CN1169809C - Boc保护的β-四氢咔啉羧酸及纳米制剂和RGD缀合物，其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及β-四氢咔啉羧酸的合成及纳米颗粒的制备；涉及液相法逐步接肽得到通式(1)的保护四肽中间体，脱Boc(叔丁氧羰基)后与N-Boc-β-四氢咔啉羧酸缩合，进一步经HF脱保护得到通式(2)的化合物；涉及四氢咔啉羧酸的纳米颗粒和通式(2)的化合物的体外和体内活性，例如涉及它们的抗血小板聚集作用和抗血栓作用。经体内和体外试验证明，本发明的化合物显示了优秀的抗血小板聚集活性，抗细胞粘附作用，以及抗血栓作用。
Description
技术领域
本发明涉及四氢咔啉羧酸及其RGD缀合物，它们的合成及其在医学上的应用。
背景技术
血小板聚集在血栓形成中有重要作用。正常的血小板在凝血酶原、二磷酸腺苷或胶原的诱导下被激活，释放花生四烯酸。花生四烯酸经环氧化酶催化，生成环内过氧化物(PGH2)。PGH2在异构酶的作用下生成血栓素A2(TXA2)，引起血小板聚集和粘附。血小板激活后，表面的糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)受体暴露，发生构象变化，并与纤维蛋白原结合，导致血栓形成。
研究GPIIb/IIIa受体与纤维蛋白α链及γ链结合的过程中，发现纤维蛋白之中存在的RGD序列是介导它自身与GPIIb/IIIa结合的关键序列(SamanenJ.，et al.，J.Med.Chem.，1991，34，3114)。
发明人采用液相法合成了RGDS，RGDV和RGDF，并证实它们可以抑制血栓形成(赵明，彭师奇，含RGD四肽的合成与功能，药学学报，1997，32，271)。发明人注意到，四氢咔啉羧酸是中药薤白中的一种成分，具有抗血小板聚集活性(姚新生等，中国药物化学杂志，1995，5，134)。发明人通过Pictet-Spengler反应合成了四氢咔啉羧酸，发现常规方法所得该化合物的水溶性极差，不便进行各种生物活性测定。
发明人曾报道，含RGD的四肽，例如RGDS，可以把溶血栓药物，例如尿激酶，输送到血栓形成部位，具有明确的靶向性(凌世长，赵明，彭师奇，RGDS修饰的脂质体作为药物载体导向溶栓的研究，北京医科大学学报，1994，26，174)。
附图说明
图1是咔啉羧酸纳米颗粒及N-BOC咔啉羧酸的制备路线图。
图2是含RGD四肽及对应的中间体的合成路线图。
图3是咔啉羧酸-RGDAA缀合物的合成路线图。
发明内容
根据上述认识，本发明对β-四氢咔啉羧酸进行了两方面修饰。一方面，下与甲醛反应制备β-四氢咔啉羧酸，该化合物在DMF中在三乙胺的存在下与Boc-N3或BOC酸酐反应，制得N-Boc-β-四氢咔啉羧酸；以及制备了β-四氢咔啉羧酸的纳米颗粒，包括在甲苯(或类似的的非极性溶剂)、浓硫酸(或其他的酸，如盐酸)和TWEEN 80(或类似的表面活性剂)的存在下，使L-色氨酸与甲醛反应，然后分离和冻干。
本发明按照图2所示的路线合成了通式(1)的保护四肽，在通式(1)中AA为L-Ser，L-Val或L-Phe残基。通式(1)的化合物经HF脱保护，得到对应的多肽RGDS，RGDV和RGDF。通式(1)的化合物经HCL脱保护得到通式为HCL.Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-AAoBzl的中间体，其中AA的定义与通式(1)同。
本发明按照图3所示的路线将通式为
HCL.Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-AAoBzl的化合物与N-Boc-β-四氢咔啉羧酸偶联，经HF脱保护，得到通式(2)的化合物，其中AA的定义与通式(1)同。
本发明采用体外和体内的模型评价了β-四氢咔啉羧酸的纳米颗粒，RGDS、RGDV、RGDF以及通式(2)的化合物的抗血小板聚集活性，抗细胞粘附作用，以及抗血栓作用。结果表明，本发明提供的β-四氢咔啉羧酸的纳米颗粒和通式(2)的化合物，β-四氢咔啉羧酸-RGDAA缀合物，都显示优秀的抗血小板聚集活性，抗细胞粘附作用，以及抗血栓作用。
因此，本发明的化合物可用于治疗血栓性疾病，例如血小板升高、脑血栓、冠心病、心肌梗塞、静脉血栓形成、栓塞性疾病，如脑动脉栓塞、肺栓塞等。
为了进一步阐述本发明，下面给出一些实施例。值得指出的是这些实施例应理解为对本发明的解释，对本发明没有任何意义上的限制。
实施例1.β-四氢咔啉羧酸的制备
25ml 1N的H2SO4，搅拌中加入5g(24.5mmol)色氨酸，再加75ml水，4ml(45.6mmol)38％的甲醛溶液，反应液变澄清，5Min左右析出大量固体，反应4小时后，滴加入8ml浓氨水，调pH到近中性，静置过夜，抽滤，滤饼用少量冷水洗，抽干，再干燥得固体(1)5.1g(浅黄色粉末，收率96％)MP：280-282C；EI-MS：217(M+1)；H-NMR(DMSO)：δ10.99(1H，s)，7.44(1H，d，7.5)，7.33(1H，t，8.0)，7.08(1H，t，8.0)，6.99(1H，t，7.5)，4.22(1H，d，4.8)，3.69(1H，dd，10.5，5.0)，3.14(1H，dd，10.5，2.4)，2.83(1H，ddd，10.5，5.0，2.4)。实施例2：N-BOC-β-四氢咔啉羧酸(2)的制备
1.1g(5mmol)β-四氢咔啉羧酸悬浮于15ml DMF中，加入1.4ml三乙胺，冰浴下搅拌直到溶液中悬浮颗粒大小均匀后，30min内滴加1.1g(7.7mmol)Boc-N3，24hr后升至40℃，3天后加入20％柠檬酸水溶液5ml，用乙酸乙酯萃取，有机层用MgSO4干燥，过滤，滤液减压蒸馏至干，残留物用CHCl3重结晶，得标题化合物0.9g(56％)mp165-170TOF-MS：317[M+1]+，339[M+Na]+，355[M+K] 1H-NMR(DMSO-d6)：1.46(s，9H，-Boc)，3.25～3.34(m，2H，4-H)，4.29～4.75(m，2H，1-H)，5.02～5.14(m，1H，3-H)，6.92～7.41(m，4H，Ar-H(5，6，7，8))，10.87(s，1H，9-H)，12.77(s，1H，-COOH)。
实施例3：β-四氢咔啉羧酸纳米颗粒(1)的制备
10ML去离子水中加入0.05ML浓H2SO4，搅拌中加入L-色氨酸1G，再加入20ML甲苯，0.02ML TWEEN80，剧烈搅拌，加入38％甲醛溶液0.8ML，反应4小时后，加入0.4ML浓氨水，静置1HR，分去甲苯层和上层清液(水层)，再加入10ML去离子水，搅拌2MIN后静置1HR，分去上清液，下层冻干得类白色疏松干粉。(TLC为纯点，与四氢咔啉羧酸对照RF相同)。
实施例4：RGDS(6)的制备
Boc-Ser(Bzl)OBzl
33mg(0.10mmol)Cs2CO3溶于蒸馏水，加入到59mg(0.20mmol)Boc-Ser(Bzl)-OH的无水乙醇溶液中，40min后减压除去溶剂，残留物置干燥器过夜，得到的白色固体溶于无水DMF，滴加34mg(0.2mmol)溴苄，于50℃恒温搅拌16hr后，滤除CsBr沉淀，滤液减压蒸馏至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在37℃下减压浓缩，残留物以石油醚研磨，得标题化合物76mg(99％)。
HCl·Ser(Bzl)OBzl
77mg(0.2mmol)Boc-Ser(Bzl)OBzl溶于6ml4mol/L无水氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，1hr后TLC显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
Boc-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)OBzl
63mg(0.2mmol)Boc-Asp(OcHex)-OH溶于3ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.22mmol)DCC，混合30min后待用。将64mg(0.2mmol)HCl·Ser(Bzl)OBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8～9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应12hr，TLC显示原料点消失，停止反应，滤除DCU(二环己基脲)，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物114mg(98％)mp101-103℃[α]20 D+15(C2，CHCl3)。
HCl·Asp(OcHex)-Ser(Bzl)OBzl
116mg(0.2mmol)Boc-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)OBzl溶于6ml4mol/L无水氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，1hr后TLC显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
Boc-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)OBzl
35mg(0.2mmol)Boc-Gly-OH溶于3ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.22mmol)DCC，混合30min后待用。将104mg(0.2mmol)HCl·Asp(OcHex)-Ser(Bzl)OBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8～9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应12hr，TLC显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物120mg(94％)mp160-163℃
[α]20 D-3(C2，CHCl3)。
HCl·Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)OBzl
128mg(0.2mmol)Boc-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)OBzl溶于6ml4mol/L无水氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，1hr后TLC显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)OBzl (6)
86mg(0.2mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于4ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.22mmol)DCC，混合30min后待用。将115mg(0.2mmol)HCl·Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)OBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8～9，加入上面得到的混合物，0℃反应1hr后，室温反应12hr，TLC显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得粗品，经硅胶H60柱层析分离纯化，得标题化合物133mg(70％)mp73-75℃[α]20 D-3(C2，CHCl3)。
实施例5：RGDV(7)的制备
Boc-ValOBzl
33mg(0.10mmol)Cs2CO3溶于蒸馏水，加入到43mg(0.20mmol)Boc-Val-OH的无水乙醇溶液中，40min后减压除去溶剂，残留物置干燥器过夜，得到的白色固体溶于无水DMF，滴加34mg(0.2mmol)溴苄，于50℃恒温搅拌16hr后，滤除CsBr沉淀，滤液减压蒸馏至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在37℃下减压浓缩，残留物以石油醚研磨，得标题化合物61mg(99％)。
HCl·ValOBzl
61mg(0.2mmol)Boc-ValOBzl溶于6ml4mol/L无水氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，1hr后TLC显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
Boc-Asp(OcHex)-ValOBzl
63mg(0.2mmol)Boc-Asp(OcHex)-OH溶于3ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.22mmol)DCC，混合30min后待用。将49mg(0.2mmol)HCl·ValOBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8～9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应12hr，TLC显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物99mg(98％)mp 95-98℃[α]20 D+13(C2，CHCl3)。HCl·Asp(OcHex)-ValOBzl
101mg(0.2mmol)Boc-Asp(OcHex)-ValOBzl溶于6ml4mol/L无水氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，1hr后TLC显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
Boc-Gly-Asp(OcHex)-ValOBzl
35mg(0.2mmol)Boc-Gly-OH溶于3ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.22mmol)DCC，混合30min后待用。将88mg(0.2mmol)HCl·Asp(OcHex)-ValOBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8～9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应12hr，TLC显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物107mg(95％)mp163-165℃[α]20 D+7(C2，CHCl3)。
HCl·Gly-Asp(OcHex)-ValOBzl
112mg(0.2mmol)Boc-Gly-Asp(OcHex)-ValOBzl溶于6ml4mol/L无水氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，1hr后TLC显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-ValOBzl (7)
86mg(0.2mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于4ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.22mmol)DCC，混合30min后待用。将99mg(0.2mmol)HCl·Gly-Asp(OcHex)-ValOBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8～9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应12hr，TLC显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得粗品，经硅胶H60柱层析分离纯化，得标题化合物132mg(76％)mp79-81℃[α]20 D-6(C2，CHCl3)。
实施例6：RGDF(8)的制备
Boc-PheOBzl
Nα-(叔丁氧羰基)-苯基丙氨酸-苄酯
33mg(0.1 0mmol)Cs2CO3溶于蒸馏水，加入到53mg(0.20mmol)
Boc-Phe-OH的无水乙醇溶液中，40min后减压除去溶剂，残留物置干燥器过夜，得到的白色固体溶于无水DMF，滴加34mg(0.2mmol)溴苄，于50℃恒温搅拌16hr后，滤除CsBr沉淀，滤液减压蒸馏至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在37℃下减压浓缩，残留物以石油醚研磨，得标题化合物70mg(99％)。
HCl·PheOBzl
71mg(0.2mmol)Boc-PheOBzl溶于6ml 4mol/L无水氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，1hr后TLC显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
Boc-Asp(OcHex)-PheOBzl
63mg(0.2mmol)Boc-Asp(OcHex)-OH溶于3ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.22mmol)DCC，混合30min后待用。将58mg(0.2mmol)HCl·PheOBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8～9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应12hr，TLC显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物109mg(99％)mp96-98℃[α]20 D+12(C2，CHCl3)。HCl·Asp(OcHex)-PheOBzl
110mg(0.2mmol)Boc-Asp(OcHex)-PheOBzl溶于6ml 4mol/L无水氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，1hr后TLC显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
Boc-Gly-Asp(OcHex)-PheOBzl
35mg(0.2mmol)Boc-Gly-OH溶于3ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.22mmol)DCC，混合30min后待用。将98mg(0.2mmol)HCl·Asp(OcHex)-PheOBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8～9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应12hr，TLC显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物121mg(97％)mp 165-170℃[α]20 D-2(C2，CHCl3)。
HCl·Gly-Asp(OcHex)-PheOBzl
122mg(0.2mmol)Boc-Gly-Asp(OcHex)-PheOBzl溶于6ml 4mol/L无水氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，1hr后TLC显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-PheOBzl (8)
86mg(0.2mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于4ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.22mmol)DCC，混合30min后待用。将109mg(0.2mmol)HCl·Gly-Asp(OcHex)-PheOBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8～9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应12hr，TLC显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得粗品，经硅胶H60柱层析分离纯化，得标题化合物110mg(60％)mp79-81℃[α]20 D-8(C2，CHCl3)。
实施例7：HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)OBzl (9)
189mg(0.2mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(Bzl)OBzl溶于6ml4mol/L无水氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，1hr后TLC显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物。
实施例8：HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-ValOBzl(10)的制备
174mg(0.2mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-ValOBzl溶于6ml4mol/L无水氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，1hr后TLC显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物。
实施例9：HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-PheOBzl(11)的制备
184mg(0.2mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-PheOBzl溶于6ml 4mol/L无水氯化氢-乙酸乙酯溶液，室温搅拌，1hr后TLC显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物。
实施例10：咔啉酰-RGDS(15)的制备
64mg(0.2mmol)化合物(2)溶于4ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.22mmol)DCC，1hr后得混合物。将177mg(0.2mmol)HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-Ser(BzL)OBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8～9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应12hr，TLC显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解并依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液和5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得粗品，经硅胶H60柱层析分离纯化，得化合物N-[(2-N-叔丁氧羰基-3，4，9-三氢-β咔啉-3-基)-甲酰基]-精氨酰-(Nω甲苯磺酰基)-甘氨酰-天冬氨酰-(β-环己酯)-丝氨酸苄酯(12)174mg(76％)mp94-98℃[α]20 D+23(C1，CHCl3)TOF-MS(m/e)1148[M+1]+1160[M+Na]+，1186[M+K]+。
N-[(2，3，4，9-四氢-β咔啉-3-基)-甲酰基]-精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-丝氨酸(15)
115mg(0.1mmol)化合物(12)与1ml苯甲醚及2ml无水HF混合后，0℃反应1hr，减压除去HF，再次通入无水HF 6ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，固体物用SephadexG10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后，得40mg标题化合物(15)(63％)mp258-260℃[α]20 D-11(C0.5，H2O)TOF-MS(m/e)632[M+1]+654[M+Na]+，670[M+K]+。
实施例11：咔啉酰-RGDV(16)的制备
N-[(2-N-叔丁氧羰基-3，4，9-三氢-β咔啉-3-基)-甲酰基]-精氨酰-(Nω甲苯磺酰基)-甘氨酰-天冬氨酰-(β-环己酯)-缬氨酸苄酯(13)
64mg(0.2mmol)化合物(2)溶于4ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.22mmol)DCC，1hr后得混合物。将161mg(0.2mmol)HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-ValOBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8～9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应12hr，TLC显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解并依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液和5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得粗品，经硅胶H60柱层析分离纯化，得化合物(13) 154mg(72％)mp118-120℃[α]20 D+22(C1，CHCl3)TOF-MS(m/e)1070[M+1]+1091[M+Na]+，1108[M+K]+。
N-[(2，3，4，9-四氢-β咔啉-3-基)-甲酰基]-精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-缬氨酸(16)
107mg(0.1mmol)化合物(13)与1ml苯甲醚及2ml无水HF混合后，0℃反应1hr，减压除去HF，再次通入无水HF6ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，固体物用Sephadex G10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后，得标题化合物(16)44mg(68％)mp300以上[α]20 D-24(C0.5，H2O)TOF-MS(m/e)644[M+1]。
实施例12：咔啉酰-RGDF(17)的制备
N-[(2-N-叔丁氧羰基-3，4，9-三氢-β咔啉-3-基)-甲酰基]-精氨酰-(Nω甲苯磺酰基)-甘氨酰-天冬氨酰-(β-环己酯)-苯基丙氨酸苄酯(14)
64mg(0.2mmol)化合物(2)溶于4ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.22mmol)DCC，1hr后得混合物。将171mg(0.2mmol)HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-PheOBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8～9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应12hr，TLC显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解并依次用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液和5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得粗品，经硅胶H60柱层析分离纯化，得化合物(14)163mg(73％)mp 108-110℃[α]20 D+22(C1，CHCl3)TOF-MS(m/e)1118[M+1]+1140[M+Na]+，1156[M+K]+。
N-[(2，3，4，9-四氢-β咔啉-3-基)-甲酰基]-精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-苯基丙氨酸(17)
112mg(0.1mmol)化合物(14)与1ml苯甲醚及2ml无水HF混合后，0℃反应1hr，减压除去HF，再次通入无水HF 6ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，固体物用SephadexG10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后，得标题化合物(17)47mg(68％)mp260-263℃[α]20 D-10(C0.5，H2O)TOF-MS(m/e)692[M+1]+。
实施例13：体外抗血小板聚集活性测定
正常兔血用3.8％枸橼酸钠抗凝，离心制得富血小板血浆，调节血小板记数为20万/μl，用标准浊度法测定血小板聚集率，诱导剂为血小板激活因子(PAF，终浓度10-7mol/L)和二磷酸腺苷(ADP，终浓度10-7mol/L)最大聚集率(AM％)表示血小板聚集曲线的峰值。各化合物的抗血小板聚集活性列于表中，用ANOVA检验对数据作统计分析，P＜0.05即认为有显著性差异。
表1.本发明化合物对由ADP(10-5mol/L)诱发的血小板聚集的作用
Am％(
x±SD)，剂量
化合物
10-7mol/L 10-6mol/L 10-5mol/L
NS 56.72±5.15
1 53.66±2.41 45.16±4.78a 24.60±1.99a
6 52.85±2.46 40.54±3.18a 14.22±2.49a
7 51.16±4.25b 29.40±2.95a 9.80±1.98a
8 35.70±2.14a 22.11±3.16a 7.36±1.10a
15 50.16±3.44b 43.05±3.90a 16.11±2.05a，c
16 50.20±4.01b 26.01±2.45a，c 10.75±1.56a，c
17 36.05±3.00a，c 21.05±3.06a，c 9.01±2.15a，c
N＝8；NS＝载体；a)与NS比较，P＜0.001；b)与NS比较，P＜0.01；.c)与1比较，P＜0.001。
表2.本发明化合物对由PAFPAF(10-7mol/L)诱发的血小板聚集的作用
Am％(
x±SD)，剂量
化合物
10-7mol/L 10-6mol/L 10-5mol/L
NS 58.90±4.65
1 55.15±3.16 50.18±3.49 35.66±2.46a
6 57.20±3.90 36.15±3.45a 21.16±2.55a
7 54.36±4.11 34.17±2.99a 19.56±1.98a
8 39.18±2.55a 23.80±2.34a 7.81±1.85a
15 56.10±3.25 34.15±3.18a，c 28.07±2.58a，c
16 54.10±3.90b 35.05±3.12a，c 24.11±2.35a，c
17 36.05±3.60a，c 25.54±2.80a，c 20.05±2.41a，c
N＝8；NS＝载体；a).与NS比较，P＜0.001；b).与NS比较，P＜0.01；P＜0.01；.P＜0.01；.c).与1比较，P＜0.001。
实施例14：体外抗粘附活性测定
采用高转移的肺SACC细胞系的SACC-LM细胞和血小板，测定方法据文献(Chiang H.，et al，Br. J.Cancer 1995，71，265)，数据见表：
表3.本发明化合物对SACC-LM和血小板的粘附的作用
化合物 ％，
x±SD
NS 78.3±4.0
1 45.6±2.4a
6 35.8±2.1a
7 32.1±1.9a
8 29.7±1.9a
15 36.1±1.4a，b
16 30.2±2.4a，b
17 28.1±1.6a，b
N＝8；NS＝载体；a).与NS比较，P＜0.001；b).与1比较，P＜0.001。
实施例15：体内抗血栓活性测定
实验动物为250～300g雄性Wistar大鼠(北京大学动物中心提供)，被测化合物用前溶于生理盐水并保存于冰水中。大鼠用戊巴比妥钠(80.0mg/Kg)麻醉后，分离右颈动脉和左颈静脉。一根6cm长事先精确称重的丝线放入聚乙烯插管的中间，将插管充满肝素钠的生理盐水溶液(50IU/ml)后，一端插入左侧静脉，从另一端加入定量肝素钠溶液抗凝，并加入待测化合物，再插入右侧动脉。血流从右侧动脉流经聚乙烯管流入左侧静脉，15分钟后取出丝线并记录湿重，丝线在干燥器中保存两周后记录干重。数据见表，用ANOVA检验对数据作统计分析，P＜0.05即认为有显著性差异。
表4.本发明化合物对血栓重量的影响(
x±SD)
化合物 湿血栓(mg) 干血栓(mg)
NS 45.92±6.23 8.95±1.97
1 42.99±3.80 7.17±0.70a
6 43.61±5.78 7.68±2.40
7 34.62±3.20b 6.03±1.06b
8 26.61±3.44a 4.14±0.95a
15 28.09±4.42a，c 4.98±1.21b，d
16 29.49±4.30b，e 4.87±1.04b，e
17 22.30±2.43a，f 2.76±0.45a，g
N＝8；剂量，5μmol/kg；NS＝载体；a)与NS(3ml/kg)比较，P＜0.001；b)与NS(3ml/kg)比较，P＜0.01；c)与6比较，P＜0.01；d)与6比较，P＜0.05；e)与7比较，P＜0.05；f)与8比较，P＜0.001；g)与8比较，P＜0.01。
Claims (9)
1、以下结构式的Boc保护的β-四氢咔啉羧酸：
2、权利要求1的Boc保护的β-四氢咔啉羧酸的制备方法，包括色氨酸在硫酸的存在下与甲醛反应制备β-四氢咔啉羧酸，该化合物在DMF中在三乙胺的存在下与Boc-N3反应，制得N-Boc-β-四氢咔啉羧酸。
3、以下结构式的四氢咔啉羧酸纳米制剂的制备方法，包括在甲苯、浓硫酸和TWEEN 80的存在下，使L-色氨酸与甲醛反应，然后分离和冻干：
4、以下通式(II)的化合物：
其中R为精氨酰基，G为甘氨酰基，D为天冬氨酰基，AA为L-Ser，L-Val或L-Phe残基。
5、通式(II)的化合物的制备方法，包括通式为HCL.Arg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-AAoBzl的化合物与N-Boc-β-四氢咔啉羧酸偶联，经HF脱保护，得到通式(II)的化合物，其中AA为L-Ser，L-Val或L-Phe残基。
6、权利要求3的纳米化合物在制备治疗血栓性疾病的药物中的应用。
7、权利要求6的应用，其中所述血栓性疾病为脑血栓、冠心病、心肌梗塞、脑栓塞或下肢静脉血栓形成。
8、权利要求4的化合物在制备治疗血栓性疾病的药物中的应用。
9、权利要求8的应用，其中所述血栓性疾病为脑血栓、冠心病、心肌梗塞、脑栓塞或下肢静脉血栓形成。
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