WO2013038575A1 - コリモナス（Collimonas）属細菌を用いた植物病原菌の増殖抑制方法 - Google Patents

コリモナス（Collimonas）属細菌を用いた植物病原菌の増殖抑制方法 Download PDF

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阿野貴司
廣瀬陽一郎
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一般社団法人新環境技術評議会
学校法人近畿大学
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    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a method for inhibiting the growth of plant pathogenic bacteria using microorganisms, and more particularly, to a method for inhibiting the growth of plant pathogenic bacteria using bacteria belonging to the genus Collimonas.
  • Fusarium genus bacteria and Rhizoctonia genus bacteria represented by seedling blight are known as pathogens of soil infectious diseases.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 Plant pathogens using colimonas bacteria Studies have been carried out to suppress the growth of potato.
  • Wieste de Boer Johan H. J. Leveau, George A. Kowalchuk, Paulien J. A. Klein Gunnewiek, Edwin C. A. Abeln, Marian J. Figge, Klaas Sjollema, Jjo Collimonas fungivorans gen. Nov., Sp. Nov., A chitinolytic soil bacterium with the ability to grow on living fungal hyphae. Francesca Mela, Kathrin Fritsche, Wietse de Boer, Johannes A van Veen, Leo H de Graaff, Marlies van den Berg and Johan HJ Leveau: Dual transcriptional profiling of a bacterial / fungals Faina Kamilova, Johan H. J.
  • Leveau and Ben Lugtenberg Collimonas fungivorans, an unpredicted in vitro but efficient in vivo biocontrol agent for the suppression of tomato foot and root rot
  • Sachie Hoppener-Ogawa Ecology of mycrophagous Collimonas bacteria in soil Uroz, S., et al., Bacterial weathering and its contribution to nutrient cycling in temperate forest ecosystems, Research in Microbiology (2011) Barbara Vu, Miao Chen, Russell J. Crawford and Maria P. Ivanova: Bacterial Extracellular Polysaccharides Involved in Biofilm. Wieste de Boer, Johan H. J. leveau, George A.Kowalchuk, paulien J. A.
  • Collimonas bacteria are known as microorganisms that grow in an oligotrophic environment, for example, microorganisms that grow on a 1/10 TSB medium or R2A medium diluted 10-fold in a TSB medium and difficult to grow on a medium rich in nutrients. (Non-Patent Document 5).
  • Collimonas bacteria are known as phagocytic effects of phytopathogenic fungi, but this phagocytic action is expressed when there is no nutrient source in addition to phytopathogenic fungi. It has not been confirmed that it is expressed in the source medium.
  • an object of the present invention is to provide a novel method for suppressing the growth of phytopathogenic fungi using bacteria belonging to the genus Collimonas.
  • the D-25 strain grows well on a nutrient-rich medium, and the growth of the phytopathogenic fungi Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum is suppressed on a nutrient-rich medium.
  • the present invention has been discovered.
  • the present invention is a method for inhibiting the growth of phytopathogenic fungi, characterized by culturing a microorganism belonging to the genus Collimonas, having the ability to inhibit the growth of phytopathogenic fungi, and inoculating the cultured microorganism in plant soil. is there.
  • the microorganism can be effectively inhibited from growing plant pathogens by culturing on a medium that does not dilute the medium components to form a biofilm.
  • the microorganism is a microorganism selected from the D-25 strain deposited under the deposit number NITE P-1104, the Collimonas NBRC3740 strain, the Collimonas fungivorans DMZ17622 strain.
  • the plant pathogen is a filamentous fungus belonging to the genus Rhizoctonia or the genus Fusarium.
  • FIG. 1 The figure which shows the proliferation on the TSA culture medium (24 degreeC) of D-25 stock
  • FIG. 11 is a diagram showing the growth inhibition of plant pathogens Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum by D-25 strain, and (a) only Rhizoctonia solani cultured on TSA medium (B) Rhizoctonia solani inoculated on TSA medium in which D-25 strain was cultured, (c) Fusarium oxysporum only cultured on TSA medium, (d) ) Inoculated Fusarium oxysporum on TSA medium in which D-25 strain was cultured.
  • FIG. 7 is a diagram showing the growth inhibition of the phytopathogenic fungus Rhizoctonia by the D-25 strain phagocytosed from the R2A medium to the TSA medium, (a) only Rhizoctonia solani (Rhizoctonia) cultured on the TSA medium; (B) One day culture of the D-25 strain inoculated on the TSA medium followed by inoculation with Rhizoctonia solani, (c) Two days on the D-25 strain inoculated on the TSA medium Inoculated with Rhizoctonia solani after culturing, It is a figure which shows the growth suppression of the phytopathogenic fungus Fusarium oxysporum (Fusarium oxysporum) by the D-25 stock
  • FIG. 6 is a diagram showing the growth inhibition of the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani by the D-25 strain when the cycle of transferring the D-25 strain from the R2A medium to the TSA medium is set to 2 times, (a) the TSA medium On top of this, only Rhizoctonia ani solani was cultured, and (b) the second inoculation of D-25 strain into TSA medium, and at the same time, Rhizoctonia ani solani was inoculated on TSA medium (C) One day after the second inoculation of the D-25 strain into the TSA medium, Rhizoctonia solani was inoculated into the TSA medium.
  • FIG. 7 is a diagram showing the growth inhibition of the plant pathogenic fungus Fusarium oxysporum by the D-25 strain when the cycle of transferring the D-25 strain from the R2A medium to the TSA medium is set to 2 times, (a) the TSA medium On top of this, only Fusarium oxysporum was cultured, and (b) Fusarium oxysporum was inoculated into TSA medium at the same time as the second inoculation of D-25 strain into TSA medium. (C) One day after the second inoculation to the TSA medium of D-25 strain, Fusarium oxysporum was inoculated.
  • FIG. 11 is a diagram showing the suppression of the growth of the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani by the D-25 strain when the cycle of transferring the D-25 strain from the R2A medium to the TSA medium is four times, (a) the TSA medium Above, only Rhizoctonia solani was cultured, (b) D-25 strain was inoculated into TSA medium at the same time, Rhizoctonia solani was inoculated into TSA medium (C) One day after the fourth inoculation of the D-25 strain to the TSA medium, and then inoculated with Rhizoctonia solani.
  • FIG. 11 is a diagram showing the suppression of the growth of the plant pathogenic fungus Fusarium oxysporum by the D-25 strain when the cycle of transferring the D-25 strain from the R2A medium to the TSA medium is set to 4 times, (a) the TSA medium On top of this, only Fusarium oxysporum was cultured, and (b) Fusarium oxysporum was inoculated into TSA medium at the same time as the fourth inoculation of D-25 strain into TSA medium. (C) One day after the fourth inoculation of D-25 strain to TSA medium, and then inoculated with Fusarium oxysporum. Growth curve of D-25 strain at 24 ° C (2% inoculation) FIG.
  • FIG. 11 is a diagram showing the suppression of Rhizoctonia solani seeds of tomato (Solanum lycopersicum) and cucumber (Cucumis sativus) soaked in the culture solution of D-25 strain, and (a) Tomato (Solanum lycopersicum) Observation result, (b) Observation result of cucumber (Cucumis sativus), (c) Observation result of tomato (Solanum lycopersicum) when distance between D-25 strain and Rhizoctonia solani is increased, (d) The observation result of cucumber (Cucumis sativus).
  • FIG. 2 is an observation view of cucumber when 200 ⁇ l of D-25 strain concentrate is dropped.
  • the D-25 strain according to the present invention was cultured using solid and liquid media.
  • the medium used was TSB medium as liquid medium, 1/10 TSB medium diluted TSB medium 10 times, TSA medium obtained by solidifying the two liquid mediums as a solid medium with agar, 1/10 TSA medium, and R2A medium.
  • TSA medium obtained by solidifying the two liquid mediums as a solid medium with agar
  • TSA medium obtained by solidifying the two liquid mediums as a solid medium with agar
  • R2A medium R2A medium.
  • the components of the medium are as follows.
  • -TSB medium (1L) Polypeptone 20g Glucose 2.5g NaCl 5g K 2 HPO 4 2.5g 1/10 TSB medium (1 L) Polypeptone 2g Glucose 0.25g NaCl 0.5g K 2 HPO 4 0.25 g -TSA medium TSB medium solidified with 1.5% agar. 1/10 TSA medium 1/10 TSB medium solidified with 1.5% agar. ⁇ R2A medium (1L) Polypeptone 0.5g Yeast extract 0.5g Casamino acid 0.5g Glucose 0.5g Soluble starch 0.5g Pyruvate Na 0.3g K 2 HPO 4 0.3 g MgSO 4 0.05 g Agar 15g
  • the bacteria of the genus Collimonas are microorganisms that prefer an oligotrophic state such as the 1/10 TSB medium and the 1/10 TSA medium, and that growth is not observed under abundant nutritional conditions.
  • a confirmation experiment was conducted using the TSA medium.
  • the cultured bacteria of the genus Collimonas were centrifuged using a sterilized centrifuge tube, and the cells were collected. The collected cell supernatant was removed and suspended in 40 ml of sterilized water.
  • Bacteria belonging to the genus Bacillus which are usually used for biological pesticides, are highly auxotrophic, so they form spores and become inactive in the dormant state in soil environments where nutrient sources are scarce. Not often reported.
  • D-25 strain was used to carry out growth inhibition experiments against the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani.
  • Rhizoctonia solani In the R2A medium, 1/10 TSA medium, or PDA medium for filamentous fungi, the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani was used. No growth inhibition of (Rhizoctonia solani) was observed, and the D-25 strain was covered with the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani.
  • the growth of the D-25 strain was observed in the solid medium TSA medium in which the medium components were not diluted, and the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani (Rhizoctonia ⁇ ⁇ ⁇ solani) ) was observed to inhibit the growth of the phytopathogenic fungi Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum strain D-25.
  • Example Method 1 (1) The D-25 strain was inoculated from the R2A medium to the TSA medium and cultured at 24 ° C. for 2 days. (2) Paper with grid lines was pasted on the petri dish, and the D-25 strain was applied to the TSA medium along the lines. (3) Cultured overnight at 24 ° C. (4) The plant pathogen Rhizoctonia solani or Fusarium oxysporum was inoculated in the center of the petri dish and cultured at 24 ° C.
  • Example Method 2 (1) The D-25 strain was inoculated from the R2A medium to the TSA medium and cultured at 24 ° C. for 1 day. (2) The D-25 strain was inoculated from the R2A medium to the TSA medium and cultured at 24 ° C. for 2 days. (3) A paper with a square line was pasted on the petri dish, and the D-25 strain was applied along the line to each of the two types of TSA media. (4) The D-25 strain was further cultured for a predetermined period. (5) The plant pathogen Rhizoctonia solani or Fusarium oxysporum was inoculated at the center of the petri dish of the two TSA media and cultured at 24 ° C. for 7 days.
  • the D-25 strain is inoculated from the R2A medium, which is an oligotrophic medium, into the rich medium TSA medium and allowed to grow, and the proliferated D-25 strain is again inoculated into the R2A medium and allowed to grow. Thereafter, the D-25 strain grown on the R2A medium is again inoculated into the TSA medium, and the D-25 strain grown there is used to grow against the phytopathogenic fungi Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum. The inhibitory ability was examined.
  • the D-25 strain and the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani or Fusarium oxysporum are simultaneously used. Both the inoculum and the D-25 strain after one-day culture showed growth inhibitory effects of the phytopathogenic fungi Rhizoctonia ⁇ solani and Fusarium oxysporum. Therefore, it was confirmed that no mutation occurred in the ability to suppress the growth of phytopathogenic fungi even through the TSA medium in which the medium components were not diluted.
  • the cycle in which the D-25 strain was transferred from the R2A medium to the TSA medium was changed from 2 to 4 times, and the plant pathogens Rhizoctonia solani or Fusarium oxysporum were simultaneously inoculated. .
  • the D-25 strain was cultured for 1 day in the TSA medium after 4 cycles of the above cycle, and then inoculated with the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani or Fusarium oxysporum Each prepared.
  • standard for comparison is the same as the said Example, description is abbreviate
  • the D-25 strain was cultured in 2 ml of 1/10 TSB medium for 2 days at 24 ° C. and 200 rpm. Then, seeds of tomato (Solanum lycopersicum) and cucumber (Cucumis sativus) subjected to seed sterilization were pregerminated on an agar medium (Agar 2%), and then each seed was immersed in the culture solution of the D-25 strain, Inoculated on PDA medium. In addition, seeds of tomato (Solanumperslycopersicum) and cucumber (Cucumis sativus) not soaked in the culture solution were inoculated into the PDA medium as controls. After seed inoculation, the plant pathogen Rhizoctonia solani was inoculated at the center of the PDA medium, and the disease on seeds immersed in the culture medium and seeds not immersed was observed.
  • the D-25 strain was cultured in 2 ml of 1/10 TSB medium for 2 days at 200 rpm and 24 ° C. 100 ml of 1/10 TSB was added to a 500 ml flask, and 2% of the D-25 strain was inoculated therein and cultured at 120 rpm. After culturing, the strain D-25 was collected by centrifugation and resuspended in 1 ml of sterile distilled water.
  • the 1/10 PDA medium was inoculated with seeds of seed sterilized cucumber (Cucumistivsativus) (Control 4-1), and the 1/10 PDA medium was pre- germinated with seeds sterilized.
  • a cucumber (Cucumis sativus) seed and a plant pathogen Rhizoctonia solani inoculated (Control 4-2) were prepared.
  • cucumber (Cucumis sativus) seeds grew without any problems in Control 4-1 (FIGS. 12 (a) and (b)), while cucumber (Cucumis sativus) in Control 4-2.
  • Seeds are infected with the phytopathogenic fungus Rhizoctonia ani solani, the stem is brown, the roots are infected with hyphae and die (FIGS. 12 (c) and 12 (d)).
  • the liquid medium was TSB medium.
  • the D-25 strain was cultured in a TSB medium, and a 500 ml flask with 100 ml TSB added thereto was prepared.
  • the D-25 strain was inoculated therein and cultured. After culturing, the strain D-25 was collected by centrifugation and resuspended in 40 ml of sterile distilled water. 10 ml of this suspension of D-25 strain was added to a test tube containing 1/10 PDA medium, and the following test specimens were prepared to observe the ability to inhibit the growth of the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani.
  • the seeds of cucumber (Cucumis sativus) of test specimen 5-3 were infected with the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani in the same manner as test specimen 5-1, even when immersed in the culture medium of D-25 strain (Fig. 13 (c)).
  • the medium for culturing the D-25 strain was changed from a liquid medium to a solid medium TSA medium.
  • the D-25 strain cultured in the TSA medium was collected with a spatula, and the following test specimens were prepared to observe the growth inhibitory ability of the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani.
  • Biofilm Colonies cultured by such means are generally called “Biofilm”, and are mainly colonies of bacteria composed of exopolysaccharides.
  • an expression system of a gene different from a vegetative cell (planktonic cell) obtained by aeration and agitation culture usually used in biopesticides is suggested. From the results of this experiment, it was shown that the biofilm composition of the bacteria by solid culture or other culture means is effective in suppressing the growth of phytopathogenic fungi by the D-25 strain.
  • Rhizoctonia solani In order to confirm whether a substance that suppresses the growth of the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani is produced from the D-25 strain, an experiment on the inhibition of the growth of the (Rhizoctonia solani) using the supernatant of the D-25 strain was conducted. went.
  • the D-25 strain was cultured in 2 ml of 1/10 TSB medium for 2 days. Thereafter, 100 ml of 1/10 TSB medium was added to a 500 ml flask, 2% of the D-25 strain was inoculated therein, and cultured at 24 ° C. and 120 rpm for 5 days. The cultured D-25 strain is centrifuged at 15000 rpm, and 0.2 ⁇ m (ADVANTEC) filter sterilization is performed to obtain a supernatant of the D-25 strain.
  • ADVANTEC 0.2 ⁇ m
  • TSA medium was added to each of the obtained supernatants 1, 3, 5 and 10 ml to make 10 ml as a whole.
  • 1/10 TSA medium 1, 3, 5 ml was prepared instead of the supernatant, and the growth inhibitory ability of the plant pathogen Rhizoctonia solani was examined for each test specimen.
  • the growth inhibitory ability of the phytopathogenic fungus was not observed even when 5 ml of the supernatant of the culture solution of the D-25 strain was used. Therefore, the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani was used. It was determined that no antibacterial active substance that suppresses the growth of the D-25 strain was produced. That is, the D-25 strain can suppress the growth of the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani without relying on antibiotics produced by bacteria normally used in biological pesticides.
  • an experiment for inhibiting the growth of the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani was performed using a bacterium belonging to the genus Collimonas other than the D-25 strain.
  • the NBRC3740 strain (former name: Janthinobacterium lividum) is used as a bacterium belonging to the genus Collimonas.
  • the NBRC3740 strain grown in liquid culture is used to compare the growth inhibitory ability of phytopathogenic fungi with the D-25 strain using the NBRC3740 strain grown on an agar medium. did.
  • the D-25 strain was cultured using a TSA medium, and the NBRC3740 strain was grown using a double water medium, and the bacterial cells were collected and compared for their ability to inhibit the growth of plant pathogens. ⁇ ⁇ Because there was a concern that the number of NBRC3740 strains was small, NBRC3740 strain was applied to 15 double water culture media and then collected with a spatula. After each collected bacteria was applied to a petri dish, a plant pathogen Rhizoctonia solani was inoculated at the center and cultured at 24 ° C. for 3 days.
  • the D-25 strain suppresses the growth of the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani, while the NBRC 3740 strain has the mycelium growing to the outer enclosure.
  • the D-25 strain uses one TSA medium and the NBRC3740 strain uses 15 condensate medium cells.
  • the NBRC3740 strain is D-25. It is used much more than the bacterial cells of the strain. However, no significant suppression was observed compared to the D-25 strain.
  • the D-25 strain and the Collimonas fungivorans DMZ17622 strain are respectively applied in a grid pattern to 1/10 TSA medium. Thereafter, the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani was inoculated in the center of the culture medium to compare the growth inhibitory ability of the plant pathogenic fungi.
  • the culture medium to be cultured was replaced with the TSA medium, and the inhibitory ability of the plant pathogenic bacteria of the D-25 strain and the Collimonas fungivorans DMZ17622 strain was compared.
  • the D-25 strain and Collimonas gi fungivorans DMZ17622 strain were applied in a square shape so as to be double-wrapped on the TSA medium, and then the plant pathogen Rhizoctonia solani was inoculated in the center of the medium, 25
  • the growth-inhibitory ability of the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani by the above-mentioned two strains was compared after culturing at °C.
  • FIG. 19 is a photograph on the 4th day of culture.
  • the two strains have the same ability to suppress the growth of the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani, both of which have the central portion of the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani. I was trapped in the square. However, it was confirmed that the Collimonas fungivorans DMZ17622 strain had a faster growth speed and stronger adhesion than the D-25 strain.
  • Example 9 the Collimonas fungivorans DMZ17622 strain was used for trial purposes, and it has been found that this bacterial species depends on the known phagocytic action of chitinase (non-patent literature). 7). From these experimental results, it was strongly suggested that the chitinase produced by the microbial cells is the main activity mechanism of the ability to suppress the growth of phytopathogenic bacteria in the bacteria of the genus Collimonas.
  • the three bacterial cells (D-25 strain, NBRC3740 strain, and DMZ17622 strain) used in the embodiments of the present invention have a remarkable inhibitory activity in an oligotrophic medium such as 1/10 TSB provided in past experiments. Although it was confirmed that it does not show, its hidden control ability is not the state of vegetative cells by aeration and agitation culture generally used in bacterial culture, but provides a solid biofilm culture in which nutrient sources are normally present As a result, it was confirmed that it appeared remarkably. Moreover, although there is a difference in the ability to suppress the growth of plant pathogenic bacteria, it can be said that it is inherent in all bacteria of the genus Collimonas.
  • exopolysaccharides which are the main composition of biofilms produced by bacteria, have been reported to have antibacterial activity. It is also possible that this is a synergistic effect of the bacterium belonging to the genus Collimonas) and the exopolysaccharide.
  • Non-Patent Document 9 it is suggested that Collimonas genus bacteria are slime (refers to a biofilm) when they encounter phytopathogenic fungi under oligotrophic conditions and in an excessive stress state. It is shown that antibacterial activity is expressed. Furthermore, in this document, Xanthomonas bacteria are slime to dissipate excess carbon sources under acid stress and growth arrest, and the same is true for Collimonas bacteria. This suggests the possibility of the phenomenon.
  • Non-Patent Document 9 a strain that exhibits the ability to suppress the growth of phytopathogenic fungi in an oligotrophic environment such as 1/10 TSB such as Collimonas fungivorans Ter331 is used, and finally, Collimonas (Collimonas It is concluded that the gene expression governing the phagocytic ability of the genus bacteria is in an oligotrophic environment.
  • the present invention has succeeded in developing its ability by eutrophication to form a biofilm even for cells that do not exhibit remarkable ability to suppress the growth of phytopathogenic bacteria in an oligotrophic environment.
  • the genus Collimonas is a colony in a culture environment different from the natural world, When it is introduced into exotic soil, even if the soil is in an oligotrophic environment, it maintains the same viability as the number of bacteria that normally live in the natural world. You can expect.
  • the phytopathogenic fungi Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum shown in the above embodiment are also used. It is thought that the growth inhibitory effect of can be demonstrated.

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Abstract

　植物性病原菌の増殖抑制方法を提供すること。　植物病原菌の増殖抑制能を有し、コリモナス（Collimonas）属に属する微生物を培養し、当該培養した微生物を植物土壌に植菌することを特徴する植物病原菌の増殖抑制方法。

Description

コリモナス（Collimonas）属細菌を用いた植物病原菌の増殖抑制方法
　この発明は、微生物を用いた植物病原菌の増殖抑制方法に関するものであり、特に、コリモナス（Collimonas）属細菌を用いた植物病原菌の増殖抑制方法に関する。
　従来から、土壌伝染性病害の病原菌としてフザリウム（Fusarium）属菌や苗立枯病に代表されるリゾクトニア（Rhizoctonia）属菌が知られている。
　これら植物病原菌を防除するために特殊な化学成分を有する農薬が種々検討、提案されている他、化学農薬とは異なる別のアプローチが検討されており、例えば、コリモナス属細菌を用いて植物性病原菌の増殖を抑制する研究が行われている（非特許文献１～４）。
Wieste de Boer, Johan H. J. Leveau, George A. Kowalchuk, Paulien J. A. Klein Gunnewiek, Edwin C. A. Abeln, Marian J. Figge, Klaas Sjollema, Jaap D. Janse and Johannes A. van Veen: Collimonas fungivorans gen. nov., sp. nov., a chitinolytic soil bacterium with the ability to grow on living fungal hyphae. Francesca Mela, Kathrin Fritsche, Wietse de Boer, Johannes A van Veen, Leo H de Graaff, Marlies van den Berg and Johan HJ Leveau: Dual transcriptional profiling of a bacterial/fungal confrontation: Collimonas fungivorans versus Aspergillus niger Faina Kamilova, Johan H. J. Leveau and Ben Lugtenberg: Collimonas fungivorans, an unpredicted in vitro but efficient in vivo biocontrol agent for the suppression of tomato foot and root rot Sachie Hoppener-Ogawa: Ecology of mycrophagous Collimonas bacteria in soil Uroz, S., et al., Bacterial weathering and its contribution to nutrient cycling in temperate forest ecosystems, Research in Microbiology(2011) Barbara Vu, Miao Chen, Russell J. Crawford and Elena P. Ivanova: Bacterial Extracellular Polysaccharides Involved in Biofilm. Wieste de Boer, Johan H. J. leveau, George A.Kowalchuk, paulien J. A. Klein Gunnewiek, Edwin C. A. Abeln, Marian J. Figge, Klaas Sjollema, Jaap D. Janse and Johannes A. Van Veen: Collimonas fungivorans gen. nov., sp. nov., a chitinolytic soil bacterium with the ability to grow on living fungal hyphae. 鈴木　志保、「新規多糖フィルムの物性と機能（Physical and functional properties of novel polysaccharide films」 Francesca Mela, Kathrin Fritsche, Wietse de Boer, Johannes A van Veen, Leo H de Graaff, Marlies van den Berg and Johan HJ Leveau: Dual transcriptional profiling of a bacterial/fungal confrontation: Collimonas fungivorans versus Aspergillus niger.
　コリモナス（Collimonas）属細菌は、貧栄養環境で増殖をする微生物、例えば、ＴＳＢ培地を１０倍に希釈した１／１０ＴＳＢ培地或いはＲ２Ａ培地において増殖し、栄養分が多い培地では増殖し難い微生物として知られている（非特許文献５）。
　また、コリモナス（Collimonas）属細菌は、植物性病原菌の食菌作用として知られているが、この食菌作用は植物性病原菌の他に栄養源がない場合に発現するものであり、豊富な栄養源の培地で発現されるということは確認されていない。
　そこで本発明は、コリモナス（Collimonas）属細菌を用いて植物性病原菌の増殖を抑制する新規な方法を提供することを目的とする。
　発明者らは、上記課題を解決するため、平成２３年６月９日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－１１０４として寄託されているコリモナス（Collimonas）属細菌Ｄ－２５株（以下、「Ｄ－２５株」という）を用いて、１／１０ＴＳＢ培地等とは異なる条件での培養を試み、また、この菌株が植物性病原菌の増殖を抑制することが可能か検討を行った。
　その結果、Ｄ－２５株が栄養分の多い培地上で良好に増殖すること、及び植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の増殖を、栄養分の多い培地上で抑制することを発見し、本発明に至った。
　なお、コリモナス（Collimonas）属細菌が植物性病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の増殖を、明確に抑制するという報告は、従前の貧栄養の培地条件であっても、栄養源が豊富な培地条件であっても、未だなされていない。
　即ち、本発明は、植物病原菌の増殖抑制能を有し、コリモナス（Collimonas）属に属する微生物を培養し、当該培養した微生物を植物土壌に植菌することを特徴する植物病原菌の増殖抑制方法である。
　前記微生物は、培地成分を希釈しない培地上で培養して、バイオフィルムを形成することで植物病原菌の増殖を効果的に抑制することができる。
　また、前記微生物は、寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－１１０４として寄託されているＤ－２５株、コリモナス（Collimonas）　ＮＢＲＣ３７４０株、コリモナス　フンギボランス（Collimonas　fungivorans）　ＤＭＺ１７６２２株の中から選択される微生物である。
　また、植物病原菌は、リゾクトニア（Rhizoctonia）属又はフザリウム（Fusarium）属に属する糸状菌である。
　本発明によれば、コリモナス（Collimonas）属細菌を用いて植物性病原菌の増殖を抑制する新規な方法を提供することができる。
Ｄ－２５株のＴＳＡ培地上（２４℃）における増殖を示す図。 Ｄ－２５株のＴＳＡ培地上（２４℃）における植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）に対する増殖抑制効果を示す図。 Ｄ－２５株による植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の増殖抑制を示す図であって、（ａ）ＴＳＡ培地上にリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）のみ培養したもの、（ｂ）Ｄ－２５株を培養させたＴＳＡ培地上にリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を植菌したもの、（ｃ）ＴＳＡ培地上にフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）のみ培養したもの、（ｄ）Ｄ－２５株を培養させたＴＳＡ培地上にフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を植菌したもの。 Ｒ２Ａ培地からＴＳＡ培地に食菌したＤ－２５株による植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia）の増殖抑制を示す図であって、（ａ）ＴＳＡ培地上にリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia）のみ培養したもの、（ｂ）ＴＳＡ培地上に植菌したＤ－２５株を１日培養した後にリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を植菌したもの、（ｃ）ＴＳＡ培地上に植菌したＤ－２５株を２日培養した後にリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を植菌したもの、 Ｒ２Ａ培地からＴＳＡ培地に食菌したＤ－２５株による植物病原菌フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の増殖抑制を示す図であって、（ａ）ＴＳＡ培地上にフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）のみ培養したもの、（ｂ）ＴＳＡ培地上にＤ－２５株を１日培養した後にフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を植菌したもの、（ｃ）ＴＳＡ培地上にＤ－２５株を２日培養した後にフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を植菌したもの。 Ｄ－２５株をＲ２Ａ培地からＴＳＡ培地に移すサイクルを２回とした場合の、Ｄ－２５株による植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制を示す図であって、（ａ）ＴＳＡ培地上にリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）のみを培養したもの、（ｂ）Ｄ－２５株のＴＳＡ培地への２回目の植菌と同時に、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）をＴＳＡ培地に植菌したもの、（ｃ）Ｄ－２５株のＴＳＡ培地への２回目の植菌後１日培養し、その後リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）をＴＳＡ培地に植菌したもの。 Ｄ－２５株をＲ２Ａ培地からＴＳＡ培地に移すサイクルを２回とした場合の、Ｄ－２５株による植物病原菌フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の増殖抑制を示す図であって、（ａ）ＴＳＡ培地上にフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）のみを培養したもの、（ｂ）Ｄ－２５株のＴＳＡ培地への２回目の植菌と同時に、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）をＴＳＡ培地に植菌したもの、（ｃ）Ｄ－２５株のＴＳＡ培地への２回目の植菌後１日培養し、その後フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を植菌したもの。 Ｄ－２５株をＲ２Ａ培地からＴＳＡ培地に移すサイクルを４回とした場合の、Ｄ－２５株による植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制を示す図であって、（ａ）ＴＳＡ培地上にリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）のみを培養したもの、（ｂ）Ｄ－２５株のＴＳＡ培地への４回目の植菌と同時に、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）をＴＳＡ培地に植菌したもの、（ｃ）Ｄ－２５株のＴＳＡ培地への４回目の植菌後１日培養し、その後リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を植菌したもの。 Ｄ－２５株をＲ２Ａ培地からＴＳＡ培地に移すサイクルを４回とした場合の、Ｄ－２５株による植物病原菌フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の増殖抑制を示す図であって、（ａ）ＴＳＡ培地上にフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）のみを培養したもの、（ｂ）Ｄ－２５株のＴＳＡ培地への４回目の植菌と同時に、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）をＴＳＡ培地に植菌したもの、（ｃ）Ｄ－２５株のＴＳＡ培地への４回目の植菌後１日培養し、その後フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を植菌したもの。 Ｄ－２５株の２４℃における増殖曲線（２％植菌） Ｄ－２５株の培養液に浸したトマト（Solanum lycopersicum）とキュウリ（Cucumis sativus）の種子のリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）に対する発病抑制を示す図であって、（ａ）トマト（Solanum lycopersicum）の観察結果、（ｂ）キュウリ（Cucumis sativus）の観察結果、（ｃ）Ｄ－２５株とリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）との距離を長くした場合のトマト（Solanum lycopersicum）の観察結果、（ｄ）同じくキュウリ（Cucumis sativus）の観察結果。 １／１０ＰＤＡ培地（０．６％）によるキュウリ（Cucumis sativus）の生育の観察を示す図であてって、（ａ）１／１０ＰＤＡ培地にキュウリ（Cucumis sativus）の種子のみを接種した場合、（ｂ）同じく一部拡大図、（ｃ）１／１０ＰＤＡ培地にキュウリ（Cucumis sativus）とリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を接種した場合、（ｄ）同じく一部拡大図、（ｅ）１／１０ＰＤＡ培地にキュウリ（Cucumis sativus）、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）及びＤ－２５株を接種した場合、（ｆ）同じく一部拡大図 （ａ）ＴＳＢ培地で培養したＤ－２５株を接種した１／１０ＰＤＡ培地に、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、キュウリ（Cucumis sativus）の種子を接種した場合のキュウリの観察図、（ｂ）ＴＳＢ培地で培養したＤ－２５株を接種した１／１０ＰＤＡ培地に、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、キュウリ（Cucumis sativus）の種子を接種し、Ｄ－２５株の濃縮液を２００μｌ滴下した場合のキュウリの観察図、（ｃ）ＴＳＢ培地で培養したＤ－２５株を接種した１／１０ＰＤＡ培地に、Ｄ－２５株の培養液に浸したキュウリ（Cucumis sativus）の種子、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を接種し、Ｄ－２５株の濃縮液を２００μｌ滴下した場合のキュウリの観察図。 （ａ）キュウリ（Cucumis sativus）の種子を１／１０ＰＤＡ培地に接種し、５日目の観察図、（ｂ）同じく７日目の観察図、（ｃ）キュウリ（Cucumis sativus）の種子とリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を１／１０ＰＤＡ培地に接種し、５日目の観察図、（ｄ）同じく７日目の観察図、（ｅ）キュウリ（Cucumis sativus）の種子とＤ－２５株（ＴＳＡ１枚分）を１／１０ＰＤＡ培地に接種し、５日目の観察図、（ｆ）同じく７日目の観察図、（ｇ）キュウリ（Cucumis sativus）の種子とＤ－２５株（ＴＳＡ１枚分）及びリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を１／１０ＰＤＡ培地に接種し、５日目の観察図、（ｈ）同じく７日目の観察図、（ｉ）キュウリ（Cucumis sativus）の種子とＤ－２５株（ＴＳＡ３枚分）及びリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を１／１０ＰＤＡ培地に接種し、５日目の観察図、（ｊ）同じく７日目の観察図。 （ａ）キュウリ（Cucumis sativus）の種子を１／１０ＰＤＡ培地に接種した場合の観察図、（ｂ）キュウリ（Cucumis sativus）の種子とリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を１／１０ＰＤＡ培地に接種した場合の観察図、（ｃ）キュウリ（Cucumis sativus）の種子とＤ－２５株（ＴＳＡ２枚分）を１／１０ＰＤＡ培地に接種した場合の観察図、（ｄ）キュウリ（Cucumis sativus）の種子とＤ－２５株（ＴＳＡ２枚分）及びリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を１／１０ＰＤＡ培地に接種した場合の観察図、（ｅ）キュウリ（Cucumis sativus）の種子とＤ－２５株（ＴＳＡ１枚分）及びリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を１／１０ＰＤＡ培地に接種した場合の観察図。 Ｄ－２５株の培養液の上清によるリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制の観察図であって、（ａ）コントロールとして１／１０ＴＳＡ培地１ｍｌ、（ｂ）上清１ｍｌの場合、（ｃ）コントロールとして１／１０ＴＳＡ培地３ｍｌ、（ｄ）上清３ｍｌの場合、（ｅ）コントロールとして１／１０ＴＳＡ培地５ｍｌ、（ｆ）上清５ｍｌの場合。 （ａ）Ｄ－２５株によるリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制観察図、（ｂ）ＮＢＲＣ３７４０株によるリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制観察図。 （ａ）１／１０ＴＳＡ培地で培養したＤ－２５株によるリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制観察図であって、１日目の観察図、（ｂ）同じく３日目の観察図、（ｃ）同じく７日目の観察図、（ｄ）１／１０ＴＳＡ培地で培養したＤＭＺ１７６２２株によるリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制観察図であって、１日目の観察図、（ｅ）同じく３日目の観察図、（ｆ）同じく７日目の観察図。 （ａ）ＴＳＡ培地で培養したＤ－２５株によるリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制観察図、（ｂ）ＴＳＡ培地で培養したＤＭＺ１７６２２株によるリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制観察図。
　以下、添付図面を参照して本発明の一実施形態を説明する。
（Ｄ－２５株の異なる培地条件下における増殖特性）
　本発明に係るＤ－２５株を固体および液体培地を用いて培養した。用いた培地は、液体培地としてＴＳＢ培地、ＴＳＢ培地を１０倍に希釈した１／１０ＴＳＢ培地、固体培地として前記２種の液体培地をそれぞれ寒天で固化したＴＳＡ培地、１／１０ＴＳＡ培地、およびＲ２Ａ培地の５種である。前記培地の成分は以下のとおりである。
・ＴＳＢ培地（１Ｌ）
ポリペプトン　　２０ｇ
グルコース　　　２．５ｇ
ＮａＣｌ　　　　５ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４　　　２．５ｇ
・１／１０ＴＳＢ培地（１Ｌ）
ポリペプトン　　２ｇ
グルコース　　　０．２５ｇ
ＮａＣｌ　　　　０．５ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４　　　０．２５ｇ
・ＴＳＡ培地
ＴＳＢ培地を１．５％寒天で固化したもの。  
・１／１０ＴＳＡ培地
１／１０ＴＳＢ培地を１．５％寒天で固化したもの。  
・Ｒ２Ａ培地（１Ｌ）
ポリペプトン　　０．５ｇ
酵母エキス　　　０．５ｇ
カザミノ酸　　　０．５ｇ
グルコース　　　０．５ｇ
溶性デンプン　　０．５ｇ
ピルビン酸Ｎａ　０．３ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４　　　０．３ｇ
ＭｇＳＯ４　　　　０．０５ｇ
寒天　　　　　　　１５ｇ
　前記各培地でのＤ－２５株の増殖試験の結果、液体培地１／１０ＴＳＢ培地上において、２４℃、３０℃でＤ－２５株の増殖が認められた。
　また、固体培地Ｒ２Ａ培地、１／１０ＴＳＡ培地上においても、２４℃、３０℃でＤ－２５株の増殖が認められた。
　しかし、３７℃における前記各培地上ではＤ－２５株の増殖は認められなかった。
　また、Ｄ－２５株の植菌量として一般的な１％植菌の場合、２４℃において増殖開始が認められるまで数時間を要したが、植菌量を２％に増加することにより、速やかな増殖が認められることが示された（図１０）。なお、菌数は定常状態で約１．６×１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。
　ここでコリモナス（Collimonas）属細菌は、前記１／１０ＴＳＢ培地、１／１０ＴＳＡ培地のような貧栄養状態を好む微生物であること、また、豊富な栄養条件では増殖が認められないことが知られており、これらの事実を検証すべく前記ＴＳＡ培地を用いて確認実験を行った。
　その結果、ＴＳＡ培地上では、２４℃、一日の培養ではＤ－２５株の増殖は認められないか、ごく微弱な増殖が一部に認められるだけであった。しかし、２日目には、良好な増殖を示すことが見出された（図１）。
（減菌土壌中におけるコリモナス（Collimonas）属細菌の菌数変化）
　次に、コリモナス（Collimonas）属細菌の土壌中における生存菌数の確認実験を行った。まず、コリモナス（Collimonas）属細菌を１／１０ＴＳＢ培地で２日間、２４℃、２００ｒｐｍの条件下で培養した。その後、５００ｍｌフラスコに１／１０ＴＳＢ培地を１００ｍｌ加え、そこに前記コリモナス（Collimonas）属細菌を植菌し、２４℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。
　前記培養したコリモナス（Collimonas）属細菌を滅菌済みの遠心チューブを用いて遠心分離し、その菌体を集めた。集めた菌体の上清を除去後、滅菌水４０ｍｌで懸濁した。
　一方、土１０ｇを１００ｍｌビーカーに入れ滅菌し、この滅菌済みの土に前記滅菌水で懸濁したコリモナス（Collimonas）属細菌全量を加え、薬さじで混合後、菌数の変化を測定した。サンプリングは、ビーカー内５か所から少しずつ土を採取したものとし、重量測定後に滅菌水を用いて１０倍に希釈した後、希釈系列を作成して菌数算定を行った。サンプルは、実験開始初日、２日目、７日目、１４日目に採取し、それぞれのコリモナス（Collimonas）属細菌を菌数算定した。
　その結果、土壌１ｇあたりの菌数に換算して、初日から１４日目迄で、ほぼ１０６ ｃｆｕ／ｇ－ｓｏｉｌの菌数が検出された。同様の実験を３回行った結果、土壌粒子とコリモナス（Collimonas）属細菌の菌体との相互作用により十分に菌体が回収されないため、測定値で二桁程度（100倍）の誤差が実験であったものの、滅菌土壌に接種した菌体の生存が認められた。
　通常、生物農薬に使用されるバチルス（Bacillus）属細菌は、栄養要求性が高い為、栄養源の乏しい土壌環境では芽胞を形成して休眠状態で不活性となる為、農薬としての効果が安定しないことが度々報告されている。
　一方、コリモナス（Collimonas）属細菌に関しては、２桁程度（100倍程度）の誤差が実験間で認められたが、フラスコ内で培養した菌体が、平均して１０６ ｃｆｕ／ｇ－ｓｏｉｌの生存性があることがフラスコ外の貧栄養環境にある滅菌土壌中で証明出来た。
　尚、過去の実験データ等から、コリモナス（Collimonas）属細菌の土壌での生育数は、１０５ ｃｆｕ／ｇ－ｓｏｉｌとの報告がなされていることから、今回の実験結果は、ほぼ、コリモナス（Collimonas）属細菌の生態に即したデータであると判断することができる。
（Ｄ－２５株による植物病原菌増殖抑制効果）
　Ｄ－２５株を用いて、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）に対する増殖抑制実験を行ったが、Ｒ２Ａ培地や１／１０ＴＳＡ培地、あるいは糸状菌用のＰＤＡ培地などにおいては、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制はまったく認められず、Ｄ－２５株は、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）に覆われた。
　そこで、ＴＳＡ培地を用いて、２４℃における植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）に対する増殖抑制効果を調べたところ、図２に示すようにＤ－２５株の存在により、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖が阻止されるように見える現象が認められた。
　前記のように、培地成分を希釈していない固体培地ＴＳＡ培地にて、Ｄ－２５株の増殖が認められたこと、及び当該ＴＳＡ培地上におけるＤ－２５株による植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖を阻止する現象が認められたことから、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）のＤ－２５株による増殖抑制効果の再現性を試みた。
（実験方法１）
（１）Ｒ２Ａ培地からＴＳＡ培地にＤ－２５株を植菌し、２日間２４℃で培養した。  
（２）シャーレに格子状に線を引いた紙を張り付け、前記ＴＳＡ培地にＤ－２５株を前記線に沿って塗布した。  
（３）一晩２４℃で培養した。  
（４）シャーレの中心に植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）あるいはフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を植菌し24℃で培養した。  
（５）比較の基準となるコントロール培地として、Ｄ－２５株を塗布していないＴＳＡ培地に植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、あるいはフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）のみを植菌し、２４℃で培養したものを用意し、これらと前記Ｄ－２５株を塗布したＴＳＡ培地に植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、あるいはフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を植菌したものと比較した。
　その結果、図３（ｂ）、（ｄ）に示すように、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の増殖が、ＴＳＡ培地上で培養されたＤ－２５株により完全に抑制され、シャーレの中央にとどまることが示された。
　一方、コントロール培地に植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）あるいはフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）のみを培養したシャーレでは、前記２種の植物病原菌が同一期間内で良好な増殖を示しており（図３（ａ）、（ｃ））、このことからも植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の増殖は、ＴＳＡ培地、すなわち培地成分を希釈していない培地上で培養されたＤ－２５株によって阻害されていることが認められた。
（実験方法２）
（１）Ｒ２Ａ培地からＴＳＡ培地にＤ－２５株を植菌し、１日間２４℃で培養した。  
（２）Ｒ２Ａ培地からＴＳＡ培地にＤ－２５株を植菌し、２日間２４℃で培養した。  
（３）シャーレに正方形に線を引いた紙を張り付け、前記２種のＴＳＡ培地それぞれにＤ－２５株を前記線に沿って塗布した。  
（４）所定期間Ｄ－２５株をさらに培養した。  
（５）前記２種のＴＳＡ培地のシャーレの中心にそれぞれ植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）あるいはフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を植菌し７日間２４℃で培養した。  
（６）比較の基準となるコントロール培地として、Ｄ－２５株を塗布していないＴＳＡ培地に植物病原菌リゾクトニア・ソラニ、あるいはフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）のみを植菌し、７日間２４℃で培養したものを用意し、これらと前記Ｄ－２５株を塗布したＴＳＡ培地に植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、あるいはフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を植菌したものと比較した。
　図４（ｂ）、図５（ｂ）に示されるように、Ｄ－２５株の植菌量を図３の格子状から正方形の形状に減らしたにもかかわらず、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の増殖はＤ－２５株により阻害されていることが認められた。
　また、図４（ｃ）、図５（ｃ）に示されるように、Ｄ－２５株が十分に増殖する２日後の方が、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の増殖の阻害能力が高いことも示された。
　コリモナス（Collimonas）属細菌が１／１０ＴＳＢ培地、１／１０ＴＳＡ培地のような貧栄養培地においてのみ増殖することが知られているため、上述のように見出された通常の栄養培地におけるＤ－２５株の増殖により、何らかの変化（変異）が生じている可能性が考えられる。
　そこで、貧栄養培地であるＲ２Ａ培地から富栄養培地ＴＳＡ培地にＤ－２５株を植菌し、増殖させ、当該増殖したＤ－２５株を再びＲ２Ａ培地に植菌し、増殖させる。その後、前記Ｒ２Ａ培地で増殖したＤ－２５株を再びＴＳＡ培地に植菌し、そこで増殖したＤ－２５株を用いて植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）に対する増殖抑制能を調べた。
　本実施例では、Ｒ２Ａ培地からＴＳＡ培地に移すサイクルを２回(Ｒ２Ａ培地からＴＳＡ培地、ＴＳＡ培地からＲ２Ａ培地、Ｒ２Ａ培地からＴＳＡ培地)行った後に、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、あるいはフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を同時に植菌したものをそれぞれ用意した。また、前記サイクルを２回行った後のＴＳＡ培地でＤ－２５株を１日培養させ、その後に植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、あるいはフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を植菌したものをそれぞれ用意した。なお、比較の基準となるコントロール培地は前記実施例と同一なので説明を省略する。
　図６（ｂ）、（ｃ）、図７（ｂ）、（ｃ）に示されるように、Ｄ－２５株と植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、あるいはフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の同時植菌、Ｄ－２５株の１日培養後のもの共に、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の増殖抑制効果が認められた。従って、培地成分を希釈していないＴＳＡ培地を経由しても、植物病原菌の増殖抑制能について、変異が生じていないことが認められた。
　上述のように、Ｄ－２５株が培地成分を希釈していないＴＳＡ培地を経由しても植物病原菌の増殖抑制能に変化が生じないことが示されたが、培地を移す回数が多くなっても植物病原菌の増殖抑制能が変化しないことを確認するために、Ｄ－２５株をＲ２Ａ培地からＴＳＡ培地に移すサイクルをさらに増やして観察を試みた。
　Ｄ－２５株をＲ２Ａ培地からＴＳＡ培地に移すサイクルを前記２回から４回とし、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、あるいはフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を同時に植菌したものをそれぞれ用意した。また、前記サイクルを４回行った後のＴＳＡ培地でＤ－２５株を１日培養させ、その後に植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、あるいはフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を植菌したものをそれぞれ用意した。なお、比較の基準となるコントロール培地は前記実施例と同一なので説明を省略する。
　図８（ｂ）、（ｃ）及び図９（ｂ）、（ｃ）に示されるように、Ｄ－２５株を貧栄養培地Ｒ２Ａ培地から富栄養培地ＴＳＡ培地に移すサイクルを４回に増やしても、Ｄ－２５株の植物病原菌の増殖抑制能力に変化は認められなかった。このことから、Ｄ－２５株をＴＳＡ培地で大量に増殖させても、菌の性質に影響を与えることはないことが示された。
　次に、Ｄ－２５株を植物に用いて植物病原菌の増殖を抑制できるかいくつかの実験を行った。
　Ｄ－２５株を２ｍｌの１／１０ＴＳＢ培地で２日間、２４℃、２００ｒｐｍで培養した。そして、種子殺菌を行ったトマト（Solanum lycopersicum）とキュウリ（Cucumis sativus）の種子を寒天培地(Ａｇａｒ２％)上で前発芽させた後に、それぞれの種子を前記Ｄ－２５株の培養液に浸し、ＰＤＡ培地上に接種した。また、前記培養液に浸していないトマト（Solanum lycopersicum）とキュウリ（Cucumis sativus）の種子それぞれをコントロールとして前記ＰＤＡ培地に接種した。前記種子の接種後、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を前記ＰＤＡ培地上の中心に植菌し、前記培養液に浸した種子及び浸していない種子への発病を観察した。
　図１１（ａ）、（ｂ）に示すように、前記培養液に浸した種子（図１１（ａ）、（ｂ）中、左の３種子）及び浸していない種子（図１１（ａ）、（ｂ）中、右の３種子）共に、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）に感染し、Ｄ－２５株による植物病原菌の増殖抑制は認められなかった。
　上記実験では、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）をＰＤＡ培地の中心に置いたため、Ｄ－２５株との距離が短いことが考えられた。そこでＤ－２５株と植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）との距離を長くする実験を行ったが、結果は図１１（ｃ）、（ｄ）に示すように植物病原菌の増殖抑制は認められなかった。
　Ｄ－２５株を２ｍｌの１／１０ＴＳＢ培地で２日間、２００ｒｐｍ、２４℃で培養した。５００ｍｌフラスコに１００ｍｌの１／１０ＴＳＢを加え、そこに前記Ｄ－２５株を２％植菌し、１２０ｒｐｍで培養した。培養後、遠心分離により前記Ｄ－２５株を集菌し、滅菌蒸留水１ｍｌで再懸濁した。
　１／１０ＰＤＡ培地（Ａｇａｒ ０．６％）を試験管に３５ｍｌ加え、種子殺菌後に前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子と共に、前記Ｄ－２５株の懸濁液０．１ｍｌを前記１／１０ＰＤＡ培地に接種した。この培地に植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を植菌し、種子への発病を観察した。
　比較の基準として、前記１／１０ＰＤＡ培地に種子殺菌済みで前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子を接種したもの（コントロール４－１）、前記１／１０ＰＤＡ培地に種子殺菌済みで前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子及び植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を植菌したもの（コントロール４－２）を用意した。
　図１２に示されるように、コントロール４－１ではキュウリ（Cucumis sativus）の種子は特に問題なく生育しているが（図１２（ａ）、（ｂ））、コントロール４－２ではキュウリ（Cucumis sativus）の種子が植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）に感染し、茎は茶色く変色し、根にも菌糸が感染し、枯死している（図１２（ｃ）、（ｄ））。
　また、図１２（ｅ）、（ｆ）に示されるように、前記Ｄ－２５株の懸濁液０．１ｍｌを接種した場合においても、キュウリ（Cucumis sativus）の種子が植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）に感染し、根、茎の成長が見られず茶色く変色し枯死した。
　本実施例では、液体培地をＴＳＢ培地とした。Ｄ－２５株をＴＳＢ培地で培養し、５００ｍｌフラスコに１００ｍｌのＴＳＢを加えたものを用意し、そこに前記Ｄ－２５株を植菌し培養した。培養後、遠心分離により前記Ｄ－２５株を集菌し、滅菌蒸留水４０ｍｌで再懸濁した。このＤ－２５株の懸濁液１０ｍｌを１／１０ＰＤＡ培地が入れられた試験管に加え、以下の試験体を用意して植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制能を観察した。
（試験体５－１）
　ＴＳＢ培地で培養したＤ－２５株を接種した１／１０ＰＤＡ培地に、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、種子殺菌済みで前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子を接種したもの。  
（試験体５－２）
　ＴＳＢ培地で培養したＤ－２５株を接種した１／１０ＰＤＡ培地に、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、種子殺菌済みで前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子を接種し、前記Ｄ－２５株の濃縮液を２００μｌ滴下したもの。  
（試験体５－３）
　ＴＳＢ培地で培養したＤ－２５株を接種した１／１０ＰＤＡ培地に、前記Ｄ－２５の培養液に浸したキュウリ（Cucumis sativus）の種子、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を接種し、前記Ｄ－２５株の濃縮液を２００μｌ滴下したもの。  
　試験体５－１のキュウリ（Cucumis sativus）の種子については、その生育はあまり良くないが、実施例４のコントロール４－２のキュウリ（Cucumis sativus）の種子に比べて茎が枯れることなく、病気の進行が遅くなっている現象が認められた（図１３（ａ））。
　試験体５－２キュウリ（Cucumis sativus）の種子については、１／ＰＤＡ培地上に前記Ｄ－２５株の濃縮液を滴下しても試験体５－１と同様に、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）に感染した（図１３（ｂ））。
　試験体５－３のキュウリ（Cucumis sativus）の種子については、Ｄ－２５株の培養液に浸しても試験体５－１と同様に、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）に感染した（図１３（ｃ））。
　前記実施例３乃至５から、寒天培地の表面に液体が存在すると、Ｄ－２５株の植物病原菌の抑制能力が発揮される前に、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の菌糸が伸び、植物種子への感染が進行しやすくなることが推測される。
　従って、Ｄ－２５株の植物病原菌の抑制においては、ＴＳＡ培地上で観察されるような粘性のあるＤ－２５株を、なるべく自由な液体が存在しない状態で接種する必要があることが判明した。
　本実施例では、Ｄ－２５株を培養する培地を液体培地から固体培地ＴＳＡ培地に代えた。ＴＳＡ培地で培養したＤ－２５株をスパチュラで集め、以下の試験体を用意して植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制能を観察した。
（試験体６－１）
　アグリポットに１／１０ＰＤＡ培地（Ａｇａｒ ０．６％）を入れ、種子殺菌後に前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子を前記１／１０ＰＤＡ培地に接種したもの。  
（試験体６－２）
　アグリポットに１／１０ＰＤＡ培地（Ａｇａｒ ０．６％）を入れ、種子殺菌後に前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を前記１／１０ＰＤＡ培地に接種したもの。  
（試験体６－３）
　アグリポットに１／１０ＰＤＡ培地（Ａｇａｒ ０．６％）を入れ、種子殺菌後に前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子、ＴＳＡ培地で培養したＤ－２５株（ＴＳＡ１枚分）を前記１／１０ＰＤＡ培地に接種したもの。  
（試験体６－４）
アグリポットに１／１０ＰＤＡ培地（Ａｇａｒ ０．６％）を入れ、種子殺菌後に前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子、ＴＳＡ培地で培養したＤ－２５株（ＴＳＡ１枚分）、及び植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を前記１／１０ＰＤＡ培地に接種したもの。  
（試験体６－５）
　アグリポットに１／１０ＰＤＡ培地（Ａｇａｒ ０．６％）を入れ、種子殺菌後に前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子、ＴＳＡ培地で培養したＤ－２５株（ＴＳＡ３枚分）、及び植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を前記１／１０ＰＤＡ培地に接種したもの。  
　図１４に示されるように、ＴＳＡ培地上から集積された、粘性のあるＤ－２５株のコロニーにより、植物病原菌の感染までの時間を長くすることができることが示され、前記粘性のあるＤ－２５株の接種方法を工夫することで、植物病原菌の増殖抑制効果がさらに顕著になることが期待された。
　そこで、Ｄ－２５株のさらに下記の試験体を用意し、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制能を観察した。
（試験体６－６）
　アグリポットに１／１０ＰＤＡ培地（Ａｇａｒ ０．６％）を入れ、種子殺菌後に前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子を接種したもの。  
（試験体６－７）
　アグリポットに１／１０ＰＤＡ培地（Ａｇａｒ ０．６％）を入れ、種子殺菌後に前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を接種したもの。  
（試験体６－８）
　アグリポットに１／１０ＰＤＡ培地（Ａｇａｒ ０．６％）を入れ、ＴＳＡ培地で培養したＤ－２５株（ＴＳＡ２枚分）を培地全体に塗布し、種子殺菌後に前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子を接種したもの。  
（試験体６－９）
　アグリポットに１／１０ＰＤＡ培地（Ａｇａｒ ０．６％）を入れ、ＴＳＡ培地で培養したＤ－２５株（ＴＳＡ２枚分）を培地全体に塗布し、種子殺菌後に前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を接種したもの。  
（試験体６－１０）
　アグリポットに１／１０ＰＤＡ培地（Ａｇａｒ ０．６％）を入れ、ＴＳＡ培地で培養したＤ－２５株（ＴＳＡ１枚分）を培地全体に塗布し、種子殺菌後に前発芽させたキュウリ（Cucumis sativus）の種子、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を接種したもの。
　図１５（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）に示されるように、実験開始から7日までの間、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖に有利な培地、及び本実施例のような小型で閉鎖的である感染に有利な実験環境であるにも関わらず、キュウリ（Cucumis sativus）の種子への植物病原菌の感染は防除された。
　これらの一連の結果から、Ｄ－２５株の植物病原菌の増殖抑制能は、ＴＳＡ培地のような固体培地での培養によって、粘性のあるスライム状のコロニーを形成した場合に顕著であることが示された。
　このような手段で培養されたコロニーは、一般には、「バイオフィルム（Biofilm）」と呼ばれ、主として、菌体外多糖類により構成される細菌の自然界での集落であり、非特許文献６にて公知の如く、通常、生物農薬で用いられる通気攪拌培養による栄養細胞（planktonic cell）とは異なる遺伝子の発現系の存在が示唆されている。今回の実験結果から、Ｄ－２５株による植物病原菌の増殖抑制には、固体培養、或いは、その他の培養手段による当該細菌のバイオフィルム（Biofilm）組成が有効であることが示された。
　植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖を抑制する物質がＤ－２５株から生成されるかどうかを確認するため、Ｄ－２５株の上清を用いて（Rhizoctonia solani）の増殖抑制実験を行った。
　Ｄ－２５株を２ｍｌの１／１０ＴＳＢ培地で２日間培養した。その後、５００ｍｌフラスコに１／１０ＴＳＢ培地を１００ｍｌ加え、そこに前記Ｄ－２５株を２％植菌し、２４℃、１２０ｒｐｍで５日間培養した。前記培養したＤ－２５株を１５０００ｒｐｍで遠心分離し、０．２ μｍ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）フィルター滅菌を行い、Ｄ－２５株の上清を得る。
　前記得た上清１、３、５ ｍｌに対してそれぞれＴＳＡ培地を９、７、５ ｍｌずつ加えて全体が１０ｍｌになるようにした。コントロールとして、上清の代わりに１／１０ＴＳＡ培地１、３、５ｍｌを用意し、各試験体について植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制能を調べた。
　図１６（ｆ）に示されるように、Ｄ－２５株の培養液の上清を５ｍｌ使用しても植物病原菌の増殖抑制能が観察されなかったことから、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖を抑制する抗菌活性物質はＤ－２５株から生産されていないと判断した。つまり、Ｄ－２５株は、通常生物農薬で用いられる細菌が生成する抗生物質に頼らずに、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖を抑制することができる。
　本実施例では、Ｄ－２５株以外のコリモナス（Collimonas）属細菌を用いて植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制実験を行った。使用するコリモナス（Collimonas）属細菌をＮＢＲＣ３７４０株（旧名：Janthinobacterium lividum）とし、液体培養のＮＢＲＣ３７４０株において、寒天培地上で増殖したＮＢＲＣ３７４０株を用いてＤ－２５株と植物病原菌の増殖抑制能を比較した。
　Ｄ－２５株はＴＳＡ培地を用いて培養し、ＮＢＲＣ３７４０株は複水培地を用いて増殖させて、それぞれ菌体を集めて植物病原菌の増殖抑制能の比較を行った。 ＮＢＲＣ３７４０株の菌数が少ないことが懸念されたため、複水培地１５枚にＮＢＲＣ３７４０株を塗布後、スパチュラにより集菌した。集菌したそれぞれの菌をシャーレに塗布後、中心に植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を植菌し、２４℃で３日間培養を行った。
　図１７（ａ）で示されるように、Ｄ－２５株は植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖を抑制しているが、ＮＢＲＣ３７４０株は外側の囲いまで菌糸が増殖している。Ｄ－２５株はＴＳＡ培地１枚分で、ＮＢＲＣ３７４０株は復水培地１５枚分の菌体を用いており、図１７（ｂ）からも明らかなように、ＮＢＲＣ３７４０株の菌体はＤ－２５株の菌体に比べても十分に多く用いている。しかし、Ｄ－２５株に比較して顕著な抑制は認められなかった。
　以上の液体培養、固体培養の菌体を用いた結果から、ＮＢＲＣ３７４０株を固体培地で培養しバイオフィルムを形成した場合、植物病害抑制能は、非常に弱いが少なからず備えていると判断された。
　本実施例では、他のコリモナス（Collimonas）属細菌であるコリモナス・フンギボランス（Collimonas fungivorans）ＤＭＺ１７６２２株を用いて植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制実験を行った。
　１／１０ＴＳＡ培地にそれぞれＤ－２５株とコリモナス・フンギボランス（Collimonas fungivorans）ＤＭＺ１７６２２株を格子状に塗布する。その後、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を培地中央に植菌して植物病原菌の増殖抑制能を比較した。
　図１８に示されるように、２種類のコリモナス（Collimonas）属細菌のいずれも、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制の強さに差は認められず、ともに植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖を抑制することはなかった。つまり、Ｄ－２５株が抑制できない１／１０ＴＳＡ培地のような低栄養条件においては、コリモナス・フンギボランス（Collimonas fungivorans）も増殖抑制能を示すことはなかった。
　そこで、培養する培地をＴＳＡ培地に代え、Ｄ－２５株とコリモナス・フンギボランス（Collimonas fungivorans）ＤＭＺ１７６２２株の植物病原菌の抑制能の比較を行った。
Ｄ－２５株及びコリモナス・フンギボランス（Collimonas fungivorans）ＤＭＺ１７６２２株をＴＳＡ培地上で二重に囲むように四角形に塗布後、植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を前記培地の中心に植菌し、２５℃で培養ご、前記２種の菌株による植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制能力を比較した。
　図１９は培養４日目の写真であるが、前記２種の菌株の植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）の増殖抑制能力は同等で、共に植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）を中心部分の四角内に閉じ込めていた。但し、コリモナス・フンギボランス（Collimonas fungivorans）ＤＭＺ１７６２２株は、Ｄ－２５株に比して増殖スピードが速く、尚且つ、粘着力が強いことが認められた。
　本実施例及び実施例８の実験結果から、コリモナス（Collimonas）属細菌には、植物病原菌の増殖抑制能は、種による能力の差は存在するものの、固体バイオフィルム（Biofilm）培養によって新たに出現する事が確認された。
（結論）
　実施例７において示された如く、コリモナス（Collimonas）属細菌による植物病原菌の増殖抑制は、バチルス（Bacillus）属細菌などのように、生物農薬で一般的に用いられる抗生物質を生成することによる、植物病害抑制能力とは異なることが確認された。
　また、実施例９において、コリモナス・フンギボランス（Collimonas fungivorans）ＤＭＺ１７６２２株を試用に供したが、この菌種は、公知となっているキチナーゼによる食菌作用に依ることが判明している（非特許文献７）。これらの実験結果から、コリモナス（Collimonas）属細菌における植物病原菌の増殖抑制能は、菌体が生成するキチナーゼが主たる活性メカニズムであることが強く示唆された。
 本願発明の実施形態で使用した３菌体(Ｄ－２５株、ＮＢＲＣ３７４０株、及びＤＭＺ１７６２２株)は、過去の実験で供されている１／１０ＴＳＢなどの貧栄養培地においては、顕著な抑制活性は示さないことが確認されたが、その隠れたる防除能力が、一般的に細菌の培養で用いられる通気攪拌培養などによる栄養細胞状態では無く、栄養源が普通に存在する固体バイオフィルム培養を供する事により、顕著に出現することが確認された。また、植物病原菌の増殖抑制能力には差はあれ、少なからずコリモナス（Collimonas）属細菌全体に本来備わっているものと言って差し支えない。
 尚、非特許文献８に記載されている通り、細菌の生成するバイオフィルム（Biofilm）の主たる組成物である菌体外多糖類には、抗菌活性を持つものも報告されているので、コリモナス（Collimonas）属細菌のキチナーゼと、菌体外多糖類による相乗効果であることも考えられる。
 非特許文献９において、コリモナス（Collimonas）属細菌が、貧栄養条件下において、植物病原菌と出会った場合、及び過度のストレス状態にある場合に、スライム状（バイオフィルムを指しているものと示唆される）になることで抗菌活性が発現していることが示されている。さらに、この文献では、キサントモナス（Xanthomonas）属細菌が、酸によるストレスと成長停止状態で、過度の炭素源を散逸させる為にスライム状になることを引用して、コリモナス（Collimonas）属細菌でも同じ現象が起きる可能性を示唆している。しかし、非特許文献９では、コリモナス・フンギボランス（Collimonas fungivorans）Ｔｅｒ３３１株という１／１０ＴＳＢのような貧栄養環境においても植物病原菌の増殖抑制能が出現する菌株を試用し、最終的に、コリモナス（Collimonas）属細菌の食菌能を司る遺伝子発現は、貧栄養環境下であることと結論付けている。
　 一方、本願発明は、貧栄養環境においては顕著な植物病原菌の増殖抑制能を出現させない菌体であっても、富栄養化でバイオフィルム化することで、その能力を出現させることに成功した。
 キサントモナス（Xanthomonas）属細菌の場合は、酸によるストレスなどにより、成長が停止することで、過剰な炭素源を散逸させる為にスライム状になると示唆されているが、本願発明は、培養当初から富栄養環境でコリモナス（Collimonas）属細菌の生育旺盛なスライム状のコロニーを十分生育させた後、その植物病原菌の増殖抑制能の出現方法を供している。　
 従って、コリモナス（Collimonas）属細菌による植物病原菌の増殖抑制能の発現において、スライム状のバイオフィルム(Biofilm)培養することにより、細菌が本来持っている食菌能力が発現或いは増幅されるが、それは必ずしも貧栄養下に晒されることが絶対条件では無く、寧ろ栄養成分が普通に存在する固体培地であって、過度の水分が存在しない環境下におけるスライム状のバイオフィルム発現を供することが、この細菌の植物病原菌防除に有効であると判断出来る。
　さらに、上述の「減菌土壌中におけるコリモナス（Collimonas）属細菌の菌数変化」の実験で示された如く、コリモナス（Collimonas）属細菌は、自然界とは異なる培養環境によるコロニーであっても、それを外来土壌に投入した場合、その土壌中が貧栄養環境であっても、通常自然界に生息する菌数と同等の生存性を維持することから、植物病原菌の増殖抑制効果発現の安定性を期待することができる。
　以上、添付図面を参照して本発明の好ましい実施形態を説明したが、本発明はかかる実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々の形態に変更可能である。
　例えば、Ｄ－２５株、ＮＢＲＣ３７４０株、及びＤＭＺ１７６２２株以外のコリモナス（Collimonas）属に属する菌株についても、上記実施形態で示された植物病原菌リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）の増殖抑制効果を発揮し得ると考えられる。

Claims (6)

  1. 　植物病原菌の増殖抑制能を有し、コリモナス（Collimonas）属に属する微生物。
  2. 　請求項１記載の微生物を培養し、
    　当該培養した微生物を植物土壌に植菌する
    　ことを特徴とする植物病原菌の増殖抑制方法。
  3. 　請求項１記載の微生物は、培地成分を希釈しない培地上で培養された
    　ことを特徴とする請求項２記載の植物病原菌の増殖抑制方法。
  4. 　請求項１記載の微生物が、培地成分を希釈しない固体培地上で培養され、バイオフィルムを形成する
    　ことを特徴とする請求項３記載の植物病原菌の増殖抑制方法。
  5. 　請求項１記載の微生物が、寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－１１０４の菌株、コリモナス（Collimonas）ＮＢＲＣ３７４０、コリモナス・フンギボランス（Collimonas　fungivorans）　ＤＭＺ１７６２２の中から選択される微生物である
    　ことを特徴とする請求項４記載の植物病原菌の増殖抑制方法。
  6. 　植物病原菌は、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属又はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する糸状菌であることを特徴とする請求項1乃至５いずれか１項記載の植物病原菌の増殖抑制方法。
PCT/JP2011/079246 2011-09-15 2011-12-16 コリモナス（Collimonas）属細菌を用いた植物病原菌の増殖抑制方法 WO2013038575A1 (ja)

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