EP1108053A1 - Verfahren zur herstellung von (2r)-piperidinderivaten - Google Patents

Verfahren zur herstellung von (2r)-piperidinderivaten

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EP1108053A1
EP1108053A1 EP99944524A EP99944524A EP1108053A1 EP 1108053 A1 EP1108053 A1 EP 1108053A1 EP 99944524 A EP99944524 A EP 99944524A EP 99944524 A EP99944524 A EP 99944524A EP 1108053 A1 EP1108053 A1 EP 1108053A1
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EP
European Patent Office
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general formula
microorganisms
pipecolinic acid
amino
reaction
Prior art date
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EP99944524A
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English (en)
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Michael Petersen
Wolfgang Beck
Klaus Heinzmann
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Lonza AG
Original Assignee
Lonza AG
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Publication date
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    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers

Definitions

  • the present invention relates to a new process for the preparation of (2R) - piperidine derivatives of the general formulas
  • R 1 is hydroxy, amino or C ,. -AIkoxy and R 4 is hydroxy or amino
  • (2R) -piperidine derivatives of the general formula I are important synthesis building blocks for biologically active compounds, such as stimulants of growth hormone release (WO-A-9513069) or anti-anxiety agents (DE-A-37 02 943).
  • EP-A-686 698 describes a biotechnological process for the production of S- ⁇ -aminocarboxylic acids, for example S- ⁇ -pipecolinic acid, by reacting the racemic RS- ⁇ -aminocarboxylic acid amides with microorganisms of the genera Klebsiella and Pseudomonas, and also the corresponding ones R- ⁇ -aminocarboxylic acid amides are obtained In order to prepare the R- ⁇ -aminocarboxylic acid amides, however, the S- ⁇ -aminocarboxylic acids have to be separated off using relatively complex processes
  • JP-A-63 248 393 describes a process for the preparation of (R) -pipecolinic acid starting from racemic pipecolinic acid by means of microorganisms of the genera Pseudomonas, Kurthia or Alcaligenes. The long reaction times are disadvantageous in this process
  • the object of the present invention is to eliminate these disadvantages and to provide a simple process for the preparation of (2R) -piperidine derivatives, with which high yields can be achieved and which is feasible on an industrial scale
  • microorganisms which have the property of ⁇ -aminocarboxamides in foam of racemate or its optically active isomers of the general formula III,
  • microorganisms wherein A together with -NH and -CH represent an optionally substituted 5- or 6-membered saturated heterocyclic ring as the only nitrogen source that can be used.
  • Such microorganisms are known in the prior art and have already been described in detail in EP-A-686 698 Preferred microorganisms with the properties described above are microorganisms of the genera Klebsiella and Pseudomonas. Microorganisms of the species Pseudomonas putida, in particular those of the species Pseudomonas putida with the designation DSM 9923, and their functionally equivalent variants and mutants are particularly preferred
  • microorganisms of the species Pseudomonas putida with the designation DSM 9923 were on 20 04 1 95 at the German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSM). Mascherodeweg lb, D-38124 Braunschweig, deposited in accordance with the Budapest Treaty
  • R "is hydroxyl, amino or d .c-alkoxy can decompose in the presence of trace elements and under aerobic conditions with ring cleavage and, in the case of microorganisms, can be used as the only source of carbon and energy. After a sufficient reaction time, usually after 1 to 48 hours, then there is little or no ring-shaped S- ⁇ -aminocarboxylic acid or other disruptive open-chain by-products such as S-2-aminoadipic acid in the reaction medium in the reaction medium.
  • the (2R) -piperidine derivatives of the general formula I accumulated during the reaction
  • R is hydroxy, amino or C
  • C] - f -Aikoxy has the meaning of a straight-chain or branched alkoxy group with 1 to 6 C atoms here and below. Methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy should be mentioned. tert-butoxy, pentoxy and its isomers and hexoxy and its isomers
  • the enzymes for the cell-free system can be obtained by disrupting the microorganisms in a manner customary in the art. For example, the ultrasound, French press or lysozyme method can be used for this purpose. These cell-free enzymes can also be immobilized on a suitable carrier material
  • trace elements are, for example, zinc, manganese, cobalt, copper, nickel, molybdenum, calcium, magnesium, boi.
  • Zinc and manganese are preferred.
  • Boron, iron and sulfur »emeinsa 'sge sets
  • the most preferred substrates of the general formula II are (RS) -pipecolinic acid, (RS) -pipecolinic acid ethyl ester, (RS) -pipecolinic acid isopropyl ester and (RS) -pipecolinic acid amide
  • Aerobic conditions are understood to mean culture conditions in which the microorganisms are supplied with oxygen. This can be experienced, for example, in shake culture by atmospheric oxygen or in submerged culture by blowing in molecular oxygen or atmospheric oxygen
  • the reaction can be carried out without conventional cultivation directly by adding the microorganisms to (RS) -piperidine derivatives of the general formula II.
  • the reaction can be carried out after conventional cultivation of the microorganisms with a suitable carbon and energy source Sugar.
  • Carboxylic acids, sugar alcohols or amino acids can be used.
  • sugars hexoses such as glucose or pentoses can be used
  • glutamate can be used
  • reaction is preferably carried out without customary cultivation directly by adding the microorganisms to (RS) -piperidine derivatives of the general Foimel II
  • the microorganisms can use the (S) -isomer of the (RS) -piperidine derivative of the general formula II as the only carbon and energy source and as the only nitrogen source
  • the medium customary in the art can be used as the medium for the process according to the invention, such as mineral salt media, for example the mineral salt medium according to Kulla et al (Arch Microbiol 135, 1-7. 1983), the media described in Table 1 or low-molar buffers such as 10 to 100 mM phosphate buffer to which the necessary trace elements have been added.
  • the process is preferably carried out in the media according to Table 1
  • the conditions are expediently chosen such that the S-isomer of the (RS) -piperidine derivatives of the formula II is preferably used by the microorganisms as a carbon and energy source.
  • the medium therefore preferably does not contain any compounds other than compound II that are easily usable as a carbon and energy source links
  • the reaction is carried out expediently with a single, repeated or continuous addition of (RS) -piperidine derivatives of the general formula II.
  • the addition of (RS) -piperidine derivatives of the general formula II is carried out in such a way that the concentration is 30% by weight, preferably 10% by weight %, particularly preferably 5% by weight, not exceeded
  • the pH of the medium is expediently in a range from 4 to 9, preferably from 6 to 8
  • the reaction is expedient at a temperature of from 15 to 80 ° C., preferably from 25 to 40 ° C. by 'saw 1 -f
  • (2R) -pipecolinic acid amide or (2R) -pipecolinic acid is obtained from (RS) -pipecolinic acid amide can be controlled, for example, via the reaction time.
  • the (2R) initially Pipecolinic acid amide which can be isolated if necessary
  • the acid is formed from the (2R) -pipecolinic acid amide.
  • the reaction can be followed analytically, e.g. chromatographically. The same applies to the reaction of (RS) -pipecolinic acid esters, in which the (2R ) -Pipecolinic acid ester and then the acid accumulates
  • the (2R) -piperidine derivatives of the general formula I preferably the (R) -pipecolinic acid, the (R) -pipecolinic acid amide and the (R) -pipecolinic acid ethyl and isopropyl esters, become very high to quantitative Yield obtained in the medium
  • the (2R) -piperidine derivatives of the general formula I obtained in this way can be isolated by customary work-up methods such as, for example, by separating off the biomass, acidification, chromatography, electrodialysis or crystallization
  • the course of the reaction can also be regulated via the supply of oxygen.
  • the reaction is expedient until the (R) -pipecolinic acid amide or the like is accumulated (R) -pipecolinic acid esters as above described carried out under aerobic conditions and then the oxygenation adjusted, after which the acid is formed
  • R has the meaning given above, which can be temporarily accumulated in the medium with increasing enantiomeric excess and, if appropriate, isolated. If the (R) -pipecolinic acid derivative according to formula VI is to be prepared from the (RS) -pipecolinic acid derivative according to formula V, it will after accumulation isolated If the (R) -pipecolinic acid according to formula IV is to be produced from the (RS) -pipecolinic acid derivative according to formula V, the reaction is expediently carried out under aerobic conditions until the accumulation of the (R) -pipecolinic acid derivative according to formula VI and then the oxygen supply is stopped
  • reaction can be followed analytically, for example by chromatography Implementation should be stopped as soon as the accumulation of the (R) -p ⁇ pecol ⁇ nsaurede ⁇ ⁇ ats according to formula VI is reached
  • Another component of the invention is the further implementation, the reduction, of the (2R) - Pipecolmsaurede ⁇ vate dei general formula VI to the (2R) -P ⁇ pe ⁇ d ⁇ nde ⁇ ⁇ aten of the general Foimel VII
  • R is Hvdroxv or Amino
  • an alkali metal hydride or an alkaline earth metal hydride such as, for example, is used as the reducing agent Potassium or
  • the reduction is expediently carried out at a temperature of 0 to 100 ° C., preferably at the reflux temperature of the corresponding solvent
  • the reduction can be carried out in a polar organic solvent, for example in an ethei. Diethyl ether, dipropylethei, tetrahydrofuran or 1,4-dioxane are suitable as ethers, for example
  • the desired products of the general formula VII such as the (R) -2- (aminomethyl) p; per ⁇ d ⁇ n or the (R) -2- (hydroxymethyl) p ⁇ pe ⁇ d ⁇ n, can then be isolated by known processing methods Table 1
  • Pseudomonas putida DSM 9923 was grown on medium 3 with 20 g / l glutamate overnight in the fermenter. At OD650 of 14, 1% (RS) -pipecolinic acid amide was added. According to GC analysis, after 2 hours there was practically enantiomerically pure (R) -pipecolinic acid amide before pipecolinic acid was not to prove

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung von (R)-Piperidinderivaten der allgemeinen Formel (I) und (VII), worin R<1> Hydroxy, Amino oder C1-6-Alkoxy und R<4> Hydroxy oder Amino bedeutet, beschrieben. Die (R)-Piperidinderivate werden ausgehend von (RS)-Piperidinderivaten der allgemeinen Formel (II), worin R<2> Hydroxy, Amino oder C1-6-Alkoxy bedeutet, in Gegenwart von Spurenelementen mit Mikroorganismen oder mittels zellfreien Enzymen aus diesen Mikroorganismen erhalten.

Description

Verfahren zur Herstellung von {2R)-Piperidindcrivnten
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von (2R)- Piperidinderivaten der allgemeinen Formeln
und
worin R1 Hydroxy, Amino oder C,. -AIkoxy und R4 Hydroxy oder Amino bedeutet
(2R)-Piperidindcrivate der allgemeinen Formel I, wie z.B. (R)-Pipecolinsaure, sind wichtige Synthesebausteine für biologisch aktive Verbindungen, wie z B Stimulanzien der Wachstumshormon-Ausschüttung (WO-A-9513069) oder Antiangstmittel (DE-A-37 02 943).
Die EP-A-686 698 beschreibt ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von S-α- Aminocarbonsauren, beispielsweise S-α-Pipecolinsaure, durch Umsetzung der racemischen RS-α-Aminocarbonsaureamide mit Mikroorganismen der Gattungen Klebsiella und Pseudomonas, \\ obei auch die entsprechenden R-α-Aminocarbonsaureamide anfallen Zur Reindarstellung der R-α-Aminocarbonsaureamide müssen die S-α-Aminocarbonsauren aber über relativ aufwendige Verfahren abgetrennt werden
Bekannt ist auch ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von (R)-Pipecolinsaure durch Kultivierung von Mikroorganismen der Gattung Alcaligenes in (RS)-Pipecolinsaure- enthaltendem Medium (Mochizuki. K . Yamazaki. Y . Maeda, H . Agric Biol Chem , 1988, 52(5), 1 1 13) Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass die (R)-Pipeeolinsaure im Gemisch mit (S)-2-Aminoadipinsaure erhallen wird und nach der Herstellung von der gebildeten Amino- adipinsaure abgetrennt werden m ss
Ein Verfahren zur Herstellung \ on (R)-Pipecolinsaureestern ist von R J Kazlauskas et al (J Org Chem , 1994, 59, 2075-2081 ) beschrieben Dabei werden die entsprechenden racemischen Ester mittels isolierten stereoselektiven Lipasen aus Aspergillus niger zum gewünschten Produkt umgesetzt Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass die gewünschten Produkte in schlechter Enantiomerenreinheit sind und in niedriger Ausbeute erhalten werden Desweiteren sind auch sehr grosse Enzymmengen notwendig
Die JP-A-63 248 393 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von (R)-Pipecolinsaure ausgehend von racemischer Pipecolinsaure mittels Mikroorganismen der Gattungen Pseudomonas, Kurthia oder Alcaligenes Nachteilig bei diesem Verfahren sind die langen Umsetzungszeiten
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, diese Nachteile zu beseitigen und ein einfaches Verfahren zur Herstellung von (2R)-Piperidinderivaten zur Verfugung zu stellen, mit dem hohe Ausbeuten erzielt werden können und das grosstechnisch gangbar ist
Diese Aufgabe wird mit dem neuen biotechnologischen Verfahren gemass Anspruch 1 gelost
Erfindungsgema ß werden Mikroorganismen eingesetzt, die die Eigenschaft haben, α- Aminocarbonsaureamide in Foi m des Racemats oder seiner optisch aktiven Isomere der allgemeinen Formel III,
worin A zusammen mit -NH und -CH einen gegebenenfalls substituierten 5- oder 6-gliedrigen gesattigten heterocyclischen Ring bedeutet, als einzige Stickstoffquelle verwerten zu können Derartige Mikroorganismen sind im Stand der Technik bekannt und bereits in der EP-A-686 698 ausführlich beschrieben Bevorzugte Mikroorganismen mit den oben beschriebenen Eigenschaften sind Mikroorganismen der Gattungen Klebsiella und Pseudomonas Besonders bevorzugt werden Mikroorganismen der Spezies Pseudomonas putida, insbesondere diejenigen der Spezies Pseudomonas putida mit der Bezeichnung DSM 9923, sowie deren funktionell äquivalente Varianten und Mutanten ei uesetzt
Die Mikroorganismen der Spezies Pseudomonas putida mit der Bezeichnung DSM 9923 wurden am 20 04 1 95 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM). Mascherodeweg lb, D-38124 Braunschweig, gemass Budapester Vertrag hinterlegt
Unter "funktioneil äquivalente Varianten und Mutanten" werden Mikroorganismen verstanden, die im wesentlichen dieselben Eigenschaften und Funktionen wie die Ursprungsmikro- erganismen besitzen Derartige Varianten und Mutanten können zufallig z B durch UV- Bestrahiuno gebildet werden
Überraschenderweise wurde gefunden, dass diese Mikroorganismen, oder zeüfreie Enzyme daraus, das S-Isomere in (RS)-Piperidinderivaten der allgemeinen Formel II
worin R" Hydroxy, Amino oder d .c-Alkoxy bedeutet, in Gegenwart von Spurenelementen und unter aeroben Bedingungen unter Ringspaltung abbauen und, im Falle der Mikroorganismen, als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle verwerten können. Nach einer ausreichenden Umsetzungsdauer, üblicherweise nach 1 bis 48 Stunden, liegen dann im Reaktionsmedium nur noch wenig oder gar keine ringförmigen S-α-Aminocarbonsauren oder andere störende offenkettige Nebenprodukte wie S-2-Aminoadipinsaure im Reaktionsmedium vor. Die bei der Umsetzung akkumulierten (2R) - Piperidinderivate der allgemeinen Formel I
worin R Hydroxy, Amino oder C|.r,-Alkoxy bedeutet, können dann ohne Schwierigkeiten, insbesondere ohne aufwendige Trennverfahren, isoliert werden
C] - f,-Aikoxy hat hier und im weiteren die Bedeutung einer geradkettigen oder verzweigten Alkoxygruppe mit 1 bis 6 C-Atomen Namentlich erwähnt seien Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, Isobutoxy. tert-Butoxy, Pentoxy und seine Isomeren sowie Hexoxy und seine Isomeren
Die Enzyme für das zellfreie Svstem können durch fachmannisch übliches Aufschliessen der Mikroorganismen gewonnen w eiden Hierzu kann beispielsweise die Ultraschall-, French-Press oder Lysozym-Methode verwendet werden Diese zellfreien Enzyme können auch auf einem geeigneten Tragermaterial immobilisiert werden
Unter Spurenelementen sind beispielsweise Zink, Mangan, Kobalt, Kupfer, Nickel, Molybdän, Calcium, Magnesium, Boi. Eisen oder Schwefel zu verstehen, wobei die optimale Zusammensetzung der Spurenelemente vom verwendeten Mikroorganismus abhangig ist Bevorzugt werden Zink, Mangan. Kobalt, Kupfer, Nickel, Molybdän, Calcium, Magnesium. Bor, Eisen und Schwefel »emeinsa ein 'sge"setzt
Zweckmassig wird die Umsetzung von (RS)-Piperidinderivaten der allgemeinen Formel II mit wachsenden Mikroorganismen durchgeführt
Die bevorzugtesten Substrate der allgemeinen Formel II sind (RS)-Pipecolinsaure, (RS)-Pipecolinsaureethylester, (RS)-Pipecolinsaureιsopropylester und (RS)-Pipecolinsaureamid
Unter aeroben Bedingungen werden Kulturbedingungen verstanden, bei denen die Mikroorganismen mit Sauerstoff versorgt werden Dies kann zum Beispiel in Schuttelkultur durch Luftsauerstoff oder in Submerskultur durch Einblasen von molekularem Sauerstoff oder Luftsauerstoff erfahren Die Umsetzung kann ohne übliche Anzucht direkt durch Zugabe der Mikroorganismen zu (RS)-Piperidinderivaten der allgemeinen Formel II durchgeführt werden Alternativ kann die Umsetzung nach üblichem Anzuchten der Mikroorganismen mit einer geeigneten Kohlenstoff- und Energiequelle durchgeführt w erden Als Kohlenstoff- und Energiequelle können hierbei beispielsweise Zucker. Carbonsauren, Zuckeralkohole oder Aminosäuren eingesetzt werden Als Zucker können Hexosen w ie beispielsweise Glucose oder Pentosen angewendet werden Als Carbonsauren können Di- oder Tricarbonsauren bzw deien Salze verwendet werden wie beispielsweise Citronensaure oder Succinat Als Zuckeralkohol kann ein dreiwertiger Alkohol Verwendung finden, wie beispielsweise Glycerin Als Aminosäure kann beispielsweise Glutamat eingesetzt werden
Bevorzugt wird die Umsetzung ohne übliche Anzucht direkt durch Zugabe der Mikroorganismen zu (RS)-Piperidinderivaten der allgemeinen Foimel II durchgeführt
Bei der Umsetzung können die Mikroorganismen das (S)-Isomer des (RS)-Piperidinderivates der allgemeinen Formel II als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle und als einzige Stickstoffquelle verwerten
Als Medium für das erflndungsgemaße Verfahren können die fachmannisch üblichen Medien wie Mineralsalzmedien dienen, beispielsweise das Mineralsalzinedium gemass Kulla et al , (Arch Microbiol 135, 1-7. 1983), die in Tabelle 1 beschriebenen Medien oder niedermolare Puffer, wie beispielsweise 10 bis 100 mM Phosphatpuffer, denen die erforderlichen Spurenelemente zugesetzt wurden Vorzugsweise wird das Verfahren in den Medien gemass Tabelle 1 durch»efuhrt
Zweckmäßig werden die Bedingungen so gewählt, daß das S-Isomere der (RS)- Piperidinderivate der Formel II von den Mikroorganismen bevorzugt als Kohlenstoff- und Energiequelle verwertet wird Bevorzugt enthalt das Medium daher neben der Verbindung II keine anderen leicht als Kohlenstoff- und Energiequelle verwertbaren Verbindungen
Zvveckmassig wird die Umsetzung unter einmaliger, mehrmaliger oder kontir.uierlicher Zugabe von (RS)-Piperidinderivaten der allgemeinen Formel II durchgeführt Die Zugabe von (RS)- Piperidinderivaten der allgemeinen Formel II wird solchermassen durchgeführt, dass die Konzentration 30 Gew %, bevorzugt 10 Gew %, besonders bevorzugt 5 Gew %, nicht ubersteiyt Der pH-Wert des Mediums liegt zweckmassig in einem Bereich von 4 bis 9. vorzugsweise von 6 bis 8 Zweckmassig wird die Umsetzung bei einer Temperatur von 15 bis 80°C, vorzugsweise von 25 bis 40°C. durch 'sge1-f hrt
Welches Endprodukt der allgemeinen Formel I bei der Umsetzung erhalten wird, hangt von der Wahl des Ausgangsmaterials und der Reaktionsbedingungen, insbesondere der Reaktionsdauer und der Sauerstoffzufuhr ab
Ausgehend von (RS)-Pipecolinsaure [(RS)-Piperidinderivat II, worin R^ Hydroxy bedeutet], kann nur die (2R)-Pipecolinsäure erhalten werden Ausgehend von (RS)-Pipecolinsaureamid [(RS)-Piperidinderivat II, worin R^ Amino bedeutet], kann sowohl das (2R)-Pipecolinsaureamid als auch die (2R)-Pipecolinsaure erhalten werden Ausgehend von einem (RS)-Pipecolinsaureester [(RS)-Piperidinderivat II, worin R^ C]_5-Alkoxy bedeutet], kann sowohl der (2R)-Pipecolinsaureester als auch die (2R)-Pipecolinsaure erhalten werden
Ob aus (RS)-Pipecolinsaureamid das (2R)-Pipecolinsaureamid oder die (2R) Pipecolinsaure erhalten wird, kann beispielsweise über die Umsetzungszeit gesteuert werden So akkumuliert bei der Umsetzung von (RS)-Pipecolinsaureamid mit den erfindungsgemaßen Mikroorganismen zunächst das (2R)-Pipecolinsaureamid, das gegebenenfalls isoliert werden kann Nach längerer Umsetzungsdauer wird dann aus dem (2R)-Pipecolinsaureamid die Säure gebildet Die Umsetzung kann analytisch, beispielsweise chromatographisch, verfolgt werden Entsprechendes gilt für die Umsetztung von (RS)-Pipecolinsaureestern, bei der zunächst der (2R)-Pipecolinsaureester und anschließend die Saure akkumuliert
Nach einer üblichen Umsetzungszeit von vorzugsweise 1 bis 48 Stunden werden die (2R)- Piperidinderivate der allgemeinen Formel I vorzugsweise die (R)-Pipecolinsaure, das (R)- Pipecolinsaureamid und der (R)-Pipecolinsaureethyl- und isopropylester in sehr hoher bis quantitativer Ausbeute im Medium erhalten
Die auf diese Weise gewonnenen (2R)-Piperidinderivate der allgemeinen Formel I können durch übliche Aufarbeitungsmethoden wie z B durch Abtrennung der Biomasse, Ansäuern, Chromatographie, Elektrodialyse oder Kristallisation isoliert werden
Alternativ kann der Verlauf der Umsetzungsreaktion auch über die Sauerstoffzufuhr reguliert werden Soll beispielsweise aus (RS)-Pipecolinsaureamid oder (RS)-Pipecolinsaureester (R)-Pipecolinsaure hergestellt werden, so wird die Umsetzung zweckmassig bis zur Akkumulation des (R)-Pipecolinsaureamids bzvv des (R)-Pipecolinsaureesters wie oben beschrieben unter aeroben Bedingungen durchgeführt und anschliessend die Sauerstoffversoigung eingestellt, wonach die Saure gebildet wird
Die Umsetzung des (RS)-Pipecolinsaurederivats gemass Formel V
worin R1 Amino oder C].,-Alkoxy bedeutet, wobei Cι.r,-Alkoxy die oben genannte Bedeutung hat, zur (R)-Pipecolinsaure gemass Formel IV
erfoigt also über das (R)-Pipecolinsaurederivat gemass Formel VI,
worin R" die oben genannte Bedeutung hat, welches vorübergehend im Medium mit steigendem Enantiomerenuberschuss akkumuliert und gegebenenfalls isoliert werden kann. Soll das (R)-Pipecolinsaurederivat gemass Formel VI aus dem (RS)-Pipecolinsaurederivat gemass Formel V hergestellt werden, wird es nach Akkumulation isoliert Soll die (R)-Pipecolinsaure gemass Formel IV aus dem (RS)-Pipecolinsaurederivat gemass Formel V hergestellt werden, wird die Umsetzung zweckmassig bis zur Akkumulation des (R)-Pipecolinsaurederivats gemass Formel VI unter aeroben Bedingungen durchgeführt und anschliessend die Sauerstoifversorgung eingestellt
Um festzustellen, ob das (R)-Pipecolinsaurederivat gemass Formel VI im Medium akkumuliert ist, kann die Umsetzung analytisch, beispielsweise chromatographisch, verfolgt werden Die Umsetzung sollte beendet w ei den sobald die Akkumulation des (R)-Pιpecolιnsauredeπ\ ats gemass Formel VI erreicht ist
Ein weiterer Bestandteil der Ei findung ist die Weiterumsetzung, die Reduktion, der (2R)- Pipecolmsauredeπvate dei allgemein Formel VI zu den (2R)-Pιpeπdιndeπ\ aten der allgemein Foimel VII
worin R Hvdroxv oder Amino bedeutet
Üblicherweise wird als Reduktionsmittel ein Alkalimetallhydπd oder ein Erdalkalunetallhydnd wie bspw Kalium- oder
Natπumaluminiumhydrid Magnesium- oder Calciumborhydπd verwendet Insbesondere wird Lithiumaluminiumhydπd
Zweckmassig wird die Reduktion bei einer Temperatur von 0 bis 100 °C, vorzugsweise bei Ruckflusstempei atur des entspi echenden Lösungsmittels durchgeführt
Wie fachm nnisch bekannt kann die Reduktion in einem polaren organischen Losungsmittel wie beispielsweise in einem Ethei durchgeführt werden Als Ether sind beispielsweise Diethylether Dipropylethei Tetrah\drofuran oder 1 ,4-Dιoxan geeignet
Nach einer üblichen Umsetzungszeit von 1 bis 16 h können dann die gewünschten Produkte dei allgemein Formel VII wie das (R)-2-(Amιnomethyl)p;perιdιn oder das (R)-2- (Hydroxymethyl)pιpeπdιn durch bekannte Aufaibeitungsmethoden isoliert werden Tabelle 1
Medium 1
(NH.,)2SO4 2.0 g/1
Na2HPO4 2.0 g/1
KH2PO 1 ,0 g/1
NaCl 2,0 g/1
MgCl2 • 6 H2O 0,4 g/1
CaCl2 • 2 H2O 14,5 mg/1
FeCl3 • 6 H2O 0.8 mg/1
ZnSO., • 7 H2O 0, 1 mg/1
MnCl2 • 4 H2O 0,09 mg/1
H3BO3 0,3 mg/1
CoCl2 • 6 H2O 0,2 mg/1
CuCl2 • 2 H2O 0,01 mg/1
NiCl2 • 6 H2O 0,02 mg/1
Na2MoO4 • 2 H2O 0,03 mg/1
FeSO4 • 7 H2O 2,0 mg/1
EDTA-Na2 • 2 H2O 5,0 mg/1
Medium 2
KH2PO 1 ,3 g/1
NH4C1 5 g/1
(NH )2SO4 2 g/1
Na2SO4 0,25 g/1
MgCl2 • 6 H2O 0,8 g/1
CaCl2 • 2 H2O 0.16 g/1
ZnSO4 • 7 H2O 9 mg/1
MnCl2 • 4 H2O 4 mg/1
H3BO3 2,7 mg/1
CoCl2 • 6 H2O 1 ,8 mg/1
CuCI2 • 2 H2O 1.5 mg/1
NiCl2 • 6 H2O 0. 18 mg/1
Na2MoO., • 2 H2O 0,2 mg/1
FeSO4 • 7 H2O 30 mg/1
EDTA-Na2 • 2 H2O 175 mg/1 Me ium 3
Na:SO., 0, 1 g/1
Na2HPO, 2,0 g/1
KH2PO4 1 ,0 g/1
NaCl 2,0 g/1
MgCl2 • 6 H2O 0,4 g/1
CaCl2 • 2 H2O 14.5 mg/1
FeCl3 • 6 H2O 0,8 mg/1
ZnSO • 7 H2O 0, 1 mg/1
MnCl2 • 4 H2O 0,09 mg/1
H3BO3 0,3 mg/1
CoCl2 • 6 H2O 0,2 mg/1
CuCl2 • 2 H2O 0,01 mg/1
NiCl2 • 6 H2O 0,02 mg/1
Na2MoO4 • 2 H:O 0,03 mg/1
FeSO., ■ 7 H2O 2,0 mg/1
EDTA-Na2 • 2 H2O 5,0 mg/1
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung von (R)-Pipecoiinsäιιre aus (RS)-Pipecoiinsäure
1.1 in Schütteikuitur
400 ml Medium 1 mit einer Konzentration von 1 ,5 % (RS)-Pipecolinsaure wurden in einem 1-1- Erlenmeyerkolben vorgelegt und mit Pseudomonas putida DSM 9923 versetzt Der Ansatz wurde bei 30°C und 140 Umdrehungen/min auf einer Schuttelmaschine inkubiert Nach 24 h wurde bei einer OD650 von 3,7 der zellfreie Überstand mit HPLC auf den Gehalt an (R)- Pipecolinsaure untersucht (R)-Pipecolinsaure wurde in einer Ausbeute von > 45 % bezogen auf die eingesetzte (RS)-Pipecolinsaure und mit einem ee-Wert von > 99% erhalten
1.2 im Fermenter 100 ml Medium 3 mit einer Konzentration von 1% (RS)-Pipecolinsaure wurden in einem 500- l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen vorgelegt und mit Pseudomonas putida DSM 9923 versetzt. Der Ansatz wurde bei 30°C und 140 Umdrehungen/min auf einer Schuttelmaschine 16 h inkubiert 3 1 Medium 2 mit einer Konzentration von 1,5% (RS)-Pipecolinsaure (45g) wurden in einem 5-1-Fermenter vorgelegt und mit der Vorkultur von Pseudomonas putida DSM 9923 versetzt Nach 7 h wurden innerhalb von 5 h weitere 45 g (RS)-Pipεcolinsaure als lOprozentige Losung kontinuierlich zugegeben Nach weiteren 4 h wurde die Biotransformation gestoppt und der zellfreie Überstand mit HPLC auf den Gehalt an (R)-Pipecolinsaure untersucht (R)- Pipecolinsaure wurde in quantitativer Ausbeute und mit einem ee-Wert von > 97% erhalten
Beispiel 2
Herstellung von (R)-Pipecolinsäure aus (RS)-PipecoIinsäureethylester
40 ml Medium 3 mit einer Konzentration von 1 ,5% (RS)-Pipecolinsaureethylester wurden in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen vorgelegt und mit Pseudomonas putida DSM 9923 versetzt Der Ansatz wurde bei 30°C und 140 Umdrehungen/min auf einer
Schüttelmaschine inkubiert Nach 26 h wurde bei einer OD650 von 2,0 der zellfreie Überstand mit HPLC auf den Gehalt an (R)-Pipecolinsaure untersucht (R)-Pipecolinsaure wurde in einer Ausbeute mit > 45% bezogen auf den eingesetzten (RS)-Pipecolinsaureethylester und mit einem ee-Wert \ on > 80% erhalten Nach 44 h wurde bei einei OD650 von 3,2 enantiomerenreine (R)-Pipecolinsaure erhalten Beispiel 3
Herstellung von (R)-Pipecolinsäureaιnid aus (RS)-PipeeoIinsäureamid in Schüttelkultur
40 ml Medium 3 mit einer Konzentration von 1,5% (RS)-Pipecolinsaureamid wurden in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen vorgelegt und mit Pseudomonas putida DSM 9923 versetzt Der Ansatz wurde bei 30°C und 140 Umdrehungen/min auf einer Schuttelmaschine inkubiert Nach 20 h wurde bei einer OD650 von 3,0 der zellfreie Überstand mit HPLC auf den Gehalt an (R)-Pipecolinsaureamid untersucht (R)-Pipecolinsaureamid wurde in einer Ausbeute von > 45% bezogen auf das eingesetztes (RS)-Pipecolinsaureamid und mit einem ee-Wert von > 99% erhalten
Beispiel 4
Herstellung von (R)-Pipecolinsäιιreamid und (R)-Pipecolinsäure aus (RS)- Pipecoiinsäurcamid im Fermenter
Pseudomonas putida DSM 9923 wurde auf Medium 3 mit 20g/l Glutamat über Nacht im Fermenter angezogen Bei OD650 von 14 wurde 1% (RS)-Pipecolinsaureamid zugegeben Nach 2 h lag laut GC-Analyse praktisch enantiomerenreines (R)-Pipecolinsaureamid vor Pipecolinsaure war nicht nachzuweisen
Eine Probe dieser Losung wurde unter Luftabschluss im Schuttelschrank bei 37°C und 140 Umdrehungen/min inkubiert Nach 48 h lag laut GC-Analyse enantiomerenreine (R)-Pipecolinsaure vor Pipecolinsaureamid war nicht mehr nachzuweisen
Beispiel 5
Herstellung von (R)-Pipecolinsäure aus (RS)-PipecoIinsäureamid in Schüttelkultur 40 ml Medium 3 mit einer Konzentration von 1% (RS)-Pipecolinsaureamid wurden in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen vorgelegt und mit Pseudomonas putida DSM 9923 versetzt Der Ansatz wurde bei 30°C und 140 Umdrehungen/min auf einer Schuttelmaschine inkubiεrt Nach 26 h wurde bei einer OD650 von 3 9 der zellfreie Überstand per GC untersucht Es wurde (R)-Pipecolinsaure mit ee > 98% in ca 10% Ausbeute gefunden Beispiel 6
Herstellung von (R)-Pipecolinsaureisopropylester aus (RS)-PipecoIinsäureisopropylcster in Schüttclkuliiir 100 ml Minimalmedium 3 mit einer Konzentration von 4 g/1 (RS)-Pipecolinsaureisopropylester wurden in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen vorgelegt und mit Pseudomonas putida DSM 9923 versetzt Der Ansatz wurde bei 30°C und 140 rpm auf einer Schuttelmaschine inkubiert Nach 4.5 h wurde bei einer OD650 von 1 ,4 der zellfreie Überstand mit GC auf den Gehalt und Enantiomerenuberschuss an Pipecolinsaure und Pipecolinsaure- isopropylester untersucht (R)-Pipecolinsaureisopropylester wurde enamiomerenrein und in einer Ausbeute von 88% bezogen auf eingesetzten (R)-Pipecolinsaureisopropylester erhalten Als Nebenprodukt wurden wenige Prozent enantiomerenreine (R)-Pipecolinsaure gefunden
Nach Abtrennung dei Biomasse durch Zentrifugation (20 min bei 8000^) wurde die wassrige Losung im Vakuum auf ein Drittel eingedampft, mit 30%ιger Natronlauge auf pH 10 eingestellt und unverzüglich dreimal mit je 20 ml Diethyiether extrahiert Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Natriumsulfat getrocknet und aufkonzentriert Durch Einleiten von Salzsaure wurden 0.195g (R)-Pipecolinsaureisopropylester als Hydrochlorid kristallisiert (80% Ausbeute, ee > 98% lt GC)
Beispiel 7
Herstellung von (R)-Pipecolinsäure aus (RS)-Pipecolinsäureisopropyiester 100 ml Minimalmedium 3 mit einer Konzentration von 4 g/1 (RS)-Pιpecolinsaure;sopropylester wurden in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen vorgelegt und mit Pseudomonas putida DSM °>923 versetzt Der Ansatz wurde bei 30°C und 140 rpm auf einer Schuttelmaschine inkubiert Nach 7,5 h wurde bei einer OD650 von 1,4 eine Probe gezogen und unter Luftausschluss inkubiert Nach 22 h wurde der zellfreie Überstand mit GC auf den Gehalt und Enantiomerenuberschuss an Pipecolinsaure und Pipecolinsaureisopropylester untersucht (R)-Pipecolinsaure wurde enantiomerenrein und in einer Ausbeute von 80% bezogen auf eingesetzten (R)-Pipecolinsaure-isoproρylester erhalten Als Nebenprodukt wurden wenige Prozent enantiomerenreinen (R)-Pipecolinsaureisopropylesters gefunden Beispiel 8
Reduktion von (R)-Pipecoliιιsäureamid zu (R)-2-(Aminomethyl)-piperidin
In einem 2-1-Kolben wurden unter StickstofFatmosphare 1 1 ,8g Lithiumaluminiumhydrid in 500 ml Diethylether suspendiert Bei 5°C wurden 20 g (R)-Pipecolinsaureamid (vgl Bsp 3) langsam zugegeben Das Gemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur und dann 5 h unter Rückftuss gerührt Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden nacheinander langsam 12 ml Wasser, 12 ml 1 %ige Natronlauge und 36 ml Wasser zugetropft Das Gemisch wurde bei Raumtemperatui gerührt, bis es schneeweiss war Es wurden 120 g Natriumsulfat zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur genährt Der Feststoff wurde abfiltriert und viermal mit je 250 ml Diethylether gewaschen Die vereinigten organischen Phasen wurden im Vakuum eingedampft Man erhielt 12,5g (R)-2-(Aminomethyl)-piperidin als gelbliches Ol (Gehalf 66% laut GC) Destillation bei 52-53°C / 18 mbar lieferte 3 6g (20%) GC-reines (R)-2- (Aminomethyl)-piperidin als farblose Flüssigkeit
Beispiel 9
Reduktion von (R)-Pipecolinsäureisopropylester zu (R)-2-(HydroxymethyI)-piperidin In einem 250-ml-Kolben wurden unter StickstofFatmosphare 0,2g Lithiumaluminiumhydrid in 20 ml Diethylether suspendiert Bei 5°C wurden 90 mg (R)-Pipecolinsaureisopropylester- hydrochlorid langsam zugegeben Das Gemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur und dann 4 h unter Ruckfluss gerührt Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden nacheinander langsam 0,2 ml Wasser. 0.2 ml 15%ige Natronlauge und 0,4 ml Wasser zugetropft Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis es schneeweiss war Es wurden 2 g Natπumsuifat zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt Der Feststoff wurde abfiltriert und viermal mit je 20 ml Diethylether gewaschen Die vereinigten organischen Phasen wurden im Vakuum eingedampft Man erhielt 47 mg (R)-2-(Hydroxymethyl)-piperidin als schwach gelbliches Ol (Gehalf 95%, ee > 97% laut GC)

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Herstellung von (2R) - Piperidinderivaten der allgemeinen Formel
worin R Hydroxy, Amino oder C].ή-A]koxy bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man ein (RS) - Piperidinderivat der allgemeinen Formel
1 1 1 * worin R Hydroxy, Amino oder Cι_<-,-Alkoxy bedeutet und R und R gleich oder verschieden sein können mit der Einschränkung, daß wenn R Amino ist R nicht Hydroxy oder Cι_f,-Alkoxy ist und wenn R1 C].f)-Alkoxy ist R nicht Hydroxy oder Amino ist, mit Mikroorganismen, die befähigt sind, α-Aminocarbonsaureamide, in Form des Racemats oder eines seiner optisch aktiven Isomeren, der allgemeinen Formel
worin A zusammen mit -NH und -CH einen gegebenenfalls substituierten 5- oder 6- gliedrigen gesättigten heterocyclischen Ring bedeutet, als einzige Stickstoffquelle zu verwerten, oder zell freien Enzymen aus diesen Mikroorganismen, in Gegenwart von Spurenelementen und unter aeroben Bedingungen umsetzt, wobei das S-Isomere des (RS)-Piperidinderivats II unter Ringspaltung als Kohlenstoff- und Energiequelle verwertet bzw. abgebaut wird. Verfahren nach Anspruch I . dadurch gekennzeichnet, dass man als Substrat der Formel II (RS)-Pipecolinsaure. (RS)-PψecolinsaureethyΙester, (RS)-Pipecolinsaureisopropylester oder (RS)-Pιpecolinsaureamid verwendet
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung mit Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas, insbesondere der Spezies Pseudomonas putida, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung mit Mikroorganismen der Spezies Pseudomona putida (DSM 9923) oder deren funktionell äquivalenten Varianten und Mutanten durchgeführt wird
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung mit wachsenden Mikroorganismen durchgeführt wird
Verfahren nach einem der Anspr che 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zugabe von (RS) - Pipecolinsaurederivaten der allgemeinen Formel II solchermassen durchgeführt wird, dass die Konzentration 30 Gew % nicht übersteigt
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einem pH von 4 bis 9 und einer Temperatur von 15 bis 80°C durchgeführt wird
Verfahren zur Herstellung von (R)-Pipecolinsaure der Formel
dadurch gekennzeichnet, dass man (RS)-Pipecolinsaurederivate der allgemeinen Formel
worin R1 Amino oder C|-f,-Alkoxy bedeutet, als Substrat mit Mikroorganismen, die befähigt sind, α-Aminocaibonsaureamide, in Form des Racemats oder eines seiner optisch aktiven Isomeren, der allgemeinen Formel
worin A zusammen mit -NH und -CH einen gegebenenfalls substituierten 5- oder 6- gliedrigen gesattigten heterocyclischen Ring bedeutet, als einzige Stickstoffquelle zu verwerten, oder mittels zellfreien Enzymen aus diesen Mikroorganismen, in Gegenwart von Spurenelementen und unter aeroben Bedingungen umsetzt, wobei die Umsetzung bis zur Akkumulation des entsprechenden (R)-Pipecolinsaurederivats der Formel
worin R die genannte Bedeutung hat, welches gegebenenfalls isoliert werden kann, unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, wobei das S-Isomere des (RS)-Piperidinderivats II unter Ringspaltung als Kohlenstoff- und Energiequelle verwertet bzw abgebaut wird, und anschliessend die Sauerstoffversorgung eingestellt wird
Verfahren zur Herstellung \ on (2R)-Piperidin-Derivaten der allgemeinen Formel
worin R4 Hydroxy oder Amino bedeutet, dadurch gekennzeichnet dass man in der ersten Stufe (RS)-Pipecolinsauredeπvate der allgemeinen Formel
worin R1 Amino oder Cι.6- λlkoxy bedeutet, als Substrat mit Mikroorganismen, die befähigt sind, α-Aminocarbonsaureamide, in Form des Racemats oder eines seiner optisch aktiven Isomeren, der allgemeinen Formel
worin A zusamen mit -NH und -CH einen gegebenenfalls substituierten 5- oder 6- gliedrigen gesattigten heterocychschen Ring bedeutet, als einzige Stickstoffquelle zu verwerten, oder mittels zellfreien Enzymen aus diesen Mikroorganismen, in Gegenwart von Spurenelementen und unter aeroben Bedingungen, unter denen das S-Isomere des (RS)-Piperidinderivats II unter Ringspaltung als Kohlenstoff- und Energiequelle verwertet bzw abgebaut wird, in ein (R)-Pipecolinsaurederivat der allgemeinen Formel
worin R Amino oder Cι.f,-Alkoxy bedeutet, überfuhrt und dieses in der zweiten Stufe in die gewünschte Verbindung der allgemeinen Formel VII reduziert
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