CN110250396A - 乳酸片球菌cgmcc 1.4在抑制黄曲霉中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了乳酸片球菌CGMCC 1.4在抑制黄曲霉中的应用，属于微生物技术领域，所述乳酸片球菌CGMCC 1.4能够显著抑制黄曲霉的生长和繁殖，根据实施例的记载，将所述乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液注入到106个/mL浓度的黄曲霉孢子悬液涂布的平板上，抑菌圈直径达到15.860±0.050mm，而注入生理盐水和空白MRS培养基则没有出现抑菌圈。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及乳酸片球菌CGMCC 1.4在抑制黄曲霉中的应用。
背景技术
黄曲霉是一类生命力极其顽强的腐败微生物，在动物饲料中生长会对人和动物产生伤害，同时黄曲霉是在饲料储存、贮藏过程中引起饲料腐败霉化的主要污染源之一。
国内外对如何抑制黄曲霉生长进行了大量研究，如热处理、红外线处理等物理方法，添加乳酸、苯甲酸等添加剂的化学方法等，但随着实际应用，这些传统方法尚未证明是经济有效可行的。研究和开发绿色饲料添加剂产品，已经成为世界性的研究课题。
目前国内外研究表明，部分菌种对黄曲霉的生长和毒素的形成有一定的抑制作用；但是尚没有成熟的、效率高的抑制黄曲霉的菌种应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供乳酸片球菌CGMCC 1.4在抑制黄曲霉中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
乳酸片球菌CGMCC 1.4在抑制黄曲霉中的应用。
优选的，所述应用采用乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液。
优选的，所述乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液通过以下步骤制备获得：
1)将所述乳酸片球菌CGMCC 1.4活化后接种于液体发酵培养基中，33～37℃培养20～28h获得发酵液，所述发酵液的OD600nm为4.5～4.9，所述发酵液的pH值为4.2～4.5，所述发酵液的RG值为4.0～18g/L，活菌数为10.1～12.9lg cfu·g-1；
2)将步骤1)中获得的发酵液固液分离后收集发酵上清液；
3)浓缩步骤2)中所述的发酵上清液获得乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液。
优选的，步骤1)中所述液体发酵培养基为MRS液体培养基。
优选的，步骤1)中所述培养伴随搅拌，所述搅拌的转速为100～150rpm。
优选的，步骤3)中所述浓缩的倍数为8～12倍。
优选的，将所述乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液与物料混合，抑制物料中的黄曲霉。
优选的，所述物料包括动物饲料和食品原料。
一种黄曲霉抑制剂，有效成分由乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液构成。
优选的，所述黄曲霉抑制剂的剂型选自悬浮剂、乳油剂、溶液剂、泡腾剂和粉剂中的一种。
本发明的有益效果：本发明提供了乳酸片球菌CGMCC 1.4在抑制黄曲霉中的应用，所述乳酸片球菌CGMCC 1.4能够显著抑制黄曲霉的生长和繁殖，根据实施例的记载，将所述乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液注入到106个/mL浓度的黄曲霉孢子悬液涂布的平板上，抑菌圈直径达到15.860±0.050mm，而注入生理盐水和空白MRS培养基则没有出现抑菌圈。
附图说明
图1为乳酸片球菌CGMCC 1.4的生长曲线；
图2为不同浓度黄曲霉孢子生长对比图(48h)；
图3为乳酸片球菌CGMCC 1.4发酵上清浓缩液的抑菌效果图。
具体实施方式
本发明提供了乳酸片球菌CGMCC 1.4在抑制黄曲霉中的应用。在本发明中，所述乳酸片球菌CGMCC 1.4购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
在本发明中，所述应用优选的采用乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液。在本发明中，所述乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液优选的通过以下步骤制备获得：1)将所述乳酸片球菌CGMCC 1.4活化后接种于液体发酵培养基中，33～37℃培养20～28h获得发酵液；2)将步骤1)中获得的发酵液固液分离后收集发酵上清液；3)浓缩步骤2)中所述的发酵上清液获得乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液。
在本发明中，将所述乳酸片球菌CGMCC 1.4活化后接种于液体发酵培养基中。在本发明中，优选的将所述乳酸片球菌CGMCC 1.4菌种接种于MRS固体斜面培养基进行两代活化后，再接种于MRS液体培养基中进行一代活化。本发明对活化过程中的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规操作即可。在本发明中，所述液体发酵培养基优选为MRS液体培养基；在本发明中，所述接种的接种体积优选为8％～12％，更优选为10％。在本发明中，MRS培养基优选的(Modified MRS Medium Base，MRS)购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
本发明在所述接种后，33～37℃培养20～28h获得发酵液。在本发明中，所述培养的温度优选为35℃，所述培养的时间优选为24h；所述发酵液的OD600nm优选为4.5～4.9；所述发酵液的pH值优选为4.2～4.5，所述发酵液的RG值优选为4.0～18g/L，活菌数为10.1～12.9lg cfu·g-1。本发明所述培养过程中优选的伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为100～150rpm，更优选为120rpm。
本发明在获得上述发酵液后，将所述发酵液固液分离后收集发酵上清液。在本发明中，所述固液分离优选为离心或过滤；所述离心的转速优选为8000～12000rpm，更优选为10000rpm；所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min；所述离心的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。
本发明在收到所述发酵上清液后，浓缩所述的发酵上清液获得发酵上清浓缩液。在本发明中，所述浓缩的倍数优选为8～12倍，更优选为10倍；在本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩，所述减压浓缩优选的通过旋转蒸发仪实现。
在本发明的具体应用过程中，优选的将所述乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液与物料混合，抑制物料中的黄曲霉。本发明对所述物料的种类没有特殊限定，所有可能遭受黄曲霉污染的物料均可；所述物料优选的包括动物饲料和食品原料。
本发明还提供了一种黄曲霉抑制剂，有效成分由乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液构成。本发明中，所述黄曲霉抑制剂的剂型优选的选自悬浮剂、乳油剂、溶液剂、泡腾剂和粉剂中的一种。本发明对所述黄曲霉抑制剂的辅料的种类和含量没有特殊要求，采用本领域常规的辅料种类和含量即可；本发明对所述的黄曲霉抑制剂具体剂型的制备方法，没有特殊要求，采用本领域常规的制备方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
试验材料
试验菌株：乳酸片球菌Pediococcus acidilactici CGMCC 1.4购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
培养基：MRS培养基(Modified MRS Medium Base，MRS)购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。马铃薯葡萄糖(PDA)固体培养基：马铃薯200g，琼脂8g，溶于1L去离子水，121℃灭菌20min。
试验仪器：LRH-250A生化培养箱，由韶关市泰宏医疗器械有限公司生产；HNTC-2027恒温培养振荡器，由天津欧诺仪器股份有限公司生产；SBA-40E生物传感分析仪，由山东省科学院生物研究所生产；UV-6100紫外可见分光光度计，由上海美谱达仪器有限公司生产；常规试剂及仪器由本实验室提供。
试验方法
菌种的活化
用无菌接种环从冻存管中取出乳酸片球菌，于MRS固体斜面上划线，置35℃培养箱中培养至出现菌落，如此活化2次后挑取单菌落接于MRS液体培养基中35℃，120rpm培养过夜，备用。
生长曲线、pH值以及发酵液葡萄糖残留量(RG)的测定
将活化好的乳酸片球菌按10％(v:v)接种量接于MRS液体培养基中，35℃，120rpm培养24h，培养期间定时取样测定菌液的OD600nm吸光度、pH值和RG值，绘制各菌株生长曲线、pH变化曲线和RG变化曲线，每组试验3个重复。
菌种的平板计数
将上述活化后的乳酸片球菌用0.85％(w:v)的无菌PBS缓冲液分别稀释至10-7、10-8、10-9、10-10后进行涂布，35℃培养过夜，进行菌落计数，每组试验3个重复。
抑菌试验
黄曲霉孢子悬液的制备及指示菌浓度的确定
将黄曲霉接种在PDA平面培养基上，在30℃培养箱内培养4d后，加入一定量的无菌PBS缓冲液刮取斜面上的孢子，将黄曲霉菌孢子洗下，收集到离心管中，用无菌的PBS缓冲液洗涤3次后，再用无菌纱布过滤3次除去黄曲霉菌孢子的菌丝，进行血球计数板计数。将孢子悬液浓度调整为103孢子/mL、104孢子/mL、105孢子/mL、106孢子/mL、107孢子/mL，涂布到PDA平板上30℃培养。
发酵上清浓缩液的制备
将上述活化后的乳酸片球菌的菌种接种到MRS液体培养基中35℃、120rpm培养24h后测定pH值，在4℃、10000rpm下离心15min，取上清液，用酸度计测量其pH值，然后将上清液旋蒸浓缩10倍，待用。
抑菌活性的测定
抑菌实验采用琼脂扩散法进行测定，取指示菌孢子悬液100μL(每个平板约含106个孢子)与经融化后保持在45℃的PDA半固体培养基混匀后倒入平板上，凝固后用内径8mm打孔器打孔，将100μL乳酸片球菌的上清浓缩液注入孔中，于4℃水平放置预扩散24h后30℃培养12h测量其抑菌圈直径，每组试验3个重复。
数据处理与分析
数据分析和图表制作分别由IBM SPSS statistic 20.0和Microsoft Excel 2010完成，数据均以“平均值±标准差”表示。
实验结果
菌种发酵活菌测定结果见表1，,乳酸片球菌的生长曲线图见图1，可以看出，在2h左右的迟缓期后开始进入对数生长期，在20h时达到最大OD600nm值4.686±0.006；其pH值从起始5.37经过22h下降到最低值4.21；乳酸片球菌发酵液的RG值24h时为4.42±0.144(P<0.05)。
表1菌种发酵活菌测定结果，单位lg cfu·g-1
图2为不同浓度的黄曲霉孢子悬液生长48h后的对比图，孢子悬液浓度为103孢子/mL和104孢子/mL的平板，黄曲霉生长时间需5～7d，实验周期过长。孢子悬液浓度为107孢子/mL的平板，因孢子浓度过高，黄曲霉菌丝生长及孢子萌发过快，不易观察抑菌实验结果，在105孢子/mL和106孢子/mL中进行选择，从生长状况及易于观察方面考虑，故均以106孢子/mL浓度的菌悬液进行抑菌实验。
菌种发酵上清浓缩液的抑菌直径结果见表2和图3。
表2菌种发酵后上清浓缩液抑菌圈直径的测定结果
同行数据肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同则表示差异不显著(P>0.05)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.乳酸片球菌CGMCC 1.4在抑制黄曲霉中的应用。
2.根据权利要求1中所述应用，其特征在于，所述应用采用乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液。
3.根据权利要求2中所述应用，其特征在于，所述乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液通过以下步骤制备获得：
1)将所述乳酸片球菌CGMCC 1.4活化后接种于液体发酵培养基中，33～37℃培养20～28h获得发酵液，所述发酵液的OD600nm为4.5～4.9，所述发酵液的pH值为4.2～4.5，所述发酵液的RG值为4.0～18g/L，活菌数为10.1～12.9lg cfu·g-1；
2)将步骤1)中获得的发酵液固液分离后收集发酵上清液；
3)浓缩步骤2)中所述的发酵上清液获得乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液。
4.根据权利要求3中所述应用，其特征在于，步骤1)中所述液体发酵培养基为MRS液体培养基。
5.根据权利要求3或4中所述应用，其特征在于，步骤1)中所述培养伴随搅拌，所述搅拌的转速为100～150rpm。
6.根据权利要求3中所述应用，其特征在于，步骤3)中所述浓缩的倍数为8～12倍。
7.根据权利要求2中所述应用，其特征在于，将所述乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液与物料混合，抑制物料中的黄曲霉。
8.根据权利要求7中所述应用，其特征在于，所述物料包括动物饲料和食品原料。
9.一种黄曲霉抑制剂，其特征在于，有效成分由乳酸片球菌CGMCC 1.4的发酵上清浓缩液构成。
10.根据权利要求8所述的黄曲霉抑制剂，其特征在于，所述黄曲霉抑制剂的剂型选自悬浮剂、乳油剂、溶液剂、泡腾剂和粉剂中的一种。
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