与细菌生物膜上清液共孵育后的药物释放曲线。
图6为实施例中所制备的黏液渗透型Cipro-Col-Lips的对细菌生物膜上清液(A)和Rhl(B)的溶血保护作用，其中，Cipro-Col-Lips简写为C-Lips。
图7中A为Rhl与实施例中所制备的不同浓度的黏液渗透型Cipro-Col-Lips(mg/mL)孵育后Rhl的中和百分比；B为RAW264.7细胞与不同浓度的Cipro-Col-Lips、Rhl共孵育后的细胞存活率，其中，Cipro-Col-Lips简写为C-Lips。
图8为A549细胞(A)和HUVEC细胞(B)在与鼠李糖脂、Cipro-Col-Lips共孵育后的活/死细胞染色；分别对A549(C)和HUVEC(D)的活细胞和死细胞进行定量分析，其中，Cipro-Col-Lips简写为C-Lips。
图9为实施例中所制备的黏液渗透型Cipro-Col-Lips和其它实验组的MIC、MBEC；其中，联用药物组使用“/”分开两种药物的MIC和MBEC，“/”左边数字代表环丙沙星的浓度0.125，4，8μg/mL、“/”右边的数字代表代表多粘菌素的浓度2，64，128μg/mL。
图10为实施例中所制备的黏液渗透型Cipro-Col-Lips和其它实验组的细菌耐药行为。
图11为实施例中所制备的黏液渗透型Cipro-Col-Lips和其它实验组的持留菌抑制情况。
图12为实施例中所制备的黏液渗透型Cipro-Col-Lips和其它实验组的生物膜活菌计数结果。
图13为实施例中载黏液渗透型Cipro-Col-Lips干粉的松密度和振实密度。
图14为实施例中载黏液渗透型Cipro-Col-Lips干粉的微观形貌。
图15为实施例中载黏液渗透型Cipro-Col-Lips干粉的复溶后脂质体粒径和粒径分布变化。
图16为实施例中载黏液渗透型Cipro-Col-Lips干粉的复溶后脂质体包封率变化。
图17为实施例中载黏液渗透型Cipro-Col-Lips干粉NGI测试中各层级的沉积率。
图18为实施例中所制备的载黏液渗透型Cipro-Col-Lips溶液和干粉在体外气道黏液模型的穿透比例。
图19为实施例中所制备的载黏液渗透型Cipro-Col-Lips干粉在气道生物膜模型上的穿透行为。
图20为实施例中所制备的载黏液渗透型Cipro-Col-Lips在气道生物膜模型上的生物膜基质(A)和细菌(B)清除能力；
图21为各实验组、对照组、健康组的造模后小鼠体重变化(A)和生存率(B)。
图22为各实验组、对照组、健康组的造模后小鼠肺内生物膜活菌计数情况。
图23为各实验组、对照组、健康组的造模后小鼠肺组织病理情况。
图24为各实验组、对照组、健康组的造模后小鼠BALF炎细胞数量、种类(A)和比例(B)。
图25为各实验组、对照组、健康组的造模后小鼠BALF细胞染色结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1一种载抗生素的黏液渗透型脂质体Cipro-Col-Lips
称取HSPC 45mg、胆固醇45mg、EPC 15mg、DSPE-PEG2000 34mg，其摩尔比为25:50:20:5，溶于4mL氯仿中，水浴加热至脂质完全溶解，用旋转蒸发仪去除有机溶剂(EYELA N-1300，Japan)，形成一层脂质薄膜。之后加入5％(w/w)蔗糖和500mM硫酸铵的混合溶液6mL，在60℃下旋转水化脂质薄膜30min，之后转移至小烧杯中。冰浴下，功率200w,探头超声(SCIENTZ-IID，China)处理15min(超1s-停2s)。将脂质体过0.45μm和0.22μm的滤膜各5次。以5％的蔗糖溶液为透析介质，使用8-14kDa(源叶生物)的透析袋透析2.5h除去脂质体外水相硫酸铵离子，透析期间不断更换透析介质。将透析后的脂质体与等体积5％(w/w)的含药蔗糖溶液(含环丙沙星5mg/mL、多粘菌素2.5mg/mL)在60℃下孵育30min得到载药脂质体Cipro-Col-Lips溶液(20mg/mL)。环丙沙星通过硫酸铵梯度法主动载药，多粘菌素通过其脂肪链插入脂质体脂膜的疏水区载药。
实施例2一种载抗生素的黏液渗透型脂质体干粉F1
向实施例1制备得到的Cipro-Col-Lips溶液中加入蔗糖保护剂，使蔗糖在溶液中浓度为15％(w/w)并混合均匀(1mL溶液含有20mg Cipro-Col-Lips脂质体、150mg蔗糖)。由精密注射泵控制脂质体溶液以1mL/min的速度送入超声雾化喷头，超声频率100k，振幅40％，雾化后液滴被喷入一个含有液氮的玻璃烧杯中凝结成为冻结颗粒。将得到的冻结颗粒在冻干机中真空干燥24h即得到黏液渗透型脂质体Cipro-Col-Lips的干粉(F1)，收集干粉于密封的小瓶中，于20℃，湿度小于5％的干燥环境中保存。
实施例3一种载抗生素的黏液渗透型脂质体干粉F2
向实施例1制备得到的Cipro-Col-Lips溶液中加入蔗糖、L-亮氨酸保护剂，使蔗糖在溶液中浓度为15％(w/w)，L-亮氨酸为2％(w/w)并混合均匀(1mL溶液含有20mg Cipro-Col-Lips脂质体、150mg蔗糖、20mg L-亮氨酸)。由精密注射泵控制脂质体溶液以1mL/min的速度送入超声雾化喷头，超声频率100k，振幅40％，雾化后液滴被喷入一个含有液氮的玻璃烧杯中凝结成为冻结颗粒。将得到的冻结颗粒在冻干机中真空干燥24h即得到黏液渗透型脂质体Cipro-Col-Lips的干粉(F2)，收集干粉于密封的小瓶中，于20℃，湿度小于5％的干燥环境中保存。
实施例4一种载抗生素的黏液渗透型脂质体干粉F3
向实施例1制备得到的Cipro-Col-Lips溶液中加入蔗糖、海藻糖保护剂，使蔗糖在溶液中浓度为5％(w/w)，海藻糖为10％(w/w)，并混合均匀(1mL溶液含有20mg Cipro-Col-Lips脂质体、50mg蔗糖、100mg海藻糖)。由精密注射泵控制脂质体溶液以1mL/min的速度送入超声雾化喷头，超声频率100k，振幅40％，雾化后液滴被喷入一个含有液氮的玻璃烧杯中凝结成为冻结颗粒。将得到的冻结颗粒在冻干机中真空干燥24h即得到黏液渗透型脂质体Cipro-Col-Lips的干粉(F3)，收集干粉于密封的小瓶中，于20℃，湿度小于5％的干燥环境中保存。
实施例5一种载抗生素的黏液渗透型脂质体干粉F4
向实施例1制备得到的Cipro-Col-Lips溶液中加入蔗糖、海藻糖、L-亮氨酸保护剂，使蔗糖在溶液中浓度为5％(w/w)，海藻糖为10％(w/w)，L-亮氨酸为2％(w/w)，并混合均匀(1mL溶液含有20mg Cipro-Col-Lips脂质体、50mg蔗糖、100mg海藻糖、20mg L-亮氨酸)。由精密注射泵控制脂质体溶液以1mL/min的速度送入超声雾化喷头，超声频率100k，振幅40％，雾化后液滴被喷入一个含有液氮的玻璃烧杯中凝结成为冻结颗粒。将得到的冻结颗粒在冻干机中真空干燥24h即得到黏液渗透型脂质体Cipro-Col-Lips的干粉(F4)，收集干粉于密封的小瓶中，于20℃，湿度小于5％的干燥环境中保存。
实施例6一种载抗生素的黏液渗透型脂质体干粉F5
向实施例1制备得到的Cipro-Col-Lips溶液中加入蔗糖、甘露醇保护剂，使蔗糖在溶液中浓度为5％(w/w)，甘露醇为10％(w/w)，并混合均匀(1mL溶液含有20mg Cipro-Col-Lips脂质体、50mg蔗糖、100mg甘露醇)。由精密注射泵控制脂质体溶液以1mL/min的速度送入超声雾化喷头，超声频率100k，振幅40％，雾化后液滴被喷入一个含有液氮的玻璃烧杯中凝结成为冻结颗粒。将得到的冻结颗粒在冻干机中真空干燥24h即得到黏液渗透型脂质体Cipro-Col-Lips的干粉(F5)，收集干粉于密封的小瓶中，于20℃，湿度小于5％的干燥环境中保存。
实施例7一种载抗生素的黏液渗透型脂质体干粉F6
向实施例1制备得到的Cipro-Col-Lips溶液中加入保护剂蔗糖、甘露醇、L-亮氨酸，使蔗糖在溶液中浓度为5％(w/w)，甘露醇为10％(w/w)，L-亮氨酸为2％(w/w)并混合均匀(1mL溶液含有20mg Cipro-Col-Lips脂质体、50mg蔗糖、100mg甘露醇、20mg L-亮氨酸)。由精密注射泵控制脂质体溶液以1mL/min的速度送入超声雾化喷头，超声频率100k，振幅40％，雾化后液滴被喷入一个含有液氮的玻璃烧杯中凝结成为冻结颗粒。将得到的小冰晶在冻干机中真空干燥24h得到黏液渗透型脂质体Cipro-Col-Lips的干粉(F6)，收集干粉于密封的小瓶中，于20℃，湿度小于5％的干燥环境中保存。
实施例8一种荧光标记的载抗生素的黏液渗透型脂质体干粉F7
称取HSPC 45mg、胆固醇45mg、EPC 15mg、DSPE-PEG2000 34mg，香豆素6(C6)0.5mg，溶于4mL氯仿中，水浴加热至脂质完全溶解，用旋转蒸发仪去除有机溶剂(EYELA N-1300，Japan)，形成一层脂质薄膜。之后加入5％(w/w)蔗糖和500mM硫酸铵的混合溶液6mL，在60℃下旋转水化脂质薄膜30min，之后转移至小烧杯中。冰浴下，功率200w,探头超声(SCIENTZ-IID，China)处理15min(超1s-停2s)。将脂质体过0.45μm和0.22μm的滤膜各5次。以5％(w/w)的蔗糖溶液为透析介质，使用8-14kDa的透析袋透析2.5h除去脂质体外水相硫酸铵离子，透析期间不断更换透析介质。将透析后的脂质体与等体积5％(w/w)的含药蔗糖溶液(含环丙沙星5mg/mL、多粘菌素2.5mg/mL)在60℃下孵育30min得到荧光标记的载药脂质体Cipro-Col-Lips-C6(20mg/mL)。
向Cipro-Col-Lips-C6加入保护剂蔗糖、甘露醇、L-亮氨酸，使蔗糖在溶液中浓度为5％(w/w)，甘露醇为10％(w/w)，L-亮氨酸为2％(w/w)并混合均匀(1mL溶液含有20mgCipro-Col-Lips脂质体、50mg蔗糖、100mg甘露醇、20mg L-亮氨酸)。由精密注射泵控制脂质体溶液以1mL/min的速度送入超声雾化喷头，超声频率100k，振幅40％，雾化后液滴被喷入一个含有液氮的玻璃烧杯中凝结成为冻结颗粒。将得到的小冰晶在冻干机中真空干燥24h得到黏液渗透型脂质体Cipro-Col-Lips-C6的干粉(F7)，收集干粉于密封的小瓶中，于20℃，湿度小于5％的干燥环境中保存。
对比例1一种空白黏液渗透性脂质体干粉
称取HSPC 45mg、胆固醇45mg、EPC 15mg、DSPE-PEG2000 34mg，其摩尔比为25:50:20:5，溶于4mL氯仿中，水浴加热至脂质完全溶解，用旋转蒸发仪去除有机溶剂(EYELA N-1300，Japan)，形成一层脂质薄膜。之后加入5％(w/w)的蔗糖溶液6mL，在60℃下旋转充分水化脂质薄膜30min，之后转移至小烧杯中。冰浴下，功率200w,探头超声(SCIENTZ-IID，China)处理15min(超1s-停2s)。将脂质体过0.45μm和0.22μm的滤膜各5次，得到空白脂质体Lips(20mg/mL)。
向脂质体溶液中加入保护剂蔗糖、甘露醇、L-亮氨酸，使蔗糖在溶液中浓度为5％(w/w)，甘露醇为10％(w/w)，L-亮氨酸为2％(w/w)，并混合均匀(1mL溶液含有20mg Cipro-Col-Lips脂质体、50mg蔗糖、100mg甘露醇、20mg L-亮氨酸)。由精密注射泵控制脂质体溶液以1mL/min的速度送入超声雾化喷头，超声频率100k，振幅40％，雾化后液滴被喷入一个含有液氮的玻璃烧杯中凝结成为冻结颗粒。将得到的冻结颗粒在冻干机中真空干燥24h即得到空白黏液渗透型脂质体Lips的干粉，收集干粉于密封的小瓶中，于20℃，湿度小于5％的干燥环境中保存。
对比例2未经高密度PEG修饰的载抗生素的脂质体Cipro-Col-Lips*
称取HSPC 45mg、胆固醇45mg、EPC 15mg，溶于4mL氯仿中，水浴加热至脂质完全溶解，用旋转蒸发仪去除有机溶剂(EYELA N-1300，Japan)，形成一层脂质薄膜。之后加入5％(w/w)蔗糖和500mM硫酸铵的混合溶液6mL，在60℃下旋转充分水化脂质薄膜30min，之后转移至小烧杯中。冰浴下，功率200w,探头超声(SCIENTZ-IID，China)处理15min(超1s-停2s)。将脂质体过0.45μm和0.22μm的滤膜各5次。以5％的蔗糖溶液为透析介质，使用8-14kDa的透析袋透析2.5h除去脂质体外水相硫酸铵离子。将透析后的脂质体与等体积5％(w/w)的含药蔗糖溶液(含环丙沙星5mg/mL、多粘菌素2.5mg/mL)在60℃下孵育30min，共同孵育得到未经高密度PEG修饰的载药脂质体Cipro-Col-Lips*(*表示无PEG修饰，20mg/mL)。环丙沙星通过硫酸铵梯度法主动载药，多粘菌素通过其脂肪链插入脂质体脂膜的疏水区载药。
对比例3未经高密度PEG修饰的载抗生素的脂质体Cipro-Col-Lips*干粉
向对比例2制备得到的Cipro-Col-Lips*中加入保护剂蔗糖、甘露醇、L-亮氨酸，使蔗糖在溶液中浓度为5％(w/w)，甘露醇为10％(w/w)，L-亮氨酸为2％(w/w)并混合均匀(1mL溶液含有20mg Cipro-Col-Lips脂质体、50mg蔗糖、100mg甘露醇、20mg L-亮氨酸)。由精密注射泵控制脂质体溶液以1mL/min的速度送入超声雾化喷头，超声频率100k，振幅40％，雾化后液滴被喷入一个含有液氮的玻璃烧杯中凝结成为冻结颗粒。将得到的冻结颗粒在冻干机中真空干燥24h，即得到Cipro-Col-Lips*(*表示无PEG修饰)的干粉，收集干粉于密封的小瓶中，于20℃，湿度小于5％的干燥环境中保存。
对比例4一种荧光标记的未经高密度PEG修饰的载抗生素的脂质体Cipro-Col-Lips*-C6
本实施例制备方法同对比例2，不同在于：称取HSPC 45mg、胆固醇45mg、EPC 15mg、香豆素6(C6)0.5mg，溶于4mL氯仿中，水浴加热至脂质完全溶解，得到荧光标记的未经高密度PEG修饰的载抗生素的脂质体Cipro-Col-Lips*-C6(*表示无PEG修饰，20mg/mL)。
对比例5一种荧光标记的未经高密度PEG修饰的载抗生素的脂质体干粉
向对比例4制备得到的Cipro-Col-Lips*-C6中加入保护剂蔗糖、甘露醇、L-亮氨酸，使蔗糖在溶液中浓度为5％(w/w)，甘露醇为10％(w/w)，L-亮氨酸为2％(w/w)并混合均匀。其余方法同对比例3，得到即得到荧光标记Cipro-Col-Lips*-C6(*表示无PEG修饰)的干粉对比例6一种载游离抗生素的干粉
向混合药物水溶液(含环丙沙星2.5mg/mL、多粘菌素1.25mg/mL)中加入保护剂蔗糖、甘露醇、L-亮氨酸，使蔗糖在溶液中浓度为5％(w/w)，甘露醇为10％(w/w)，L-亮氨酸为2％(w/w)并混合均匀。由精密注射泵控制溶液以1mL/min的速度送入超声雾化喷头，超声频率100k，振幅40％，雾化后液滴被喷入一个含有液氮的玻璃烧杯中凝结成为冻结颗粒。将得到的冻结颗粒在冻干机中真空干燥24h即得到载游离抗生素的干粉，收集干粉于密封的小瓶中，于20℃，湿度小于5％的干燥环境中保存。
效果实施例1黏液渗透型脂质体的表征
(1)粒径和Zeta电位的分析
将本发明对比例1制备的空白黏液渗透性脂质体Lips与实施例1制备的Cipro-Col-Lips，用马尔文纳米粒度电位仪(Zetasizer Nano S90)测定Lips和Cipro-Col-Lips的粒径和zeta电位，Lips和Cipro-Col-Lips的粒径测试结果如图1所示，在表1中统计了Lips和Cipro-Col-Lips的平均粒径和Zeta电位。
表1Lips和Cipro-Col-Lips的平均粒径和Zeta电位
黏液渗透型脂质体Cipro-Col-Lips的粒径为102.05±9.56nm，多分散指系数(PDI)为0.16±0.017，表面电荷为-22.53±0.31mV。粒径小于粘蛋白网络空隙，可以满足肺黏液穿透需要。
(2)形貌分析
使用透射电子显微镜对实施例1制备得到的Cipro-Col-Lips的形貌进行分析，滴加10μL Cipro-Col-Lips于铜网上，自然晾干后用2％的磷钨酸负染。用透射电子显微镜观察Cipro-Col-Lips的形貌。
结果如图2所示，黏液渗透型Cipro-Col-Lips粒径约为120nm，呈球形，可以清楚地看到脂膜(虚线表示厚度为15nm)和暗色内腔，这可能是环丙沙星结晶的缘故。
(3)包封率和载药量测定
脂质体的药物包封率(EE)由超滤离心法测得。
将实施例1制备的0.5mL黏液渗透型Cipro-Col-Lips溶液(20mg/mL)加入Ultra离心过滤器(MWCO 100kDa，Millipore)中，然后在3000×g下离心20分钟，以分离游离药物和包封药物。用高效液相色谱法(HPLC)测定滤液中的游离药物(Cf)。将20μL脂质体加入400μL甲醇中，破坏脂质体以释放包封药物，然后用HPLC测定药物的总量(Ct)。
载药量测定方法如下，将实施例1制备得到的Cipro-Col-Lips直接冻干，称量总重量即为脂质体和膜材总质量，溶解后用上述方法破坏脂质体，用HPLC测量总药物质量。药物高效液相色谱分析方法为：色谱柱XB-C18(250×4.6mm，5μm)，进样量、流速和柱温分别设定为20μL、1.0mL/min和40℃。环丙沙星和多粘菌素分离的流动相均为30mM的硫酸钠，pH用磷酸调节到2.5，流动相中水相和乙腈的比例为76:24(v/v)，环丙沙星和多粘菌素的检测波长分别为278nm和205nm。
黏液渗透型Cipro-Col-Lips中多粘菌素和环丙沙星的载药量分别为4.00％和9.09％，包封率(EE％)分别为63.94％和84.21％。如图3在4℃温度下放置10天条件下，其粒径和粒径分布都没有显著变化，表明其具有良好的稳定性。
效果实施例2黏液渗透型脂质体生物膜响应释药和中和生物膜毒素性质表征
(1)生物膜及其上清液的制备
铜绿假单胞菌在37℃的LBA板上生长24h。将单个菌落接种于(LB)中，37℃，200r/min,震荡培养18h得到浮游细菌悬液。取铜绿假单胞菌悬液，用无菌LB肉汤稀释至细菌密度为1×106CFU/mL，每孔2mL接种于6孔板中，置于37℃恒温培养箱中静置培养24h得到细菌生物膜。培养结束后将培养介质吸出，细菌生物膜刮下，二者一同转移至离心管中，4000g离心20min，收集上清液，储存于4℃冰箱待用。
该上清液包含细菌的生物膜及其分泌的毒性成分，作为Biofilm成分用于后续实施例的测试。
(2)生物膜上清液引起脂质体渗漏
使用ANTS-DPX-Lips研究铜绿假单胞菌生物膜是否会使脂质体发生渗漏。首先制备脂质体ANTS-DPX-Lips，称取HSPC 45mg、胆固醇45mg、EPC 15mg、DSPE-PEG2000 34mg，其摩尔比为25:50:20:5，溶于4mL氯仿中，水浴加热至脂质完全溶解，用旋转蒸发仪去除有机溶剂(EYELAN-1300，Japan)，形成一层脂质薄膜。将6mL的12.5mM 8-氨基-1,3,6-萘三磺酸二钠盐(ANTS)和45mM的1,1'-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双(1-吡啶鎓)二溴化物(DPX)作为要负载的物质溶解与水溶液中，纯水作为水化介质，将ANTS和DPX共同负载到空白脂质体的内水腔中。在60℃下旋转水化脂质薄膜30min，之后转移至小烧杯中。冰浴下，功率200w，探头超声(SCIENTZ-IID，China)处理15min(超1s-停2s)，过0.45μm和0.22μm的滤膜各5次，得到ANTS和DPX共载脂质体溶液(ANTS-DPX-Lips，20mg/mL)。将20μL的ANTS-DPX-Lips)加入透析袋(8-14kDa中，与40mL的测试释放介质在37℃，100rpm的条件下恒温震荡孵育3h，释放介质共设置4组，其中阴性对照组为PBS，阳性对照组为Triton，实验组1为PBS稀释的Biofilm2％(V/V)，实验组2为PBS稀释的Biofilm 5％(V/V)。孵育结束后，用去离子水透析24h，以获得未渗漏的ANTS-DPX-Lips用于荧光定量分析。加入等体积1％的Triton X-100释放脂质体中的荧光ANTS，并用荧光光谱仪(Horiba Fluoromax,USA)测定ANTS的荧光强度，Ex波长为360nm，Em波长为425-700nm。
ANTS是一种多阴离子荧光体，DPX是配对的阳离子淬灭剂。当以适当的摩尔比将它们共同装载于脂质体的内水腔时，DPX可以通过碰撞淬灭作用有效淬灭ANTS的荧光。然而，当脂质体不稳定时，ANTS和DPX会从脂质体中渗漏，两种荧光物质的相对距离增加，碰撞概率减少，从而恢复ANTS的荧光。用不同的释放介质培养ANTS-DPX-Lips后，透析充分除去已经渗漏的成分，用Triton X-100破坏未泄漏的脂质体，测试脂质体中剩余ANTS总荧光强度。荧光强度越低，说明脂质体泄漏越多。如图4中A所示，加入铜绿假单胞菌生物膜上清液共孵育后，脂质体荧光强度降低，即荧光分子渗漏量增加。并且随着加入的生物膜上清液浓度增加，脂质体内荧光分子渗漏的量也显著增加。
同样的，本发明测试了铜绿假单胞菌细胞膜糖脂成分鼠李糖脂(Rhl)是否为生物膜上清液破坏脂质体的主要成分。将上述步骤(2)制备得到的20μL的ANTS-DPX-Lips加入透析袋(8-14kDa)中，与40mL测试释放介质在37℃，100rpm的条件下恒温震荡孵育3h，释放介质共设置4组，其中对照组为PBS，阳性对照组为Triton，实验组1为溶解于PBS中的Rhl(0.4mg/mL)，实验组2为溶解于PBS中的Rhl(2mg/mL)。孵育结束后，用去离子水透析24h，以获得未渗漏的ANTS-DPX-Lips用于荧光定量分析。加入等体积1％的Triton X-100释放脂质体中的荧光ANTS，并用荧光光谱仪(Horiba Fluoromax,USA)测定ANTS的荧光强度，Ex波长为360nm，Em波长为425-700nm。结果如图4中B所示，加入鼠李糖脂共孵育后，ANTS-DPX-Lips荧光强度降低，即荧光分子渗漏量增加。并且随着加入的鼠李糖脂浓度增加，ANTS-DPX-Lips内荧光分子渗漏的量也显著增加。表明鼠李糖脂可能是引发脂质体泄漏的主要成分之一。
(3)生物膜上清液促进药物快速释放
采用透析法测定了黏液渗透型Cipro-Col-Lips溶液(实施例1制备得到，20mg/mL)的药物释放曲线。将20μL的Cipro-Col-Lips放入透析袋(8-14kDa)，37℃，100rpm条件下与40mL释放介质恒温震荡孵育。在设定的时间点(0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h)取出1mL释放介质。释放介质共设置3组，其中对照组为PBS，实验组1为PBS+Biofilm 2％(V/V)，实验组2为PBS+Biofilm 5％(V/V)。同时向体系补加等温等体积的释放介质。通过高效液相色谱法(实验步骤同效果实施例1)测定释放的药物，并绘制累积药物释放曲线。
图5可看出，随着铜绿假单胞菌生物膜上清液的加入，药物释放速度加快，并且与生物膜上清液加入的量呈正相关。
(4)脂质体对Rhl或生物膜上清液诱导溶血的保护作用
收集健康小鼠全血，置于离心机中4℃，3000×g，离心15min，弃上清，下层沉淀的红细胞用生理盐水洗涤三次，之后用生理盐水稀释为20％的红细胞悬液。设置两组实验，实验组将细菌生物膜上清液、脂质体、红细胞悬液充分混合，用PBS调整各组分浓度，使各组别中Cipro-Col-Lips浓度均为2mg/mL，红细胞悬液浓度均为2％(V/V)，生物膜上清液加入范围为0～30％(V/V)，于37℃孵育3h；对照组将实验组中的脂质体溶液替换为相同体积的PBS，其余操作相同。孵育结束后，4℃，3000×g，离心15min,观察各组别的溶血情况。将上清液收集，测量其在540nm的吸光度(OD540)，定量各组分孵育后溶血情况。采用同样的方法，探究Cipro-Col-Lips对于鼠李糖脂诱导溶血的保护作用，将上述实验中的生物膜上清液更换为鼠李糖脂，浓度范围在0～100μg/mL。
图6中A结果表明，铜绿假单胞菌生物膜上清液可以诱导红细胞溶血，当上清液浓度为30％时，溶血百分比达到69.64±1.80％。而Cipro-Col-Lips的加入显著的减少了这种溶血现象的发生，各组加入Cipro-Col-Lips后的溶血百分比都降至5％以下。图6中B结果表明，Rhl在20～100μg/mL浓度内会诱导红细胞溶血，但Cipro-Col-Lips的加入可以显著减轻Rhl诱导的溶血现象，当Rhl浓度在0～60μg/mL范围内时，各组溶血百分比都降低至5％以下。当Rhl浓度在100μg/mL，Cipro-Col-Lips的加入使溶血比例从88.34±6.97％降至49.04±3.05％。进一步说明了鼠李糖脂可能是铜绿假单胞菌生物膜上清液的毒力因子。
(5)脂质体吸附鼠李糖脂的定量测定
采用高效液相色谱-蒸发光散射法(HPLC-ELSD)研究Cipro-Col-Lips(实施例1制备得到)对Rhl的吸附作用的定量关系。将鼠李糖脂溶液(孵育时终浓度40μg/mL)和Cipro-Col-Lips(四个实验组，浓度分别为3、1.5、0.63、0.31mg/mL)混合并在37℃条件下孵育1h，然后使用超速离心机(Beckman Optima XE-100，美国)在100,000×g转速下离心2h，以分离未被吸附的Rhl和Cipro-Col-Lips。HPLC-ELSD方法如下，采用1％乙酸水溶液(A)和乙腈(B)进行梯度洗脱，流速为1mL/min。梯度条件为：0-3min，50％A；20min，100％B；25min，100％B；35min，50％A。蒸发光散射检测器的温度为45℃，增益值设为8。
图7中A结果表明与Cipro-Col-Lips孵育后，Rhl的中和量随Cipro-Col-Lips添加量的增加呈浓度依赖性的增加，当Cipro-Col-Lips添加量为3mg/mL时，可以中和70.21±1.11％的Rhl。而当Cipro-Col-Lips加入量减半为1.5mg/mL时，Rhl中和量也降低至37.72±0.61％。证明Cipro-Col-Lips存在Rhl吸附作用。
(6)脂质体保护细胞免受损伤
通过CCK-8法评估Cipro-Col-Lips(实施例1制备得到)保护巨噬细胞免受Rhl损伤的能力。将RAW264.1细胞按照1×104个/孔的密度接种于96孔板中，于培养箱中孵育培养24h。之后将培养基弃去，替换为含鼠李糖脂溶液(终浓度40μg/mL)和Cipro-Col-Lips溶液(四个实验组，终浓度分别为3、1.5、0.63、0.31mg/mL)的培养基，与细胞共孵育12h。孵育结束后，弃去含药培养基，每孔加入含CCK-8(10μL/孔)的培养基避光孵育2h，孵育结束后用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光值(OD值)，计算细胞存活率。
图7中B结果表明，鼠李糖脂对小鼠巨噬细胞RAW264.7表现出明显的细胞毒性，这种毒性可以通过添加Cipro-Col-Lips以浓度依赖的方式减轻或逆转。
为了研究Cipro-Col-Lips(实施例1制备得到)对上皮细胞和内皮细胞免受Rhl损伤的保护作用，本发明使用Calcein AM/PI细胞存活率/细胞毒性检测试剂盒(Beyotime,China)来评估不同处理后细胞膜的完整性。将A549细胞和HUVEC细胞分别按照8×104个/孔的密度接种于24孔板中，在培养箱中孵育培养24h后，之后将培养基弃去，替换为含鼠李糖脂(终浓度40μg/mL)和Cipro-Col-Lips(终浓度3mg/mL)溶液的培养基，与细胞共孵育12h。孵育结束后，弃去含药培养基，按照试剂盒说明书加入Calcein AM/PI检测工作液于37℃避光孵育30min。孵育结束后，在荧光显微镜下观察染色效果。
通过活/死细胞染色法研究了Cipro-Col-Lips对A549和HUVEC细胞鼠李糖脂的保护作用。A549细胞(如图8中A所示)和HUVEC细胞(如图8中B所示)在与鼠李糖脂共培养后，平均细胞存活率分别仅为4.68％和0.98％。当两种细胞系与鼠李糖脂和Cipro-Col-Lips共孵育时，平均细胞存活率分别为99.04％和99.40％，这表明Cipro-Col-Lips首先受到鼠李糖脂的攻击，并保护细胞不被破坏，因此显著提高了细胞的存活率。
效果实施例3黏液渗透型脂质体清除生物膜能力
(1)MIC、MBEC测定
采用微量肉汤稀释法评价游离药物及Cipro-Col-Lips溶液(实施例1制备得到，20mg/mL)的最低抑菌浓度(MIC)。MIC测定方法根据CLSI.M07-A10准则进行。用MH肉汤将铜绿假单胞菌悬液稀释至细菌密度为1×106CFU/mL，与连续稀释(使用MH肉汤稀释)两倍浓度的游离药物及Cipro-Col-Lips在37℃共孵育24h，每个浓度设置3个复孔(药物浓度范围从0.0625μg/mL至4096μg/mL，Cipro-Col-Lips组浓度为负载的药物浓度)。孵育结束后，观察孔板内肉汤颜色清亮的最低药物浓度为抗菌药物对于该细菌的最低抑菌浓度(MIC)。细菌生物膜的最低生物膜根除浓度(MBEC)按照下法测定。将铜绿假单胞菌生物膜与连续稀释两倍浓度的游离药物及Cipro-Col-Lips在37℃共孵育24h，每个浓度设置3个复孔。孵育结束后，弃去含药上清液，用PBS洗涤3次。之后加入100μL空白LB培养基，与生物膜中残存的细菌继续在37℃培养24h。培养结束后，观察孔板内肉汤颜色清亮的最低药物浓度为游离药物及Cipro-Col-Lips对于该细菌生物膜的MBEC。
图9显示了单一游离抗生素、游离抗生素混合物和黏液渗透型Cipro-Col-Lips溶液对铜绿假单胞菌及其生物膜的MIC和MBEC。与浮游细菌相比，铜绿假单胞菌生物膜对环丙沙星和多粘菌素的耐药性更强，MIC分别增加了2048倍和512倍。虽然环丙沙星和多粘菌素复方制剂对浮游铜绿假单胞菌的MIC几乎没有变化，但这两种抗生素复方制剂对生物膜的MBEC却明显下降，分别只比其相应的MIC高32倍(游离药物混合物)和64倍(Cipro-Col-Lips)。因此，环丙沙星和多粘菌素联合使用可以降低生物膜中细菌的抗生素耐药性。
(2)延缓耐药现象
取细菌悬液(第0代)，用无菌MH肉汤稀释至细菌密度为1×106CFU/mL，与亚抑菌浓度1/2MIC0浓度的游离药物与Cipro-Col-Lips制剂溶液(实施例1制备得到，使用MH肉汤稀释)在37℃共孵育24h，每组设置三个复孔。孵育结束后，将各组别存活的细菌离心、洗涤、收集，这些细菌被定为第1代细菌。测定第1代细菌的MIC1，之后将第一代细菌再次与亚抑菌浓度1/2MIC1孵育，存活的细菌定为第2代细菌。连续测试10代细菌的MIC。上述操作连续重复10次，以评估铜绿假单胞菌对单一抗生素、联合抗生素及其Cipro-Col-Lips的耐药性发展情况。
抗生素的重复应用可能会增加获得性细菌耐药的发生率，因此发明人研究了黏液渗透型Cipro-Col-Lips延缓细菌耐药性的能力。将铜绿假单胞菌与亚抑制浓度(1/2MIC)的游离抗生素、游离抗生素混合物和黏液渗透型Cipro-Col-Lips连续共孵育10次。如图10所示，单独使用环丙沙星和多粘菌素10代后MIC分别增加32倍和8倍，表明细菌发生耐药。与此相反，环丙沙星和多粘菌素(药物混合物溶液)或黏液渗透型Cipro-Col-Lips组合能延缓细菌耐药性的发生(MIC仅增加1-2倍)。因此，多粘菌素与环丙沙星联用不仅具有协同抗生物膜作用，还能延缓细菌耐药的产生。
(3)持留菌生长抑制
将铜绿假单胞菌生物膜与100倍MIC浓度的环丙沙星孵育24h,将存活的细菌离心、PBS洗涤、收集后得到持留菌(Persister)。用无菌LB肉汤将持留菌密度稀释为1×106CFU/mL，加入MIC浓度的游离药物与Cipro-Col-Lips溶液(无菌LB肉汤稀释)，在37℃共孵育24h，每个浓度设置3个复孔。分别在0、4、8、20、32、54、72h用酶标仪(BioTek ELX800,USA)测定每孔在波长630nm处的吸光值(OD值)，并绘制持留菌生长曲线。
持留菌是生物膜中以低代谢或休眠的方式生活的细菌亚群，能够在多种抗生素和机体免疫压力下存活，与慢性和复发性肺部感染密切相关，是生物膜耐药性的主要原因之一。将铜绿假单胞菌生物膜暴露于100×MIC的抗生素中24h来获得持留菌。如图11所示，环丙沙星或多粘菌素仅能轻微抑制持留菌的生长，这些细菌会迅速增殖直到生长平台期。出乎意料的是，环丙沙星和多粘菌素混合物溶液和黏液渗透型Cipro-Col-Lips都能完全抑制持留菌的增殖，这表明黏液渗透型Cipro-Col-Lips有降低感染复发的潜力。
(4)生物膜重复给药后活菌剩余数
由于慢性肺部细菌生物膜感染需要重复给药，发明人在体外条件下测定了三次给药后生物膜中剩余的活菌数。将铜绿假单胞菌生物膜与加入MIC药物浓度的游离药物或制剂溶液(负载药物的浓度)在37℃条件下共孵育24h，孵育结束后，弃含药培养基，用PBS洗涤。之后加入新的PBS，用无菌棉签仔细擦拭孔底和孔壁上的细菌生物膜，将棉签转移至1.5mL EP管中，超声3min分散细菌生物膜，之后用标准平板计数法测定给药一次后生物膜内剩余活菌数量。对于二或三次重复给药，生物膜与药物溶液孵育24h后，弃去含药培养基，重新加入同浓度的含药培养基孵育。孵育结束后，分别测定生物膜中剩余的细菌量。
结果如图12所示，黏液渗透型Cipro-Col-Lips经过三次重复给药后显示出卓越的抗菌效果，细菌减少率高达99.993％。
效果实施例4黏液渗透型脂质体干粉性质评价
(1)粉体学性质
采用量筒法考察实施例2-7制备的干粉的密度。将样品经漏斗过筛添加于5mL量筒内并记录初始体积(Vbulk)，振动量筒100次至粉体体积无明显变化，记录最终体积(Vtap)。分别称量加样前后量筒，其差值为所加样品微粉质量(m)，分别计算微粉的松密度(ρb)和振实密度(ρt)。
较低密度的干粉不易因重力而过早沉降，易于跟随气流递送至下呼吸道，从而有着更好的肺部递送效率。如图13所示，实施例6和实施例7制备的干粉F5、F6密度最轻，因此可能有更高的肺部递送效率。
(2)微观形貌表征
采用扫描电镜表征实施例2-7制备的干粉颗粒的表面形态及分布。取0.1mg干粉样品固定于导电胶布上，吹去多余的粉末，经喷金处理150s后，采用扫描电子显微镜(ZeissEVO MA10W,Germany)表征微观形貌，操作电压为10kv，放大倍数为100～2000倍。用NanoMeasurer 1.2软件计数200颗粒子大小并绘制粒径分布图，并计算粒子平均粒径和分散度(SPAN)。
表2实施例制备干粉的平均粒径和SPAN值
如图14所示，F1,F2显示出颗粒表面融化和不规则的球形，这可能是蔗糖与海藻糖的干粉容易吸收环境中的水分，形成颗粒间液桥。但是向处方中额外加入L-亮氨酸后(F2,F4)，粒子球形度改善，且未观察到吸潮现象，这是因为辅料中的L-亮氨酸有着良好的表面活性，在喷雾冷冻干燥的过程中容易吸附于液滴界面处，冻干后形成粒子外壳，因此可以改善吸入干粉的微观形貌、球形度、吸湿性等。甘露醇组(F5)呈现多孔样疏松表面结构，并且无吸潮现象发生，这可能是因为甘露醇的不易吸湿的性质。F6组处方中加入L-亮氨酸，表面存在壳状结构，因此改善了颗粒的球形度。同时，加入亮氨酸后，干粉粒径有所减小，这可能是由于L-亮氨酸的表面活性特性降低了水性原料的表面张力，这导致雾化过程中产生的液滴尺寸减小，从而形成更小的颗粒。
(3)脂质体干粉复溶后的性质测定
为了探究USFD过程后黏液渗透型Cipro-Col-Lips的稳定性变化，将各实施例制备的干粉重新溶解在去离子水中，测量脂质体的粒径、表面电荷和包封率(方法同效果实施例1)，并将其与实施例1制备的脂质体Cipro-Col-Lips的数据进行比较。
为获得最佳黏液渗透型Cipro-Col-Lips配方，既能耐受USFD过程，又能保持黏液渗透型Cipro-Col-Lips的特性。如图15所示，经过USFD工艺后，干粉复溶后的Cipro-Col-Lips的粒径大小几乎没有变化，但粒度分布有所增加，这归因于USFD的影响。辅料对黏液渗透型Cipro-Col-Lips包封率的影响如图16所示。总结来说，F5和F6的USFD干粉制剂有着颗粒密度低，不易吸潮，复溶后脂质体粒径不变，保留较好的包封率(EE％)等优点，因此进一步评价其空气动力学粒径。
(4)空气动力学性质表征
根据2020版《中国药典》通则0951“吸入制剂微细粒子空气动力学特性测定法”评价干粉的吸入性质。采用新一代药物撞击器(Next generation impactor，NGI)评价干粉的体外雾化性质。
本研究选择操作简单、灌装方便、罐装剂量易于调控的单剂量胶囊型Free-作为DPIs的给药装置，用于后续干粉吸入性质的评价。将制备得到的干粉以5±0.5mg/粒的剂量手动填充至3号HPMC胶囊中，将装有干粉样品的胶囊放置于Free-/>中。首先测定Free-/>装置的气流阻力，采用合适的适配器将Free-/>与递送剂量均一性测量装置(Dosage unit sampling apparatus,DUSA)管相连，另一端连接流量控制器和真空泵。开启真空泵，打开双向阀，调节流量控制器调节阀使得吸入装置前后压力差(P1)为4kPa，测定此时Free-/>的气流阻力。之后取下DUSA管及吸入装置，在装置吸入口连接流量计，记录流量计的读数Qout,本测试中Free-/>的气流阻力为99.1L/min,后续干粉吸入性质实验中流量设为100L/min，计算吸入时间(T)＝(60×4)/Qout,单位为秒。在测试流量下，控制阀前后的压力比(P3/P2)应小于或等于0.5，即控制阀内形成临界气流。
在各级样品收集杯用硅油喷剂均匀喷涂，待抛射剂挥发完全后，将收集杯安装于撞击器内，合上盖子，扳下手柄，密封NGI撞击器。向预分离器的中心收集杯中装入15mL水，将预分离器与NGI撞击器相连，并连接人工喉。在人工喉的另一端通过适配器与Free-开启真空泵，调节流速100L/min，通过装置，检查P3/P2≤0.5，将计时器设为2.4s(每胶囊吸气时间)，每次测定重复抽吸10颗胶囊。实验结束后，取下各组件，用水冲洗适配器、预分离器、人工喉，NGI各层级收集杯，收集并超声处理10min，定量转移至容量瓶中，定容后过滤膜(0.22μm滤膜)，取续滤液用HPLC法测量各部分药物沉积量。每个处方重复测定三次。使用CITDAS软件计算测定样品的空气动力学质量中位粒径(Mass medianaerodynamic diameter,MMAD)，细粒子分数(Fine particle fraction,FPF)等参数。
本发明采用NGI法考察DPIs装置的排空率(Emitted dose,ED)。取已知药物装量(m)的待测胶囊一粒，称量含胶囊药物总重量W0，放入Free-中。打开真空泵，调节流速100L/min，通过装置，检查P3/P2≤0.5，将计时器设为2.4s(每胶囊吸气时间)，每次测定重复抽吸10颗胶囊。实验结束后，取出胶囊并再次称重，记为W。每个处方重复测定十颗胶囊，根据公式计算DPIs的排空率。
表3实施例6-7中F5、F6干粉的空气动力学性质
实施例6-7制备的干粉在吸入装置、预分离器，层级1～层级7(S1～S7)，微孔收集器(MOC)的粒子沉积量见图17。FPF可表示沉积于肺部的药量(通常指空气动力学粒径在0.5-5μm范围)占从装置发射总药量的百分比。FPF是评价DPIs肺部药物递送效率的重要指标，FPF越高，DPIs的肺部沉积效率最高。从表3可以看出，F5的FPF为43.99±4.45％，F6的FPF为44.44±0.78％，均显著高于药典中对于FPF的要求(＞10％)。MMAD是DPIs肺部递送的关键参数之一，其主要受DPIs的颗粒大小，密度，表面形态等参数影响，F5、F6的MMAD均＜5μm，可以较好地满足干粉肺部递送的需要。F5和F6的ED均高于95％，能较好的排空胶囊中的药粉。
效果实施例5载黏液渗透型脂质体干粉的黏液渗透性质评价
人工CF肺黏液(CF-AM)由以下配方配制，将脱氧核糖核酸(DNA)500mg，粘蛋白250mg,二亚乙基三胺五乙酸二酐(DTPA)0.295mg，RPMI 1640氨基酸溶液1mL，蛋黄乳250μL，氯化钠250mg和氯化钾110mg混合在最终体积为50mL无DNA酶的水中，搅拌2h使所有成分充分溶解。
(1)脂质体人工肺黏液渗透性质测定
为探究制备的Cipro-Col-Lips和干粉的黏液穿透特性，构建了一个体外气道黏液模型。用95℃的去离子水制备0.3w/v％琼脂糖溶液，取1mL琼脂糖溶液放入样品瓶中，室温硬化。取800μL CF-AM加入硬化后的琼脂糖凝胶中，将200μL脂质体溶液(Cipro-Col-Lips-C6和对比例4Cipro-Col-Lips*-C6，均为20mg/mL)，或10mg干粉(实施例8和对比例5)铺于黏液上，37℃孵育，于设定的时间(0.5h、1h、2h、4h、6h)弃去纳米粒和黏液，用去离子水清洗琼脂糖凝胶。之后融化琼脂糖凝胶，在激发波长420nm，发射波长505nm测定琼脂糖内的荧光。设纳米粒全部穿透的总荧光强度为E，设定时间的荧光强度为E1。在设定时间的黏液渗透百分比(％)＝(E1/E)×100％。
为实现Cipro-Col-Lips抗铜绿假单胞菌生物膜功效，本发明制备的脂质体表面使用高密度的PEG分子修饰，以尽量减少其与气道黏液/痰液的相互作用。研究发现，当粒子表面的PEG密度高且呈“致密刷状”修饰时，才能有效发挥作用。参数RF/D是粒子表面PEG接枝密度的指标。RF是Flory半径(PEG分子量的直接函数)，D是颗粒表面上两个最接近的PEG链之间的平均分离距离。当RF/D＞2时，认为粒子表面PEG修饰呈“致密刷状”。经理论计算，本发明制备的RF/D＞2，这种“致密刷状”PEG修饰提供了一个中性、高度亲水的表面，因此最大限度地减少了与气道黏液成分的静电和疏水相互作用，提高黏液渗透能力。为了验证致密PEG修饰对于纳米粒子黏液穿透性的影响，发明人构建了一个琼脂糖凝胶和人工CF气道黏液模型，分别模拟颗粒与气道黏液之间的空间阻碍和黏附作用。图18结果表明，表面经过致密PEG修饰的Cipro-Col-Lips很容易渗透到人工CF黏液和琼脂糖凝胶中，这表明Cipro-Col-Lips可以克服气道黏液中成分的粘附作用和黏液网络的空间阻碍。
(2)脂质体渗透黏液及清除细菌生物膜性质
为了研究脂质体在铜绿假单胞菌生物膜部位的积累情况，发明人构建了一个体外黏液细菌生物膜模型。将细菌生物膜在Transwell(孔径0.4μm)的小室培养24h。培养结束后，弃上清液，用PBS洗去孵育细菌。取80μL CF-AM加入细菌生物膜生长的小室上，将10mg含有C6标记(实施例8和对比例5)的干粉分散在黏液上，37℃孵育2h。孵育结束后，弃去黏液和嵌入的脂质体，用Hoechest33342(20μg/mL，Invitrogen公司)对细菌生物膜染色20min，PBS洗涤3次。利用激光共聚焦显微镜(Olympus FV3000，日本)观察渗透黏液和聚集至生物膜感染处的脂质体。
图19结果表明，含有高密度PEG修饰的Cipro-Col-Lips的干粉显示出很强的荧光强度，而无PEG化脂质体干粉处理组仅有零星荧光信号。表明实施例制备的载Cipro-Col-Lips干粉可以穿透黏液屏障到达生物膜感染位点。为了探究Cipro-Col-Lips和干粉对铜绿假单胞菌生物膜的清除效率，将体外黏液细菌生物膜模型给药后的剩余细菌进行定量。将Cipro-Col-Lips(实施例1(PEG+，20mg/mL)和对比例2(PEG-，20mg/mL))10μL，或干粉(实施例7(PEG﹢)和对比例3(PEG-))10mg分散在体外黏液细菌生物膜模型的黏液表面，孵育24h。将剩余的细菌生物膜分别用结晶紫法和细菌计数法进行定量。将200μL结晶紫染液加入小室，染色20分钟后，吸去结晶紫并用PBS多次洗涤，洗去多余染液。再用200μL 30％乙酸溶液溶解剩余结晶紫，用微孔板阅读器测定570nm处的吸光度。通过细菌计数法确定生物膜内剩余活菌数量。
图20中A和图20中B分别显示了不同处理后对剩余生物膜基质和嵌入细菌的定量分析结果。无论是溶液还是USFD干粉，高密度PEG修饰后的Cipro-Col-Lips表现出更好的生物膜基质和细菌的清除效果。
效果实施例6载黏液渗透型脂质体干粉的动物体内药效表征
(1)肺感染模型及动物实验方案
配制含司盘80(0.01％v/v)的液体石蜡，高压灭菌处理并保温至50℃。收集对数生长期的P.aeruginosa,离心(4000×g,5min)收集细菌，重悬于1mL无菌PBS中，并将其与9mL预热至50℃的LBA(肉汤琼脂)迅速混匀，快速滴加至150mL上述液体石蜡中，在50℃下搅拌6min(1000rpm)，之后放于冰上快速降温，固化处理琼脂珠10min。离心3次(4000×g，5min)除去上层液体石蜡，用无菌PBS重悬，过80目(200μm)不锈钢筛网3次除去较大粒子，将得到的包埋P.aeruginosa的琼脂珠重悬于10mL无菌PBS中，储存于4℃冰箱内。为了测定P.aeruginosa琼脂珠的细菌负载量，将超声波细胞粉碎机的探头用75％的酒精消毒，取10μL琼脂珠用无菌PBS稀释100倍，探头超声处理1min(功率100w,工作1s,暂停2s)，显微镜下观察到琼脂珠结构已基本破碎。用无菌PBS稀释不同梯度后，取不同浓度稀释液各10μL涂布于LB琼脂平板上，37℃培养24h后进行菌落计数。
采用气管滴管法进行小鼠肺部感染，以5×105CFU/Lung剂量进行接种。用气管插管(22g,0.7mm)以50μL/只体积滴入小鼠气道内，造成感染，接种当天记为第0天，将感染后的小鼠随机分为模型组(Control)、实验组(Cipro-Col-Lips干粉F6)(实施例7制备得到)、游离药物干粉组(Cipro/Col)(对比例6制备得到)，将未感染小鼠设置为健康组(Healthy)，每组9只。在接种第五天时，实验组以每只每天环丙沙星2.7mg/kg，多粘菌素1.44mg/kg(约1.5mg/只干粉)剂量给药，模型组和健康组给予不含药物的空白干粉(对比例1制备得到)，游离药物干粉组每只每天剂量为环丙沙星2.7mg/kg，多粘菌素1.44mg/kg药物干粉，连续给药3天后，停药观察1天。实验期间，每天两次记录小鼠的精神状态、毛发、体重等，记录各组小鼠体重绘制体重变化曲线。
(2)抗菌效果
接种第八天，取小鼠6只/组过量麻醉处死，解剖取肺组织，观察肺组织大体病理变化，记录肺部重量、颜色、质地变化，观察肺表面是否有出血点、实变等。分离小鼠左肺组织，用无菌PBS清洗表面，擦干后称重并记录。将肺组织剪成小碎块，加入无菌PBS，置于组织匀浆机中处理至无块状。用无菌PBS稀释不同梯度后，取不同浓度稀释液各100μL涂布于LB琼脂平板上，37℃培养24h后进行菌落计数。
图22结果表明，游离药物干粉在体内表现出较低的生物膜清除能力，肺组织菌落数减少了97.5％，黏液渗透型Cipro-Col-Lips干粉表现出更好的生物膜清除能力，菌落数减少99.7％，
分离小鼠左肺组织，用无菌PBS清洗表面，置于4％的多聚甲醛溶液中固定48h。组织样品经脱水、透明、石蜡包埋、切片后，进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色后，在显微镜下观察其组织病理变化情况。
肺部的组织病理学结果显示(如图23所示)，与健康组相比，对照组可观察到严重的肺泡损伤、数量减少、融合和炎细胞浸润现象，这意味着严重的肺损伤。对于游离的药物干粉治疗组，肺泡损伤现象仍然存在，这可能是因为游离药物干粉体内抗菌能力有限和其较大的刺激性。出人意料的是，黏液渗透型Cipro-Col-Lips干粉治疗的小鼠肺泡结构已基本恢复正常，炎细胞浸润情况也显著降低。同时，Cipro-Col-Lips治疗后的小鼠的体重显著反弹(图21中A)，生存率为100％(图21中B)，这也进一步说明了Cipro-Col-Lips较好的体内抗菌能力。
(3)炎症指标检测
接种第八天，取小鼠3只/组过量麻醉处死，解剖剪剖开小鼠咽喉部，将气管插管针平行插入小鼠气管，退出留置针，用手术线固定套管，接入注射器缓慢注入0.5mL无菌PBS，静置30s后缓慢回收支气管肺泡灌洗液(BALF)，重复操作3次，将3次灌洗液合并。将收集到的BALF离心(500×g，10min)，将下层细胞沉淀重悬分散于无菌PBS中。为了对支气管肺泡灌洗液中的总白细胞进行计数，取细胞悬液10μL,与90μL Turk染液混合均匀，常温静置孵育3min，取10μL用细胞计数器进行计数，得到肺泡灌洗液中的炎症细胞总数。为了观察统计灌洗液中各细胞种类和数量，将细胞悬液浓缩1×107cell/mL，取10μL涂片于黏附性载玻片上，室温晾干后用甲醇固定5min，室温晾干后按照说明书进行Wright-Giemsa染色，室温烘干后用中性树脂封片。60倍显微镜下观察并随机计数200个细胞，计算各类细胞所占百分比，乘以灌洗液内总细胞数量，得到每只小鼠BALF各类细胞总数。
BALF可以直接获取肺支气管和肺泡部位的细胞、非细胞成分，进而获取炎症因子、细胞学等信息，是临床肺部感染类疾病的重要诊治手段。从图24、25可以看出，模型组小鼠BALF中存在大量的中性粒细胞，这意味着肺部有严重的炎症反应。游离药物干粉给药后炎症细胞总数减少，出现更多巨噬细胞，这表明炎症反应部分缓解。出乎意料的是，黏液渗透型Cipro-Col-Lips干粉吸入组炎症细胞总数，中性粒细胞与巨噬细胞比例已基本恢复至健康组标准。因此，小鼠的慢性肺部生物膜感染经过黏液渗透型Cipro-Col-Lips干粉治疗后，与对照组和游离药物干粉组相比，更大程度上清除了体内生物膜感染，因此炎症反应得到较好的缓解。

Claims (10)

1.一种载药脂质体，所述载药脂质体的制备原料包含：脂质体材料和药物；
所述脂质体材料包括聚乙二醇、磷脂、胆固醇中的至少一种；
优选地，所述聚乙二醇包括磷脂酰胆碱-聚乙二醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇中的至少一种；
优选地，所述磷脂包括蛋黄卵磷脂、卵磷脂酰甘油、卵磷脂酰肌醇、卵磷脂酰丝氨酸、氢化卵磷脂酰胆碱、氢化卵磷脂酰甘油、氢化卵磷脂酰肌醇、氢化卵磷脂酰丝氨酸、氢化磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、氢化大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂酰甘油、氢化大豆磷脂酰丝氨酸、氢化大豆磷脂酰肌醇、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酸中的至少一种；
优选地，所述磷脂包括氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂中的至少一种；
优选地，所述固醇包括胆固醇、羊毛固醇、谷甾醇、豆固醇、麦角固醇中至少一种；
优选地，所述脂质体材料包括：氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、胆固醇、和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；
优选地，所述氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、胆固醇、和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的摩尔比为(20-55)：(15-35)：(40-60)：(5-8)；
优选地，所述药物包含亲水性药物和疏水性药物；
优选地，所述药物包括抗生素；
优选地，所述抗生素包括青霉素、头孢酶素、阿莫西林、克拉维酸、红霉素、吉他霉素、麦迪霉素、罗红霉素、螺旋霉素、克拉霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、泰拉霉素、替米考星、克林霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、安普霉素、新霉素、大观霉素、阿米卡星、奈替霉素、杆菌肽、多粘菌素、金霉素、土霉素、四环素、多西环素、氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、万古霉素、培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星、二氧沙星、磺胺嘧啶中的至少一种；
优选地，所述抗生素包括多粘菌素和环丙沙星中的至少一种；
优选地，所述抗生素包括多粘菌素和环丙沙星；
优选地，所述药物的用量为每mg脂质体材料载0.1mg-1mg药物。
2.根据权利要求1所述的载药脂质体，其特征在于：
优选地，所用PEG为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000；
优选地，所用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000在总脂质体材料中的摩尔比例为5-8％；
优选地，所述载药脂质体表面采用高密度PEG修饰；
优选地，所述高密度PEG修饰具体为载药脂质体的RF/D＞2；
优选地，所述RF为PEG的Flory半径；
优选地，所述D为载药脂质体表面上两个最接近的PEG链之间的平均分离距离。
3.根据权利要求1所述的载药脂质体，其特征在于：
所述载药脂质体的粒径为50-150nm；和/或
所述载药脂质体的电位为-25～0mV；和/或
所述载药脂质体的载药量为2-15％；和/或
所述载药脂质体的包封率为50-95％。
4.权利要求1-3中任一项所述的载药脂质体的制备方法，其特征在于：
若负载药物为疏水性药物时，包括以下步骤：
1)将脂质体材料和疏水性药物加入至有机溶剂，使其完全溶解；
2)除去有机溶剂形成薄膜；
3)加入水化介质水化薄膜；
4)超声处理水化后溶液，过滤；
5)去除游离药物，得到载药脂质体；
若负载药物为亲水性药物时，包括以下步骤：
1)将脂质体材料入至有机溶剂，使其完全溶解；
2)除去有机溶剂形成薄膜；
3)加入水化介质和亲水性药物水化薄膜；
4)超声处理水化后溶液，过滤；
5)去除游离药物，得到载药脂质体；
若负载药物为疏水性药物和亲水性药物时，包括以下步骤：
1)将脂质体材料和疏水性药物加入至有机溶剂，使其完全溶解；
2)除去有机溶剂形成薄膜；
3)加入水化介质和亲水性药物水化薄膜；
4)超声处理水化后溶液，过滤；
5)去除游离药物，得到载药脂质体；
优选地，步骤1)中有机溶剂选自乙醇、甲醇、乙醚、氯仿、二氯甲烷、乙腈、丙酮、含3-20个碳原子的链状、环状或者芳香类烃、醇、胺、醚、酯、酮、醛、酸中的一种或者多种；
优选地，步骤1)中有机溶剂包括氯仿；
优选地，步骤3)中水化介质选自水、葡萄糖水溶液、葡萄糖氯化钠水溶液、磷酸盐水溶液、醋酸盐水溶液、蔗糖水溶液、硫酸铵水溶液中的至少一种；
优选地，步骤3)中水化的温度为50～65℃，时间为20～60分钟；
优选地，步骤4)中超声功率为100～200w，超声工作时间为2～5分钟；
优选地，步骤5)中除去游离药物的方法包括透析；
优选地，所述透析的时间为2-5小时，透析袋分子截留率为8-14kDa。
5.一种黏液渗透型脂质体干粉，包含权利要求1-4中任一项所述的载药脂质体；
优选地，所述黏液渗透型脂质体干粉还包括保护剂；
优选地，所述保护剂选自海藻糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、棉籽糖、果糖、木糖醇、山梨醇、甘露醇、乙醇、甘油、丙二醇、肌醇、硫酸钠、乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、醋酸铵、氯化铵、柠檬酸、硼酸、磷酸、酒石酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、赖氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸、乙二胺四乙酸、聚乙二醇、葡聚糖、聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、明胶、果胶、阿拉伯胶、淀粉、糊精、二甲亚砜、维生素C、维生素E、抗坏血酸、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和茶多酚中的一种或多种的混合物；
优选地，所述保护剂包括蔗糖、海藻糖、L-亮氨酸、甘露醇中的至少一种；
优选地，所述保护剂包括蔗糖、甘露醇、L-亮氨酸中的至少一种；
优选地，所述保护剂的总质量在黏液渗透型脂质体干粉的质量比50-90％；
优选地，所述保护剂包括占黏液渗透型脂质体干粉的质量比为20-40％的蔗糖、和/或40-60％的甘露醇、和/或4-20％的L-亮氨酸。
6.根据权利要求5所述的黏液渗透型脂质体干粉，其特征在于：
所述黏液渗透型脂质体干粉的颗粒为球形或椭球形；和/或
所述黏液渗透型脂质体干粉的粒径为15～30μm；和/或
所述黏液渗透型脂质体干粉的密度为0.07～0.35g/cm3；和/或
所述黏液渗透型脂质体干粉的细粒子分数为40～50％；和/或
所述黏液渗透型脂质体干粉的空气动力学中位粒径为3～5μm。
7.权利要求5-6中任一项所述的黏液渗透型脂质体干粉的制备方法，包括以下步骤：
向所述载药脂质体中加入保护剂，混匀，超声喷雾冷冻干燥，得到；
优选地，超声喷雾冷冻干燥的注射泵推进速度为0.25～2mL/min，超声频率为80-120k，超声振幅可为20～80％，干燥时间为12～24小时。
8.权利要求1-3中任一项所述的载药脂质体、和/或权利要求5-6中任一项所述的黏液渗透型脂质体干粉在制备治疗肺部疾病药物中的应用；
优选地，所述肺部疾病包括细菌感染、真菌感染、肺癌、肺炎、肺纤维化中的至少一种；
优选地，所述肺部相关疾病包括细菌感染；
优选地，所述细菌感染包括生物膜感染。
9.一种药物，包括权利要求1-3中任一项所述的载药脂质体、和/或权利要求5-6中任一项所述的黏液渗透型脂质体干粉。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于：
所述药物还包括药学上可接受的辅料；
优选地，所述辅料包括填充剂、粘合剂、矫味剂、干燥剂、稳定剂、保护剂、着色剂、抗氧化剂、和缓冲剂中的至少一种。
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