FI120267B - Process for producing therapeutically useful peptides - Google Patents
Process for producing therapeutically useful peptides Download PDFInfo
- Publication number
- FI120267B FI120267B FI20065064A FI20065064A FI120267B FI 120267 B FI120267 B FI 120267B FI 20065064 A FI20065064 A FI 20065064A FI 20065064 A FI20065064 A FI 20065064A FI 120267 B FI120267 B FI 120267B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- fermentation
- milk
- peptides
- lactic acid
- lactase
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C21/00—Whey; Whey preparations
- A23C21/02—Whey; Whey preparations containing, or treated with, microorganisms or enzymes
- A23C21/023—Lactose hydrolysing enzymes, e.g. lactase, B-galactosidase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C21/00—Whey; Whey preparations
- A23C21/02—Whey; Whey preparations containing, or treated with, microorganisms or enzymes
- A23C21/026—Whey; Whey preparations containing, or treated with, microorganisms or enzymes containing, or treated only with, lactic acid producing bacteria, bifidobacteria or propionic acid bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
- A23C9/127—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using microorganisms of the genus lactobacteriaceae and other microorganisms or enzymes, e.g. kefir, koumiss
- A23C9/1275—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using microorganisms of the genus lactobacteriaceae and other microorganisms or enzymes, e.g. kefir, koumiss using only lactobacteriaceae for fermentation in combination with enzyme treatment of the milk product; using enzyme treated milk products for fermentation with lactobacteriaceae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/185—Vegetable proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Dairy Products (AREA)
Description
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisien peptidien vatrnis-tamiseksiA method for viable therapeutic peptides
Keksinnön alaField of the Invention
Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisten, pepti-s dien valmistamiseksi. Menetelmässä proteiinipitölnen materiaali fermentoidaari mikro-organismien avulla, jotka fermentoinnin aikana vapauttavat lähtömateriaalista lyhytketjuisia peptidejä. Peptidit ovat ACE:n eli angiotensiiniä muuttavan entsyymin inhibiittoreita ja niillä on havaittu muun muassa verenpainetta aientava vaikutus sekä iuunmuodostusta parantava vaikutus. Ne ovat siten 10 käyttökelpoisia terveysvaikutteisina tuotteina sellaisinaan ja nautittavaksi tarkoitettujen aineiden ainesosana tai lisäaineena.The invention relates to a process for the preparation of therapeutically useful peptides. In the method, the protein-rich material is fermented by microorganisms which release short chain peptides from the starting material during fermentation. The peptides are inhibitors of ACE, an angiotensin-converting enzyme, and have been shown to have antihypertensive effects, for example, and to improve bone formation. They are thus useful as health active products as such and as an ingredient or additive in substances intended for human consumption.
Keksinnön taustaBackground of the Invention
Terapeuttisesti käyttökelpoisten ja erityisesti verenpainetta alentavien peptidien valmistusta fermentoimalla on tutkittu paljon ja alaan liittyvää kiris jallisuutta on runsaasti.The preparation of therapeutically useful peptides, in particular antihypertensives, by fermentation has been extensively studied and there is a great deal of Kiris related in the art.
Nakamura et ai. kuvaavat esimerkiksi julkaisussa J Dairy Soi 78 (1995) 777-783 Lactobacillus helveticusta ja Saccharomyces cerevisiaeta sb sältävän hapatteen käyttöä kahden ACE-inhibiittorin valmistuksessa. Raaka-aineena käytettiin rasvattomasta maitojauheesta (9 %) ennastettua Ruma, ja 20 fermentointi suoritettiin perinteisenä hapatuksena 37 °C:n lämpötilassa 24 h. Fermentoinnin jälkeen ACE-inhibiittorit puhdistettiin kromatografisesti ja analysoitiin. Aktiiviset yhdisteet olivat molemmat tripeptidejä, Val-Pro-Pro ja lie-Pro-Pro (VPP ja IPP). Julkaisussa J Dairy Soi 78 (1995) 1253-1257 Nakamura et ai. kuvaavat mainittujen tripeptidien ja hapatteella valmistetun hapanmaitotuot-25 teen verenpainetta alentavaa vaikutusta in vivo.Nakamura et al. describe, for example, the use of an acid containing Lactobacillus helveticus and Saccharomyces cerevisiae sb in J Dairy Soi 78 (1995) 777-783 for the preparation of two ACE inhibitors. The raw material used was Ruma reconstituted from skimmed milk powder (9%), and the fermentation was carried out by conventional fermentation at 37 ° C for 24 h. After fermentation, the ACE inhibitors were purified by chromatography and analyzed. The active compounds were both tripeptides, Val-Pro-Pro and lie-Pro-Pro (VPP and IPP). J Dairy Soi 78 (1995) 1253-1257 Nakamura et al. describe the in vivo antihypertensive effect of said tripeptides and acidified sour milk product.
US-patentissa 5,449,661, Nakamura et ai. kuvaavat tripeptidise-kvenssin Vai-Pro-Pro (VPP) sisältävän peptidin valmistusta ja käyttöä korkean verenpaineen alentamiseen. Peptidi valmistettiin rasvattomasta maitojauheesta Lactobacillus helveticus -kannalla JCM-1004. Tässäkin suoritettiin perintel-30 nen hapatus 37 öC:n lämpötilassa 24 h, minkä jälkeen peptidi puhdistettiin kromatografisesti ja kylmäkuivattiin.U.S. Patent No. 5,449,661 to Nakamura et al. describe the preparation and use of a Vai-Pro-Pro (VPP) peptide containing tripeptide sequence for lowering hypertension. The peptide was prepared from skimmed milk powder with Lactobacillus helveticus strain JCM-1004. Here again, traditional acidification was carried out at 37 ° C for 24 hours, after which the peptide was purified by chromatography and freeze-dried.
Yamamoto et ai. kuvaavat julkaisussa J Dairy Sei 82 (1999) 1388-1393 sellaisen jogurttityyppisen tuotteen valmistamista, joka sisältää antihy-pertensiivistä Tyr-Pro -peptidiä (TP). Tuote valmistettiin perinteisellä hapatuk-35 sella Lactobacillus helveticus CPN4 -kannalla. Raaka-aineena oli tässäkin 2 rasvattomasta maitojauheesta (9 %) ennastettu kurri. Hapatus suoritettiin 37 °C:n lämpötilassa ja hapantuminen lopetettiin, kun pH oli laskenut 4,3:een. Muodostuneiden Tyr-Pro -peptidien pitoisuus jogurttituotteesta erotetussa herassa oii noin 8,1 mg/i. Vastaava menetelmä on kuvattu myös US^patentissa 5 5,854,029 ja EP-pateritissa 0 583 074 B1.Yamamoto et al. in J Dairy Sci 82 (1999) 1388-1393 describe the preparation of a yoghurt type product containing the antihypertensive Tyr-Pro peptide (TP). The product was prepared with a traditional strain of Lactobacillus helveticus CPN4. Here again the raw material was Kurri, reconstituted from 2 skimmed milk powder (9%). The acidification was carried out at 37 ° C and the acidification was terminated after the pH had dropped to 4.3. The concentration of Tyr-Pro peptides formed in whey separated from the yogurt product is about 8.1 mg / l. A similar method is also described in U.S. Pat. No. 5,585,029 and EP 0 583 074 B1.
EP-patentti 1 016 709 B1, Yamamoto et ai., koskee Lactobacillus fielveticus -kantoja, jotka tuottavat suuria määriä ns. laktotripeptidejä, eli VPP:tä ja IPPtta. Peptidien pitoisuus VFP-peptideiksi laskettuna on yli 60 mg/i.EP-A-1 016 709 B1 to Yamamoto et al. Relates to Lactobacillus fielveticus strains which produce large amounts of so-called. lactotripeptides, i.e. VPP and IPP. The concentration of peptides, calculated as VFP peptides, is greater than 60 mg / l.
Parasta tuottoa saatiin käyttäen CM 4 -kantaa, joka perinteisellä hapatuksella 10 rasvattomasta maitojauheesta (9 %J ennastetulla kurrialustalla tuotti VPP:tä 74,4 mg/i. Hapatusolosuhteet olivat 32 °C ja 20 h. EP-juikaisu 1 142 481 A1,The best yield was obtained using a CM 4 strain which, by conventional acidification from 10 skimmed milk powder (9% J on a reconstituted courgette medium, produced 74.4 mg / l of VPP. The acidification conditions were 32 ° C and 20 h. EP stripping 1 142 481 A1,
Kitamura ja Ueyama, koskee edellä kuvatusta menetelmästä muokattua menetelmää, jossa kasvualustaa sekoitetaan joko yhtäjaksoisesti tai ajoittaisesti nopeudella 50 rpm. Julkaisun mukaan tällä menetelmällä saadaan tuote, jonka 15 viskositeetti on paljon alempi, ja josta heran talteenotto on tehokkaampaa. Verenpainetta aientavien peptidien saanto pysyy suurin piirtein samana verrattuna hapatukseen, jossa ei käytetä sekoitusta, EP-patentissa 1 266 267 B1, Valio Oy, kuvataan menetelmää verenpainetta alentavia peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi, joka me-20 neteimä käsittää kaksi päävaihetta, fermentoinnin ja nanosuodatuksen. Verenpainetta aientavia peptidejä vapautettiin maitoproteiinista hapattamalla tuo-tantokantaa rasvattomasta maitojauheesta (9-10 %) valmistetulla kasvualustana 37 °C:n lämpötilassa 22-24 tuntia. Kasvatuksen aikana pH:n annettiin laskea 3,3-3,5:een. Hapatuksen päätyttyä pH nostettiin KOH-liuoksella 25 4,6:een rahkasakan saostamiseksi. Tällä menetelmällä valmistettujen veren- painepeptidien pitoisuus on ollut noin 24 mg/l.Kitamura and Ueyama, relates to a method modified from the method described above, wherein the medium is mixed either continuously or intermittently at 50 rpm. According to the publication, this method provides a product with a much lower viscosity and more efficient whey recovery. The yield of the antihypertensive peptides remains approximately the same as that of the unmixed acidification, EP 1 266 267 B1, Valio Oy, discloses a process for the preparation of an antihypertensive peptide product comprising two main steps, fermentation and nanofiltration. The antihypertensive peptides were released from the milk protein by fermentation of the production strain as a medium prepared from skimmed milk powder (9-10%) at 37 ° C for 22-24 hours. During culturing, the pH was allowed to drop to 3.3-3.5. At the end of the acidification, the pH was raised to 4.6 with KOH solution to precipitate the slurry. The concentration of blood pressure peptides produced by this method has been about 24 mg / l.
Yhteistä edellä kuvatuille menetelmille on, että hapatus tehdään perinteisesti. Perinteisellä hapatuksella tarkoitetaan hapatusta, jossa pH:n yleensä annetaan laskea vapaasti fermentaation aikana, ja hapatus lopetetaan kun 30 pH on laskenut tiettyyn arvoon. Yleensä hapatteet lisätään maitoon maidon pH:ssa, eli pH-arvossa noin 6,5.Common to the methods described above is that the acidification is conventionally performed. Conventional acidification refers to acidification where the pH is generally freely lowered during fermentation and is terminated when the pH has dropped to a certain value. Generally, the acidifiers are added to the milk at a pH of about 6.5.
US-pateniissa 5,449,661, Nakamura et ai., mainitaan, että fermentaation alussa pH voidaan säätää arvoon 6-7, ja että pH voidaan säätää myös fermentaation aikana esimerkiksi NaOHJIa tai KOH:lla.U.S. Patents 5,449,661 to Nakamura et al. Mention that the pH at the beginning of the fermentation can be adjusted to 6-7, and that the pH can also be adjusted during the fermentation, for example with NaOH or KOH.
35 WO-patenttijulkaisussa 04/060073, Unilever N.V., kuvataan fermen- toitua maitotuotetta, joka sisältää tripeptidiä VPP ja/tai IPP, Tuotetta valmiste- t 3 taan fermentoimafta maitoa Lactobacillus helveticus -kannalla CNRZ 244, jolloin pH pidetään arvossa 4,3-5,9 emäslisäyksellä, Julkaisun mukaan käytetty kanta tuottaa suuria määriä tripeptidejä, ja sen pH-optimi on noin 4,5.35 WO 04/060073, Unilever NV, discloses a fermented milk product containing the tripeptide VPP and / or IPP. The product is prepared by fermenting milk with Lactobacillus helveticus strain CNRZ 244, maintaining the pH at 4.3-5. , With 9 base addition, the strain used in the publication produces large amounts of tripeptides and has an optimum pH of about 4.5.
Vapaassa hapatuksessa vain osa laktoosista fermentoidaan maito-5 hapoksi. Tyypillisesti rasvatonta maitoa hapatettaessa muodostuneen maitohapon pitoisuus on 1,5-2 % ja jäännöslaktoosin pitoisuus 2,5-3 %. Perinteisellä hapatuksella saadun tuotteen happamuus on osalle kuluttajia epämieluisa, ja korkea laktoosipitoisuus aiheuttaa laktoosille herkille ihmisille epämiellyttäviä ja kivuliaita vatsa- ja suolisto-oireita. Näihin ongelmiin edellä mainittu, 10 EP-patentissa 1 266 267 Bt, Valio Oy, kuvattu menetelmä nanosuodatusvai-h eineen ta rjoaa erään ratkaisu n.In free acidification, only a portion of the lactose is fermented to lactic acid. Typically, the concentration of lactic acid formed during the fermentation of skimmed milk is 1.5-2% and the residual lactose content is 2.5-3%. The acidity of the product obtained by conventional acidification is unpleasant to some consumers and high lactose levels cause unpleasant and painful stomach and intestinal symptoms in people who are lactose sensitive. To overcome these problems, the above-described process with the nanofiltration steps described in Valio Oy, EP Patent No. 1 266 267 Bt, provides a solution n.
Terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien saannon parantamiseksi on myös esitetty vaihtoehtoja, jotka useimmiten liittyvät tehokkaiden proteo-lyyttlsten tuotantobakteerien löytämiseen. WO-patenttijuikaisussa 03/082019 15 A2, Chr. Hansen A/S, kuvataan menetelmää verenpainetta aientavien peptidien valmistamiseksi, jossa menetelmässä käytetään proteolyyttisen kannan lisäksi lyyttistä (autolysoituvaa) kantaa, jolloin lyyttisen kannan tuottamien pep-tidaasientsyymien avulla pystytään vapauttamaan enemmän verenpainepepti-dejä raaka-aineesta kuin käytettäessä pelkästään proteolyyttistä tuotantokan-20 taa.Alternatives, most often related to the discovery of efficient proteolytic production bacteria, have also been proposed to improve the yield of therapeutically useful peptides. WO Patent Application 03/082019 15 A2, Chr. Hansen A / S describes a method for producing hypertensive peptides using a lytic (autolysable) strain in addition to a proteolytic strain, whereby the peptide enzymes produced by the lytic strain are capable of releasing more hypertensive peptides from the raw material than from using protein alone.
Keksinnön lyhyt kuvausBrief Description of the Invention
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tarjota uusi menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, jolla menetelmällä saadaan aiempaa korkeampi peptidisaanto.It is an object of the present invention to provide a novel process for the preparation of therapeutically useful peptides which provides a higher peptide yield.
25 Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on lisäksi tarjota uusi mene- telmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, jolla menetelmällä lopputuotteen laktoosipitoisuutta voidaan vähentää merkittävästi.It is a further object of the present invention to provide a novel process for the preparation of therapeutically useful peptides by which the lactose content of the final product can be significantly reduced.
Keksintö koskee siten menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisia, erityisesti verenpainetta aientavia, peptidejä sisältävän tuotteen vaimistami-30 seksi fermentoimaila maitoproteiinia maitohappobakteerilla, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että maitohappobakteeri on terapeuttisesti käyttökelpoisia, erityisesti verenpainetta alentavia, peptidejä tuottava maitohappobakteeri ja että fermehtointi suoritetaan lisätyn laktaasin läsnä oilessa.The invention thus relates to a process for the preparation of a therapeutically useful peptide-containing product, in particular antihypertensives, by fermentation of a milk protein with a lactic acid bacterium, characterized in that the lactic acid bacterium is a therapeutically useful, in particular, hypertensive and lactic acid producing peptide.
Eräässä edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mukaisessa me-35 netetmässä terapeuttisesti käyttökelpoisia peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi fermentoinnissa käytetään laktaasin lisäksi pH-saätÖä.In a preferred embodiment, the fermentation of the present invention involves the use of pH control in addition to lactase to produce a product containing therapeutically useful peptides.
44
Eräässä toisessa edullisessa Suoritusmuodossa keksinnön mukaisessa menetelmässä terapeuttisesti käyttökelpoisia peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi fermentoimalia maitoproteiinia maitohappobakteerilla käytetään maitohappobakteerina sukuun Lactobacillus kuuluvaa mlkro-orga-5 nismia. Edullisemmin käytetään Lactobacillus heiveticus -kantaa. Erityisen edullinen on Lactobacillus heiveticus LB1936, DSM 17754.In another preferred embodiment, the lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus is used as the lactic acid bacterium in the preparation of a product containing therapeutically useful peptides according to the invention. More preferably, the strain of Lactobacillus heiveticus is used. Particularly preferred is Lactobacillus heiveticus LB1936, DSM 17754.
Keksintö koskee myös kantaa Lactobacillus heiveticus LB 1936, DSM 17754.The invention also relates to Lactobacillus heiveticus LB 1936, DSM 17754.
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on myös tarjota keksinnön ίο mukaisella menetelmällä valmistettua bioaktiivisia peptidejä sisältävää tuotetta tai siitä puhdistettuja bioaktiivisia peptidejä käyttöön joko sellaisenaan terveysvaikutteisena aineena tai nautittavaksi tarkoitettujen aineiden, kuten terveysvaikutteisten elintarvikkeiden tai lääkeaineiden valmistuksessa.It is also an object of the present invention to provide a product containing bioactive peptides or purified bioactive peptides prepared by the process of the invention, either as such as a health active ingredient or in the preparation of ingestible substances such as health food or pharmaceuticals.
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on lisäksi tarjota käyttöön 15 suun kautta nautittavia tuotteita, kuten terveysvaikutteisia elintarvikkeita ja lääkeaineita, jotka eräänä vaikuttavana ainesosanaan sisältävät edeiiä kuvatulla menetelmällä valmistettua tuotetta täi siitä puhdistettuja bioaktiivisia peptidejä.It is a further object of the present invention to provide orally administered products, such as health food and pharmaceuticals, which contain, as an active ingredient, a product prepared by the method described herein, supplemented with purified bioactive peptides.
Kuvioiden lyhyt selostusBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Kuvassa 1 esitetään pH-käyrä, joka saadaan suorittamalla perintei-20 nen fermentaatio ilman laktaasiiisäystä tai pH-säätöä (vertailu).Figure 1 shows the pH curve obtained by performing conventional fermentation without lactase addition or pH adjustment (comparison).
Kuvassa 2 esitetään pH-käyrä, joka saadaan suorittamana fermentaatio keksinnön mukaisella laktaasiiisäykseila ilman pH-säätöä.Figure 2 shows the pH curve obtained by fermentation with a lactase inoculum according to the invention without pH adjustment.
Kuvassa 3 esitetään pH-käyrä, joka saadaan suorittamalla fermentaatio keksinnön mukaisella laktaasiiisäykseila ja pH-säädöllä.Figure 3 shows the pH curve obtained by performing the fermentation with the lactase addition step of the invention and adjusting the pH.
25 Kuvassa 4 esitetään pH-käyrä, joka saadaan suorittamaiia fermen- taatiö keksinnön mukaisella laktaasilisäyksellä ja pH-säädöiia,Figure 4 shows the pH curve obtained by fermentation of the lactam with the lactase addition according to the invention and the pH adjustment,
Kuvassa 5 esitetään pH-käyrä, joka saadaan suorittamaiia fermentaatio käyttäen pH-säätöä ilman iaktaasilisäystä.Figure 5 shows the pH curve obtained by fermentation of the fermentation broth using pH adjustment without addition of lactase.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 30 Esillä olevan keksinnön mukaisesti on siis yllättäen havaittu, että edellä esitetyt tavoitteet voidaan saavuttaa uudella meneteimäliä, joka perustuu laktaasi-entsyymin käyttöön fermentoinnin tehostamiseksi.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Thus, according to the present invention, it has surprisingly been found that the above objects can be achieved by a novel process based on the use of the enzyme lactase to enhance fermentation.
Laktaasia eli β-D-gaiaktosidaasia on kaupallisesti saatavissa useina eri entsyymivaimisteina. Esimerkkeinä hiivaperäisistä kaupallisista laktaasi- i 5 valmisteista voidaan mainita mm. GODO YNL (Godo Shusei Company, Japani), Maxilakt L2000 (DSM, Gist-Brocades, Alankomaat), Validase (Valley Research inc., USA), Ha-Lactase (Chr. Hansen A/S, Tanska), ja Laetozym 3000L (Novo Nordisk A/S, Novozymes, Tanska). Lisäksi on homeperäisiä lak-5 taasivalmisteita saatavilla, kuten mm. GLL-Conc. (Biocon Japan Ltd). Entsyymien optimaaliset hydrolyysiolosuhteet voivat vaihdella valmisteesta riippuen, ja ne valitaan kulloinkin käytettävän entsyymin valmistajan ohjeiden mukaisesti.Lactase, or β-D-galactosidase, is commercially available as a variety of enzyme preparations. As examples of yeast-derived commercial lactase preparations, e.g. GODO YNL (Godo Shusei Company, Japan), Maxilakt L2000 (DSM, Gist-Brocades, The Netherlands), Validase (Valley Research inc., USA), Ha-Lactase (Chr. Hansen A / S, Denmark), and Laetozym 3000L ( Novo Nordisk A / S, Novozymes, Denmark). In addition, mold-based lak-5 re-formulations are available, including e.g. GLL-Conc. (Biocon Japan Ltd). Optimal hydrolysis conditions for the enzymes may vary depending on the preparation and are selected according to the manufacturer of the enzyme used.
Laktaasia käytetään meijeriteollisuudessa vähälaktoosisten ja lak-10 toosittomien tuotteiden valmistuksessa. Lähtöaineena käytettävä maito voidaan esikäsiteilä erilaisia kromatografisia tai kalvotekniikoita käyttäen, minkä jälkeen laktaasia lisätään (jäännös)laktoosin poistamiseksi. Tällaista menetelmää laktoosittoman maidon valmistamiseksi on kuvattu Fi-patentissa 115752, Valio Oy. EP-patentissa 1 266 267 B1, Valio Oy, kuvatussa menetelmässä te-15 rapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi kuvataan eräänä vaihtoehtona lakfaasin käyttöä laktoosin pilkkomiseksi ennen nanosuodatusvaihet-ta. Laktaasin lisäämistä fermentointivaiheessa ei ole kuvattu verenpainetta alentavien peptidituotteiden valmistusta koskevassa kirjallisuudessa.Lactase is used in the dairy industry for the manufacture of low-lactose and lactose-free products. The milk to be used as the starting material may be pre-treated using various chromatographic or membrane techniques, followed by the addition of lactase (residue) to remove lactose. Such a method for producing lactose-free milk is described in Fi patent 115752, Valio Oy. Valio Oy, a process for preparing therapeutically useful peptides described in EP 1 266 267 B1, describes one alternative use of lactase to cleave lactose prior to the nanofiltration step. The addition of lactase during the fermentation step has not been described in the literature for the preparation of antihypertensive peptide products.
Keksinnön mukaisessa fermentoinnissa lähtöaineena voidaan 'käyt-20 tää mitä tahansa tuotetta, joka sisältää haluttujen terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien sekvenssejä osana omaa peptidi- tai proteiinisekvenssiääh. Edullisesti käytetään maidon proteiinia, erityisesti kaseiinia, sellaisenaan tai erilaisten valmisteiden muodossa. Lähtöaineeksi soveltuvat myös erilaiset kaseiinia sisältävät maitotuotteet, kuten rasvaton tai rasvapitoisuudeltaan vaihte-25 leva maito sellaisenaan tai vastaavan maitojauheen muodossa ja hapatetut maitotuotteet, kuten piimä, kirnupiimä, jogurtti, viili, tuorejuustot, jne. Eläin-maidon (isäksi lähtöaineena voidaan käyttää myös kasviperäistä maitoa ja siitä valmistettuja tuotteita, esimerkiksi soija-, vehnä- tai kauramaitoa tai näistä saatuja proteiineja.In the fermentation of the invention, any product containing the sequences of the desired therapeutically useful peptides as part of its own peptide or protein sequence can be used as starting material. Preferably the milk protein, especially casein, is used as such or in the form of various preparations. Also suitable are various dairy products containing casein, such as skimmed or semi-skimmed milk as such or in the form of powdered milk and acidified dairy products such as milk, buttermilk, yoghurt, filet, cream cheese, etc. Animal milk may also be used as a parent. and products derived therefrom, for example, soy, wheat or oat milk or proteins derived therefrom.
30 Fermenteinti voidaan suorittaa millä tahansa maitohappobakteerilla, joka kykenee tuottamaan haluttuja terapeuttisesti käyttökelpoisia peptidejä lähtöaineesta. Sopivia maitohappobakteereja voi löytyä mm. sukuihin Lactobacillus, Laciococcus, Leuconostoc, Streptococcus ja Bifidobacterium kuuluvista lajeista. Maitohappobakteereista proteolyyttisin on Lactobacillus helveticus, ja 35 tätä pidetään siten erityisen sopivana tähän tarkoitukseen. Maitohappobakteereja voidaan käyttää puhdasviijelmlnä tai sekaviljelminä, erikseen tai tavan- 6 omaisesti käytettyjen ja kaupallisesti saatavien hapatteiden kanssa. Maitohappobakteereja voidaan myös käyttää yhdessä muiden mikro-organismien kanssa. Mikrobiyhdistefmien osalta valitaan tarkoituksenmukaisesti sellaisia yhdistelmiä, joilla saadaan lopputuotteeseen paras mahdollinen maku ja joilla kon-5 taminaatioriski väistyy.The fermentation can be carried out with any lactic acid bacterium capable of producing the desired therapeutically useful peptides from the starting material. Suitable lactic acid bacteria can be found e.g. Lactobacillus, Laciococcus, Leuconostoc, Streptococcus and Bifidobacterium. The most lactolactic bacterial proteolytic is Lactobacillus helveticus and is therefore considered particularly suitable for this purpose. Lactic acid bacteria can be used as pure inoculum or mixed cultures, alone or with conventionally used and commercially available acids. Lactic acid bacteria can also be used in combination with other microorganisms. For microbial compound formulations, combinations that provide the best taste to the final product and which eliminate the risk of contamination are appropriately selected.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti edullinen Lactobacillus helvetl· cus -kanta on L. helveticus IB 1936, DSM 17754.A preferred Lactobacillus helvetl · cus strain according to the present invention is L. helveticus IB 1936, DSM 17754.
Lactobacillus-sukuun ja Lactobacillus helveticus -lajiin kuuluvien bakteerien luokitus ja yleiset ominaisuudet esitetään mm. teoksessa Bergey's 10 Manual of Systematic Bacteriology, voi. 2, Sneath et al., Williams & Wilkins, Baltimore, London, Los Angeles, Sydney, 1984, osa 14, s. 1208 eteenpäin. Lactobacillus helveticus -kannat on yleensä eristetty meijerituotteista, kuten fermentoiduista maitotuotteista ja juustoista, ja niitä käytetään perinteisesti ha-patteina juustojen, erityisesti Emmental- ja Gruyere-tyyppisten juustojen val-15 mistuksessa.The classification and general characteristics of the bacteria belonging to the genus Lactobacillus and the species Lactobacillus helveticus are presented, inter alia, in Bergey's 10 Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, Sneath et al., Williams & Wilkins, Baltimore, London, Los Angeles, Sydney, 1984, Vol. 14, p. 1208 forth. Lactobacillus helveticus strains are generally isolated from dairy products, such as fermented milk products and cheeses, and are traditionally used as inhibitors in the manufacture of cheeses, particularly Emmental and Gruyere cheeses.
Lactobacillus helveticus LB 1936 on talletettu talletuslaitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH (DSMZ). Sen tailetusnumero on DSM 17754 ja talletuspäivämäärä 25.11.2005, ja sillä on seuraavat ominaisuudet: 20 Gram-positiivinen Lactobacillus helveticus -kanta, joka morfologial taan on lyhyt sauva. Lämpötilaoptimi on noin 35-45 °C, edullisesti noin 37-42 °C, ja pH-optimi on noin 4,5-7. Kanta on proteolyyttisesti aktiivinen, se sietää hyvin happamuutta ja muodostaa fermentoinnissa DL-maitohappoa. Hiilen-lähteenä se pystyy käyttämään mm. galaktoosia, glukoosia, fruktoosia, man-25 noosia, N-asetyyliglukoosiamiinia, maitoosia, laktoosia ja trehaloosia.Lactobacillus helveticus LB 1936 is deposited with the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH (DSMZ). It has a strain number of DSM 17754 and a deposit date of November 25, 2005, and has the following characteristics: 20 gram-positive strain of Lactobacillus helveticus, morphologically a short rod. The temperature optimum is about 35-45 ° C, preferably about 37-42 ° C, and the pH optimum is about 4.5-7. The strain is proteolytically active, highly tolerant to acidity and forms DL-lactic acid during fermentation. As a carbon source, it can use e.g. galactose, glucose, fructose, man-25 noose, N-acetylglucoseamine, milk, lactose and trehalose.
Lactobacillus helveticus LB 1936 kasvaa hyvin laktobasiileille tavallisesti käytetyissä kasvatusalustoissa, kuten Rogosa- ja MRS-iiemessä, ja maidossa, kuten esimerkiksi käsittelemättömissä maidossa, rekonstruoidussa maitojauhemaidossa tai ultraäänellä käsitellyssä maidossa, ja sitä voidaan 30 tuottaa kasvattamalla tällaisessa kasvatusalustassa tavanomaisia menettelyjä käyttäen,Lactobacillus helveticus LB 1936 grows well in lactobacilli commonly used media, such as Rogosa and MRS broth, and in milk, such as untreated milk, reconstituted milk powder or ultrasonically treated milk, and can be produced by growth such as
Lactobacillus helveticus LB 1936 voidaan käyttää terveysvaikutteisena aineena seliisenaan, nautittavaksi tarkoitettujen aineiden valmistuksessa tai nautittavaksi tarkoitettujen aineiden ainesosana tai lisäaineena. Edullisesti 35 sitä käytetään erikoistuotteiden, kuten bioaktiivisia peptidejä sisältävien fer-mentöitujen maitotuotteiden valmistuksessa, mutta se on myös käyttökelpoi- 7 nen tavanomaisena hapatebakteerina meijeriteollisuudessa, esimerkiksi fer-mentoitujen maitotuotteiden ja juustojen valmistuksessa.Lactobacillus helveticus LB 1936 may be used as a health active ingredient in the form of selenium, in the manufacture of ingestible substances or as an ingredient or adjuvant in ingestible substances. It is preferably used in the manufacture of specialized products such as fermented milk products containing bioactive peptides, but is also useful as a conventional acid bacterium in the dairy industry, for example in the manufacture of fermented milk products and cheeses.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti fermentointi suoritetaan laktaa-sin läsnä ollessa. Laktaasia lisätään laktoosin hydrolysoimiseksi glukoosiksi ja 5 galaktooSiksi. Monosakkaridit ja varsinkin glukoosi ovat nopeammin ja tehokkaammin käytettävissä fermentoinnissa mikro-organismien hiiienlähteinä kuin disakkaridi, joten laktoosin hydroiyysi nopeuttaa huomattavasti fermentaatiota.According to the present invention, the fermentation is carried out in the presence of lactase. Lactase is added to hydrolyze lactose to glucose and galactose. Monosaccharides, and glucose in particular, are faster and more efficient in fermentation as the carbon source of microorganisms than disaccharide, so hydrolysis of lactose significantly accelerates fermentation.
Keksinnön mukainen etu on suurimmillaan käytettäessä tuotantökantaa, joka kykenee tuottamaan terapeuttisesti aktiivisia peptidejä proteiinilähteestä hyvin, 10 mutta joka metaboloi hitaasti laktoosia, mutta saanto paranee myös muilla kannoilla niiden kasvuolosuhteiden parannettua laktaasilisäyksen seurauksena.The advantage of the invention is greatest when using a production strain which is able to produce therapeutically active peptides well from a protein source, but which slowly metabolizes lactose, but the yield is improved by other strains as a result of their lactase addition.
Laktaasina voidaan käyttää kaupallisia iaktaasivaimisteita, kuten edellä kuvattuja valmisteita. Puhtaan entsyyrnivalmisteen lisäksi voidaan myös 15 käyttää epäpuhtaita entsyymivalmisteita ja jopa suuren laktaasiaktiivisuuden omaavaa mikro-organismia sellaisenaan tai siitä saadun uutteen tai muun yhdistelmän muodossa.Commercial lactase formulations such as those described above can be used as lactase. In addition to the pure enzyme preparation, impure enzyme preparations and even a microorganism having a high lactase activity may be used as such or in the form of an extract or other combination thereof.
Laktaasia käytetään sellainen määrä, jolla aikaansaadaan optimaalinen iaktoosihydrolyysiteho. Määrä voi olla esimerkiksi noin 10-10 000 p\/\ 20 (maitoa), edullisesti noin 50-300 μ\!\ (maitoa). Käytettyyn määrään vaikuttaa valittu entsyymivalmiste ja sen aktiivisuus. Ylimäärin annostelusta ei ole mitään haittaa, mutta kustannussyistä määrää pyritään kuitenkin pitämään mahdollisimman pienenä.The amount of lactase is used in an amount that provides optimum lactose hydrolysis efficiency. For example, the amount may be from about 10 to about 10,000 microns (milk), preferably from about 50 microns to about 300 microns (milk). The amount used depends on the enzyme preparation selected and its activity. There is no harm in dosing excess, but for reasons of cost, the goal is to keep the amount as low as possible.
Eräässä keksinnön edullisessa suoritusmuodossa fermentoinnissa 25 käytetään iaktaasiiisäyksen lisäksi pH-säatöä. Tavallisessa fermentoinnissa pH:ta ei säädetä, jolioin se fermentoinnissa syntyneen maitohapon johdosta laskee selvästi happamaksi, yleensä jopa arvoon noin 3-3,5. Esillä olevan keksinnön puitteissa on yflättäen havaittu, että myös pH-säädöl!ä on merkittävä vaikutus haluttujen terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien saantoon. Pi-30 tämäilä pH arvossa noin 4,6-7, edullisesti arvossa noin 4,8-6, edullisemmin arvossa noin 5-5,5, ja erityisesti arvossa 5,1-5,3 esillä olevan keksinnön mukaisesti voidaan varmistaa, että kaseiinia on proteolyyttisten entsyymien tavoitettavissa ja siten käytettävissä peptidien tuottamiseksi. Vaikka fermentoinnissa aina syntyy hiutaleita, kaseiinia ei ole niin paljon saostuneena kuin alem-35 massa pH-arvossa, ja helpon tavoitettavuuden takia menetelmän saanto paranee entisestään. pH-arvon säätäminen on havaittu erityisen edulliseksi fer- i δ mentöinnin alkuvaiheessa ja tehokkaimman mikro-organismi(e)n kasvun aikana. pH:n tasainen säätö pidetään edullisena suoritusmuotona, mutta pH:n säätö voi olla myös jaksottaista. Fermentoinnin loppuvaiheessa pH:n säätö voidaan lopettaa ja pH:n antaa laskea vapaasti ilman että saanto laskee. Siinä 5 vaiheessa pH ei kuitenkaan yleensä laske alle arvoa 4,6.In a preferred embodiment of the invention, in addition to the lactase addition, pH is used in the fermentation. In normal fermentation, the pH is not adjusted, whereby, due to the lactic acid produced during the fermentation, it is clearly acidified, usually up to about 3-3.5. Within the framework of the present invention, it has been surprisingly found that pH control also has a significant effect on the yield of the desired therapeutically useful peptides. The pH of the Pi-30 at about 4.6-7, preferably at about 4.8-6, more preferably at about 5-5.5, and especially at 5.1-5.3, according to the present invention, is to ensure that casein is accessible to proteolytic enzymes and thus available for the production of peptides. Although flakes are always formed during fermentation, casein is not as precipitated as Alem-35 at pH, and due to its easy availability, the yield of the process is further improved. Adjustment of pH has been found to be particularly advantageous in the initial stages of fermentation and during the growth of the most efficient microorganism (s). Evenly adjusting the pH is considered a preferred embodiment, but the pH may also be intermittent. At the end of the fermentation, the pH adjustment can be stopped and the pH can be freely lowered without decreasing the yield. However, at that 5 step, the pH does not generally fall below 4.6.
pH:n säätämiseksi voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa emäksistä ainetta. Yleisesti käytettyjä aineita ovat mm. KOH ja NaOH, ja näiden pitoisuus voi olla noin 10-90 %. Usein käytetään noin 50-prosenttista KOH-iiuosta. pH:n säätöön tarvittava määrä riippuu fermentoinnin muista parametreistä. pH:n 10 kontrolli ja säätäminen sekä sopivan säätökemikaaiin käyttömäärän toteaminen halutun pH:n ylläpitämiseksi kuuluvat alan asiantuntijan tietotaitoihin.Any suitable alkaline agent may be used to adjust the pH. Commonly used substances include e.g. KOH and NaOH, and may be present in a concentration of about 10-90%. Often about 50% KOH solution is used. The amount required to adjust the pH depends on other parameters of the fermentation. Control and adjustment of pH 10 and determination of the appropriate amount of control chemical to be used to maintain the desired pH are within the skill of the art.
Fermentointiolosuhteet valitaan fermentoinnissa käytettävän kannan vaatimusten mukaisesti siten, että muodostuu optimaalinen määrä terapeuttisesti käyttökelpoisia peptidejä. Sopivien olosuhteiden, kuten esimerkiksi 15 kasvuaiustam lämpötilan ja ilmastuksen valinta kuuluvat alan asiantuntijoiden tietotaitoihin. Lämpötila voi olla esimerkiksi 30-45 °C.The fermentation conditions are selected according to the requirements of the strain used in the fermentation so that an optimal amount of therapeutically useful peptides is formed. The selection of suitable conditions, such as 15 growth temperature and aeration, is within the skill of the art. The temperature may be, for example, 30-45 ° C.
Fermentoinnin annetaan jatkua, kunnes haluttu määrä peptidejä on muodostunut. Aikaa tähän kuluu normaalisti noin 20-30 h, edullisesti 22-25 h.The fermentation is allowed to continue until the desired amount of peptides is formed. This usually takes about 20-30 hours, preferably 22-25 hours.
Fermentoinnissa muodostuu erilaisten peptidien seos. Peptidien 20 koko on riippuvainen fermentoinnin pituudesta, mitä lyhyempi fermentointiaika, sitä pitempiä ovat muodostuneet peptidit, ja mitä kauemmin fermentointi kestää, sitä enemmän syntyy pieniä peptidejä. Kun fermentointi kestää riittävän kauan, saadaan pääasiassa suhteellisen pieniä di- ja tripeptjdejä, kuten esimerkiksi Val-Pro-Pro (VPP) ja lie-Pro-Pro (IPP), joilla on havaittu olevan mm. 25 erinomainen verenpainetta alentava vaikutus.During fermentation, a mixture of different peptides is formed. The size of the peptides 20 is dependent on the length of the fermentation, the shorter the fermentation time, the longer the peptides formed, and the longer the fermentation, the more small peptides are formed. When fermentation is long enough, predominantly relatively small di- and tripeptides, such as Val-Pro-Pro (VPP) and lie-Pro-Pro (IPP), are found to have, e.g. 25 excellent antihypertensive effect.
Fermentoinnin jälkeen solususpensio kerätään talteen. Tarkoituksen mukaan solususpensio voidaan jatkokäsitellä halutulla tavalla, esimerkiksi poistamalla siltä mahdollinen jäännöskaseiini tai kaikki maidon proteiinit alalla tunnetuin puhdistusmenetelmän, kuten saostus-, suodatus- tai kaivomenetei-30 min tai lämpökäsittelyllä. Yhteissaostusta, jolla saadaan lähes proteiinitonta, peptidit sisältävä heraa, voidaan aikaansaada esimerkiksi CaGi2-lisäyksellä, lämpökäsittelyllä tai happolisäykseiiä, Tarvittaessa käytetään sentrifugikäsittelyä. Solususpensiota voidaan myös käsitellä tai viimeistellä nanosuodattamal-la, ultrasuodattamalla tai muita kalvotekniikoita tai kromatografiaa käyttäen. 35 Peptidit voidaan erottaa ja puhdistaa siitä esimerkiksi kromatografisesti tai kal-votekniikoiden avulla.After fermentation, the cell suspension is collected. It is contemplated that the cell suspension may be further treated as desired, for example, by removing any residual casein or all milk proteins by a purification method known in the art, such as precipitation, filtration, or well, or by heat treatment. Co-precipitation to obtain a nearly protein-free, peptide-containing whey can be effected, for example, by addition of CaGl 2, heat treatment or acid addition. Centrifuge treatment may be used if necessary. The cell suspension may also be treated or finalized by nanofiltration, ultrafiltration, or other membrane techniques or chromatography. Peptides can be separated and purified therefrom, for example, by chromatography or membrane techniques.
99
Soiususpensiota voidaan myös käyttää suoraan tai se voidaan konsentroida, esimerkiksi- haihduttamalla tai kuivaamalla osittain tai kokonaan, kuten levittämällä se levylle, kuivaamalla ja lopuksi jauhamalla hyvin säilyvän kuivan jauheen saamiseksi.The moss suspension can also be used directly or concentrated, for example, by evaporation or partial or total drying, such as applying to a plate, drying and finally grinding to obtain a well-preserved dry powder.
5 Esillä olevan keksinnön puitteissa on edulliseksi loppukäsittelyksi havaittu menetelmä, jossa kaseiinisakka fermentaation jälkeen erotetaan separaattorilla ja hera kirkastetaan kirkastuslingolla. Tämä jälkeen hera nano-suodatetaan ja retentaatti haihdutetaan tiivisteeksi. Retentaatti voidaan myös haihduttaa ja kuivata spraykuävurilia jauheeksi.Within the scope of the present invention, a process has been found to be advantageous for the final treatment, wherein the casein precipitate after fermentation is separated by a separator and the whey is clarified by a clarifying centrifuge. The whey is then nano-filtered and the retentate is evaporated to a concentrate. The retentate can also be evaporated and dried as a spray powder.
10 Keksinnön mukaisella menetelmällä saatua bioaktiivisia peptidejä sisältävää ja mahdollisesti konsentroitua tuotetta voidaan siis käyttää sellaisenaan terveysvaikutteisena aineena. Kuivattua tuotetta voidaan myös käyttää jauheen tai iyofilisoidun valmisteen muodossa. Esillä olevan keksinnön mukaisesti tuotetta käytetään kuitenkin edullisesti terveysvaikutteisten efintarvikkei-15 den tai muiden tuotteiden valmistuksessa.Thus, the product containing the bioactive peptides obtained by the process of the invention and possibly concentrated, can be used as such as a health active ingredient. The dried product may also be used in the form of a powder or lyophilized preparation. However, in accordance with the present invention, the product is preferably used in the manufacture of health-promoting foods or other products.
Käsitteellä elintarvike on tässä julkaisussa laaja merkitys kattaen kaikki nautittavaksi tarkoitetut tuotteet, jotka voivat olla kiinteässä, hyyteiöidys-sä tai nestemäisessä muodossa, ja kattaen sekä valmiit tuotteet että tuotteet, joihin keksinnön mukaisesti saatu tuote lisätään nauttimisen yhteydessä, iisä-20 aineeksi tai osaksi tuotetta. Elintarvikkeet voivat olla esimerkiksi meijeriteollisuuden, iihanjalosiusteoliisuuden, einesteollisuuden, juomateollisuuden, leipomoteollisuuden ja makeisteollisuuden tuotteita. Tyypillisiä ovat maitotuotteet, kuten jogurtti, viili, rahka, piimä, kirnupiimä, muut hapanmaitojuomat, tuorejuustot ja kypsytetyt juustot, välipalasnackien täytteet, jne. Toisen tärkeän 25 ryhmän muodostavat juomat, kuten herajuomat, hedetmäjuomat, ja oluet.The term food has a broad meaning in this publication, encompassing all products intended for ingestion, which may be in solid, gelatinized or liquid form and encompassing both finished products and products to which the product of the invention is added upon ingestion, as an additive or as part of a product. Foodstuffs may be, for example, products of the dairy industry, the pulp industry, the food industry, the beverage industry, the bakery industry and the confectionery industry. Typical are dairy products such as yogurt, frankfurters, quark, buttermilk, buttermilk, other sour milk drinks, cream cheese and matured cheeses, snack fillings, etc. Beverages such as whey drinks, fruit drinks, and beers form another important category.
Bioaktiivisia peptidejä sisältävää tuotetta voidaan lisätä elintarvikkeeseen sen valmistusprosessin aikana tai jo valmistettuun elintarvikkeeseen. Kyseiset elintarvikkeet sisältävät siis keksinnön mukaisesti saatua bioaktiivisia peptidejä sisältävää tuotetta tai siitä eristettyjä ja/tai puhdistettuja bioaktiivisia 30 peptidejä muiden vastaavanlaisiin elintarvikkeisiin sisältyvien, ainesosien lisäksi, ja vastaavat maultaan ja käyttötavoiltaan täysin näitä tavanomaisia tuotteita.The product containing the bioactive peptides may be added to the food during the manufacturing process or to the food already prepared. The foodstuffs in question thus contain, in addition to the ingredients contained in the bioactive peptide product of the invention or isolated and / or purified bioactive peptides, ingredients which are similar in taste and usage to those conventional products.
Kun lopputuote on maitotuote, voidaan se ennen pakkaamista viimeistellä iämpökäsitteiyiiä, joka suoritetaan esimerkiksi pastöroimalla {72 °D, 35 15 s), ESL-käsitteiyllä (130 °G, 1-2 s) tai UHT-käsitteiyliä (138 °C, 2-4 s).When the final product is a dairy product, it can be pre-packaged by heat treatment, for example by pasteurization at {72 °, 35 for 15 s), ESL (130, for 1-2 seconds) or UHT (138, 2 for 2). 4 s).
1010
Keksinnön mukaisella menetelmällä saavutetaan monta etua. Verrattuna tekniikan tasossa kuvattuihin menetelmiin saanto paranee merkittävästi, Keksinnön mukaisella menetelmällä peptidejä heraan on saatu tuotettua jopa 136 mg/l, jolloin saanto on noin 46 % teoreettisesta saannosta. Vertailun 5 vuoksi voidaan mainita, että käyttämällä perinteiseen hapatukseen perustuvaa menetelmää saanto on noin 24 mg/l. Lisäämällä laktaasia mikro-organismien kasvatusalustaan laktoosin hydroiyysi nopeutuu, mikä puolestaan nopeuttaa huomattavasti fermentöintia. Lisäämällä laktaasia voidaan yllättäen myös huonoista tuotantokannoista tehdä hyvin tuottavia kantoja, ja näin ollen terapeutti-10 sesti käyttökelpoisten peptidien saanto paranee sitäkin kautta.The process according to the invention provides many advantages. Compared to the methods described in the prior art, the yield is significantly improved. The method of the invention has yielded peptides in whey up to 136 mg / l, yielding about 46% of the theoretical yield. For comparison 5, it can be mentioned that the yield using the conventional acidification method is about 24 mg / L. By adding lactase to the culture medium of microorganisms, the hydrolysis of lactose is accelerated, which in turn greatly accelerates the fermentation. Unexpectedly, by adding lactase, poor production strains can also be transformed into highly productive strains, and thus the yield of therapeutically useful peptides is further improved.
Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan myös varmistaa, että kaseiinia on koko ajan tuotanto-organismi(e)n käytettävissä, jolloin lähtöaineesta voidaan vapauttaa bioaktiivisia peptidejä huomattavasti tehokkaammin kuin aikaisemmin, jopa 3 kertaa tehokkaammin. Tälläkin tavoin parannetaan 15 merkittävästi valmistusprosessin tehokkuutta.The process of the invention can also ensure that casein is continuously available to the producing organism (s), whereby the starting material can release the bioactive peptides much more efficiently than before, up to 3 times more efficiently. Again, this significantly improves the efficiency of the manufacturing process.
Keksinnön mukaisella menetelmässä voidaan lisäksi valmistaa jopa täysin laktoositonta tuotetta. Lisäämällä laktaasia ja säätämällä pH saavutetaan se etu, että kaikki kasvualustan laktoosi fermentoidaan maitohapon ka-liumsuoiaksi (kaiiumlaktaatiksi).Furthermore, in the process according to the invention even a completely lactose-free product can be prepared. By adding lactase and adjusting the pH, the advantage is obtained that all lactose in the culture medium is fermented to the potassium salt of lactic acid (potassium lactate).
20 Keksinnön mukainen menetelmä on yksinkertainen ja halpa ja sopii hyvin suuren mittakaavan valmistukseen.The process according to the invention is simple and inexpensive and is suitable for very large scale production.
Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkien avulla. Nämä esimerkit annetaan vain keksinnön valaisemiseksi eikä niitä pidä katsoa sen suojapiiriä mitenkään rajoittaviksi.The invention will be described in more detail by the following examples. These examples are provided for purposes of illustration only and are not to be construed as limiting the scope thereof.
25 Vertailuesimerkki 125 Comparative Example 1
Perinteinen fermentaatioTraditional fermentation
Kylmäkuivattu LB 1936 -hapate valmisiettiiri käyttäen kasvualustana steriloitua herapermeaattipohjaista alustaa, jossa oli lisäravinteina tryptonia ja hiivauutetta, sekä kivennäisiä. Fermentaatio suoritettiin lämpötilassa 37 °C 30 ja pH:ssa 5,0 sekoittaen 100-120 rpm. Kasvatusaika oli 22 h. Fermentaation jälkeen solut konsentroitiin mikrosuodattamalla, minkä jälkeen konsentraatti Syofilisoiiiin.Freeze-dried LB 1936 Acid Protein Titer using sterile whey permeate-based medium supplemented with tryptone and yeast extract as well as minerals. The fermentation was carried out at 37 ° C and pH 5.0 with stirring at 100-120 rpm. The growth time was 22 h. After fermentation, the cells were concentrated by microfiltration followed by concentration of the concentrate into Syophilisol.
Perinteinen hapatus suoritettiin LB 1936 -kannalla käyttäen lähtöaineena rasvatonta maitoalustaa. 4 litraa maitoa pastöroitiin 85 °C:ssa 10 min 35 ja jäähdytettiin hapatuslämpötilaan 42 °C. Kasvualustaan siirrostettiin LB 1936 -hapatetta niin, että elävien solujen pitoisuus hapatuksen alussa oli noin i 11 1,60*10° PMY/g. Maidon annettiin hapantua 42 °C:n lämpötilassa 24 tuntia, Hapantumisen aikana kasvualustaa sekoitettiin 200 rpm:n nopeudella. Kuvassa 1 on esitetty pH-käyrä hapantumisen aikana. Valmiista piimästä erotettiin hera sentrifugoimaila 4000 rpm 15 min ja herasta analysoitiin VPP- ja IPP-5 peptidit, laktoosi, glukoosi, gafaktoosi ja maitohappo.Conventional fermentation was performed on LB 1936 using non-fat milk medium as starting material. 4 liters of milk were pasteurized at 85 ° C for 10 min 35 and cooled to a fermentation temperature of 42 ° C. The medium was inoculated with LB 1936 acid so that the concentration of living cells at the start of acidification was about 11 1.60 * 10 ° CFU / g. The milk was allowed to acidify at 42 ° C for 24 hours, during which the medium was agitated at 200 rpm. Figure 1 shows the pH curve during acidification. Whey was separated from the prepared milk by centrifugation at 4000 rpm for 15 min and analyzed for VPP and IPP-5 peptides, lactose, glucose, gaffactose and lactic acid.
Vertailuesimerkin mukaisesti valmistetussa piimässä pH laski arvosta 6,5 arvoon 3,7 kuvan 1 mukaisesti. Piimässä hapantumisen lopussa elävien maitohappobakteerien pitoisuus oli1,9*109 PMY/g. Heran VPP+IPP -pitoisuus o!i 29 rng/l. Hapantumisen lopussa taiteen otetun heran kemiallinen koostu-to mus o!i vastaava kuin taulukossa 1 esitetty.In the butter prepared according to Comparative Example, the pH dropped from 6.5 to 3.7 as in Figure 1. At the end of acidification in milk, the concentration of live lactic acid bacteria was 1.9 * 10 9 CFU / g. Hera has a VPP + IPP content of 29 rng / l. At the end of acidification, the chemical composition of the whey taken in the art was similar to that shown in Table 1.
Esimerkki 1Example 1
Fermentaatio laktaasilisäykseiläFermentation lactase supplementation
Kylmäkuivattu LB 1936 -hapate valmistettiin käyttäen kasvualustana steriloitua herapermeaattipohjaista alustaa, jossa oii lisäravinteina tryptonia 15 ja hiivauutetta, sekä kivennäisiä. Fermentaatio suoritettiin lämpötilassa 37 °C ja pH:ssa 5,0 sekoittaen 100-120 rpm. Kasvatusaika oli 22 h. Fermentaation jälkeen solut konsentroitiin mikrosuodattamaila, minkä jälkeen konsentraatti lyofiiisöitiin.Freeze-dried LB 1936 acid was prepared using a sterilized whey permeate-based medium supplemented with trypton 15 and yeast extract as well as minerals. The fermentation was carried out at 37 ° C and pH 5.0 with stirring at 100-120 rpm. The growth time was 22 h. After fermentation, the cells were concentrated by microfiltration, followed by lyophilization.
Keksinnön mukainen hapatus suoritettiin LB 1936 -kannalla käytiä-20 en lähtöaineena rasvatonta maitoaiustaa. 4 litraa maitoa pastöroitiin 85 °C:ssa 10 min ja jäähdytettiin hapatuslampötiiaan 42 °C, Maidon Joukkoon lisättiin 400 μ\ GODO-laktaasientsyymiä laktoosin hydroiysoimiseksi glukoosiksi ja gaiak-toosiksl. Kasvualustaan siirrostettiin 60 mg pakkaskuivattua LB 1936 -hapa-tetta (Valio Oy). Tällöin elävien solujen pitoisuus hapatuksen alussa oli 25 1,65*106 PMY/g. Maidon annettiin hapantua 42 °C:n lämpötilassa 24 tuntia. Hapantumisen aikana kasvualustaa sekoitettiin 200 rpm:n nopeudella. Kuvassa 2 on esitetty pH-käyrä hapantumisen aikana. Valmiista piimästä erotettiin hera sentrifugoimaila 4000 rpm 15 min ja herasta analysoitiin VPP- ja IPP-peptidit, laktoosi, glukoosi, galaktoosi ja maitohappo.The fermentation according to the invention was carried out on LB 1936 strain starting from skimmed milk medium. 4 liters of milk were pasteurized at 85 ° C for 10 min and cooled to a fermentation temperature of 42 ° C, 400 µL of GODO lactase enzyme was added to the Milk Set to hydrolyze lactose to glucose and galactose. The medium was inoculated with 60 mg of freeze-dried LB 1936 yeast (Valio Oy). Thus, the concentration of living cells at the start of the fermentation was 1.65 * 10 6 CFU / g. The milk was allowed to acidify at 42 ° C for 24 hours. During acidification, the medium was agitated at 200 rpm. Figure 2 shows the pH curve during acidification. Whey was separated from the prepared milk by centrifugation at 4000 rpm for 15 min and analyzed for VPP and IPP peptides, lactose, glucose, galactose and lactic acid.
30 Esimerkin 1 mukaisesti valmistetussa piimässä pH laski arvosta 6,5 arvoon 3,7 kuvan 2 mukaisesti. Piimässä hapantumisen lopussa elävien maitohappobakteerien pitoisuus oli 1,9*109 PMY/g. Heran VPP+IPP-pitoisuus oli 40 mg/l. Hapantumisen lopussa talteen otetun heran kemiallinen koostumus on esitetty taulukossa 1.In the butter prepared according to Example 1, the pH dropped from 6.5 to 3.7 as shown in Figure 2. At the end of acidification in milk, the concentration of live lactic acid bacteria was 1.9 * 10 9 CFU / g. The VPP + IPP concentration of whey was 40 mg / l. The chemical composition of the whey recovered at the end of acidification is shown in Table 1.
1212
Taulukko 1,. Herani kemiallinen koostumus fermentaation jälkeen iak-taasilisäykseilä Näyte__Laktoosi [%] Glukoosi [%j Gaiaktoosi f%1 Maitohappo j'%]Table 1,. Chemical composition of whey after fermentation iak-re-addition sieve Sample__Lactose [%] Glucose [% j Glucose f% 1 Lactic acid j '%]
Hera 24 h 0,22 [0,80 2,04 12,16Hera 24h 0.22 [0.80 2.04 12.16]
Esimerkki 2 5 Fermentaatio käyttäen laktaasia ja pH-säätöä LB 1936 -hapate valmistettiin silrrostamalla ampullista 1 % tuotan-tokantaa 10 ml steriloitua 9% rasvatonta maitojauhemaitoa ja kasvattamalla lämpötilassa 42 °C 17 h. Kantaa jatkettiin kahteen kertaan samalla tavalla, käyttäen aina ymppikokona 1 %. Lopullinen fermentaatiössa käytettävä siirros-io te valmistettiin lämpötilassa 110 °G 10 min lämpökäsitellyssä 9% rasvattomassa maidossa kasvattamalla 22 h ja lämpötilassa 37 °C.Example 2 Fermentation Using Lactase and pH Adjustment LB 1936 acid was prepared by silencing 1% of the production vial with 10 ml of sterilized 9% skimmed milk powder and growing at 42 ° C for 17 h. The strain was repeated twice, always using 1% inoculum. . The final fermentation inoculum was prepared at 110 ° C for 10 min in heat-treated 9% skim milk by growth for 22 h and at 37 ° C.
Fermentaatio LB 1936 -kannalla tehtiin rasvattomalla maitoalustai-la. 4 litraa maitoa pastöroitiin 85 °G:ssa 10 min ja jäähdytettiin hapatusiämpöti-iaan (42 °C). Maidon joukkoon lisättiin 400 μ\ GODO-laktaasientsyymiä. Kas-15 vualustaan siirrostettiin 400 mi LB 1936 -hapatetta rasvattomalla maitoalustai-la (Valio). Maidon annettiin hapantua 42 °C:n lämpötilassa 24 tuntia siten, että ensimmäiset 20 tuntia pH pidettiin arvossa 5,0 lisäämällä 50-prosenttisia KOH-liuosta. Tämän jälkeen pH:n annettiin laskea vapaasti. Hapantumisen aikana kasvualustaa sekoitettiin 200 rpm:n nopeudella. Kuvassa 3 on esitetty 20 pH-käyrä hapantumisen aikana. Valmiista piimästä erotettiin hera sentrifugoi-maila 4000 rpm 15 min ja herasta analysoitiin VPP- ja IPP-peptidit, laktoosi, glukoosi, gaiaktoosi ja maitohappo.Fermentation with LB 1936 was carried out on non-fat milk medium. 4 liters of milk were pasteurized at 85 ° C for 10 min and cooled to fermentation temperature (42 ° C). 400 μL of GODO lactase enzyme was added to the milk. 400 ml LB 1936 acid was inoculated into the Kas-15 medium with non-fat milk medium (Valio). The milk was allowed to acidify at 42 ° C for 24 hours with the pH maintained at 5.0 for the first 20 hours by the addition of 50% KOH solution. The pH was then freely lowered. During acidification, the medium was agitated at 200 rpm. Figure 3 shows the pH curve during acidification. Whey was centrifuged at 4000 rpm for 15 min from the prepared milk and analyzed for VPP and IPP peptides, lactose, glucose, galactose and lactic acid.
Esimerkin 2 mukaisesti valmistetussa piimässä pH-käyrä oli kuvan 3 mukainen ja ioppu-pH oli 4,95. Piimässä hapantumisen lopussa elävien mai-25 tohappobakteerien pitoisuus oli 1,3*109 PMY/g. Esimerkin 2 mukaisesti valmistetun heran VPP+IPP -pitoisuus oli 120 mg/i. Heran kemiallinen koostumus esitetään taulukossa 2.In the butter prepared according to Example 2, the pH curve was as in Figure 3 and the end pH was 4.95. At the end of the acidification in the milk, the concentration of live maize-25 acid was 1.3 * 10 9 CFU / g. The whey prepared according to Example 2 had a VPP + IPP concentration of 120 mg / l. The chemical composition of whey is shown in Table 2.
Taulukko 2. Heran kemiallinen koostumus fermentaation jälkeen lak-taasiiisäykseliä jä pH-säädöllä Näyte__Laktoosi f%1 Glukoosi [%] Gaiaktoosi i%] Maitohappo [%]Table 2. Chemical composition of whey after fermentation by lactase up-regulation with pH control Sample__Lactose f% 1 Glucose [%] Gaucose i%] Lactic acid [%]
Hera 24 h lo,QQ 0,00 |o,01 4,16 30 13Hera 24 h lo, QQ 0.00 | o, 01 4.16 30 13
Esimerkki 3Example 3
Femnentaatio käyttäen laktaasia ja pH-säätöä LB 1936 -hapate: valmistettiin siirrostamalla ampullista 1 % tuotan-tokantaa 10 ml steriloitua 9 % rasvatonta maitojauhemaitoa ja kasvattamalla 5 lämpötilassa 42 °C 17 h. Kantaa jatkettiin kahteen kertaan samalla tavalla, käyttäen aina ympplkokona 1 %. Lopullinen fermentaatiossa käytettävä siirros-te valmistettiin: lämpötilassa 110 °C 10 min iämpökäsiieilyssä 9 % rasvattomassa maidossa Kasvattamalla 22 h ja lämpötilassa 37 “C.Femnation using Lactase and pH Adjustment LB 1936 Acidate: Prepared by inoculating a 1% production strain with 10 ml of sterilized 9% skimmed milk powder and raising at 5 ° C for 17 h. The strain was repeated twice, always using 1% seed size. The final fermentation inoculum was prepared: at 110 ° C for 10 min in a heat-treated 9% skimmed milk by incubation for 22 h and at 37 ° C.
Fermentaatio LB 1936 -kannalla tehtiin rasvattomalla maitoaiustal-10 ia. 4 litraa maitoa pastöroitiin 85 °C:ssa 10 min ja jäähdytettiin hapatuslämpöti-laan (42 °C). Maidon joukkoon lisättiin 400 μ\ GODG-iaktaasientsyymiä. Kasvualustaan siirrostettiin 400 ml LB 1936 -hapatetta rasvattomalla maiioalustal-la (Valio). Maidon annettiin hapantua 42 °C:n lämpötilassa 24 tuntia siten, että ensimmäiset 20 tuntia pH pidettiin arvossa 5,2 lisäämällä 50-pfosenttista 15 KOH-liuosta. Tämän jälkeen pH:n annettiin laskea vapaasti. Hapanturnisen aikana kasvualustaa sekoitettiin 200 rpm:n nopeudella. Kuvassa 4 on esitetty pH-käyrä hapanturnisen aikana. Valmiista piimästä erotettiin hera sentrifugoi-maiia 4000 rpm 15 min ja herasta analysoitiin VPP- ja IPP-peptidit, laktoosi, glukoosi, gaiaktoosi ja maitohappo.Fermentation with LB 1936 strain was performed on non-fat milk meal 10. 4 liters of milk were pasteurized at 85 ° C for 10 min and cooled to an acidification temperature (42 ° C). 400 µg of GODG lactase enzyme was added to the milk. The medium was inoculated with 400 ml of LB 1936 acid on a non-greasy medium (Valio). The milk was allowed to acidify at 42 ° C for 24 hours with the pH being maintained at 5.2 for the first 20 hours by the addition of a 50% solution of 15 KOH. The pH was then freely lowered. During acid turbulence, the medium was agitated at 200 rpm. Figure 4 shows the pH curve during acid turbulence. Whey was centrifuged at 4000 rpm for 15 min from the prepared milk and analyzed for VPP and IPP peptides, lactose, glucose, galactose and lactic acid.
20 Esimerkin 3 mukaisesti valmistetussa piimässä pH-käyrä oli kuvan 4 mukainen ja ioppu-pH oli 5,15. Piimässä hapanturnisen lopussa elävien maitohappobakteerien pitoisuus oli 2,0*109 PMY/g. Esimerkin 3 mukaisesti valmistetun heran VPP+IFP -pitoisuus oli 136 mg/L Heran kemiallinen koostumus esitetään taulukossa 3.In the butter prepared according to Example 3, the pH curve was as in Figure 4 and the end pH was 5.15. The concentration of live lactic acid bacteria in the diatomaceous earth was 2.0 x 10 9 CFU / g. The whey VPP + IFP content of the whey prepared according to Example 3 was 136 mg / L. The chemical composition of the whey is shown in Table 3.
25 Taulukko 3. Heran kemiaiiinen koostumus fermentaation jälkeen lak-taasilisäykseltä ja pH-säädölIä Näyte Laktoosi 1%1 Glukoosi f%] Gaiaktoosi [%] Maitohappo f%l Hera 24 h 0,QQ 10,00 0,01 13,3325 Table 3. Chemical composition of whey after fermentation by addition of lactate and pH adjustment Sample Lactose 1% 1 Glucose f%] Glycose [%] Lactic acid f% l Hera 24 h 0, QQ 10.00 0.01 13.33
Esimerkki 4Example 4
Fermentaatio käyttäen pH-säätöä ilman laktaasiiisäystä 30 LB 1936 -hapate valmistettiin siirrostamalla ampullista 1 % tuotan- tokantaa 10 m! steriloitua 9 % rasvatonta maitojauhemaitoa ja kasvattamalla lämpötilassa 42 °C 17 h. Kantaa jatkettiin kahteen kertaan samalla tavalla, 14 käyttäen aina ymppikokona 1 %. Lopullinen fermentaatiossa käytettävä siirros-te valmistettiin lämpötilassa 110 °C 10 min lämpökäsitellyssä 9 % rasvattomassa maidossa kasvattamalla 22 h ja lämpötilassa 37 °C.Fermentation using pH adjustment without lactase addition 30 LB 1936 acid was prepared by inoculating a 1% production strain from an ampoule at 10 m! sterilized 9% skimmed milk powder and incubated at 42 ° C for 17 h. The strain was repeated twice in the same manner, 14 always using 1% inoculum. The final fermentation inoculum was prepared at 110 ° C for 10 min in heat-treated 9% skimmed milk by growing for 22 h and at 37 ° C.
Fermentaatio LB 1936-kannaiia tehtiin rasvattomalla maitoalustalia, 5 kuten edellä olevassa esimerkissä on kuvattuna, paitsi että kasvualustaan ei lisätty laktaasia. Kuvassa 5 on esitetty pH-klyrä hapantumisen aikana. Valmiista piimästä erotettiin hera sentrifugoimälla 4000 rpm 15 min ja herasta analysoitiin VPP ja (PR peptidit, laktoosi, glukoosi, gaiaktoosi ja maitohappo.Fermentation of LB 1936 strains was performed on non-fat milk medium as described in the example above except that no lactase was added to the medium. Figure 5 shows the pH-clade during acidification. The whey was separated from the prepared milk by centrifugation at 4000 rpm for 15 min and the whey was analyzed for VPP and (PR peptides, lactose, glucose, galactose and lactic acid.
Esimerkin 4 mukaisesti valmistetussa piimässä pH-käyrä oii kuvan ro 5 mukainen ja loppu pH oli 4,59. Piimässä hapantumisen lopussa elävien maitohappobakteerien pitoisuus oii 2,0*109 PMY/g. Esimerkin mukaisesti valmistetun heran VPP-HPF pitoisuus oli 86 mg/LIn the butter prepared according to Example 4, the pH curve was as in Figure 5 and the final pH was 4.59. At the end of the acidification in the milk, the concentration of live lactic acid bacteria was 2.0 * 10 9 CFU / g. The whey prepared according to the example had a VPP-HPF content of 86 mg / L
Taulukko 4. Heran kemiallinen koostumus fermentaation jälkeen pH-säädölfä ilman laktaasilisäystä Näyte__Laktoosi [%] Glukoosi [%] Gaiaktoosi j%] Maitohappo [%]Table 4. Chemical composition of whey after fermentation pH adjusted without addition of lactase Sample__Lactose [%] Glucose [%] Glucose [%] Lactic acid [%]
Hera 24 h: 0,72 0,00 0,1 3,51 15Hera 24h: 0.72 0.00 0.1 3.51 15
Esimerkki 5Example 5
Tuotteen käyttö lopputuotteen valmistamiseksiUse of the product to make the final product
Esimerkin 2 mukaisesti valmistettu piimä separoitiin ja saatu hera nanosuodatettiin. Nanosuodatettu retentaatti haihdutettiin. Täfiä tavalta vaimis-20 lettua tiivistettä käytettiin bioaktiivisia peptidejä sisältävän piimän valmistamisessa siten, että piimän joukkoon lisättiin n, 1% tiivistettä.The diatomaceous earth prepared according to Example 2 was separated and the resulting whey was nanofiltered. The nanofiltered retentate was evaporated. The tag-like concentrate was used to prepare milk containing bioactive peptides by adding n, 1% concentrate to the milk.
ii
Claims (11)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI20065064A FI120267B (en) | 2006-01-30 | 2006-01-30 | Process for producing therapeutically useful peptides |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI20065064A FI120267B (en) | 2006-01-30 | 2006-01-30 | Process for producing therapeutically useful peptides |
FI20065064 | 2006-01-30 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI20065064A0 FI20065064A0 (en) | 2006-01-30 |
FI20065064A FI20065064A (en) | 2007-07-31 |
FI120267B true FI120267B (en) | 2009-08-31 |
Family
ID=35883961
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI20065064A FI120267B (en) | 2006-01-30 | 2006-01-30 | Process for producing therapeutically useful peptides |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FI (1) | FI120267B (en) |
-
2006
- 2006-01-30 FI FI20065064A patent/FI120267B/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI20065064A0 (en) | 2006-01-30 |
FI20065064A (en) | 2007-07-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI113741B (en) | Process for the preparation of a product containing peptides with antihypertensive effect | |
JP6193439B2 (en) | Lactobacillus lactic acid bacteria growth promoter and / or survival improver | |
FR2723960A1 (en) | Prodn. of Streptococcus thermophilus cultures rich in beta-galactosidase | |
JP7144478B2 (en) | Method for producing protein-polysaccharide double-coated lactic acid bacteria using protein hydrolyzate | |
JP6923883B2 (en) | Compositions for use in improving nutritional status | |
JP3706345B2 (en) | Flavor improver for milk drinks or fermented milk | |
Alhaj et al. | Milk‐derived bioactive components from fermentation | |
JP3291250B2 (en) | Whey beverages and their production | |
JP2001120179A (en) | Method for production of gaba-containing fermented milk | |
JP2013188177A (en) | Lactobacillus fermented matter highly containing reduced type glutathione, and method for producing the same | |
FI120267B (en) | Process for producing therapeutically useful peptides | |
RU2268599C2 (en) | Composition for manufacturing of fermented milky beverage and method for production thereof | |
JP4375761B2 (en) | Composition for promoting the growth of bifidobacteria | |
JP6777911B2 (en) | Fermented milk for suppressing the decrease in immune function acquired by anti-influenza drugs and its manufacturing method | |
CN1887099A (en) | Fresh soft cheese with angiotensinase inhibiting function and its prepn process | |
CN116869046A (en) | Small peptide probiotic yogurt rich in nano small molecule nutrition and preparation method of freeze-dried product thereof | |
Gandhi | Microbiology of fermented dairy products | |
KR20070009626A (en) | Method of preparing a food ingredient and food product having angiotensin-i-converting enzyme inhibiting properties and products thus obtained | |
MX2011013949A (en) | Composition that comprises lactobacillus and a carrier. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FG | Patent granted |
Ref document number: 120267 Country of ref document: FI |
|
MM | Patent lapsed |