CN104004680A - 一株草甸山冈单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株草甸山冈单胞菌及其应用。本发明的草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)，其菌株号为JZB120004，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.9193。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004为革兰氏阴性杆菌，好氧菌；适宜生长温度为20-28℃，25℃生长最好，4℃下能缓慢生长，37℃以上不能生长，仅对桃褐腐病褐有抑制作用。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004繁殖速度快，能够人工培养，可用于用于防治桃褐腐病，还可生产低温蛋白酶。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种微生物及其应用，特别涉及一株作为桃褐腐病生防菌的草甸山冈单胞菌及其应用。
背景技术
由链核盘菌(Monilinia spp.)引起的褐腐病是桃生产中最重要的病害之一，也是世界范围内核果类最重要的采后病害(Sisquella M,Casals C,I,et al.Combination ofperacetic acid and hot water treatment to control postharvest brown rot on peachesand nectarines；Postharvest Biology and Technology,2013,83:1-8；Giobbe S,MarcedduS,Scherm B,et al.The strange case of a biofilm-forming strain of Pichia fermentans,which controls Monilinia brown rot on apple but is pathogenic on peach fruit；FEMSYeast Res.,2007,7(8):1389-1398.Hou D Y,Yan C Q,Liu H X,et al.Berberine asa natural compound inhibits the development of brown rot fungus Monilinia fructicola.Crop Protection,2010,29:979-984)。在欧洲地中海地区，褐腐病由核果链核盘菌(M.laxa)和果生链核盘菌(M.fructigena)引起,在澳大利亚、南非和美洲的病原为美澳型核果链核盘菌(M.fructicola),后者在欧洲被列为检疫对象(Larena I,Torres R,De Cal A,et al.Biological control of postharvest brown rot(Monilinia spp.)of peaches by fieldapplications of Epicoccum nigrum.Biological Control,2005,32:305-310)。此病在采前、采后及贮藏运输期均可造成大量减产，采后尤为严重，在欧美损失高达59％–90％。我国桃产量在1000万吨以上，为仅次于苹果的第二大水果，桃褐腐病在16个省(区)有记载发生，是桃的重要病害之一，如素有“中国桃乡”之称的北京市平谷区近年褐腐病已成为桃外销产业发展的一大障碍。调查表明，北京地区此病的主要病原是美澳型核果链核盘菌，可致贮藏库果实年损失近1/4，出库后烂果率高达84.6％－100％。
迄今化学防治仍是控制褐腐病的主要手段，近年桃褐腐病菌已对生产上常用的苯并咪唑类(Bzl s)、二甲酞亚胺类(DCFs)及甾醇脱甲基化酶抑制剂类(DMIs)杀菌剂产生了抗药性(Holb I J,Schnabel S.Differential effect of triazoles on mycelial growth anddisease measurements of Monilinia fructicola isolates with reduced sensitivity toDMI fungicides.Crop Prot.,2007,26(5):753-759)，使此病害的防治受到了极大的威胁；此外，由于化学杀菌剂存在环境污染、食品安全等诸多问题，在欧洲桃主产区采后病害的防治早已严禁使用任何类型的化学农药；我国近年也提出了绿色防控的植保理念和示范区建设规划，并在全国建立了北京平谷等24个果树绿色防控示范区。开发安全、环保的替代产品已成为全球的热点。微生物制剂具有靶标特异性强、对人畜安全、环境兼容性好等优势，是一类理想的替代产品。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供对桃褐腐病菌有特异性抑制作用且能够产生低温蛋白酶、几丁质酶、磷酸酯酶和嗜铁素的山岗单胞菌。
本发明所提供的山岗单胞菌是草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)，其菌株号为JZB120004，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.9193。
本发明所提供的草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的16S rDNA序列如SEQ ID No.3所示，为革兰氏阴性杆菌，好氧菌；产蛋白酶、氧化酶、淀粉酶、几丁质酶、磷酸酯酶和嗜铁素，未检测到纤维素酶；适宜生长温度为20-28℃，25℃生长最好，4℃下能缓慢生长，37℃以上不能生长。将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004与该属模式菌株C.fungivorans CCUG48868T、C.arenae CCUG54727T、C.pratensis CCUG54728T的碳源代谢比较结果显示：草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和上述三株模式菌株对环糊精、糊精、淀粉、N-乙酰基-D-半乳糖胺、侧金盏花醇、α-D-乳糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、麦芽糖、赤藻糖醇、D-蜜二糖、D-棉子糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖醛酸、丁二胺、L-棉子糖、γ-羟基丁酸、p-羟基苯乙酸、衣康酸、葡糖醛酰胺、丙二酸、α-酮戊酸、癸二酸、松二糖、甘氨酰-L-天门冬氨酸、D-丙氨酸、羟基-L-脯氨酸、L-组氨酸、胸腺嘧啶核苷、D-丝氨酸、L-亮氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、D,L-肉碱、苯乙胺、2-氨基乙醇、2,3-丁二醇和1-磷酸葡萄糖的利用均为阴性；均为阳性的是吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-半乳糖、α-D-葡萄糖、m-肌醇、D-甘露醇、D-甘露糖、D-乳糖酸内酯、D-葡萄糖酸、β-羟基丁酸、α-酮戊二酸、丙酸、D-葡糖二酸、琥珀酸、琥珀酰胺酸、L-丙氨酸胺、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、肌苷、尿苷和丙三醇；对甲酸、D,L-乳酸、溴丁二酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺酸和L-焦谷氨酸的利用均为弱阳性。而草甸山岗单胞菌(Collimonaspratensis)JZB120004对L-阿拉伯糖等21种碳源的利用情况与上述三株模式菌株不同(表1)。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004与Collimonas pratensis CCUG54728T有最高基因组相似性，为83.99±1.83％，高于DNA-DNA种的杂交水平的临界值70％，而与C.fungivorans CCUG48868T和C.arenae CCUG54727T基因组相似性分别仅为45.32±1.89％和32.52±2.30％，均低于DNA-DNA种的杂交水平的临界值，草甸山岗单胞菌(Collimonaspratensis)JZB120004与C.pratensis CCUG54728T对乳果糖、D-海藻糖、甲基丙酮酸、乙酸、L-苏氨酸、顺-乌头酸、柠檬酸、奎尼酸、γ-氨基丁酸、尿刊酸、D,L-α-磷酸甘油和6-磷酸葡萄糖的利用是不同的，结合菌落形态(KB培养基)和16S rDNA序列的差异，说明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004是草甸山岗单胞菌的一个新菌株。
本发明所提供的草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004作为生防菌的关键性生防指标是具有产低温蛋白酶的能力，另外还可以产氧化酶、淀粉酶、几丁质酶、磷酸酯酶、嗜铁素，而不产生纤维素酶。
草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的下述任一种用途也属于本发明的保护范围：
1)植物褐腐病菌抑制剂，它的活性成分是所述的草甸山岗单胞菌和/或所述的草甸山岗单胞菌的代谢物；
2)植物褐腐病抑制剂，它的活性成分是所述的草甸山岗单胞菌和/或所述的草甸山岗单胞菌的代谢物；
3)所述的草甸山岗单胞菌和/或所述的草甸山岗单胞菌的代谢物在制备植物褐腐病菌抑制剂中的应用；
4)所述的草甸山岗单胞菌和/或所述的草甸山岗单胞菌的代谢物在抑制植物褐腐病菌中的应用；
5)所述的草甸山岗单胞菌和/或所述的草甸山岗单胞菌的代谢物在制备植物褐腐病抑制剂中的应用；
6)所述的草甸山岗单胞菌和/或所述的草甸山岗单胞菌的代谢物在抑制植物褐腐病中的应用；
7)所述的草甸山岗单胞菌在生产生产蛋白酶中的应用；
8)所述的草甸山岗单胞菌在生产几丁质酶中的应用；
9)所述的草甸山岗单胞菌在生产淀粉酶中的应用；
10)所述的草甸山岗单胞菌在生产氧化酶中的应用；
11)所述的草甸山岗单胞菌在生产嗜铁素中的应用。
其中，上述植物褐腐病菌可为桃褐腐病菌(如美澳型核果链核盘菌(Moniliniafructicola(Wint.)Honey))。
上述草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的代谢物可从所述草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的发酵液中获得。所述草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的代谢物具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004，除去液体培养物(发酵液)中的所述草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004即得到所述山岗单胞菌的代谢物。
实验证明，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对植物病原菌的抑制活性具有很强的专化性，在所供试的病原真菌、细菌和酵母菌中，仅对桃褐腐病菌有较强的抑制作用，而对其它病原菌均无抑制作用。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对桃褐腐病菌的抑菌能力为1-7天，最大抑菌带宽为8mm，抑菌率达64.29％，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004室内离体防效检测结果表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004代谢物能够明显抑制桃褐腐病病斑的扩展，对桃褐腐病病斑的防治效果高达86.4％。本发明的草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004分离自西藏色季拉山海拔4530m的高山草甸土壤，所栖息的高寒荒漠环境年均温0℃，最暖月均温6℃，0℃以上的天数120d，高于0℃的年积温1000℃。对高寒生态环境的适应使草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004具备了耐低温的特性，其生长温度范围为4-30℃，最适生长温度为25℃，在30℃以上的温度下不生长，依据Morita对嗜冷菌和耐冷菌的定义，该菌株属于耐冷菌。酶学性质试验表明，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004产生的胞外蛋白酶Capro最适温度为30℃，在30℃-40℃范围内酶活力较高，40℃以上酶活力急骤下降，而在10℃时仍保持在70％以上。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004繁殖速度快，能够人工培养，可用于生产低温蛋白酶，还可用于防治桃褐腐病。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)
生物材料的菌株编号：JZB120004
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2014年5月23日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9193
附图说明
图1为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的菌落形态(KB平板上)及革兰氏染色后的菌体形态；A-B为培养96h后的菌落形态；C为400×光学显微镜下观察到的菌体形态。
图2为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对桃褐腐病菌的抑菌活性检测；A:对峙培养7天结果；B:对峙培养14天结果；C：无菌发酵上清液的抑菌活性检测结果，C中左侧孔为对照，右侧孔为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质。
图3为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对桃褐腐病室内离体防效测定结果；A：处理A；B：处理B；C：处理C；D：处理D。
图4为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004生防相关性状测定结果；A：磷酸酯酶检测；B：几丁质酶检测；C：蛋白酶检测；D：嗜铁素检测。
图5为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004在蛋白酶活性检测平板上的透明圈。
图6为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004基因组DNA BamHⅠ酶切图谱；1：15000bp DNA Ladder Marker；2：基因组DNA酶切0min；3：基因组DNA酶切60min。
图7为蛋白酶基因阳性克隆子的筛选；A：蛋白酶基因阳性转化子初筛结果；B：蛋白酶基因阳性转化子复筛结果；B中1：重组大肠杆菌DH5α/pUC118；B中2：重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro。
图8为pUC118-capro质粒酶切检测结果；1：5000bp DNA Ladder Marker；2：pUC118的BamH Ⅰ酶切片段；3：pUC118-capro的BamH Ⅰ酶切片段。
图9为重组大肠杆菌代谢物活性检测；1：重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro非诱导培养48h总蛋白溶液；2：重组大肠杆菌DH5α/pUC118的诱导培养48h总蛋白溶液；3、重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养24h总蛋白溶液；4、重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养48h总蛋白溶液。
图10为目的蛋白SDS-PAGE检测图谱；M：蛋白Marker；1、重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养24h总蛋白溶液；2、重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养48h总蛋白溶液；3、重组大肠杆菌DH5α/pUC118的诱导培养48h总蛋白溶液。
图11为温度和pH对蛋白酶capro活性的影响；A为温度蛋白酶活性的影响，B为pH对蛋白酶活性的影响；E.coli表示DH5α/pUC118-capro，JZB120004表示草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
几丁质粉为美国Sigma化学试剂公司产品；BamH I酶、pUC118、Hind III内切酶、pMD18-T载体为TAKARA公司产品；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购于原平皓生物技术有限公司。实施例中所用的培养基如下：
(1)PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1000mL。
(2)LB培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g,琼脂15g，用蒸馏水定容至1000mL，pH7.0-7.2。
(3)KB固体培养基：蛋白胨20g，MgSO4·7H2O1.5g，K2HPO41.5g，甘油10ml，琼脂20g，用蒸馏水定容至1000mL，pH6.8，121℃灭菌30min。
KB液体培养基(KB培养基中不加琼脂，即：蛋白胨20g，MgSO4·7H2O15g，K2HPO415g，甘油10ml，用蒸馏水定容至1000ml，pH6.8，121℃灭菌30min。
(4)磷酸酯酶检测培养基：酵母浸粉0.5g，葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，Ca3(PO4)25g，MgCl20.1g，KCl0.2g，FeSO40.1mg，MnSO4·H2O0.1mg，琼脂15g，用蒸馏水定容至1000mL，pH7.0。
(5)嗜铁素(CAS)检测培养基：由4种溶液组成(溶液1-3及casamino acid)。
溶液1(CAS/HDTMA溶液)：铬天青(CAS)溶液：60.5mg CAS溶解在50ml水中；铁溶液：1mmol/L FeCl3·6H2O溶解于10mmol/L HCI中,pH2.0；十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶液：72.9mg HDTMA溶解于40ml水中。取10ml铁溶液与CAS溶液混合后加入到HDTMA溶液中，混均后溶液呈蓝黑色，121℃灭菌15min，该液体即CAS/HDTMA溶液。
溶液2(Salts/Buffer溶液)：盐(Salts)溶液：将30.24g Pipes溶解于750mLSalts溶液(KH2PO40.3g，NaCl0.5g，NH4Cl1.0g)中，以50％(W/V)KOH调节pH至6.8，加入15g琼脂定容至800ml，121℃灭菌15min。
溶液3：甘露醇2g，葡萄糖2g，MgSO4·7H2O493mg，H3BO31.4mg，CaCl211mg，MnSO4·2H2O1.17mg，ZnSO4·7H2O1.2mg，Na2MoO4·2H2O1mg，CuSO440μg，蒸馏水定容至750ml，121℃灭菌15min。
将溶液2与冷却至45-50℃左右溶液3混合后再与30ml已用微孔滤膜过滤除菌过的10％(W/V)casamimo acid混合，最后加入溶液1，缓慢混均(避免产生泡沫)，倒平板。
(6)纤维素水解培养基：蛋白胨10g，KH2PO41g，酵母浸粉10g，NaCl5g，羧甲基纤维素钠10g，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，pH7.2。
(7)蛋白酶检测培养基：进口脱脂奶粉10g，琼脂15g，用去离子水定容至1000ml，121℃灭菌15min。
(8)几丁质酶检测培养基：酵母提取物0.05g，胶体几丁质2g，KH2PO41g，NaCl5g，琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌25min。
(9)1.5％水琼脂培养基：琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌25min。
(10)TSA培养基：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.3。
(11)BUG+B培养基：BUG琼脂培养基57g，蒸馏水950mL，煮沸溶解，pH7.3±0.1，121℃灭菌15min，将50mL新鲜的脱纤羊血加入到已溶解冷却至45-50℃BUG琼脂培养基中，混均，倒平板。
(12)胶体几丁质的制备：取10g几丁质粉溶于170mL4℃过夜预冷的浓盐酸中，磁力搅拌器搅拌混匀后，置于4℃冰箱过夜，用蒸馏水反复洗至中性，定容到1000mL，4℃保存备用。
(13)蛋白酶检测(重组子筛选)培养基：进口脱脂奶粉10g，琼脂15g，去离子水1000ml，121℃灭菌15min。
实施例1、本发明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的分离及鉴定
1、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的分离
以漠河永冻层、西藏雪域高原、海洋红树林等特殊生境采集的样品为对象，以传统的活性筛选方法结合分子生物学和生理生化等技术，筛选果蔬作物重要真菌病害新的或稀有生防因子。结果从西藏林芝色季拉山海拔4530m高山草甸土壤中分离得到一编号为JZB120004的菌株，即草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004。
2、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的鉴定
草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004在KB固体培养基上产生紫色可溶性色素，菌落扁平、光滑，直径为3-7mm；革兰氏阴性，菌体呈短杆状，直或近直(图1)。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的16S rDNA序列如SEQ ID No.3所示，与山岗单胞菌属全部3个种的模式菌株CCUG54728T、CCUG54727T和CCUG48868T(Gene Bank：AY281137，AY281146和AJ310394)的16S rDNA序列相似性最高，均为99％。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004为革兰氏阴性杆菌，好氧菌；产氧化酶、淀粉酶、蛋白酶、几丁质酶、磷酸酯酶和嗜铁素，未检测到纤维素酶；适宜生长温度为20-28℃，25℃生长最好，4℃下能缓慢生长，37℃以上不能生长。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004与该属模式菌株C.fungivorans CCUG48868T、C.arenae CCUG54727T、C.pratensis CCUG54728T的碳源代谢比较结果显示：草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和三株模式菌株对环糊精、糊精、淀粉、N-乙酰基-D-半乳糖胺、侧金盏花醇、α-D-乳糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、麦芽糖、赤藻糖醇、D-蜜二糖、D-棉子糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖醛酸、丁二胺、L-棉子糖、γ-羟基丁酸、p-羟基苯乙酸、衣康酸、葡糖醛酰胺、丙二酸、α-酮戊酸、癸二酸、松二糖、甘氨酰-L-天门冬氨酸、D-丙氨酸、羟基-L-脯氨酸、L-组氨酸、胸腺嘧啶核苷、D-丝氨酸、L-亮氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、D,L-肉碱、苯乙胺、2-氨基乙醇、2,3-丁二醇和1-磷酸葡萄糖的利用均为阴性；均为阳性的是吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-半乳糖、α-D-葡萄糖、m-肌醇、D-甘露醇、D-甘露糖、D-乳糖酸内酯、D-葡萄糖酸、β-羟基丁酸、α-酮戊二酸、丙酸、D-葡糖二酸、琥珀酸、琥珀酰胺酸、L-丙氨酸胺、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、肌苷、尿苷和丙三醇；对甲酸、D,L-乳酸、溴丁二酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺酸和L-焦谷氨酸的利用均为弱阳性。而草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对L-阿拉伯糖等21种碳源的利用情况与上述三株模式菌株不同(表1)。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004与Collimonaspratensis CCUG54728T有最高基因组相似性，为83.99±1.83％，高于DNA-DNA种的杂交水平的临界值70％，而与C.fungivorans CCUG48868T和C.arenae CCUG54727T基因组相似性分别仅为45.32±1.89％和32.52±2.30％(表2)，均低于DNA-DNA种的杂交水平的临界值，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004与C.pratensis CCUG54728T对乳果糖、D-海藻糖、甲基丙酮酸、乙酸、L-苏氨酸、顺-乌头酸、柠檬酸、奎尼酸、γ-氨基丁酸、尿刊酸、D,L-α-磷酸甘油和6-磷酸葡萄糖的利用是不同的，结合菌落形态(KB固体培养基)和16S rDNA序列的差异，说明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004是草甸山岗单胞菌的一个新菌株。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004已于2014年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9193，本申请中简称草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004。
表1、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004与C.fungivorans CCUG48868T、C.arenae CCUG54727T和C.pratensis CCUG54728T对21种碳源代谢的差异
| 碳源类型 | CCUG48868T | CCUG54727T | CCUG54728T | JZB120004 |
| L-阿拉伯糖(L-Arabinose) | - | - | + | + |
| 乳果糖(Lactulose) | + | - | w | - |
| 阿洛酮糖(D-Psicose) | - | w | - | - |
| D-山梨醇(D-Sorbitol) | + | w | + | + |
| D-海藻糖(D-Trehalose) | + | - | + | - |
| 木糖醇(Xylitol) | + | - | + | + |
| 甲基丙酮酸(Methyl Pyruvate) | - | w | + | - |
| 单甲基琥珀酸(Mono-Methyl-Succinate) | - | w | - | - |
| 乙酸(Acetic Acid) | w | w | w | - |
| 顺-乌头酸(Cis-Aconitic Acid) | + | + | + | - |
| 柠檬酸(Citric Acid) | + | w | + | - |
| D-葡萄糖胺酸(D-Glucosaminic Acid) | - | + | + | + |
| α-羟基丁酸(α-Hydroxy Butyric Acid) | - | w | - | - |
| α-酮丁酸(α-Keto Butyric Acid) | - | + | - | - |
| 奎尼酸(Quinic Acid) | - | + | + | - |
| 甘氨酰-L-谷氨酸(Glycyl-L-Glutamic Acid) | + | - | + | + |
| L-苏氨酸(L-Threonine) | - | - | + | w |
| γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid) | - | + | w | - |
| 尿刊酸(Urocanic Acid) | w | - | + | - |
| D,L-α-磷酸甘油(D,L-α-glycerol Phosphate) | - | - | - | w |
| 6-磷酸葡萄糖(Glucose-6-Phosphate) | - | w | - | + |
注：+为阳性；-为阴性；w为弱阳性。
表2、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004与C.fungivorans CCUG48868T、C.arenae CCUG54727T和C.pratensis CCUG54728T DNA-DNA杂交分析
| DNA-DNA杂交菌株 | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 基因组相似性 |
| JZB120004×CCUG48868T | 43.90％ | 44.60％ | 47.47％ | 45.32±1.89％ |
| JZB120004×CCUG54727T | 31.31％ | 31.07％ | 35.17％ | 32.52±2.30％ |
| JZB120004×CCUG54728T | 82.16％ | 83.98％ | 85.82％ | 83.99±1.83％ |
具体实验方法如下：
分离鉴定参比菌株：食真菌山冈单胞菌(Collimonas fungivorans CCUG48868T)、沙土山冈单胞菌(Collimonas arenae CCUG54727T)、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensisCCUG54728T)均购自瑞典哥德堡大学菌种保藏中心(CCUG)。
2.1草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的培养性状与形态特征观察
将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004划线接种于KB固体培养基，25℃恒温培养3天后，观察菌落形态，有无色素的产生；通过革兰氏染色测定菌体大小，观察菌体形态。
2.2草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的生理生化测定
草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的生理生化性状参照《常见细菌系统鉴定手册》和《Bergey’s manual of systematic bacteriology》进行，碳源利用采用Biolog鉴定系统进行。
培养温度试验：测定菌株适宜生长的温度。将菌种接入KB固体培养基，分别于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、37℃、45℃恒温下培养7d和15d，观察其生长情况。
氧化酶试验：蘸取少许菌苔于洁净的一小块滤纸，将10g/L盐酸二甲基对苯二胺溶液滴1滴于菌落上，若为阴性则不变色，若为阳性则立刻变为红色，继而逐渐加深。
革兰氏染色：挑取平板培养24h的细菌菌苔些许，用结晶紫染色1min，水洗；滴加碘液冲去残水并染色1min，水洗；脱色20-30s用95％乙醇，水洗，轻轻用滤纸吸干后蕃红复染1min，水洗，风干后镜检。
Biolog鉴定试验：依据革兰氏染色、氧化酶试验结果，确定菌株类型，依照Biolog微生物鉴定流程，选择与菌株鉴定类型相对应的鉴定板以及培养条件。将菌株在KB(TSA)固体培养基连续培养3-4代，选择培养生长良好的单菌落，转接到BUG+B固体培养基上，于25℃培养24-48h,用无菌竹签挑取少量新鲜菌落,将其用专用接种液制备为均一菌悬液，与标准菌悬液进行浊度对比，误差控制在±2％；用八通道移液器将菌悬液接种到Biolog GN2板，每孔接种菌悬液150μl。将接种好的鉴定板编号并置于25℃培养，在培养24h后每隔4h用读数仪读取菌株特征性碳源代谢指纹特征，直至培养时间为120h，比对分析试验结果。
2.3草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的16S rDNA序列测定
利用16S rDNA扩增通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'及1492R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'PCR扩增菌株JZB120004的16S rDNA，并进行测序，测序结果表明菌株JZB120004的16S rDNA序列如SEQ ID No.3所示。
2.4草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的DNA-DNA杂交测定
采用液相复性速率方法测定两株菌种的DNA-DNA杂交率。所用仪器为Perkin ElmerLambda35UV/VIS Spectrophotometer。温度控制用PTP-1Peltier System数字控温系统。
具体实验步骤如下：
1)DNA样品处理：提取的DNA样品，实验前需先置冰浴中用超声波40W处理24min(设定为：工作3s/停3s；DNA样品浓度为2.0)，将DNA样品剪切为2-5×105道尔顿的片段。
2)将待测DNA样品分别用0.1×SSC精确配制成为OD260nm1.8-2.0，且两者OD260nm值一致(精确到0.001)；
3)进入UV Winlab程序，出现其方法窗口，在方法窗口中选择时间驱动TD方法，通过Timed.lnst.Sample.设置页来设定合适的测定参数。测定波长为260nm，总测定时间设定为30min。按照已经测定的G+C mol％计算最适复性温度(optimal renaturation temperature，TOR)，将比色杯的温度稳定在最适复性温度。在2×SSC反应液中，最适复性温度按公式：TOR＝0.51×(G+C)mol％+47计算。
4)取两株菌种DNA样品各400ul分别装在两个离心管中，再取两株菌种DNA样品各200ul装在同一个离心管中为混合样品；
5)单一DNA样品和混合DNA样品测试前分别通过PTP-1控温系统设置100℃变性15min，然后降温至最适复性温度。记录OD260nm值，待反应进行到30min时，停止读数，全部过程样品的温度都不得低于TOR，最终得到一条随时间延长，光吸收值逐渐减小的直线；
6)根据软件UV Winlab，在其中的Algorithm栏中选择Slope，得出复性速率(V)，即斜率(通常V表示为每分钟吸光值的减少值)；
7)根据公式计算同源杂交率(H)％＝4Vm-(Va+Vb)/2(VaVb)1/2×100％。
实施例2、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004抑菌谱测定
草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对病原菌的抑制活性具有很强的专化性，在所供试的病原真菌、细菌和酵母菌中，仅对桃褐腐病菌有较强的抑制作用，而对其它病原菌均无抑制作用。食真菌山冈单胞菌(Collimonas fungivorans CCUG48868T)、沙土山冈单胞菌(Collimonas arenae CCUG54727T)和草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensisCCUG54728T)对桃褐腐病菌均无抑制作用。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对桃褐腐病室内离体防治效果为86.4％。
具体实验方法和实验结果如下：
靶标病原菌：甘蓝枯萎病菌，西瓜枯萎病菌，小麦纹枯病菌，小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，番茄灰霉病菌，桃褐腐病菌，大白菜黑腐病菌，茄子青枯病原菌，平菇褐斑病菌，黄瓜角斑病原菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC10366)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)均由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所和中国农业大学植病系提供。其中，甘蓝枯萎病菌为尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen](李明远等.十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定.植物保护.2003年6第29卷第3期)；西瓜枯萎病菌为西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)(耿丽华等.西瓜枯萎病菌生理小种鉴定技术体系的建立和验证.中国蔬菜.2010(20)：52-56)；小麦纹枯病菌为小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cereali)(纪兆林等.小麦纹枯病菌毒素对小麦植株的作用.扬州大学学报(农业与生命科学版)第32卷第3期2011年9月p55-59)；番茄灰霉病菌为灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr.)(李兴红等.北京地区番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检测.植物保护.2012.38(4)：141-143)；桃褐腐病菌为美澳型核果链核盘菌(Moniliniafructicola(Wint.)Honey)(陈育，桃褐腐病菌Cytb基因1166bp内含子对G143A突变影响的分子机理初步研究[D]，武汉：华中农业大学，2012)；平菇褐斑病菌为托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasii Paine)(金丹等.一种平菇褐斑病病原菌的鉴定.食用菌学报.200916(1)：89～91)；黄瓜角斑病原菌为黄瓜角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)(A.T.Alleyne.et.al.Identification of Pseudomonas syringae pv.lachrymans in Barbados by rep-PCR.Journal of Agricultural Science and TechnologyB1(2001)593-597)；茄子青枯病菌(Ralstonia solanacearum)(封林林等.茄子青枯病抗性材料的鉴定及性状观察.长江蔬菜.2000年第10期P35)；大白菜黑腐病菌为大白菜黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campsetris)(翟文慧等.大白菜黑腐病鉴定的湿度试验及其苗期与成株期抗病性的相关分析.中国蔬菜.2010(10)：59-63)。
1、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对植物病原真菌抑菌活性检测
以上述甘蓝枯萎病菌，西瓜枯萎病菌，小麦纹枯病菌，小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，番茄灰霉病菌和桃褐腐病菌这六种真菌为病原真菌，采用平板对峙培养法测定草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对植物病原真菌抑菌活性，具体方法如下：
将已在PDA平板上活化好的每种病原真菌，用7mm无菌打孔器在菌落边缘打制病原真菌菌饼，接种于9cm PDA平板中央，培养2天，将已活化好的草甸山岗单胞菌(Collimonaspratensis)JZB120004点接于距病原真菌菌饼约2cm处，设不接种草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的处理为对照，25℃培养，至对照长满整个平板，观察记录抑菌情况。抑菌率＝(对照病原菌直径-处理病原菌直径)/(对照病原菌直径-7mm)×100％。实验重复三次，每次重复每种病原真菌3个平板。结果表明对所供试的病原真菌中，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004只对桃褐腐病菌——美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola(Wint.)Honey)有抑菌作用，对甘蓝枯萎病菌，西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)，小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cereali)，小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)，番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)这些病原真菌均无抑菌作用。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对桃褐腐病菌——美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola(Wint.)Honey)的抑制能力在1-7天时较好并逐渐增强，在第7天时最大抑菌带宽为8mm，抑菌率达64.29％(图2中A)，7天以后抑制效果逐渐下降(图2中B)。表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004只能暂时抑制桃褐腐病菌的生长，而不能杀死其病原菌。
2、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对植物病原细菌及酵母菌抑菌活性检测。
以大白菜黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campsetris)，茄子青枯病原菌(Ralstonia solanacearum)，平菇褐斑病菌(Pseudomonas tolaasii)，黄瓜角斑病原菌(Pseudomonas syringae pv.Lachrymans)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisCICC10366)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为病原菌，采用双层培养法测定草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对植物病原细菌及酵母菌抑菌活性，具体方法如下：将活化好的草甸山岗单胞菌(Collimonaspratensis)JZB120004点接于KB固体培养基平板，25℃培养72-96h，加入5mL氯仿，静置10-12h，以其蒸汽杀死菌体且使氯仿蒸气完全挥发。供试病原在LB培养基平板上活化，28℃恒温静置培养24h，制备成108CFU/mL的菌悬液。取100μl菌悬液加入到3mL1％水琼脂中(已融化且冷却至50℃左右)，迅速混匀，倒入已杀死菌体的培养基平板上，铺成均匀的薄层，每个处理三皿重复，28℃静置培养24-48h，观察是否有抑菌活性，如有抑菌圈则有抑菌活性，测量抑菌圈直径，如无抑菌圈，则无抑菌作用。结果表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的代谢物对大白菜黑腐病菌(Xanthomonas campestrispv.campsetris)，茄子青枯病原菌(Ralstonia solanacearum)，平菇褐斑病菌(Pseudomonastolaasii Paine)，黄瓜角斑病原菌(Pseudomonas syringae pv.Lachrymans)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC10366)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)均无抑制作用。
3、抑菌圈法检测草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质抑菌活性
3.1草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质的制备
将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004接种到KB液体培养基(100mL/500mL锥形瓶)，25℃160r/min振荡培养36h得到种子液，按5％的接种量转接到KB液体培养基(100mL/500mL锥形瓶)，25℃160r/min振荡发酵培养96h，10000r/min离心15min取上清液并用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，收集滤液得到草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质。
3.2桃褐腐病菌孢子悬浮液制备
桃褐腐病菌—美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola(Wint.)Honey)在PDA平板上25℃培养5-7天，待平板上产生大量的分生孢子后，用无菌水洗下孢子，制成106CFU/ml的病原菌孢子悬液。
3.3抑菌圈法检测草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质对桃褐腐病菌的抑菌活性
取200μL3.2的病原菌孢子悬液均匀涂布在9cm PDA平板上，用7mm无菌打孔器等距离打制两个孔，向孔内分别注入3.1的草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质和无菌KB液体培养基(对照)100μL，每个处理三次重复，25℃恒温培养48h，十字交叉法测量抑菌圈的直径。结果表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质的抑菌圈直径为23mm(图2中C)，表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004在发酵过程中产生了抑制桃褐腐病菌的活性物质。
4、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对桃褐腐病室内离体防效检测
以本申请的发明人从西藏林芝色季拉山海拔4530m高山草甸土壤中分离得到的编号为ZLZ261的另一株不产几丁质酶的山岗单胞菌，即山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261(W.LIU,et al.Collimonas sp.ZLZ261—A novel antagonistic strain against Moniliniafructicola.Phytopathology103(Suppl.2):S2.84.VOLUME103,NUMBER6(SUPPLEMENT)JUNE2013)为对照菌株，按照与草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004相同的实验方法测定山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261对桃褐腐病室内离体防效。具体方法如下：
4.1草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质的制备
将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004接种到KB液体培养基(100mL/500mL锥形瓶)，25℃160r/min振荡培养36h得到种子液，按5％的接种量转接到KB液体培养基(100mL/500mL锥形瓶)，接种后的KB液体培养基的OD600nm值为0.1，25℃160r/min振荡发酵培养96h，10000r/min离心15min取上清液并用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，收集滤液得到草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质。
4.2山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261活性物质的制备
将步骤4.1草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质的制备中的草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004替换为山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261，其它步骤均不变，得到山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261的活性物质，具体方法如下：
山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261接种到KB液体培养基(100mL/500mL锥形瓶)，25℃160r/min振荡培养36h得到种子液，按5％的接种量转接到KB液体培养基(100mL/500mL锥形瓶)，接种后的KB液体培养基的OD600nm值为0.1，25℃160r/min振荡发酵培养96h，10000r/min离心15min取上清液并用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，收集滤液得到山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261活性物质。
4.3、对桃褐腐病防效测定
实验重复三次，每次重复的实验方法如下：挑选品种、成熟度(90％)、物理状态一致，大小均匀，无机械损伤、无病虫害侵染的新鲜市售毛桃为供试果实。先用0.5％NaClO将果实处理1min，用无菌水多次冲洗干净。在桃子果实腰部用无菌接种针刺5mm(深)×3mm(宽)的伤口，伤口晾干后，将60个桃子果实随机均分为5组，每组12个桃子果实，分别为处理A(阴性对照)、处理B、处理C、处理D和处理E。处理A的每个桃子果实接种50μl无菌水，待完全吸收后，接种50μl106CFU/ml的桃褐腐病菌—美澳型核果链核盘菌(Moniliniafructicola(Wint.)Honey)孢子悬浮液；处理B的每个桃子果实接种50μl步骤4.1的草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质，待完全吸收后，接种50μl106CFU/ml的桃褐腐病菌—美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola(Wint.)Honey)孢子悬浮液；处理C的每个桃子果实接种50μl50％多菌灵可湿性粉剂500倍液(简称500×多菌灵)，待完全吸收后，接种50μl106 CFU/ml的桃褐腐病菌—美澳型核果链核盘菌(Moniliniafructicola(Wint.)Honey)孢子悬浮液；处理D的每个桃子果实只接种50μl无菌水，不接种桃褐腐病菌孢子悬浮液；处理E的每个桃子果实接种50μl步骤4.2的山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261活性物质，待完全吸收后，接种50μl106CFU/ml的桃褐腐病菌—美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola(Wint.)Honey)孢子悬浮液。25℃，保湿培养5天后，统计各处理发病情况和病斑直径。根据病斑直径按照如下公式计算桃褐腐病的防治效果：防治效果(％)＝(处理A病斑直径－相应处理的病斑直径)/处理A病斑直径×100％。
表3、接种桃褐腐病菌5天时各个处理对桃褐腐病的防治效果
| 处理 | 病斑直径(mm) | 防治效果(％) |
| A | 33.0±0.6 | 0 |
| B | 4.5±0.5 | 86.4 |
| C | 2.5±0.2 | 92.4 |
| D | 0 | - |
| E | 19.5±0.5 | 40.9 |
结果如图3和表3所示，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质能够明显抑制桃褐腐病病斑的扩展，病斑面积显著低于阴性对照处理。其中，只接桃褐腐病菌孢子悬浮液的阴性对照在接种桃褐腐病菌2天后已全部发病，而用草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质和500×多菌灵处理后的桃子均未出现病斑；在接种桃褐腐病菌后的第5天调查时，阴性对照病斑直径均在32 mm以上，而接种了草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质的果实发病率在50％以下，且发病果实的病斑直径都远远小于阴性对照(图3)，仅为7mm左右，对桃褐腐病的防治效果为86.4％；接种了山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261活性物质的果实发病率为100％，发病果实的病斑直径为20mm左右，对桃褐腐病的防治效果为40.9％。可见，草甸山岗单胞菌(Collimonaspratensis)JZB120004产生的代谢物对桃褐腐病的防治效果是山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261产生的代谢物的2.1倍。
实施例3、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004生防相关性状检测
磷酸酯酶检测试验：采用点接法将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004接种于磷酸酯酶检测培养基，于25℃恒温培养，分别在3天、6天、9天、14天观察菌落周围有无透明圈形成，如有则为阳性，反之为阴性。
嗜铁素(CAS)检测试验：将活化好的草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004菌株点接于嗜铁素检测培养基，25℃培养5-7d，观察菌落外围是否产生黄色晕圈。
纤维素酶检测试验：将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004点接于纤维素水解培养基，25℃培养5d，用4g/L的刚果红染色5min，再用0.9％NaCl冲洗，观察菌落周围有无透明圈形成，如有则为阳性，反之为阴性。
蛋白酶检测试验：将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004菌株点接于蛋白酶检测培养基，25℃培养3-4d，观察菌落周围是否有透明圈产生，如有则为阳性，反之为阴性。
几丁质酶检测试验：将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004接种于几丁质酶检测培养基，25℃培养10-14d，观察菌落周围是否有透明圈产生，如有则为阳性，反之为阴性。
检测生防相关性状的结果显示：草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004能够产生蛋白酶、几丁质酶、磷酸酯酶、嗜铁素，未检测到纤维素酶(图4)。
实施例4、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004中蛋白酶Capro基因的获得
1、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的蛋白酶活性测定
采用透明圈法，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004在KB平板上划线接种，25℃静置培养48-72h，挑单菌落点接于蛋白酶检测培养基，25℃培养3-5d，以接种于1.5％水琼脂培养基的处理为对照，观察菌落周围是否有透明圈产生。结果表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004菌株在蛋白酶检测平板上25℃培养4d后，菌落直径为0.5cm，菌落周围产生了明显的透明圈，其直径为3.6cm，透明圈直径/菌落直经的比值达到7.2(图5)，表明其扩散至培养基中的代谢产物具有很强的蛋白酶活性。
2、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004基因组文库的构建及阳性克隆子的筛选
2.1基因组DNA的部分消化及目的片段回收
用BamH Ⅰ对草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004基因组DNA进行部分酶切，反应体系为50μL：10×buffer K5μL，BamH Ⅰ1μL，基因组DNA20μL，ddH2O24μL。同时设置6个平行反应，其中一份用ddH2O替代酶作为对照，37℃恒温反应；每20min取出一份反应产物，加5μL10×loading buffer置于-20℃终止反应；0.7％琼脂糖凝胶电泳检验酶切反应程度。BamH I酶切不同时间的结果表明，草甸山岗单胞菌(Collimonaspratensis)JZB120004基因组DNA在酶切反应时间低于60min时酶切不充分；当酶切60min时，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004基因组DNA消化程度符合试验要求(图6)；时间超过90min，酶切过度，片段多为小片段，不利于建库。因此，试验选酶切60min作为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004基因组DNA部分消化时间。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化1-7.5kb DNA酶切片段，-20℃保存备用。
2.2质粒酶切及去磷酸化
BamH Ⅰ酶切质粒pUC118，反应体系为50μL：10×buffer K5μL，BamH Ⅰ2.5μL，pUC118 25μL，ddH2O17.5μL，37℃反应3h，0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收质粒酶切片段进行去磷酸化，反应体系为50μL：10×buffer5μL，质粒酶切回收片段20μL，CIAP1μL，ddH2O24μL，37℃保温30min后，65℃反应30min灭活CIAP，普通DNA产物回收试剂盒回收目的片段，-20℃保存备用。
2.3表达载体的构建及转化
T4DNA Ligase连接基因组酶切片段与pUC118载体酶切去磷酸化片段，热击法转入大肠杆菌DH5α，涂布于LB平板(含100μg/mL氨苄青霉素、24μg/mL IPTG、40μg/mL X-Gal)，37℃静置培养过夜，随机挑选20个白色转化子利用通用引物BcaBEST Primer M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和BcaBEST Primer RV-M(5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)进行菌落PCR检测文库平均插入片段的大小。扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性40s；53℃退火40s，72℃延伸1min30s，运行35个循环；最后72℃延伸10min。随机挑选10000个阳性转化子作为文库保存。
2.4含有草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004蛋白酶基因阳性克隆的筛选
将构建好的基因组文库涂布于重组子筛选平板(含100μg/mL氨苄青霉素、24μg/mLIPTG)，37℃恒温培养2d，观察到有一重组子菌落周围出现明显的透明圈(图7中A)，将该重组子中含有的重组质粒命名为pUC118-capro，将该重组子命名为重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro。
将pUC118导入大肠杆菌DH5α得到的重组子命名为重组大肠杆菌DH5α/pUC118，作为空载载体转化子。
按照步骤1的方法测定重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro和重组大肠杆菌DH5α/pUC118的蛋白酶活性(图7中B)，表明重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro菌落周围产生了明显的透明圈，重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro能产生蛋白酶，已携带了蛋白酶基因，将该基因命名为capro。重组大肠杆菌DH5α/pUC118菌落周围没有产生透明圈，不产生蛋白酶。
2.5草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004蛋白酶基因序列测定及结构分析
酶切验证重组质粒pUC118-capro插入片段大小约为1.5kb左右(图8)，测序结果表明pUC118-capro为用SEQ ID No.1的DNA分子替换pUC118的BamH Ⅰ位点得到的重组表达载体。SEQ ID No.1由1475个核苷酸组成，其编码序列是SEQ ID No.1的第228-1319位，编码SEQ ID No.2的蛋白质Capro。SEQ ID No.2由363个氨基酸组成，其中酸性氨基酸29个，碱性氨基酸个28个，所有氨基酸组成中，丙氨酸(Ala)含量最高，为13.8％，甲硫氨酸(Met)含量最低，为0.6％。ExPASy服务系统中ProtParam软件计算结果表明该基因编码蛋白的分子量为37.97kDa，理论等电点6.65，不稳定系数28.01，总平均疏水性-0.264，是一个稳定的亲水蛋白。
3、蛋白酶基因的诱导表达及检测
将蛋白酶基因阳性转化子—重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro接种于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃180r/min振荡培养过夜，再按1％的接种量转接一次，以同样的培养条件培养至菌液的OD600值达0.5，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，30℃180r/min分别诱导培养24h和48h，4000r/min离心10min，收集上清液，诱导培养24h的上清液即为重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养24h总蛋白溶液，诱导培养48h的上清液即为重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养48h总蛋白溶液。
同时，将重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro接种于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃180r/min振荡培养过夜，再按1％的接种量转接一次，以同样的培养条件培养至菌液的OD600值达0.5，30℃180r/min培养48h，4000r/min离心10min，收集上清液，该上清液即为重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro非诱导培养48h总蛋白溶液。
同时，将重组大肠杆菌DH5α/pUC118接种于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃180r/min振荡培养过夜，再按1％的接种量转接一次，以同样的培养条件培养至菌液的OD600值达0.5，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，30℃180r/min诱导培养48h，4000r/min离心10min，收集上清液，该上清液即为重组大肠杆菌DH5α/pUC118的诱导培养48h总蛋白溶液。
按照步骤1的方法测定重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养24h总蛋白溶液、重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养48h总蛋白溶液、重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro非诱导培养48h总蛋白溶液和重组大肠杆菌DH5α/pUC118的诱导培养48h总蛋白溶液的蛋白酶活性，各孔加液量均为100μL，结果表明重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养24h总蛋白溶液、重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养48h总蛋白溶液可见明显的透明圈，说明其具有蛋白酶活性，且诱导培养48h的酶活性强于培养24h的，而重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro非诱导培养48h总蛋白溶液和重组大肠杆菌DH5α/pUC118的诱导培养48h总蛋白溶液的对照均未见透明圈(图9)，由此证明了蛋白酶capro基因已在大肠杆菌DH5α中诱导表达；经SDS-PAGE(12％的分离胶和5％的浓缩胶)电泳法检测蛋白酶capro基因的表达见图10。经验证,此蛋白酶capro分子量大约为38kDa。
实施例5、利用草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和含有蛋白酶Capro基因的工程菌生产蛋白酶生物学特性检测
1.1蛋白酶酶活测定
草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004在KB液体培养基中25℃160r/min振荡培养3-5d，4000r/min离心10min，收集上清液，该上清液即为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的总蛋白溶液。
将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的总蛋白溶液和实施例4步骤3中的重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养48h总蛋白溶液分别在pH7.5、150mmol/L的PBS缓冲液中用孔径为3.5kDa透析袋透析处理，真空冷冻干燥至粉状即为粗酶粉样品，取1mg粗酶样品溶解于10mL蒸馏水得粗酶液。采用Folin法测定粗酶液酶活，反应温度为30℃，pH值7.5，反应时间：10min，反应体积为4mL。具体方法如下：
(1)Folin试剂的配制
于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2Wo4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g、去离子水700mL、85％磷酸50mL、浓盐酸100mL，温火沸腾回流10h；在通风橱中加入硫酸锂(Li2SO4)100g、去离子水50mL和数滴浓溴水(99％)，再微沸15min，以除去多余的溴，冷却，用去离子水定溶至1000ml。混匀过滤。贮存于棕色瓶内备用。
使用溶液：一份福林试剂与二份去离子水混合，摇匀。
(2)10g/L酪蛋白底物溶液配制
精确称取酪蛋白1g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的磷酸缓冲液(pH＝7.5)约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用磷酸缓冲液(pH＝7.5)稀释至刻度。当天配用或置于冰箱中保存3d。
(3)100μg/mL酪氨酸溶液配制
精确称取100mg酪氨酸，逐步加入0.lmol/L盐酸溶解后，用去离于水定容至100mL放入冰箱中保存，临用时用去离子水稀释10倍。
(4)酪氨酸标准曲线的绘制
分别吸取100μg/mL酪氨酸溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于试管中，并用去离子水稀释至1mL，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00mL、Folin试剂使用溶液1.00mL，置于30℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的处理为空白对照，分别测定其吸光度。以吸光值OD680为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线，线性回归求直线方程，计算当吸光值为1时酪氨酸的量(μg/mL)，即为吸光常数K值。
(5)样品酶活测定
粗酶液用去离子水稀释至吸光值在0.25～0.40范围内，取1mL加入试管中，30℃水浴3min，加入同样预热过的10g/L酪蛋白底物溶液1mL，精确反应10min，加0.4mol/L三氯乙酸2mL中止反应，混匀，30℃水浴沉淀15min，过滤，取1.00mL滤液，加0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，再加Folin试剂使用液1mL,混匀，30℃水浴显色20min，冷却后于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度；对照在加2％酪蛋白前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL使酶失活再加酪蛋白。
以30℃、pH7.5条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位(U)，按下式计算1mL粗酶液中所含的酶活力单位：
酶活力(U/mL)＝K×OD680×N×4/10
式中N为酶的稀释倍数，4为反应体积，10为反应时间(min)。
实验重复三次。结果表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004在上述发酵条件下制备的粗酶液的蛋白酶酶活为(48.594±1.36)U/mL，换算成粗酶粉的酶活为(485.94±13.6)U/mg；重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的粗酶液和粗酶粉蛋白酶酶活分别为(47.839±1.05)U/mL和(478.39±10.5)U/mg。
1.2温度对蛋白酶活性的影响
取200μL粗酶液与800μL1％酪蛋白溶液(pH7.5)混匀，分别在0-60℃条件下测定酶活力，以最高酶活力为100％，计算其他条件下的相对酶活力，绘制酶活力温度曲线。除酶反应温度不同外，蛋白酶活测定方法的其它条件与1.1蛋白酶酶活测定相同。
结果表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro所产的Capro最适温度均为30℃，在30℃～40℃范围内酶活力较高，40℃以上酶活力急骤下降，而在10℃时仍保持在70％以上(图11)，表现出低温蛋白酶特性。
1.3pH对蛋白酶活性的影响
设置pH4-10的梯度缓冲液(pH4-5采用醋酸-醋酸钠缓冲液，pH6-8采用磷酸盐缓冲液，pH9-10采用Gly-NaOH缓冲液)，粗酶液分别在各pH梯度缓冲液中室温处理60min，测定酶活，以最高酶活力为100％，绘制酶活力pH曲线。除酶反应pH不同外，蛋白酶活测定方法的其它条件与1.1蛋白酶酶活测定相同。
结果表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro所产的Capro，不同的pH条件也影响其酶活性，最适作用pH为7，在pH6.5～7.5范围内活性较高，过酸或过碱的环境均对酶活有较大的抑制作用(图11)，属中性蛋白酶。
1.4金属离子对蛋白酶活力的影响
取浓度为10mmol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+等10种金属离子及金属蛋白酶抑制剂EDTA(pH7.0)分别与粗酶液混合，使离子终浓度为10mmol/L，除离子浓度不同外，蛋白酶活测定方法的其它条件与步骤1.1蛋白酶酶活测定相同。以粗酶液在步骤1.1的条件下测定的酶活力为100％(CK)，检测各处理对酶活力的影响，实验重复三次，并利用SPSS软件通过Fischer’s最小显著差数法进行差异显著性分析。
金属蛋白酶抑制剂EDTA及金属离子对Capro酶活影响试验结果显示(表4)，该蛋白酶对EDTA非常敏感，10mmol/L的浓度就可使酶基本失活。各种金属离子对蛋白酶活性的影响存在差异。Zn2+、Mn2+对酶活有激活作用，当Zn2+浓度为10mmol/L时，重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro所产蛋白酶的酶活力是在步骤1.1的条件下测定的酶活力的171.43±6.3％，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004所产蛋白酶的酶活力是在步骤1.1的条件下测定的酶活力的172.45±2.3％；Na+、K+对酶活无显著影响；而Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+和Mg2+则对酶活表现出了抑制作用，其中以Co2+的抑制作用最强，其浓度为10mmol/L时，重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro和草甸山岗单胞菌(Collimonaspratensis)JZB120004的蛋白酶酶活分别仅为在步骤1.1的条件下测定的酶活力的10.71±5.1％和15.82±2.8％；Ca2+和Mg2+抑制作用较弱。由此可见，Capro具有金属蛋白酶的典型特征。
表4、不同金属离子处理对酶活力的影响
注：表中相对酶活为平均值±标准差；其后的小写字母仅表示差异显著性分析结果，同一列内带有不同字母的均值在a＝0.05水平上具有显著性差异。
SPSS独立样本t检验的结果表明，不同温度、pH及金属离子对Capro酶活性的影响在草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro之间均无显著性差异。
Claims (10)
1.草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis),其菌株号为JZB120004，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.9193。
2.植物褐腐病菌抑制剂，它的活性成分是权利要求1所述的草甸山岗单胞菌和/或权利要求1所述的草甸山岗单胞菌的代谢物。
3.植物褐腐病抑制剂，它的活性成分是权利要求1所述的草甸山岗单胞菌和/或权利要求1所述的草甸山岗单胞菌的代谢物。
4.权利要求1所述的草甸山岗单胞菌和/或权利要求1所述的草甸山岗单胞菌的代谢物的下述任一应用：
A)权利要求1所述的草甸山岗单胞菌和/或权利要求1所述的草甸山岗单胞菌的代谢物在制备植物褐腐病菌抑制剂中的应用；
B)权利要求1所述的草甸山岗单胞菌和/或权利要求1所述的草甸山岗单胞菌的代谢物在抑制植物褐腐病菌中的应用；
C)权利要求1所述的草甸山岗单胞菌和/或权利要求1所述的草甸山岗单胞菌的代谢物在制备植物褐腐病抑制剂中的应用；
D)权利要求1所述的草甸山岗单胞菌和/或权利要求1所述的草甸山岗单胞菌的代谢物在抑制植物褐腐病中的应用。
5.根据权利要求2所述的植物褐腐病菌抑制剂、权利要求3所述的植物褐腐病抑制剂，或权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物褐腐病菌为桃褐腐病菌；所述植物褐腐病为桃褐腐病。
6.权利要求1所述的草甸山岗单胞菌在生产生产蛋白酶中的应用。
7.权利要求1所述的草甸山岗单胞菌在生产几丁质酶中的应用。
8.权利要求1所述的草甸山岗单胞菌在生产淀粉酶中的应用。
9.权利要求1所述的草甸山岗单胞菌在生产氧化酶中的应用。
10.权利要求1所述的草甸山岗单胞菌在生产嗜铁素中的应用。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104946567A (zh) * | 2015-07-02 | 2015-09-30 | 北京市农林科学院 | 一株深褐芽孢杆菌及其应用 |
| CN104946567B (zh) * | 2015-07-02 | 2018-03-23 | 北京市农林科学院 | 一株深褐芽孢杆菌及其应用 |
| CN106520648A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-03-22 | 北京市农林科学院 | 对链核盘菌具有抑制活性的重组山冈单胞菌及其构建方法与应用 |
| CN106520648B (zh) * | 2016-10-28 | 2019-11-26 | 北京市农林科学院 | 对链核盘菌具有抑制活性的重组山冈单胞菌及其构建方法与应用 |
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| CN104004680B (zh) | 2016-07-13 |
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