CZ3599A3 - Mikroorganismy a způsob výroby derivátů D-prolinu - Google Patents
Mikroorganismy a způsob výroby derivátů D-prolinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ3599A3 CZ3599A3 CZ9935A CZ3599A CZ3599A3 CZ 3599 A3 CZ3599 A3 CZ 3599A3 CZ 9935 A CZ9935 A CZ 9935A CZ 3599 A CZ3599 A CZ 3599A CZ 3599 A3 CZ3599 A3 CZ 3599A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- microorganisms
- dsm
- der
- formula
- acid
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 45
- ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N D-Proline Chemical class OC(=O)[C@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N 0.000 title description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 125000000180 D-prolyl group Chemical class N1[C@@H](C(=O)*)CCC1 0.000 claims abstract description 7
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 14
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 12
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 12
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 claims description 10
- 241000186073 Arthrobacter sp. Species 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 claims description 6
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 claims description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 5
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 claims description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ZHVPKJSXMPRWLG-UHFFFAOYSA-N 2-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical class CCCC(C(O)=O)N=C(N)N ZHVPKJSXMPRWLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 2
- 150000008535 L-arginines Chemical class 0.000 claims 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical class O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 abstract description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- MOSSGQWHFMZGTB-UHFFFAOYSA-N NC(N)=N.CCCCC(O)=O Chemical class NC(N)=N.CCCCC(O)=O MOSSGQWHFMZGTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229930182820 D-proline Natural products 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 15
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 14
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N Arginine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 6
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 6
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 6
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N benzyl chloroformate Chemical compound ClC(=O)OCC1=CC=CC=C1 HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- ZPMVNZLARAEGHB-UHFFFAOYSA-N cyproheptadine hydrochloride (anhydrous) Chemical compound Cl.C1CN(C)CCC1=C1C2=CC=CC=C2C=CC2=CC=CC=C21 ZPMVNZLARAEGHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DXTIKTAIYCJTII-UHFFFAOYSA-N guanidine acetate Chemical compound CC([O-])=O.NC([NH3+])=N DXTIKTAIYCJTII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 2
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N Agmatine Natural products NCCCCNC(N)=N QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Chemical compound OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-P agmatinium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCCC[NH3+] QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 2
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N d-xylitol Chemical compound OC[C@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N 0.000 description 2
- 239000012954 diazonium Substances 0.000 description 2
- 150000001989 diazonium salts Chemical class 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXBWRDAJHMWERI-UHFFFAOYSA-N 2-(4-aminobutylamino)-3,7-dihydropurin-6-one Chemical compound N1C(NCCCCN)=NC(=O)C2=C1N=CN2 TXBWRDAJHMWERI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PVHFNSMJNXJUNM-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCCC(Cl)C(O)=O PVHFNSMJNXJUNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N Arginine hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical class Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 101150026476 PAO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241001240958 Pseudomonas aeruginosa PAO1 Species 0.000 description 1
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- AZFNGPAYDKGCRB-XCPIVNJJSA-M [(1s,2s)-2-amino-1,2-diphenylethyl]-(4-methylphenyl)sulfonylazanide;chlororuthenium(1+);1-methyl-4-propan-2-ylbenzene Chemical compound [Ru+]Cl.CC(C)C1=CC=C(C)C=C1.C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)[N-][C@@H](C=1C=CC=CC=1)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 AZFNGPAYDKGCRB-XCPIVNJJSA-M 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N benzopyrrole Natural products C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 1
- 238000006193 diazotization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 101150089730 gly-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000004304 potassium nitrite Substances 0.000 description 1
- 235000010289 potassium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pyrrole Compounds (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká nového enzymu s amidinohydrolasovou aktivitou, nových mikroorganismů, které tuto amidinohydrolasu obsahuji, jakož i nového způsobu výroby derivátů D-prolinu za použiti mikroorganismů, popř. amidinohydrolas.
Dopsavadní stav techniky
Deriváty D-prolinu jsou důležité meziprodukty pro výrobu farmaceutických látek (J.Org.Chern., 1994, 59, 7496-7498).
Je známo více postupů pro výrobu D-prolinu.
JP-A 92183399 popisuje způsob výroby D-prolinu z (DL)-prolinu pomoci mikroorganismů rodu Candida nebo Trichospora. Nedostatkem tohoto postupu je dlouhá doba přeměny a malý výtěžek D-prolinu. JP-A 07127354 popisuje způsob výroby D-prolinu z ornitinu pomoci mikroorganismů druhu Próteus mitajiri. Nevýhodou při tomto postupu je to, že jednak je edukt ornitin příliš drahý a jednak že se D-prolin získá ve špatném výtěžku.
Dále popisuje JP-A 07289275 způsob výroby D-prolinu z L-prolinu. Přitom se L-prolin pomocí mikroorganismů rodu Escherichia, které mají racemásovou aktivitu, racemizuje na (DL)-prolin, který se se pak kultivuje s mikroorganismy odbourávajícími L-prolin. Tím se získá D-prolin. Nevýhodou tohoto postupu je to, že získaný D-prolin se musí dále čistit a to je spojeno s velkými ztrátami na výtěžku.
Úkolem předloženého vynálezu je poskytnout amidinohydrolasu, popř. mikroorganismy, které tento enzym obsahují, které se použijí pro cenově výhodný způsob výroby derivátů D-prolinu a D-prolin se získá v dobrém výtěžku.
• ·
Podstata vynálezu
Tento úkol se řeší pomocí mikroorganismů podle nároku 1, pomocí amidinohydrolasy podle nároku 4, jakož i způsobem podle nároku 5
Mikroorganismy podle vynálezu se mohou izolovat ze vzorků půdy, kalu nebo odpadních vod za pomocí obvyklých mikrobiologických metod. Izolace mikroorganismů se podle vynálezu provádí tak, že se tyto pěstují v mediu, které obsahuje derivát kyseliny guanidinovalerové (guanidinovalerianové) obecného vzorce V
Ί . 9 kde R znamená atom vodíku nebo hydroxyskupmu a R znamená atom halogenu nebo -NH2, jako jediný zdroj dusíku se vhodným zdrojem uhlíku obvyklým způsobem.
Jako deriváty kyseliny guanidinovalerové obecného vzorce V jsou např. vhodné: kyselina L-a-chlor-S-guanidinovalerová, D-a-chlor-S-guanidinovalerová, (DL)-α-chlor-S-guanidinovalerová, L-a-brom-S-guanidinovalerová, D-a-brom-S-guanidinovalerová, ( DL) -a-brom-S-guanidinovalerová , L-a-chlor-T-hydroxy-S-guanidinvalerová, D-a-brom-T-hydroxy-S-guanidinovalerová, L-, Dnebo (DL)-arginin.
Z kultury získané pěstováním se pak účelně podrobí selekci ty mikroorganismy, které zužitkují kyselinu L-a-chlor-S-guanidinvalerovou (R1 = H, R2 = Cl) nebo L-arginin (R1 = H, R2 = NH2) jako jediný zdroj dusíku.
Jako vhodný zdroj uhlíku mohou mikroorganismy užít například cukry, cukerné alkoholy nebo dikarboxylové kyseliny jako růstový substrát.
Jako cukry se mohou použít hexosy jako je glukosa. Jako cukerné alkoholy se může například použít glycerin. Jako dikarboxylová • ·
kyselina se uhlíku může glutamin nebo muže použít např. sukcinat. Dále se jako zdroj použít arginin, agmatin kyselina glutaminová.
(4-aminobutylguanin),
Jako selekční a růstová media používaná media, jako například Výhodně se používá medium popsané se mohou medium v tabulce použít v popsané v
1.
oboru běžně tabulce 1.
Během pěstování a selekce se účelně indukují účinné enzymy mikroorganismů. Jako induktor enzymů se může použít například kyselina a-chlor-S-guanidinovalerová, L-arginin, guanidin, guanidinhydrochlorid nebo guanidinacetat. Indukce účinných enzymů se může také uskutečnit v plném mediu jako např. Nutrient Yeast Broth (NYB), jestliže se v tom vyskytuje jeden z induktorů.
Obvykle se pěstování a selekce provádí při teplotě od 20 do 40 °C, výhodně od 25 do 40 °C a při hodnotě pH mezi pH 5 a pH 9,5, výhodně mezi pH 8 a pH 9,5.
Výhodně se jako mikroorganismy zužitkující kyselinu a-chlor-S-guanidinovalerovou isolují rodu Pseudomonas, Arthrobacter, Agrobacterium nebo Klebsiella, zejména mikroorganismy druhu Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas cepacia, Klebsiella pneumoníae DSM 10593, Pseudomonas aeruginosa DSM 10581 nebo Arthrobacter sp. DSM 10582, jakož i jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty. Kmeny Klebsiella pneumoníae, Arthrobacter sp. a Pseudomonas aeruginosa byly uloženy 11.03.1996 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig podle Budapeštské smlouvy.
Pod pojmem funkčně ekvivalentní varianty a mutanty se rozumějí mikroorganismy, které mají v podstatě stejné vlastnosti a funkce jako původní mikroorganismy. Takové varianty a mutanty mohou vzniknout náhodně, např. UV-zářením nebo mutagenními chemikáliemi .
• · • « • ·
| • · · ···· · · · · • · · · · · · · · ·· · • ·· ··· · · · · · · ·· · ······· · · ·· ·· ·· ··· ·· ·· | |||
| - 4 - | |||
| Taxonomický popis Klebsiella | pneumoniae (DSM 10593) | ||
| buněčná forma tyčinky | ADH | - | |
| šířka μιη 1 | ,0-1,2 | LDC | - |
| délka μπι 1 | ,2-2,0 | ODC | - |
| pohyblivost | - | VP | + |
| Gram-reakce | - | indol | - |
| lyže 3 %ním KOH | + | tvorba í^S | - |
| aminopeptidáza (Cerny) | + | Simmonův citrát | + |
| spory | - | ureáza | + |
| oxidasa | - | methylová červěň | - |
| katalasa | + | hydrolýza | |
| růst anaerobně | + | želatiny | - |
| plyn z glukosy | + | DNA | - |
| kyselina z (ASS) glukosy | + | Tweenu 80 | |
| fruktosy | + | ||
| xylosy | + | Zkratky: | |
| erythritu | - | ASS: kyselina acetyl- | |
| adonitu | - | salicylová | |
| D-mannosy | + | ONPG:o-nitro-fenyl- | |
| L-rhamnosy | + | galaktosidasa | |
| inositu | + | ADH: alkoholdehydro | — |
| a-methyl-D-dlukosidu | + | genasa | |
| cellobiosy | + | LDC: laktatdekarboxy- | |
| maltosy | + | lasa | |
| laktosy | + | ODC: ornitindekarboxy- | |
| D-arabitolu | + | lasa | |
| ONPG | VP: Voges Proskauer |
Taxonomický popis Arthrobacter sp. (DSM 10582) charakteristika: Gram-positivní, koryneformní tyčinky, ve starších kulturách kockoidní; striktně aerobní žádná tvorba kyseliny nebo plynu z glukosy • · pohyblivost spory katalasa + kyselina meso-diaminopimelinová v buněčné stěně: ne peptidoglykanový typ: nb
Amidinohydrolasa podle vynálezu se získá ze shora uvedených mikroorganismů a je schopná odštěpit močovinu z derivátů kyseliny guanidinovalerové, vybraných ze sloučenin obecného vzorce V.
Účelně se Klebsiella, zejména z Pseudomonas Arthrobacter amidinohydrolasa získá z mikroorganismů rodu
Pseudomonas, Agrobacterium nebo Arthrobacter, mikroorganismů druhu Agrobacterium radiobacter, cepacia, Klebsiella pneumoniae DSM 10593, sp. DSM 10582 nebo Pseudomonas aeruginosa DSM 10581
Tyto mikroorganismy se obvyklým způsobem pěstují (kultivují) ve vodném živném mediu, které obsahuje zdroj uhlíku, zdroj dusíku, minerální soli a zdroj vitaminů, aby se získala amidinohydrolasa podle vynálezu. Účelně se mikroorganismy kultivují při teplotě od 20 do 40 °C a při hodnotě pH od 5 do 8. Amidinohydrolasy se pak mohou po rozbití (otevření) buněk mikroorganismů, např. ultrazvukem, metodou French-Press nebo pomocí lysozymů, izolovat známými postupy pro čištění enzymů.
Účelně má amidinohydrolasa následující vlastnosti:
a) pH-optimum o hodnotě pH 8,5±1,
b) teplotní optimum ca. 37 °C při pH mezi 7 a 8,
c) hodnota KM pro substrát kyselinu L-a-chlor-S-guanidinovalerovou 85,2 mM±5 (100 mM fosfátový pufr, 37 °C), dále vlastnosti, kdy
d) se indukuje kyselinou L-a-chlor-S-guanidinovalerovou, L• ·
-argininem, guanidinohydrochloridem, guanidinem a/nebo guanidinacetatem,
e) je brzděna kyselinou L-ot-chlor-ó-guanidinovalerovou a
f) hydrolyzuje substráty arginin, kyselinu L-a-chlor-S-guanidinovalerovou a kyselinu L-ct-brom-S-guanidinovalerovou na odpovídající derivát kyseliny L-aminovalerové.
Při výrobě derivátů D-prolinu stupni postupu převede derivát vzorce II podle vynálezu L-argininu nebo se účelně v prvním jeho sůl obecného
H2N
R NH,
NH
NH r
OH (II)
Ί o kde R má uvedený význam, známým způsobem na derivát kyseliny L-guanidinovalerové nebo její sůl obecného vzorce III
H,N
(III) kde R1 má uvedený význam a R3 znamená atom halogenu. Přitom se vytvoří odpovídající diazoniová sůl jako meziprodukt.
Jako derivát L-argininu se může použít L-arginin nebo L-T-hydroxy arginin.
Jako soli derivátu L-argininu a derivátu kyseliny L-guanidinovalerové se mohou použít jejich hydrochloridy nebo hydrobromidy.
Obvykle se diazotace v prvním stupni provádí roztokem nitritu nebo kyselinou dusičnou. Jako roztok nitritu se může použít roztok natriumnitritu nebo kaliumnitritu. Výhodně se používá kyselina dusičná, zejména 50 až 65 % kyselina dusičná.
• · · ·
Přeměna v prvním stupni se obvykle provádí v přítomnosti kyseliny halogenvodíkové. Jako kyselina halogenvodíková se může použít kyselina chlorovodíková nebo kyselina bromovodíková, výhodně se používá kyselina chlorovodíková.
Účelně se reakce provádí v prvním stupni při teplotě od -10 do 100 °C, výhodně od 0 do 80 °C.
Ve druhém stupni způsobu podle vynálezu se derivát kyseliny Lguanidinovalerové (vzorec III) hydrolyzuje pomocí amidinohydrolasy podle nároku 4, pomocí mikroorganismů podle nároku 1 a/nebo jejich enzymových extraktů za vzniku derivátu kyseliny L-aminovalerové obecného vzorce IV
Ί 3 kde R a R mají uvedený význam.
V zásadě je mikrobiologická hydrolýza uskutečnitelná jak s již popsanými amidinohydrolasami, tak také s již popsanými mikroorganismy a enzymovými extrakty. Pro hydrolýzu jsou obvzláště vhodné dříve popsané mikroorganismy rodu Pseudomonas, Arthrobacter, Agrobacterium nebo Klebsiella, zejména mikroorganismy druhu Klebsiella pneumoniae DSM 10593, Pseudomonas aeruginosa DSM 10581, Arthrobacter sp. DSM 10582, Agrobacterium radiobacter nebo Pseudomonas cepacia, jakož i jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.
Mikrobiologická hydrolýza se může provádět po obvyklém pěstování mikroorganismů s buňkami v klidu (nerostoucí buňky, které již nepotřebují žádný zdroj uhlíku a energie) nebo s rostoucími buňkami. Výhodně se hydrolýza provádí s buňkami v klidu.
Pro mikrobiologickou hydrolýzu se mohou použít v oboru běžná • ·
- 8 media, jako například nízkomolární fosfátový pufr nebo Hepes-pufr, plná media jako např. Nutrient Yeast Broth (NYB) nebo medium popsané v tabulce 3. Výhodně se hydrolýza provádí bud' s nízkomolárním fosfátovým pufrem nebo s Hepes-pufrem.
Účelně se hydrolýza provádí při jednorázovém nebo kontinuálním přidávání derivátu kyseliny L-guanidinovalerové tak, aby koncentrace nepřesáhla 20 % hmotn., výhodně 1 % hmotn.
Ve třetím stupni se derivát kyseliny L-aminovalerové (obecného vzorce IV) cyklizuje na konečný produkt obecného vzorce I
OH (I)
Ί kde R má uvedený význam.
Účelně se volí rozsah pH media tak, že se druhý stupeň a třetí stupeň provádí bez izolace derivátu kyseliny L-aminovalerové (vzorec IV). Při tomto výhodném provedeni se upraví hodnota pH media na pH 5 až pH 13, výhodně na pH 7 až pH 9,5. V tomto rozmezí probíhá cyklizace derivátu kyseliny L-aminovalerové (vzorec IV) na D-prolin spontánně. Účelně se cyklizace a hydrolýza uskutečňuje při teplotě 10 až 60 °C, výhodně od 30 do 40 °C.
V podstatě se může uskutečnit výroba derivátů D-prolinu vzorce I také tak, že se derivát L-argininu vzorce II nebo jeho soli hydrolyzují přímo pomocí shora popsaných mikroorganismů, enzymových extraktů nebo amidinohydrolas na sloučeniny vzorce VI
R1 R4
OH
9 9 9 9 99 9 9 9 9
9 9 99 9 9 · · · · · • ·· ··· · · · ······
9 9 9 9 9 9 · · •· ·· ·· ··· ·· ··
- 9 kde R4má uvedený význam a R4 znamená -NH2. Tyto sloučeniny se pak převedou jak shora popsáno přes mezistupeň diazoniové soli za vzniku derivátu kyseliny L-aminovalerové vzorce IV a ten se cyklizuje na požadované deriváty prolinu. Avšak tento způsob je méně výhodný.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace mikroorganismů Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas cepacia, Agrobacterium radiobacter a Arthrobacter sp.
Vzorky půdy ze zahradního kompostu nebo z čističky LONZA (Visp) se za třepání inkubovaly v následujícím minimálním mediu při 37 °C.
Jako zdroj uhlíku se použila glukosa nebo glycerin v koncentraci 1-20 g/l.
Jako zdroj dusíku a/nebo induktory se použily sloučeniny L-arginin, močovina, (NH4)2SO4, kyselina L-a-chlor-S-guanidinovalerová v koncentraci 0,25-20 mM. Přidal se extrakt kvasnic v koncentraci 0,1-1 g/l jako suplement.
Tabulka 1
A) kapalné medium
MgCl2x6H2O
CaCl2x2H20
FeCl3x6H2O
Na2SO4
Na2HPO4 kh2po4
NaCl roztok vitaminů roztok stopových prvků pH 6,8-8,0
0,4 g/l 0,014 g/l 2,8 mg/1 0,1 g/l 2 g/i g/i g/l 1 ml/1 1 ml/1
B) pevná media
K A) se přidá 20 g/1 agaru.
Mikroorganismy rostly po inkubačni dobu 2-30 dní na odpovídajích mediích.
l-3krát se přeočkovaly na čerstvá media a rozjednotily na pevná media.
Buněčné suspenze izolovaných mikroorgansimů se testovaly na aktivitu (srovnej příklad 3). Byly izolovány následující mikroorganismy: Klebsiella pneumoniae (DSM 10593), Arthrobacter sp. (DSM 10582), Pseudomonas cepacia a Agrobacterium radiobacter
Příklad 2
Selekce spontánních mutantů
Divoký typ Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PAO1 (Holloway, B.W., Bacteriol.Rev.,1959,33,419-443) se inkuboval na pevném nebo kapalném mediu jak je popsáno v příkladu 1 s kyselinou L-a-chlor-S-guanidinovalerovou jako jediným zdrojem dusíku a glycerinem nebo glukosou jako zdrojem uhlíku po dobu 1-30 dnů při 37 °C. Po této době rostlo na pevných mediích 11 stejných, kolonie se znovu rozetřely kapalném minimálním mediu, testovaly na odpovídající lehce nahnědlých kolonií. Jednotlivé a pak se pěstovaly na odpovídajícím Buněčné suspenze takových buněk se enzymovou aktivitu. Takto se izoloval Pseudomonas aeruginosa (DSM 10581), který požadovaným způsobem exprimoval hydrolasu. Podle Phagen-typing a identifikace kmenu API-testem (20 NE bio Merieux SA, France) byl kmen ještě identický s divokým kmenem Pseudomonas aeruginosa PAO1, v podstatě se lišil od divokého typu ve své schopnosti exprimovat amidinohydrolasu kyseliny L-a-chlor-S-guanidinovalerové.
Příklad 3
Indukce a biotransformace s buňkami v klidu s bakteriálními kmeny Klebsiella pneumoniae DSM 10593 a Pseudomonas aeruginosa
- 11 ··
I · · · » · · · ·· · ··«
DSM 10581
Isolované mikroorgansimy popsané v příkladu 1 a 2 se pěstovaly na 100 ml kapalného media A) s glycerinem nebo glukosou jako zdrojem uhlíku a kyselinou L-ot-chlor-S-guanidinovalerovou jako induktorem a zdrojem dusíku při teplotě 37 °C. Po dasažení stacionární růstové fáze (OD650 0,8-1,5) se buňky sklízely centrifugací a 10-20krát koncentrované se daly do biotransformačního roztoku. Biotransformační roztok měl následující složení: 10-100 mM fosfátový pufr nebo Hepes-pufr, 10-150 mM kyselina α-chlor-S-guanidinovalerová, pH 6,8-11). Biotransformace se prováděla při 37 °C za mírného třepání.
v časových intervalech a analyzovaly chromatografie nebo pomocí HPLC.
Kyselina L-a-chlor-6-guanidinovalerová se přitom kvantitativně převedla na D-prolin v časovém rozpětí 5-24 hod. v závislosti na koncentraci, přičemž ee-hodnota D-prolinu byla nad 96 % (podle HPLC).
Vzorky se odebíraly pomocí tenkovrstevné
Příklad 4
Indukce a biotransformace s bakteriálním kmenem Arthrobacter sp. DSM 10582
Pěstování na následujících mediích umožnila indukci amidinohydrolasy: NYB (Difco); NYB a 1-10 mM kyselina L-a-chlor-S-guanidinovalerová; medium (A) s glycerinem 25 mM a L-argininem 1-10 mM jako zdrojem dusíku. Buňky se pěstovaly přes 24 hod. při 37 °C ve 100 ml media. Buňky se sklidily jak je uvedeno v příkladu 3 a použily se pro biotransformaci. Po promytí buněk se provedla biotransformace ve fosfátovém nebo Hepes pufru 10-200 mM (pH 5-10). Kyselina L-ct-chlor-8-guanidinovalerová se přitom kvantitativně převedla na D-prolin v časovém rozpětí 5-24 hod. v závislosti na koncentraci, přičemž ee-hodnota D-prolinu byla nad 96 % (podle HPLC).
• 9 • · • 9 99 · 9 • 9 9
999 999
- 12 Příklad 5
Indukce a biotransformace s Pseudomonas aeruginosa DSM 10581
Kmen se pěstoval ve 100 ml Erlenmeyerové baňce s retardérem (se šikanou) při 37 °C za třepání na následujících mediích: minimální medium (A) s přísadami popsanými v následující tabulce 2, jakož i NYB-plné medium obsahující Trypton 10 g/1, masový extrakt 5 g/1, NaCl 5 g/1)· Buňky byly pro biotransformaci připraveny jak je popsáno v příkladě 3.
Tabulka 2
| Zdroj C | Zdroj N | Induktor | extrakt | OD650 | biotransfor- |
| kvasnic | mační poměr | ||||
| mM | mM | mM | g/i | 24 hod | % |
| gluk 20 | - | Cl-arg 2 | 0,2 | - | 25 |
| gluk 20 | arg 1 | Cl-arg 4 | 1,7 | 100 | |
| gluk 20 | arg 1 | Cl-arg 3 | 0,2 | - | 25 |
| gluk 20 | nh4 + 1 | Cl-arg 2 | 0,2 | - | 25 |
| gluk 20 | nh4 + 1 | Cl-arg 4 | 0,2 | - | 25 |
| gluk 20 | arg 2 | Cl-arg 2 | 0,1 | 1,6 | 30 |
| gluk 20 | ornit 1 | Cl-arg 1 | 0,1 | 1 | 10 |
| gluk 20 | citrull | Cl-arg 1 | 0,1 | 0,9 | 6 |
| gly 20 | arg 2 | Cl-arg 2 | 0,1 | 1 | 30 |
| gly 20 | ornit 1 | Cl-arg 1 | 0,1 | 0,9 | 20 |
| gly 20 | citrull | Cl-arg 1 | 0,1 | 0,75 | 30 |
| gly 10 | arg 10 | Cl-argO,5 | 0,1 | 30 | |
| gluk 20 | guanin5 | - | 0,4 | 23 | |
| gluk 20 | guanin5 | arginin 1 | 1,1 | 20 | |
| gluk 20 | guanidin acetat 5 | - | 0,5 | 20 |
• «· ·* • · · • · ··· • · · • * * ·· ·« *< · • · ·· • · · • · · · • · · ·· ··· • · • · · « · · • ··· ·· »* ··«
| Zdroj C mM | Zdroj N mM | Induktor mM | OD 24 hod | biotransformační poměr % |
| glu 10 | - | Cl-arg 5 | 0,6 | 10 |
| glu 20 | - | Cl-arg 5 | 0,8 | 30 |
| gluk 20 | glu 10 | Cl-arg 5 | 1,2 | 70 |
| gin 10 | - | Cl-arg 5 | 0,3 | 10 |
| gin 20 | - | Cl-arg 5 | 0,5 | 10 |
| gluk 10 | betain 10 | Cl-arg 5 | 1,2 | 70 |
| arg 10 | - | Cl-arg 5 | 0,5 | 70 |
| gluk 10 | arg 1 | Cl-arg 5 | 0,8 | 70 |
| agmatinlO | - | Cl-arg 5 | 0,2 | 20 |
gluk=glukosa, arg=arginin, gly=glycerin, glu=kys.glutaminová, gln=glutamin, Cl-arg=kys. L-a-chlor-8-guanidinovalerová, ornit= =ornitin, citrul=citrulin
Kyselina L-ot-chlor-8-guanidinovalerová se přitom převedla na D-prolin v časovém rozmezí 5-24 hodin podle koncentrace, přičemž byla ee-hodnota D-prolinu nad 96 % (podle HPLC). Takto vzniklo 13 g/1 D-prolinu (podle HPLC). Nejlepší výsledky se dosáhly ve jmenovaném mediu s přísadami gluk 20 mM, arg 1 mM a Cl-arg 4 mM (srovnej tabulku 2).
Příklad 6
Příprava kyseliny L-a-chlor-5-guanidinovalerová
100 g (0,475 mol) L-argininmonohydrochloridu se rozpustilo ve 150 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a zahřálo na 65 °C. Během 30 minut se přikapalo 75 ml 65 %ní HNOg, přidávání bylo od začátku doprovázeno mohutnou tvorbou plynu, po dalších 30 • ·
- 14 minutách při 65 °C byla tvorba plynu ukončena a čirý mírně nažloutlý reakční roztok se zahustil ve vakuu. Získaný zbytek se ještě dvakrát dal do 200 ml koncentrované HCl a zahustil do sucha ve vakuu. Získalo se 112,2 g mírně nažloutlé pevné látky. Pevná látka se rozpustila v 750 ml koncentrované HCl při 60 °C a ochlazením roztoku na 0 °C se krystalizovala. Sraženina se filtrovala, dvakrát promyla 100 ml chladnou 6N HCl a sušila ve vakuu. Získalo se 72,9 g bezbarvé krystalické pevné látky, což odpovídá 66,7 %nímu výtěžku.
teplota tavení 149 °C ctD 25(c=10 % v H2O)=-7,87° 1H-NMR v ppm (400 MHz, v D2O): 4,55(dd,1H,H-l); 3,25(t,2H,H-4); 2,15-1,95(br.m,2H);1,8-1,7(br.m,2H)
Obsah: 100,8 %
Příklad 7
a) Výroba D-prolinu ve 3,5 1 fermentoru
Buňky kmenu Pseudomonas aeruginosa (DSM 10581) se naočkovali mediem popsaným v tabulce 3 s 10 %ní předkulturou a pěstovaly se hod. až k hodnotě Οϋθθ0 13. Biomase se oddělila centrifugací, promyla v 10 mM Hepes pH 8,5 a v něm se resuspendovala. Biotransformace se uskutečnila v 11 Applikonfermentoru za kontrolování pH při konstantní hodnotě pH 8,5, při teplotě 37 °C, hustota buněk byla při OD600 10-20. Koncentrace kyseliny a-chlor-5-guanidinovalerové byla během biotransformace stále nad mM. Dohromady se přidalo 110 mM substrátu. Po 40 hod. se vytvořilo 106 mM D-prolinu s ee-hodnotou 98,3 % (podle HPLC) (Obr. 1).
Po 40 hod. se buňky oddělily centrifufací. Surový roztok se čistil přes Celíte 535; po vysrážení proteinů kyselinou perchlorovou a následné neutralizaci s KOH se biotransformační roztok ošetřil aktivním uhlím a filtroval přes Celíte 535. Produkt se zahustil do sucha.
• ·
- 15 b)
Výroba D-prolinu s bezbuněčným extraktem
Buňky kmenu Pseudomonas aeruginosa (DSM 10581) se rozbily pomocí Frenchova tlakové zařízení (3krát; 120 MPa). K 1 ml bezbuněčného extraktu se přidal 1 ml 50 mM kyseliny L-a-chlor-δ-guanidinovalerové ve 100 mM fosfátovém pufru (pH 7-8) a inkubovalo se při 37 °C. Pro srovnání se to celé provedlo i s celými buňkami. Odebíraly se vzorky a analyzovaly pomocí HPLC. Ukázalo se, že aktivita bezbuněčného extraktu byla více než dvojnásobná než aktivita odpovídajících nerozbitých buněk (Obr. 2) .
Tabulka 3
MgCl2x6H2O
CaCl2x6H20
FeO4x7H2O stopové prvky bez EDTA polypropylenglykol 2000 glukosa
Na2HPO4
KH2PO4
NaCl induktor:
zdroj dusíku:
g/1
0,16 g/1 mg/1 1 ml/1 ml g/1 (přívod glukosy až 30 g/1) g/1 g/i g/1 kys. ot-chlor-S-guanidinovalerová 10 mM (dokrmení) (NH4)2SO4, 3,1 g/1
c)
Přeměna D-prolinu na derivát D-Z-prolin
4,6 g shora izolovaného D-prolinu se rozpustilo ve 20 ml H2O. Za konstantního pH 11,5-12 (4N NaOH) se přikapal benzylester kyseliny chlormravenčí (Z-Cl). Dohromady se přikapalo 9,3 g Z-Cl. Po reakci se neutralizovalo s HCl. Tento roztok se extrahoval butylacetatem. Organické fáze se odstranily. Dalším přidáním HCl k vodné fázi se hodnota pH upravila na 2 a rovněž protřepala s butylacetatem. Organické fáze se spojily a • · • · • · φφ φφ
- 16 zahustily. Produkt vykrystalizoval z roztoku 2,5 ml ethylacetatu a 1,5 ml hexanu. Získalo se 3,6 g Z-D-prolinu.
teplota tavení: 68,5 °C obsah: 97,86 % [aD 20](c=2 v ledové kys. octové )=+55,766 [α546 20](ο=2 v ledové kys. octové )=+66,251 ee(podle HPLC) 95,4 % 1H-NMR (400 MHz v CDgOD); & v ppm:
7,35(m,5H),
5,l(m,2H),
4,3(m,lH),
3,6-3,4(m,2H),
2,3-2,2(m,1H),
2,1-1,9(m,3H).
Příklad 8
Čištění enzymu
Buňky Pseudomonas aeruginosa DSM 10581 se pěstovali podle příkladu 1. Sklízely v pozdně exponencielní růstové fázi centrifugací a promyly se 0,85 % NaCl nebo 30-200 mM Hepes pufrem pH 7-9. Frenschovým tlakovým zařízením (3krát, 120 MPa) se buňky rozbily. Buněčný extrakt se 30 min centrifugoval při 30000 g. Bezbuněčný supernatant se filtroval (0,4 μ,πι) a čistil přes sloupec MonoQ-FPLC (Pharmacia). Jako mobilní fáze se použil 10 mM Hepes pufr pH 8. Použil se gradient Na2SC>4, aby se enzym eluoval ze sloupce. Enzym eluoval ze sloupce při koncentraci soli 120 mM. 25 mM kyseliny L-a-chlor-S-guanidinovalerové se přes noc přeměnilo na D-prolin obohaceným enzymem.
Aktivní frakce z čištění na MonoQ FPLC se spojily a dále čistily sloupcem fenylsepharosy (Pharmacia). Jako mobilní fáze se použil 50 mM Hepes pufr pH 8, 1,7 M (NH4)2SO4. Hydrolasa eluovala ze sloupce 50 mM Hepes pufrem pH 8. Čištěný enzym transformoval 25 • · · • · ·
- 17 mM kyseliny L-a-chlor-8-guanidinovalerové během 24 hod úplně na kyselinu L-a-chlor-S-guanidinovalerovou, která vlivem bazicity media cyklizovala na D-prolin.
Příklad 9
Charakteristika enzymu
Charakteristika enzymu se prováděla s celými buňkami Pseudomonas aeruginosa (DSM 10581). Optická hustota buněčné suspenze byla přitom ODg00=17. Vliv teploty se stanovil ve 100 mM fosfátovém pufru (pH 7-8) při koncentraci substrátu 25 mM kyseliny L-a-chlor-S-guanidinovalerové. Přitom se zjistilo, že je při 37 °C o 40 % vyšší aktivita než při 30 °C.
Vliv hodnoty pH se zjišťoval ve stejném pufru, při stejné koncentraci substrátu a při teplotě 37 °C. Měřena byla aktivita při pH 7;pH 7,5;pH 8,0;pH 8,5. Přitom se zjistilo, že pH optimum bylo při pH 8,5.
Použitím různých koncentrací kyseliny L-a-chlor-S-guanidinovalerové se zjišťovala hodnota a Vmax při teplotě 37 °C ve 100 mM fosfátovém pufru (pH 8,5). Hodnota KM byla 85,2 mmol/1 a Vmax 0,38 mmol/l/min (Obr. 3).
Přidáváním různých koncentrací kyseliny L-a-chlor-S-guanidinovalerové (připravené z ornitinu jako v příkladě 6) se prokázal zpomalující účinek. Jak je zřejmé z Obr. 4, došlo při koncentraci 50 mM k úplnému zastavení.
• · · · • · · · • · · · • · ··· · · ·
WO 98/01577 í»PCT«ř97/0S546
BUDAPESTER VERTRAG OBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERU-AmG VON MIKROORGANISMEN FLIR DIE ZWECKE VON FATENTVERTAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Lonza AG Walliser Werke
CH-3930 Visp
EMPFANGSBESTATIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemSO Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
| I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS | |
| Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen: BEC002 | Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: DSM 10581 |
| II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG | |
| Mít dem unter 1. bezeichneten Mikroorganismus wurde ( ) eine wissenschaftliche Beschreibung (X ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (ZutrefTendes ankreuzen). | |
| III. EINGANG UND ANNAHME | |
| Diese intemationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1996-03-11 (Datum der Ersthinterlegung)' eingegangen ist. | |
| IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG | |
| Der unter 1 bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Intemationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinterlegung, und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemilfi Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung). | |
| V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE | |
| Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Anschrift: Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig | Unterschrift(en) der zur Vertretung der intemationalen Hinterlegungsstelle befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermSchtigten Bediensteten: Datum: 1996-03-18 |
1 Falls Regel 6.4 Buchstabe d zulrilR, isl dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer intemationalen Hinterlegungsstelle envorben worden ist. Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 0196
WO 98/01577 ••*PCT/K)P97703546
BUDAPESTER VERTRAO OBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MKXOORGANISN3TN FOR DIE ZWECKE VON PATENTVEREAhREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Lonza AG Walliser Werke CH-3930 Visp
LEBENSFÁHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemafl Regel 10.2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
| I. IIINTERLEGER | II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS |
| Name: Lonza AG Walliser Werke Anschrift: CH-3930 Visp | Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: DSM 10581 Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung': 1996-03-11 |
| III. LEBENSFÁHIGKEITSBESCHEINIGUNG | |
| Die Lebensfahigkeit des unter II genannten Mikroorganismus istam 1996-03-11’ geprflft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus (X)’ lebensiahig ( )’ nicht mehr lebensiahig | |
| IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFÁHIGKEITSPROFUNG DURCHGEFÚHRT WORDEN IST4 | |
| V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE | |
| Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Anschrift: Mascheroder Weg 1b D-38I24 Braunschweig | Unterschrift(en) der zur Vertretung der intemationalen Hinterlegungsstelle beftigten Persori(en) oder des (der) von ihr ermachtigten Bediensteten: Datum: 1996-03-18 |
Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn einc cmeute Hinterlegung oder cíne Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabc des Datums der jcweils letzten emeuten Hinterlegung oder Weiterleitung.
In den in Regel 10.2 Buchstabe a Zifler ii und iii vorgesehenen Fallen Angabe der letzten Lebensiahigkeitsprtlfung.
Zutreflendes ankreuzen.
Ausftlllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnísse der Prilfung negativ waren.
Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 0196
WO 98/01577 • ·
• · · · · · • · · · · .·. PClŤÍŤ97Író546
BUDAPESTER VERTRAG OBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEM FOR DIE ZWECKE VON PATENTVERF/.HREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Lonza AG Walliser Werke
CH-3930 Visp
EMPFANGSBESTÁTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemafl Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
| I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS | |
| Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen: BEC003 | Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: DSM 10582 |
| II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG | |
| Mil dem unter 1. bezeichneten Mikroorganismus wurde ( ) eine wissenschaftliche Beschreibung ( ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (ZutrefTendes ankreuzen). | |
| III. EINGANG UND ANNAHME | |
| Diese intemationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1996-03-11 (Datum der Ersthinterlegung)' eingegangen ist. | |
| IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG | |
| Der unter 1 bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Intemationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemaB Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung). | |
| V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE | |
| Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Anschrift: Mascheroder Weg lb 0-38124 Braunschweig | Unterschrift(en) der zur Vertrctung der intemationalen Hinterlegungsstelle befugten Person(cn) oder des (der) von ihr ermachtigten Bediensteten: Datum: 1996-03-18 |
1 Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status eincr intemationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 0196
WO 98/01577 • · · · • · · · · · · •pct/eH 7/0^546
BUDAPESTER VERTRAG OBCI'. DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERJ .EUUNG VON MIKR3CRGAN'SMHN FOR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Lonza AG
Walliser Werke
CH-3930 Visp
LEBENSFÁHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestcllt gcmSB Regcl 10.2 von der unten angegebencn
INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
| I. HINTERLEGER | II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS |
| Name: Lonza AG Walliser Werke Anschrift: CH-3930 Visp | Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: DSM 10582 Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung1: 1996-03-11 |
| III. LEBENSFÁHIGKEITSBESCHEINIGUNG | |
| Die Lebensf&higkeit des unter 11 genannten Mikroorganismus istam 1996-03-11’ geprtlft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus (X)’ Icbcnsffthig ( )' nicht mehr lebensf&hig | |
| IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFÁHIGKEITSPROFUNG DURCHGEFOHRT WORDEN IST4 | |
| V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE | |
| Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Anschrift: Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig | Unterschrift(en) der zuř Vertretung der intemationalen Hinterlegungsstelle befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermtlchtigten Bediensteten: ÍCíjKS' Datum: 1996-03-18 |
Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn cíne emeute Hinterlegung oder cíne Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jewcils letzten emeuten Hinterlegung oder Weiterleitung.
In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziňer ii und iii vorgesehenen Fitllcn Angabe der letzten Lebcnsfóhigkeilsprtlfung.
Zutreflendes ankreuzcn.
Ausftillcn, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prtlfung negativ waren.
Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 0196
• · · · · · . Ρθ}ϊΤ972(Β546
WO 98/01577
BUDAPESTER VERTRAG U3ER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FtIR DIE ZWECKE VON PATENTVLRFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Lonza AG Walliser Werke
CH-3930 Visp
EMPFANGSBESTÁTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgcstellt gemaB Regcl 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
| I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS | |
| Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszcichen: BEC004 | Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: DSM 10593 |
| II.. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMÍSCHE BEZEICHNUNG | |
| Mít dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde ( ) eine wissenschaftliche Beschreibung ( ) eine vorgeschlagene taxonomísche Bezeichnung eingereicht. (ZutrefTendes ankreuzen). | |
| III. EINGANG UND ANNAHME | |
| Diese intemationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter 1 bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1996-03-11 (Datum der Ersthinterlegung)' eingegangen ist. | |
| IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG | |
| Der unter 1 bezeichnete Mikroorganismus ist bel dieser Intemationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemdO Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung). | |
| V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE | |
| Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Anschrift: Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig | Unterschrift(en) der zuř Vertretung der intemationalen Hinterlegungsstelle befugten Pcrson(en) oder des (der) von ihr ermachtigten Bediensteten: Datum: 1996-03-18 |
' Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifR, ist dies der Zcilpunkt, zu dcm der Status einer intemationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist.
Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 0196 '7Í2_
WO 98/01577 *VCT/EP97703546
BUDAPESTER VERTRAC U3ER DIE II TEPNATtONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MLG.OORGAKISMEN FUR DIE ZWECKE VON IATENTVCRFAHPEN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Lonza AG Walliser Werke
CH-3930 Visp
LEBENSFÁHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemaC Regel 10.2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
| I. WNTERLEGER | II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS |
| Name: Lonza AG Walliser Werke Anschrift: CH-3930 Visp | Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: DSM 10593 Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung1: 1996-03-11 |
| III. LEBENSFÁHIGKEITSBESCHEINIGUNG | |
| Die Lebensfóhigkeit des unter II genannten Mikroorganismus istam 1996-03-11’ gcprtlft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus (X)’ lebensIShig ( )’ nicht mehr lebensfthig | |
| IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFÁHIGKEITSPROFUNG DURCHGEFOHRT WORDEN IST* | |
| V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE | |
| Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Anschrift: Mascheroder Weg lb 0-38124 Braunschweig | Unterschrift(cn) der zur Vcrtretung der intemationalen Hinterlegungsstelle befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermMchtigten Bediensteten: Datum: 1996-03-18 |
Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn cíne crneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten emcutcn Hinterlegung oder Weiterleitung.
In den in Regel 10.2 Buchstabe a ZifTer ii und iii vorgesehenen Fallen Angabe der letzten LebensfUhigkeitsprtliung.
ZutrefTendes ankreuzen.
AusRlIlcn, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn dic Ergcbnisse der Prtlfung negativ warcn.
Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 0196
Claims (11)
- PATENTOVÉNÁROKY1. Mikroorgansmy, vyznačjící se tím, že jsou schopné zužitkovat derivát kyseliny quanidinovalerové vybraný ze sloučenin obecného vzorce V (V)Ί . ?kde R znamená atom vodíku nebo hydroxyskupmu a R znamená atom halogenu nebo skupinu -NH2, jako jediný zdroj dusíku, jakož i jejich enzymové extrakty.
- 2. Mikroorganismy podle nároku 1 rodu Klebsiella, Pseudomonas, Agrobacterium nebo Arthrobacter.
- 3. Mikroorganismy podle nároku 1 nebo 2 druhu Klebsiella pneumoniae DSM 10593, Arthrobacter sp. DSM 10582, Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas cepacia nebo Pseudomonas aeruginosa DSM 10581, jakož i jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.
- 4. Enzym s amidinohydrolasovou aktivitou, získatelný z mikroorganismů podle jednoho z nároků 1 až 3 a který je schopný z derivátů kyseliny guanidinovalerové vybraných ze sloučenin obecného vzorce VH2N (V)Ί · ?kde R znamená atom vodíku nebo hydroxyskupmu a R znamená atom halogenu nebo skupinu -NH2, odštěpit močovinu, jakož i jeho funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.• · • · ·· · ·· ·- 25
- 5. Způsob výroby derivátů D-prolinu obecného vzorce IOH (I) kde R1 znamená atom vodíku nebo hydroxyskupinu, vyznačující se tím, že se derivát kyseliny L-guanidinovalerové nebo jeho sůl obecného vzorce III (III) halogenu, hydrolyzuje podle nároku 1 nebo kyseliny L-aminovale mikroorganismem nebo enzymovým extraktem amidinohydrolasou podle nároku 4 na derivát rové obecného vzorce IV (IV) kde R1 a R3mají uvedený význam, a ten se cyklizuje na konečný produkt vzorce I.
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se derivát kyseliny L-guanidinovalerové vzorce III nebo jeho sůl vyrobí v prvním stupni přeměnou derivátu L-argininu nebo jeho soli obecného vzorce IINH kde R1 má uvedený význam.(II) ► ·· • · <• · 4 » · · · <- 26
- 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se přeměna derivátu L-argininu nebo jedné z jeho solí provádí při teplotě od -10 do 100 °C.
- 8. Způsob podle jednoho z nároků 5 až 7, vyznačující se tím, že se hydrolýza derivátu kyseliny L-guanidinovalerové vzorce III nebo jeho solí provádí pomocí mikroorganismů rodu Klebsiella, Pseudomonas, Agrobacterium nebo Arthrobacter.
- 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se hydrolýza provádí pomocí mikroorganismů druhu Klebsiella pneumoniae DSM 10593, Arthrobacter sp. DSM 10582, Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas cepacia nebo Pseudomonas aeruginosa DSM 10581 nebo s jejich funkčně ekvivalentními variantami a mutanty.
- 10. Způsob podle jednoho z nároků 5 až 9, vyznačující se tím, že se hydrolýza provádí při hodnotě pH od 5 do 13.
- 11. Způsob podle jednoho z nároků 5 až 10, vyznačující se tím, že se cyklizace provádí bez izolace derivátu kyseliny L-aminovalerové vzorce IV.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH169696 | 1996-07-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ3599A3 true CZ3599A3 (cs) | 1999-04-14 |
Family
ID=4216467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ9935A CZ3599A3 (cs) | 1996-07-08 | 1997-07-04 | Mikroorganismy a způsob výroby derivátů D-prolinu |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0912751B1 (cs) |
| JP (1) | JP2000515010A (cs) |
| AT (1) | ATE196777T1 (cs) |
| AU (1) | AU3620397A (cs) |
| CA (1) | CA2257542A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ3599A3 (cs) |
| DE (1) | DE59702430D1 (cs) |
| DK (1) | DK0912751T3 (cs) |
| ES (1) | ES2153207T3 (cs) |
| PT (1) | PT912751E (cs) |
| SK (1) | SK172698A3 (cs) |
| WO (1) | WO1998001577A1 (cs) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2122294C3 (de) * | 1971-05-05 | 1979-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase |
| JPH0662880A (ja) * | 1992-08-10 | 1994-03-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 |
-
1997
- 1997-07-04 PT PT97932775T patent/PT912751E/pt unknown
- 1997-07-04 DE DE59702430T patent/DE59702430D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-04 ES ES97932775T patent/ES2153207T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-04 DK DK97932775T patent/DK0912751T3/da active
- 1997-07-04 AU AU36203/97A patent/AU3620397A/en not_active Abandoned
- 1997-07-04 JP JP10504773A patent/JP2000515010A/ja active Pending
- 1997-07-04 EP EP97932775A patent/EP0912751B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-04 WO PCT/EP1997/003546 patent/WO1998001577A1/de not_active Application Discontinuation
- 1997-07-04 CZ CZ9935A patent/CZ3599A3/cs unknown
- 1997-07-04 SK SK1726-98A patent/SK172698A3/sk unknown
- 1997-07-04 CA CA002257542A patent/CA2257542A1/en not_active Abandoned
- 1997-07-04 AT AT97932775T patent/ATE196777T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3620397A (en) | 1998-02-02 |
| JP2000515010A (ja) | 2000-11-14 |
| EP0912751A1 (de) | 1999-05-06 |
| ATE196777T1 (de) | 2000-10-15 |
| DE59702430D1 (de) | 2000-11-09 |
| CA2257542A1 (en) | 1998-01-15 |
| EP0912751B1 (de) | 2000-10-04 |
| WO1998001577A1 (de) | 1998-01-15 |
| PT912751E (pt) | 2001-03-30 |
| ES2153207T3 (es) | 2001-02-16 |
| SK172698A3 (en) | 1999-07-12 |
| DK0912751T3 (da) | 2000-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH06343462A (ja) | 新規微生物、Ｌ−α−アミノ酸の製法、新規微生物の突然変異種及び変体の培養法、カルバモイラーゼ及び／又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の獲得法、及びカルバモイラーゼ及び／又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の微生物又は細胞中への挿入法 | |
| CS224624B2 (en) | Method for producing 2,5-diketo-d-gluconic acid or its salts | |
| JPH07289284A (ja) | 光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法 | |
| CA2062281C (en) | Biotechnological process for the production of s-(+)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxamide | |
| CZ66896A3 (en) | Micro-organisms of pseudomonas strain and process of microbiological production of s-alpha-aminocarboxylic acids and amides of r-alpha-aminocarboxylic acids | |
| CZ279492B6 (cs) | Mikrobiologický způsob výroby kyseliny 6-hydroxypikolinové | |
| CZ281198A3 (cs) | Způsob výroby N-chráněných derivátů D-prolinu | |
| CH636078A5 (it) | Complessi enzimatici atti a trasformare idantoine raceme in amminoacidi otticamente attivi e loro applicazioni. | |
| CZ3599A3 (cs) | Mikroorganismy a způsob výroby derivátů D-prolinu | |
| SK278514B6 (en) | Rhodococcus erythropolis microorganism and a method for producing hydroxylated pyrazines and quinoxalines | |
| JP2002281993A (ja) | シキミ酸の製造方法 | |
| CA2217067A1 (en) | Biotechnical production process of piperazine r-.alpha.-carboxylic acids and piperazine s-.alpha.-carboxylic acid amide | |
| JP3917723B2 (ja) | ラクトン加水分解酵素およびその製造法 | |
| CZ279298B6 (cs) | Mikroorganismy Alcaligenes faecalis DSM 6335 a způsob mikrobiologické výroby kyseliny 6-hydroxypikolinové | |
| KR0122284B1 (ko) | 내열성 d-히단토이나제 활성을 갖는 신규 미생물 | |
| CZ279769B6 (cs) | Mikrobiologický způsob přípravy 5-hydroxypyrazinkarboxylové kyseliny | |
| JPH0515394A (ja) | 光学活性（ｓ）−３−フエニル−１，３−プロパンジオールの製造法 | |
| JP2001120290A (ja) | 微生物によるカルボン酸類の製法 | |
| JPH07274985A (ja) | Ｄ−γ−メチルロイシンの製造法 | |
| JPH0445797A (ja) | Ｌ―α―アラニンの製造法 | |
| JP2001120259A (ja) | 微生物によるカルボン酸アミド類の製法 | |
| JPWO2004083420A1 (ja) | 新規エステラーゼ、その生産菌及び製造法 | |
| JP2002360293A (ja) | 微生物によるクロロヒドリンの光学分割法 | |
| JPS5828291A (ja) | Ｎ，ｎ′−ビスカルバモイル−ｄ−シスチンの製造方法 | |
| JPS62253398A (ja) | （＋）−トランス−パ−メトリン酸の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |