CN104745505A - 一株苏云金孢杆菌及其在产氨肽酶中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株苏云金孢杆菌及其在产氨肽酶中的应用。本发明从深海沉积物中分离得到产氨肽酶的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis SWJS 52）。该菌株于2014年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9696。该菌株产氨肽酶的最适反应温度为65℃，温度不高于55℃保温30min活性基本不变；在pH7–9.5的范围内有较好的稳定性。该酶对N端为亮氨酸的肽键的水解能力最强，对N端为亮氨酸为甲硫氨酸的肽键也有一定的水解能力。该氨肽酶可应用于食品、饲料等行业以提高蛋白质的利用率、蛋白酶解液脱苦、制备生物活性肽等。

Description

一株苏云金孢杆菌及其在产氨肽酶中的应用
技术领域
本发明涉及一株深海来源的氨肽酶生产菌株，具体涉及苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis SWJS 52）及其在液体发酵产氨肽酶的应用。
背景技术
蛋白酶根据其作用方式可分为内切蛋白酶和外切蛋白酶。内切蛋白酶主要从肽链的内部切割肽键，生成小分子的多肽，外切蛋白酶分为氨肽酶和羧肽酶，分别从肽链的N端或C端顺序水解氨基酸、使氨基酸逐个释放出来。目前大部分常用商业蛋白酶，如木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶等都是内切蛋白酶，外切蛋白酶的产品相对较少，如风味蛋白酶则是氨肽酶与内切蛋白酶的复合物。蛋白酶酶解能在一定程度上改善原料蛋白的营养特性和功能特性，已成为蛋白质资源高值化利用的重要途径。但内切蛋白酶在蛋白质水解的应用中存在两个主要问题，一是对植物蛋白的酶解效率不高，二是酶解液苦味重。这两个问题理论上可以由外内蛋白酶来解决。
   氨肽酶广泛存在于动物组织及植物中，研究者们陆续研究了白对虾肌肉、鲤鱼骨骼肌、日本薏仁粉、日本雪松花粉、牛骨骼肌、杏鲍菇、烟草、大豆子叶等来源的氨肽酶，但从动植物组织中提取分离氨肽酶存在提取工艺复杂、提取效率低等问题。氨肽酶的另外一个重要来源就是微生物，目前已报道的产氨肽酶的菌株主要是米曲霉、红曲霉、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌等。不同微生物所产氨肽酶的性质、产量都有较大的区别。本发明从深海沉积物中分离得到一株产氨肽酶的苏云金芽孢杆菌，并对其氨肽酶性质进行了初步的研究，旨在为氨肽酶产品的开发提供新的生产菌种及理论基础。
发明内容
本发明的目的是提供一株苏云金孢杆菌及其在产氨肽酶中的应用。
本发明的一株苏云金孢杆菌分离自南海深海沉积物样品，采用酪蛋白平板初筛和摇瓶发酵氨肽酶活性测定复筛得到，分类命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis SWJS 52）。该菌株已于2014年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 9696。
对保藏编号为CGMCC No. 9696菌株的16S rDNA基因进行PCR扩增与序列测定，测得16S rDNA基因片段长度为1351bp，具体序列见序列表。该基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行分析得知，该菌株与数据库中Bacillus thuringiensis不同菌株的16S rDNA序列性具有99%的相似性，与Bacillus thuringiensis strain 5a相似性最高，同源性达99%，鉴定该菌株为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis SWJS 52）。
本发明对保藏编号为CGMCC No.9696菌株液体发酵产氨肽酶的最适反应温度、最适反应pH、温度稳定性及pH稳定性、底物特异性进行了研究。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：本发明筛选得到一株深海来源的产氨肽酶的菌株苏云金芽孢杆菌SWJS 52，其氨肽酶反应条件温和，有较强的底物特异性。该菌株可成为新型氨肽酶资源的生产菌种或提供新的氨肽酶编码基因，具有重要的后续开发及工业应用价值。
附图说明
图1为苏云金芽孢杆菌SWJS 52产氨肽酶的最适反应温度曲线。
图2为温度对苏云金芽孢杆菌SWJS 52产氨肽酶稳定性的影响曲线。
图3为苏云金芽孢杆菌SWJS 52产氨肽酶的最适反应pH曲线。
图4为pH对苏云金芽孢杆菌SWJS 52产氨肽酶稳定性的影响曲线。
图5为苏云金芽孢杆菌SWJS 52产氨肽酶的底物特异性比较图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施和包含不限于此，需指出的是，以下若有为特别详细说明之处，均是本领域技术人员可参照现有技术实现的。
富集及种子培养基：蛋白胨5g,酵母粉1g，人工海水1L,pH 7.4。
酪蛋白培养基：酪蛋白10g，牛肉浸膏3g，磷酸二氢钾2g,琼脂粉15g，人工海水1L,pH 7.2左右。
发酵培养基：甘油3g，葡萄糖5g, 酵母粉 10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，硫酸铵1g，氯化钙1g，海盐10g， pH7.2左右。
产氨肽酶的CGMCC No. 9696的分离筛选
富集培养：称取2g深海海泥样品样于50mL灭菌离心管中，加15mL无菌蒸馏水，充分混合，在摇床中振摇30min，静置后取上清液1mL于富集培养中（25 mL /250mL），37℃，120rpm，培养48h。
初筛：取富集后的培养液1mL加入9mL无菌生理水中，用倍比法稀释到不同梯度（10-1-10-7）。选取10-4，10-5，10-6，10-7稀释度，各吸取0.1mL，加入已凝固的酪蛋白培养基中，涂布均匀。倒置放在37℃培养箱中培养24-48h。
分离纯化：挑选上述酪蛋白平板中有明显水解圈的菌落，在新的酪蛋白平板上连续划线分离三次以上，直到为纯培养物为止。挑选水解圈较大的单菌落保存于试管斜面上，保藏于4℃冰箱。
摇瓶发酵复筛：将上述保藏的菌株接种于种子培养基中，37℃，150rpm,活化12h,以2%接种量接种于发酵培养基中，37℃，150rpm,培养48h。发酵液在4℃，10000rpm离心10min,取上清液即为粗酶液。采用LNA法测定氨肽酶活力，复筛出液体发酵氨肽酶产量高的菌株。
氨肽酶活性测定：将粗酶液用pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液稀释到合适的浓度，取80μL样品稀释液加入96孔板中，加20μL L-亮氨酸对硝基苯胺（L-leu-pNA），在40℃准确反应10 min后，加入100μL无水乙醇终止反应，测定405nm下的吸光值。以不同浓度对硝基苯胺在405nm下的吸光值绘制标准曲线。40℃每分钟酶解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1μmol对硝基苯胺所需的酶量即为一个酶活单位。
产蛋白酶的CGMCC No. 9696的鉴定
     将活化的CGMCC No. 9696接种于LB培养基中，37℃，150rpm培养10h，取1.5mL新鲜菌液4℃，10000rpm离心5min，收集菌体于2mL离心管中，采用DNA提取试剂盒提取DNA。电泳检测后采用通用引物进行PCR（正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。
扩增总反应体系为（20μL）:模板基因DNA 0.5μL；上下游引物(20μmol/l)各1.0μL；Taq DNA聚合酶0.2μL；10×buffer 2.0μL；4种脱氧核苷酸混合物dNTP(各2.5 mmol/L)1.6μL，25 mmol/L MgCl2 1.6μL，双蒸水(ddH2O)12.1μL。PCR扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1.5 min；72℃ 10 min；10℃，共30个循环。PCR产物纯化后完成测定的16S rRNA基因基因片段长度为1351bp，与Bacillus thuringiensis strain 5a相似性最高，同源性达99%，与其它 Bacillus thuringiensis不同菌株的16S rDNA序列性达99%，具体序列见序列表，鉴定CGMCC No.9696为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis  SWJS 52）。
苏云金芽孢杆菌CGMCC No. 9696所产氨肽酶的酶学性质研究
最适反应温度：粗酶液通过超滤浓缩、凝胶柱层析后得到电泳纯酶，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃测定氨肽酶的活力，以最高活力为100%，以其它温度下氨肽酶的活力以最高酶活的百分比表示，结果见图1。氨肽酶在65℃下活力最高，在50 - 65℃有较高的活力。温度低于25℃或高于75℃基本无活力。
热稳定性的研究：将氨肽酶在25 - 75℃范围内保温30min后，在65℃下测定残留的氨肽酶活力，以不保温时的酶活为100%，结果见图2。温度不高于55℃，保温30min后活力基本不变，60保温30min剩余75%左右的活力，温度高于65℃则较快失活。
最适pH：用pH 6.0-10.0的缓冲液稀释酶液，在65℃下分别测定氨肽酶的活力，结果见图3。该氨肽酶的最适反应pH为9.5，在pH7.5-9.5范围内有较高的活力，pH超出此范围则活力低于最高酶活50%。
pH稳定性：将氨肽酶在不同的pH缓冲溶液（pH 3.0-10.0）放置（4℃）不同的时间，然后在pH9.5、65℃下测定氨肽酶活力，以放置0h时的活力为100%，结果见图4。该氨肽酶在pH 6.0-9.0范围内放置48h后仍能保持80%以上的活力。最适pH 为9.5，但在pH 9.0的缓冲溶液中酶活下降了20%，在pH 6.0-8.0的缓冲溶液中酶活性先下降，超过6h后活性又恢复。pH 低于5.0时氨肽酶迅速下降至20%左右。
    底物特异性：在相同的条件下，分别测定不同的氨基酸-对硝基苯胺（Leu-pNA、Phe-pNA、Ala-pNA、Arg-pNA、Glu-pNA、Lys-pNA、Pro-pNA和Met-pNA）作为底物时氨肽酶的活力，以Leu-pNA作为底物时的活力为100%。 如图5可知氨肽酶对Leu-pNA和Met-pNA有较强的底物特异性，氨肽酶活力较高，对Ala-pNA及Pro-pNA有较弱的特异性，对其他底物的则无特异性。
序列表
TCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACaAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTCTTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAAC

Claims (2)

1.一株苏云金孢杆菌（Bacillus thuringiensis SWJS 52），该菌株于2014年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9696。
2.权利要求1所述的苏云金孢杆菌（Bacillus thuringiensis SWJS 52）在液体发酵产氨肽酶中的应用。
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