FI120267B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisien peptidien vatrnis-tamiseksi

Keksinnön ala

Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisten, pepti-s dien valmistamiseksi. Menetelmässä proteiinipitölnen materiaali fermentoidaari mikro-organismien avulla, jotka fermentoinnin aikana vapauttavat lähtömateriaalista lyhytketjuisia peptidejä. Peptidit ovat ACE:n eli angiotensiiniä muuttavan entsyymin inhibiittoreita ja niillä on havaittu muun muassa verenpainetta aientava vaikutus sekä iuunmuodostusta parantava vaikutus. Ne ovat siten 10 käyttökelpoisia terveysvaikutteisina tuotteina sellaisinaan ja nautittavaksi tarkoitettujen aineiden ainesosana tai lisäaineena.

Keksinnön tausta

Terapeuttisesti käyttökelpoisten ja erityisesti verenpainetta alentavien peptidien valmistusta fermentoimalla on tutkittu paljon ja alaan liittyvää kiris jallisuutta on runsaasti.

Nakamura et ai. kuvaavat esimerkiksi julkaisussa J Dairy Soi 78 (1995) 777-783 Lactobacillus helveticusta ja Saccharomyces cerevisiaeta sb sältävän hapatteen käyttöä kahden ACE-inhibiittorin valmistuksessa. Raaka-aineena käytettiin rasvattomasta maitojauheesta (9 %) ennastettua Ruma, ja 20 fermentointi suoritettiin perinteisenä hapatuksena 37 °C:n lämpötilassa 24 h. Fermentoinnin jälkeen ACE-inhibiittorit puhdistettiin kromatografisesti ja analysoitiin. Aktiiviset yhdisteet olivat molemmat tripeptidejä, Val-Pro-Pro ja lie-Pro-Pro (VPP ja IPP). Julkaisussa J Dairy Soi 78 (1995) 1253-1257 Nakamura et ai. kuvaavat mainittujen tripeptidien ja hapatteella valmistetun hapanmaitotuot-25 teen verenpainetta alentavaa vaikutusta in vivo.

US-patentissa 5,449,661, Nakamura et ai. kuvaavat tripeptidise-kvenssin Vai-Pro-Pro (VPP) sisältävän peptidin valmistusta ja käyttöä korkean verenpaineen alentamiseen. Peptidi valmistettiin rasvattomasta maitojauheesta Lactobacillus helveticus -kannalla JCM-1004. Tässäkin suoritettiin perintel-30 nen hapatus 37 öC:n lämpötilassa 24 h, minkä jälkeen peptidi puhdistettiin kromatografisesti ja kylmäkuivattiin.

Yamamoto et ai. kuvaavat julkaisussa J Dairy Sei 82 (1999) 1388-1393 sellaisen jogurttityyppisen tuotteen valmistamista, joka sisältää antihy-pertensiivistä Tyr-Pro -peptidiä (TP). Tuote valmistettiin perinteisellä hapatuk-35 sella Lactobacillus helveticus CPN4 -kannalla. Raaka-aineena oli tässäkin 2 rasvattomasta maitojauheesta (9 %) ennastettu kurri. Hapatus suoritettiin 37 °C:n lämpötilassa ja hapantuminen lopetettiin, kun pH oli laskenut 4,3:een. Muodostuneiden Tyr-Pro -peptidien pitoisuus jogurttituotteesta erotetussa herassa oii noin 8,1 mg/i. Vastaava menetelmä on kuvattu myös US^patentissa 5 5,854,029 ja EP-pateritissa 0 583 074 B1.

EP-patentti 1 016 709 B1, Yamamoto et ai., koskee Lactobacillus fielveticus -kantoja, jotka tuottavat suuria määriä ns. laktotripeptidejä, eli VPP:tä ja IPPtta. Peptidien pitoisuus VFP-peptideiksi laskettuna on yli 60 mg/i.

Parasta tuottoa saatiin käyttäen CM 4 -kantaa, joka perinteisellä hapatuksella 10 rasvattomasta maitojauheesta (9 %J ennastetulla kurrialustalla tuotti VPP:tä 74,4 mg/i. Hapatusolosuhteet olivat 32 °C ja 20 h. EP-juikaisu 1 142 481 A1,

Kitamura ja Ueyama, koskee edellä kuvatusta menetelmästä muokattua menetelmää, jossa kasvualustaa sekoitetaan joko yhtäjaksoisesti tai ajoittaisesti nopeudella 50 rpm. Julkaisun mukaan tällä menetelmällä saadaan tuote, jonka 15 viskositeetti on paljon alempi, ja josta heran talteenotto on tehokkaampaa. Verenpainetta aientavien peptidien saanto pysyy suurin piirtein samana verrattuna hapatukseen, jossa ei käytetä sekoitusta, EP-patentissa 1 266 267 B1, Valio Oy, kuvataan menetelmää verenpainetta alentavia peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi, joka me-20 neteimä käsittää kaksi päävaihetta, fermentoinnin ja nanosuodatuksen. Verenpainetta aientavia peptidejä vapautettiin maitoproteiinista hapattamalla tuo-tantokantaa rasvattomasta maitojauheesta (9-10 %) valmistetulla kasvualustana 37 °C:n lämpötilassa 22-24 tuntia. Kasvatuksen aikana pH:n annettiin laskea 3,3-3,5:een. Hapatuksen päätyttyä pH nostettiin KOH-liuoksella 25 4,6:een rahkasakan saostamiseksi. Tällä menetelmällä valmistettujen veren- painepeptidien pitoisuus on ollut noin 24 mg/l.

Yhteistä edellä kuvatuille menetelmille on, että hapatus tehdään perinteisesti. Perinteisellä hapatuksella tarkoitetaan hapatusta, jossa pH:n yleensä annetaan laskea vapaasti fermentaation aikana, ja hapatus lopetetaan kun 30 pH on laskenut tiettyyn arvoon. Yleensä hapatteet lisätään maitoon maidon pH:ssa, eli pH-arvossa noin 6,5.

US-pateniissa 5,449,661, Nakamura et ai., mainitaan, että fermentaation alussa pH voidaan säätää arvoon 6-7, ja että pH voidaan säätää myös fermentaation aikana esimerkiksi NaOHJIa tai KOH:lla.

35 WO-patenttijulkaisussa 04/060073, Unilever N.V., kuvataan fermen- toitua maitotuotetta, joka sisältää tripeptidiä VPP ja/tai IPP, Tuotetta valmiste- t 3 taan fermentoimafta maitoa Lactobacillus helveticus -kannalla CNRZ 244, jolloin pH pidetään arvossa 4,3-5,9 emäslisäyksellä, Julkaisun mukaan käytetty kanta tuottaa suuria määriä tripeptidejä, ja sen pH-optimi on noin 4,5.

Vapaassa hapatuksessa vain osa laktoosista fermentoidaan maito-5 hapoksi. Tyypillisesti rasvatonta maitoa hapatettaessa muodostuneen maitohapon pitoisuus on 1,5-2 % ja jäännöslaktoosin pitoisuus 2,5-3 %. Perinteisellä hapatuksella saadun tuotteen happamuus on osalle kuluttajia epämieluisa, ja korkea laktoosipitoisuus aiheuttaa laktoosille herkille ihmisille epämiellyttäviä ja kivuliaita vatsa- ja suolisto-oireita. Näihin ongelmiin edellä mainittu, 10 EP-patentissa 1 266 267 Bt, Valio Oy, kuvattu menetelmä nanosuodatusvai-h eineen ta rjoaa erään ratkaisu n.

Terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien saannon parantamiseksi on myös esitetty vaihtoehtoja, jotka useimmiten liittyvät tehokkaiden proteo-lyyttlsten tuotantobakteerien löytämiseen. WO-patenttijuikaisussa 03/082019 15 A2, Chr. Hansen A/S, kuvataan menetelmää verenpainetta aientavien peptidien valmistamiseksi, jossa menetelmässä käytetään proteolyyttisen kannan lisäksi lyyttistä (autolysoituvaa) kantaa, jolloin lyyttisen kannan tuottamien pep-tidaasientsyymien avulla pystytään vapauttamaan enemmän verenpainepepti-dejä raaka-aineesta kuin käytettäessä pelkästään proteolyyttistä tuotantokan-20 taa.

Keksinnön lyhyt kuvaus

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tarjota uusi menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, jolla menetelmällä saadaan aiempaa korkeampi peptidisaanto.

25 Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on lisäksi tarjota uusi mene- telmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, jolla menetelmällä lopputuotteen laktoosipitoisuutta voidaan vähentää merkittävästi.

Keksintö koskee siten menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisia, erityisesti verenpainetta aientavia, peptidejä sisältävän tuotteen vaimistami-30 seksi fermentoimaila maitoproteiinia maitohappobakteerilla, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että maitohappobakteeri on terapeuttisesti käyttökelpoisia, erityisesti verenpainetta alentavia, peptidejä tuottava maitohappobakteeri ja että fermehtointi suoritetaan lisätyn laktaasin läsnä oilessa.

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mukaisessa me-35 netetmässä terapeuttisesti käyttökelpoisia peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi fermentoinnissa käytetään laktaasin lisäksi pH-saätÖä.

4

Eräässä toisessa edullisessa Suoritusmuodossa keksinnön mukaisessa menetelmässä terapeuttisesti käyttökelpoisia peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi fermentoimalia maitoproteiinia maitohappobakteerilla käytetään maitohappobakteerina sukuun Lactobacillus kuuluvaa mlkro-orga-5 nismia. Edullisemmin käytetään Lactobacillus heiveticus -kantaa. Erityisen edullinen on Lactobacillus heiveticus LB1936, DSM 17754.

Keksintö koskee myös kantaa Lactobacillus heiveticus LB 1936, DSM 17754.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on myös tarjota keksinnön ίο mukaisella menetelmällä valmistettua bioaktiivisia peptidejä sisältävää tuotetta tai siitä puhdistettuja bioaktiivisia peptidejä käyttöön joko sellaisenaan terveysvaikutteisena aineena tai nautittavaksi tarkoitettujen aineiden, kuten terveysvaikutteisten elintarvikkeiden tai lääkeaineiden valmistuksessa.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on lisäksi tarjota käyttöön 15 suun kautta nautittavia tuotteita, kuten terveysvaikutteisia elintarvikkeita ja lääkeaineita, jotka eräänä vaikuttavana ainesosanaan sisältävät edeiiä kuvatulla menetelmällä valmistettua tuotetta täi siitä puhdistettuja bioaktiivisia peptidejä.

Kuvioiden lyhyt selostus

Kuvassa 1 esitetään pH-käyrä, joka saadaan suorittamalla perintei-20 nen fermentaatio ilman laktaasiiisäystä tai pH-säätöä (vertailu).

Kuvassa 2 esitetään pH-käyrä, joka saadaan suorittamana fermentaatio keksinnön mukaisella laktaasiiisäykseila ilman pH-säätöä.

Kuvassa 3 esitetään pH-käyrä, joka saadaan suorittamalla fermentaatio keksinnön mukaisella laktaasiiisäykseila ja pH-säädöllä.

25 Kuvassa 4 esitetään pH-käyrä, joka saadaan suorittamaiia fermen- taatiö keksinnön mukaisella laktaasilisäyksellä ja pH-säädöiia,

Kuvassa 5 esitetään pH-käyrä, joka saadaan suorittamaiia fermentaatio käyttäen pH-säätöä ilman iaktaasilisäystä.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 30 Esillä olevan keksinnön mukaisesti on siis yllättäen havaittu, että edellä esitetyt tavoitteet voidaan saavuttaa uudella meneteimäliä, joka perustuu laktaasi-entsyymin käyttöön fermentoinnin tehostamiseksi.

Laktaasia eli β-D-gaiaktosidaasia on kaupallisesti saatavissa useina eri entsyymivaimisteina. Esimerkkeinä hiivaperäisistä kaupallisista laktaasi- i 5 valmisteista voidaan mainita mm. GODO YNL (Godo Shusei Company, Japani), Maxilakt L2000 (DSM, Gist-Brocades, Alankomaat), Validase (Valley Research inc., USA), Ha-Lactase (Chr. Hansen A/S, Tanska), ja Laetozym 3000L (Novo Nordisk A/S, Novozymes, Tanska). Lisäksi on homeperäisiä lak-5 taasivalmisteita saatavilla, kuten mm. GLL-Conc. (Biocon Japan Ltd). Entsyymien optimaaliset hydrolyysiolosuhteet voivat vaihdella valmisteesta riippuen, ja ne valitaan kulloinkin käytettävän entsyymin valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Laktaasia käytetään meijeriteollisuudessa vähälaktoosisten ja lak-10 toosittomien tuotteiden valmistuksessa. Lähtöaineena käytettävä maito voidaan esikäsiteilä erilaisia kromatografisia tai kalvotekniikoita käyttäen, minkä jälkeen laktaasia lisätään (jäännös)laktoosin poistamiseksi. Tällaista menetelmää laktoosittoman maidon valmistamiseksi on kuvattu Fi-patentissa 115752, Valio Oy. EP-patentissa 1 266 267 B1, Valio Oy, kuvatussa menetelmässä te-15 rapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi kuvataan eräänä vaihtoehtona lakfaasin käyttöä laktoosin pilkkomiseksi ennen nanosuodatusvaihet-ta. Laktaasin lisäämistä fermentointivaiheessa ei ole kuvattu verenpainetta alentavien peptidituotteiden valmistusta koskevassa kirjallisuudessa.

Keksinnön mukaisessa fermentoinnissa lähtöaineena voidaan 'käyt-20 tää mitä tahansa tuotetta, joka sisältää haluttujen terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien sekvenssejä osana omaa peptidi- tai proteiinisekvenssiääh. Edullisesti käytetään maidon proteiinia, erityisesti kaseiinia, sellaisenaan tai erilaisten valmisteiden muodossa. Lähtöaineeksi soveltuvat myös erilaiset kaseiinia sisältävät maitotuotteet, kuten rasvaton tai rasvapitoisuudeltaan vaihte-25 leva maito sellaisenaan tai vastaavan maitojauheen muodossa ja hapatetut maitotuotteet, kuten piimä, kirnupiimä, jogurtti, viili, tuorejuustot, jne. Eläin-maidon (isäksi lähtöaineena voidaan käyttää myös kasviperäistä maitoa ja siitä valmistettuja tuotteita, esimerkiksi soija-, vehnä- tai kauramaitoa tai näistä saatuja proteiineja.

30 Fermenteinti voidaan suorittaa millä tahansa maitohappobakteerilla, joka kykenee tuottamaan haluttuja terapeuttisesti käyttökelpoisia peptidejä lähtöaineesta. Sopivia maitohappobakteereja voi löytyä mm. sukuihin Lactobacillus, Laciococcus, Leuconostoc, Streptococcus ja Bifidobacterium kuuluvista lajeista. Maitohappobakteereista proteolyyttisin on Lactobacillus helveticus, ja 35 tätä pidetään siten erityisen sopivana tähän tarkoitukseen. Maitohappobakteereja voidaan käyttää puhdasviijelmlnä tai sekaviljelminä, erikseen tai tavan- 6 omaisesti käytettyjen ja kaupallisesti saatavien hapatteiden kanssa. Maitohappobakteereja voidaan myös käyttää yhdessä muiden mikro-organismien kanssa. Mikrobiyhdistefmien osalta valitaan tarkoituksenmukaisesti sellaisia yhdistelmiä, joilla saadaan lopputuotteeseen paras mahdollinen maku ja joilla kon-5 taminaatioriski väistyy.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti edullinen Lactobacillus helvetl· cus -kanta on L. helveticus IB 1936, DSM 17754.

Lactobacillus-sukuun ja Lactobacillus helveticus -lajiin kuuluvien bakteerien luokitus ja yleiset ominaisuudet esitetään mm. teoksessa Bergey's 10 Manual of Systematic Bacteriology, voi. 2, Sneath et al., Williams & Wilkins, Baltimore, London, Los Angeles, Sydney, 1984, osa 14, s. 1208 eteenpäin. Lactobacillus helveticus -kannat on yleensä eristetty meijerituotteista, kuten fermentoiduista maitotuotteista ja juustoista, ja niitä käytetään perinteisesti ha-patteina juustojen, erityisesti Emmental- ja Gruyere-tyyppisten juustojen val-15 mistuksessa.

Lactobacillus helveticus LB 1936 on talletettu talletuslaitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH (DSMZ). Sen tailetusnumero on DSM 17754 ja talletuspäivämäärä 25.11.2005, ja sillä on seuraavat ominaisuudet: 20 Gram-positiivinen Lactobacillus helveticus -kanta, joka morfologial taan on lyhyt sauva. Lämpötilaoptimi on noin 35-45 °C, edullisesti noin 37-42 °C, ja pH-optimi on noin 4,5-7. Kanta on proteolyyttisesti aktiivinen, se sietää hyvin happamuutta ja muodostaa fermentoinnissa DL-maitohappoa. Hiilen-lähteenä se pystyy käyttämään mm. galaktoosia, glukoosia, fruktoosia, man-25 noosia, N-asetyyliglukoosiamiinia, maitoosia, laktoosia ja trehaloosia.

Lactobacillus helveticus LB 1936 kasvaa hyvin laktobasiileille tavallisesti käytetyissä kasvatusalustoissa, kuten Rogosa- ja MRS-iiemessä, ja maidossa, kuten esimerkiksi käsittelemättömissä maidossa, rekonstruoidussa maitojauhemaidossa tai ultraäänellä käsitellyssä maidossa, ja sitä voidaan 30 tuottaa kasvattamalla tällaisessa kasvatusalustassa tavanomaisia menettelyjä käyttäen,

Lactobacillus helveticus LB 1936 voidaan käyttää terveysvaikutteisena aineena seliisenaan, nautittavaksi tarkoitettujen aineiden valmistuksessa tai nautittavaksi tarkoitettujen aineiden ainesosana tai lisäaineena. Edullisesti 35 sitä käytetään erikoistuotteiden, kuten bioaktiivisia peptidejä sisältävien fer-mentöitujen maitotuotteiden valmistuksessa, mutta se on myös käyttökelpoi- 7 nen tavanomaisena hapatebakteerina meijeriteollisuudessa, esimerkiksi fer-mentoitujen maitotuotteiden ja juustojen valmistuksessa.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti fermentointi suoritetaan laktaa-sin läsnä ollessa. Laktaasia lisätään laktoosin hydrolysoimiseksi glukoosiksi ja 5 galaktooSiksi. Monosakkaridit ja varsinkin glukoosi ovat nopeammin ja tehokkaammin käytettävissä fermentoinnissa mikro-organismien hiiienlähteinä kuin disakkaridi, joten laktoosin hydroiyysi nopeuttaa huomattavasti fermentaatiota.

Keksinnön mukainen etu on suurimmillaan käytettäessä tuotantökantaa, joka kykenee tuottamaan terapeuttisesti aktiivisia peptidejä proteiinilähteestä hyvin, 10 mutta joka metaboloi hitaasti laktoosia, mutta saanto paranee myös muilla kannoilla niiden kasvuolosuhteiden parannettua laktaasilisäyksen seurauksena.

Laktaasina voidaan käyttää kaupallisia iaktaasivaimisteita, kuten edellä kuvattuja valmisteita. Puhtaan entsyyrnivalmisteen lisäksi voidaan myös 15 käyttää epäpuhtaita entsyymivalmisteita ja jopa suuren laktaasiaktiivisuuden omaavaa mikro-organismia sellaisenaan tai siitä saadun uutteen tai muun yhdistelmän muodossa.

Laktaasia käytetään sellainen määrä, jolla aikaansaadaan optimaalinen iaktoosihydrolyysiteho. Määrä voi olla esimerkiksi noin 10-10 000 p\/\ 20 (maitoa), edullisesti noin 50-300 μ\!\ (maitoa). Käytettyyn määrään vaikuttaa valittu entsyymivalmiste ja sen aktiivisuus. Ylimäärin annostelusta ei ole mitään haittaa, mutta kustannussyistä määrää pyritään kuitenkin pitämään mahdollisimman pienenä.

Eräässä keksinnön edullisessa suoritusmuodossa fermentoinnissa 25 käytetään iaktaasiiisäyksen lisäksi pH-säatöä. Tavallisessa fermentoinnissa pH:ta ei säädetä, jolioin se fermentoinnissa syntyneen maitohapon johdosta laskee selvästi happamaksi, yleensä jopa arvoon noin 3-3,5. Esillä olevan keksinnön puitteissa on yflättäen havaittu, että myös pH-säädöl!ä on merkittävä vaikutus haluttujen terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien saantoon. Pi-30 tämäilä pH arvossa noin 4,6-7, edullisesti arvossa noin 4,8-6, edullisemmin arvossa noin 5-5,5, ja erityisesti arvossa 5,1-5,3 esillä olevan keksinnön mukaisesti voidaan varmistaa, että kaseiinia on proteolyyttisten entsyymien tavoitettavissa ja siten käytettävissä peptidien tuottamiseksi. Vaikka fermentoinnissa aina syntyy hiutaleita, kaseiinia ei ole niin paljon saostuneena kuin alem-35 massa pH-arvossa, ja helpon tavoitettavuuden takia menetelmän saanto paranee entisestään. pH-arvon säätäminen on havaittu erityisen edulliseksi fer- i δ mentöinnin alkuvaiheessa ja tehokkaimman mikro-organismi(e)n kasvun aikana. pH:n tasainen säätö pidetään edullisena suoritusmuotona, mutta pH:n säätö voi olla myös jaksottaista. Fermentoinnin loppuvaiheessa pH:n säätö voidaan lopettaa ja pH:n antaa laskea vapaasti ilman että saanto laskee. Siinä 5 vaiheessa pH ei kuitenkaan yleensä laske alle arvoa 4,6.

pH:n säätämiseksi voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa emäksistä ainetta. Yleisesti käytettyjä aineita ovat mm. KOH ja NaOH, ja näiden pitoisuus voi olla noin 10-90 %. Usein käytetään noin 50-prosenttista KOH-iiuosta. pH:n säätöön tarvittava määrä riippuu fermentoinnin muista parametreistä. pH:n 10 kontrolli ja säätäminen sekä sopivan säätökemikaaiin käyttömäärän toteaminen halutun pH:n ylläpitämiseksi kuuluvat alan asiantuntijan tietotaitoihin.

Fermentointiolosuhteet valitaan fermentoinnissa käytettävän kannan vaatimusten mukaisesti siten, että muodostuu optimaalinen määrä terapeuttisesti käyttökelpoisia peptidejä. Sopivien olosuhteiden, kuten esimerkiksi 15 kasvuaiustam lämpötilan ja ilmastuksen valinta kuuluvat alan asiantuntijoiden tietotaitoihin. Lämpötila voi olla esimerkiksi 30-45 °C.

Fermentoinnin annetaan jatkua, kunnes haluttu määrä peptidejä on muodostunut. Aikaa tähän kuluu normaalisti noin 20-30 h, edullisesti 22-25 h.

Fermentoinnissa muodostuu erilaisten peptidien seos. Peptidien 20 koko on riippuvainen fermentoinnin pituudesta, mitä lyhyempi fermentointiaika, sitä pitempiä ovat muodostuneet peptidit, ja mitä kauemmin fermentointi kestää, sitä enemmän syntyy pieniä peptidejä. Kun fermentointi kestää riittävän kauan, saadaan pääasiassa suhteellisen pieniä di- ja tripeptjdejä, kuten esimerkiksi Val-Pro-Pro (VPP) ja lie-Pro-Pro (IPP), joilla on havaittu olevan mm. 25 erinomainen verenpainetta alentava vaikutus.

Fermentoinnin jälkeen solususpensio kerätään talteen. Tarkoituksen mukaan solususpensio voidaan jatkokäsitellä halutulla tavalla, esimerkiksi poistamalla siltä mahdollinen jäännöskaseiini tai kaikki maidon proteiinit alalla tunnetuin puhdistusmenetelmän, kuten saostus-, suodatus- tai kaivomenetei-30 min tai lämpökäsittelyllä. Yhteissaostusta, jolla saadaan lähes proteiinitonta, peptidit sisältävä heraa, voidaan aikaansaada esimerkiksi CaGi2-lisäyksellä, lämpökäsittelyllä tai happolisäykseiiä, Tarvittaessa käytetään sentrifugikäsittelyä. Solususpensiota voidaan myös käsitellä tai viimeistellä nanosuodattamal-la, ultrasuodattamalla tai muita kalvotekniikoita tai kromatografiaa käyttäen. 35 Peptidit voidaan erottaa ja puhdistaa siitä esimerkiksi kromatografisesti tai kal-votekniikoiden avulla.

9

Soiususpensiota voidaan myös käyttää suoraan tai se voidaan konsentroida, esimerkiksi- haihduttamalla tai kuivaamalla osittain tai kokonaan, kuten levittämällä se levylle, kuivaamalla ja lopuksi jauhamalla hyvin säilyvän kuivan jauheen saamiseksi.

5 Esillä olevan keksinnön puitteissa on edulliseksi loppukäsittelyksi havaittu menetelmä, jossa kaseiinisakka fermentaation jälkeen erotetaan separaattorilla ja hera kirkastetaan kirkastuslingolla. Tämä jälkeen hera nano-suodatetaan ja retentaatti haihdutetaan tiivisteeksi. Retentaatti voidaan myös haihduttaa ja kuivata spraykuävurilia jauheeksi.

10 Keksinnön mukaisella menetelmällä saatua bioaktiivisia peptidejä sisältävää ja mahdollisesti konsentroitua tuotetta voidaan siis käyttää sellaisenaan terveysvaikutteisena aineena. Kuivattua tuotetta voidaan myös käyttää jauheen tai iyofilisoidun valmisteen muodossa. Esillä olevan keksinnön mukaisesti tuotetta käytetään kuitenkin edullisesti terveysvaikutteisten efintarvikkei-15 den tai muiden tuotteiden valmistuksessa.

Käsitteellä elintarvike on tässä julkaisussa laaja merkitys kattaen kaikki nautittavaksi tarkoitetut tuotteet, jotka voivat olla kiinteässä, hyyteiöidys-sä tai nestemäisessä muodossa, ja kattaen sekä valmiit tuotteet että tuotteet, joihin keksinnön mukaisesti saatu tuote lisätään nauttimisen yhteydessä, iisä-20 aineeksi tai osaksi tuotetta. Elintarvikkeet voivat olla esimerkiksi meijeriteollisuuden, iihanjalosiusteoliisuuden, einesteollisuuden, juomateollisuuden, leipomoteollisuuden ja makeisteollisuuden tuotteita. Tyypillisiä ovat maitotuotteet, kuten jogurtti, viili, rahka, piimä, kirnupiimä, muut hapanmaitojuomat, tuorejuustot ja kypsytetyt juustot, välipalasnackien täytteet, jne. Toisen tärkeän 25 ryhmän muodostavat juomat, kuten herajuomat, hedetmäjuomat, ja oluet.

Bioaktiivisia peptidejä sisältävää tuotetta voidaan lisätä elintarvikkeeseen sen valmistusprosessin aikana tai jo valmistettuun elintarvikkeeseen. Kyseiset elintarvikkeet sisältävät siis keksinnön mukaisesti saatua bioaktiivisia peptidejä sisältävää tuotetta tai siitä eristettyjä ja/tai puhdistettuja bioaktiivisia 30 peptidejä muiden vastaavanlaisiin elintarvikkeisiin sisältyvien, ainesosien lisäksi, ja vastaavat maultaan ja käyttötavoiltaan täysin näitä tavanomaisia tuotteita.

Kun lopputuote on maitotuote, voidaan se ennen pakkaamista viimeistellä iämpökäsitteiyiiä, joka suoritetaan esimerkiksi pastöroimalla {72 °D, 35 15 s), ESL-käsitteiyllä (130 °G, 1-2 s) tai UHT-käsitteiyliä (138 °C, 2-4 s).

10

Keksinnön mukaisella menetelmällä saavutetaan monta etua. Verrattuna tekniikan tasossa kuvattuihin menetelmiin saanto paranee merkittävästi, Keksinnön mukaisella menetelmällä peptidejä heraan on saatu tuotettua jopa 136 mg/l, jolloin saanto on noin 46 % teoreettisesta saannosta. Vertailun 5 vuoksi voidaan mainita, että käyttämällä perinteiseen hapatukseen perustuvaa menetelmää saanto on noin 24 mg/l. Lisäämällä laktaasia mikro-organismien kasvatusalustaan laktoosin hydroiyysi nopeutuu, mikä puolestaan nopeuttaa huomattavasti fermentöintia. Lisäämällä laktaasia voidaan yllättäen myös huonoista tuotantokannoista tehdä hyvin tuottavia kantoja, ja näin ollen terapeutti-10 sesti käyttökelpoisten peptidien saanto paranee sitäkin kautta.

Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan myös varmistaa, että kaseiinia on koko ajan tuotanto-organismi(e)n käytettävissä, jolloin lähtöaineesta voidaan vapauttaa bioaktiivisia peptidejä huomattavasti tehokkaammin kuin aikaisemmin, jopa 3 kertaa tehokkaammin. Tälläkin tavoin parannetaan 15 merkittävästi valmistusprosessin tehokkuutta.

Keksinnön mukaisella menetelmässä voidaan lisäksi valmistaa jopa täysin laktoositonta tuotetta. Lisäämällä laktaasia ja säätämällä pH saavutetaan se etu, että kaikki kasvualustan laktoosi fermentoidaan maitohapon ka-liumsuoiaksi (kaiiumlaktaatiksi).

20 Keksinnön mukainen menetelmä on yksinkertainen ja halpa ja sopii hyvin suuren mittakaavan valmistukseen.

Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkien avulla. Nämä esimerkit annetaan vain keksinnön valaisemiseksi eikä niitä pidä katsoa sen suojapiiriä mitenkään rajoittaviksi.

25 Vertailuesimerkki 1

Perinteinen fermentaatio

Kylmäkuivattu LB 1936 -hapate valmisiettiiri käyttäen kasvualustana steriloitua herapermeaattipohjaista alustaa, jossa oli lisäravinteina tryptonia ja hiivauutetta, sekä kivennäisiä. Fermentaatio suoritettiin lämpötilassa 37 °C 30 ja pH:ssa 5,0 sekoittaen 100-120 rpm. Kasvatusaika oli 22 h. Fermentaation jälkeen solut konsentroitiin mikrosuodattamalla, minkä jälkeen konsentraatti Syofilisoiiiin.

Perinteinen hapatus suoritettiin LB 1936 -kannalla käyttäen lähtöaineena rasvatonta maitoalustaa. 4 litraa maitoa pastöroitiin 85 °C:ssa 10 min 35 ja jäähdytettiin hapatuslämpötilaan 42 °C. Kasvualustaan siirrostettiin LB 1936 -hapatetta niin, että elävien solujen pitoisuus hapatuksen alussa oli noin i 11 1,60*10° PMY/g. Maidon annettiin hapantua 42 °C:n lämpötilassa 24 tuntia, Hapantumisen aikana kasvualustaa sekoitettiin 200 rpm:n nopeudella. Kuvassa 1 on esitetty pH-käyrä hapantumisen aikana. Valmiista piimästä erotettiin hera sentrifugoimaila 4000 rpm 15 min ja herasta analysoitiin VPP- ja IPP-5 peptidit, laktoosi, glukoosi, gafaktoosi ja maitohappo.

Vertailuesimerkin mukaisesti valmistetussa piimässä pH laski arvosta 6,5 arvoon 3,7 kuvan 1 mukaisesti. Piimässä hapantumisen lopussa elävien maitohappobakteerien pitoisuus oli1,9*109 PMY/g. Heran VPP+IPP -pitoisuus o!i 29 rng/l. Hapantumisen lopussa taiteen otetun heran kemiallinen koostu-to mus o!i vastaava kuin taulukossa 1 esitetty.

Esimerkki 1

Fermentaatio laktaasilisäykseilä

Kylmäkuivattu LB 1936 -hapate valmistettiin käyttäen kasvualustana steriloitua herapermeaattipohjaista alustaa, jossa oii lisäravinteina tryptonia 15 ja hiivauutetta, sekä kivennäisiä. Fermentaatio suoritettiin lämpötilassa 37 °C ja pH:ssa 5,0 sekoittaen 100-120 rpm. Kasvatusaika oli 22 h. Fermentaation jälkeen solut konsentroitiin mikrosuodattamaila, minkä jälkeen konsentraatti lyofiiisöitiin.

Keksinnön mukainen hapatus suoritettiin LB 1936 -kannalla käytiä-20 en lähtöaineena rasvatonta maitoaiustaa. 4 litraa maitoa pastöroitiin 85 °C:ssa 10 min ja jäähdytettiin hapatuslampötiiaan 42 °C, Maidon Joukkoon lisättiin 400 μ\ GODO-laktaasientsyymiä laktoosin hydroiysoimiseksi glukoosiksi ja gaiak-toosiksl. Kasvualustaan siirrostettiin 60 mg pakkaskuivattua LB 1936 -hapa-tetta (Valio Oy). Tällöin elävien solujen pitoisuus hapatuksen alussa oli 25 1,65*106 PMY/g. Maidon annettiin hapantua 42 °C:n lämpötilassa 24 tuntia. Hapantumisen aikana kasvualustaa sekoitettiin 200 rpm:n nopeudella. Kuvassa 2 on esitetty pH-käyrä hapantumisen aikana. Valmiista piimästä erotettiin hera sentrifugoimaila 4000 rpm 15 min ja herasta analysoitiin VPP- ja IPP-peptidit, laktoosi, glukoosi, galaktoosi ja maitohappo.

30 Esimerkin 1 mukaisesti valmistetussa piimässä pH laski arvosta 6,5 arvoon 3,7 kuvan 2 mukaisesti. Piimässä hapantumisen lopussa elävien maitohappobakteerien pitoisuus oli 1,9*109 PMY/g. Heran VPP+IPP-pitoisuus oli 40 mg/l. Hapantumisen lopussa talteen otetun heran kemiallinen koostumus on esitetty taulukossa 1.

12

Taulukko 1,. Herani kemiallinen koostumus fermentaation jälkeen iak-taasilisäykseilä Näyte__Laktoosi [%] Glukoosi [%j Gaiaktoosi f%1 Maitohappo j'%]

Hera 24 h 0,22 [0,80 2,04 12,16

Esimerkki 2 5 Fermentaatio käyttäen laktaasia ja pH-säätöä LB 1936 -hapate valmistettiin silrrostamalla ampullista 1 % tuotan-tokantaa 10 ml steriloitua 9% rasvatonta maitojauhemaitoa ja kasvattamalla lämpötilassa 42 °C 17 h. Kantaa jatkettiin kahteen kertaan samalla tavalla, käyttäen aina ymppikokona 1 %. Lopullinen fermentaatiössa käytettävä siirros-io te valmistettiin lämpötilassa 110 °G 10 min lämpökäsitellyssä 9% rasvattomassa maidossa kasvattamalla 22 h ja lämpötilassa 37 °C.

Fermentaatio LB 1936 -kannalla tehtiin rasvattomalla maitoalustai-la. 4 litraa maitoa pastöroitiin 85 °G:ssa 10 min ja jäähdytettiin hapatusiämpöti-iaan (42 °C). Maidon joukkoon lisättiin 400 μ\ GODO-laktaasientsyymiä. Kas-15 vualustaan siirrostettiin 400 mi LB 1936 -hapatetta rasvattomalla maitoalustai-la (Valio). Maidon annettiin hapantua 42 °C:n lämpötilassa 24 tuntia siten, että ensimmäiset 20 tuntia pH pidettiin arvossa 5,0 lisäämällä 50-prosenttisia KOH-liuosta. Tämän jälkeen pH:n annettiin laskea vapaasti. Hapantumisen aikana kasvualustaa sekoitettiin 200 rpm:n nopeudella. Kuvassa 3 on esitetty 20 pH-käyrä hapantumisen aikana. Valmiista piimästä erotettiin hera sentrifugoi-maila 4000 rpm 15 min ja herasta analysoitiin VPP- ja IPP-peptidit, laktoosi, glukoosi, gaiaktoosi ja maitohappo.

Esimerkin 2 mukaisesti valmistetussa piimässä pH-käyrä oli kuvan 3 mukainen ja ioppu-pH oli 4,95. Piimässä hapantumisen lopussa elävien mai-25 tohappobakteerien pitoisuus oli 1,3*109 PMY/g. Esimerkin 2 mukaisesti valmistetun heran VPP+IPP -pitoisuus oli 120 mg/i. Heran kemiallinen koostumus esitetään taulukossa 2.

Taulukko 2. Heran kemiallinen koostumus fermentaation jälkeen lak-taasiiisäykseliä jä pH-säädöllä Näyte__Laktoosi f%1 Glukoosi [%] Gaiaktoosi i%] Maitohappo [%]

Hera 24 h lo,QQ 0,00 |o,01 4,16 30 13

Esimerkki 3

Femnentaatio käyttäen laktaasia ja pH-säätöä LB 1936 -hapate: valmistettiin siirrostamalla ampullista 1 % tuotan-tokantaa 10 ml steriloitua 9 % rasvatonta maitojauhemaitoa ja kasvattamalla 5 lämpötilassa 42 °C 17 h. Kantaa jatkettiin kahteen kertaan samalla tavalla, käyttäen aina ympplkokona 1 %. Lopullinen fermentaatiossa käytettävä siirros-te valmistettiin: lämpötilassa 110 °C 10 min iämpökäsiieilyssä 9 % rasvattomassa maidossa Kasvattamalla 22 h ja lämpötilassa 37 “C.

Fermentaatio LB 1936 -kannalla tehtiin rasvattomalla maitoaiustal-10 ia. 4 litraa maitoa pastöroitiin 85 °C:ssa 10 min ja jäähdytettiin hapatuslämpöti-laan (42 °C). Maidon joukkoon lisättiin 400 μ\ GODG-iaktaasientsyymiä. Kasvualustaan siirrostettiin 400 ml LB 1936 -hapatetta rasvattomalla maiioalustal-la (Valio). Maidon annettiin hapantua 42 °C:n lämpötilassa 24 tuntia siten, että ensimmäiset 20 tuntia pH pidettiin arvossa 5,2 lisäämällä 50-pfosenttista 15 KOH-liuosta. Tämän jälkeen pH:n annettiin laskea vapaasti. Hapanturnisen aikana kasvualustaa sekoitettiin 200 rpm:n nopeudella. Kuvassa 4 on esitetty pH-käyrä hapanturnisen aikana. Valmiista piimästä erotettiin hera sentrifugoi-maiia 4000 rpm 15 min ja herasta analysoitiin VPP- ja IPP-peptidit, laktoosi, glukoosi, gaiaktoosi ja maitohappo.

20 Esimerkin 3 mukaisesti valmistetussa piimässä pH-käyrä oli kuvan 4 mukainen ja ioppu-pH oli 5,15. Piimässä hapanturnisen lopussa elävien maitohappobakteerien pitoisuus oli 2,0*109 PMY/g. Esimerkin 3 mukaisesti valmistetun heran VPP+IFP -pitoisuus oli 136 mg/L Heran kemiallinen koostumus esitetään taulukossa 3.

25 Taulukko 3. Heran kemiaiiinen koostumus fermentaation jälkeen lak-taasilisäykseltä ja pH-säädölIä Näyte Laktoosi 1%1 Glukoosi f%] Gaiaktoosi [%] Maitohappo f%l Hera 24 h 0,QQ 10,00 0,01 13,33

Esimerkki 4

Fermentaatio käyttäen pH-säätöä ilman laktaasiiisäystä 30 LB 1936 -hapate valmistettiin siirrostamalla ampullista 1 % tuotan- tokantaa 10 m! steriloitua 9 % rasvatonta maitojauhemaitoa ja kasvattamalla lämpötilassa 42 °C 17 h. Kantaa jatkettiin kahteen kertaan samalla tavalla, 14 käyttäen aina ymppikokona 1 %. Lopullinen fermentaatiossa käytettävä siirros-te valmistettiin lämpötilassa 110 °C 10 min lämpökäsitellyssä 9 % rasvattomassa maidossa kasvattamalla 22 h ja lämpötilassa 37 °C.

Fermentaatio LB 1936-kannaiia tehtiin rasvattomalla maitoalustalia, 5 kuten edellä olevassa esimerkissä on kuvattuna, paitsi että kasvualustaan ei lisätty laktaasia. Kuvassa 5 on esitetty pH-klyrä hapantumisen aikana. Valmiista piimästä erotettiin hera sentrifugoimälla 4000 rpm 15 min ja herasta analysoitiin VPP ja (PR peptidit, laktoosi, glukoosi, gaiaktoosi ja maitohappo.

Esimerkin 4 mukaisesti valmistetussa piimässä pH-käyrä oii kuvan ro 5 mukainen ja loppu pH oli 4,59. Piimässä hapantumisen lopussa elävien maitohappobakteerien pitoisuus oii 2,0*109 PMY/g. Esimerkin mukaisesti valmistetun heran VPP-HPF pitoisuus oli 86 mg/L

Taulukko 4. Heran kemiallinen koostumus fermentaation jälkeen pH-säädölfä ilman laktaasilisäystä Näyte__Laktoosi [%] Glukoosi [%] Gaiaktoosi j%] Maitohappo [%]

Hera 24 h: 0,72 0,00 0,1 3,51 15

Esimerkki 5

Tuotteen käyttö lopputuotteen valmistamiseksi

Esimerkin 2 mukaisesti valmistettu piimä separoitiin ja saatu hera nanosuodatettiin. Nanosuodatettu retentaatti haihdutettiin. Täfiä tavalta vaimis-20 lettua tiivistettä käytettiin bioaktiivisia peptidejä sisältävän piimän valmistamisessa siten, että piimän joukkoon lisättiin n, 1% tiivistettä.

i

Claims (11)

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisia, erityisesti verenpainetta alentavia, peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi fermentoirnalia mai- 5 toproteiinia maitohappobakteerilla, tunnettu siitä, että maitohappobakteeri on terapeuttisesti käyttökelpoisia, erityisesti verenpainetta aientavia, peptidejä tuottava maitohappobakteeri ja että fermentointi suoritetaan lisätyn laktaasin läsnä oilessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 10 että maitoproteiinin lähde on maito tai maitopohjainen tuote.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että maitoproteiinin iähde on kaseiini.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentoinnissa käytetään maitohappobakteerien ja muiden 15 mikrobien seosta.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tun-n e 11 u siitä, että fermentoinnissa käytetään mikro-organismia Lactobacillus helveticus.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siltä, 20 että mikro-organismi on Lactobacillus helveticus -kanta LB 1936, DSM 17754.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen meneteimä, tunnettu siitä, että fermentointi suoritetaan pH-säädöliä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH ylläpidetään arvossa noin 4,6-7, edullisesti arvossa noin 4,8-6, edulli- 25 semmin arvossa noin 5-5,5 ja edullisimmin arvossa noin 5,1-5,3.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tun-n e ttu siitä, että fermentoinnissa muodostuu iyhytketjuisten peptidien seos.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidit ovat di- ja tripeptidejä, erityisesti Ile-Pro-Pro ja/tai Val-Pro-Pro.

11. Lactobacillus helveticus -kanta LB 1936, DSM 17754.