CN115141786B - 一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用 - Google Patents

一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115141786B
CN115141786B CN202211034518.8A CN202211034518A CN115141786B CN 115141786 B CN115141786 B CN 115141786B CN 202211034518 A CN202211034518 A CN 202211034518A CN 115141786 B CN115141786 B CN 115141786B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus thuringiensis
root
bat
nematodes
control
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211034518.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115141786A (zh
Inventor
李晶
刘锦霞
李娜
丁品
武建荣
张建军
付麟雲
杨海兴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Biology of Gansu Academy of Sciences
Original Assignee
Institute of Biology of Gansu Academy of Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Biology of Gansu Academy of Sciences filed Critical Institute of Biology of Gansu Academy of Sciences
Priority to CN202211034518.8A priority Critical patent/CN115141786B/zh
Publication of CN115141786A publication Critical patent/CN115141786A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115141786B publication Critical patent/CN115141786B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A01N63/23—B. thuringiensis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P5/00—Nematocides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P7/00—Arthropodicides
    • A01P7/04—Insecticides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/075—Bacillus thuringiensis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明提供了一株苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis，于2022年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24483。该菌株耐旱、耐盐碱、在植物根茎叶及其根围土壤能稳定定殖，对部分植物害虫尤其地下虫害有较好防治效果。

Description

一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用。
背景技术
植物害虫尤其农作物害虫对于粮食安全、农产品产量和品质是重要的威胁之一。目前对植物害虫的防控技术主要有化学农药防控、物理防控、农业技术防控和生物防控等，每一种防控技术都各有优势有存在不足，而植物害虫生物防治因具有环境安全风险较小、防治作用较持久、易于与其他植物保护技术相协调并能节约能源等优点，一直被公认为是害虫综合治理中一项环境友好的、最节约的方法。该方法既是农业可持续发展与农产品安全生产的保障，又符合保护生物多样性、保护生态安全的需要。进入21世纪以来，随着全球对环境保护和农产品安全的愈加关注，生物防治技术其在植物保护中的地位与作用愈加突显，其在支撑现代农业可持续发展，保障农产品质量安全，减少环境污染，保护生物多样性与生态安全，维护公众健康等方面均发挥着其他害虫防治方法不可替代的关键作用。在虫害防治中生物防治技术主要有植物发酵液活性物质、生防微生物、昆虫天敌等，其中生防微生物被认为是更生态环保的防控技术物质，如球孢白僵菌、绿僵菌、蜡蚧轮枝菌和苏云金芽孢杆菌等。
苏云金芽孢杆菌，简称Bt，是一种自然界广泛存在的杆状细菌，其区别于其他芽孢杆菌的明显特征是在芽孢生长期能够产生伴孢晶体，这些伴胞体对许多种类的害虫有杀虫活性，除了伴孢晶体，苏云金芽孢杆菌还会产生杀虫蛋白、苏云金素、增效蛋白、几丁质酶、溶细胞素等具有杀虫活性的多种物质，不同的Bt菌株产生的杀虫活性物质的种类不同，杀虫谱不同，活性也不同，而且苏云金芽孢杆菌的杀虫特异性比较高，一般情况下某一个菌株只对某一类害虫具有较高杀虫活性。因此针对防控目标优选高活性、强抗逆和在土壤及寄主中高定殖的新菌种，是提高植物害虫防控效果的有效措施。本发明主要针对植物害虫尤其地下虫害从生境土壤优选高活性目标生防菌株，为其高效生态防控提供技术和物质支撑。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种苏云金芽孢杆菌，该苏云金芽孢杆菌耐旱、耐盐碱、在土壤和植株中定殖能力强，发酵液活性物质富含多种杀虫抑菌化合物和植物生长调节物质。
上述苏云金芽孢杆菌是2022年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis，保藏编号为CGMCC No.24483。
所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis从甘肃榆中县健康甘蓝根际土壤中通过富集、纯化分离、复壮和拮抗活性筛选，得到具备高活性作用的芽孢杆菌属菌株BAT-1807，经过形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA分子鉴定最终确定该菌株为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis。
所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis在分离纯化过程中采用的分离纯化培养基配方为：葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，NaCl 8 g，酵母膏6 g MnSO4·H2O 0.008g，琼脂粉适量,蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0。该分离纯化培养基促进苏云金芽孢杆菌富集，提高了其分离纯化效率。
所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis耐旱，能耐受模拟环境的重度干旱，即PGE6000浓度为150～270g/L均能生长繁殖。
所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis为耐盐碱菌株，在NaCL浓度10%～20%或pH9～pH13的中度以上模拟盐、碱环境下均能生长繁殖。
所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis在植物根茎叶及其根围土壤能稳定定殖，定殖菌数在103cfu/ml～105cfu/ml ，其中在植物根和根围土壤的定殖能力强，根围土壤中定殖菌数30天内保持105cfu/ml以上，根内定殖数20天内保持104cfu/ml以上，在叶和茎内定殖较弱，定殖菌数在103cfu/ml左右。
所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis的发酵液制备时的发酵培养基配方为：牛肉膏8 g，酵母膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨8 g，MnSO4·H2O 0.005g，K2PO4 0.005g，NaCl 5g，蒸馏水容至1000 mL，pH7.0。该发酵培养基促进苏云金芽孢杆菌生长繁殖，提高了其发酵液的含菌量和芽孢量，使其杀虫活性显著提高。
所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis发酵液活性物质种类比较丰富，特有二羟基肉桂酸、高香草酸、氨基丁醛、乙基二甲基吡嗪、甲基脱氧尻霉素、吡啶碱、肽、复合氨基酸、鱼藤酮、碳烯脱氢哌嗪和四氢吡咯等杀虫抑菌化合物，以及单氨基酸群、植物激动素等植物生长调节物质，促进植物健壮，增强植物抗病抗虫能力。
本发明的目的二是提供苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis在植物地下害虫防控中的应用，所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis活菌与发酵液活性物质共同作用，其主要杀虫谱为粘虫 、小菜蛾等鳞翅目害虫，蚜虫等同翅目害虫和根结线虫、根腐线虫等作物线虫。 苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis发酵液10倍以下稀释液对以上靶标害虫的校正累计死亡率为61.64%～92.42% ，其中对线虫和蚜虫毒力强，对粘虫和小菜蛾等鳞翅目害虫毒力相对较弱。
苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis发酵液能有效防控根结线虫、根腐线虫和孢囊线虫，平均防治效果为87%～90%，对鳞翅目害虫小地老虎也有较好作用，平均防治效果为85.38%，与对照药剂均不存在显著性差异（p≥0.05））。
附图说明
图1：苏云金芽孢杆菌BAT-1807菌落形态
图2为本发明苏云金芽孢杆菌BAT-1807耐旱能力；
图3为本发明苏云金芽孢杆菌BAT-1807耐酸碱能力；
图4为本发明苏云金芽孢杆菌BAT-1807耐盐能力；
图5为本发明苏云金芽孢杆菌BAT-1807在黄瓜植株及其根围土壤的定殖能力。
具体实施方式
生防菌株的分离、纯化和分类鉴定
1.1菌株的分离、纯化
1.1.1 主要培养基
NA培养基，LB培养基，均为现有常规配方。
分离纯化培养基配方：葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，NaCl 8 g，酵母膏6 g MnSO4·H2O0.008g，琼脂粉 适量,蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0。
菌株分离纯化
选取榆中县十字花科蔬菜未连作的甘蓝种植地，且所有甘蓝健康未生病。甘蓝苗移栽后60天左右，采用五点法取样。选长势健康一致的甘蓝植株轻轻拔出, 将植株自根茎处剪断,装入无菌袋冷藏保存带回实验室。抖落根上松散的附着土,称取根5g，置于盛有80ml灭菌的0.1%水琼脂的三角瓶中, 20℃,200 rmp/min匀速振荡30 min,得到甘蓝根际土壤悬浮液，静置30分钟。
用移液枪吸取1 mL震荡均匀的菌悬液，置入装有9 mL无菌水的试管中，振荡均匀，进行系列稀释至10-8。选取10-8、10-7、10-6、10-5、10-4和10-2 6个稀释梯度分别在分离纯化培养基平板上进行涂布，每个浓度梯度重复3次，每平板取稀释液200µl。各试验平板于28℃下倒置培养2～3 d，挑取平板上特征相异的单菌落，28℃下继续进行多次划线纯培养，直至平板上菌落形态单一为止。编号，接种于斜面试管中培养、保藏6个月。活化发酵保藏菌，采用40W UV和0.02µg/ml NTG复合诱变处理筛选抑菌活性强、传代稳定的菌株，编号，接种于斜面试管中培养、保藏备用。
高活性菌株筛选
挑取消毒后的根结线虫J2 幼虫放于灭菌的 24 孔中，每孔加入 2 mL 处理液，置25℃培养箱中恒温培养，于72进行观察计数，采用针触法判断线虫死亡情况。将1.1中分离纯化的菌株发酵液为处理，发酵培养基为空白对照。每处理重复 3 次。
死亡率%=死虫数/试验虫数 ×100
表1：高活性菌株筛选结果
Figure 517788DEST_PATH_IMAGE002
注释：表中列出的是拮抗活性最强的前五株1.1.2中分离纯化获得菌；表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
依据表1结果选取拮抗活性最高的菌株BAT-1807做进一步分类鉴定。
高拮抗活性菌株BAT-1807分类鉴定
1.1.4.1形态学鉴定
用接种环挑取新鲜菌株BAT-1807接于NA培养基中，将其放置于28℃恒温培养箱中培养48h后进行观察菌落形态，并在显微镜下观察菌体的形状、芽孢的有无。
1.1.4.2生理生化测定
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对接触酶反应、淀粉水解、MR试验、麦芽糖、乳糖、D-葡萄糖和硝酸盐等生理生化指标进行观测。
1.1.4.3 16S rDNA序列分析
细菌DNA提取采用蛋白酶-SDS法制备，扩增引物:
27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、
1492R: 5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，由上海美吉生物医药科技有限公司完成测序及同源性分析。
1.1.4.4鉴定结果
菌株BAT-1807的菌落圆形，乳白色，表面湿润起皱，中央稍隆起，边缘较整齐（见图1）。革兰氏染色呈阳性，杆状、端生或中生芽孢,有不规则晶体。接触酶反应、葡萄糖发酵、酯酶反应、硝酸盐还原、明胶液化反应、柠檬酸盐利用试验、果糖发酵、甘露醇水解、麦芽糖发酵均为阳性，淀粉水解、VP试验、蛋白酶反应、MR试验、蔗糖发酵和乳糖发酵均为阴性。菌株的 16S rDNA 序列与NCBI数据比对分析和多株苏云金芽孢杆菌菌株归于同一簇群，同源性在99%-100％。综合形态学特征、生理生化特征和 16S rDNA分子鉴定结果，菌株1807为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，终编号BAT-1807。
二、特性及效果试验：
1 苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液制备方法：将菌株BAC-1807的108cfu/ml菌悬液以9%接种量接于发酵培养基中，28±1℃、200转∕分恒温震荡培养48h，即得苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液。
上述发酵培养基配方为牛肉膏8 g、酵母膏10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨8 g、
MnSO4·H2O 0.005g、K2PO4 0.005g、NaCl 5g，蒸馏水定容至1000 mL，pH7.0。
苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液主要活性物质。
采用甲醇（含同位素标记内标混合物）-超声波提取法，提取苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液发酵液活性物质，送上海阿趣生物科技有限公司进行基于LC-MS和GC-TOF-MS非靶标的代谢组学检测分析。结果见表2。
表2: 苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液主要活性物质
Figure 169349DEST_PATH_IMAGE004
Figure 949086DEST_PATH_IMAGE006
Figure 141033DEST_PATH_IMAGE008
Figure 689826DEST_PATH_IMAGE010
表2结果显示，苏云金芽孢杆菌BAT-1807的发酵液活性物质主要有各类氨基酸、蛋白、核酸、糖类、有机杂环类、甾醇、芳香族、黄酮类、生物碱和其它有机化合物。其中N-Methyl-1-deoxynojirimycin; Phytosphingosine; 11-Dehydrocorticosterone;Caffeic acid; 21-Hydroxypregnenolone; 3,4-Dihydroxyhydrocinnamic acid;Daidzein; Dethiobiotin; Gentisic acid; Glycine; Glycyl-glycine; LeukotrieneC4; Methyldopa; Xanthohumol; Harmalol; Hygromycin B; Imidaprilat;Glycylproline; 2,4-Undecadiene-8,10-diynoic acid 2,3-dehydropiperidide;Glycylproline; Glycyltyrosine; Homovanillic acid; 4-Aminobutyraldehyde; 4-Hydroxybenzaldehyde; 5-Ethyl-2,3-dimethylpyrazine; 5-Nitro-2-propoxyaniline;Rotenone;L-Phenylalanine;Acetylcholine; L-Proline; Debrisoquine; Pyrrolidine；L-Norleucine; L-Lysine, L-Histidine; L-Glutamine; L-Glutamic acid; L-Arginine; L-Serine; L-Threonine; L-Tyrosine和N-Methylnicotinium是苏云金芽孢杆菌BAT-1807特有的促健杀虫化合物，有二羟基肉桂酸、氨基丁醛、对羟基苯甲醛、乙基二甲基吡嗪、高香草酸、甲基脱氧尻霉素、吡啶碱、肽、复合氨基酸、鱼藤酮、碳烯脱氢哌嗪和四氢吡咯等杀虫抑菌化合物，抑菌物质能提高杀虫化合物的毒力，还有单氨基酸群、植物激动素是等植物生长调节物质，促进植物健壮，增强植物抗病抗虫能力。
、苏云金芽孢杆菌BAT-1807耐旱能力测定
在灭菌后的 100 mL LB培养基中分别添加经无菌处理过后不同浓度的 PEG6000，使 PEG6000 的终浓度为 0、30、60、90、120、150、180、210、240、270g/L。接入6%苏云金芽孢杆菌BAT-1807种子培养液，在28℃，200 r/min 的条件下震荡培养 48h 后，用分离纯化液体纯培养基调零，读取 700 nm 处的 OD 值。PEG6000 的浓度为 0-60 g/L 代表轻度干旱，90-150g/L 代表中度干旱，大于 150 g/L 代表重度干旱。
图2结果显示，苏云金芽孢杆菌BAT-1807耐旱能力强， PGE6000浓度小于等于270g/L均能生长繁殖，PGE6000浓度越小 ，生长繁殖越好。PGE6000浓度150g/L～270g/L的重度干旱模拟环境下，处理液OD700nm值在0.647～0.114，即表示苏云金芽孢杆菌BAT-1807也能生长繁殖。
、苏云金芽孢杆菌BAT-1807耐盐碱能力测定。
用接种环挑苏云金芽孢杆菌BAT-1807菌落接至分离纯化液体培养基中28℃、180r/min培养24h制成种子液，按6%分别接种到ph7.2含有1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、25%NaCL和PH为3、5、7、9、11、13、14的含5g/L NaCL的NA液体培养基，28℃、180r/min摇床培养48h。用分离纯化液体培养基调零，测各培养液在600nm处的OD值，依此判断苏云金芽孢杆菌BAT-1807的耐盐碱能力。耐盐能力参考刘彩霞的标准：非耐盐菌株，Na Cl 含量小于1.17%；低耐盐菌株，Na Cl 在 1.17～2.93%；中等耐盐菌株，NaCl 浓度在 2.93%～14.63%，高度耐盐菌株：14.63%～30.4%。耐碱能力标准：耐碱微生物，PH值7～9生长，PH＞9.5不能生长；嗜碱微生物，PH值7～9生长；极端嗜碱微生物，最适生长PH值≥10，PH值低于8.9～9则不生长，为专性极端嗜碱微生物；兼性嗜碱微生物，具有能在两种或两种以上不同环境下生存或繁衍后代的能力。
图3结果显示，苏云金芽孢杆菌BAT-1807在PH值5～11能正常生长，小于5，大于11，能生长，但较慢，PH3和PH14时死亡。证明苏云金芽孢杆菌BAT-1807耐受酸碱能力较强，尤其耐碱能力强（PH值9～13）。图4结果显示，苏云金芽孢杆菌BAT-1807在NaCL浓度小于15%时能正常生长，15%～25%也能生长，但较慢，25%NaCL时死亡。证明苏云金芽孢杆菌BAT-1807为高度耐盐菌株。
、苏云金芽孢杆菌BAT-1807的定殖能力测定
菌株BAC-1807在黄瓜根、茎、叶及其根围土壤的定殖能力测定：将苏云金芽孢杆菌BAT-1807的利福平和卡那霉素双标记菌株接种于含300 μg/ mL利福平和卡那霉素 200μg/mL的改良NYDA培养液中, 28±1 ℃、180 r/min振荡培养72 h, 稀释浓度至108 cfu/mL, 以 10.0 mL/株 灌根接种于试验标准的黄瓜植株, 5.0 mL/株喷施于植株表面, 以无菌培养液为对照，共处理500株。接种后1、5、10、15、20、25 d 和30 d 各取1.0 g的根、茎、叶组织及其根围土壤（取紧密附着于根系的土作为根围土）样品。将处理植株根、茎、叶样品各平均分成两份（0.5 g）, 一份表面用70 %酒精擦洗后，于0.1 %升汞中浸泡1.5 ～ 2.0 min, 再用无菌水洗涤5 次, 晾干后剪碎并加入1mL 无菌水磨碎，另一份直接用5mL无菌水分5次各震荡15min,合并震荡液，备用；将根围土（1.0 g）分散于10mL 无菌水中， 200 r/min振荡10min后静置，取上清液稀释成10－1、10－２、10－３、10－４ 。然后分别取上述各样品溶液200 μl均匀涂布于含300 μg/ mL利福平和卡那霉素 200 μg/mL的改良NYDA培养培养基平板上,每个处理样品重复3 次, 28±1 ℃ 恒温培养48ｈ后计数。根据每个处理的平均菌落数量，计算每克鲜叶、根、茎及其根围土壤中所含的菌量（ cfu/g ）。
图5显示，菌株BAS-1692在黄瓜根、茎、叶及其根围土壤的都可以稳定定殖，定殖菌数在103cfu/ml～105cfu/ml ，其中在植物根和根围土壤的定殖能力强，根围土壤中定殖菌数30天内保持105cfu/ml以上，根内定殖数20天内保持104cfu/ml以上，在叶和茎内定殖相对较弱，定殖菌数在103cfu/ml左右。
苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液的杀虫谱及其活性测定
6.2.1苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液杀目标害虫活性
桃蚜(Myzus persicae) 采自西葫芦叶片、无翅孤雌蚜；粘虫（Pseudaletia separata）为实验室人工饲养，试验用初孵幼虫。苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液用无菌水稀释为原液、2倍液、10倍液、50倍液、100倍液、500倍液和1000倍液，备用。
蚜虫毒力试验采用药液浸虫法：将带有蚜虫的叶采下，以毛笔仔细剔除不合要求的个体，置9cm培养皿(皿底铺一层湿滤纸)中,用微型喷雾器将苏云金芽孢杆菌BAT-1807各发酵稀释液定量（40ml）均匀喷湿叶片和试虫，合上皿盖，在20℃～25℃、10h/14h自然光周期下培养。重复3次，每处理试虫20头，无菌水处理作对照。分别于12h、24h、48h、72h检查试虫死亡数，计算校正死亡率%。
粘虫、小菜蛾毒力测定采用药液喷雾法：取直径9 cm的培养皿放入36g人工饲料，铺平，每个培养皿中接入24头初孵粘虫、小菜蛾，用微型喷雾器将苏云金芽孢杆菌BAT-1807各发酵稀释液定量（50ml）均匀喷湿饲料和试虫。重复3次，以无菌水为对照。之后将饲料混匀平均分成24份（约1.5 g）置于24孔培养板中，每孔接1头处理试虫。在25 ± 1℃，75% ±5%相对湿度， L // D = 16 h // 8 h 光周期环境下进行饲养，观察。分别于24h、72h、120h和168h后统计幼虫的死亡虫数、活虫数，计算校正死亡率。
以用小毛刷触碰虫体后无反应或幼虫表现出中毒症状，如畸形、颤搐、行动迟缓、进食中断、蜕皮停止和生长严重抑制等则被视为死亡。当CK 的死亡率超过5% 时，判定试验无效。
死亡率=死亡虫数/处理总虫数X 100%
校正累计死亡率=(处理死亡率一对照死亡率)/(1一对照死亡率)X 100%
表2：苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液对蚜虫的毒杀活性
Figure 512289DEST_PATH_IMAGE012
注释：表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
表3：苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液对粘虫的毒杀活性
Figure 576060DEST_PATH_IMAGE014
注释：表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
表4：苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液对小菜蛾的毒杀活性
Figure 509381DEST_PATH_IMAGE016
注释：表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
数据分析：表2结果显示，苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液对蚜虫有较好毒杀活性，BAT-1807发酵液浓度越大杀虫活性越强，原液、2倍稀释液、10倍稀释液和50倍稀释液72小时蚜虫校正累计死亡率分别88.12%、83.27%、75.70%和63.35%，稀释100倍以上72小时蚜虫校正累计死亡率在48%以下，杀虫毒力弱，需要辅助增效才能达到应用防治效果。表3、4结果显示，高浓度苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液对粘虫和小菜蛾有较好毒杀活性，其原液和2倍稀释液168小时粘虫和小菜蛾校正累计死亡率分别为81.58%、69.12%和74.19%、61.64%，稀释10倍以上168小时粘虫和小菜蛾校正累计死亡率均在在49%以下，杀虫毒力弱，应用时需要改进增效。
6.2.2苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液杀线虫活性
供试线虫采用室内盆栽的方法保存。根结线虫( Meloidogyne hapla)用番茄繁育，当供试根系上大量卵囊出现时，取出根系，用水轻轻冲洗，小心取下卵囊，放在 0.5%的次氯酸钠中消毒 3 min、用灭菌水冲洗 3 次，放在有灭菌水的培养皿中，25℃恒温培养，3d 后每24 h 收集新孵化的2龄幼虫。将分离的根结线虫２龄幼虫配制成悬浮液，浓度为10～11条/10μL，保存，备用；根腐线虫(Pratylenchus coffeae) 用马铃薯繁育，当供试马铃薯上大量卵囊出现时，收集卵囊薯，通过淘洗过筛法收集卵囊，将卵囊放在 0.5% 的次氯酸钠中消毒3 min，用灭菌水冲洗3 次，放在含有少量灭菌水的培养皿中，25℃恒温箱中培养，7d 后开始收集孵化的2龄幼虫。将分离的根腐线虫２龄幼虫配制成悬浮液，浓度为5～6条/10μL，保存，备用。
将苏云金芽孢杆菌BAT-1807活性，用5 mL含0.3%吐温80的无菌水，将斜面上的菌苔刮下置于装有无菌玻璃球的50 mL锥形瓶内，摇床中充分震荡2小时后，稀释至含菌量大于1 ×108 cfu/mL，备用。利用９６孔细胞培养板进行杀线活性测定，每孔取10μL线虫悬浮液，然后加入90μL苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液，无菌水为对照，重复6次。25℃的恒温箱中培养，24、48和72ｈ时，分别观察并记录线虫的死亡率。注：线虫的死亡判定标准为虫体僵直，并且使用毛针刺激后依然不活动，则判定线虫死亡。
线虫死亡率%＝（死亡线虫数／供试总线虫数）×100
校正累计死亡率=(处理死亡率一对照死亡率)/(1一对照死亡率)X 100%
表5：苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液对根结线虫的毒杀活性
Figure DEST_PATH_IMAGE018
注释：表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
表6：苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液对根腐线虫的毒杀活性
Figure DEST_PATH_IMAGE020
注释：表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
数据分析：表5、6结果显示，苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液对根结线虫和根腐线虫有很强毒杀活性， BAT-1807发酵液浓度越大杀虫活性越强，原液、2倍稀释液、10倍稀释液和50倍稀释液72小时根结线虫校正累计死亡率分别为92.42%、84.33%、76.15%和69.40%，72小时根腐线虫校正累计死亡率分别为90.57%、82.79%、71.83%和68.25%，稀释100倍以上72小时两种线虫的校正累计死亡率均在52%以下，杀虫毒力弱，需要辅助增效才能达到应用防治效果。
、苏云金芽孢杆菌BAT-1807对线虫和地下害虫的防治效果
供试植物准备：挑选籽粒饱满的番茄和甘蓝种子用70%的酒精消毒1 min后，再用0.5%的次氯酸钠消毒1 min，无菌水冲洗5～6次，然后用40 ℃的无菌水浸泡2 h，(27±1)℃恒温、黑暗催芽，待大部分种子出芽后，挑取出芽情况一致的种子，播种。
苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液，采用上述二之1节中方法制备。
线虫悬液制备：分别将分离的根结线虫２龄幼虫、根腐线虫２龄幼虫、孢囊线虫2龄幼虫等配制成悬浮液，浓度为15条/10μL，保存，备用。
供试药剂: 苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液为试验药剂，5%阿维菌素乳油1500倍稀释液为药剂对照，清水处理为空白对照。
防治试验：将育苗基质灭菌，施用体积重量百分比30%的试验药剂、对照药剂和清水（空白对照）于无菌基质，保温（28±1℃）保湿放置3天。再分别将制备的根结线虫２龄幼虫、根腐线虫２龄幼虫、孢囊线虫2龄幼虫采用灌注接入法，每穴接种15 ml 线虫悬液，覆一薄层土，保湿放置2天，每种线虫接种3穴盘，标记，播种。另外每种处理选2穴盘接种小地老虎初孵幼虫，每穴接种1头，标记，播种。均在播种后5天后，再将试验药剂、对照药剂和清水按30ml/株的量灌根处理，共处理3次，前2次每次间隔3天，后1次每次间隔7天。所有处理于27±1℃，湿度75%～80%，光周期9h / 15h的条件下进行培养。每天观察记录出苗生长情况，40ｄ后调查各处理发病植株数和发病株率（或死亡率），统计防控效果（或校正死亡率）。结果详见表7。
计算公式：
发病株率(%)=发病株数/调查总株数 ×100
防治效果(%)=(对照区发病株率－处理区发病株率)/对照区发病株率 ×100
死亡率=死亡虫数/处理总虫数X 100%
校正死亡率=(处理死亡率一对照死亡率)/(1一对照死亡率)X 100%
表7：苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液对线虫和小地老虎的防治效果
Figure DEST_PATH_IMAGE022
注释：表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）；
数据分析：表7结果显示，苏云金芽孢杆菌BAT-1807发酵液对根结线虫、根腐线虫和孢囊线虫2龄幼虫的防治效果分别为 88.24%、89.17%、87.54%，对小地老虎初孵幼虫的校正死亡率为 85.38%，与对照药剂（5%阿维菌素乳油1500倍）相比防治效果较弱一点，但均不存在显著性差异（p≥0.05））。

Claims (6)

1.一株苏云金芽孢杆菌，该苏云金芽孢杆菌是2022年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis，保藏编号为CGMCC No.24483。
2.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌在分离纯化过程中采用的分离纯化培养基配方为：葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，NaCl 8 g，酵母膏6 gMnSO4·H2O 0.008g，琼脂粉适量,蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0。
3.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌在对蚜虫、粘虫、小菜蛾、小地老虎、根结线虫、根腐线虫、孢囊线虫虫害防控中的应用。
4.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌的发酵液在对蚜虫、粘虫、小菜蛾、小地老虎、根结线虫、根腐线虫、孢囊线虫虫害防控中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵液制备时的发酵培养基配方为：牛肉膏8 g，酵母膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨8 g，MnSO4·H2O 0.005g，K2PO4 0.005g，NaCl5g，蒸馏水定容至1000 mL，pH7.0。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵液的活性物质有高香草酸、乙基二甲基吡嗪、甲基脱氧尻霉素、吡啶碱、碳烯脱氢哌嗪和四氢吡咯。
CN202211034518.8A 2022-08-26 2022-08-26 一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用 Active CN115141786B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211034518.8A CN115141786B (zh) 2022-08-26 2022-08-26 一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211034518.8A CN115141786B (zh) 2022-08-26 2022-08-26 一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115141786A CN115141786A (zh) 2022-10-04
CN115141786B true CN115141786B (zh) 2023-07-04

Family

ID=83416066

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211034518.8A Active CN115141786B (zh) 2022-08-26 2022-08-26 一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115141786B (zh)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001515355A (ja) * 1997-03-13 2001-09-18 マイコーゲン コーポレーション 殺虫性バチルス・チューリンギエンシス菌株
CN102329752B (zh) * 2011-09-23 2012-10-17 黑龙江大学 一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌
CN103160450A (zh) * 2011-12-15 2013-06-19 河北农业大学 一株广谱高效的苏云金芽孢杆菌新菌株及其菌剂和应用
CN105441362A (zh) * 2015-12-30 2016-03-30 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 可杀鳞翅目昆虫、植物线虫和鞘锈菌的苏云金芽孢杆菌及应用
CN108070535B (zh) * 2016-11-14 2020-10-30 华中农业大学 防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫的苏云金芽孢杆菌及制剂与应用
CN109880775B (zh) * 2019-04-12 2019-12-17 湖北省生物农药工程研究中心 一株苏云金芽孢杆菌novonest4及其应用
CN111004760B (zh) * 2020-01-07 2021-05-25 山东农业大学 一株苏云金芽孢杆菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115141786A (zh) 2022-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103045515B (zh) 一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂及其制备方法和应用
Afzal et al. Managing the root diseases of okra with endo-root plant growth promoting Pseudomonas and Trichoderma viride associated with healthy okra roots
CN101822272B (zh) 灰黄链霉菌及其在植物病害生物防治中的应用
CN107736379B (zh) 解淀粉芽孢杆菌在防治植物真菌病害中的应用
CN101851597A (zh) 一株抗苜蓿病害灰黄链霉菌及其筛选方法
CN108148794A (zh) 一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3及制备方法和应用
CN109207412A (zh) 一种抗青枯病生防菌株及其应用
CN108676761B (zh) 一株防治植物线虫的蜡样芽孢杆菌及其应用
CN110628664A (zh) 防治根结线虫的远东假单胞菌及其制备方法与应用
CN115261283B (zh) 一种蜡样芽孢杆菌及其在旱作马铃薯病害防控中的应用
CN103109870B (zh) 一种假单胞菌发酵上清液的应用
CN102925387B (zh) 一株具诱导大豆抗大豆胞囊线虫的简单芽孢杆菌及应用
KR101756683B1 (ko) 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주, 이를 포함하는 미생물 제제 및 이를 포함하는 생물 농약
CN106244480B (zh) 一株假格里尼翁苍白杆菌及其防治植物寄生线虫的应用
CN115141785B (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其在甘蓝种植中的应用
CN115141786B (zh) 一种苏云金芽孢杆菌及其在植物害虫防控中的应用
CN108441443B (zh) 一株防治植物线虫的菌株及其应用
CN114507626B (zh) 一株对根结线虫有毒杀活性的枯草芽孢杆菌2jq3及其应用
CN109609403A (zh) 一种生防菌及其在农作物霜霉病防治方面的应用
CN115851553A (zh) 一种可防治根肿病的弗吉尼亚链霉菌及其应用
CN112646757B (zh) 丁香链霉菌及其在植物病害防治中的应用
CN114908021A (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治黄瓜棒孢叶斑病上的应用
CN110800761B (zh) 一种用于防治根结线虫的含信号蛋白组合物及其制备方法和应用
CN102876611A (zh) 一种杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌及其制备方法与应用
CN104120084B (zh) 一种黄绿绿僵菌mfyy090714及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant