CN112662717A - 一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。本发明采用分离自香满楼牌酸牛奶的鼠李糖乳酸菌菌株为出发菌株，生产胞外多糖，该胞外多糖为均一组分，其分子量为88650Da；且包含甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖。该胞外多糖具有良好的体外降糖作用，检测到其具有良好的体外抑制α‑葡萄糖苷酶的能力，且工艺简单，市场前景广阔，热力学性能稳定，适合规模化生产。因此，该多糖是一种有潜力的用于预防和治疗糖尿病的活性成分。此外，作为益生菌的发酵产物，与降血糖领域内常见的化学类药物相比，其具有活性成分简单易得、价格低廉、无副作用等优势，具有很大的应用价值。

Description

一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其制备方法与应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，由于过量的营养摄入，糖尿病的发病率越来越高。而二型糖尿病(T2 DM)是异常高血糖水平患者最常见的慢性疾病之一。由于本病发病机制复杂，影响因素多，目前尚无有效的防治措施。

临床上用于糖尿病的药物主要包括阿卡波糖、伏格立波糖和米格列醇。在这些糖尿病药物中，阿卡波糖是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，它可以与小肠上皮细胞边的低聚糖竞争，可逆地与α-葡萄糖苷酶结合。其活性能够抑制对1,4-糖苷键的水解作用，从而达到了降血糖的效果。然而，这些药物，如阿卡波糖，有明显的副作用，如腹胀和腹泻。因此，一些研究人员致力于寻找一些天然产品，以减轻与使用合成药物有关的频繁副作用。虽然天然产物不像合成药物那么常见和有效，但它们具有中等的生物活性，是一种天然的功能性食品，很容易被纳入基本的饮食。因此，寻找高效的天然降血糖产品具有重要意义。

益生菌已被越来越多地用于开发功能性食品，它们也被证明有效地改善胃肠健康和某些代谢综合征，包括癌症、肥胖、甚至精神疾病。益生菌在治疗糖尿病中的重要作用也得到了认可。然而，大多数益生菌控制糖尿病的数据都是直接从动物实验中获得的，关于益生菌调节血糖的具体机制的研究很少，益生菌在2型糖尿病中的应用前景没有得到广泛的探索。抑制α-葡萄糖苷酶是T2D管理的重要途径。筛选具有有效α-葡萄糖苷酶抑制活性的潜在益生菌可用于调节血糖浓度，使其能够作为糖尿病治疗的辅助药物。据之前的报道，含有胞外多糖的酸奶中α-葡萄糖苷酶抑制活性明显(RAMCHANDRAN et al.2009)。乳酸菌发酵上清液具有降低血糖的潜在能力，发酵上清液中胞外多糖(EPS)的含量与其降血糖活性呈正相关(Li et al.2016)。益生菌的降血糖作用可能是由于益生菌产生的EPS。

综上所述，筛选具有潜在降血糖能力的益生菌菌株以及其产生的降糖活性成分的研究是目前社会的热点问题。然而，目前尚未有从具有明显α-葡萄糖苷酶抑制活性的益生菌中提取的胞外多糖也具有相似体外降糖能力的报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的胞外多糖。

本发明的再一目的在于提供上述胞外多糖的应用。

本发明以中国华南地区酸奶为来源，利用常规的菌种分离方法(例如梯度稀释法、涂布培养法等)收集筛选益生菌株。然后采用体外抑制α-葡萄糖苷酶的方法筛选具有潜在降血糖能力的菌株，挑选出一株具有最高体外降糖活性的优势菌株——Lactobacillusrhamnosus LB1lac10。此菌种与阳性对照阿卡波糖的抑制率很接近，分离自香满楼牌酸牛奶。在此基础上对该菌株的发酵产物胞外多糖利用醇沉法进行提取。并将收集得到的粗胞外多糖进行进一步的纯化。然后采用体外抑制α-葡萄糖苷酶的方法验证其降糖能力，证实其所产的胞外多糖具有潜在的降血糖能力。并对纯化后的胞外多糖结构组成进行了初步探索。通过与已知文献和专利作对比，我们认为这是一种还未被发现的新的胞外多糖，并具有潜在调控血糖的能力，具有很大的应用价值。

本发明的鼠李糖乳杆菌来源自香满楼牌酸牛奶，能高产胞外多糖，该胞外多糖既有降糖作用，将为开发糖尿病预防、治疗药物提供新的思路，是一个非常有潜力的菌株，具有广阔的应用前景。该胞外多糖具有良好的降糖活性，因此，该多糖是一种有潜力的用于预防和治疗糖尿病的活性成分。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：利用鼠李糖乳杆菌进行厌氧发酵，对发酵液通过醇沉法提取获得粗胞外多糖，再通过分子筛层析对其进行分离纯化，最终获得鼠李糖乳杆菌胞外多糖；

具体包括如下步骤：

(1)将鼠李糖乳杆菌LB1lac10进行厌氧发酵培养，得发酵培养液；

(2)发酵培养液经离心除菌体取上清，高温灭活处理，再加入三氯乙酸除蛋白，得到上清液；

(3)将上清液采用醇沉法提取多糖，得到的产物进行真空冷冻干燥，即得粗胞外多糖，记为EPS-1；

(4)粗胞外多糖在Sephacryl TM-S-200HR柱上进行进一步纯化，真空冷冻干燥得到鼠李糖乳杆菌胞外多糖，记为EPS1-1。

所述的鼠李糖乳杆菌LB1lac10是从香满楼牌酸牛奶中分离纯化得到；常规的菌种分离方法为梯度稀释法、涂布培养法等；

本发明的产胞外多糖的鼠李糖乳杆菌菌株，具有以下特性：

本发明所述菌株在MRS固体培养基上的单菌落呈圆形、表面光滑，乳白色，

边缘整齐，有拉丝表型，革兰氏染色呈紫蓝色。

MRS培养基的组分为(g·L^-1)：葡萄糖(20)、吐温80(1.08)、MnSO₄·4H₂O(0.05)、MgSO₄·7H₂O(0.2)、无水乙酸钠(5)、柠檬酸三铵(2)、酪蛋白(10)、牛肉提取物(10)、酵母提取物(4)、K₂HPO₄(2)(pH5.7±0.2)。固体培养基含1.5％琼脂。所有材料在使用前121℃灭菌20分钟。

优选的，步骤(1)中，将鼠李糖乳杆菌按照3％体积比的接种量接种于MRS肉汤培养基，于37±0.5℃发酵培养12～24h(优选18h)，得到发酵培养液。

步骤(2)中，

优选的，离心的条件为4℃，11000rpm，15min。

优选的，高温灭活处理的方法为：在100℃的高温下煮沸15～20分钟(优选15分钟)，以灭活可能降解多糖的酶。

优选的，加入三氯乙酸除蛋白的方法为：在高温灭活处理后的上清中加入三氯乙酸至终浓度为4.5～5.5％(m/v)(优选5％)，然后搅拌使三氯乙酸充分反应，离心(4℃，8000rpm，20min)，除去残留细胞和沉淀蛋白，得到上清液。

所述的搅拌的时间为20～40分钟，进一步为30分钟。

步骤(3)中，

优选的，醇沉法为：在上清液中加入2～4倍体积的无水乙醇(优选3倍体积的无水乙醇)，于3～5℃放置8～12h(优选于4℃放置8h)，离心，取沉淀进行真空冷冻干燥，即得粗胞外多糖，记为EPS-1；

步骤(4)中，

粗胞外多糖溶于超纯水中，在Sephacryl TM-S-200HR柱上进行进一步纯化，以超纯水为洗脱剂，上样量为4.8mL，流速设定为0.6～0.8mL/min(优选为0.7mL/min)。

一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖，通过上述制备方法制备得到。

该鼠李糖乳杆菌胞外多糖为均一组分，其分子量为88650Da。

所述鼠李糖乳杆菌胞外多糖包含甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)和阿拉伯糖(Ara)，其中，摩尔比为：甘露糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：木糖：半乳糖：阿拉伯糖＝31.19：23.01：36.62：2.03：3.57：3.58。

上述鼠李糖乳杆菌胞外多糖在制备降糖的产品中的应用；

进一步，所述鼠李糖乳杆菌胞外多糖作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。

糖尿病是目前危害人类健康的一种常见病和多发病，糖尿病的预防和治疗一直是人类攻克的目标之一，世界各国一直都在寻找新的有效的预防和治疗糖尿病的活性成分，α-葡萄糖苷酶抑制剂是目前用于治疗糖尿病的一种药物，筛选和寻找有效、安全的α-葡萄糖苷酶抑制剂是目前各国科学家关注的热点之一。

采用本发明的鼠李糖乳杆菌生产得到的胞外多糖在体外降糖试验中呈现良好的降糖活性，其降糖效果剂相比具有较强的降糖活性。当α-葡萄糖苷酶浓度为0.01、0.1、0.15、0.2U/mL时，该纯化后的多糖EPS1-1(0.5mg/mL)对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别达到了95.89％，37.51％，25.97％和15.33％。显示出良好的体外降糖活性。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果

(1)本发明的鼠李糖乳酸菌菌株来源广泛，具有高产胞外多糖的能力。且该胞外多糖有潜在的调控血糖方面的作用，将为开发糖尿病预防、治疗药物提供新的思路，是一个非常有潜力的菌株。

(2)本发明采用上述产胞外多糖的分离自香满楼牌酸牛奶的鼠李糖乳酸菌菌株为出发菌株，生产胞外多糖，且该多糖具有良好的体外降糖作用，且工艺简单，市场前景广阔，热力学性能稳定，适合规模化生产。此外，作为益生菌的发酵产物，与降血糖领域内常见的化学类药物相比，其具有活性成分简单易得、价格低廉、无副作用等优势。

(3)本发明的胞外多糖，检测到其具有良好的体外抑制α-葡萄糖苷酶的能力。

(4)本发明的胞外多糖EPS1-1通过对其组成和结构进行解析后发现，与已知的胞外多糖均有所差异，在体外降糖试验中显示出较强的降糖活性，可能是乳酸菌胞外多糖家族的新成员。

附图说明

图1是本发明菌株LB1lac10的平板培养性状。

图2是本发明菌株LB1lac10的革兰氏染色镜检形态。

图3是本发明菌株LB1lac10纯化胞外多糖的洗脱曲线。

图4是本发明菌株LB1lac10胞外多糖EPS1-1红外光谱检测谱图。

图5是本发明菌株LB1lac10胞外多糖EPS1-1单糖组分检测谱图；其中，a为不同单糖标品；b为EPS1-1。

图6是本发明菌株LB1lac10所产粗胞外多糖EPS-1与纯化后的胞外多糖EPS1-1的紫外全波长检测结果。

图7是刚果红(Congo red)和刚果红与EPS1-1的复合溶液(Congo red+EPS1-1)最大吸收波长的变化情况。

图8是本发明菌株LB1lac10胞外多糖EPS1-1核磁共振(NMR)检测结果；其中，A为¹HNMR谱结果；B为¹³C NMR谱结果。

图9是本发明菌株LB1lac10胞外多糖EPS1-1的热稳定性分析结果示意图；其中，A为热重分析(TGA)；B为差示扫描量热分析(DSC)。

图10是本发明菌株LB1lac10所产胞外多糖EPS1-1对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1：一株产胞外多糖的鼠李糖乳酸菌菌株的筛选方法

本研究中的产胞外多糖的鼠李糖乳酸菌菌株是从华南地区的香满楼牌酸牛奶中获得的，采用传统的分离技术，将培养物用0.85％的生理盐水进行梯度稀释(10^-1-10^-7)，后用一次性涂布器均匀涂板在MRS固体培养基平板上。所述MRS肉汤培养基的组分为(g·L^-1)：葡萄糖(20)、吐温80(1.08)、MnSO₄·4H₂O(0.05)、MgSO₄·7H₂O(0.2)、无水乙酸钠(5)、柠檬酸三铵(2)、酪蛋白(10)、牛肉提取物(10)、酵母提取物(4)、K₂HPO₄(2)(pH5.7±0.2)。固体培养基含1.5％琼脂。所有材料在使用前121℃灭菌20分钟。

在37℃的厌氧条件下培养2天后，选择具有典型菌落形态的菌株进行革兰氏染色观察。

实施例2：上述产胞外多糖的鼠李糖乳酸菌菌株的鉴定

本发明的产胞外多糖的鼠李糖乳杆菌菌株，具有以下特性：

本发明所述菌株在MRS固体培养基上的单菌落呈圆形、表面光滑，乳白色，边缘整齐，有拉丝表型，革兰氏染色呈紫蓝色(如图1，2所示)。

将上述筛选得到的产胞外多糖的鼠李糖乳酸菌菌株暂时命名为LB1lac10。为了进一步确定菌株的种属，该菌株的基因组采用酶解法提取，根据捷瑞生物细菌基因组DNA提取试剂盒(Generay Biotech Bacteria Genomic DNA ExtractionKit)步骤提取所述菌株的总DNA，将该样品作为模板进行基因扩增，以通用引物27F和1492R扩增该菌的16S rDNA基因，回收扩增产物后送至天一辉远(广州)基因科技有限公司进行测序，通过测定16S rDNA的序列来进行菌种鉴定。获得的序列结果在NCBI进行Blast比对，从Gen Bank的数据库中获得与该菌株16S rDNA同源的公认标准序列数据，使用MEGA6.6.5计算序列相似性并采用领位相连算法(Neighbor-Joining)作系统发育分析。

结果显示其与鼠李糖乳杆菌等的序列同源性超过99％。因此，菌株LB1lac10在分子系统发育分类学上属于鼠李糖乳杆菌。该结果与生理生化鉴定结果相符，因此综合菌落形态、菌体形态特征观察、分子生物学测序结果，最终确定一菌株为鼠李糖乳杆菌，命名为Lactobacillus rhamnosus LB1lac10，简称LB1lac10。

该鼠李糖乳杆菌可以从华南地区的香满楼牌酸牛奶中重复分离纯化获得。

实施例3：上述产胞外多糖的鼠李糖乳杆菌菌株体外降糖能力

上述产胞外多糖的鼠李糖乳杆菌菌株体外降糖能力，包括如下步骤：

步骤1：将冷冻在-80℃下的LB1lac10接种到液体MRS肉汤培养基中，在厌氧条件下在37℃下孵育18小时。然后活化第二代进行后续实验，将培养的LB1lac10在4℃，6000rpm离心10分钟。

活菌悬液：离心后，用磷酸盐缓冲盐(PBS，0.1M，pH＝6.8)洗涤LB1lac10培养液两次，调节菌株浓度为1×10⁹CFU/mL。

灭活菌悬浮液：将活菌(1×10⁹CFU/mL)在100℃下煮沸20分钟。

步骤2：首先将25μL 20mmol/L PNPG(4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷)和25μL样品加入96孔板中，在37℃下孵育10分钟。然后加入50μL 20U/mLα-葡萄糖苷酶，在37℃下反应20分钟。最后，加入100μL 0.1mol/L Na₂CO₃终止反应。用酶标仪(TECAN，infinite M200)检测波长为405nm的反应液。以阿卡波糖(Acarbose)为阳性对照，用以下公式计算抑制百分比：

抑制率(％)＝[1-(C-D)/(A-B)]

其中A是含有α-葡萄糖苷酶不含样品的吸光度，B是不含α-葡萄糖苷酶和样品的吸光度，C是含有α-葡萄糖苷酶和样品的吸光度，D是含有样品但不含α-葡萄糖苷酶的吸光度。

上述产胞外多糖的鼠李糖乳杆菌菌株LB1lac10体外降糖能力：活菌悬液12.75％±0.007、灭活菌悬液6.19％±0.0048。通过实验结果，可以看到LB1lac10的活菌悬液对α葡萄糖苷酶抑制活性为12.75％±0.007。作为阳性对照，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性可达15.06％±0.011。Lactobacillus rhamnosus LB1lac10菌株具有较高的抑制活性，与阳性对照阿卡波糖也较为接近，具有很大的潜力和应用市场。我们也把此菌株作为后续的研究目标。

此外，LB1lac10的灭活菌悬液对α-葡萄糖苷酶也产生了一定的抑制活性，为6.19％±0.0048。这可能是细胞内外存在的某些物质产生竞争性抑制，抑制α-葡萄糖苷酶。一些研究表明，α葡萄糖苷酶的抑制活性可能是由乳酸菌产生的胞外多糖所致。因此，我们将主要研究其中α-葡萄糖苷酶抑制能力较高的Lactobacillus rhamnosus LB1lac10的胞外多糖。

实施例4：鼠李糖乳杆菌LB1lac10所产胞外多糖的提取、纯化及含量测定

从MRS固体培养基上挑取适量的上述菌株接种到MRS肉汤培养基中。在37℃的厌氧环境中培养48h得到发酵液。图1为本发明菌株LB1lac10的平板培养性状。

将具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的高效菌株(LB1lac10)在37℃下培养在380mL MRS肉汤培养基中，在厌氧环境下培养18小时，接种量为3％(v：v)。通过离心分离细胞(4℃，11000rpm，15min)，在100℃的高温下煮沸15分钟，以灭活可能降解多糖的酶。冷却后加入100％(v：v)三氯乙酸(TCA，阿拉丁)，最后达成5％的TCA浓度。然后将溶液搅拌30分钟使三氯乙酸充分接触，后离心(4℃，8000rpm，20min)，去除残留细胞和沉淀蛋白。取上清液备用。上清液中加入三倍无水乙醇，在4℃下放置8小时后离心(4℃，11000rpm，20min)，沉淀为粗胞外多糖EPS-1。然后加入等量蒸馏水再悬浮，用苯酚-硫酸法测定EPS-1的糖含量。称重，计算EPS-1的产量为8.24g/L。

将粗胞外多糖EPS-1进行真空冷冻干燥，在Sephacryl TM-S-200HR柱上进行进一步纯化。将粗胞外多糖EPS-1溶于20mL的超纯水中，并以超纯水为洗脱剂。上样量为4.8mL，流速设定为0.7mL/min。每管采集8分钟，共采集40管。然后用苯酚硫酸法测定各管的含糖量，并绘制洗脱曲线(如图3所示)。收集管号为横坐标，吸光度值为纵坐标。由图可知EPS-1能够获得两个峰，收集第一个大峰(8-11管)的主要成分。然后我们依次检查每个管的纯度，以确定单个成分。将鉴定为单组分的溶液组合后，我们将单个样品在真空冷冻干燥机中干燥24小时，得到纯化的胞外多糖，指定为EPS1-1。

实施例5：鼠李糖乳杆菌LB1lac10胞外多糖EPS1-1红外光谱分析

将实施例4得到的纯化后的胞外多糖EPS1-1进行红外光谱测试。具体方法为：将约1mg干燥的EPS1-1样品与100mg干燥的KBr粉末混合，然后将它们压入1mm厚的球团中进行测量。在4000-400cm^-1的频率范围内，在FT-IR光谱仪(N ICOLETI S50，FT-IR)上记录FT-IR光谱。结果如图4所示。从图4上可以看出，在3448cm^-1(3200-3600cm^-1)处的宽而强的特征吸收峰是由多糖的O-H键的拉伸振动引起的。表明EPS1-1分子中存在大量羟基；在2966cm^-1处为C-H伸缩振动峰；上述两组吸收峰为糖的特征峰。在1606cm^-1和1384cm^-1处的吸收峰可归因于不对称和对称的羧基C＝O拉伸振动，表明存在醛酸；多糖的其他特征峰在1200cm^-1到1000cm^-1范围内，这是由C-O-C或C-O-H键的拉伸振动引起的，表明存在吡喃糖。因此，可以通过观察该区域特定峰的强度和位置来判断特定的多糖。在572cm^-1处的峰是由吡喃糖环的对称拉伸振动引起的。红外光谱表明所提取的来源于Lactobacillus rhamnosus LB1lac10胞外多糖样品EPS1-1含有与多糖相关的大部分特征吸收峰，可鉴定为多糖。

实施例6：鼠李糖乳杆菌LB1lac10胞外多糖分子量及单糖组分检测

采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定多糖组分的子量(Kook et al，2019)。样品制备：称取样品适量于容量瓶中(5mg/mL左右)，用流动相溶解，定容。采用：Waters 1525高效液相色谱仪(配2410示差折光检测器和Empower工作站)

色谱条件：

色谱柱：Ultrahydrogel^TMLinear 300mm×7.8mmid×2；

流动相为0.1mol/LNaNO₃；

流速为0.8mL/min；

柱温为30℃；

上样量为20μL。

分子量校正曲线所用葡聚糖标准品(均购置于sigma公司)：Dextran T-20000(MW2000000)、DextranT-150(MW133800)、DextranT-40(MW36800)、DextranT-10(MW9700、Dextran T-5(MW2700)，计算出标准曲线为：Log分子量＝13.2–0.434T。EPS1-1的保留时间为19.690min，分子量为88650Da。

将5mg纯化多糖EPS1-1溶于2mL 2mol/L三氟乙酸(TFA，Macklin)中。然后在120℃烘箱中水解4小时。水解后冷却旋转蒸发除去TFA。然后加入1mL的甲醇进行旋转蒸发，重复3-5次，完全去除TFA。将EPS1-1溶于1mL超纯水中，制备5mg/mL多糖溶液。然后直接加入500μL 0.3mol/L NaOH溶液和500μL0.5mol/L PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮)溶液混合，在70℃下反应1小时。冷却至室温后，加入500μL 0.3mol/L HCL，重复加入1mL CH₂CL₂三次以去除PMP。上清液通过0.22μm滤膜进行后续实验。进行HPLC检测，检测条件如下所示：

色谱柱：CNW Technologies,Athena C18-WP,250mm×4.6mm,5μm

仪器：Agilent Technologies,1220Infinity LC

流动相：PBS(0.1M):乙腈(v:v)＝83:17

上样量：10μL

流速：1mL/min

检测波长：245nm

根据HPLC检测结果确定单糖的组成。

在等摩尔单糖标准上进行相同的PMP衍生化方法，在与对照相同的条件下进行HPLC。以D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖和L-阿拉伯糖(Solarbio，北京)为原料。

单糖组成结果如图5所示。结果表明，EPS1-1主要由甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)和阿拉伯糖(Ara)组成，摩尔比例分别为31.19：23.01：36.62：2.03：3.57：3.58。不同于已知文献与专利中记载的其他胞外多糖的组成，EPS1-1可能是乳酸菌胞外多糖家族的新成员。

实施例7：本发明菌株LB1lac10所产粗胞外多糖EPS-1与纯化后的胞外多糖EPS1-1的紫外全波长检测

分别将EPS-1和EPS1-1溶于超纯水(1mg/mL)中，用U-3010分光度计(HITACHI)在190～350nm波长范围内记录紫外可见吸收光谱。

实验结果如图6所示。结果表明，粗胞外多糖EPS-1在约260nm和200nm处分别产生两个峰，表明样品不纯。除多糖外，还有核酸、蛋白质或其他杂质。经Sephacryl TM-S-200HR柱纯化后，EPS1-1仅在200nm左右产生一个多糖的峰，在260nm光谱下未观察到明显的吸收，证明EPS1-1中没有核酸。此外，在280nm光谱下没有吸收或弱吸收，表明EPS1-1中没有蛋白质。

实施例8：刚果红和刚果红与EPS1-1的复合溶液随NaOH浓度其最大吸收波长的变化情况

采用刚果红法对纯化后的胞外多糖组分进行构象分析。1mL多糖样品(0.5mg/mL)与相同体积的刚果红溶液(50μmol/L)，然后加入不同体积的浓度为1mol/L NaOH溶液，使其最终浓度为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4mol/L，室温保存5min，以相同NaOH浓度与刚果红混合溶液作为对照。使用紫外可见光谱仪在波长400～600nm扫描，确定混合物的最大吸收波长(λmax)。

本发明菌株LB1lac10所产纯化后的胞外多糖EPS1-1与刚果红溶液结合后在不同浓度的NaOH溶液里，其最大吸收波长如图7所示。从图中可以看出，当NaOH浓度在0～0.1mol/L的范围内，EPS1-1出现红移现象，并且随着NaOH浓度的增加，复合溶液与纯刚果红溶液的最大吸收波长呈现相同的上升趋势。当NaOH浓度在0.1～0.4mol/L的范围内，纯刚果红溶液的最大吸收波长呈现稳定趋势。然而，NaOH浓度在0.15～0.25mol/L的范围时，EPS1-1与刚果红的复合溶液的最大吸收波长逐渐减小，说明EPS1-1存在三股螺旋，其结构在较高浓度的碱性环境中发生了变化，可能是三股螺旋解开。直至NaOH浓度增加到0.3mol/L，基本完全解离。已有研究报道，Lactobacillus helveticus MB2-1所产生的胞外多糖具有三股螺旋结构，可能有利于其抗癌活性(Li et al.2015d)。

实施例9：上述纯化胞外多糖在核磁共振中的检测结果

对EPS1-1进行NMR结构解析。约35mg的EPS1-1溶于0.5mL D₂O中。在25℃的400M Hz核磁共振仪上记录了纯化的EPS1-1的¹H和¹³C NMR谱(BrukerAVANCEIII，德国)。化学位移自动记录并以ppm表示。结果如图8所示。

其中¹H NMR谱区主要包括异头质子区(δ4.5-5.5ppm)和H2-H6连接质子信号区(δ3.1-4.5ppm)。然而，在δ3.1-4.5ppm范围内的信号重叠严重，EPS的糖苷键构型主要是通过分析异头质子区的信号来获得的。由图8A可知，在异头质子区有三个吸收峰，在4.69ppm处明显的吸收峰是由D₂O引起的。其余两个化学位移(δ)分别为5.31，4.95ppm，表明EPS1-1可能含有两个不同的糖苷键，并且2个糖苷键为α构型吡喃糖。在5.31ppm出现的信号峰是α-D-葡萄糖异构氢的特征吸收峰，这一结果与FT-IR光谱中样品在1200-1000cm^-1处的特征吸收峰相对一致。此外，δ540ppm的化学位移没有明显的质子信号，表明EPS1-1组分为吡喃糖，这与FT-IR光谱分析一致。

多糖¹³C NMR谱主要包括异头碳区(δ95-110ppm)和非异头碳区(δ50-85ppm)。由图8B可知，在异头碳区99.73和98.21ppm处有两种强度信号，表明有两种类型的糖苷键，对应于¹H NMR中5.31和4.95ppm处的异构体质子信号。主信号在99.73ppm产生，信号峰值对应→4)-α-D-Glcp-(1→。在δ160-δ180ppm(174.98ppm)区域的微弱信号表明，它含有微量的醛酸，这与单糖组成的分析是一致的。在101到105ppm的区域中没有信号峰，这表明EPS1-1只含有α构型的糖苷键。在δ90ppm附近无明显信号，表明多糖中没有呋喃环结构。60.49ppm和61.10ppm对应于C-6，未发生替代。

一般来说，乳酸菌的杂多糖中会出现α和β的构型。然而，一些EPS只含有α构型，如嗜酸乳杆菌DSM20079，植物乳杆菌70810产生的胞外多糖，这与我们的结果一致。综上所述，EPS1-1含有两种不同的糖残基，具有α构型的吡喃糖，主要的糖苷键为→4)-α-D-Glcp-(1→。考虑到阿卡波糖也含有α-D-葡萄糖基-(1→4)，我们推测这是EPS1-1也具有抑制α-糖苷酶活性的能力的重要原因。

实施例10：上述纯化胞外多糖的热重分析(TGA)和差示扫描量热分析(DSC)结果

胞外多糖的热稳定性能是影响其潜在工业应用的重要因素，对研究EPS的生物活性具有重要意义。称取3.806mg EPS1-1纯化多糖置于Al₂O₃坩埚中，Ar气流速设置为50mL/min，以10℃/min的线性加热速度将EPS1-1样品从30℃加热到800℃，期间采用TGA-DSC热分析仪(Mettler 1600HT)记录多糖样品重量以及熔点的变化，从而得到TGA和DSC曲线图。

L.rhamnosus LB1lac10的纯化多糖EPS1-1的TGA-DSC曲线如图9所示。从图中可以看出EPS1-1的降解过程主要为：当温度从30℃增加到135℃时，EPS1-1共失重11.62％(0.44mg)，这部分损失主要是由于水分或其他易挥发物质造成的，说明EPS1-1结构中含有大量羧基。多糖的重量在135℃～220℃之间基本保持不变；当温度继续增加时，EPS1-1出现最大的质量损失为70.74％(2.69mg)，在此过程可以得知多糖样品的降解温度(Td)为310.70℃，这部分失重主要是由于样品自身的降解造成的；最后，EPS1-1样品的重量逐渐减少直至恒重0.52mg(13.58％)。

另外，根据差示扫描量热分析(DSC)测定结果可以发现，EPS1-1的熔点为246.86℃。EPS1-1在热稳定性能上的差异可能与分子结构和单糖组成有关。例如，KR780676EPS是只由半乳糖单元组成的半乳聚糖，其熔点为274.65℃；而YW11 EPS是由比例为2.71：1的葡萄糖和半乳糖组成的异型多糖，其熔点为143.6℃。在一般的工业产品常规灭菌和加工过程中温度不超过150℃，L.rhamnosus LB1lac10所产的EPS 1-1的降解温度(310.70℃)和熔点(246.86℃)远超150℃，说明具备良好的热稳定性，可以应用于工业和食品领域。

实施例11：上述纯化胞外多糖EPS1-1作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用

首先将25μL 20mmol/L PNPG和25μL样品(0.5mg/mL EPS1-1)加入96孔板中，在37℃下孵育10分钟。然后加入50μL 0.2U/mLα-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)，在37℃下反应20分钟。最后，加入100μL 0.1mol/LNa₂CO₃终止反应。用酶标仪(TECAN，infinite M200)检测波长为405nm的反应液。以阿卡波糖为阳性对照，用以下公式计算抑制百分比：

抑制率(％)＝[1-(C-D)/(A-B)]

其中A是含有α-葡萄糖苷酶不含样品的吸光度，B是不含α-葡萄糖苷酶和样品的吸光度，C是含有α-葡萄糖苷酶和样品的吸光度，D是含有样品但不含α-葡萄糖苷酶的吸光度。

上述纯化多糖作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的效果如图10所示。

比较其在不同浓度α-葡萄糖苷酶(0.2U/mL，0.15U/mL，0.1以及0.01U/mL)下的抑制能力，具有明显的α-葡萄糖苷酶抑制能力，分别达到15.33％、25.97％和37.51％和95.89％。结果表明，EPS1-1本身在体外试验中显示出较强的降糖活性，是一个非常有潜力的降糖活性成分，可以发挥抑制α-葡萄糖苷酶活性的潜在作用，具有降低血糖的巨大潜力，有望为糖尿病的预防和药物的开发提供新的活性成分和来源。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

利用鼠李糖乳杆菌进行厌氧发酵，对发酵液通过醇沉法提取获得粗胞外多糖，再通过分子筛层析对其进行分离纯化，最终获得鼠李糖乳杆菌胞外多糖；

所述的鼠李糖乳杆菌是从香满楼牌酸牛奶中分离纯化得到。

2.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：

(1)将鼠李糖乳杆菌进行厌氧发酵培养，得发酵培养液；

(2)发酵培养液经离心除菌体取上清，高温灭活处理，再加入三氯乙酸除蛋白，得到上清液；

(3)将上清液采用醇沉法提取多糖，得到的产物进行真空冷冻干燥，即得粗胞外多糖，记为EPS-1；

(4)粗胞外多糖在Sephacryl TM-S-200HR柱上进行进一步纯化，真空冷冻干燥得到鼠李糖乳杆菌胞外多糖，记为EPS1-1。

3.根据权利要求2所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中，将鼠李糖乳杆菌按照3％体积比的接种量接种于MRS肉汤培养基，于37±0.5℃发酵培养12～24h，得到发酵培养液。

4.根据权利要求2所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中，高温灭活处理的方法为：在100℃的高温下煮沸15～20分钟；

步骤(2)中，加入三氯乙酸除蛋白的方法为：在高温灭活处理后的上清中加入三氯乙酸至终浓度为4.5～5.5％m/v，然后搅拌使三氯乙酸充分反应，离心，除去残留细胞和沉淀蛋白，得到上清液。

5.根据权利要求2所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：

步骤(3)中，醇沉法为：在上清液中加入2～4倍体积的无水乙醇，于3～5℃放置8～12h，离心，取沉淀进行真空冷冻干燥，即得粗胞外多糖，记为EPS-1。

6.根据权利要求2所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：

步骤(4)中，粗胞外多糖溶于超纯水中，在Sephacryl TM-S-200HR柱上进行进一步纯化，以超纯水为洗脱剂，上样量为4.8mL，流速设定为0.6～0.8mL/min。

7.一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖，其特征在于：

所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖为均一组分，其分子量为88650Da；

所述鼠李糖乳杆菌胞外多糖包含甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖，其中，摩尔比为：甘露糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：木糖：半乳糖：阿拉伯糖＝31.19：23.01：36.62：2.03：3.57：3.58。

8.根据权利要求7所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖，其特征在于：通过权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到。

9.权利要求7或8所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖在制备降糖的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。

Images