CN117965394A - 一种用于防治草地贪夜蛾和番茄潜叶蛾的苏云金芽孢杆菌 - Google Patents
一种用于防治草地贪夜蛾和番茄潜叶蛾的苏云金芽孢杆菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于防治草地贪夜蛾和番茄潜叶蛾的苏云金芽孢杆菌，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29548，其对番茄潜叶蛾和草地贪夜蛾均具有杀虫活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治领域，特别涉及对有害昆虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株。
背景技术
南美番茄潜叶蛾（Tuta absoluta），又名番茄潜叶蛾，属鳞翅目（Lepidoptera）麦蛾科（Gelechiidae），原发南美洲，主要以幼虫潜食番茄的叶肉，亦可蛀食果实、顶梢，以及嫩芽、嫩茎和侧枝。
草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的幼虫及成虫均能对玉米等多种主要经济作物造成危害。
筛选高毒力苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）菌株资源可以为实现南美番茄潜叶蛾或草地贪夜蛾的高效、绿色、持续防控提供一条有效的途径。
发明内容
本发明之一提供了一种苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 29548。
对本发明的菌株遗传改良后得到的工程菌可以赋予其更优和/或更多的性能，例如可以结合菌株自身的特性，根据实际应用增加和/或拓宽其杀虫和/或抗虫的性能，或使其兼具抗菌的性能。即通过对本发明的菌株遗传改良，使其兼具如上性能中的至少一种。由于该工程菌株以本发明的苏云金芽孢杆菌为改造对象，即向其中转入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，遗传改良后的菌株仍然为苏云金芽孢杆菌。
因此，本发明之二提供了一种对本发明之一所述的苏云金芽孢杆菌进行遗传改良后得到的工程菌。例如，所述遗传改良后的工程菌可以为转入携带有功能基因的质粒后所得到的工程菌株，也可以为将功能基因重组到野生菌株的基因组中得到的工程菌株。
因此，在一个具体实施方式中，所述工程菌通过向如本发明之一所述的苏云金芽孢杆菌转入功能基因得到。
在一个具体实施方式中，所述功能基因为用于防治为害植物害虫的基因、用于防治为害植物病原微生物的基因和增强所述苏云金芽孢杆菌防治为害植物害虫效果的基因中的至少一种。
虽然转基因倍受部分群体质疑，然而将苏云金芽孢杆菌进行遗传改良后得到的工程菌并不直接供人类或动物食用。而且在将其投放市场进行商业化之前，需要首先通过国家有关部门的安全性评价，以避免产生安全性问题。根据工程菌的安全性结论以及国家有关部门的批准，然后对其合理使用。
本发明之三提供了一种组合物，所述组合物包含如本发明之一所述的苏云金芽孢杆菌或如本发明之二所述的工程菌。
在一个具体实施方式中，所述组合物的剂型为悬浮剂、粉剂和颗粒剂中的一种。
在一个具体实施方式中，所述组合物的剂型为为油悬剂或可湿性粉剂。
本发明之四提供了如本发明之一所述的苏云金芽孢杆菌、如本发明之二所述的工程菌和如本发明之三所述的组合物中的至少一种在用于防治南美番茄潜叶蛾和/或草地贪夜蛾中的应用。
在本发明中没有特殊说明的情况下，本发明中的术语均属于现有技术中所指的通用术语。
菌株保藏：本发明筛选的微生物BiotB53菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 29548，保藏日期为2024年01月08日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。
附图说明
图1显示了BiotB53菌株16S的系统发育树。
图2显示了BiotB53菌株及对照菌株对试虫的杀虫活性。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做以下详细说明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
液体LB培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl10.0 g/L，121°C灭菌20 min。
固体LB培养基：LB液体培养基加琼脂15 g/L，121°C灭菌20 min。
牛肉膏蛋白胨培养基：0.3wt%牛肉膏，0.5wt%蛋白胨，pH 7.2，121°C灭菌20 min。
实施例1：菌株的分离与形态学鉴定。
使用LB固体培养基对采集的土样进行芽孢杆菌筛选与分离。首先将土样在80°C下烘干5小时，将烘干的土样加入50 mL离心管，加入灭菌水15mL，放入粒径为3 mm玻璃珠10颗左右，斡旋震荡混匀，并进行梯度稀释，然后将系列稀释的样品置于80°C的水浴锅中20分钟，在无菌条件下取100微升的不同梯度下的稀释液涂布于LB固体平板上，并于30°C培养48小时，对菌落形态为无粘液、湿润、厚实且菌落外沿稍有扩散而不很整齐的菌落进行纯化，然后保藏纯化出的单菌落，以备用于后续的菌种鉴定和生物活性分析。
对纯化的单菌落在30°C条件下LB培养，不同时间取样镜检观察菌落形态特征、晶体特征等。在LB培养基上培养不同阶段观察结果如下，营养体：呈杆状，两端钝圆，大小约1.0×0.5 μm至1.5×0.5 μm；单个或两个以上呈链状存在。芽孢：椭圆形，大小约1.0×0.5μm至1.3×0.5 μm，为休眠体；对高温或者干燥等不良环境有较强的抵抗力。伴胞晶体：球形、菱形和方形等。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠等编著，科学出版社.2001年）中描述的芽孢杆菌形态特征基本一致，因此，将具有这种形态菌落的菌株初步鉴定为苏云金芽孢杆菌。
对分离的菌株进行编号。
实施例2：Bt蛋白芽孢混合液制备及SDS-PAGE分析。
取400 μL活化的Bt菌液（每个编号下的菌株）均匀地涂布于1/2 LB固体培养基上，在30°C恒温条件下培养至50%以上菌体裂解时，将全部菌体刮到50 mL离心管中，加适量预冷的超纯水充分洗涤两次，每次8000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀最后加入4 mL预冷的50 mMNa2CO3（pH 10.0）溶解，反复吹打混匀得蛋白芽孢混合液。
取上述蛋白芽孢混合液，加入1/5体积预冷的0.5M NaOH溶液，室温反应5 min，随后加入5×上样缓冲液，混匀，煮沸5 min，12000 r/min离心3 min，取10 μL上清液进行SDS-PAGE电泳分析，电泳方法参照萨姆布鲁克和拉塞尔（2002）的方法进行。蛋白图谱使用ImageJ2x软件对60至130 kDa蛋白条带（测定番茄潜叶蛾活性时使用该定量结果）或60蛋白条带（测定草地贪夜蛾活性时使用该定量结果）进行定量。
对比例1：HD73-芽孢液制备及SDS-PAGE分析。
苏云金芽孢杆菌HD73-为无晶体突变菌株。
将HD73-菌株采用实施例2相同的操作，制备HD73-芽孢液，并对芽孢液中的60至130 kDa蛋白条带进行定量。
实施例3：番茄潜叶蛾活性菌株的筛选。
供试番茄潜叶蛾（Tuta absoluta）由中国农业科学院植物保护研究所提供，用番茄叶片饲喂。
用已经定量的实施例2制备的待测蛋白芽孢混合液进行杀虫活性初筛，具体操作如下：将实施例2制备且已经定量的BiotB53菌株的待测蛋白芽孢混合液加入到6cm的培养皿中，然后加入100 μL 1wt%果蔬洗洁精，混合均匀，将大小相近的番茄叶片（长度5 cm，宽3cm）正反面均浸泡到待测蛋白芽孢混合液中各30 s，然后将番茄叶片转移到新的培养皿中，待番茄叶片自然晾干；将晾干的番茄叶片转移至垫有滤纸的9 cm培养皿中，并接入15头大小一致的番茄潜叶蛾1龄幼虫到叶片上，接好幼虫后用纸巾铺盖并用内置的培养皿盖盖好，以防止幼虫逃逸。每个处理重复3 次。置于温度（25±1）°C，RH（60±5）%，光照周期16L﹕8D的养虫室中。
同时，以同样的操作，利用对比例1制备且已经定量的HD73-芽孢液进行番茄潜叶蛾的杀虫活性测定作为阴性对照。
分别调查2 d后死、活虫数，计算平均死亡率。
结果表明BiotB53对番茄潜叶蛾有非常好的杀虫活性。
实施例4：草地贪夜蛾活性菌株的筛选。
供试草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）由中国农业科学院植物保护研究所提供。
草地贪夜蛾人工饲料配方：玉米粉200 g，黄豆粉100 g，酵母粉90 g，蔗糖50 g，琼脂15 g，山梨酸1.8 g，对羟基苯甲酸甲酯（尼泊金）1.8 g，水1000 ml。
用已经定量的实施例2制备的待测样品的蛋白芽孢混合液进行杀虫活性初筛，具体操作如下：称取15 g草地贪夜蛾人工饲料置于灭菌培养皿中，加入3mL实施例2制备且已经定量的BiotB53菌株的待测蛋白芽孢混合液，充分搅拌均匀，于室温放置；待饲料中多余的水分蒸发后，将全部饲料均匀的分装于24孔板中；随后用毛笔挑取拉丝、个体活跃且大小一致的初孵幼虫接于24孔板内，每孔一头，接好幼虫后用内置吹塑纸板的顶盖盖好，再用橡皮筋固定扎紧，防止幼虫逃逸。将24孔板置于温度（27±1）°C，RH（65±5）%，光照周期16L﹕8D的养虫室中。每处理3次重复，每个重复24头。每天检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结。
同时，以同样的操作，利用对比例1制备且已经定量的HD73-芽孢液进行草地贪夜蛾的杀虫活性测定作为阴性对照。
分别调查7 d后死、活虫数，计算平均死亡率。
结果表明BiotB53对草地贪夜蛾有非常好的杀虫活性。
实施例5：BiotB53菌株的聚类分析。
基因16S rRNA是细菌的进化标尺，对一个未知的种，一般首先考察其16S rRNA基因的系统发育关系，因此，对BiotB53进行16S rRNA基因测序并构建系统发育树。
参照Song F P, et al.（Identification of cry1I-type genes from Bacillusthuringiensis strains and characterization ofa novel cry1I-type gene[J].Applied and environmental microbiology. 2003,69(9), 5207-5211.）中所述的方法提取Bt菌株BiotB53的基因组DNA。用细菌16S rDNA通用引物：BiotB53F1（SEQ ID No. 1）和BiotB53R1（SEQ ID No. 2）扩增菌株BiotB53的16S rDNA序列。50 μL的反应体系包括：基因组DNA（50 ng/μL） 1 μL，BiotB53F1（20 μM）1 μL，BiotB53R1（20 μM）1 μL，PrimeSTAR MaxPremix（2×）25 μL，ddH2O补充至50 μL。PCR扩增条件：94°C 5 min预变性，94°C 30 sec，52°C 30 sec，72°C 90 sec，共30个循环，72°C 5 min终延伸。得到的1400 bp左右片段经试Axygen胶回收试剂盒（爱思进生物技术（杭州）有限公司）纯化进行TA克隆，克隆到pMD-18T（Takara）上，转化大肠杆菌（Escherichia coli）并进行常规的培养，得到转化子，经过对转化子的菌液PCR验证正确后，送北京六合华大基因科技有限公司测序，所得序列为1425 bp（详见SEQ ID No. 3所示）。所测序列提交NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行同源性比较，比较结果显示BiotB53与苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）LC756465.1（公布的16SrDNA基因片段长度为1479 bp）相似性为100%。基于16S rDNA 的序列采用MEGA6.0构建系统发育树，结果见图1。根据图1的系统发育树可知，其与苏云金芽孢杆菌菌株亲缘关系较近。因此，BiotB53菌株的系统分类为苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）。该菌株已于2024年01月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 29548，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例6：杀虫基因的克隆与表达。
设计PCR上游引物BiotB53F2（SEQ ID No. 4）和下游引物BiotB53R2（SEQ ID No.5），以BiotB53菌株基因组为模板进行PCR扩增及测序鉴定菌株中所含的杀虫基因。PCR扩增反应结束后，取3 μL PCR 产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，检测到1.9 kb的条带。经测序所得基因为cry2Ab35。
将cry2Ab35基因连接在表达载体pSTK上，得到pSTK-cry2Ab35重组表达载体， 将pSTK-cry2Ab35转化Bt无晶体突变株HD73-，得到HD73/pSTK-cry2Ab35，以用于表达Cry2Ab35蛋白。
取400 μL活化的HD73/pSTK-cry2Ab35均匀地涂布于1/2 LB固体培养基上，在30°C恒温条件下培养至50%以上菌体裂解时，将全部菌体刮到50 mL离心管中，加适量预冷的超纯水充分洗涤两次，每次8000 r/min离心10min，弃上清，沉淀最后加入4 mL 预冷的50mMNa2CO3（pH 11.5）溶解，反复吹打混匀得蛋白芽孢混合液。
取上述蛋白芽孢混合液，加入1/5体积预冷的 0.5M NaOH溶液，室温反应5 min，随后加入5×上样缓冲液，混匀，煮沸5 min，12000 r/min离心3 min，取10 μL上清液进行SDS-PAGE电泳分析，电泳方法参照萨姆布鲁克和拉塞尔（2002）的方法进行。蛋白图谱使用ImageJ2x软件对60 kDa蛋白条带进行定量。
对比例2：BiotPS3蛋白芽孢混合液制备及SDS-PAGE分析。
将BiotPS3菌株采用实施例2相同的操作，制备蛋白芽孢混合液，并对蛋白芽孢混合液中的60至130 kDa蛋白条带进行定量。
实施例7：菌株对番茄潜叶蛾的杀虫活性分析。
将实施例2制备且已经定量的BiotB53菌株的蛋白芽孢混合液在6cm的培养皿中进行梯度稀释，并在各稀释液中加入100 μL 1wt%果蔬洗洁精，混合均匀，将大小相近的番茄叶片（长度5 cm，宽3 cm）正反面均浸泡到蛋白芽孢混合液中各30 s，将浸液的番茄叶片转移到新的培养皿中，待番茄叶片自然晾干；将晾干的番茄叶片转移至垫有滤纸的9 cm培养皿中，并接入15头大小一致的番茄潜叶蛾1龄幼虫到叶片上，接好幼虫后用纸巾铺盖并用内置的培养皿盖盖好，以防止幼虫逃逸。每个处理重复3 次。置于温度（25±1）°C，RH（60±5）%，光照周期16L﹕8D 的养虫室中。
同时，以同样的操作，利用对比例1制备且已经定量的HD73-菌株的芽孢液进行番茄潜叶蛾的杀虫活性测定；利用对比例2制备且已经定量的BiotPS3菌株的蛋白芽孢混合液进行番茄潜叶蛾的杀虫活性测定。
分别调查2 d后死、活虫数，计算平均死亡率，并基于HD73-的测定结果计算校正死亡率，使用Polo Plus软件分析死亡率以及LC50值，结果见图2。
实施例8：草地贪夜蛾活性菌株的筛选。
称取15 g草地贪夜蛾人工饲料置于灭菌培养皿中，加入3mL已经定量且梯度稀释的实施例2制备的待测样品的蛋白芽孢混合液，充分搅拌均匀，于室温放置；待饲料中多余的水分蒸发后，将全部饲料均匀的分装于24孔板中；随后用毛笔挑取拉丝、个体活跃且大小一致的初孵幼虫接于24孔板内，每孔一头，接好幼虫后用内置吹塑纸板的顶盖盖好，再用橡皮筋固定扎紧，防止幼虫逃逸。将24孔板置于温度（27±1）°C，RH（65±5）%，光照周期16L﹕8D的养虫室中。每处理3次重复，每个重复24头。每天检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结。
同时，以同样的操作，利用实施例6制备且已经定量的HD73/pSTK-cry2Ab35菌株的蛋白芽孢混合液进行草地贪夜蛾的杀虫活性测定；利用对比例1制备且已经定量的HD73-菌株的芽孢液进行草地贪夜蛾的杀虫活性测定。
分别调查7 d后死、活虫数，计算平均死亡率，并基于HD73-的测定结果计算校正死亡率，使用PoloPlus软件分析致死中浓度LC50值，结果见图2。
根据图2的结果可知，对于番茄潜叶蛾，BiotB53的杀虫活性是BiotPS3的3.21倍；对于草地贪夜蛾，BiotB53的杀虫活性是HD73/pSTK-cry2Ab35的16.3倍。
Claims (8)
1.一种苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 29548。
2.一种对权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌进行遗传改良后得到的工程菌。
3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌通过向如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌转入功能基因得到。
4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述功能基因为用于防治为害植物害虫的基因、用于防治为害植物病原微生物的基因和增强所述苏云金芽孢杆菌防治为害植物害虫效果的基因中的至少一种。
5.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌或如权利要求2至4中任意一项所述的工程菌。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为悬浮剂、粉剂和颗粒剂中的一种。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为油悬剂或可湿性粉剂。
8.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌、如权利要求2至4中任意一项所述的工程菌和如权利要求5至7中任意一项所述的组合物中的至少一种在用于防治南美番茄潜叶蛾和/或草地贪夜蛾中的应用。
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