CN103923204A - 杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质及其应用，杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质为杀南方根结线虫的晶体蛋白基因cry9Aa-like，是一种杀虫晶体蛋白，分子量为98kDa。cry9Aa-like蛋白编码区由2223个碱基组成，具有序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；由741个氨基酸残基组成，具有序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。杀南方根结线虫的芽胞杆菌活性物质用于南方根结线虫的生物防治。杀线虫晶体蛋白Cry9Aa-like对南方根结线虫半致死浓度为5.92μg/mL；经灌根后的番茄根部根结数量大大减少，根系发达，防治效果为50%。

Description

杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质及其应用
技术领域
本发明涉及一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质及其应用。
背景技术
据FAO保守估计，全世界每年因线虫危害对粮食和纤维作物造成的损失大约为12%，对蔬菜、花生、烟草和某些果树造成的损失要超过20%，甚至达到50%。据权威专家报道，植物寄生线虫每年造成世界农业生产的损失约1500亿美元。我国每年因线虫造成的损失大约35亿美元。
目前对植物有害的线虫约有3000多种，而在我国发现的有40多种，其中对作物危害最严重的线虫之一是根结线虫。根结线虫虫体微小，生活在植物体内或土壤中，会随着雨水、劳事操作及病株的转移而转移，防治极为困难。
防治植物寄生线虫病害的主要方法有化学防治和生物防治。化学药剂大部分为剧毒药物，严重污染环境。生物防治是利用线虫的天敌来控制虫口数量和限制线虫引起的损失，且对人、动物和环境均相对安全，应用前景广阔。生物防治中目前应用最广泛的是苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt），此外还有穿刺巴氏杆菌（Psteuriapenetrans）、假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）以及近年发现的坚强芽胞杆菌（Bacillus firmus）等。
早在1972年，Prasad等首先发现Btβ-外毒素对根结线虫(Root-knotnematode,RKN)的卵和幼虫有很高的活性。之后发现Btβ--外毒素对香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、大豆胞囊线虫和酸酱线虫(Panagrellus redivivus)等线虫具有很高的杀虫活性(Ignoff et al.,1977;Devidas et al.,1988)。20世纪80年代中期Bone等发现Bt库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)和以色列亚种(subsp.israelensis)对动物寄生线虫蛇形毛圆线虫(Trichostrongluscolubriformis)的卵和幼虫有很高的杀虫活性，1988年美国Mycogen公司发现Bt晶体蛋白对根结线虫属(Meloidogyne spp.)、矮化线虫属(Tylenchs spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.)和滑刃线虫属(Aphlenchoides spp.)等植物。美国Mycogen公司筛选到很多对植物寄生线虫有杀虫活性的Bt菌株，同时也申请了专利。1993年我们初步筛选到9株对植物寄生线虫有杀虫活性的Bt菌株，这些Bt菌株对甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)、北方根结线虫(M.hapla)、和苎麻短体线虫(P.scribneri)有很高杀虫活性，其中已申请国家专利的菌株是YBT-1532(ZL 00-1-16062.1)(余子全等，2007b)。
发明内容
本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质及其应用。
本发明目的的实现方式为，杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质,杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏中心编号CCTCC NO：M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。
杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质为杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like，是一种杀南方根结线虫晶体蛋白，分子量为98kDa。cry9Aa-like蛋白编码区由2223个碱基组成，具有序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；由741个氨基酸残基组成，具有序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌活性物质用于植物寄生线虫尤其是南方根结线虫的生物防治。
附图说明
图1是杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like基因片段的PCR产物回收检测凝胶电泳图；
图2是重组质粒pUC19-cry9Aa-like的构建示意图；
图3是重组表达质粒pHBERC0563的构建示意图；
图4是杀南方根结线虫的晶体蛋白Cry9Aa-like纯化后的SDS-PAGE电泳分析图；
图5是番茄盆栽实验对比图。
具体实施方式
杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏中心编号CCTCC NO：M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。
杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质为cry9Aa-like蛋白，是一种杀虫晶体蛋白，分子量为98kDa。cry9Aa-like蛋白编码区由2223个碱基组成，具有序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；由741个氨基酸残基组成，具有序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本申请人同日申请的《一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌及其培养方法》对苏云金芽胞杆菌及其培养方法作了详细说明，按该申请文件培养方法培养的菌株经在光学显微镜油镜镜头下进行形态观察，显微镜检测图片证实为杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株。
有关DNA的标准操作方法和所使用的药品均参考《分子克隆实验指南》所描述的内容（参见萨姆布鲁克和拉塞尔，2001，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等（译），科学出版社，北京）。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，说明书中没有特别说明。
本申请人作了杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌NBIN-863中杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like的克隆实验1。
本发明以苏云金芽胞杆菌NBIN-863作为杀线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like的来源菌株，苏云金芽胞杆菌NBIN-863菌株的来源是湖北省生物农药工程研究中心自行分离的苏云金芽胞杆菌野生型菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863，于2013年11月29日在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国，武汉，武汉大学）保藏，菌种保藏号CCTCC NO：M2013612。苏云金芽胞杆菌NBIN-863菌株能形成典型的菱形晶体，对南方根结线虫和秀丽小杆线虫具有高毒力。
1、杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌NBIN-863基因组DNA的提取
将杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株NBIN-863过夜活化，按1/100（v/v）的接种量转接至5mL新鲜的LB培养基中（LB培养基配方：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠0.5%，pH7.0）28℃，200rpm培养至对数生长中期。收集菌体后按照树脂型TM基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛，上海）的操作说明进行基因组DNA的提取。
2.、杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌NBIN-863中杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like的克隆
根据杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like的序列，设计引物，上游引物C1（引物序列：5’GAATTC ATGAATCAAAATAAACACGG）和下游引物C2（引物序列：5’GTCGAC CTATTGATTGTATTAAAATC3’）。PCR反应的体系和程序如下：
25μL反应体系包含：2.5μL10×PCR反应缓冲液，1μL dNTP（各2.5mM），1μL引物C1,1μL引物C2，1μL模板（NBIN-863基因组DNA），0.2μL Ex Taq酶，加灭菌去离子水补至25μL。PCR反应参数和程序为：94℃，5min，1个循环；94℃，30s，55℃，30s，72℃，2.5min，25个循环；72℃，10min，1个循环。
将扩增到的目标产物通过PCR产物回收试剂盒（康为世纪，北京）纯化回收后（见图1），经过T/A克隆连接到T载体pMD19-T Vector上（TAKARA，大连），得到含有杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like全长序列的重组质粒pUC19-cry9Aa-like（见图2）。图2中A：cry1Ac、cry2Aa、杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like的PCR扩增图；B：Cry1Ac、Cry2Aa、Cry9Aa-like蛋白表达图。之后将该质粒转化大肠杆菌DH5α，并涂布氨苄青霉素抗性平板（Ampr，终浓度为100μg/mL），将抗性平板置于37℃培养箱中培养12-16h，待转化子长至一定大小，抽提转化子质粒进行酶切验证，酶切片段大小与预期大小一致。最后将筛选到的正确转化子用5mL液体LB培养基活化过夜，取1mL的过夜培养物送样测序（由上海生工完成）。
测序结果显示该基因具有如序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，申请人将该基因命名为cry9Aa-like（在本发明中，被命名的基因以斜体小写表示）。通过软件分析预测此段编码序列可编码一个如序列表SEQ ID NO:1所示的由741个氨基酸组成的多肽片段，预测其分子量为98kDa，申请人将其命名为Cry9Aa-like（在本发明中，被命名的蛋白以正体大写表示）。
3.苏云金芽胞杆菌NBIN-863中杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like的序列分析
对杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like进一步序列分析表明，杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like蛋白编码区由2223个碱基组成，具有序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；由741个氨基酸残基组成，具有序列表SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，同序列表SEQ ID NO:1所示的Cry9Aa-like多肽最相似的蛋白质为Cry9Aa蛋白，其氨基酸序列的一致性为99%。
本申请人作了杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like在大肠杆菌BL21中的表达纯化及生物活性测定实验2。
1、杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like在大肠杆菌中超量表达载体的构建
将实验1中获得的含有杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like的重组质粒pUC19-cry9Aa-like经过EcoRI和SalI双酶切，同时将质粒载体pGEX-6p-1进行相同的双酶切，然后将上述载体和外源的酶切产物通过0.8%的琼脂糖凝胶分离后，切下目标片段并通过DNA凝胶回收试剂盒（康为世纪，北京）纯化回收。之后将两者通过T4DNA连接酶（TAKARA，大连）连接，从而获得了含有杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like全长ORF的重组表达质粒pHBERC0563（见图3），图3中A：通过HPLC分离的各组分样杀南方根结线虫的活性表格，数字9代表线虫死亡率大于90%；数字5代表线虫死亡率大于50%；数字3代表线虫死亡率大于30%；数字0代表线虫无死亡。B：杀线虫活性组分的HPLC图谱。将该重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，并抽提质粒分别进行EcoRI和SalI双酶切验证，酶切片段大小和预期大小一致，进一步的测序结果表明杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like被正确的插入到了表达载体pGEX-6p-1中。
2、杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like在大肠杆菌BL21中的表达和纯化
为了大量表达杀南方根结线虫晶体蛋白Cry9Aa-like，申请人将上述携带有编码序列的重组表达质粒pHBERC0563转化到大肠杆菌BL21中，得到了重组菌BL21/pHBERC0563。将该重组菌接种于5mL LB液体培养基中，置于37℃摇床培养至OD600为0.6以后，加入1.0mmol/L的异丙基-B-D硫代半乳糖苷（即IPTG，购自Sigma公司）于30℃诱导培养3h。将上述50mL重组菌BL21/pHBERC0563的3h诱导培养物经过12000rpm离心30s收集菌体，利用超声波（技术参数：300W，破碎30s，间歇30s），将细胞破碎后12000rpm离心15min取上清，然后用0.4μm孔径的滤膜过滤除杂，用GST融合蛋白的亲和层析法纯化各种蛋白质。对最终的纯化产物进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图4所示，提纯的蛋白与蛋白分子量标准比对，估算分子量为96kDa，与预计的晶体蛋白Cry9Aa-like分子量大小98kDa基本吻合，证明本发明的杀线虫晶体蛋白Cry9Aa-like在大肠杆菌BL21中得到了成功的表达。
3、杀南方根结线虫晶体蛋白Cry9Aa-like对南方根结线虫生物活性的测定
取南方根结线虫（Meloidogyne incognita）（温室人工培养繁殖）严重感染的番茄根，用自来水冲洗干净表面泥沙后，用尖头镊子从根上取下卵块，0.5%（V/W）NaClO对卵块表面消毒2次，每次5min，再用无菌水反复冲洗干净。将消毒的卵块置于吸足水的滤纸上，25℃孵化3-5天；孵化出的线虫即可用作生物测定。生物测定在96孔板上进行生物测定，参照Masler（2007）的方法。每孔吸入190μl2龄幼虫线虫悬液包含线虫约40头，加入供试样品(蛋白悬液)10μl，用20μg/ml氯霉素抑制杂菌生长。设5-7个浓度梯度，每个浓度设3次重复，采用20μg/mlBSA作为对照。pH8.0，25℃条件下作用3天，在奥林巴斯倒置显微镜下观察计数，统计每孔死亡虫数。利用LD50数据处理软件（C）蓝宙工作室Version1.01计算LC50，结果见表1。从表1中可以看出，本发明得到的杀南方根结线虫晶体蛋白Cry9Aa-like对南方根结线虫显示出了很高的杀虫活性，半致死浓度为5.92μg/mL。
表1：杀线虫晶体蛋白Cry9Aa-like对南方根结线虫的活性测定
晶体蛋白 回归方程 R2值 半致死浓度
Cry9Aa-like y=1.0579x+3.2781 0.9752 5.92
本发明发现的杀南方根结线虫晶体蛋白Cry9Aa-like对南方根结线虫具有高毒力，为南方根结线虫的生物防治提供了一种新的基因资源。
本申请人作了番茄盆栽实验3。
在育苗盘中培育番茄苗，等幼苗长至4片叶时，挑选长势一致的幼苗移栽至装有健康土壤的花盆中，置于温室中培养1个星期，每天浇水一次。1个星期后，待供试苗生长稳定后，接种线虫悬液，每株接种1500头。接虫1周后，进行蛋白悬液灌根实验：每棵苗子灌10mL蛋白悬液（200μg/mL），每星期灌1次，连灌4次。1个月后，拔根统计结果，清洗番茄根，记录番茄根上的虫卵数、番茄的株高、株重。
番茄盆栽实验的数据处理：按照下面的公式计算增长率、病情指数和防治效果，用邓肯式新复极差法比较各处理间的株高、植株鲜重增长率及病情方面的差异。
株高增长率=[（处理株高-对照株高）/对照株高]×100%
地上部植株鲜重增长率=[（处理鲜重-对照鲜重）]/对照鲜重×100%
病情指数=[∑（每个病级植株数×该级代表数值）/（总株数×4）]×100%
防治效果=[（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数]×100%
图5是盆栽实验各处理组的防治效果对比图。结果显示杀南方根结线虫晶体蛋白Cry9Aa-like悬液灌根后的番茄根部根结数量大大减少，且根系发达，通过该蛋白悬液处理后的植株发病病情指数为50%，防治效果为50%（见表2）。
表2：盆栽实验各处理组的防治效果统计

Claims (3)

1.杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质，其特征在于杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质,杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏中心编号CCTCC NO：M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。
杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质为杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like，是一种杀南方根结线虫晶体蛋白，分子量为98kDa。
2.根据权利要求1所述的、苏云金芽胞杆菌的活性物质，其特征在于杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质为杀南方根结线虫cry9Aa-like蛋白，是一种杀南方根结线虫晶体蛋白基因，分子量为98kDa。杀南方根结线虫晶体蛋白基因cry9Aa-like蛋白编码区由2223个碱基组成，具有序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；由741个氨基酸残基组成，具有序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌活性物质的应用，其特征在于杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌活性物质用于植物寄生线虫尤其是南方根结线虫的生物防治。
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