JP7399409B2 - リゾビウム属菌の培養方法 - Google Patents
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Description
本発明は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌の培養方法等に関する。詳細には、リゾビウム属菌の液体培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保ち、且つ、生菌数が向上するような培地組成・培養条件等により、その後の生菌体濃縮・分離工程などを簡便且つ効率的とする培養方法等に関する。
根頭がんしゅ病は、主に土壌中に生息する細菌である病原性リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）（異名：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、病原性リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（異名：アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ））、病原性リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）（異名：アグロバクテリウム・ヴィティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ））（以下、本明細書において、これらを総称して「根頭がんしゅ病菌」という場合もある）が、植物体に感染し、「根頭がんしゅ」と呼ばれるがんしゅ（癌腫）を形成することにより、樹勢などを低下させたり、激しい場合は植物体を衰弱・枯死させる植物病の一種である。この根頭がんしゅ病は、日本国内においては、主に果樹や花卉に発生していることから、特に、果樹及び花卉の農業生産現場や公園等の樹木管理に深刻な被害をもたらす植物病である。
根頭がんしゅ病では、前記根頭がんしゅ病菌のいずれもがＴｉ（ｔｕｍｏｒ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ）プラスミドを保有しており、かかる保有するＴｉプラスミドの一部（Ｔ－ＤＮＡ領域）が、植物細胞核ＤＮＡに形質転換されることにより腫瘍化が誘導される。一度腫瘍が形成されると、根頭がんしゅ病菌を除去しても腫瘍は増殖を続け、植物体の衰弱・枯死などを引き起こす。従って、現状の技術では、植物体が根頭がんしゅ病を一度発病してしまうと、治療することは困難である。そのため、根頭がんしゅ病に関しては、植物体が根頭がんしゅ病菌に感染しないように予防措置をとることが重要である。
このような根頭がんしゅ病菌の感染に対する予防措置としては、従来、根頭がんしゅ病菌に汚染された土壌に対して、土壌全体を加熱滅菌したり、クロルピクリン剤や臭化メチル剤等の土壌殺菌剤を用いて土壌を薫蒸消毒したり、根頭がんしゅ病菌がグラム陰性であるため、グラム陰性細菌用抗生物質で当該土壌を処理したりすることがなされてきた。しかし、このような方法では、当該土壌に含まれる、根頭がんしゅ病菌以外の有用土壌細菌も殺菌・除去されてしまうので、当該土壌の土質が改悪される。このように改悪された土壌を、本来の植物栽培に適した土壌に回復させるには、有機肥料の投与等が必要であるため、多大な経費・労力と、多時間とを要するという問題が生じる。さらに、土壌殺菌剤を用いた土壌の薫蒸消毒では、土壌殺菌剤の毒性がきわめて高く、作業者及び周辺住民の健康を害する危険性がある。
そこで、上記に代わる方法として、近年、非病原性菌を生物農薬として用いる防除方法が提案されている。特に有効なものとして、非病原性リゾビウム属菌を生物農薬として用いる方法が提案され、例えば、非病原性のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株、ＡＲＫ－２株、ＡＲＫ－３株は高い根頭がんしゅ病防除効果及び植物種子発芽率向上効果を発揮するため、これらを用いた微生物農薬等が有望であることが開示されている（特許文献１）。
しかし、リゾビウム属菌、特に上記ＡＲＫ－１株、ＡＲＫ－２株、ＡＲＫ－３株などは、生産培養時などで菌体の増殖に不可欠な栄養成分を十分量添加して菌体増殖性を向上させると、培養液粘度が上昇し、培養時の攪拌や、培養終了後の生菌体濃縮又は分離が困難となる。例えば、遠心分離で菌体を濃縮又は分離する際に、同じ遠心力で生菌体回収を試みると粘度が高いほど菌体が沈降しにくくなり、上清に菌体が漏れてしまう。その結果、製造時の生菌体回収ロスが大きくなりコスト増加に繋がる。
微生物の培養液を低粘度化する方法としては、液体培地中で細胞を培養し多糖類を分泌させて多糖類を製造する際に、金属塩を１０～１００ｍＭ含有させ培養液を低粘度化する方法（特許文献２）、オウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属菌を変異処理してその培養液を低粘度化する方法（特許文献３）などが知られている。しかし、特許文献２に記載されている方法は、主として植物細胞の液体培養時に多糖類を分泌させて多糖類を製造する方法であり、リゾビウム属菌培養液の低粘度化には適さない。また、特許文献３に記載されている変異処理方法は、リゾビウム属菌の変異処理による培養液の低粘度化が可能か不明であり、さらに、変異処理により菌体増殖性及び根頭がんしゅ病防除効果等の菌株の性質も変異する可能性があるというリスクが存在する。そして、リゾビウム属菌の培養液の低粘度化に関しては、現在までのところ報告は見当たらない。
このような背景技術の中、当業界では、リゾビウム属菌の液体培養中及び培養終了時の培養液粘度を上昇させないような培養技術等の開発が望まれていた。
本発明は、リゾビウム属菌の液体培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保つことができ、その後の濃縮や生菌体分離などが容易且つ効率的となるような培養方法等を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を行った結果、二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用し、且つ、培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持してリゾビウム属菌を液体培養することで、リゾビウム属菌の培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保つことができ且つ生菌数の向上も可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用してリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持することを特徴とする、リゾビウム属菌の培養方法。
（２）二糖類が、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースから選ばれる１種又は２種以上である、（１）に記載の方法。
（３）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス、リゾビウム・ヴィティスのいずれかである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）リゾビウム属菌が非病原性である、（１）～（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株のいずれかである、（１）又は（２）に記載の方法。
（６）培養液量５Ｌ以上の大量培養であることを特徴とする、（１）～（５）のいずれか１つに記載の方法。
（７）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用し、且つ、培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持してリゾビウム属菌を液体培養し、この培養液から生菌体を濃縮及び／又は分離することを特徴とする、リゾビウム属菌生菌体の製造方法。
（８）さらに、生菌体を凍結乾燥することを特徴とする、（７）に記載の方法。
（９）二糖類が、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースから選ばれる１種又は２種以上である、（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス、リゾビウム・ヴィティスのいずれかである、（７）～（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１１）リゾビウム属菌が非病原性である、（７）～（１０）のいずれか１つに記載の方法。
（１２）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株のいずれかである、（７）～（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１３）培養液量５Ｌ以上の大量培養により製造することを特徴とする、（７）～（１２）のいずれか１つに記載の方法。
（１４）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める液体培地を使用し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持しながら液体培養することで得られる、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌の培養物。
（１５）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用して下記のリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持することを特徴とする、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）またはリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）またはリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）の培養方法。
（１６）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用して下記のリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～６．０の範囲内に保持することを特徴とする、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株の培養方法。
（１）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用してリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持することを特徴とする、リゾビウム属菌の培養方法。
（２）二糖類が、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースから選ばれる１種又は２種以上である、（１）に記載の方法。
（３）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス、リゾビウム・ヴィティスのいずれかである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）リゾビウム属菌が非病原性である、（１）～（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株のいずれかである、（１）又は（２）に記載の方法。
（６）培養液量５Ｌ以上の大量培養であることを特徴とする、（１）～（５）のいずれか１つに記載の方法。
（７）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用し、且つ、培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持してリゾビウム属菌を液体培養し、この培養液から生菌体を濃縮及び／又は分離することを特徴とする、リゾビウム属菌生菌体の製造方法。
（８）さらに、生菌体を凍結乾燥することを特徴とする、（７）に記載の方法。
（９）二糖類が、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースから選ばれる１種又は２種以上である、（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス、リゾビウム・ヴィティスのいずれかである、（７）～（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１１）リゾビウム属菌が非病原性である、（７）～（１０）のいずれか１つに記載の方法。
（１２）リゾビウム属菌が、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株のいずれかである、（７）～（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１３）培養液量５Ｌ以上の大量培養により製造することを特徴とする、（７）～（１２）のいずれか１つに記載の方法。
（１４）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める液体培地を使用し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持しながら液体培養することで得られる、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌の培養物。
（１５）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用して下記のリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持することを特徴とする、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）またはリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）またはリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）の培養方法。
（１６）二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用して下記のリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～６．０の範囲内に保持することを特徴とする、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株の培養方法。
本発明によれば、リゾビウム属菌の培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保つ（粘度上昇を抑制する）ことができ、その後の濃縮や生菌体分離などが容易となる。また、培養期間中に常時ｐＨ調整を行うことで、培養液の粘度上昇抑制だけでなく培養終了時のリゾビウム属菌生菌数の向上も可能となり、工業生産等において非常に効率的な生菌製造ができる。本発明は、工業生産などを想定した培養液量５Ｌ以上の大量培養において特に有効である。
本発明は、リゾビウム属菌の培養方法等に関するものであるが、本発明の対象となるリゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウム・アラミ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ａｌａｍｉｉ）、リゾビウム・アルカリソリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ａｌｋａｌｉｓｏｌｉ）、リゾビウム・セルロシライティカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｍ）、リゾビウム・ダエジェオネンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）、リゾビウム・エンドフィティカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｕｍ）、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ）、リゾビウム・ファバエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆａｂａｅ）、リゾビウム・ガリカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｇａｌｌｉｃｕｍ）、リゾビウム・ギアルディニ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｇｉａｒｄｉｎｉｉ）、リゾビウム・グラハミ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｇｒａｈａｍｉｉ）、リゾビウム・ハイナネンセ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｈａｉｎａｎｅｎｓｅ）、リゾビウム・フアウトレンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｈｕａｕｔｌｅｎｓｅ）、リゾビウム・ガレガーエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｇａｌｅｇａｅ）、リゾビウム・インディカ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｉｎｄｉｃａ）、リゾビウム・インディカス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｉｎｄｉｃｕｓ）、リゾビウム・インディゴフェラエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａｅ）、リゾビウム・ラリームーレイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、リゾビウム・ロイカエナエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｕｃａｅｎａｅ）、リゾビウム・ロエセンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｅｓｓｅｎｓｅ）、リゾビウム・ルピニ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｕｐｉｎｉ）、リゾビウム・ラシタナム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｕｓｉｔａｎｕｍ）、リゾビウム・メソシニカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｓｏｓｉｎｉｃｕｍ）、リゾビウム・ミルオネンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｉｌｕｏｎｅｎｓｅ）、リゾビウム・モンゴレンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｅｎｓｅ）、リゾビウム・マルチホスピティウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｕｌｔｉｈｏｓｐｉｔｉｕｍ）、リゾビウム・ナガージュナ・ナガレンシス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｎａｇａｒｊｕｎａ ｎａｇａｒｅｎｓｉｓ）、リゾビウム・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｏｒｙｚａｅ）、リゾビウム・ファゼオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｐｈａｓｅｏｌｉ）、リゾビウム・ピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｐｉｓｉ）、リゾビウム・ピュセンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｐｕｓｅｎｓｅ）、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、リゾビウム・ルビ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｕｂｉ）、リゾビウム・セレニティレデゥセンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、リゾビウム・ソリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｏｌｉ）、リゾビウム・スラエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｕｌｌａｅ）、リゾビウム・ティベティカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｉｂｅｔｉｃｕｍ）、リゾビウム・トリフォリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、リゾビウム・トロピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｉ）、リゾビウム・ツクストレンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｕｘｔｌｅｎｓｅ）、リゾビウム・アンディコラ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｕｎｄｉｃｏｌａ）、リゾビウム・ヴァリダム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖａｌｉｄｕｍ）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）などが挙げられ、これらを人工的に改変（変異処理や遺伝子組み換えなど）した株も対象となる。
本発明は、上記したリゾビウム属菌の中でも、リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス、リゾビウム・ヴィティスへの適用が好適である。本発明の培養方法等は、このように根頭がんしゅ病菌、非病原性リゾビウム属菌のいずれのリゾビウム属菌にも適用できるが、特に、非病原性であるリゾビウム・ヴィティス（異名：アグロバクテリウム・ヴィティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ））Ｆ２／５（ｐＴ２ＴＦＸＫ）株（米国特許第７１４１３９５号明細書参照）、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株、リゾビウム・リゾゲネス（異名：アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ））Ｋ８４株（商品名：バクテローズ（登録商標）、日本農薬株式会社製品）などに適用するのが好適であり、この他の天然由来又は人工的な変異処理や遺伝子組み換えなどがされた非病原性リゾビウム属菌を使用することもできるが、なかでも、非病原性のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株、ＡＲＫ－２株、ＡＲＫ－３株、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株への適用は非常に好適である。
この非病原性リゾビウム属菌のうち、ＡＲＫ－１菌株、ＡＲＫ－２菌株及びＡＲＫ－３菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター：〒２９２－０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に２０１０年（平成２２年）１０月１４日付で上記名称で寄託された後、２０１１年（平成２３年）１０月３１日付けで国際寄託に移管されており、その受託番号は、ＡＲＫ－１菌株はＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６であり、ＡＲＫ－２菌株はＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７であり、そしてＡＲＫ－３菌株はＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８である。
そして本発明では、このようなリゾビウム属菌を液体培養により培養する。液体培養に際しては、まず、上記のようなリゾビウム属菌の種菌を入手する。この種菌は、上記寄託菌株や市販品株を平板培地などで培養して得る方法以外であっても、天然に普遍的に存在する菌株であれば当業者は自ら単離することにより入手可能であり、外来種の菌株や閉鎖環境中で突然変異を起こした菌株についても、公知のものであれば独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＲＢＣ）のような生物遺伝資源機関などから入手することができる。天然に全く存在しない、例えば人為的に遺伝子を組み換えた菌株は、自ら実験室内などで作成し或いは他者から譲渡された菌株又はそれらを純粋培養して得た菌株を種菌として用いてもよい。
この種菌は、本培養の前に少量の培地で前培養（拡大培養）を行い、菌数を一定程度増やしておくのが好ましい。この前培養は、培養スケールが小さいこと等から、炭素源や培養期間中のｐＨなどに特段の制限はなく、リゾビウム属菌の前培養方法として公知の培地や培養条件を適宜利用可能である。
次に、本培養である該リゾビウム属菌の液体培養を行うが、この本培養の培地に用いる炭素源としては、二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上、好ましくは４０質量％以上、更に好ましくは５５質量％以上、最も好ましくは７０質量％以上を占めるようにする。使用する二糖類の例としては、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、イソトレハロース、ネオトレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ネオラクトース、ガラクトスクロース、シラビオース、ルチノース、ビシアノース、キシロビオース、プリメベロースなどが挙げられ、マルトース、トレハロース、スクロース、ラクトースから選ばれる１種又は２種以上を用いるのが好適例として示されるが、これらに限定されるものではない。
培地に用いる二糖類以外の成分は、リゾビウム属菌液体培養に用いることができるものでよく、微生物の液体培養に通常使用される、炭素源、窒素源、無機塩類等が示される。例えば、炭素源として、デンプン、糖蜜等の糖類、クエン酸等の有機酸など（但し、上記した二糖類との比率が維持されるような使用量）、窒素源として、酵母エキス、大豆ペプチド、肉エキス、ペプトン等の有機窒素源や、アンモニア、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩や硝酸塩等の無機窒素源などが利用できる。無機塩としては、リン酸、カリウム、マグネシウム、マンガン、ナトリウム等の塩類が挙げられ、ビタミン等の微量有機栄養素も添加可能である。また、消泡剤としてはリゾビウム属菌の生育に影響がなく、消泡効果を有するいずれの消泡剤（例えばシリコーン系、ポリエーテル系など）も利用できる。
このような培地を用いてリゾビウム属菌を液体培養するが、本培養の培養条件は、好気的条件下に、例えば通気撹拌や振盪培養等によって培養することができ、流加培養を行うこともできる。培養温度条件及び培養時間は特に限定はないが、培養温度は１０～４０℃程度、好ましくは１５～３５℃程度の範囲から選択され、培養時間は２４～７２時間程度が目安として示される。
更に、この本培養において、培養開始時から培養終了時まで常に培養液のｐＨを５．０～７．０、より好ましくは５．５～７．０に保持（維持）しながら培養を行う。例えば、ＡＲＫ－１菌株またはＡＲＫ－２菌株またはＡＲＫ－３菌株を培養する場合には培養液のｐＨを５．０～７．０、より好ましくは５．５～７．０、最も好ましくは６．０～７．０に保持（維持）しながら培養を行い、Ｋ８４菌株を培養する場合には培養液のｐＨを５．０～７．０、より好ましくは５．０～６．５、最も好ましくは５．０～６．０に保持（維持）しながら培養を行うのが良い。これにより、培養液の粘度上昇を抑制するだけでなく、培養終了時のリゾビウム属菌生菌数の向上も可能となる。ｐＨを保持するための方法は特に限定されないが、通常、リゾビウム属菌の液体培養液ｐＨは培養が進むとともに徐々に上昇していく場合が多いため、リン酸、硫酸等の酸を用いてｐＨ上昇を抑制する方法が好適である。一方、ｐＨを上昇させたい場合は水酸化ナトリウムやアンモニア等の塩基を用いれば良い。また、酢酸と酢酸ナトリウムの組み合わせ、リン酸水素２カリウムとリン酸２水素カリウムの組み合わせ等、弱酸とその塩あるいは弱塩基とその塩をあらかじめ培地に配合するか培養中に適宜添加し、それらの緩衝作用を用いる方法なども例示される。
なお、前記培養操作は全て無菌的に行い、培地成分やｐＨ調整に用いる材料には滅菌したものを用いる。滅菌方法としては、典型的にはオートクレーブを用いた蒸気滅菌が採用されるが、高温や高圧に耐えない材料においては、適当な代替手段を採ってもよい。蒸気滅菌以外の滅菌方法としては火炎滅菌、乾熱滅菌などの加熱による方法、γ線、Ｘ線、波長２００～２８０ｎｍの紫外線（ＵＶ－Ｃ）のような電離放射線又はマイクロ波や高周波のような非電離放射線などの電磁波照射による滅菌方法、酸化エチレンガスなどによるガス滅菌、エタノール滅菌、過酸化水素低温プラズマ滅菌、グルタルアルデヒド、フタルジアルデヒド、次亜塩素酸、過酢酸などによる化学滅菌などの化学作用による滅菌方法、濾過滅菌などの分離除去による滅菌方法などを挙げることができるが、特に限定されない。
このような培養法により得られたリゾビウム属菌の培養液は、そのまま微生物農薬又は原体として利用することができるが、これは実使用時に多量の培養液が必要となる。運送及び保管等を考慮すると、生菌体の濃縮及び／又は製剤化等を行い、より高濃度でコンパクトな形態とすることによりコスト低減に繋がる。生菌体を濃縮する方法としては、遠心分離や膜濃縮等の通常の方法が挙げられる。本発明においては、液体培養終了時の粘度が高くないため、この濃縮工程を非常に簡便且つ効率的に行うことができる。また、製剤化の方法としては凍結乾燥、流動層乾燥及びスプレードライ乾燥等の方法が挙げられるが、特に凍結乾燥組成物とすることが好適である。また、乾燥等により製剤化する際には保護剤（タンパク質及びその加水分解物、炭水化物、糖アルコール、アミノ酸及びその塩類、イオン性ハロゲン化物塩など）を培養終了時の培養液あるいは濃縮液に添加することが好ましい。
なお、本発明は、工業生産などにおける培養液量５Ｌ以上の大量培養時（大量液体培養時）に特に効果を発揮することが特徴である。大量培養においては、培養液粘度の上昇は攪拌不良、通気不良に陥りやすく、また、培養終了後の濃縮工程が極めて困難となる場合が非常に多い。本発明は、このような大量培養においても十分な効果を奏する。
このようにして培養されたリゾビウム属菌生菌体や、ここから得られた製剤等は、非病原性菌であれば根頭がんしゅ病防除などの生物農薬として使用できる。例えば、この生物農薬を植物体（種子を含む）又は土壌に適用（地上散布処理、土壌灌注処理、植物を菌液に浸漬する処理、植物に菌粉を粉衣する処理等）することにより農園芸作物を根頭がんしゅ病などから防除することができる。
この生物農薬の施用対象植物の種類は特に制限されないが、具体的にはリンゴ、バラ、スモモ、オウトウなどのバラ科植物、キクなどのキク科植物、ブドウなどのブドウ科植物、トマトなどのナス科植物を例示することができる。前記のＡＲＫ－１株及びＡＲＫ－３株は、上記植物のいずれに対しても高い根頭がんしゅ病防除効果を発揮する。また、ＡＲＫ－２株は、上記植物のうち、特にバラ、ブドウ及びトマトに対して根頭がんしゅ病防除効果を発揮する。Ｋ８４株は、上記植物のうち、特にリンゴ、バラ、キクに対して根頭がんしゅ病防除効果を発揮する。
このようにして、二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用してリゾビウム属菌を液体培養し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持することで、リゾビウム属菌の培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保つ（粘度上昇を抑制する）ことができ、その後の濃縮や生菌体分離が容易且つ効率的となり、また、生菌数の向上も可能となり、工業生産等において非常に効率的となる。
なお、本発明において「炭素源」とは、炭素、水素、酸素から構成される、液体培養中にリゾビウム属菌に資化され得る化合物（主として糖類や有機酸）を意味する。
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内においてこれらの様々な変形が可能である。なお、下記実施例の操作は全て無菌的に行った。また、以下の記載において「部」は質量部を表す。
＜ＮＡ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ）平板培地の調製＞
肉エキス５部、ペプトン１０部、塩化ナトリウム５部、寒天１５部及び水１０００部を混合し、加熱して完全に溶解させた後、シャーレに流し入れ、冷却して、ＮＡ平板培地を調製した。
肉エキス５部、ペプトン１０部、塩化ナトリウム５部、寒天１５部及び水１０００部を混合し、加熱して完全に溶解させた後、シャーレに流し入れ、冷却して、ＮＡ平板培地を調製した。
＜前培養用培地の調製＞
大豆ペプチド１７部、酵母エキス３部、グルコース２．５部、塩化ナトリウム５部及び水１０００部を混合して前培養用培地を調製した。
大豆ペプチド１７部、酵母エキス３部、グルコース２．５部、塩化ナトリウム５部及び水１０００部を混合して前培養用培地を調製した。
＜試験例１＞
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１菌株のグリセリンストックを解凍して前記ＮＡ培地に画線法にて接種し、２８℃の恒温室内で１日間静置培養して種菌とした。まず、前記前培養培地に種菌より一白金耳量を接種し、２８℃の恒温室内で１９０ｒｐｍのロータリーシェーカーを用いて１日間前培養を行った。次に、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３（消泡剤）を３０部及び水６０００部を混合して調製した培地をコントロールとし、別途炭素源としてマルトース、グルコース、フルクトース、マンニトール、トレハロース、ラクトース、スクロース、デンプンを各１２０部添加した６Ｌの８種培地成分及びコントロールに前培養液をそれぞれ接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中、各培養液のｐＨが７を超えないようにリン酸を用いてｐＨ７以下制御（おおよそｐＨ６．５～７．０の範囲）で培養を行った。
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１菌株のグリセリンストックを解凍して前記ＮＡ培地に画線法にて接種し、２８℃の恒温室内で１日間静置培養して種菌とした。まず、前記前培養培地に種菌より一白金耳量を接種し、２８℃の恒温室内で１９０ｒｐｍのロータリーシェーカーを用いて１日間前培養を行った。次に、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３（消泡剤）を３０部及び水６０００部を混合して調製した培地をコントロールとし、別途炭素源としてマルトース、グルコース、フルクトース、マンニトール、トレハロース、ラクトース、スクロース、デンプンを各１２０部添加した６Ｌの８種培地成分及びコントロールに前培養液をそれぞれ接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中、各培養液のｐＨが７を超えないようにリン酸を用いてｐＨ７以下制御（おおよそｐＨ６．５～７．０の範囲）で培養を行った。
そして、培養終了時の各培養液粘度（ｍＰａ・ｓ）及び生菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）を常法により測定した。その結果を下記表１に示す。
この結果から、グルコース、フルクトース及びマンニトールを炭素源とした場合の培養液粘度はかなり上昇し、デンプンを炭素源とした場合は培養液粘度が低い結果であったが、ＡＲＫ－１菌株はデンプンを資化できないためにコントロールと同程度の粘度、生菌数であると推察された。これら炭素源と比較して、マルトース、トレハロース、ラクトース及びスクロースを炭素源とした場合は培養液が低粘度であり、培養終了時の生菌数も十分であって、二糖類を炭素源として用いて培養を行い且つ培養期間中のｐＨ調整を行うと、ＡＲＫ－１菌株培養液粘度の上昇が抑制され且つ生菌数も向上することが明らかとなった。
また、種菌及び前培養は上記と同様に行い、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を３０部及び水６０００部を混合して調製した培地に、別途炭素源としてマルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースを各１２０部添加した６Ｌの４種培地成分にそれぞれ前培養液を接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行う試験も行った。なお、この培養期間中、培養液のｐＨ制御は行わずに培養を行った。
そして、培養終了時の各培養液ｐＨ、培養液粘度及び生菌数を常法により測定した。その結果を下記表２に示す。
この結果、グルコースなど二糖類以外を炭素源とした場合ほどではないものの、いずれも同じ二糖類を炭素源としてｐＨ調整を行った場合と比較して、培養液粘度はやや上昇し、生菌数もやや少ないことが示された。以上より、炭素源として二糖類を使用し、且つ、培養期間中にｐＨ調整を行うことが、ＡＲＫ－１菌株培養液の粘度上昇抑制及びＡＲＫ－１菌株の生菌数向上という点において非常に有効であることが明らかとなった。
＜試験例２＞
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株及びアグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株のグリセリンストックを解凍して前記ＮＡ培地に画線法にて接種し、２８℃の恒温室内で１日間静置培養して種菌とした。まず、前記前培養培地に種菌より一白金耳量を接種し、２８℃の恒温室内で１９０ｒｐｍのロータリーシェーカーを用いて１日間前培養を行った。次に、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３（消泡剤）を３０部及び水６０００部を混合して調製した培地をコントロールとし、別途炭素源としてマルトース、グルコース、マンニトールを各１２０部添加した６Ｌの３種培地成分及びコントロールに前培養液をそれぞれ接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株は、各培養液のｐＨが７．０を超えないようにリン酸を用いてｐＨ７．０以下制御、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株は各培養液のｐＨが６．０を超えないようにリン酸を用いてｐＨ６．０以下制御、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株の炭素源にグルコースを用いた培養のみアンモニア水を用いてｐＨ５．０以上の制御を加えた。
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株及びアグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株のグリセリンストックを解凍して前記ＮＡ培地に画線法にて接種し、２８℃の恒温室内で１日間静置培養して種菌とした。まず、前記前培養培地に種菌より一白金耳量を接種し、２８℃の恒温室内で１９０ｒｐｍのロータリーシェーカーを用いて１日間前培養を行った。次に、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３（消泡剤）を３０部及び水６０００部を混合して調製した培地をコントロールとし、別途炭素源としてマルトース、グルコース、マンニトールを各１２０部添加した６Ｌの３種培地成分及びコントロールに前培養液をそれぞれ接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株は、各培養液のｐＨが７．０を超えないようにリン酸を用いてｐＨ７．０以下制御、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株は各培養液のｐＨが６．０を超えないようにリン酸を用いてｐＨ６．０以下制御、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株の炭素源にグルコースを用いた培養のみアンモニア水を用いてｐＨ５．０以上の制御を加えた。
培養終了後の各培養液粘度（ｍＰａ・ｓ）及び生菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）を常法により測定した。その結果を下記表３に示す。
単糖類であるグルコース及び糖アルコール類であるマンニトールと比較して、二糖類であるマルトースを炭素源とした場合は、培養液粘度が低粘度であり、生菌数も十分であった。リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株及びアグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株もリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株と同様に、二糖類を炭素源として用いて培養を行い且つ培養期間中のｐＨ調整を行うと培養液粘度の上昇が抑制され且つ生菌数も向上した。
＜試験例３＞
種菌及び前培養は試験例１と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを３０６部、酵母エキスを５４部、塩化ナトリウムを９０部、マルトースを３６０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を９０部及び水１８０００部を混合して調製した１８Ｌの培地成分に前培養液を接種して、３０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中の培養液ｐＨが４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０を超えないような９種の系に分け、それぞれリン酸を用いて各培養液ｐＨが設定を超えないように（設定ｐＨから－０．５以内の範囲内で）制御して培養を行った。また、コントロールとして培養液のｐＨ制御無しで培養を行ったものも用意した。
種菌及び前培養は試験例１と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを３０６部、酵母エキスを５４部、塩化ナトリウムを９０部、マルトースを３６０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を９０部及び水１８０００部を混合して調製した１８Ｌの培地成分に前培養液を接種して、３０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中の培養液ｐＨが４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０を超えないような９種の系に分け、それぞれリン酸を用いて各培養液ｐＨが設定を超えないように（設定ｐＨから－０．５以内の範囲内で）制御して培養を行った。また、コントロールとして培養液のｐＨ制御無しで培養を行ったものも用意した。
そして、培養終了時の各培養液ｐＨ、培養液粘度及び生菌数を常法により測定した。その結果を下記表４に示す。
この結果、コントロールの培養終了時ｐＨは８．３であり、表３に示されるようにｐＨ７．５以上では培養液粘度がやや高く、ｐＨ４．５以下では増殖性が悪かった。これと比較して、ｐＨ５．０～７．０の範囲では培養液が低粘度であり、特にｐＨ５．５～７．０では生菌数も極めて向上することが明らかとなった。
＜試験例４＞
ＡＲＫ－１菌株の他に、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２菌株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３菌株、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株を用い、種菌の取得及び前培養の方法は試験例１と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、マルトースを１２０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を３０部及び水６０００部を混合して調製した６Ｌの培地成分に前培養液を接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。なお、本培養中の培養液ｐＨが７．０を超えないようにリン酸を用いて制御した場合と、ｐＨ制御をしない場合の２種類の試験を行い、これらの培養終了時の各培養液の粘度及び生菌数を常法により測定した結果を下記表５に示した。
ＡＲＫ－１菌株の他に、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２菌株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３菌株、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株を用い、種菌の取得及び前培養の方法は試験例１と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、マルトースを１２０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を３０部及び水６０００部を混合して調製した６Ｌの培地成分に前培養液を接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。なお、本培養中の培養液ｐＨが７．０を超えないようにリン酸を用いて制御した場合と、ｐＨ制御をしない場合の２種類の試験を行い、これらの培養終了時の各培養液の粘度及び生菌数を常法により測定した結果を下記表５に示した。
この結果から、ＡＲＫ－２菌株及びＡＲＫ－３菌株においても、ＡＲＫ－１菌株と同様に、本培養中の培養液ｐＨの制御が生菌数の向上と培養液粘度の低下に極めて有効であることが明らかとなった。また、Ｋ８４株においても、上記３菌株よりもやや効果は低いものの、やはり本培養中の培養液ｐＨの制御が生菌数の向上と培養液粘度の低下に有効であることが明らかとなった。
＜試験例５＞
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の他に、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株を用い、種菌の取得及び前培養の方法は試験例２と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、マルトースを１２０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を３０部及び水６０００部を混合して調製した６Ｌの培地成分に前培養液を接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った、なお、本培養中の培養液ｐＨが６．０を超えないようにリン酸を用いて制御した場合と、ｐＨ制御をしない場合の２種類の試験を行い、これらの培養終了時の各培養液の粘度及び生菌数を常法により測定した。結果を下記表６に示す。
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の他に、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株、アグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株を用い、種菌の取得及び前培養の方法は試験例２と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを１０２部、酵母エキスを１８部、塩化ナトリウムを３０部、マルトースを１２０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を３０部及び水６０００部を混合して調製した６Ｌの培地成分に前培養液を接種して、１０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った、なお、本培養中の培養液ｐＨが６．０を超えないようにリン酸を用いて制御した場合と、ｐＨ制御をしない場合の２種類の試験を行い、これらの培養終了時の各培養液の粘度及び生菌数を常法により測定した。結果を下記表６に示す。
この結果、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－２株、リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－３株及びアグロバクテリウム・ラジオバクター Ｋ８４株において本培養中のｐＨ制御が培養液粘度の上昇の抑制及び生菌数の向上に極めて有効であることが明らかとなった。
＜試験例６＞
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株を用い、種菌及び前培養は試験例２と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを３０６部、酵母エキスを５４部、塩化ナトリウムを９０部、マルトースを３６０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を９０部及び水１８０００部を混合して調製した１８Ｌの培地成分に前培養液を接種して、３０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中の培養液ｐＨが５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０を超えないような７種の系に分け、それぞれリン酸を用いて各培養液ｐＨが設定を超えないように（設定ｐＨから－０．５以内の範囲内で）制御して培養を行った。また、コントロールとして培養液のｐＨ制御無しで培養を行った。本培養終了後の培養液を遠心分離して上澄みを捨て、菌体濃縮物を得た。凍結乾燥用保護剤水溶液として、トレハロース２０部、グルタミン酸ナトリウム１０部、システイン塩酸塩８部、カルボキシメチルセルロースナトリウム１部及び水６１部を混合し、若干量の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に調整して凍結乾燥用保護剤水溶液を調製した。菌体濃縮物５０部と凍結乾燥用保護剤水溶液５０部を混合し、水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨ７に再度調整し、生菌原液を調製した。該生菌原液７．０ｇを１０ｍＬ容バイアル瓶に取り、－８０℃に設定したディープフリーザーで予備凍結した後、凍結乾燥装置（ＶｉｒＴｉｓ２５Ｌ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＳＱ Ｓｕｐｅｒ ＥＳ－５５、ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製品）を用いて、２００ｍ Ｔｏｒｒ程度に減圧して凍結乾燥を４８時間実施し、凍結乾燥組成物を得た。バイアル瓶内の凍結乾燥組成物の全質量は２．０ｇ、水分含量は７．９質量％であった。得られた凍結乾燥組成物は、密封したバイアル瓶の状態で６℃の冷蔵室又は２８℃の恒温室で静置保存した。
リゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株を用い、種菌及び前培養は試験例２と同様とし、本培養培地成分として大豆ペプチドを３０６部、酵母エキスを５４部、塩化ナトリウムを９０部、マルトースを３６０部、ディスホームＮＱＨ－７４０３を９０部及び水１８０００部を混合して調製した１８Ｌの培地成分に前培養液を接種して、３０Ｌジャーファーメンターを用いて２８℃で２日間本培養を行った。本培養中の培養液ｐＨが５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０を超えないような７種の系に分け、それぞれリン酸を用いて各培養液ｐＨが設定を超えないように（設定ｐＨから－０．５以内の範囲内で）制御して培養を行った。また、コントロールとして培養液のｐＨ制御無しで培養を行った。本培養終了後の培養液を遠心分離して上澄みを捨て、菌体濃縮物を得た。凍結乾燥用保護剤水溶液として、トレハロース２０部、グルタミン酸ナトリウム１０部、システイン塩酸塩８部、カルボキシメチルセルロースナトリウム１部及び水６１部を混合し、若干量の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に調整して凍結乾燥用保護剤水溶液を調製した。菌体濃縮物５０部と凍結乾燥用保護剤水溶液５０部を混合し、水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨ７に再度調整し、生菌原液を調製した。該生菌原液７．０ｇを１０ｍＬ容バイアル瓶に取り、－８０℃に設定したディープフリーザーで予備凍結した後、凍結乾燥装置（ＶｉｒＴｉｓ２５Ｌ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＳＱ Ｓｕｐｅｒ ＥＳ－５５、ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製品）を用いて、２００ｍ Ｔｏｒｒ程度に減圧して凍結乾燥を４８時間実施し、凍結乾燥組成物を得た。バイアル瓶内の凍結乾燥組成物の全質量は２．０ｇ、水分含量は７．９質量％であった。得られた凍結乾燥組成物は、密封したバイアル瓶の状態で６℃の冷蔵室又は２８℃の恒温室で静置保存した。
＜凍結乾燥直後の生菌生存率評価＞
試験例６の凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌数濃度（ｃｆｕ／ｇ）を常法により測定し、これに凍結乾燥組成物の全質量（ｇ）を乗じて、凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株総生菌数（ｃｆｕ）を求めた。この総生菌数を前記生菌原液７ｇ中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の総生菌数で除し、凍結乾燥直後のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌生存率（％）を算出した。
試験例６の凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌数濃度（ｃｆｕ／ｇ）を常法により測定し、これに凍結乾燥組成物の全質量（ｇ）を乗じて、凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株総生菌数（ｃｆｕ）を求めた。この総生菌数を前記生菌原液７ｇ中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の総生菌数で除し、凍結乾燥直後のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌生存率（％）を算出した。
＜保存安定性の生菌生存率評価＞
各保存日数時の凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌数濃度（ｃｆｕ／ｇ）を常法により測定し、これに凍結乾燥組成物の全質量（ｇ）を乗じて、凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株総生菌数（ｃｆｕ）を求めた。この総生菌数を前記凍結乾燥直後の総生菌数で除し、各保存日数時のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌生存率（％）を算出した。
各保存日数時の凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌数濃度（ｃｆｕ／ｇ）を常法により測定し、これに凍結乾燥組成物の全質量（ｇ）を乗じて、凍結乾燥組成物中のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株総生菌数（ｃｆｕ）を求めた。この総生菌数を前記凍結乾燥直後の総生菌数で除し、各保存日数時のリゾビウム・ヴィティス ＡＲＫ－１株の生菌生存率（％）を算出した。
各ｐＨ制御時で培養した培養液を用いた生菌原液の凍結乾燥前のバイアル瓶当り総生菌を下記表７に示す。
各ｐＨ制御時で培養した培養液を用いた凍結乾燥組成物の凍結乾燥直後の生菌生存率（％）の結果を下記表８に示す。
各ｐＨ制御時で培養した培養液を用いた凍結乾燥組成物の６℃での保存安定性の結果を下記表９に示す。
各ｐＨ制御時で培養した培養液を用いた凍結乾燥組成物の２８℃での保存安定性の結果を下記表１０に示す。
表８より、凍結乾燥直後の生菌生存率は、本培養中のｐＨ制御の有無で著しい差は見られなかったが、表９及び表１０に示されている通り、保存安定性はｐＨ７．５以上では保存安定性が低い結果であったが、ｐＨ６．０～７．０以下制御の範囲では６℃保存及び２８℃保存共に高い保存安定性を示した。本培養中のｐＨを７．０以下に制御することは、培養液の粘度の上昇の抑制及び生菌数の向上に加え、凍結乾燥組成物の保存安定性の向上にも極めて有効である。
本発明を要約すれば、以下の通りである。
本発明は、リゾビウム属菌の液体培養中及び培養終了時の培養液粘度を低く保つことができ、その後の濃縮や生菌体分離などが容易且つ効率的となるような培養方法等を提供することを目的とする。
そして、二糖類（例えば、マルトース、トレハロース、ラクトース、スクロースなど）が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める培地を使用し、且つ、培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持してリゾビウム属菌を液体培養することで、上記課題を解決する。
本発明で寄託されている微生物の受託番号を下記に示す。
（１）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）
（２）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）
（３）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）
（１）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）
（２）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）
（３）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）
Claims (5)
- リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｋ８４株のいずれかであるリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌株の培養方法であって、マルトース、トレハロース、ラクトースから選ばれる１種又は２種以上である二糖類が培地中の炭素源のうち２５質量％以上を占める液体培地を使用し、且つ、該培養液のｐＨを培養開始時から培養終了時まで５．０～７．０の範囲内に保持することを特徴とする、液体培養中及び培養終了時の培養液粘度の上昇を抑制することができる該リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌株の培養方法。
- 培養液量５Ｌ以上の大量培養であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 請求項１～２のいずれか１項に記載の方法で液体培養することを特徴とする、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｋ８４株のいずれかであるリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌株生菌体の製造方法。
- さらに、生菌体を凍結乾燥することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
- 請求項３～４のいずれか１項に記載の方法で製造することで得られる、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－１株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－２株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ－３株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１４２８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｋ８４株のいずれかである該リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌株の培養物。
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