CN114276962B

CN114276962B - 一株假格里尼翁苍白杆菌及其防治疫霉的应用

Info

Publication number: CN114276962B
Application number: CN202111657289.0A
Authority: CN
Inventors: 黄�俊; 向梅春; 张龙; 叶伟伟; 杨晓燕
Original assignee: Shandong Jinniu Group Co ltd
Current assignee: Shandong Jinniu Group Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114276962A

Abstract

本发明涉及一株假格里尼翁苍白杆菌及其防治疫霉的应用，属于微生物技术领域，提供了一株具有高效防治植物疫霉病害的假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株，可以抑制疫霉菌丝生长、降低孢子囊数量和游动孢子浓度，并引起菌丝畸形肿胀、分支分隔数增加；离体叶片实验表明NC1菌株对疫霉引起的植物病害也具有较强的防护作用，是一株能用于防治疫霉病害的微生物种质资源。本发明制备的微生物菌剂不仅能够有效防治疫霉病害，而且促进作物生长，具有无污染无残留、不产生抗药性、对环境无害、对人类健康的特点，具有良好的应用开发前景。

Description

一株假格里尼翁苍白杆菌及其防治疫霉的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株假格里尼翁苍白杆菌及其防治疫霉的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

疫霉属(Phytophthora)隶属于腐霉科(Pythiaceae)，此属大多寄生，疫霉菌几乎都是植物病原菌，诱发许多重要的植物病害，所引起的病害通常称为疫病。疫霉菌以厚垣孢子或卵孢子在土壤中存活，在土壤中的腐生能力不强。疫霉菌的寄主范围很广，可以侵染植物地上和地下部分，危害植物在病斑表面形成类似于腐霉菌的白色棉絮状物或近似于霜霉菌的霜状霉层。病菌从侵入到发病，潜育期不过3-4天，病叶上产生的孢子囊又可继续传播，不断引起再次侵染，病害可以从叶片扩展到叶柄和茎，发病严重的几天内整株枯萎腐烂，造成严重的经济损失。目前，对疫病常用的防治手段是化学防治和生物防治。化学防治主要采用甲霜灵、霜疫克、疫霜锰锌、福美双等药剂，但大量重复使用化学药剂不仅会使病菌发生变异产生耐药性，而且增加生产成本和污染环境，危害人类健康；生物防治无残留无污染、不会产生抗药性、有利于环保及食品安全，因此，生物防治越来越受到科研工作者和消费者的青睐。

中国专利CN106244480A公开了一株假格里尼翁苍白杆菌及其防治植物寄生线虫的应用。假格里尼翁苍白杆菌(Ochrobactrum pseudogrignonense)NC1是从上千株细菌中筛选出来的具有生物防治功能的优良菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12154。现有研究发现NC1能够有效防治寄生线虫导致植物病害，但对于其他类型的植物病害是否也有良好的防治效果，尚未研究，限制了该优良菌株商业化应用范围。

发明内容

为了解决上述问题，本发明开展进一步的深入研究，提供了一种采用假格里尼翁苍白杆菌防治疫霉的方法及其应用，发现该菌株在防治疫霉病害上有良好效果，拓宽了其应用范围，解决了化学杀菌剂对环境污染及食品安全带来的问题，该菌株能够有效防治疫霉，并且能对植物生长有良好的促进作用。

本发明的第一个方面，提供了假格里尼翁苍白杆菌或其产生的挥发性有机物在防治疫霉中的应用。

本发明通过与假格里尼翁苍白杆菌所有单位的技术合作，对假格里尼翁苍白杆菌对其他植物病害的防治效果进行了系统研究和大规模实验模式，发现：NC1菌株及其挥发性有机化合物对于疫霉具有特异性的杀菌效果，并利用假格里尼翁苍白杆菌NC1对疫霉的防治作用，开发出了一株能用于防治疫霉病害的微生物种质资源。

本发明的第二个方面，提供了假格里尼翁苍白杆菌或其产生的挥发性有机物在抑制疫霉菌丝生长、降低孢子囊数量、降低游动孢子浓度、引起菌丝畸形肿胀或增加分支分隔数中的应用。

本发明的第三个方面，提供了一种采用假格里尼翁苍白杆菌防治疫霉的方法，包括：

将假格里尼翁苍白杆菌活化、种子培养，发酵培养，得到发酵液；

将所述发酵液稀释后，加入海藻酸钠、黄腐酸钾Ⅰ型或腐殖酸钾，混合均匀，得到菌剂；

将所述菌剂在植物上施用，即得。

本发明的第四个方面，提供了上述的方法制备的菌剂。

由于本发明制备的菌剂具有较优的防治疫霉，且制备工艺简单，性能稳定。因此，有望在农业领域得到广泛的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一株具有高效防治植物疫霉病害的假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株，可以抑制疫霉菌丝生长、降低孢子囊数量和游动孢子浓度，并引起菌丝畸形肿胀、分支分隔数增加；离体叶片实验表明NC1菌株对疫霉引起的植物病害也具有较强的防护作用，是一株能用于防治疫霉病害的微生物种质资源。

(2)本发明制备的微生物菌剂不仅能够有效防治疫霉病害，而且促进作物生长，具有无污染无残留、不产生抗药性、对环境无害、对人类健康的特点，具有良好的应用开发前景。

(3)本发明的方法简单、成本低、实用性强，易于推广。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1，假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株挥发性有机化合物对四株疫霉菌丝直径和游动孢子浓度的抑制作用。

图2，假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株挥发性有机化合物抑制三种疫霉生长的回归曲线。

图3，假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株发酵液滤液的抑菌效果。

图4，三种疫霉在不同浓度发酵液滤液处理下的孢子囊数量和菌丝形态。

图5，假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株发酵液对大豆疫霉防治效果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

一株假格里尼翁苍白杆菌及其防治疫霉的应用，包括以下步骤：

1.将假格里尼翁苍白杆菌NC1斜面活化，活化固体培养基成分为：葡萄糖0.25％、蛋白胨0.5％、牛肉浸膏0.3％、琼脂1.8％、pH＝7.0；

2.活化后接种于液体培养基中，培养基成分为：葡萄糖0.35％、胰蛋白胨1％、酵母浸粉0.45％、氯化钠1％，pH＝7.0；培养条件：温度30-34℃，转速180rpm/min，培养20h获得种子液；

3.将种子液接种于灭菌后的发酵液中，接种率为2％，培养基成分为：葡萄糖0.35％、胰蛋白胨1％、酵母浸粉0.45％、氯化钠1％，pH＝7.0，温度30-34℃，转速180rpm/min，培养48h获得发酵液，有效活菌数在1×10¹⁰cfu/ml左右；

4.将发酵液用无菌水稀释10倍，向稀释后的发酵液中添加1-2％海藻酸钠或1.5-2％黄腐酸钾Ⅰ型或腐殖酸钾1-2％，进行分装得到产品；

5.本产品每亩地施用2-4L，可有效防治植物疫霉。

在一些实施例中，所述假格里尼翁苍白杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12154。

在一些实施例中，活化固体培养基成分为：葡萄糖0.25～0.3％、蛋白胨0.5～0.6％、牛肉浸膏0.3～0.6％、琼脂1.8～2.5％、pH＝7.0～7.2。

在一些实施例中，种子培养的培养基成分为：葡萄糖0.35～0.4％、胰蛋白胨1～1.5％、酵母浸粉0.45～0.5％、氯化钠1～1.5％，pH＝7.0～7.2；

在一些实施例中，培养条件：温度30-34℃，转速180～200rpm/min，培养20～24h。

在一些实施例中，用于发酵培养的发酵液的组成是：葡萄糖0.35％、胰蛋白胨1％、酵母浸粉0.45％、氯化钠1％，pH＝7.0。

在一些实施例中，所述发酵培养的条件为温度30-34℃，转速180～200rpm/min，培养48～50h。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1、假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株挥发性有机化合物对四株疫霉菌丝生长和游动孢子数量的拮抗作用

1.菌株来源：假格里尼翁苍白杆菌(Ochrobactrum pseudogrignonense)NC1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12154；马铃薯疫霉Phytophthora solanum和大豆疫霉Phytophthora sojae由河北省农科院植保所提供；寄生疫霉烟草致病变种Phytophthora parasitica var.nicotiana和辣椒疫霉Phytophthoracapsici从中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC购买。

2.培养基及培养条件：NC1菌株生长的培养基:葡萄糖2.5g、蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、琼脂18g、水1000ml，pH＝7.0。马铃薯疫霉用黑麦培养基培养，成分：黑麦粒80g，琼脂15g，蔗糖20g，水1000ml。大豆疫霉用胡萝卜琼脂培养基(CA)培养，成分：胡萝卜200g，琼脂20g，水1000ml。其他两种疫霉用PDA培养基培养。

3.采用平板叠加法，在皿盖一侧划线接种NC1菌，2d后在皿底一侧培养基中央接种直径为5mm的疫霉菌碟，以不接种细菌作为对照，每个处理重复4次，置于最适条件下培养，10d后测量菌落直径并计算抑制率，计算公式如下：

抑菌率(％)＝(对照平均菌落直径-处理组平均菌落直径)/对照平均菌落直径

将上述各处理后的疫霉菌落，分别用打孔器取两个直径为5mm的菌碟于1.5ml EP管内，加入1mL无菌水，于4℃冰箱低温处理45-90min，然后于室温放置60min，刺激孢子囊释放游动孢子，经振荡后于血球计数板计算游动孢子浓度。

4.假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株挥发性有机化合物对四株疫霉菌丝生长和游动孢子浓度的抑制作用如图1所示。

5.表1，假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株挥发性有机化合物对四株疫霉菌丝生长和游动孢子浓度抑制率

表1 NC1菌株挥发性有机化合物对四株疫霉菌丝生长和游动孢子浓度抑制率

6.结果表明，NC1菌株产生的挥发性有机化合物可以显著抑制P.solanum、P.sojae、P.capsici三株疫霉菌丝的生长，并且显著抑制了P.parasitica var.nicotiana气生菌丝的生长，但是其基内菌丝的生长并未受到影响，因此该株疫霉在菌落直径上与对照组差异不显著。与对照相比，四株疫霉游动孢子浓度都显著降低。

实施例2、假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株发酵液对马铃薯疫霉、大豆疫霉和寄生疫霉烟草致病变种抑制的IC₅₀值测定

1.菌株来源：同实施例一

2.培养基及培养条件：NC1菌株液体生长的培养基:葡萄糖3.5g、胰蛋白胨10g、酵母浸粉4.5g、氯化钠10g、水1000ml，pH＝7.0；培养条件：温度30℃，转速180rpm/min，培养48h获得发酵液。其余同实施例1。

3.分别制备含NC1菌株发酵液滤液浓度为2％、10％、20％的无菌培养基(总体积15ml)，每板中央接种直径为5mm的疫霉，以不含发酵液滤液的培养基作为对照，5个重复，分别在最适条件下培养，10天后测定菌落直径，并计算发酵液对三种疫霉抑制的IC₅₀值和回归方程，并在暗箱内拍照记录。

4.假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株挥发性有机化合物抑制三种疫霉生长的回归曲线如图2所示，

5.假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株发酵液滤液的抑菌效果如图3所示，

6.表2，假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株发酵液抑菌物质抑制疫霉的回归方程和IC₅₀值

表2抑菌物质抑制疫霉的回归方程和IC₅₀值

*表示回归方程中的x值进行了对数转换

7.结果表明，2％,10％,20％的NC1菌株发酵液滤液对三种疫霉有不同程度的抑制，且抑制效果与发酵液滤液的添加量呈正相关关系。NC1菌株发酵液滤液抑制P.solanum、P.sojae和P.parasitica var.nicotiana菌丝生长的IC₅₀值分别为21.37％、46.06％、20.40％，回归方程分别为y＝19.527x-9.7887(R²＝0.999)、y＝9.9754x+11.797(R²＝0.9985)、y＝1.8764x+11.717(R²＝0.9999)。

实施例3、假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株胁迫下马铃薯疫霉、大豆疫霉、寄生疫霉烟草致病变种菌丝形态变化

1.菌株来源：同实施例1

3.分别在黑麦培养基、CA培养基和PDA培养基中添加2％、10％、20％NC1菌株发酵液滤液，接种相应的疫霉培养10天后，在显微镜下观察比较不同处理间疫霉菌丝形态的变化。

4.三种疫霉在不同浓度发酵液滤液处理下的孢子囊数量和菌丝形态如图4所示。

5.结果表明，P.solanum，P.sojae和P.parasitica var.nicotiana三种疫霉经过不同浓度发酵液滤液处理后，孢子囊数量显著降低。在显微镜下可以观察到，与对照处理菌丝形态相比，发酵液滤液胁迫的疫霉菌丝出现畸形、扭曲、分支和隔数增加、菌丝肿胀的现象。

实施例4、假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株发酵液对大豆疫霉的防治效果

1.菌株来源：同实施例1

3.采用离体叶片法评价NC1菌株对大豆疫霉的防治效果。离体叶片接种法：选取叶龄相同和大小一致的健康大豆叶片，喷洒28℃180rpm/min培养48h的NC1菌株发酵液，以无菌水为空白对照。在菌落边缘打取5mm的大豆疫霉菌碟接种于大豆叶脉一侧，每个处理4个重复，叶片置于25℃下保湿10d，观察记录叶片发病情况。

4.假格里尼翁苍白杆菌NC1菌株发酵液对大豆疫霉防治效果如图5所示。

5.采用离体叶片测定NC1菌株发酵液对大豆疫霉的防治效果，按照0.1mL/大豆叶片的喷洒量喷施NC1菌株发酵液，对照组喷施等量的无菌水，在叶片上接种大豆疫霉菌碟，10天后观察发病情况。结果显示对照组叶片出现黄褐色病斑，而喷洒NC1发酵液的大豆叶片未见发病症状，表明NC1菌株具有良好的防治疫病的潜力。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.假格里尼翁苍白杆菌在防治疫霉中的应用，其特征在于，所述假格里尼翁苍白杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12154；

所述疫霉为马铃薯疫霉、大豆疫霉、寄生疫霉烟草致病变种、辣椒疫霉中的至少一种。

2.一种采用假格里尼翁苍白杆菌防治疫霉的方法，其特征在于，包括：

将所述菌剂在植物上施用，即得；

所述假格里尼翁苍白杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12154；

3.如权利要求2所述的采用假格里尼翁苍白杆菌防治疫霉的方法，其特征在于，活化固体培养基成分为：葡萄糖0.25~0.3%、蛋白胨0.5~0.6%、牛肉浸膏0.3~0.6%、琼脂1.8~2.5%、pH=7.0~7.2。

4.如权利要求2所述的采用假格里尼翁苍白杆菌防治疫霉的方法，其特征在于，种子培养的培养基成分为：葡萄糖0.35~0.4%、胰蛋白胨1~1.5%、酵母浸粉0.45~0.5%、氯化钠1~1.5%，pH=7.0~7.2。

5.如权利要求2所述的采用假格里尼翁苍白杆菌防治疫霉的方法，其特征在于，种子培养的培养条件：温度30-34℃，转速180~200rpm/min，培养20~24h。

6.如权利要求2所述的采用假格里尼翁苍白杆菌防治疫霉的方法，其特征在于，用于发酵培养的培养基的组成是葡萄糖0.35%、胰蛋白胨1%、酵母浸粉0.45%、氯化钠1%，pH=7.0。

7.如权利要求2所述的采用假格里尼翁苍白杆菌防治疫霉的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为温度30-34℃，转速180~200rpm/min，培养48~50h。

8.如权利要求2所述的采用假格里尼翁苍白杆菌防治疫霉的方法，其特征在于，菌剂的施用量为2-4L/亩。