CN103214535A

CN103214535A - 蛹虫草(粤96-18)菌种的子实体中新的化合物发现和应用

Info

Publication number: CN103214535A
Application number: CN2012100197824A
Authority: CN
Inventors: 吴更余
Original assignee: HEALTHFIRST ZHUHAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HEALTHFIRST ZHUHAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-01-20
Filing date: 2012-01-20
Publication date: 2013-07-24

Abstract

本发明涉及蛹虫草(粤96-18)菌种的子实体中发现一种新的有效成份及有效成份的结构鉴定和结构式的确认以及用途。属于生物领域。该物质由蛹虫草子实体品种提取纯化而获得。蛹虫草属子囊菌亚门(Ascomycotina)核菌纲(Pyrenomycetes)球壳目(Sphaerinles)麦角菌科(Claviticpitaceae)虫草属(Cordyceps sp.)，是虫草属的模式种。[Cordyceps militaris(L.)Link]，人工培育的蛹虫草子实体采用色谱、波谱技术和化学方法进行化学成份的研究，证实人工培育的蛹虫草子实体含有的独特有效成分和主要的作用，并为深入药效物质研究提供基础。

Description

蛹虫草(粤96-18)菌种的子实体中新的化合物发现和应用

本发明涉及蛹虫草子实体菌种(粤96-18)中蛹虫草子实体中新的有效成份化合物，其提取方法及其作为药物，功能保健食品，食品的应用，属于生物领域。

背景技术

蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草、北虫草、蛹草，隶属真菌门、子囊菌亚门、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，与冬虫夏草同属虫草属。蛹虫草属子囊菌亚门(Ascomycotina)核菌纲(Pyrenomycetes)球壳目(Sphaerinles)麦角菌科(Claviticpitaceae)虫草属(Cordyceps sp.)，是虫草属的模式种。蛹虫草是由子座和菌核两部分组成的，主要寄主为鳞翅目的蚕蛾科、舟蛾科、天蚕蛾科等的幼虫和蛹，冬季其蛰居土里，真菌寄生其中吸收营养，最后其体内充满菌丝而死。到了夏季，自僵虫或僵蛹上形成子座，夏至前后采集而得。它是迄今已报道的400余种虫草菌中唯一能进行无性繁殖生产出子实体的菌种，也是唯一能大量形成虫草素的菌种，子实体内的活性物质虫草素、虫草酸、虫草多糖、核苷、腺苷和超氧化物歧化(SOD)酶等的种类和含量与天然冬虫夏草基本相同。此外，还富含人体所需的几乎全部氨基酸和必须的氨基酸；以及总糖、粗蛋白、粗脂肪等营养物质，其三大营养总量占60％以上。

人工培育的蛹虫草子实体是由从天然蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link]上分离的无性型菌种------蛹草拟青霉(Paecilomyces militaris Liang)培养所得的。研究证明，人工培育的蛹虫草子实体与天然冬虫夏草的化学成分和药理作用相似，都具有增强肌体免疫力和抗衰老、抗疲劳、抗菌、抗肿瘤以及补肾壮阳、润肌美容、延年益寿等医疗保健作用。

核苷类化合物为蛹虫草中的主要活性成分，其中虫草素是一种核苷类抗菌素，属嘌呤类生物碱，研究发现它对多种肿瘤具有抑制作用。众多研究结果还表明，蛹虫草中虫草素的含量大大高于冬虫夏草。腺苷具有改善心脑血液循环、防止心率失常等活性。

(1)、呼吸系统疾病：对咳嗽无力、气短气喘、恶风自汗、神疲乏力等“肺虚症”有明显的缓解作用，同时对肺结核、哮喘、肺气肿也有良好的辅助治病效果。

(2)、肾科疾病：现代医学实验证明：蛹虫草能改善肾脏代射及运转功能；改善肾脏组织的细胞动力学状态，促进尿毒的排泄；减轻及修复肾小管、肾小球的病理或药毒性损伤；抑制肾脏的继发性感染及高磷血症，有效控制尿毒症的恶化倾向。对腰膝酸软、遗精早泄、性功能低下、性冷淡、夜尿频等“肾虚症”及“肺、肾两虚症”有良好辅助治疗作用。

(3)、心血管疾病：蛹虫草能缓慢而持久地增加冠脉流量，能调整人体血液钙、磷比，对冠心病有稳定的治疗和康复作用，蛹虫草对动脉血管有明显抑制胶原性血小板聚集的作用，抑制率为13.3％--48.5％，是很有发展前途的抗血栓药物。

(4)、肝炎和肝硬化：蛹虫草能直接改善肝脏功能，对肝硬化的防治有重要价值。目前国内外对肝炎，尤其是肝硬化缺乏有效的治疗药物，进口免疫调节剂“十扰素”对黄种人并不理想，且价格远比蛹虫草昂贵。

(5)、血液病：蛹虫草对原发性血小板缺乏性紫癜有很好的辅助治疗效果，对白血病有一定改善症状及减缓恶性程度的作用。

(6)、抗肿瘤：由于蛹虫草对肝、肾、心轿管、呼吸道等重要脏器均有良好的综合治疗及全面康复作用，故对癌症晚期患者的想关症状改善也具有显著效果，并可降低上述部位主发病症的恶性程度，延长存活期，改善生存质量。另外，蛹虫草有升高白血球的作用，可维持放、化疗的正常进行，对良性脑瘤患者，有较理想的保守治疗效果。对妇女乳腺增生、子宫肌瘤的防治效果显著。

(7)、解毒作用：蛹虫草性温而无毒、无火，能改善肝、肾、肺等脏器的细胞动力学状态和总体代谢，有利于体内的有毒废物或其它药物残毒的排除。

(8)提高免疫力：昌鸣先等投喂虫草多糖能够明显地增强日本沼虾的免疫防御能力。李义等试验证明，口服虫草菌粉可显著地提高罗氏沼虾的免疫功能，有效地预防嗜水气单胞菌的感染。戴瑛等实验得出：蛹虫草提取物可调节小鼠机体组织的免疫功能，可以缓解由于内毒素或类似物质造成的肺部炎症，具有一定的肺保护作用。刘海燕、赵林伊等也通过实验表明：柞蚕蛹虫草对小鼠机体的非特异性免疫功能有明显的增强作用。韩国Jong-Ho KOH，Kaiming sin，Yuh-chiKuo等人关于蛹虫草多恢复机体免疫功能方面的研究表明口服蛹虫草可以提高机体的单核巨噬细胞的功能，提高吞噬能力。

(9)、日常保健功能：虫草的滋补作用久负盛名，有缓进稳补，治补兼顾，寓治于防的特点。临床报道可用于提高运动能力、改善睡眠、美容护肤、减肥、生发护中新发等广泛的滋补保健领域。

蛹虫草子实体中的有效成份化合物，其提取方法及其作为药物，功能保健食品，食品的应用。

发明内容

技术问题：本发明的目的是针对上述蛹虫草子实体菌种(粤96-18)的蛹虫草子实体中的主要活性成份的提取，确认。公开一种蛹虫草子实体含有的活性成分及独特的成份。

技术方案：采用硅胶、大孔树脂、MPLC和HPLC等色谱方法，从蛹虫草子实体的水提取物中分离得到白色粉末。

制备的方法：

1.蛹虫草水提物制备流程：取蛹虫草子实体粉粹，过60目筛粉术得蛹虫草子实体供试品，精密称取蛹虫草子实体供试品约1kg，置试管中加入3L，浸泡1h，超声提取30min，4500rpm离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，即得蛹虫

2.草子实体水提物有效成分提取：

蛹虫草子实体水提物采用HP2MG大孔树脂，水和不同比例乙醇洗脱有效成分。依次配成50％，70％，90％乙醇溶液，得到不同的醇沉部分，在90％乙醇溶解部分得到CM100(140g)。

3.CM100中有效成分提取：

将分离得到的CM100成份在进一步分离，采用采用HP2MG大孔树脂，水和不同比例乙醇洗脱有效成分。

蛹虫草乙醇沉淀成份CM100-20，CM100-0，CM100-50，CM70的成份分离流程。CM100-20经MPLC制备，分离条件：流动相10％甲醇水，254nm检测，流速12ml/min。得到化合物1(见附图1)。

有效成份鉴定方法：

2.从CM100-20经MPLC制备，分离条件：流动相10％甲醇水，254nm检测.流速12ml/min。得到化合物1经核磁结构确认，白色粉末(甲醇水)，mp 189-191℃。该化合物微溶水和甲醇等溶剂，不溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯等溶剂。IR v max：3150(NH and OH)，2977，2931，2873，1620(C＝N)cm-1。HRESIMS给出分子离子峰m/z 312.1285[M+H]+，结合NMR数据确定分子式为C12H17O5N5(calcd forC12H18O5N5，312.1302)。该化合物1H-NMR(DMSO-d6，300MHz)显示如下信号：低场区δH 8.34(1H，s，H-8)，8.20(1H，s，H-2)，与虫草素腺嘌呤片段数据相似[13]；在δH 5.87(1H，d，J＝6.3Hz，H-1’)显示1个糖端基质子信号，δH 4.59(1H，dd，J＝11.4，6.3Hz，H-2’)，4.13(1H，m，H-3’)，3.95(1H，dd，J＝6.6，3，6Hz，H-4’)，3.5-3.7(2H，m，H-5’)显示5个连氧碳上的氢信号，提示分子中含有1个五碳糖；δH 7.69(1H，s，H-N6)显示单峰信号，而且位于如此低场，提示其为腺嘌呤片段N6上的氢信号，积分只有一个质子，提示该处于可能发生变化。化合物1的13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)显示12个碳信号(表1)，除了可归属于腺苷片段的信号外，在δC 42.8和59.9有两个碳信号，结合分子式和δH 3.5-3.7(4H，m)推测可能含有一个羟乙基片断。结合N6-H只有一个氢原子，推测羟乙基连接在N6-上。化合物1的碳谱数据与N6-(2-羟乙基)腺苷数据一致[14]，确定化合物为N6-(2-羟乙基)腺苷。该化合物为首次从蛹虫草中分离得到。经HPLC分析，在先康公司提供的水提取物CM中，N6-(2-羟乙基)腺苷与虫草素峰面积比为1∶2.72(YMC色谱柱，15％MeOH水，0.8ml/min，260nm检测)，证明化合物1是N6-(2-羟乙基)腺苷。见说明书附图2.

分子式为C₁₂H₁₇O₅N₅(calcd for C₁₂H₁₈O₅N₅，312.1302)。

表1：化合物N⁶-(2-羟基乙基)腺苷的核磁分析表

蛹虫草可以用于治疗糖尿病和免疫调节剂药用原料及产品的应用，也可以用于功能保健食品原料和产品的研究及应用。

3’	70.9	4.13(1H，m，H-3’)
			4’	86.1	3.95(1H，dd，J＝6.6，3.6Hz)
5’	61.9	3.5-3.7(2H，m)
			N6-H		7.69(1H，s)

表1：化合物N⁶-(2-羟基乙基)腺苷的¹H-NMR(300MHz)和¹³C-NMR(100MHz)数据(DMSO-d₆)碳信号。

蛹虫草子实体的应用

附图说明

附图1是蛹虫草CM100成份，蛹虫草乙醇沉淀成分CM100-20经MPLC制备，分离条件为：流动相10％甲醇水，254nm检测，流速12ml/min。得到化合物1图。见说明书附图1。

附图2是化合物1(N⁶-(2-羟基乙基)腺苷)图。见说明书附图2。

参考文献

[1]冯影，孟令丰，吴大勇，郝继红。冬虫夏草国内研究概况。中医药信息，2004，21(2)：24-26

[2]张兴辉，石力夫，胡晋红。冬虫夏草化学成分和药理作用研究进展，中药材，2000，23(11)：722-724

[3]国家药典委员会。中华人民共和国药典，2005版，一部，75-76。

[4]杨钊，迟少云，张春辉，吴爱英。冬虫夏草及其代用品中腺苷和虫草素的LC-MS-MS定量分析研究，中国中药杂志，2007，32(19)：2018-2021

[5]连云岚。北虫草化学成分及药理作用研究进展。山西医药杂志，2006，35(1)：44-46

[6]韦会平，肖波，胡开始。蛹虫草药用价值考。中药材，2004，27(3)：215-217

[7]郦皆秀，李进，徐丽珍，杨世林，邹忠梅。西藏产冬虫夏草化学成分研究。中国药学杂志，2003，38(7)：499-501

[8]黄春秋，功能性食品添加剂海藻糖及其研究进展，广西农学报，2005，6：28-32

[9]刘莹，海藻糖的功能与应用，陕西广播电视大学学报，2008，10(1)：94-96

[10]侯丽君，万秀玉，张天民。海藻糖的生物学特性及在医药领域的研究与应用，食品与药品，2005，7(10A)：9-12

[11]Motomasa Tanaka，Yoko Machida，Sanyong Niu，et al；Nature Medicine，2004，10(2)：148-154.

[12]蒙健宗，赵文报。海藻糖的性质及其在新型食品开发中的应用，食品科学，2005，26(6)：281-283

[13]刘静明，钟裕容，杨智，崔淑莲，王伏华。蛹虫草化学成分研究，中国中药杂志，1989，14(10)：32-33

[14]Tsutomu Furuya，Masao Hirotani and Masayuki Matsuzawa.N6-(2-hydroxyethyl)adenosine，a biologically active compound from culturedmycelia of Cordyceps and Isaria species，Phytochemistry，1983，22(11)：2509-2512

[15]Pawan K.Agrawal.NMR spectroscopy in the structure elucidation ofoligosaccharides and glycoside.Phytochemistry，1994，31(10)：3307-3330

[16]于德泉，杨峻山，分析化学手册，第七分册：904

[17]唐传核。植物生物活性物质，化学工业出版社，2005年，北京。

[18]付鸣佳，蛹虫草产类胡萝卜素的研究。食品与生物技术学报，2005，24(5)：107-110

[19]张志军，江晓路，牟海津，刘树青，张婷婷。蛹虫草类胡萝卜素提取工艺研究，食品科技，2007，4：99-103

[20]项斌，高见荣，天然色素，化学工业出版社，2004年，北京。

[21]赵文报，黄日波。能量型运动饮料，专利公开号：CN 1489943A。

[22]兰进侯建明。适用于糖尿病患者的海糖蛋白食品，专利公开号：CN1154214A。

Claims

1.权利要求：蛹虫草(粤96-18)菌种的子实体中分离得到的有效成份的保扩，N⁶-(2-羟基乙基)腺苷。

2.权利要求1所述的化合物的基础上通过硅胶、大孔树脂、MPLC和HPLC等色谱方法，从蛹虫草子实体的水提取物中首次分离一种独特的化合物，并鉴定，获得的化合物为：N⁶-(2-羟基乙基)腺苷(附图1)。要求对分离方法进行保护。

3.权利要求1所述生物活性物质具有典型的蛹虫草子实体独有性和菌种的独特性。可用于该物质进行药用原料的开发和功能保健食品和食品中应用，可使用该生物活性物质的基础上通过单独或组合配方在保健饮料，保健酒和其它形式的产品开发和应用具有广泛的领域和深远的用途，具有非常重要的保健功能和药用作用。