CZ282337B6

CZ282337B6 - Mikroorganismy rodu Pseudomonas a způsob mikrobiologické výroby S-alfa-aminokarboxylových kyselin a amidů R-alfa-aminokarboxylových kyselin

Info

Publication number: CZ282337B6
Application number: CZ96668A
Authority: CZ
Inventors: Andreas Dr. Kiener; Jean-Paul Dr. Roduit; Jörg Dr. Kohr; Nicholas Dr. Shaw
Original assignee: Lonza A. G.
Priority date: 1994-06-09
Filing date: 1995-06-08
Publication date: 1997-06-11
Also published as: PT686698E; CZ282098B6; EP0686698A3; EP0686698B1; US5622846A; CA2150526C; CZ150795A3; EP0686698A2; US5766893A; DK0686698T3; CA2150526A1; JP3694065B2; DE59509085D1; ATE199743T1; JPH0856652A; ES2155104T3; CZ66896A3

Abstract

Popsány jsou nové mikroorganismy rodu Pseudomas, které jsou schopné amidy .alfa.-aminokarboxylových kyselin, ve formě racemátu nebo jeho opticky aktivních isomerů, obecného vzorce I, kde A spolu s -NH- a -CH- znamená popřípadě substituovaný pětičlenný nebo šestičlenný nasycený heterocyklických kruh, zužitkovat jako jediný zdroj dusíku a amidy (RS) -.alfa.-aminokarboxylových kyselin shora definovaného vzorce I převést na kyselinu S-.alfa.-aminokarboxylovou obecného vzorce II, kde A má uvedený význam. ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových mikroorganismů, které jsou schopné zužitkovat amid aaminokarboxylové kyseliny ve formě racemátu nebo jeho opticky aktivních izomerů, obecného vzorce I

A

(I) ve kterém A spolu s -NH- a -CH- znamená popřípadě substituovaný pětičlenný nebo šestičlenný nasycený heterocyklický kruh, jako jediný zdroj dusíku a převést amid (RS)-aaminokarboxylové kyseliny již definovaného vzorce I na S-a-aminokarboxylovou kyselinu obecného vzorce II

(Π) ve kterém A má jmenovaný význam. Tyto mikroorganismy, popřípadě jejich bezbuněčné enzymy, se používají pro nový způsob přípravy S-a-aminokarboxylových kyselin (vzorec II) a/nebo pro přípravu amidů R-a-aminokarboxylových kyselin obecného vzorce III

(III) kde A má jmenovaný význam.

S-a-aminokarboxylové kyseliny vzorec II jako například kyselina S-a-pipekolinová jsou důležité meziprodukty pro výrobu mnoha bioaktivních sloučenin, jako například pro Thioridazin nebo Pipradol (Ng-Youn-Chen a spol., J. Org. Chem., sv. 59, č. 8, 1994).

Dosavadní stav techniky

Vedle množství chemických štěpení racemátu kyseliny (RS)-pipekolinové, popřípadě jejich derivátů, jsou známé také biotechnologická štěpení recemátů. Tak popisuje například Huh a spol. (Biosci. Biotech. Biochem., 56 (12), 2081-2082) štěpení racemátu kyseliny (RS)-pipekolinové pomocí R-aminokyselinové oxydasy. Přitom se specificky oxiduje R-izomer na kyselinu 'piperidein-2-karboxylovou, přičemž vznikne kyselina S-pipekolinová. Po chemické redukci

- 1 CZ 282337 B6 kyseliny '-piperidein-2-karboxylové na kyselinu (RS)-pipekolinovou vznikne pak vlivem Raminokvselinové oxidasy opět kyselina S-pipekolinová. Přitom stále více ubývá kyseliny Rpipekolinové. Analogický způsob přípravy S-prolinu je popsán v J. Ferm. Bioeng., 74, 189-190, 1992. Oba tyto způsoby jsou však nevýhodné v tom, že nejsou schůdné pro velkovýrobu. Dalším nedostatkem je, že se musí použít čištěná R-aminokyselinová oxidasa.

Dále je známo, že racemické estery kyseliny pipekolinové za působení lipasy z Aspergillus niger se přeměňují na kyselinu S-pipekolinovou a estery kyseliny R-pipekolinové (Ng-Youn-Chen a spol., 1994, ibid). Tento způsob má však ten nedostatek, že se kyselina S-pipekolinová získá s enantiomemí čistotou ee=93 %.

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vy nálezu je poskytnout jednoduchý a technicky schůdný biotechnologický způsob výroby cyklických S-a-aminokarboxylových kyselin, které se mohou izolovat s dobrou enantiomemí čistotou.

Tento úkol se řeší pomocí mikroorganismů podle nároku 1 a způsobem podle nároku 3.

Mikroorganismy podle vynálezu se mohou izolovat ze vzorků půdy, kalu nebo odpadní vody za pomoci obvyklých mikrobiologických postupů. Podle vynálezu se izolace těchto mikroorganismů uskuteční tak, že se

a) obvyklým způsobem pěstují v médiu s amidem cc-aminokarboxylové kyseliny (vzorec I) ve formě racemátu nebo jeho opticky aktivních izomerů jako jediným zdrojem dusíku a s vhodným zdrojem uhlíku

b)

b) z kultury získané pěstováním se pak izolují takové, které jsou stabilní a jsou schopné přeměnit amid (RS)-a-aminokarboxylové kyseliny (vzorec I) na S-a-aminokarboxylovou kyselinu (vzorec II).

K tomu se mohou použít všechny mikroorganismy, které specificky obsahují tyto Saminokyselinové amidasy. Účelně se podrobí selekci ty mikroorganismy, které zužitkují piperazinkarboxamid nebo pipekolinamid ve formě racemátu nebo opticky aktivních izomerů jako jediný zdroj dusíku. Výhodně se podrobí selekci ty mikroorganismy, které zužitkují piperazinkarboxamid nebo pipekolinamid jako jediný zdroj dusíku.

Jako zdroj uhlíku mohou mikroorganismy užít například cukry, alkoholické cukry, karboxylové kyseliny nebo alkoholy jako růstový substrát. Jako cukry se mohou použít hexosy jako například glukosa nebo pentosy. Jako karboxylové kyseliny se mohou použít dikarboxylové kyseliny nebo trikarboxylové kyseliny, popřípadě jejich soli, jako například kyselina citrónová nebo sukcinát. Jako alkohol se může použít trojmocný alkohol, jako například glycerin. Výhodně se jako zdroj používá uhlíku trojmocný alkohol jako glycerin.

Jako selekční a růstová média se mohou použít běžná média používaná v oboru, jako například médium obsahující minerální soli podle Kulla a spol., (Arch. MicrobioL, 135, 1-7, 1983) nebo médium popsané v tabulce 1. Výhodně se používá médium popsané v tabulce 1.

Během pěstování a selekce se účelně indukují účinné enzymy mikroorganismu. Jako enzymový induktor se může například použít piperazinkarboxamid, pipekolinamid nebo acetamid.

Účelně se pěstování a selekce uskutečňuje při teplotě od 15 do 50 °C, výhodně od 20 do 45 °C

-2CZ 282337 B6 a při hodnotě pH mezi pH 5 a pH 10, výhodně mezi pH 6 a pH 9.

Výhodné mikroorganismy se specifickou aktivitou S-aminokyselinové amidasy jsou mikroorganismy zužitkující pipekolinamid rodu Pseudomonas, zejména druhu Pseudomonas putida s označením DSM 9923 nebo druhu Pseudomonas fluorescens s označením DSM 9924, jakož i jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty. Tyto mikroorganismy byly uloženy 20.04.1995 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, podle Budapešťské úmluvy.

Pod pojmem funkčně ekvivalentní varianty a mutanty se rozumějí mikroorganismy, které mají v podstatě stejné vlastnosti a funkce jako původní mikroorganismy. Takové varianty a mutanty mohou náhodně vzniknout, například UV-ozářením.

Způsob přípravy S-ct-aminokarboxylových kyselin obecného vzorce II

(Π) ve kterém A má jmenovaný význam, a/nebo amidů R-a-aminokarboxylových kyselin obecného vzorce III

(III) ve kterém A má jmenovaný význam, spočívá podle vynálezu v tom, že se v amidu (RS)-aaminokarboxylové kyseliny obecného vzorce I

A

(I) ve kterém A má jmenovaný význam, amid S-a-aminokarboxylové kyseliny přemění pomocí specifických již popsaných mikroorganismů nebo pomocí bezbuněčných enzymů z těchto mikroorganismů na S-a-aminokarboxylovou kyselinu a ta se izoluje, přičemž při biotransformaci vedle S-a-aminokarboxylové kyseliny vzniká amid R-a-aminokarboxylové kyseliny, který se případně izoluje.

Edukty, amidy (RS)-a-aminokarboxylových kyselin obecného vzorce I

O (I) ve kterém A spolu s -NH- a -CH- znamená pětičlenný nebo šestičlenný nasycený heterocyklický kruh, popřípadě substituovaný, ve kterém je heteroatom vybrán z kyslíku, dusíku nebo síry, mohou být získány z odpovídajících aromatických amidů v oboru obvyklou hydrogenací.

Jako amidy aminokarboxylových kyselin vzorce I s pětičlenným nasyceným heterocyklickým kruhem se mohou použít popřípadě substituovaný prolinamid, pyrazolidinkarboxamid, imidazolidinkarboxamid, oxazolidinkarboxamid, isoxazolidinkarboxamid, thiazolidinkarboxamid nebo triazolidinkarboxamid. Jako substituovaný prolinamid se může například použít indolinamid.

Jako amidy aminokarboxylových kyselin vzorce I se šestičlenným nasyceným heterocyklickým kruhem se mohou použít piperazinkarboxamid, pipekolinamid, morfolinkarboxamid, perhydrochinolinkarboxamid (chinolinankarboxamid), perhydroisochinolinkarboxamid (isochinolinankarboxamid), perhydrochinoxalinkarboxamid (chinoxalinankarboxamid), které jsou rovněž popřípadě substituované. Zástupci amidů aminokarboxylových kyselin se substituovaným šestičlenným nasyceným heterocyklickým kruhem mohou být Ci-C₄-alkyl-substituované jako například 4-methylpipekolinamid, H₂N-CH₂-substituované jako například 4-aminomethylpipekolinamid nebo CN-substituované jako například 4-kyanpipekolinamid. Výhodně se používá piperazinkarboxamid, pipekolinamid nebo 4-methylpipekolinamid.

Enzymy pro bezbuněčný systém lze získat v oboru běžným způsobem rozbitím mikroorganismů. Například lze pro tento postup použít ultrazvuk, Frenchovo tlakové zařízení nebo metodu s lysozymy. Tyto bezbuněčné enzymy se mohou také imobilizovat na vhodném nosiči.

Pro způsob jsou zvláště vhodné výše popsané specifické mikroorganismy druhu Pseudomonas putida DSM 9923 a druhu Pseudomonas fluorescens DSM 9924, jakož i jejich bezbuněčné enzymy. Stejně vhodné jsou funkčně ekvivalentní varianty a mutanty popsaných mikroorganismů.

Biotransformace se může provádět po obvyklém napěstování mikroorganismů s buňkami v klidu (nerostoucí buňky, které již nepotřebují žádný zdroj uhlíku a energie) nebo s rostoucími buňkami.

Jako média pro postup s buňkami v klidu mohou sloužit v oboru běžná média, jako například předtím popsané médium s minerálními solemi podle Kulla a spol., 1983 (ibid), nízkomolekulámí fosfátové pufry, HEPPES-pufr, nebo médium popsané v tabulce 1. Pro postup s rostoucími buňkami se obvykle používá médium, které obsahuje zdroj uhlíku a dusíku, jako například komerčně běžná média nebo médium podle tabulky 1. Výhodně se při postupu použije médium podle tabulky 1.

Účelně se biotransformace provádí za jednorázového nebo kontinuálního přidávání amidu (RS)α-aminokarboxylové kyseliny tak, že koncentrace amidu (RS)-a-aminokarboxylové kyseliny nepřesáhne 20 % hmotnostních, výhodně 10 % hmotnostních.

-4CZ 282337 B6

Hodnota pH média může být v rozmezí od pH 5 do pH 11, výhodně od pH 7 do pH 10.

Účelně se biotransformace provádí při teplotě od 25 do 65 °C, výhodně od 30 do 60 °C.

Po obvyklé reakční době od 1 do 100 h je amid S-a-aminokarboxylové kyseliny vzorce I úplně přeměněn na S-a-aminokarboxylovou kyselinu, přičemž vzniká také amid R-aaminokarboxylové kyseliny.

Tímto způsobem získané S-a-aminokarboxylová kyselina a/nebo amid R-a-aminokarboxylové kyseliny lze izolovat obvyklými postupy zpracování, jako například okyselením, chromatografii nebo extrakcí.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace mikroorganismů, které zužitkují pipekolinamid jako jediný zdroj dusíku

100 ml B-média, jehož složení je uvedeno v tabulce 1, bylo dáno do 300 ml Erlenmeyerových baněk a smícháno s ca. 2 g vzorků půdy. Baňky byly po 3 dny inkubovány v klidu při pokojové teplotě. Pak byly čerstvé baňky se stejným médiem smíchány s 2 ml z předchozích kultur a inkubovány v klidu po 4 dny při 30 °C. Tento obohacovací cyklus byl celkem 3 krát opakován, přičemž dva poslední kroky byly provedeny sterilně. Poslední krok byl ještě dodatečně proveden na třepačce při 140 otáčkách za minutu. Nakonec byly obohacené kultury rozetřeny na Bmédium s přidanými 16 g/1 agaru ke vzniku jednotlivých kolonií. Podrobeny selekci pak byly takové kolonie, jejichž vlastnost přeměňovat (RS)-pipekolinamid na kyselinu pipekolinovou, byla stabilní. K tomu byly kultury rozetřeny na živný agar (Nutrient Agar) a po několika dnech růstu byly z destiček se živným agarem rozetřeny na destičky s pipekiliamidem a glukosou. 2 kmeny, které měly požadovanou stabilní vlastnost, byly identifikovány po Gram-barvení a oxidasovém testu s 20 NE API proužky. Byly identifikovány 2 druhy Pseudomonas: Pseudomonas putida. DSM 9923 a Pseudomonas fluorescens, DSM 9924.

Tabulka l

B-médium:

Pro přípravu tohoto média bylo kdále popsanému minimálnímu médiu přidáno 1 gl'¹ (RS)pipekolinamidu a 4 gl'¹ glukosy.

Minimální médium:

Složeni

Koncentrace (mg/1) extrakt droždí

Na₂SO₄

Na₂HPO₄

KH₂PO₄NaCI

MgCl₂x6H₂O

CaCl₂x2H₂O

FeCl₃x6H₂O

500

100 2000 1000 3000

400

14,5

0,8

-5CZ 282337 B6

ZnSO₄x7H₂O	100x10'
MnCl₂x4H₂O	90x10'
H3BO3	300x10'
CoC1₂x6H₂O	200x10'
CuC1₂x2H₂O	10x10'
NíCI₂x6H₂O	20x10
Na₂MoO₄x2H₂O	30x10
EDTANa₂x2H₂O	5
FeSO₄x7H₂O	2

Příklad 2

Příprava kyseliny S-pipekolinové:

S kmeny izolovanými v příkladu 1 byly uskutečněny 1% pipekolinamidové biotransformace (koncentrace substrátu 1 %) v 0,1 M fosfátovém pufru při pH 7,0, při 30 °C a při 130 otáčkách za min. Biomasa z předkultur byla zahuštěna a přidána k 0,1 M fosfátovému pufru pH 7,0, aby se získala koncentrace biomasy OD650nm=10. Nasazené kultury byly inkubovány na třepačce při 30 °C, 130 otáčkách za min. a odebírány vzorky v různých časových bodech. Bezbuněčné supematanty byly testovány pomocí tenkovrstevné chromatografie (silikagel, vyvíjecí rozpouštědlo: 11 dílů ethanolu, 6 dílů CHCI3, 6 dílů NH4OH 25%) na obsah zbylého amidu a vytvořené kyseliny pipekolinové. Pak byly bezbuněčné supematanty testovány pomocí vysokotlakové kapalné chromatografie (HPLC; tvorba isothiokyanátových derivátů), aby se otestovala enantiomemí čistota vytvořené kyseliny pipekolinové. Výsledky ukázaly, Pseudomonas putida a Pseudomonas fluorescens produkují kyselinu S-pipekolinovou o optické čistotě nad 90 %. Optimální podmínky pro biotransformaci s Pseudomonas putida byly při pH 8,0 a teplotě 30 °C, pro Pseudomonas fluorescens pH 8,0 a 50 °C.

Jestliže se biotransformace uskutečnila s Pseudomonas putida, získala se kyselina Spipekolinová s ee-hodnotou 95,0 %;

jestliže se biotransformace uskutečnila s Pseudomonas fluorescens, získala se kyselina Spipekolinová s ee-hodnotou 97,3 %.

ee-hodnota znamená enantiomemí přebytek (enantiomeric excess).

Příklad 3

Příprava kyseliny S-piperazinkarboxylové

Se dvěma izolovanými kmeny, jak v příkladu 1 popsáno pro pipekolinamid, byla uskutečněna 1% piperazinkarboxamidová biotransformace při pH 7,0, při 30 °C a při 130 otáčkách za min. Bezbuněčné supematanty byly rovněž testovány na obsah zbylého piperazinkarboxamidu a vytvořené kyseliny piperazinkarboxylové pomocí tenkovrstevné chromatografie. HPLCanalýza umožnila testovat optickou čistotu vytvořené kyseliny piperazinkarboxylové. Jestliže by se biotransformace uskutečnila s Pseudomonas putida, získala se kyselina Spiperazinkarboxylová s ee-hodnotou 73,9 %; jestliže by se biotransformace uskutečnila s Pseudomonas fluorescens, získala se kyselina S-piperazinkarboxylová s ee-hodnotou 59,5 %.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Mikroorganismy, druhu Pseudomonas putida DSM 9923 nebo druhu Pseudomonas fluorescens DSM 9924, které jsou schopné zužitkovat amidy cc-aminokarboxylových kyselin, ve formě racemátu nebo jeho opticky aktivních isomerů, obecného vzorce I (I) kde A spolu s -NH a -CH znamená nesubstituovaný nebo substituovaný pětičlenný nebo šestičlenný nasycený heterocyklický kruh, ve kterém je heteroatom vybrán z kyslíku, dusíku nebo síry, jako jediný zdroj dusíku a převést amidy (RS)-a-aminokarboxylových kyselin shora definovaného vzorce I na kyselinu S-a-aminokarboxylovou obecného vzorce II (Π) kde A má uvedený význam.
2. Mikroorganismy podle nároku 1, které jsou schopné zužitkovat pipekolinamid nebo piperazinkarboxamid ve formě racemátu nebo jeho opticky aktivních isomerů jako jediný zdroj dusíku.
3. Způsob mikrobiologické výroby kyselin S-a-aminokarboxylových obecného vzorce II

A (Π) kde A má uvedený význam a/nebo amidů R-a-aminokarboxylových kyselin obecného vzorce III (III) kde A má uvedený význam, vyznačující se tím, že se v amidu (R,S)-aaminokarboxylové kyseliny obecného vzorce I

NH (I) kde A má uvedený význam, převede amid S-a-aminokarboxylové kyseliny pomocí mikroorganismů rodu Pseudomonas nebo pomocí bezbuněčných enzymů z těchto mikroorganismů na kyselinu S-a-aminokarboxylovou a izoluje se, přičemž při biotransformaci vznikne vedle kyseliny S-a-aminokarboxylové amid kyseliny R-a-aminokarboxylové, který se popřípadě izoluje.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se biotransformace provádí pomocí mikroorganismů druhu Pseudomonas putida DSM 9923 nebo druhu Pseudomonas fluorescens DSM 9924 nebo s jejich funkčně ekvivalentními variantami a mutanty nebo s bezbuněčnými enzymy z těchto mikroorganismů.
5. Způsob podle nároků 3 nebo 4, vyznačující se tím, že se jako amid (R,S)-aaminokarboxylové kyseliny použije (R,S)-pipekolinamid, (R,S)-piperazinkarboxamid, (R,S)-4methylpipekolinamid nebo (R,S)-prolinamid.
6. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 3až5, vyznačující se tím, že se biotransformace provádí za jednorázového nebo kontinuálního přidání amidu (R,S)-aaminokarboxylové kyseliny tak, aby koncentrace amidu (R,S)-a-aminokarboxylové kyseliny v kultivačním médiu nepřesáhla 20 % hmotnostních.
7. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 3až6, vyznačující se tím, že se biotransformace provádí při hodnotě pH od 7 do 10 a při teplotě od 30 do 60 °C.