CN116179418A - 防治根结线虫病用粪生鞘氨醇杆菌及其应用 - Google Patents

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CN116179418A CN202211558421.7A CN202211558421A CN116179418A CN 116179418 A CN116179418 A CN 116179418A CN 202211558421 A CN202211558421 A CN 202211558421A CN 116179418 A CN116179418 A CN 116179418A
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Abstract

本申请公开了一种防治根结线虫病用粪生鞘氨醇杆菌及其应用，为CCTCC No:M20221104的粪生鞘氨醇杆菌菌株PE05。该菌株对根结线虫具有较好的防治效果，利用PE05菌株制备的菌剂对雪茄烟叶根结线虫病的防效在70％以上，具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。可以作为根结线虫病生防菌微生物使用获得较好的防治效果。

Description

防治根结线虫病用粪生鞘氨醇杆菌及其应用
技术领域
本申请涉及微生物农药、微生物肥料技术领域，特别是一种防治根结线虫病用粪生鞘氨醇杆菌及其应用。
背景技术
植物寄生线虫是一类世界性分布的重要植物病原物，全球范围内每年造成的经济损失达1570亿美元(Abad et al.,2008)。根结线虫属(Meloidogyne)线虫是其中危害最严重的病原之一，可寄生烟草、蔬菜、粮食作物、经济作物、果树、观赏植物及杂草等2 000多种寄主(Sasser，1980)。
爪哇根结线虫(M.javanica)是危害最严重的根结线虫种类之一，也是危害雪茄烟叶根结线虫的优势种(马桂妹，等.2021)，对雪茄烟叶的种植及雪茄烟产业的发展影响极大。利用线虫生防菌开发菌剂防治根结线虫病是最环保的措施之一，利用生防微生物如Purpureocillium lilacinum、Pochonia chlamydosporia、Bacillus nematocida、Bacillus firmus、Pasteuriapenetrans、Burkholderia cepacia、Paenobacillusmacerans开发的杀线剂已在很多国家登记并应用于根结线虫病防治(Priyank et al.,2019)；但现有生防微生物种类有限。
粪生鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium faecale)是2022年新发表的细菌新物种(Chen et al.,2022)作用为产脱氨酶细菌，现有并未将该菌种用于根结线虫病防治中。
上述文献信息：Abad P，Gouzy J，Aury J，et al.Genome sequence of themetazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita.Nature Biotechnology，2008，26(8):909-915.
Sasser J N.Root-knot nematode:a global menace to cropproduction.Plant Disease，1980，64:36-41.
Priyank HM,Chinnannan K,Kadirvelu K,et al.,Plant growth promotingrhizobacteria(PGPR):A potential alternative tool for nematodes bio-control.Biocatalysis and Agricultural Biotechnology,2019,17:119-128.
Chen M,Li N,Zhang XF,et al.2022.Sphingobacterium faecalesp.nov.,a1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase producing bacterium isolated fromcamel faeces.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.2022；72:005215.
马桂妹，谭涛，杨东，等.云南江城雪茄烟根结线虫病的病原鉴定及生物源氨气熏蒸的防治效果研究.云南大学学报(自然科学版),2022,4:1-7.DOI:10.7540/j.ynu.20220171.
发明内容
本申请针对现有根结线虫病防治的问题提供了一种防治根结线虫病用粪生鞘氨醇杆菌及其应用，该菌株尤其适用于防治雪茄烟叶根结线虫。
本申请提供了一种防治根结线虫病用粪生鞘氨醇杆菌，为CCTCC No:M20221104的粪生鞘氨醇杆菌菌株PE05。
优选地，所述防治植株为雪茄烟烟株；优选地，雪茄烟烟株为云雪2号品种雪茄烟。
优选地，所述根结线虫病为爪哇根结线虫；优选地，菌株PE05对爪哇根结线虫J2的致死率达98％。
本申请提供菌株为从云南省普洱市江城县雪茄烟云雪2号品种的健康烟叶中分离获得，为粪生鞘氨醇杆菌PE05菌株。该菌株的保藏证编号为CCTCC No:M20221104。该菌株可以用于对防治根结线虫病，尤其适用于对烟株上感染的爪哇根结线虫，以及爪哇根结线虫J2的防治，含该菌株的菌剂防治效果与现有常用浓度10％噻唑膦颗粒剂接近，防效可达74％以上。
且该菌剂不会对环境造成污染，也不易产生耐药性，可安全长期使用，尤其适用于烟田种植面积较大区域使用。
本申请的另一方面提供了一种防治爪哇根结线虫病用发酵液，含如上述的粪生鞘氨醇杆菌PE05。可按现有微生物发酵方法采用LB培养基，制得发酵液，所得发酵液中同时含有该菌株的代谢产物，从而发挥较好的对根结线虫的防治效果。
优选地，所述发酵液的制备方法包括以下步骤：
斜面培养、种子液培养、发酵液培养后得到含该菌株的菌体及其代谢物的发酵液。
优选地，斜面培养条件：采用LB斜面培养基在32℃～37℃下培养1～2天；
种子液培养条件：采用LB液体培养基在32℃～37℃，100～150rpm条件下摇床培养2～3天，得到种子液；
发酵液培养条件：将种子液按体积比为3％-5％接种LB培养基中，发酵培养条件控制在：温度32℃～36℃，搅拌速度120～160rpm，发酵时间48～72小时，得到发酵液；
优选地，发酵液培养所用发酵罐容积为500-1000L。
采用上述条件培养发酵可制得含有该菌株的发酵液。
本申请的另一方面还提供了一种防治爪哇根结线虫病用生防菌剂，含如上述的粪生鞘氨醇杆菌PE05；
优选地，所述生防菌剂的制备方法包括：将如上述的发酵液，制粒，得到所述生防菌剂；
优选地，所述制粒操作为将所述发酵液与可溶性玉米淀粉混合后，经喷雾干燥制粒得到所述生防菌剂。
通过将发酵液制粒后，能制得具有生物活性的生物防治菌剂，该菌剂便于运输，使用时加水稀释即可，使用方便。具体可采用现有常用生物菌剂制备方法制粒。具体参数参照现有生物菌剂制备参数设置。更优选地，植株种子为烟草种子。该菌剂可以用于各类植物根结线虫的防治中，例如还可以为番茄种子、花生植株、黄瓜植株。
优选地，所述生防菌剂的含水量控制在5％以下；所述生防菌剂中所含粪生鞘氨醇杆菌PE05菌株的有效活菌数在10亿CFU/克以上。
优选地，所述生防菌剂的使用方法：所述菌剂兑水稀释得到菌液，将植株种子浸泡于菌液中2～3小时，取出种子进行育苗或/和移栽；
或，所述生防菌剂的使用方法：所述菌剂兑水稀释后得到菌液，浇透育苗基质后进行播种育苗和移栽。
或，所述生防菌剂的使用方法包括以下步骤：所述菌剂兑水稀释后得到菌液；育苗，移栽植株后在移栽后第2天，取菌液灌根；移栽后第30天取菌液灌根。
所得生防菌剂采用上述方法进行使用，能获得较好的使用效果，对根结线虫的防效可达74％以上，尤其适用于对烟草雪茄烟植株的根结线虫防治。
优选地，兑水稀释倍数为稀释菌剂50～500倍；
优选地，兑水稀释倍数为稀释菌剂50～100倍。稀释兑水倍数可根据需要在该范围内调整。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的防治根结线虫病用粪生鞘氨醇杆菌，该菌株对根结线虫具有较好的防治效果，利用PE05菌株制备的菌剂对雪茄烟叶根结线虫病的防效在70％以上，具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。可以作为根结线虫病生防菌微生物使用获得较好的防治效果。
2)本申请所提供的防治根结线虫病用粪生鞘氨醇杆菌，该菌株的室内生测表明该菌株对爪哇根结线虫二龄幼虫(J2)的致死率高达98％，该菌株的发酵制品运用于温室试验及田间试验，所得结果表明该菌株对危害雪茄烟叶的爪哇根结线虫有很好的防效，可实现对爪哇根结线虫的有效防治。
生物保藏信息：
粪生鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium faecale)PE05菌株于2022年7月13日保存于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：保藏单位地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学；保藏号：CCTCC No:M20221104。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。
因此，以下对本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例
以下实施例中所用物料、种子和仪器，如无特殊说明均为商业渠道获得。
以下实施例中所用LB培养基为：胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl10.0g，加蒸馏水至1 000ml，pH＝7.0～7.5。
实施例1获得PE05菌株
采用现有分离内生细菌的方法(如：冯云利，等.2011.烤烟品种NC297内生细菌中拮抗烟草黑胫病的生防菌筛选及种群组成分析.云南大学学报，33(4):488～496)，从云南省普洱市江城县雪茄烟健康云雪2号品种的雪茄烟叶、根和茎上获得52株内生细菌，将所得52株内生细菌用LB液体培养基在37℃、120rpm下摇瓶培养48小时。
取每株菌的发酵液2ml置于培养皿中，并在培养皿中加入500条左右的爪哇根结线虫J2。并设置3个平行处理。
以LB培养基液体为空白对照。
于放置操作24小时后镜检各处理的线虫死亡率平均值。死亡率(％)＝死亡线虫数/镜检线虫总数*100％。
根据镜检结果按上式计算，所得结果显示，PE05菌株对爪哇根结线虫J2的致死率达98％；空白对照的爪哇根结线虫J2死亡率为0。
在从事线虫生防菌筛选研究中，从雪茄烟叶健康植株中分离到52种内生细菌；以侵染雪茄烟叶根结线虫的J2为靶标，测定各菌株LB培养基发酵液对J2的致死率，发现从云南省普洱市江城县雪茄烟云雪2号品种的健康烟叶中分离到粪生鞘氨醇杆菌PE05菌株对J2的致死率高达98％，具有极好的应用前景，并继续进行进一步的研究。
实施例2PE05菌株的培养及菌剂制备
试管斜面种子培养：将PE05菌株接种到LB培养基斜面上，32℃下培养2天后获得斜面种子。
菌株液体种子培养：将斜面种子接种到装有LB液体培养基的三角瓶中，35℃，120rpm条件下摇床培养2天获得种子液。
菌株发酵罐培养：将种子液按3％(V/V)的比例接种LB培养基中，发酵采用发酵罐进行。所用发酵罐容积为700L，发酵培养条件控制在：温度35℃，搅拌速度140rpm，发酵时间50小时，得到发酵液。发酵液中含该菌株的菌体及其代谢物。
含PE05菌株的菌剂制备：将发酵液与可溶性玉米淀粉混合后经喷雾干燥制得菌剂。所加可溶性玉米淀粉量根据喷雾干燥制粒要求调整。
所得菌剂的含水量控制在5％以下，菌剂中PE05菌株中有效活菌数在10亿CFU/克以上。
实施例3PE05菌剂处理种子对雪茄烟叶根结线虫病的防效
试验地点：云南省普洱市江城县整董镇整董村雪茄烟叶种植基地。
试验作物：雪茄烟叶(品种：云雪2号)。
供试药剂：按上述实施例中方法制备得到的PE05菌剂，活菌数含量为10亿CFU/克。
对照组所用农药：防治根结线虫用农药：10％噻唑膦颗粒剂(山东省联合农药工业有限公司生产)。
试验方法：共设以下三个处理，每个处理设置3个重复，每个重复的面积为0.3亩，随机排列。
处理1：将实施例2中所得菌剂兑水稀释50倍，将烟草种子浸泡于菌液中2-3小时，然后取出种子，按常规方法育苗和移栽。
处理2：整地时将10％噻唑膦颗粒剂(1500克/亩)撒施在厢面上并均匀混入耕作层；移栽未经PE05菌剂处理的常规烟苗。
处理3：不施用任何农药的空白对照；移栽未经PE05菌剂处理的常规烟苗。
调查和统计方法：雪茄烟叶采收结束后调查植株根瘤病级指数(0级：根部正常无根瘤；1级：四分之一以下根上有少量根结；3级：四分之一至三分之一根上有少量根结；5级：三分之一至二分之一根上有根结；7级：二分之一以上根上有根结，少量次生根上产生根结；9级：所有根上(包括次生根)长满根结，并按以下公式计算病情指数和防效：
病情指数＝(n1×1+n3×3+n5×5+n7×7+n9×9)/(S×9)×100，n1-n9分别代表根瘤病级指数1-9级相应的植株总数，S代表调查的植株总数。防效(％)＝100(1-x/y)，x、y分别代表处理和空白对照的病情指数。
雪茄烟叶根结线虫病的防效试验结果显示(表1)：
处理1中用10亿CFU/克实施例2中所得菌剂50倍液处理种子后，正常进行育苗移栽，对根结线虫病的防效达75.37％，与对照农药10％噻唑膦颗粒剂的防效(80.12％)相当。
所得结果参见下表：
表1.各处理对雪茄烟叶根结线虫病的防效结果
处理 病情指数 防效(％)
处理1(PE05菌剂) 9.87b 75.37a
处理2(农药处理) 7.97b 80.12a
处理3(空白对照) 40.1a -
注：同一列数字后字母相同表示无显著差异，反之差异显著。
实施例4PE05菌剂处理育苗基质对雪茄烟叶根结线虫病的防效
试验地点：云南省普洱市江城县整董镇整董村雪茄烟叶种植基地。
试验作物：雪茄烟叶(品种：云雪2号)。
供试药剂：PE05菌剂，活菌数含量为10亿CFU/克，按本发明上述方法制备；防治根结线虫的对照农药为10％噻唑膦颗粒剂(山东省联合农药工业有限公司生产)。
试验方法：共设以下三个处理，每个处理3个重复，每个重复0.3亩。
处理1：将育苗基质装入育苗盘中，取适量的实施例2中所得菌剂兑水稀释100倍后浇透育苗基质，然后按常规方法播种育苗和移栽。
处理2：整地时将10％噻唑膦颗粒剂(1500克/亩)撒施在厢面上并均匀混入耕作层；移栽未经PE05菌剂处理的常规烟苗。
处理3：不施用任何农药的空白对照；移栽未经PE05菌剂处理的常规烟苗
调查和统计方法：雪茄烟叶采收结束后调查植株根瘤病级指数(0级：根部正常无根瘤；1级：四分之一以下根上有少量根结；3级：四分之一至三分之一根上有少量根结；5级：三分之一至二分之一根上有根结；7级：二分之一以上根上有根结，少量次生根上产生根结；9级：所有根上(包括次生根)长满根结，并按以下公式计算病情指数和防效：
病情指数＝(n1×1+n3×3+n5×5+n7×7+n9×9)/(S×9)×100,n1-n9分别代表根瘤病级指数1-9级相应的植株总数，S代表调查的植株总数。防效(％)＝100(1-x/y)，x、y分别代表处理和空白对照的病情指数。所得结果参见下表：
表2.各处理育苗基质对雪茄烟叶根结线虫病的防效结果
处理 病情指数 防效(％)
处理1(PE05菌剂) 8.14b 78.36a
处理2(农药处理) 7.93b 78.92a
处理3(空白对照) 37.62a -
注：同一列数字后字母相同表示无显著差异，反之差异显著。
试验结果显示(表2)：处理1中用10亿CFU/克PE05菌剂100倍液处理育苗基质后育苗移栽，对根结线虫病的防效达78.36％，与对照农药10％噻唑膦颗粒剂的防效(78.92％)相当。
实施例5PE05菌剂灌根对雪茄烟叶根结线虫病的防效
试验地点：云南省普洱市江城县整董镇整董村雪茄烟叶种植基地。
试验作物：雪茄烟叶(品种：云雪2号)。
供试药剂：PE05菌剂，活菌数含量为10亿CFU/克，按本发明上述方法制备；防治根结线虫的对照农药为10％噻唑膦颗粒剂(山东省联合农药工业有限公司生产)。
试验方法：共设以下三个处理，每个处理3个重复，每个重复0.3亩。
处理1：按常规育苗移栽，移栽后第2天取实施例2中所得菌剂兑水稀释500倍灌根，200毫升/株；移栽后第30天再灌根1次。
处理2：整地时将10％噻唑膦颗粒剂(1500克/亩)撒施在厢面上并均匀混入耕作层。
处理3：不施用任何农药的空白对照。
调查和统计方法：雪茄烟叶采收结束后调查植株根瘤病级指数(0级：根部正常无根瘤；1级：四分之一以下根上有少量根结；3级：四分之一至三分之一根上有少量根结；5级：三分之一至二分之一根上有根结；7级：二分之一以上根上有根结，少量次生根上产生根结；9级：所有根上(包括次生根)，并按以下公式计算病情指数和防效：
病情指数＝(n1×1+n3×3+n5×5+n7×7+n9×9)/(S×9)×100,n1-n9分别代表根瘤病级指数1-9级相应的植株总数，S代表调查的植株总数。防效(％)＝100(1-x/y)，x、y分别代表处理和空白对照的病情指数。所得结果参见下表：
表3.PE05菌剂灌根对雪茄烟叶根结线虫病的防效
处理 病情指数 防效(％)
处理1(PE05菌剂) 11.02b 74.02a
处理2(化学药剂处理) 10.33b 75.64a
处理3(空白对照) 42.41a -
注：同一列数字后字母相同表示无显著差异，反之差异显著。
从根系上的根瘤数量来看，处理(空白对照)
试验结果显示(表3)：处理1中用10亿CFU/克PE05菌剂500倍液在移栽后灌根2次，对根结线虫病的防效达74.02％，与对照农药10％噻唑膦颗粒剂的防效(75.64％)相当。
由上可知，本申请提供的该菌株对根结线虫具有较好的防治效果，可作为生防菌剂使用，达到对根结线虫的防治。
实施例6
与实施例2的区别在于：试管斜面种子培养：将PE05菌株接种到LB培养基斜面上，30℃下培养1天后获得斜面种子。
菌株液体种子培养：将斜面种子接种到装有LB液体培养基的三角瓶中，30℃，100rpm条件下摇床培养2天获得种子液。
菌株发酵罐培养：将种子液按3％(V/V)的比例接种LB培养基中，发酵采用发酵罐进行。所用发酵罐容积为1000L，发酵培养条件控制在：温度37℃，搅拌速度160rpm，发酵时间72小时，得到发酵液。发酵液中含该菌株的菌体及其代谢物。
实施例7
与实施例2的区别在于：
试管斜面种子培养：将PE05菌株接种到LB培养基斜面上，37℃下培养2天后获得斜面种子。
菌株液体种子培养：将斜面种子接种到装有LB液体培养基的三角瓶中，37℃，150rpm条件下摇床培养3天获得种子液。
菌株发酵罐培养：将种子液按5％(V/V)的比例接种LB培养基中，发酵采用发酵罐进行。所用发酵罐容积为500L，发酵培养条件控制在：温度30℃，搅拌速度120rpm，发酵时间48小时，得到发酵液。发酵液中含该菌株的菌体及其代谢物。
实施例7～8所得菌剂防效结果与实施例2所得菌剂的防效结果类似，在此不累述。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种防治根结线虫病用粪生鞘氨醇杆菌，其特征在于，为CCTCC No:M20221104的粪生鞘氨醇杆菌菌株PE05。
2.根据权利要求1所述的防治根结线虫病用粪生鞘氨醇杆菌，其特征在于，所述防治植株为雪茄烟烟株；优选地，雪茄烟烟株为云雪2号品种雪茄烟。
3.根据权利要求1所述的防治根结线虫病用粪生鞘氨醇杆菌，其特征在于，所述根结线虫病为爪哇根结线虫；优选地，菌株PE05对爪哇根结线虫J2的致死率达98％。
4.一种防治根结线虫病用发酵液，其特征在于，含如权利要求1～3中任一项所述的粪生鞘氨醇杆菌PE05。
5.根据权利要求4所述的发酵液，其特征在于，所述发酵液的制备方法包括以下步骤：
斜面培养、种子液培养、发酵液培养后得到含该菌株的菌体及其代谢物的发酵液。
6.根据权利要求5所述的发酵液法，其特征在于，斜面培养条件：采用LB斜面培养基在30℃～37℃下培养1～2天；
种子液培养条件：采用LB液体培养基在30℃～37℃，100～150rpm条件下摇床培养2～3天，得到种子液；
发酵液培养条件：将种子液按体积比为3％-5％接种LB培养基中，发酵培养条件控制在：温度30℃～37℃，搅拌速度120～160rpm，发酵时间48～72小时，得到发酵液；
优选地，发酵液培养所用发酵罐容积为500-1000L。
7.一种防治根结线虫病用生防菌剂，其特征在于，含如权利要求1～3中任一项所述的粪生鞘氨醇杆菌PE05；
优选地，所述生防菌剂的制备方法包括：将如权利要求4或5中任一项所述的发酵液，制粒，得到所述生防菌剂；
优选地，所述制粒操作为将所述发酵液与可溶性玉米淀粉混合后，经喷雾干燥制粒得到所述生防菌剂。
8.根据权利要求7所述的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂的含水量控制在5％以下；所述生防菌剂中所含粪生鞘氨醇杆菌菌株PE05的有效活菌数在10亿CFU/克以上。
9.根据权利要求7所述的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂的使用方法：所述菌剂兑水稀释得到菌液，将植株种子浸泡于菌液中2～3小时，取出种子进行育苗或/和移栽；
或，所述生防菌剂的使用方法：所述菌剂兑水稀释后得到菌液，浇透育苗基质后进行播种育苗和移栽。
或，所述生防菌剂的使用方法包括以下步骤：所述菌剂兑水稀释后得到菌液；育苗，移栽植株后在移栽后第2天，取菌液灌根；移栽后第30天取菌液灌根。
10.根据权利要求7所述的生防菌剂，其特征在于，兑水稀释倍数为稀释菌剂50～500倍；
优选地，兑水稀释倍数为稀释菌剂50～100倍。
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