JPH0889269A - Ｌ−シトルリンの製造法および新種細菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 細菌菌体を用いてＬ−アルギニンからＬ−シ
トルリンを収率よく生産する。 【構成】 Ｌ−アルギニンからＬ−シトルリンを、かつ
Ｌ−シトルリンからＬ−オルニチンを生産する能力を有
する細菌に水溶性有機溶剤による乾燥処理を施して、得
られるＬ−オルニチン生産能欠除の水溶性有機溶剤乾燥
処理菌体をＬ−アルギニンに接触作用させる。更に、上
記の能力を有し、かつ水溶性有機溶剤乾燥処理によりそ
の乾燥菌体のＬ−オルニチン生産能が欠除する細菌がバ
チルス属のものであり、またバチルス属ｓｐ．Ｎｏ．ｃ
ｉｔ−７０株である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＬ−シトルリンの製造
法、詳しくは細菌菌体によるＬ−アルギニンからのＬ−
シトルリンの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−シトルリン（以下、シトルリンとい
う）は腎疾患の治療薬として重要なアミノ酸であるが、
現在、微生物の酵素を用いてＬ−アルギニン（以下、ア
ルギニンという）から主に製造されている。すなわち、
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌、
マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に属する菌の
菌体から酵素アルギニンデイミナーゼ（ａｒｇｉｎｉｎ
ｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅ）を分離精製し、それをアルギ
ニンに接触作用させることにより行なわれている（Ｔ．
Ｋａｍｉｍｏｔｏ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第１
９巻、１６６〜１６８頁、１９７１年；特公平３−３１
４３６号公報；特公平５−６９９８号公報）。この酵素
の分離精製の操作が繁雑であるために、多大な労力を必
要とする。それで、アルギニンからのシトルリン生産能
を有する細菌の菌体自体、またはそのトルエン処理また
はアセトン処理物をアルギニンに接触作用させて、シト
ルリンを生産する方法が案出されたが、どの方法におい
ても、シトルリン生産収率は極度に低いものである
（Ｊ．Ｃ．Ｇ． Ｏｔｔｏｗ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．、８４巻、２０９〜２１３頁、１９７４年；
Ｅ．Ｌ．Ｏｇｉｎｓｋｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、第１９８巻、７９１〜７９７頁、１９５２年）。
それはアルギニンからシトルリンを経てＬ−オルニチン
（以下、オルニチンという）まで分解してしまうからで
ある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前記
問題解決のためになされたもので、すなわち、細菌菌体
を用いてアルギニンからシトルリンを収率よく生産する
方法を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意研究した結果、次のような事実を
発見した。アルギニンからシトルリンを、かつシトルリ
ンからオルニチンを生産する能力を有する細菌菌体にア
セトンなどの水溶性有機溶剤による乾燥処理を施し、ア
ルギニンに接触作用させることを、多数の菌株について
試みたところ、 シトルリンもオルニチンも生産しない、 シトルリンとオルニチンを同時に生産する、 オルニチンだけ生産する、 シトルリンだけ生産する、 菌株に分けられた。の性質を有する細菌について更に
詳しく検討した結果、シトルリンからオルニチンを生産
する能力が欠除していた。そして、このような性質を有
する細菌の水溶性有機溶剤乾燥処理菌体をアルギニンに
接触作用さるとシトルリンが収率よく生産できるとの知
見に基づいて、本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は、アルギニンからシト
ルリンを、かつシトルリンからオルニチンを生産する能
力を有する細菌に水溶性有機溶剤による乾燥処理を施し
て得られるオルニチン生産能欠除の水溶性有機溶剤乾燥
処理菌体を、アルギニンに接触作用させ、シトルリンを
製造する方法に関するものである。更に、その細菌がバ
チルス属のものであり、また、バチルス属ｓｐ．Ｎｏ．
ｃｉｔ−７０株である。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明法
に使用する細菌は、アルギニンからシトルリンを、かつ
シトルリンからオルニチンを生産する能力を有し、水溶
性有機溶剤による乾燥処理によってオルニチン生産能が
欠除するものであればよく、特に限定されない。アルギ
ニンからシトルリンを、かつシトルリンからオルニチン
を生産する能力を有する細菌とは、以下の培地および条
件で培養して得た生菌体を次の条件でアルギニンまたは
シトルリンに接触作用させたとき、アルギニンからシト
ルリンに、またシトルリンからオルニチンに変換する活
性がモル変換率で各々０．０００１％以上ものと定義さ
れる。

【０００７】ａ）培地：０．２％（ｗ／ｖ）アルギニン
塩酸塩、１．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、１．０％
（ｗ／ｖ）グルコース、１．０％（ｗ／ｖ）ビーフエキ
ス、ｐＨ７．０（３Ｎ ＫＯＨで調整）（１２０℃、１
５分オートクレーブ殺菌）。 ｂ）培養条件：上記培地５ｍｌを試験管（１．０ｃｍ×
２０ｃｍ）に、肉汁寒天斜面培地の本発明細菌株の培養
物を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２日間振盪培養す
る。 ｃ）反応条件：培養物を遠心分離し菌体を得る。これを
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で洗浄後、その適
当量をアルギニン塩酸塩またはシトルリン０．１％（ｗ
／ｖ）含有の上記と同組成の緩衝液５ｍｌに懸濁し、Ｏ
Ｄ_660nm値が１になるようにした。次にその懸濁液を３
０℃で攪拌しながら５時間、生菌体をアルギニンまたは
シトルリンに接触作用させる。反応液を１００℃で５分
間処理し、反応を停止させる。更に、この各反応液を遠
心分離器に掛け、上澄液を得る。次に各反応液の各アミ
ノ酸を日立製アミノ酸分析計Ｌ−８５００形により定量
し、各アミノ酸のモル変換率を計算した。

【０００８】前記細菌としては、例えば、バチルス属に
属する各種細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．ｎｉｇ
ｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕ
ｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅ
ｒｅｕｓなど）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）属の各種細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒ
ｕｇｉｎｏｓａなど）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の各種細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓなど）などを好適なも
のとして挙げることができる。これらの中でも、バチル
ス属ｓｐ．Ｎｏ．ｃｉｔ−７０が属する新種の細菌を、
特に好適なものとして用いることができる。なお、前記
の細菌の変種、変異株、遺伝子組換体株も用いられるこ
とは当然である。また、前記菌株由来のアルギニンから
シトルリンを生成する酵素系をコードし、かつプロモタ
ーなどの酵素生産制御領域をコードするＤＮＡが連結さ
れたＤＮＡを有するプラスミド含有の大腸菌などの各種
菌株も用いることができる。なお、バチルス ｓｐ．
Ｎｏ．ｃｉｔ−７０は、本発明者が兵庫県内の土壌より
分離した菌株である。その菌学的性質は以下の通りであ
る。

【０００９】なお、この菌株の菌学的性質を調べるため
の実験は、主として長谷川武治編著、「微生物の分類と
同定」（東京大学出版会、１９７５年）に記載されてい
る方法によって行なった。また、分類同定の基準として
は「バージーズ・マニュアル・オブ・システマテック・
バクテレオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌｏ
ｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ）（１９８６年）を参考にした。

【００１０】バチルス ｓｐ． Ｎｏ．ｃｉｔ−７０株
の菌学的性質 （Ａ）形態的性質 顕微鏡的観察［肉汁寒天培地（ｐＨ７．２）、３０℃、
２４〜４８時間］ （１）細胞の形および大きさ：０．８〜１．２×２．０
〜３．５μｍの直状桿菌である。周辺鞭毛を有する。 （２）細胞の多形性の有無：なし （３）運動性の有無：有り （４）胞子の有無：胞子嚢は膨出し、胞子は０．６〜
０．７×０．８〜１．２μｍの楕円形で、細胞の亜端に
形成される。 （５）グラム染色：陽性 （６）抗酸性染色：陰性

【００１１】（Ｂ）培養的性質｛各培地（ｐＨ７．０〜
７．２）における生育状態｝ （１）肉汁寒天平板培養：３０℃、４８時間の培養で、
直径２．０〜３．０ｍｍのクリーム色の円形コロニーを
形成する。表面は艶がなく皺があり、周縁はギザギザで
ある。色の産生は観察されない。 （２）肉汁寒天斜面培養：３０℃、４８時間の培養で、
直径２．０〜３．０ｍｍのクリーム色の円形コロニーを
形成する。表面は艶がなく、周縁はギザギザである。色
の産生は観察されない。 （３）肉汁液体培養：３０℃、４８時間の静置培養で、
培地表面に薄い菌体の膜が認められ、沈渣（ｓｅｄｉｍ
ｅｎｔ）を生成する。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：２０℃、３０日間の静置
培養で、培地の上部にのみ生育し、徐徐にゼラチンを液
化する。 （５）リトマスミルク：３０℃、３日間の培養により、
リトマスミルクは酸の生成により赤色に変化し、液化に
より透明となる。

【００１２】（Ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元：陽性 （２）脱窒反応：陽性 （３）ＶＰテスト：陽性 （４）インドールの生成：陰性 （５）硫化水素の生成：陰性 （６）澱粉の加水分解：陽性 （７）クエン酸の利用：陽性 （８）無機窒素源の利用：陽性（硝酸ソーダ、硫酸アン
モニウム） （９）色素の生成：陰性 （１０）ウレアーゼ：陰性 （１１）オキシダーゼ：陰性 （１２）カタラーゼ：陽性 （１３）生育の範囲：温度１０〜４５℃、ｐＨ４．０〜
９．０ （１４）酸素に対する態度：好気性 （１５）Ｏ−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ
法）：発酵 （１６）有機酸の生成：Ｌ−乳酸（Ｌ−ｌａｃｔｉｃ
ａｃｉｄ） （１７）糖類からの酸およびガスの生成：表１の通り
で、いづれからもガスの生成は認められない。

【００１３】 表１ ──────────────────────── 糖 類 ガスの生成 酸生成 ──────────────────────── Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース − ＋ Ｄ−マンノース − ＋ Ｄ−フラクトース − ＋ Ｄ−ガラクトース − − マルトース − ＋ シュクロース − ＋ ラクト−ス − − トレハース − ＋ Ｄ−ソルビトース − − Ｄ−マンニトール − − イノシトール − − グリセリン − ＋ ──────────────────────── −、陰性；＋、陽性

【００１４】（Ｄ）その他の性質 （１）レシチナーゼの生産：陰性（ＮＧＫＧ培地、日水
製薬株式会社製） （２）７％食塩培地発育：陽性 （３）カゼイン分解：陽性 （４）嫌気的発育：陽性 （５）Ｔｗｅｅｎ２０、６０、または８０の分解：陽性 （６）アルギニンの分解：陽性 （７）チロシンの分解：陽性

【００１５】本菌株は、以上のごとき菌学的性質、すな
わち、捍菌で、周辺鞭毛を有し、胞子を形成すること、
グラム陽性で、カタラーゼ生産能を有すること、好気性
菌であることなどからバチルス属に属するものと判定さ
れる。更にバチルス属の中でも、胞子が卵円形、レシチ
ナーゼ反応が陰性、クエン酸塩利用性が陽性、好気性生
育を示すことにより、バチルス・リシニホルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチル
ス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａ
ｎｓ）に近い種のものと認められる。しかし、マニトー
ル、キシロース、アラビノースを利用しないことより、
バチルス・リシニホルミスとは異なる。またゼラチン液
化能があり、かつ７％食塩下で生育することによりバチ
ルス・コアグランスとも異なる。他に本菌株に近い種の
バチルス属細菌がないことより、本菌株は新種に属する
ものと認められる。よって本菌株をバチルス ｓｐ．Ｎ
ｏ．ｃｉｔ−７０と命名した。なお、バチルス ｓｐ．
Ｎｏ．ｃｉｔ−７０は工業技術院生命工学工業技術研究
所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４５５３として寄託されてい
る。

【００１６】本発明の細菌株（以下、本細菌株という）
の培養に使用される培地は、通常の公知細菌の培養に用
いる通常のものが用いられる。例えば、本細菌株が資化
し得る炭素源を含有し、さらに適量の窒素源および無機
塩などを含有するものであれば、合成培地、天然培地の
どちらでもよい。炭素源としては、例えば、グルコー
ス、フルクトース、マルトース、シュクロース、ガラク
トース、グリセロール、ソルビトール等の糖類、酢酸、
コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、ケトグルタミン酸、ピ
ルビン酸等の有機酸類、さらに、糖密、ペプトン、肉エ
キス、コーンステープリカーの天然物などを用いること
ができる。

【００１７】窒素源としては、硫安、硝安、硝酸カリ、
塩安、アンモニア等の無機窒素源、肉エキス、ポリペプ
トン、カザアミノ酸、ソイト−ン、酵母エキス等の有機
窒素源などを用いることができる。無機塩類としては、
第一及び第二りん酸カリ、ナトリウム及びアンモニウム
塩等、マグネシウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マンガ
ン塩、第一及び第二鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバル
ト塩、ほう素塩が用いられる。また、微量栄養素とし
て、ビオチン、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、ビタミンＢ
12、パントテン酸、イノシト−ル等も適宜用いられる。

【００１８】上記組成からなる培地のｐＨは、アンモニ
ア、加性カリ、加性ソ−ダ等で６．０〜８．０、好まし
くは６．８〜７．２に調整される。なお、前記培地には
適宜な量の消泡剤も必要に応じて添加される。培地殺菌
はオートクレーブ法、フィルター法のどちらを用いても
よい。またそれらの方法を併用してもよい。その条件
は、例えばオートクレーブ法の場合は、１００〜１３０
℃、５〜３０分、好ましくは１１５〜１２５℃、１０〜
２０分である。なお、前記培地にアルギニンを塩酸塩と
して、０．０１〜１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．
１〜０．５％（ｗ／ｖ）添加した培地で本細菌株を培養
すると、アルギニンからシトルリンを生産する能力の強
い菌体を得ることができる。

【００１９】培養も通常の公知細菌に用いられている公
知の方法で、通常の条件で行なってよい。例えば、通気
条件は０．４〜０．７ｖｖｍ、好ましくは０．５〜０．
６ｖｖｍであり、温度は２０〜５０℃、好ましくは３０
〜４０℃である。培養時間は２４〜１２０時間、好まし
くは４８〜７２時間である。

【００２０】本発明の特徴は、本細菌株の菌体に水溶性
有機溶剤による乾燥処理を施してシトルリンからのオル
ニチン生産能を欠除させ、それを、アルギニンに接触作
用させることにある。本発明において水溶性有機溶剤と
は、あらゆる割合、または一定の割合で水に溶ける有機
溶剤であればよく、特に制限されないが、具体的には、
例えば、好適なものとして、アセトン、ｎ−ブタノー
ル、ｎ−プロパノール、ｉｓｏ−プロパノール、エタノ
ール、メタノールなどを、これらの中でも特に好適なも
のとして、アセトン、ｎ−ブタノール、ｎ−プロパノー
ル、ｉｓｏ−プロパノールなどを挙げることできる。本
細菌株の菌体に水溶性有機溶剤による乾燥処理を施すに
は、公知の方法で常法通り行なえばよい。例えば、前記
のようにして本細菌株を培養して得られる培養液から、
先ず、遠心分離、濾過などにより菌体を分離する。次
に、その菌体を、５〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜２
００ｍＭのリン酸、トリス塩酸などの緩衝液に懸濁し、
その液を、菌体量の１０〜７００倍量、好ましくは１０
０〜５００倍量の−２０〜−５０℃、好ましくは−２５
〜−３５℃の水溶性有機溶剤に攪拌しながら、徐徐に添
加する。次に、ブフナー濾斗などの濾過器で菌体を可及
的速さで水溶性有機溶剤と濾別する。このように処理さ
れた菌体を直ちに、冷風または温風（例えば１０ないし
８０℃位）、または減圧下に乾燥させることにより、本
発明に用いる水溶性有機溶剤による乾燥処理菌体が得ら
れる。

【００２１】前記水溶性有機溶剤による乾燥処理菌体を
アルギニンに接触作用させるには、先ず、アルギニンま
たはその塩酸塩を、酢酸、トリス塩酸、トリスマレイン
酸、リン酸、その中でも特に好ましくは、リン酸、トリ
ス塩酸などの、ｐＨ５．０〜９．０、好ましくは６．５
〜７．５で、５〜５００ｍＭ、好ましくは５０〜２００
ｍＭの緩衝液に、アルギニンをフリーのものとして０．
０１〜３．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜１．０
％（ｗ／ｖ）の割合で溶解する。次に、このようにして
調製されたアルギニン溶液に所定量の前記乾燥処理菌体
を添加し、よく攪拌しながら、この乾燥菌体を所定条件
下にアルギニンに接触作用させる。このことによりアル
ギニンは、実質上１００％、シトルリンに変換する。

【００２２】上記の接触作用の条件は、使用する本細菌
株の種類、菌体量、およびアルギニン量などにより異な
り、一概には特定し得ないが、一般には、温度は、２０
〜６０℃、好ましくは３０〜４０℃、ｐＨは５．０〜
９．０、好ましくは６．５〜７．５である。時間は、通
常、１〜６時間程度であるが、３〜４間程度が好適であ
る。水溶性有機溶剤による乾燥処理菌体の使用量は重量
比で基質アルギニンに対して０．５〜３．０、好ましく
は１．０〜２．０である。水溶性有機溶剤による乾燥処
理菌体量が多いほど、反応時間が短縮され、菌体は繰返
し数回使用できる。

【００２３】なお、温度が２０℃、ｐＨが５．０、時間
が１時間の未満の各条件の下では、シトルリンは十分に
生成しない。また温度が６０℃、ｐＨが９．０を越える
反応条件の場合も、シトルリンの生成は十分でない。反
応時間が６時間を越える場合はシトルリンの生成が終了
しているか、または平衡状態に達しているので、それ以
上の反応は意味がなくなる。また、水溶性有機溶剤によ
る乾燥処理菌体の使用量がアルギニンに対して重量比で
０．５未満の場合もシトルリンの生成は十分でない。そ
して、３．０を越えて乾燥処理菌体を使用しても、シト
ルリンの生成が増加しないので、それは意味がなくな
る。なお、本発明に用いるアルギニンは、試薬級ないし
それに近いものが好適に用いられる。また、フリーのも
の、または塩酸塩、硫酸塩などのどちらを採用してもよ
い。

【００２４】前記反応液からシトルリンを採取するには
公知の方法を採用すればよい。例えば、反応液中の残渣
を遠心分離などにより除去した後、公知のアミノ酸の分
離・精製法、例えば、分別晶析法、溶媒抽出法、イオン
交換法、分子濾過法などにより容易に行なわれる。そし
て、フリーのもの、塩酸塩、または硫酸塩などとして分
離される。

【００２５】

【発明の効果】本発明のシトルリン製造法においては、
シトルリンからオルニチンを生産する能力を欠除した水
溶性有機溶剤乾燥処理菌体を使用しているので、アルギ
ニンからシトルリンを収率よく生産することができる。

【００２６】

【実施例】以下本発明を実施例をもって説明する。本実
施例ではアルギニン、シトルリン、オルニチンなどのア
ミノ酸は日立製アミノ酸分析計Ｌ−８５００形により測
定した。 実施例１ ０．２％（ｗ／ｖ）アルギニン塩酸塩、１．０％（ｗ／
ｖ）ポリペプトン、１．０％（ｗ／ｖ）グルコース、
１．０％（ｗ／ｖ）ビーフエキス、ｐＨ７．０（３Ｎ
ＫＯＨで調整）（１２０℃、１５分オートクレーブ殺
菌）なる培地５ｍｌを有する試験管（１．０ｃｍ×２０
ｃｍ）１０本に、バチルス ｓｐ． Ｎｏ．ｃｉｔ−７
０株の肉汁寒天斜面培地培養物を接種し、３０℃、２０
０ｒｐｍで２日間振盪培養した。各試験管の培養物を各
々前記培地５０ｍｌを有する５００ｍｌ容坂口フラスコ
１０本に接種して、３０℃、１４０ｒｐｍで２日間振盪
培養した。培養物を集め、更に遠心分離によって菌体を
得た。これを０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で洗
浄後、同緩衝液５０ｍｌに懸濁し、これを１０００ｍｌ
容三角フラスコ中の−３０℃のアセトン５００ｍｌに、
この菌懸濁液を攪拌しながら徐徐に添加した。菌懸濁液
全量を添加後更に５分間攪拌し、５℃の冷蔵庫にて３０
分間静置した。次に、菌体をブッフナー濾過器上のＴＯ
ＹＯ濾紙Ｎｏ．２の上に集め、更に−３０℃のアセトン
１００ｍｌで洗浄した。その菌体を直ちにデシケターに
移し、６時間減圧下に乾燥した。

【００２７】このようにして調製されたアセトンによる
乾燥処理菌体５００ｍｇ、７５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１００ｍｌ、０．２％（ｗ／ｖ）アルギニン塩
酸塩溶液１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコにとっ
た。それを３０℃の恒温水槽で、３時間振盪しながら、
アセトン乾燥処理菌体をアルギニンに接触作用させた。
反応液から菌体を遠心分離機で分離し、その上澄液中の
アミノ酸を測定した結果、シトルリン濃度は１．０％
（ｗ／ｖ）であった。シトルリンはアルギニンからモル
変換率９９．８％で生産された。また、オルニチンは全
く検出されなかった。なお、アセトン乾燥処理をしな
い、すなわち前記工程における菌体の０．２Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６．５）による洗浄工程で得た生菌体を、上
記のアセトン処理菌体の代りに用いた場合は（アセトン
乾燥処理菌体の場合と菌体の窒素濃度を同じにした）、
アルギニンからのシトルリンへのモル変換率は５０．５
％であり、アルギニンからのオルニチンへのモル変換率
は３０．４％であった。このように本発明方法により、
アルギニンから収率よくシトルリンを生産することがで
きる。

【００２８】上記上澄液を強酸性イオン交換樹脂アンバ
ーライト１２０（Ｈ型）に通液し、シトルリンを吸着さ
せた。次いで、３％アンモニア水を用いてシトルリンを
溶出させた。その液を減圧濃縮後、冷却、放置すること
により、シトルリンの結晶が析出した。この結晶を採
取、乾燥してシトルリンの結晶１６５ｍｇを得た（アル
ギニンからのモル生産収率は８３．０％であった）。

【００２９】実施例２ アセトンの代りに表２に示す各水溶性有機溶剤を用いる
こと以外は、実施例１と同様にして、アルギニン塩酸塩
からシトルリンを表２に示すモル変換率で反応液中に生
産した。そしてこの場合もオルニチンは全く検出されな
かった。

【００３０】表２ ─────────────────────────
── 水溶性有機溶剤 モル変換率（％） ─────────────────────────
── メタノール ８４．５ エタノール ８９．６ ｎ−プロパノール ９９．８ ｉｓｏ−プロパノール ９９．７ ｎ−ブタノール ９２．５ ─────────────────────────
──

【００３１】表２から分るように、本発明の方法により
アルギニンからシトルリンを収率よく生産することがで
きる。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年１２月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１４】（Ｄ）その他の性質 （１）レシチナーゼの生産：陰性（ＮＧＫＧ培地、日水
製薬株式会社製） （２）７％食塩培地発育：陽性 （３）カゼイン分解：陽性 （４）嫌気的発育：陽性 （５）Ｔｗｅｅｎ２０、６０、または８０の分解：陽性 （６）アルギニンの分解：陽性 （７）チロシンの分解：陽性 （８）ＤＮＡのＧＣ含有量：３６．５％（ＤＮＡの塩基
組成分析より） （９）菌体脂肪酸組成：Ｃ₁₆脂肪酸（パルミチン酸）が
主体

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１５】本菌株は、以上のごとき菌学的性質、すな
わち、捍菌で、周辺鞭毛を有し、胞子を形成すること、
グラム陽性で、カタラーゼ生産能を有すること、好気性
菌であることなどからバチルス属に属するものと判定さ
れる。更にバチルス属の中でも、胞子が卵円形、レシチ
ナーゼ反応が陰性、クエン酸塩利用性が陽性、好気性生
育を示すことにより、バチルス・リシニホルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチル
ス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａ
ｎｓ）に近い種のものと認められる。しかし、マニトー
ル、キシロース、アラビノースを利用しないことより、
バチルス・リシニホルミスとは異なる。またゼラチン液
化能があり、かつ７％食塩下で生育することによりバチ
ルス・コアグランスとも異なる。また、ＤＮＡのＧＣ含
有量が３６．５％であることから、バチルス・セリウス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（ＧＣ含有量：３
５．７％）に近い。しかし、菌体脂肪酸の主体がＣ₁₆脂
肪酸（パルミチン酸）であることから、イソ−Ｃ₁₅脂肪
酸を主体とするバチルス・セリウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｅｒｅｕｓ）とは明確に区別される。他に本菌株に
近い種のバチルス属細菌がないことより、本菌株は新種
に属するものと認められる。よって本菌株をバチルス
ｓｐ．Ｎｏ．ｃｉｔ−７０と命名した。なお、バチルス
ｓｐ．Ｎｏ．ｃｉｔ−７０は工業技術院生命工学工業
技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４５５３として寄託さ
れている。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１７】窒素源としては、硫安、硝安、硝酸カリ、
塩安、アンモニア等の無機窒素源、肉エキス、ポリペプ
トン、カザミノ酸、ソイト−ン、酵母エキス等の有機窒
素源などを用いることができる。無機塩類としては、第
一及び第二りん酸カリ、ナトリウム及びアンモニウム塩
等、マグネシウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マンガン
塩、第一及び第二鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト
塩、ほう素塩が用いられる。また、微量栄養素として、
ビオチン、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、ビタミンＢ12、
パントテン酸、イノシト−ル等も適宜用いられる。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１８】上記組成からなる培地のｐＨは、アンモニ
ア、苛性カリ、苛性ソ−ダ等で６．０〜８．０、好まし
くは６．８〜７．２に調整される。なお、前記培地には
適宜な量の消泡剤も必要に応じて添加される。培地殺菌
はオートクレーブ法、フィルター法のどちらを用いても
よい。またそれらの方法を併用してもよい。その条件
は、例えばオートクレーブ法の場合は、１００〜１３０
℃、５〜３０分、好ましくは１１５〜１２５℃、１０〜
２０分である。なお、前記培地にアルギニンを塩酸塩と
して、０．０１〜１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．
１〜０．５％（ｗ／ｖ）添加した培地で本細菌株を培養
すると、アルギニンからシトルリンを生産する能力の強
い菌体を得ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ−アルギニンからＬ−シトルリンを、
   かつＬ−シトルリンからＬ−オルニチンを生産する能力
   を有する細菌に、水溶性有機溶剤による乾燥処理を施し
   て得られるＬ−オルニチン生産能欠除の水溶性有機溶剤
   乾燥処理菌体を、Ｌ−アルギニンに接触作用させること
   を特徴とするＬ−シトルリンの製造法。
2. 【請求項２】 細菌がバチルス属のものである請求項１
   記載のＬ−シトルリンの製造法。
3. 【請求項３】 Ｌ−アルギニンからＬ−シトルリンを、
   かつＬ−シトルリンからＬ−オルニチンを生産する能力
   を有し、水溶性有機溶剤による乾燥処理によってＬ−オ
   ルニチン生産能が欠除するバチルス属ｓｐ．Ｎｏ．ｃｉ
   ｔ−７０株。