CN109777760B

CN109777760B - 低毒高产杀菌剂吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株及培养方法和应用

Info

Publication number: CN109777760B
Application number: CN201711125280.9A
Authority: CN
Inventors: 何亚文; 金子靖
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Yaoxin Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-11-14
Filing date: 2017-11-14
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2037-11-14
Also published as: CN109777760A

Abstract

本发明提供一种低毒高产吩嗪‑1‑酰胺的基因工程菌株及培养方法和应用。所述基因工程菌株为采用基因工程方法，将假单胞菌株PA1201基因组中的绿脓菌素PYO的编码基因phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列敲除，并将假单胞菌株PA1201中合成PCN相关基因的启动子替换为启动子PrhlI后获得。本发明通过无痕敲除PA1201基因组中与毒性相关的2个基因，使其不再产生毒性物质PYO，也增加了PCN前体物质PCA的产量；通过启动子置换，显著提高了PCN合成相关基因及基因簇的表达量；同时通过优化发酵培养工艺，进一步提高了PCN的发酵效价，为新一代绿色微生物杀菌剂的工业化生产与推广提供了可能。

Description

低毒高产杀菌剂吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株及培养方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程菌株技术领域，具体地说，涉及一种低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株及培养方法和应用。

背景技术

用绿色生物农药取代传统化学农药是农业作物病害防治的的发展趋势，有着环境友好，绿色低毒，针对性强等特点。上海交通大学从根际促生假单胞菌M18的代谢产物中提取到抗水稻纹枯病的代谢产物吩嗪-1-羧酸(PCA)，并以此为主要物质制备了生物农药申嗪霉素，已于2011年申请到农业部颁发的农药登记证，并与2016年重新注册，将批准防治的病害扩大到九种，分别为：水稻纹枯病、西瓜枯萎病、甜椒疫病、黄瓜灰霉病、黄瓜霜霉病、水稻稻曲病、水稻稻瘟病、小麦全蚀病、小麦赤霉病。然而野生型促生拮抗菌M18的PCA产量很低，生产成本高，无法进行大规模农业工业生产。同时，PCA在中性及碱性条件下抑菌活性大幅度降低，适用环境限制大。

2015年，上海交通大学何亚文团队从重庆郊区采集水稻根际土壤，分离出了PCA产量高于M18菌株3-4倍并且可以同时产生有更高抑菌活性的物质吩嗪-1-酰胺的假单胞菌株PA1201(菌种保藏号：CCTCC NO.M 2013441，参见Zhou L,Jiang H,Jin K,等.[Isolation,identification and characterization of rice rhizobacterium Pseudomonasaeruginosa PA1201producing high level of biopesticide"Shenqinmycin"andphenazine-1-carboxamide][J].Wei sheng wu xue bao＝Acta microbiologica Sinica,2015,55(4):401.)。PCA的衍生物吩嗪-1-酰胺(PCN)是由基因phzH编码酰胺基转移酶催化PCA所得。与PCA相比，PCN在中性和碱性环境中有着稳定的抑菌活性，且抑菌活性高于PCA五到十倍，有良好的应用前景。黄豆粉培养基中野生型PA1201菌株PCN产量为0.489克/升，远远达不到工业生产要求。而在现有专利及文献中通过提高合成基因及基因簇表达量提高PCN产量，往往涉及重组质粒，需要另行添加对应抗生素，无法保证稳定遗传。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株及培养方法和应用。本发明提供一种制备可稳定遗传的基因工程菌株的方法，利用RNA-seq筛选鉴定PA1201内源高效表达基因的启动子；去除PA1201基因组中PCN合成过程中前体物质竞争产物绿脓菌素(PYO)的编码基因phzS及phzM，使PA1201更加安全和低毒同时可降低PCN合成前体的消耗；用筛选到的高效启动子置换PCN合成相关基因的启动子，最终提高PCN的产量，降低生产PCN的成本以达到工业生产的要求，研发出一种新型绿色微生物杀菌剂。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株，采用基因工程方法，将假单胞菌株PA1201基因组中的绿脓菌素PYO的编码基因phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列敲除，并将假单胞菌株PA1201中合成PCN相关基因的启动子替换为启动子PrhlI后获得。

第二方面，本发明提供了一种低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

A、将假单胞菌株PA1201基因组中的绿脓菌素的编码基因phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列敲除，得三敲除菌株UMS；

B、将三敲除菌株UMS中合成PCN相关基因的启动子替换为启动子PrhlI，即得所述基因工程菌株UPAN。

优选地，步骤A中，所述绿脓菌素的编码基因phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列的敲除方法包括以下步骤：

A1、以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，通过引物分别克隆基因phzS、phzM或phz1基因簇5’端非编码序列的两段侧翼序列；

A2、以上述两段侧翼序列为模板，通过引物重叠延伸PCR克隆得到融合片段；

A3、将融合片段插入到自杀质粒pK18，构建重组自杀质粒；

A4、将重组自杀质粒转化至PA1201野生型菌株，筛选得到抗卡那霉素的交换突变株；

A5、将交换突变株置于含有蔗糖的LB培养基上培养，筛选得到phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列无痕敲除的突变株；

A6、通过引物进行菌落PCR，筛选和验证突变体菌株，即得所述三敲除菌株UMS。

优选地，步骤B中，所述合成PCN相关基因包括phz2基因、phzH基因。

优选地，所述启动子的替换方法包括以下步骤：

B1、以三敲除菌株UMS基因组DNA为模板，通过引物分别克隆启动子PrhlI的基因序列、合成PCN相关基因的启动子的两端侧翼序列；

B2、以步骤B1所述的两段侧翼序列和PrhlI的基因序列为模板，通过引物重叠延伸PCR克隆得到置换启动子融合片段；

B3、将融合片段插入到自杀质粒pK18，构建重组自杀质粒；

B4、将重组自杀质粒转化至UMS菌株，筛选得到抗卡那霉素的交换突变株；

B5、将交换突变株置于含有蔗糖的LB培养基上培养，筛选得到置换掉原有启动子的突变株；

B6、通过引物进行菌落PCR，筛选和验证突变体菌株，即得所述基因工程菌株UPAN。

优选地，所述启动子PrhlI的获得方法包括以下步骤：

通过RNA-seq筛选出PA1201菌株中高表达基因，测定其启动子活性，即筛选得到所述的启动子PrhlI。

第三方面，本发明提供了一种低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株的发酵培养方法，包括以下步骤：

S1、将基因工程菌株UPAN接种至LB琼脂培养上，倒置培养，得单菌落；

S2、将单菌落接种至PPM液体培养基中，第一次摇床发酵培养；

S3、将经步骤S2的发酵培养后获得的种子液接种到含KNO₃的浓度为10～20g/L的PPM发酵培养液中，第二次摇床发酵培养，即可。

优选地，步骤S1中，所述培养温度为28℃。

优选地，步骤S2和S3中，所述摇床发酵培养的温度为37℃、摇床转速为200rpm；所述第一次摇床发酵培养的时间为12-24h，第二次摇床发酵培养的时间为48-72h。

第四方面，本发明提供了一种低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株在制备微生物杀虫剂中的应用。

本发明采用的引物序列如下所示：

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明通过RNA-seq技术对PA1201基因组进行分析，筛选到了RPKM值2000以上的基因，并对于长度适当基因的启动子进行序列分析及活性检测，成功筛选到一段可以驱动基因高效表达的基因PrhlI，可通过启动子置换技术用于增加其他基因的表达量。

2、通过无痕敲除PA1201基因组中与毒性相关的2个基因，截断了PCA合成PYO的途径，使得PA1201不再产生毒性物质PYO，也增加了PCN前体物质PCA的产量。由于PA1201遗传操作简便及发酵周期短等特点，使今后针对PCN的遗传改造及发酵更加方便。

3、从不同起始密码子处进行启动置换，通过检测是否有PCN生成，重新注释了phzH基因起始密码子在原有起始密码子前39bp碱基处(如图4)，通过启动子置换，显著提高了PA1201中PCN合成相关基因及基因簇的表达量，最终提高了PCN的发酵效价，得到PCN合成工程菌株UPAN，PPM培养基中PCN产量相比PCN原产生菌PA1201的0.018克/升有了大幅度提升，可达2.8克/升(如图7)。经发酵条件优化后，UPAN菌株中PCN发酵效价可达8克/升(如图10)，是目前报道中PCN发酵效价最高的工程菌株，为新一代绿色微生物杀菌剂的工业化生产与推广提供了可能。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明菌株构建及发酵优化工艺路线图；

图2为实施例1和2的启动子筛选结果；其中，图2a为筛选的PA1201菌株中高表达基因；图2b为各高表达基因的β-半乳糖苷酶活性比较；

图3为启动子PrhlI在28℃和37℃下的β-半乳糖苷酶活性；

图4为phzH启动子碱基序列及起始密码子位置标注；

图5为phzH启动子两处ATG起始序列启动子活性检测；

图6为从phzH启动子两处ATG起始置换对其编码功能的影响；

图7为构建完成的工程菌株UPAN在PPM培养基中摇瓶发酵不同时间点细胞密度及PCN发酵效价；

图8为37℃条件下，发酵72小时后，摇瓶培养基中菌体形态差异；其中，图8A为含有5克/升KNO₃的PPM培养基；图8B为含有15克/升KNO₃的PPM培养基；

图9为37℃下，含有不同浓度KNO₃培养基中菌株生长曲线；

图10为37℃下，含有不同浓度KNO₃培养基中PCN发酵效价。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明实施例提供了一种低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株及其构建方法和发酵培养方法，技术路线如图1所示。通过以下实施例进行具体说明。

实施例1

本实施例涉及一种高效表达基因启动子的鉴定方法，包括如下步骤：

步骤一，对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201进行转录组测序(RNA-seq)；

步骤二，以每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数(RPKM)为标准，比较PA1201中基因表达量；

步骤三，分析并利用一组引物Px-F和Px-R(x代表对应基因名称，如SEQ ID No.13-25所示)扩增RPKM值2000以上基因的启动子序列(包括lasB、rhlI、rhlR、pqsA、oprI、phzH)，插入mini-CTX-lacZ质粒中，构建重组单拷贝质粒。

步骤四，借助辅助质粒pRK2013，通过三亲杂交法，将重组单拷贝质粒转化至M18野生菌株，得到抗四环素的单交换突变株。

步骤五，通过引物Px-F和lacZ-F；Pser-up和lacZ-R两组引物分别进行菌落PCR，筛选和验证lasB、rhlI、rhlR、pqsA、oprI、phzH的启动子报告菌株。

实施例2

本实施例涉及一种启动子活性的鉴定方法，包括如下步骤：

步骤一，试剂准备：(所有试剂的配制都要用灭过菌的超纯水Ⅱ)

(1)Z缓冲液(100ml)

在90ml灭过菌的超纯水Ⅱ中加入2.148g Na₂HPO₄·12H₂O，0.624g NaH₂PO₄·2H₂O，1ml 1M KCL(无菌)，0.1ml 1M MgSO₄(无菌)。用超纯水Ⅱ定容至100ml。

在磁力搅拌器上搅拌均匀，所有盐都溶解以后，用1N HCl或1N NaOH将pH调至7.0。贮存在4℃冰箱。

(2)磷酸盐缓冲液(100ml)

在90ml灭过菌的超纯水Ⅱ中加入2.15g Na₂HPO₄·12H2O，1.248g NaH₂PO₄·2H₂O。用超纯水Ⅱ定容至100ml。在磁力搅拌器上搅拌均匀，所有盐都溶解以后，用1N HCl或1NNaOH将pH调至7.0。室温贮存，不需要新鲜配置。

(3)4mg/ml ONPG

将ONPG粉末溶解在pH7.0的磷酸缓冲液中，配制成终浓度为4mg/ml的溶液，如称取0.1g至25ml磷酸缓冲液中。

ONPG不易溶解，应在使用前1小时配制，28度水浴温浴溶解(避光)。

ONPG见光易分解，配制好之后避光4度保存。最好当天配置。

(4)1M Na₂CO₃

将5.3g Na₂CO₃溶解在50ml超纯水Ⅱ中，即为1M Na₂CO₃。

步骤二，细菌培养及取样

(1)种子液培养：

在超净工作台中，倒30mlPPM液体培养液至50ml已灭菌的离心管中，加入15μl壮观霉素母液(100mg/ml)和15μl Tc母液(100mg/ml)，混合均匀后分装10ml到3个已灭菌的三角瓶中，标明菌株名称，用接种环挑取少量实施例1筛选获得的启动子报告菌落，接种到上述10ml培养液中，置于28℃恒温摇床，200rpm过夜培养。

(2)培养：在超净工作台中，取1ml种子液到比色皿中，测定菌株的A600值。

倒50ml PPM液体培养基至250ml已灭菌的三角瓶中，加入25μl Tc20母液，标明菌株名称，根据种子液浓度加入适量种子液，使培养液初始A600为0.2。置于28℃恒温摇床，200rpm培养。

(3)取样：取样量：0.1ml(使用2ml的离心管)，2个平行样。

取样时间点：12小时、24小时、36小时、48小时

取样时，同时记录样品时间点的OD600。

(4)待测菌10,000rpm离心2min，离心后，迅速用移液器小心地弃去上清(以避免损失)，将样品贮存于-20℃冰箱中，一批样品的四个时间点全部收集完成后，同时测定酶活。

步骤三，β-半乳糖苷酶活性测定

(1)从-20℃取出的细胞用1.0ml预冷的Z缓冲液重新悬浮。

(2)向重悬的菌液中加入40μl氯仿，振荡30s混匀。

(3)再向上述菌液中加入40μl 0.1％SDS，振荡30s。

(4)将反应液置于28℃水浴中，静置5分钟(预热+静置分层)。

(5)在反应液中加入200μl的4mg/ml的ONPG(已预热为28℃)，振荡5s混匀。放置在28℃培养箱中，记录开始时间T1。

(6)等到足够的黄色出现时(变黄速度过快时，需将菌液稀释，可进行预实验。)，加入500μl的Na₂CO₃使得溶液pH值到11左右，β-半乳糖苷酶失活而终止反应，记录反应的终止时间T2(同一批次，时间保持一致)。

(7)将上述混合物以12,000离心10分钟，以除去细胞碎片和氯仿。取其中0.8ml上清至比色皿中，测定其A₄₂₀。其中空白对照为：1ml Z缓冲液+0.2ml ONPG试剂+0.5ml Na₂CO₃。

(8)通过公式计算β-半乳糖苷酶活性活性单位

Miller units＝2*(1000*A₄₂₀)/[A₆₀₀*(T2-T1)*V]

以此为标准鉴定出高效启动子PrhlI(如图2)，且启动子PrhlI在37℃下启动子活性报告菌株中β-半乳糖苷酶活性高于28℃(如图3)。

实施例3

本实施例涉及一种三敲除菌株UMS的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，phzS-F1和phzS-R1；phzS-F2和phzS-R2两对引物克隆基因phzS的两段侧翼序列(flankingsequences)；

步骤二，以上述两段侧翼序列为模板，通过引物phzS-F1和phzS-R2重叠延伸PCR(Overlap PCR)克隆得到融合片段；

步骤三，将融合片段插入到自杀质粒pK18，构建重组自杀质粒；

步骤四，通过电转化法或双亲杂交法，将重组自杀质粒转化至PA1201野生型菌株，筛选得到抗卡那霉素的单交换突变株；

步骤五，将单交换突变株置于含有5％蔗糖的LB培养基上培养36小时，筛选得到phzS基因无痕敲除的突变株；

步骤六，通过引物phzS-F1和phzS-R2进行菌落PCR，筛选和验证单突变体菌株。

步骤七，采用步骤一到六的方法在步骤六获得的单突变菌株基础上，筛选得到进一步敲除了phzM的双敲除菌株MS；所述克隆基因phzM采用的引物为phzM-F1和phzM-R1、phzM-F2和phzM-R2；

步骤八，采用步骤一到六的方法在步骤七获得的双敲除菌株MS基础上，筛选得到进一步敲除了phz1基因簇5’端非编码区的三敲除菌株UMS；所述克隆phz1基因簇5’端非编码区采用的引物为UTR-F1和UTR-R1、UTR-F2和UTR-R2。

以上方法中，三组基因的敲除顺序可进行任意调换，均能获得所述三敲除菌株。

实施例4

本实施例涉及针对实施例3的三敲除菌株UMS置换启动子的方法，包括如下步骤：

步骤一，以UMS基因组DNA为模板，以PrhlI::phzH-F2和PrhlI::phzH-R2为引物克隆基因rhlI的启动子序列，以PrhlI::phzH-F1和PrhlI::phzH-R1；PrhlI::phzH-F3和PrhlI::phzH-R3两对引物克隆phzH启动子两侧序列；

步骤二，以上述两段侧翼序列及启动子为模板，通过引物PrhlI::phzH-F1和PrhlI::phzH-R3重叠延伸PCR(Overlap PCR)克隆得到置换启动子融合片段；

步骤四，通过电转化法或双亲杂交法，将重组自杀质粒转化至UMS菌株，筛选得到抗卡那霉素的单交换突变株；

步骤五，将单交换突变株置于含有5％蔗糖的LB培养基上培养36小时，筛选得到置换掉原有启动子phzH的突变株；所述PrhlI基因置换phzH的起始密码子位于原有注释前39bp处，即图4所示的ATG1处；

步骤六，通过引物PrhlI::phzH-F1和PrhlI::phzH-R3进行菌落PCR及测序，筛选和验证突变体菌株1。

步骤七，采用步骤一到六的方法将步骤六获得的突变体菌株1中原有的phz2启动子置换为PrhlI启动子；其中，以PrhlI::phz2-F2和PrhlI::phz2-R2为引物克隆基因rhlI的启动子序列，以PrhlI::phz2-F1和PrhlI::phz2-R1；PrhlI::phz2-F3和PrhlI::phz2-R3两对引物克隆phzH启动子两侧序列。

本实施例中，所述置换启动子的基因编码序列起始位置的鉴定方法包括如下步骤：

步骤一：分析phzH基因原有起始密码子附近序列，找到与原有注释位置相差碱基数为3的倍数的起始密码子序列(如ATG，GTG等)。分别命名原有起始密码子及其39个碱基前的起始密码子序列为ATG1及ATG2(如图4)。

步骤二，以MS基因组DNA为模板，克隆基因rhlI的启动子序列及phzH基因ATG1及ATG2位置处启动子两侧序列(ATG1序列前置换启动子的方法与前述的置换方法相同，ATG2序列前置换引物将PrhlI::phzH-R2换为PrhlI::phzH39-R2，PrhlI::phzH-F3换为PrhlI::phzH39-F3，其余同上)；

步骤三，以上述两段侧翼序列及启动子为模板，通过重叠延伸PCR(Overlap PCR)克隆得到置换启动子融合片段；

步骤三，通过电转化法或双亲杂交法，将重组自杀质粒转化至MS菌株，筛选得到抗卡那霉素的单交换突变株；

步骤五，将单交换突变株置于含有5％蔗糖的LB培养基上培养36小时，筛选得到置换掉原有启动子的突变株；

步骤六，通过基因组PCR及测序，筛选和验证突变体菌株。

步骤七：通过HPLC方法检测置换后菌株是否生成PCN，即流动相为40％5毫摩尔醋酸铵与60％乙腈等度以0.7毫升每分钟经过C18柱，保留时间8分钟。4利用高效启动子PrhlI分别从atg-1及atg-2处起始置换phzH启动子，经验证，如图5和图4所示，phzH起始密码子位于原有注释前39bp处置换启动子后PCA可完全转化为PCN。由此鉴定phzH起始密码子位于ATG2处，重新注释phzH编码序列(如图4)。

在UMS置换phz2基因簇启动子的基础上，置换重新注释的phzH基因启动子为rhlI启动子，获得最终的基因工程菌株UPAN。

以上方法中，两个启动子的置换顺序可进行任意调换，均能获得所述基因工程菌株UPAN。

实施例5

本实施例涉及一种基因工程菌株UPAN的发酵培养方法，包括如下步骤：

步骤一，取出保存在-80℃冰箱的多基因突变体UPAN置于冰上，在超净台里，在LB琼脂平板上划线，平板吹干后，置于28℃培养箱里倒置培养，直至出现足够大的单菌落；

步骤二，将单菌落接种于含10毫升PPM液体培养基的三角瓶中，三角瓶体积为50毫升，置于恒温摇床上，由于置换后启动子PrhlI在37℃下启动子活性报告菌株中β-半乳糖苷酶活性高于28℃，故将发酵条件设定为37℃、200r.p.m条件下培养过夜；

步骤三，将种子液分别接种到含50毫升的PPM发酵液体培养基(PPM培养基中本身含有5克/升KNO₃)、含浓度为10克/升KNO₃的PPM、含浓度为12.5克/升KNO₃的PPM、及含浓度为15克/升KNO₃的PPM的三角瓶中，三角瓶体积为250毫升，起始OD₆₀₀＝0.02；

步骤四，温度为37℃，摇床转速为200r.p.m条件下发酵48至72小时。

图7为构建完成的工程菌株UPAN在PPM培养基中摇瓶发酵不同时间点细胞密度及PCN发酵效价，结果可见工程菌株UPAN在PPM培养基中PCN产量可达2.8克/升。

如图8-10所示，增加PPM培养基中KNO₃的浓度，可大幅提高PCN产量，UPAN菌株中PCN发酵效价最高可达8克/升。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 低毒高产杀菌剂吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株及培养方法和应用

<130> DAG32862

<141> 2017-11-14

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

Claims

1.一种低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株UPAN，其特征在于，采用基因工程方法，将假单胞菌株PA1201基因组中的绿脓菌素的编码基因phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列敲除，并将假单胞菌株PA1201中合成PCN相关基因的启动子替换为启动子PrhlI后获得；

所述合成PCN相关基因包括phz2基因、phzH基因；

将phzH基因的启动子替换为启动子PrhlI时，通过引物分别克隆启动子PrhlI的基因序列、phzH基因的启动子的两端侧翼序列；所述克隆启动子PrhlI的基因序列的引物对如SEQID NO.31和35所示，克隆phzH基因的启动子的两端侧翼序列的引物对如SEQ ID NO.29和30所示、SEQ ID NO.34和36所示。

2.一种如权利要求1所述的低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将假单胞菌株PA1201基因组中的绿脓菌素的编码基因phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列敲除，得三敲除菌株UMS；

B、将三敲除菌株UMS中合成PCN相关基因的启动子替换为启动子PrhlI，即得所述基因工程菌株UPAN；

步骤B中，所述合成PCN相关基因包括phz2基因、phzH基因；

所述启动子的替换方法包括以下步骤：

B1、以三敲除菌株UMS基因组DNA为模板，通过引物分别克隆启动子PrhlI的基因序列、合成PCN相关基因的启动子的两端侧翼序列；

B2、以步骤B1所述的两端侧翼序列和PrhlI的基因序列为模板，通过引物重叠延伸PCR克隆得到置换启动子融合片段；

B3、将融合片段插入到自杀质粒pK18，构建重组自杀质粒；

3.根据权利要求2所述的低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤A中，所述绿脓菌素的编码基因phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列的敲除方法包括以下步骤：

A1、以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PA1201基因组DNA为模板，通过引物分别克隆基因phzS、phzM或phz1基因簇5’端非编码序列的两端侧翼序列；

A2、以上述两端侧翼序列为模板，通过引物重叠延伸PCR克隆得到融合片段；

A3、将融合片段插入到自杀质粒pK18，构建重组自杀质粒；

A5、将交换突变株置于含有蔗糖的LB培养基上培养，筛选得到phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列无痕敲除的突变株；

4.根据权利要求2所述的低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述启动子PrhlI的获得方法包括以下步骤：

5.一种如权利要求1所述的低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株在制备微生物杀虫剂中的应用。