CN112266887A - 一种苏云金芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种苏云金芽孢杆菌，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20588，其对草地贪夜蛾和/或南美番茄潜夜蛾具有杀虫活性。

Description

一种苏云金芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及一种对草地贪夜蛾和/或南美番茄潜夜蛾具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株。

背景技术

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)是一种世界性重大农业害虫，其幼虫及成虫均能对玉米等多种主要经济作物造成严重危害。于2019年侵入我国。

南美番茄潜叶蛾属鳞翅目Lepidoptera麦蛾科Gelechiidae，原发南美洲，是新近传入我国的一种世界毁灭性害虫，主要以幼虫潜食番茄的叶肉，亦可蛀食果实、顶梢，以及嫩芽、嫩茎和侧枝，严重为害时常造成番茄减产80％至100％。南美番茄潜叶蛾为害隐蔽，且已对包括有机磷类、拟除虫菊酯类、阿维菌素、邻甲酰胺基苯甲酰胺类等在内的常用的杀虫剂产生了严重抗性，同时，其对包括多杀菌素、印楝素、几丁质合成抑制剂等在内的多种生物源药剂也产生了抗性。

筛选高毒力苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)菌株资源可以为实现草地贪夜蛾和/或南美番茄潜夜蛾的高效、绿色、持续防控提供一条有效的途径。

发明内容

本发明之一提供了一种苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20588。

对本发明的菌株遗传改良后得到的工程菌可以赋予其更优和/或更多的性能，例如可以结合菌株自身的特性，根据实际应用增加和/或拓宽其杀虫和/或抗虫的性能，或使其兼具抗菌的性能。即通过对本发明的菌株遗传改良，使其兼具如上性能中的至少一种。由于该工程菌株以本发明的苏云金芽孢杆菌为改造对象，即向其中转入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，遗传改良后的菌株仍然为苏云金芽孢杆菌。

因此，本发明之二提供了一种对本发明之一所述的苏云金芽孢杆菌进行遗传改良后得到的工程菌。例如，所述遗传改良后的工程菌可以为转入携带有功能基因的质粒后所得到的工程菌株，也可以为将功能基因重组到野生菌株的基因组中得到的工程菌株。

因此，在一个具体实施方式中，所述工程菌通过向如本发明之一所述的苏云金芽孢杆菌转入功能基因得到。

在一个具体实施方式中，所述功能基因为用于防治为害植物害虫的基因、用于防治为害植物病原微生物的基因和增强所述苏云金芽孢杆菌防治为害植物害虫效果的基因中的至少一种。

虽然转基因倍受部分群体质疑，然而将苏云金芽孢杆菌进行遗传改良后得到的工程菌并不直接供人类或动物食用。而且在将其投放市场进行商业化之前，需要首先通过国家有关部门的安全性评价，以避免产生安全性问题。根据工程菌的安全性结论以及国家有关部门的批准，然后对其合理使用。

本发明之三提供了一种组合物，所述组合物包含如本发明之一所述的苏云金芽孢杆菌或如本发明之二所述的工程菌。

在一个具体实施方式中，所述组合物的剂型为悬浮剂、油悬剂、粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂中的至少一种。

本发明之四提供了如本发明之一所述的苏云金芽孢杆菌、如本发明之二所述的工程菌和如本发明之三所述的组合物中的至少一种在用于防治草地贪夜蛾中的应用。

在本发明中没有特殊说明的情况下，本发明中的术语均属于现有技术中所指的通用术语。

附图说明

图1显示了基于BiotPS3菌株16S rDNA基因全长序列所构建的系统发育树。

菌株保藏

本发明筛选的微生物BiotPS3菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20588，保藏日期为2020年9月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做以下详细说明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，121℃灭菌20min。

LB固体培养基：LB液体培养基加琼脂15g/L，121℃灭菌20min。

牛肉膏蛋白胨培养基：0.3wt％牛肉膏，0.5wt％蛋白胨，pH 7.2，121℃灭菌20min。

实施例1

菌株的分离与形态学鉴定

使用LB固体培养基对采集的土样进行芽孢杆菌筛选与分离。首先利用无菌水对土样进行梯度稀释，然后将系列稀释的样品置于70℃的水浴锅中10分钟，在无菌条件下取100微升的不同梯度下的稀释液涂布于LB固体平板上，并于30℃培养16-48小时，对菌落形态为无粘液、湿润、厚实且菌落外沿稍有扩散而不很整齐的菌落进行纯化，然后保藏纯化出的单菌落，以备用于后续的菌种鉴定和生物活性分析。

对纯化的单菌落在30℃条件下LB培养，不同时间取样镜检观察菌落形态特征、晶体特征等。在LB培养基上培养不同阶段观察结果如下，营养体：呈杆状，两端钝圆，大小约1.0×0.5μm至1.5×0.5μm；单个或两个以上呈链状存在。芽孢：椭圆形，大小约1.0×0.5μm至1.3×0.5μm，为休眠体；对高温或者干燥等不良环境有较强的抵抗力。伴胞晶体：球形、菱形和方形等。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌形态特征基本一致，因此，将具有这种形态菌落的菌株属于苏云金芽孢杆菌。

分离的菌株共计363株，分别对这些菌株进行编号。

实施例2

Bt蛋白芽孢混合液制备及SDS-PAGE分析

取400μL活化的Bt菌液(每个编号下的菌株)均匀地涂布于1/2LB固体培养基上，在30℃恒温条件下培养至50％以上菌体裂解时，将全部菌体刮到50mL离心管中，加适量预冷的超纯水充分洗涤两次，每次8000r/min离心10min，弃上清，沉淀最后加入4mL预冷的50mMNa₂CO₃(pH 10.0)溶解，反复吹打混匀得蛋白芽孢混合液。

取上述蛋白芽孢混合液，加入1/5体积预冷的0.5M NaOH溶液，室温反应5min，随后加入5×上样缓冲液，混匀，煮沸5min，12000r/min离心3min，取10μL上清液进行SDS-PAGE电泳分析，电泳方法参照萨姆布鲁克和拉塞尔(2002)的方法进行。蛋白图谱使用Image J2x软件对80kDa蛋白条带进行定量。

实施例3

草地贪夜蛾活性菌株的筛选

供试草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)由河北省沧州市农林科学院植物保护研究所提供。

草地贪夜蛾人工饲料配方：玉米粉200g，黄豆粉100g，酵母粉90g，蔗糖50g，琼脂15g，山梨酸1.8g，对羟基苯甲酸甲酯(尼泊金)1.8g，水1000ml。

称取15g草地贪夜蛾人工饲料置于灭菌培养皿中，加入3mL已经定量且梯度稀释的实施例2制备的待测样品的蛋白芽孢混合液，充分搅拌均匀，于室温放置；待饲料中多余的水分蒸发后，将全部饲料均匀的分装于24孔板中；随后用毛笔挑取拉丝、个体活跃且大小一致的初孵幼虫接于24孔板内，每孔一头，接好幼虫后用内置吹塑纸板的顶盖盖好，再用橡皮筋固定扎紧，防止幼虫逃逸；以添加50mM Na₂CO₃水溶液(pH 10.0)和蒸馏水为空白对照。将24孔板置于温度(27±1)℃，RH(65±5)％，光照周期16L﹕8D的养虫室中。每处理3次重复，每个重复24头。每天检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结。7d后分别调查死、活虫数，计算平均死亡率、校正死亡率，使用PoloPlus软件分析死亡率以及LC₅₀值。

根据测试结果，编号为BiotPS3菌株的杀虫活性较高，结果见表1。

实施例4

BiotPS3菌株的聚类分析

16S rRNA基因是细菌的进化标尺，对一个未知的种，一般首先考察其16S rRNA基因的系统发育关系，因此，对BiotPS3进行16S rRNA基因测序并构建系统发育树。

参照Song F P,et al.(Identification of cry1I-type genes from Bacillusthuringiensis strains and characterization of a novel cry1I-type gene[J].Applied and environmental microbiology.2003,69(9),5207-5211.)中所述的方法提取Bt菌株BiotPS3的基因组DNA。用细菌16S rDNA通用引物：27F(SEQ ID No.1)和1492R(SEQID No.2)扩增菌株BiotPS3的16S rDNA序列。50μL的反应体系包括：基因组DNA(50ng/μL)1μL，27F(20μM)1μL，1492R(20μM)1μL，PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，ddH₂O补充至50μL。PCR扩增条件：94℃ 5min预变性，94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 90sec，共30个循环，72℃5min终延伸。得到的1500bp左右片段经试Axygen胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)纯化进行TA克隆，克隆到pMD-18T(Takara)上，转化大肠杆菌(Escherichia coli)并进行常规的培养，得到转化子，经过对转化子的菌液PCR验证正确后，送北京六合华大基因科技有限公司测序，所得序列为1478bp(详见SEQ ID No:3所示)。所测序列提交NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行同源性比较，比较结果显示BiotPS3与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)IAM 12077(NR_043403.1)(公布的16S rRNA基因片段长度为1486bp)相似性为99.8％。使用MEGA5.0软件，选择邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，如图1所示。从图1中可以看出，与BiotPS3最接近的相似性约为100％的三株菌均为苏云金芽孢杆菌。此外，EzBioCloud网站(www.ezbiocloud.net)对16SrRNA基因的相似性比较结果显示BiotPS3与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)IAM 12077最相似。因此，其系统分类为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。该菌株已于2020年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为20588，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例5

杀虫基因鉴定

设计PCR上游引物(SEQ ID No.4)和下游引物(SEQ ID No.5)，以BiotPS3菌株基因组为模板进行PCR扩增及测序鉴定菌株中所含的杀虫基因。PCR反应体系(20μL)：模板1μL、2×Taq Mix DNA聚合酶10μL、上下游引物各1μL、超纯水补至20μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30次循环；72℃延伸5min。

PCR扩增反应结束后，取3μL PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测到2370bp的条带。经测序所得所的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，该基因翻译后的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

实施例6

杀虫基因的表达

将核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的基因连接在表达载体pET21a上，得到pET-Vip重组表达载体，在大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)中表达的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的蛋白。该蛋白在可溶组分和不可溶组分中均表达；表达约80kDa左右蛋白。

将携带pET-Vip基因的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株以1％的接种量接种于LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀值达到0.5-1.0之间时，加入诱导物50mM IPTG，在150rpm，20℃低温下诱导12h。然后在4℃下，8000rpm离心3min。离心收集菌体，加入50mM Tris·Cl(pH8.0)悬浮；破碎菌体(利用超声波常规完全破碎)，将超声破碎后的菌液在4℃下12,000rpm离心15min；然后收集上清液。进行SDS-PAGE后，蛋白图谱使用Image J2x软件对约80kDa的蛋白条带进行定量。

实施例7

杀虫蛋白对草地贪夜蛾的活性

对实施例6制备的上清液进行梯度稀释测定对草地贪夜蛾的活性，活性测定同实施例3。结果见表1。

表1

实施例	LC<sub>50</sub>(μg/g饲料)	95％置信区间(μg/g饲料)
			实施例2	0.690	0.468至1.123
实施例7	6.566	4.759至11.176

实施例8

BiotPS3对南美番茄潜叶蛾的活性

按照实施例2的方法制备蛋白芽孢混合液，对蛋白进行定量，并对蛋白芽孢混合液进行梯度稀释。

实验于4月下旬开始，5月底结束。

南美番茄潜叶蛾1至2龄幼虫和4龄幼虫采自种植有品种为毛粉番茄的连动温棚，室内用番茄叶片饲养24h后，饥饿4h。

生测方法采用浸叶法：将采集的新鲜番茄叶片完全展开(最长和最宽处约8cm和5cm)，用裁纸刀斜向快速切削叶柄后以吸水脱脂棉，并用保鲜膜包裹吸水脱脂棉，以进行保鲜，然后手持包裹有吸水脱脂棉的叶柄将叶片完全浸渍于上述不同浓度下药液中10s后自然晾干，放入圆形塑料养虫盒(直径9cm，高3cm)中。将饥饿4h的1至2龄幼虫和4龄幼虫分别接入各养虫盒中的番茄叶片上，每种浓度、每个龄期处理20头，重复3次。环境温度为20至25℃，湿度为40％至70％，自然光照。7d后分别调查死、活虫数，计算平均死亡率、校正死亡率，使用PoloPlus软件分析死亡率以及LC₅₀值。结果见表2。

实施例9

对实施例6制备的上清液进行梯度稀释测定对南美番茄潜叶蛾的活性。生测方法及结果分析同实施例8。结果见表2。

表2

菌株	幼虫龄期	LC<sub>50</sub>μg/ml	95％置信限
				BiotPS3	1至2龄	2.914	1.824-4.668
Rosetta(DE3)/pET-Vip	1至2龄	8.649	6.271-12.825
				BiotPS3	4龄	1.961	1.458-2.548
Rosetta(DE3)/pET-Vip	4龄	12.314	8.501-20.034

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种苏云金芽孢杆菌

<130> LHA2060627

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggttacctt gttacgactt 20

<210> 3

<211> 1478

<212> DNA

<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 3

cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaccg 60

gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaaa cataaaaggt ggcttcggct 120

accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaatgg ctcaccaagg 180

caacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca 240

gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca 300

acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag 360

tgccgttcga atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg 420

tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 480

ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca 540

ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa 600

atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gattgggacg 660

ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 720

acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag 780

cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 840

acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga gaaccttacc aggtcttgac 900

atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca 960

tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1020

tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga 1080

ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1140

caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc 1200

tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg 1260

atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga 1320

gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta accttttagg agccagccgc cgaaggtggg 1380

acagatgatt ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgtatc ggaaggtgcg gctggatcac 1440

ctcctttcta aggatgccat acggatataa gaccttcc 1478

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaacaaga ataatactaa attaa 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttacttaata gagacatcgt aaaaa 25

<210> 6

<211> 2370

<212> DNA

<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 6

atgaacaaga ataatactaa attaagcaca agagccttac caagttttat tgattatttt 60

aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaacatgat ttttaaaacg 120

gatacaggtg gtgatctaac cctagacgaa attttaaaga atcagcagtt actaaatgat 180

atttctggta aattggatgg ggtgaatgga agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240

ttaaatacag aattatctaa ggaaatatta aaaattgcaa atgaacaaaa tcaagtttta 300

aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc ttcgggtata tctacctaaa 360

attacctcta tgttgagtga tgtaatgaaa caaaattatg cgctaagtct gcaaatagaa 420

tacttaagta aacaattgca agagatttct gataagttgg atattattaa tgtaaatgta 480

cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgcgtatc aaaggattaa atatgtgaac 540

gaaaaatttg aggaattaac ttttgctaca gaaactagtt caaaagtaaa aaaggatggc 600

tctcctgcag atattcttga tgagttaact gagttaactg aactagcgaa aagtgtaaca 660

aaaaatgatg tggatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720

aataatttat tcgggcgttc agctttaaaa actgcatcgg aattaattac taaagaaaat 780

gtgaaaacaa gtggcagtga ggtcggaaat gtttataact tcttaattgt attaacagct 840

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attgattata cttctattat gaatgaacat ttaaataagg aaaaagagga atttagagta 960

aacatcctcc ctacactttc taatactttt tctaatccta attatgcaaa agttaaagga 1020

agtgatgaag atgcaaagat gattgtggaa gctaaaccag gacatgcatt gattgggttt 1080

gaaattagta atgattcaat tacagtatta aaagtatatg aggctaagct aaaacaaaat 1140

tatcaagtcg ataaggattc cttatcggaa gttatttatg gtgatatgga taaattattg 1200

tgcccagatc aatctgaaca aatctattat acaaataaca tagtatttcc aaatgaatat 1260

gtaattacta aaattgattt cactaaaaaa atgaaaactt taagatatga ggtaacagcg 1320

aatttttatg attcttctac aggagaaatt gacttaaata agaaaaaagt agaatcaagt 1380

gaagcggagt atagaacgtt aagtgctaat gatgatgggg tgtatatgcc gttaggtgtc 1440

atcagtgaaa catttttgac tccgattaat gggtttggcc tccaagctga tgaaaattca 1500

agattaatta ctttaacatg taaatcatat ttaagagaac tactgctagc aacagactta 1560

agcaataaag aaactaaatt gatcgtcccg ccaagtggtt ttattagcaa tattgtagag 1620

aacgggtcca tagaagagga caatttagag ccgtggaaag caaataataa gaatgcgtat 1680

gtagatcata caggcggagt gaatggaact aaagctttat atgttcataa ggacggagga 1740

atttcacaat ttattggaga taagttaaaa ccgaaaactg agtatgtaat ccaatatact 1800

gttaaaggaa aaccttctat tcatttaaaa gatgaaaata ctggatatat tcattatgaa 1860

gatacaaata ataatttaga agattatcaa actattaata aacgttttac tacaggaact 1920

gatttaaagg gagtgtattt aattttaaaa agtcaaaatg gagatgaagc ttggggagat 1980

aactttatta ttttggaaat tagtccttct gaaaagttat taagtccaga attaattaat 2040

acaaataatt ggacgagtac gggatcaact aatattagcg gtaatacact cactctttat 2100

cagggaggac gagggattct aaaacaaaac cttcaattag atagtttttc aacttataga 2160

gtgtattttt ctgtgtccgg agatgctaat gtaaggatta gaaattctag ggaagtgtta 2220

tttgaaaaaa gatatatgag cggtgctaaa gatgtttctg aaatgttcac tacaaaattt 2280

gagaaagata acttttatat agagctttct caagggaata atttatatgg tggtcctatt 2340

gtacattttt acgatgtctc tattaagtaa 2370

<210> 7

<211> 789

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 7

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe

1 5 10 15

Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp

20 25 30

Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu

35 40 45

Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys

50 55 60

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn

65 70 75 80

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln

85 90 95

Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr

100 105 110

Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val

115 120 125

Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

130 135 140

Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val

145 150 155 160

Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile

165 170 175

Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly

225 230 235 240

Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile

245 250 255

Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr

260 265 270

Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr

275 280 285

Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr

290 295 300

Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val

305 310 315 320

Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala

325 330 335

Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys

340 345 350

Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr

355 360 365

Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp

370 375 380

Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu

385 390 395 400

Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe

405 410 415

Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys

420 425 430

Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly

435 440 445

Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr

450 455 460

Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val

465 470 475 480

Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala

485 490 495

Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg

500 505 510

Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile

515 520 525

Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile

530 535 540

Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr

545 550 555 560

Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His

565 570 575

Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys

580 585 590

Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His

595 600 605

Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn

610 615 620

Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr

625 630 635 640

Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu

645 650 655

Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys

660 665 670

Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly

675 680 685

Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg

690 695 700

Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg

705 710 715 720

Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser

725 730 735

Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val

740 745 750

Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu

755 760 765

Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr

770 775 780

Asp Val Ser Ile Lys

785

Claims (7)

1.一种苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20588。

2.一种对权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌进行遗传改良后得到的工程菌。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌通过向如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌转入功能基因得到。

4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述功能基因为用于防治为害植物害虫的基因、用于防治为害植物病原微生物的基因和增强所述苏云金芽孢杆菌防治为害植物害虫效果的基因中的至少一种。

5.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌或如权利要求2至4中任意一项所述的工程菌。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为悬浮剂、油悬剂、粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂中的至少一种。

7.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌、如权利要求2至4中任意一项所述的工程菌和如权利要求5或6所述的组合物中的至少一种在用于防治草地贪夜蛾中的应用。

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