JPWO2015033400A1 - コリモナス属細菌の培養方法及び保存方法 - Google Patents
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Abstract
Description
米ぬか培地及び/又はおから培地を含む培地にてコリモナス属細菌を密封状態で培養することを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法である。
前記米ぬか培地及び/又はおから培地を含む培地に、添加剤として緑色凝灰岩を添加することを特徴とする請求項1記載のコリモナス属細菌の培養方法である。
緑色凝灰岩を含む培地にてコリモナス属細菌を培養することを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法である。
請求項3において、前記緑色凝灰岩の重量と培養液の水分量との比率を7:3に調整してコリモナス属細菌を培養することを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法である。
請求項1乃至4何れか一項において、培養後のコリモナス属細菌を常温下で保存することを特徴とするコリモナス属細菌の保存方法である。
表1〜表3に記載の菌額的性質を有するD−25株をコリモナス(Collimonas)属分類群に帰属するものと推定した。この菌株は、平成23年6月9日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に受託番号NITE P−1104として寄託されている。
ペプトン:0.5g
酵母エキス:0.5g
カザミノ酸:0.5g
グルコース:0.5g
可溶性デンプン:0.5g
ピルビン酸Na :0.5g
K2HPO4:0.3g
MgSO4:0.05g
R2A培地2mLにD−25株を爪楊枝で植菌し、2日間、24℃、200 rpmで前培養をし、生菌数算定を行った。
R2A培地で前培養を行ったD−25株について、培養2日目の生菌数は、5.67×109cfu/mlであった。表5〜表7それぞれに、前記R2A培地、米ぬか・おから培地で本培養をしたサンプル、前記グリセリンを加えたサンプル、前記十和田石を加えたサンプルにおけるD−25株の生菌数算定結果を示す。
(考察)
米ぬか・おから培地とR2A培地でD−25株を培養したものを比較すると、全体的に米ぬか・おから培地における増殖が良く、生菌数も長期間維持できている(表5)。更に、常温下で、8ヶ月経過後も108cfu/mlを維持している。これは、米ぬか・おから培地において、遠心分離をした際に培地成分の持込(沈殿として米ぬか・おからの一部が沈殿する)が多いため、生菌数を長く維持できたと考えられる。
R2A培地2mLにD−25株を爪楊枝で植菌し、2日間、24℃、200 rpmで前培養を行った。前培養後、培養液を6000 rpmで3分間遠心分離し、上清を取り除き、等量の生理食塩水を加え、これを植菌用の菌液とした。
おから・米ぬか培地では6日目に1010cfu/mlまで増殖し(図1(a))、おから培地、米ぬか培地ではそれぞれ109cfu/mlまで増殖した(図1(b)、(c))。
R2A培地、4℃で保存していたD−25株、Cal2株、Cal31株それぞれを新しいR2A液体培地に植菌し、24℃で2日間前培養を行った。
R2A培地で前培養を行ったCal2株、Cal31株、D−25株について、前培養後の生菌数はそれぞれ以下の通りであった。
D−25株 : 4.3×109 cfu/mL
Cal2株:1.8×109 cfu/mL
Cal31株 : 5.3×109 cfu/mL
表8に、Cal2株、Cal31株、D−25株の生菌数算定結果を示す。
Cal2株、Cal31株について、どちらも米ぬか・おから培地で3日間培養すると109cfu/mlまで生育することが分かった。D−25株についてもCal2株、Cal31株に比べてやや高い生菌数を示した。
<D−25株を使用した微生物製剤の作製>
実施例3において米ぬか・おから培地で培養したD−25株の培養液を用いて、微生物製剤作製のための実験を行った。
実施例3で作製した米ぬか・おから培地によるD−25株の培養液を2mL 遠心チューブ(15mL容)に分注した。生菌数は1.5×1010 cfu/2mLであった。
十和田石を添加したD−25株の生菌数は5.5×107cfu/gとなり、107cfu/g程の微生物製剤を作製することができた。生菌数が低下してしまった要因としては、攪拌が激しすぎたことが挙げられる。しかしコリモナス スピーシーズ(Collimonas sp.)は菌量を短時間で多量に確保できるので、初期の投入量を増やすことでカバーできると考えられる。
十和田石の粉末を0.9g、 0.7g、 0.5g 秤量し、試験管に分注後、乾熱滅菌器にて滅菌処理を行った。
サンプル1については、D−25株の生育が見られなかった。図3(a)中白く見えるものは、十和田石の粉末だと思われる。
十和田石を含む培地でD−25株を一週間培養後、真空乾燥を3日間行い(減圧処理は1回、30秒程度)水分を除去した。乾燥後、滅菌水を3mL加え懸濁し、懸濁液中の生菌数を算定した。
0.9gの十和田石粉末にD−25株の前培養液を100μL植菌したもの
0.7gの十和田石粉末にD−25株の前培養液を100μL植菌し、減菌水200μL加えたもの
0.5gの十和田石粉末にD−25株の前培養液を100μL植菌し、減菌水400μL加えたもの
生菌数算定の結果、どのサンプルでも、図4図示のようにD−25株の生育を確認することはできなかったので、死滅したと考えられる。
十和田石の重量とD−25株の前培養液及び減菌水を含む水分の水分量との比を7:3、5:5に調整したサンプルを作製し、それぞれのD−25株の生菌数を算定した。
図5図示のように、一週間以上の生存が認められ、106cfu/mL程度の生菌数が保持されていることが確認された。
上述した実験方法1において、D−25株の培養後、真空乾燥処理を行うとコリモナスが死滅するため、滅菌水の代わりにTSB及びグリセリン3%を添加し培養を試みた。なお、D−25株の前培養液の生菌数は2.6×107cfu/mLであった。
サンプル1:0.7gの十和田石粉末にD−25株の前培養液を100μL植菌し、TSB及びグリセリン3%を200μL添加したもの
(十和田石の重量とD−25株の前培養液を含む水分の水分量との比が7:3)
サンプル2:0.6gの十和田石粉末にD−25株の前培養液を100μL植菌し、TSB及びグリセリン3%を300μL添加したもの
(十和田石の重量とD−25株の前培養液を含む水分の水分量との比が6:4)
サンプル3:0.5gの十和田石粉末にD−25株の前培養液を100μL植菌し、TSB及びグリセリン3%を400μL添加したもの
(十和田石の重量とD−25株の前培養液を含む水分の水分量との比が5:5)
図5図示されているように、0.5gの十和田石粉末にD−25株の前培養液を100μL植菌し、減菌水400μL加えたものでは、108cfu/mL程の生菌数が得られているため、本実施例におけるサンプル1ではこれと同等の結果が得られている。
実施例4及び5において、十和田石粉末にD−25株を植菌し、減菌水を加えるとD−25株の生育が確認できたので、参考例として、十和田石粉末、D−25株の条件を変えてD−25株の生育状態を確認すると共に、コリモナス(Collimonas)属細菌の植物病原菌に対する抑制効果を観察する実験を行った。
サンプル1:0.7gの十和田石粉末にD−25株の前培養液を100μL植菌し、減菌水を200μL添加したもの
サンプル2:D−25株の前培養液100μLに、減菌水を900μL添加したもの
サンプル3:0.7gの減菌処理していない十和田石粉末にD−25株の前培養液を100μL植菌し、減菌水を300μL添加したもの
サンプル4:0.7gの減菌処理した十和田石粉末にD−25株の前培養液を100μL植菌し、減菌水を300μL添加したもの
コリモナスD−25株を1/10TSB培地で4日間、24℃で振とう前培養を行った。前培養後の生菌数は2.6×107cfu/mLであった。
サンプル2でも増殖が認められることから、十和田石からの栄養分の溶出よりも、前培養の1/10TSBの持ちこみの栄養分による増殖と考える方が適当であると思われる。
十和田石でD−25を培養し植物病原菌に対する抑制効果を確認すると、D−25のみに比べ阻止円の形成がよりはっきりとしていた。
Claims (5)
- 米ぬか培地及び/又はおから培地を含む培地にてコリモナス属細菌を密封状態で培養する
ことを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法。 - 前記米ぬか培地及び/又はおから培地を含む培地に、添加剤として緑色凝灰岩を添加する
ことを特徴とする請求項1記載のコリモナス属細菌の培養方法。 - 緑色凝灰岩を含む培地にてコリモナス属細菌を培養する
ことを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法。 - 請求項3において、前記緑色凝灰岩の重量と培養液の水分量との比率を7:3に調整してコリモナス属細菌を培養する
ことを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法。 - 請求項1乃至4何れか一項において、培養後のコリモナス属細菌を常温下で保存する
ことを特徴とするコリモナス属細菌の保存方法。
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