CZ281198A3 - Způsob výroby N-chráněných derivátů D-prolinu - Google Patents
Způsob výroby N-chráněných derivátů D-prolinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ281198A3 CZ281198A3 CZ982811A CZ281198A CZ281198A3 CZ 281198 A3 CZ281198 A3 CZ 281198A3 CZ 982811 A CZ982811 A CZ 982811A CZ 281198 A CZ281198 A CZ 281198A CZ 281198 A3 CZ281198 A3 CZ 281198A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- amino acid
- proline
- acid derivative
- protected
- aliphatic
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 11
- ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N D-Proline Chemical class OC(=O)[C@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N 0.000 title 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 72
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 49
- -1 N-protected proline Chemical class 0.000 claims abstract description 48
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 36
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 35
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 4
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 67
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 44
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 37
- 241000186073 Arthrobacter sp. Species 0.000 claims description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 17
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 15
- JXGVXCZADZNAMJ-LLVKDONJSA-N (2r)-1-phenylmethoxycarbonylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 JXGVXCZADZNAMJ-LLVKDONJSA-N 0.000 claims description 14
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 claims description 14
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 13
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 11
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 claims description 11
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 241001250076 Achromobacter piechaudii Species 0.000 claims description 7
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 claims description 7
- 241000193400 Bacillus simplex Species 0.000 claims description 7
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 7
- 241001673062 Achromobacter xylosoxidans Species 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 5
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 5
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 5
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 claims description 5
- RQYKQWFHJOBBAO-JTQLQIEISA-N (2s)-1-benzoylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)C1=CC=CC=C1 RQYKQWFHJOBBAO-JTQLQIEISA-N 0.000 claims description 4
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- JXGVXCZADZNAMJ-NSHDSACASA-N (2s)-1-phenylmethoxycarbonylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 JXGVXCZADZNAMJ-NSHDSACASA-N 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- TYRGLVWXHJRKMT-QMMMGPOBSA-N n-benzyloxycarbonyl-l-serine-betalactone Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 TYRGLVWXHJRKMT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 4
- 125000004191 (C1-C6) alkoxy group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 125000004122 cyclic group Chemical class 0.000 abstract description 17
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 125000000229 (C1-C4)alkoxy group Chemical group 0.000 abstract 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 33
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 21
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 12
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 12
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 11
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 6
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 6
- GNMSLDIYJOSUSW-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-proline Chemical compound CC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GNMSLDIYJOSUSW-LURJTMIESA-N 0.000 description 6
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 6
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N benzyl chloroformate Chemical compound ClC(=O)OCC1=CC=CC=C1 HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 6
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 6
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 6
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 5
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 4
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 4
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NEBOPDYAXPDYHQ-LURJTMIESA-N Succinyl proline Chemical compound OC(=O)CCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O NEBOPDYAXPDYHQ-LURJTMIESA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- UBQCWSGRNIOFFC-NSHDSACASA-N (2s)-1-(2-phenylacetyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CC1=CC=CC=C1 UBQCWSGRNIOFFC-NSHDSACASA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N thioacetamide Natural products CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PJVXUVWGSCCGHT-ZPYZYFCMSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;(3s,4r,5r)-1,3,4,5,6-pentahydroxyhexan-2-one Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO PJVXUVWGSCCGHT-ZPYZYFCMSA-N 0.000 description 2
- LXDUOIDIFSKLNB-UHFFFAOYSA-N 1-(2-chloroacetyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCN1C(=O)CCl LXDUOIDIFSKLNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001453369 Achromobacter denitrificans Species 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N Benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1 KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 2
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 241000243198 Peritrichia Species 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N butan-1-amine Chemical compound CCCCN HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 235000019534 high fructose corn syrup Nutrition 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 2
- XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N quinoxaline Chemical compound N1=CC=NC2=CC=CC=C21 XSCHRSMBECNVNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 102220093061 rs139517777 Human genes 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 2
- APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N tryptamine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN)=CNC2=C1 APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCJAEFHIYXJSOL-BCMQLYLDSA-N (2S,3S)-2,3-dihydroxybutanedioic acid (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.C(=O)(O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)O WCJAEFHIYXJSOL-BCMQLYLDSA-N 0.000 description 1
- LXDUOIDIFSKLNB-YFKPBYRVSA-N (2s)-1-(2-chloroacetyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CCl LXDUOIDIFSKLNB-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ZQEBQGAAWMOMAI-ZETCQYMHSA-N (2s)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZQEBQGAAWMOMAI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- MJGBOFOZSAEULI-RUCXOUQFSA-N (2s)-5-oxopyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1.OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 MJGBOFOZSAEULI-RUCXOUQFSA-N 0.000 description 1
- 125000000027 (C1-C10) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006702 (C1-C18) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-SSDOTTSWSA-M (R)-mandelate Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-SSDOTTSWSA-M 0.000 description 1
- UUZJJNBYJDFQHL-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazolidine Chemical compound C1CNNN1 UUZJJNBYJDFQHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CIISBYKBBMFLEZ-UHFFFAOYSA-N 1,2-oxazolidine Chemical compound C1CNOC1 CIISBYKBBMFLEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine Chemical compound C1CSCN1 OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004217 4-methoxybenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1OC([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004172 4-methoxyphenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(OC([H])([H])[H])=C([H])C([H])=C1* 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010082340 Arginine deiminase Proteins 0.000 description 1
- 241000186001 Arthrobacter pascens Species 0.000 description 1
- 241000185993 Arthrobacter ramosus Species 0.000 description 1
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 description 1
- 241000589518 Comamonas testosteroni Species 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N D-arabinitol Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N D-melezitose Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008567 D-prolines Chemical class 0.000 description 1
- 150000000903 D-xyloses Chemical class 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- WRYCSMQKUKOKBP-UHFFFAOYSA-N Imidazolidine Chemical compound C1CNCN1 WRYCSMQKUKOKBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- OBSIQMZKFXFYLV-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine amide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 OBSIQMZKFXFYLV-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 150000008548 L-prolines Chemical class 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- OKJIRPAQVSHGFK-UHFFFAOYSA-N N-acetylglycine Chemical compound CC(=O)NCC(O)=O OKJIRPAQVSHGFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N N-benzoylglycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYNCHZVNFNFDNH-UHFFFAOYSA-N Oxazolidine Chemical compound C1COCN1 WYNCHZVNFNFDNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 241000185994 Pseudarthrobacter oxydans Species 0.000 description 1
- 241000168225 Pseudomonas alcaligenes Species 0.000 description 1
- 241000589755 Pseudomonas mendocina Species 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- IPBVNPXQWQGGJP-UHFFFAOYSA-N acetic acid phenyl ester Natural products CC(=O)OC1=CC=CC=C1 IPBVNPXQWQGGJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-N azetidine Chemical compound C1CNC1 HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- YBOWSASUXDVAKE-QRPNPIFTSA-N c1cc2ccccc2[nH]1.N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O Chemical compound c1cc2ccccc2[nH]1.N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O YBOWSASUXDVAKE-QRPNPIFTSA-N 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- MBVZVYAHZQRXGG-UHFFFAOYSA-N decanoic acid hexanedioic acid 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O.CCCCCCCCCC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O MBVZVYAHZQRXGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 description 1
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 description 1
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HGBCAGWLIQGSMW-UHFFFAOYSA-N hexanedioic acid;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O HGBCAGWLIQGSMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- XAAKCCMYRKZRAK-UHFFFAOYSA-N isoquinoline-1-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)O)=NC=CC2=C1 XAAKCCMYRKZRAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N melezitose Chemical compound O([C@@]1(O[C@@H]([C@H]([C@@H]1O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)CO)CO)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- CCRRYEULCXQEFI-UHFFFAOYSA-N nitrous acid propanoic acid Chemical compound N(=O)O.C(CC)(=O)O CCRRYEULCXQEFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229940049953 phenylacetate Drugs 0.000 description 1
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- WLJVNTCWHIRURA-UHFFFAOYSA-M pimelate(1-) Chemical compound OC(=O)CCCCCC([O-])=O WLJVNTCWHIRURA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- USPWKWBDZOARPV-UHFFFAOYSA-N pyrazolidine Chemical compound C1CNNC1 USPWKWBDZOARPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJAWHXHKYYXBSV-UHFFFAOYSA-N quinolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1C(O)=O GJAWHXHKYYXBSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 150000003625 trehaloses Chemical class 0.000 description 1
- 150000003628 tricarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
- C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pyrrole Compounds (AREA)
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká nových mikroorganismů, které jsou schopné zužitkovat N-chráněný derivát prolinu.
Dosavadní stav techniky
N-chráněné cyklické deriváty D-aminokyselin jako např. N-chráněné deriváty D-prolinu jako je N-benzyloxykarbonyl-D-prolin (N-Z-D-prolin) jsou důležité meziprodukty pro výrobu farmaceutických přípravků (J.Org.Chem.,1994,59,7496-7498).
Dosud je známo jen málo enzymů, které přijímají N-Z-L-prolin jako substrát a hydrolyzují ho na L-prolin. Tyto enzymy byly izolovány z mikroorganismů rodu Rhodotorula (JP-A 01 074 987), Pseudomonas (JP-A 55 071 491; Kikuchi a spol., Biochim.Biophys. Acta, 744 (1983),180-188) nebo z Alcaligenes (JP-A 55 007 015).
Všechny tyto enzymy reagují výhodně se strukturně příbuznými substráty N-Z-L-prolinu, jako např. s N-chloracetyl-L-prolinem, vykazují však s N-Z-L-prolinem malou aktivitu. Proto se tyto enzymy nehodí pro hospodárný způsob např. výroby N-Z-D-prolinu. Další nevýhodou je, že se přeměna substrátu neprovádí s celými buňkami, ale provádí se surovými extrakty nebo izolovanými enzymy, což výrazně zvyšuje technický náklad.
Z EP-A 0 416 282 je známá N-acyl-L-prolin-acyláza, která např. jako substrát upřednostňuje N-acetyl-L-prolin a používá se pro získání L-prolinu. Tato N-acyl-L-prolin-acyláza se izoluje z mikroorganismů druhu Comamonas testosteroni nebo Alcaligenes denitrificans. Nevýhoda těchto mikroorganismů spočívá v tom, že nejsou schopné zužitkovat N-Z-L-prolin jako jediný zdroj dusíku a nejsou schopné N-Z-L-prolin hydrolyzovat jako substrát.
Z WO 95/10 604 je známý mikrobiologický způsob výroby kyseliny
- 2 • · « Λ
L-pipekolinové pomocí mikroorganismů druhu Alcaligenes denitrificans. Nedostatkem také těchto mikroorganismů je to, že nezužitkují odpovídající N-acylový substrát (kyselinu N-acetyl-(DL)-pipekolinovou) jako jediný zdroj dusíku.
Úkolem předloženého vynálezu je izolovat mikroorganismy, které se mohou použít jak pro jednoduchý a technicky použitelný způsob výroby N-chráněných cyklických nebo alifatických derivátů D-aminokyselin, tak také pro jednoduchý způsob výroby cyklických nebo alifatických derivátů L-aminokyselin. Přitom se mají izolovat odpovídající produkty za dobré enantiomerní čistoty.
Podstata vynálezu
Výše uvedený úkol se řeší pomocí mikroorganismů podle nároku 1, pomocí enzymů z těchto mikroorganismů podle nároku 5 a pomocí způsobů podle nároků 6,7,9 a 10.
Předložený vynález se týká nových mikroorganismů, které jsou schopné zužitkovat N-chráněný derivát prolinu obecného vzorce I r2Á\0H
I o
C = O (I) ve formě racemátu nebo ve formě jeho opticky aktivního izomeru, kde R1 znamená -(CH2)2-COOH, každá popřípadě substituovaná skupina C-^.^-alkoxy, aryl nebo aryloxy a R2 znamená atom vodíku nebo =0, jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku. Tyto mikroorganismy, popř. jejich bezbuněčné enzymy se používají pro nový způsob výroby N-chráněných cyklických nebo alifatických derivátů D-aminokyselin a/nebo cyklických nebo alifatických derivátů L-aminokyselin .
- 3 • ·
Mikroorganismy podle vynálezu lze izolovat ze vzorků půdy, kalů nebo odpadních vod pomocí obvyklých mikrobiologických metod. Podle vynálezu se izolace mikroorganismů uskuteční tak, že se pěstují v mediu, které obsahuje N-chráněný derivát prolinu obecného vzorce I
Č = O° (!) ve formě racemátu nebo jeho opticky aktivního izomeru jako jediný zdroj uhlíku a dusíku nebo jako jediný zdroj dusíku se vhodným zdrojem uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku se vhodným zdrojem dusíku obvyklým způsobem. Z této kultury získané pěstováním se pak účelně podrobí selekci ty, které zužitkují N-chráněný derivát L-prolinu obecného vzorce I jako jediný zdroj dusíku, jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku.
Zbytek Rx v N-chraneném derivátu prolinu obecného vzorce I znamená -(CH2)2-COOH, C1_4~alkoxy, aryl nebo aryloxy. R2 znamená atom vodíku nebo =0.
Jako C-j__4-alkoxy se mohou použít methoxy, fluorenylmethoxy, ethoxy, propoxy, i-propoxy, butoxy, t-butoxy nebo i-butoxy.
Jako aryl se používá skupina fenylová nebo benzylová substituovaná nebo nesubstituovaná, jako např. 4-methoxybenzyl nebo 4-methoxyfenyl.
Aryloxy se dále definuje jako skupina fenyloxy nebo benzyloxy, substituovaná nebo nesubstituovaná. Příklady aryloxyskupiny jsou benzyloxy, 4-methoxybenzyloxy nebo 4-nitrobenzyloxy.
Obzvláště výhodné N-chráněné deriváty prolinu obecného vzorce I jsou: N-sukcinyl-L-prolin (R1=-(CH2)2 -COOH, N-fenylacetyl-L-prolin (R1=fenylmethyl), N-Z-L-prolin (R1=benzyloxy), N-benzoyl-L' · · * 9999 9999 ·· 9 ···· · · · · • · ··· 9*9·· ···· · ···· 99 9 ···
- 4 -prolin (R1=fenyl), N-isobutoxykarbonyl-L-prolin (R^isobutoxy) a N-Z-L-pyroglutamát (R-*-=benzyloxy, R2=0).
Jako vhodný zdroj uhlíku mohou mikroorganismy např. využít cukr, cukerné alkoholy nebo karboxylové kyseliny jako růstový substrát. Jako cukr se mohou použít hexosy jako např. glukosa, fruktosa nebo pentosy. Jako karboxylové kyseliny se mohou použít di- nebo trikarboxylové kyseliny, popř. jejich soli jako např. citrát nebo malát. Jako cukerný alkohol se může použít např. glycerin. Jako vhodný zdroj dusíku mohou mikroorganismy využít například amonium, nitrát, močovinu nebo glycin.
Jako selekční a růstové medium se účelně používají media běžná v oboru, jako např. medium popsané v tabulce 1. Výhodně se používá medium popsané v tabulce 1.
Během růstu a selekce se účelně indukují účinné enzymy mikroorganismů. Jako induktor enzymů se může použít N-chráněný derivát prolinu obecného vzorce I, popř. jeho L-isomer.
Obvykle probíhá růst a selekce při teplotě od 10 do 40 °C, výhodně od 20 do 35 °C a při hodnotě pH mezi pH 4 a pH 10, výhodně mezi pH 5 a pH 9.
Výhodné mikroorganismy jsou mikroorganismy zužitkující N-Z-L-prolín rodu Arthrobacter (první grampositivní mikroorganismus s prolin-acylázovou aktivitou), Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Alcaligenes. Zejména se izolují mikroorganismy druhu Arthrobacter sp. HSZ5 s označením DSM 10328, Agrobacterium/Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32, Alcaligenes piechaudii K4 nebo Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ17 s označením DSM 10329, jakož i jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty. Mikroorganismy DSM 10329 a DSM 10328 byly uloženy 6.11.1995 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, podle Budapešťské dohody.
• · · · · · • ·
- 5 Pod pojmem funkčně ekvivalentní varianty a mutanty se rozumějí mikroorgansimy, které mají v podstatě stejné vlastnosti a funkce jako původní mikroorganismy. Takové varianty a mutanty se mohou vytvořit náhodně, např. UV-ozářením.
Taxonomicky popis Alcaligenes HSZ17 (DSM 10329)
Vlastnosti kmene:
buněčná forma šířka μιη délka μιη pohyblivost mrskání
Gram-reakce lyže 3 %ním KOH aminopeptidáza (Cerny) spory oxidáza kataláza růst anaerobně
ADH (alkoholdehydrogenáza) no2 z no3 denitrifikace xylosoxydans ssp. denitrificans tyčinky
0,5-0,6
1,5-3,0 +
peritrich +
+ ureáza • · • · · • · • fefe · fe ·
• fe • ·
• · · · hydrolýza želatiny
Tweenu 80 kyselina z (OF-test) glukosy aerobně xylosy 80 využití substrátu glukosy fruktosy arabinosy citrátu + malátu + mannitolu
Taxonomický popis Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328)
Charakteristika: gram-positivní nerovnoměrné tyčinky s výrazným růstovým cyklem tyčinky-koky; striktně aerobní; žádná tvorba kyseliny nebo plynu z glukosy.
pohyblivost spory kataláza kyselina meso-diaminopimelová v buněčné stěně: ne typ peptidoglykanu: A3a,L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala podobnost sekvence 16S rDNA: sekvenování oblasti s největší variabilitou prokázalo nejvyší hodnoty 98,2 % s Arthrobacter pascens, A.ramosus a A.oxydans
- Ί -
Taxonomický popis Agrobacterium/Rhizobium HSZ30 buněčná forma šířka μιη délka μιη
Gram-reakce lyže 3 %ním KOH aminopeptidáza spory oxidáza kataláza pohyblivost růst anaerobně nitrit z nitrátu denitrifikace ureáza hydrolýza želatiny kyselina z
L-arabinosy galaktosy melezitosy fúkosy arabitolu manitolu erythritolu pleomorfní tyčinky 0,6-1,0 1,5-3,0 +
+ ♦· ····
• · · · · · ·· • · *·· ♦ ♦·· · · • · · · · · • · ·· ·· · ·
- 8 alkalizace lakmusového mléka + ketolaktosa
Parciální sekvencování 16S rDNA prokázalo srovnatelně stejně velkou podobnost ca 96 %ní se zástupci rodů Agrobacterium a Rhizobium. Jednoznačné přiřazení k jednomu druhu popsanému u těchto rodů není možné.
Taxonomický popis Bacillus simplex K2
| buněčná forma šířka um délka um | tyčinky 0,8-1,0 3,0-5,0 |
| spory | - |
| elipsoidní | - |
| kulaté | - |
| sporangium | - |
| kataláza | + |
| anaerobní růst | - |
| VP reakce | k.w. |
| maximální teplota | |
| pozitivní růst při °C | 4 0 |
| negativní růst při °C | 45 |
| růst v | |
| mediu pH 5,7 | - |
| NaCl 2 % | + |
| 5 % | - |
| 7 % | - |
| 10 % | — |
mediu s lysozymem +
- 9 fc· fc···
| kyselina z (ASS) D-glukosy | + |
| L-arabinosy | + |
| D-xylosy | - |
| D-manitu | + |
| D-fruktosy | + |
| plyn z fruktosy | - |
| lecitináza | - |
| hydrolýza | |
| škrobu | + |
| želatiny | + |
| kaseinu | - |
| Tweenu 80 | + |
| eskulinu | - |
| zužitkování | |
| citrátu | + |
| propionátu | - |
| nitrit z nitrátu | + |
| indol | - |
| fenylalanindesamináza | - |
| arginindihydroláza |
podobnost s
Analýza buněčných mastných kyselin prokázala přiřazení k rodu Bacillus.
Parciální sekvencování 16S rDNA prokázalo 100 %
Bacillus simplex.
·· 99
- 10 ·· ·»·· ♦ · · ♦ · · · · • 9 9 9
99 ·
» · t · 9
9 9
999 9 ♦ ·
9 ·
9 9 ·
• · • 9
9
9
9
Taxonomický popis Alcaligenes piechaudii K4 buněčná forma šířka μη délka μπι tyčinky
0,5-0,6
1,0-2,5 pohyblivost mrskání peritrich
Gram-reakce lyže 3 %ním KOH + aminopeptidáza + spory oxidáza + kataláza
ADH nitrit z nitrátu + denitrifikace ureáza hydrolýza želatiny zužitkování substrátu glukosy fruktosy arabinosy adipátu kaprátu citrátu
4· 44 44 φ»
4 4 4 444 4 •••4 44 44
4 4 4 444 · 444 4 4 •99 9 4 4 · ···· • 4 • · • ·
4 malátu + mannitolu pimelátu +
Charakteristika buněčných mastných kyselin je typická pro rod Alcaligenes.
Parciálním sekvencováním 16S rDNA se prokázala 99,3 % příslušnost k druhu Alcaligenes piechaudii.
Taxonomický popis Pseudomonas putida K32
| buněčná forma | tyčinky |
| šířka μιη | 0,8-0,9 |
| délka μπι | 1,5-4,0 |
| pohyblivost | + |
| mrskání | polární>l |
| Gram-reakce | - |
| lyže 3 %ním KOH | + |
| aminopeptidáza | + |
| spory | - |
| oxidáza | + |
| kataláza | + |
| růst anaerobně | - |
| pigmenty | |
| fluoreskující | + |
| pyanokyanin | - |
ADH
- 12 ·· 9··· • 9 99 « 9 9
9 9 9
9 999
9« 99 • 9 9 9
9 99
999 9 9 • 9 9
99
| nitrit z nitrátu | — |
| denitrifikace | - |
| ureáza | - |
| hydrolýza želatiny | - |
| zužitkování substrátu | |
| adipátu | - |
| citrátu | + |
| malátu | + |
| D-mandelátu | + |
| fenylacetátu | + |
| D-tartrátu | - |
| D-glukosy | + |
| trehalosy | - |
| manitolu | - |
| benzoylformiátu | - |
| propylenglykolu | + |
| butylaminu | + |
| benzylaminu | + |
| tryptaminu | - |
| acetamidu | + |
| hipurátu | + |
Charakteristika buněčných mastných kyselin je typická pro Pseudomonas putida.
Parciální sekvencování 16S rDNA prokázalo ca 98 % podobnost s
Pseudomonas mendocina a Pseudomonas alcaligenes. Podobnost s Pseudomonas putida byla 97,4 %.
Na základě fenotypických dat se může tento kmen jednoznačně přiřadit druhu Pseudomonas putida.
Enzymy podle vynálezu, N-acyl-L-prolinacylázy lze získat např. v oboru běžným otevřením popsaných buněk mikroorganismů, výhodně
- 13 AA AAAA
A A A ♦ · · • · A
A A A A
AA AA • ♦ ♦ A A AA A • •AA A A AA • A AAA A AAA A A • · A AAA ·· ·· AA AA se enzymy získají z Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10329). K tomu lze použít metod jako např. s ultrazvukem, s Frenchovým tlakovým zařízením nebo metody s losozymy. Enzymy se vyznačují následujícími vlastnostmi:
N-acyl-L-prolinacyláza se vyznačuje následujícími vlastnostmi:
a) substrátová specificita:
hydrolyzuje se N-benzyloxykarbonyl-L-prolin, N-benzoyl-L-prolin,
N-isobutoxykarbonyl-L-prolin,
N-benzyloxykarbonyl-L- pyroglutamát, N-benzyloxykarbonyl-DL-pipekolinová kyselina, N-benzyloxykarbonyl-L-alanin,
b) pH-optimum:
pH-optimum je při pH 6,5±0,2
c) teplotní stabilita:
při 43 °C a pH 6,5 není po 6 hod. inkubaci prokazatelná žádná ztráta aktivity
d) aktivita při teplotě:
při 50 °C a pH 6,5 je prokazatelná dobrá aktivita
e) vlivy inhibitorů:
inhibičně působí benzylakohol a N-benzyloxykarbonyl-D-prolin.
Podle vynálezu se způsob výroby N-chráněných cyklických derivátů D-aminokyselin obecného vzorce II a/nebo cyklického derivátu L-aminokyseliny obecného vzorce III
OH (II) íf :ch
OH
Λ
(III) • fc ···· • · • · • fc • · • fc fcfc fcfc fcfc • · · · • fcfc · • fc fc fcfcfc 4» • · · ·· fcfc • fc fcfc • · · • ·· ···· fc • · « ·· fcfc
- 14 kde A spolu s -N- a -CH znamená popřípadě substituovaný čtyř-, pěti- nebo šestičlenný nasycený heterocyklický kruh a R3 znamená -(CH2)2cooh/ každou popřípadě substituovanou skupinu alkyl, alkoxy, aryl nebo aryloxy, provádí tak, že se v racemickém N-chráněném cyklickém derivátu aminokyseliny obecného vzorce IV
kde A spolu s -N- a -CH a R3 mají jmenovaný význam, N-chráněný cyklický derivát L-aminokyseliny přeměňuje pomocí již popsaných mikroorganismů nebo pomocí jejich bezbuněčných enzymů na cyklický derivát L-aminokyseliny (vzorce III) a ten se popřípadě izoluje, přičemž při biotransformaci vzniká vedle derivátu L-aminokyseliny N-chráněný derivát D-aminokyseliny (vzorce II), který se popřípadě izoluje.
Podle vynálezu se způsob výroby N-chráněných alifatických derivátů D-aminokyselin obecného vzorce V a/nebo alifatického derivátu L-aminokyseliny obecného vzorce VI
CH i—R u
.......ť
O
OH (V)
(VI) alkylovou skupinu a RJ znamená atom substituovanou nerozvětvenou alkylovou analogicky jako u odpovídajících kde R3 má jmenovaný význam, R4 znamená atom vodíku, popřípadě substituovanou nerozvětvenou alkylovou skupinu nebo (V -hydroxy------- — vodíku nebo popřípadě skupinu, se provádí cyklických derivátů φφφ φ φ
φφ φφφφ φ φ φ φφφ φ φ φ • φ φ · φφ φφ φφφφ » φ φ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φφ φφφ φ φ φφ φ φ φ φφ φφ aminokyselin. Jako edukt se pro to používá racemický N-chráněný alifatický derivát aminokyseliny obecného vzorce VII
(VII)
C=O kde R3,R4 a R5 mají jmenovaný význam
Příklady pro případně substituované nasycené pětičlenné heterocyklické kruhy jsou prolin, pyrazolidin, imidazolidin, oxazolidin, isoxazolidin, thiazolidin, triazolidin. Jako substituovaný nasycený pětičlenný heterocyklický kruh se může použít například 5-oxoprolin (pyroglutamát).
Příklady pro případně substituované nasycené šestičlenné heterocyklické kruhy jsou piperazin, pipekolin, morfolin, chinolinan, isochinolinan, chinoxalin. Jako čtyřčlenný popřípadě substituovaný nasycený heterocyklický kruh se může použít azetidin.
Alkyl se v následujícím definuje jako C^^g-alkylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná. Příklady pro C1_18-alkylovou skupinu jsou methyl, chlormethyl, hydroxymethyl, ethyl, propyl, butyl, i-butyl, i-propyl, stearyl. Nerozvětvený alkyl se v následujícím definuje jako methyl, ethyl, propyl nebo butyl. Jakoft/-hydroxyalkylová skupina se v následujícím definuje jako hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl nebo hydroxybutyl. Alkoxy se v následujícím definuje jako C1_18-alkoxyskupina, substituovaná nebo nesubstituovaná. Příklady pro C1_lg-alkoxyskupinu jsou methoxy, fluorenylmethoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, t-butoxy, i-butoxy, stearoxy.
Jako popřípadě substituované arylové skupiny nebo aryloxyskupiny se mohou použít stejné, které byly popsány výše.
• · 9 « « φ • · • 9
- 16 Obzvláště výhodné N-chráněné cyklické nebo alifatické deriváty aminokyselin (edukty, vzorce IV nebo VII) jsou: N-Z-prolin (R3=benzyloxy), N-t-butoxykarbonylprolin (R3=t-butoxy), N-acetylprolin (R3=methyl), N-sukcinylprolin (R3=-(CH2)2-COOH),N-fenyl·acetylprolin (R3=benzyl), N-benzoylprolin (R3=fenyl), N-chloracetylprolin (R3=chlormethyl), N-i-butoxykarbonylprolin (R3=i-butoxy), kyselina N-Z-pipekolinová (R3=benzyloxy; šestičlenný nasycený heterocyklický kruh=pipekolin), N-Z-alanin (R3= benzyloxy, R4=methyl, R5=atom vodíku), N-Z-serin (R3= benzyloxy, R4=hydroxyethyl, R5=atom vodíku), N-Z-pyroglutamát (R3=benzyloxy, pětičlenný nasycený substituovaný heterocyklický kruh=5-oxoprolin) a N-Z-sarkosin (R3= benzyloxy, R5=methyl).
Výroba racemických N-chráněných cyklických nebo alifatických aminokyselin, popř. jejich derivátů je v principu známá. Přitom se odpovídající L-aminokyselina známým způsobem podle EP-A 0 057 092 racemizuje, a ta se pak opět známým způsobem přeměňuje s odpovídající N-ochrannou skupinou podle autorů Grassmann a Wúnsch (Chem.Ber.91 (1958),462-465).
Neznámý je způsob výroby N-chráněných cyklických nebo alifatických aminokyselin, kdy se vychází z odpovídající L-aminokyseliny, kdy se racemizace a zavedení chránící skupiny provádí ve vodném prostředí bez izolace racemické aminokyseliny.
V podstatě je biotransformaci možné provést se všemi mikroorganismy, které zužitkují N-chráněný derivát prolinu ve formě racemátu nebo jeho opticky aktivních isomerů jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku. Rovněž vhodné jsou z mikroorganismů izolované N-acyl-L-prolinacylázy. Pro způsob jsou zvláště vhodné výše popsané mikroorganismy rodu Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas, obvzláště druhu Agrobacterium/Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Arthrobacter sp. HSZ5, Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrifícans HSZ17 (DSM 10329), Pseudomonas putida K32 nebo Alcaligenes piechaudii K4, popř. jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.
- 17 • fe ···· fe · • · • fe • · ·· ·· • fefe·· • fefe · •fefe · ··· · • · · · • fe fefe • fefe · • · · · • •fefe · fefe ·
Biotransformace se může provádět po obvyklém pěstování mikroorganismů s buňkami v klidu (nerostoucí buňky, které již nepotřebují žádný zdroj uhlíku a energie) nebo s rostoucími buňkami. Výhodně se biotransformace provádí s buňkami v klidu.
Pro biotransformaci např. nízkomolární popsané v tabulce 1 podle tabulky 1.
se mohou použít v oboru běžná media, jako fosfátové pufry, Tris-pufr nebo medium Výhodně se biotransformace provádí s mediem
Účelně se biotransformace provádí při jednorázovém nebo kontinuálním přidávání N-chráněného derivátu aminokyseliny tak, aby koncentrace nepřesáhla 50 % hmot., výhodně 20 % hmotn.
Hodnota pH media může být v rozsahu od 3 do 12, výhodně od 5 do 9. Účelně se biotransformace provádí při teplotě od 10 do 70 °C, výhodně od 20 do 50 °C.
Podle způsobu podle vynálezu se N-chráněný cyklický nebo alifatický derivát aminokyseliny plně převede na cyklický nebo alifatický derivát L-aminokyseliny. Přitom vznikne N-chráněný derivát D-aminokyseliny v dobrém výtěžku a dobré enantiomerní čistotě (ee větší než 98 %), který se pak izoluje.
Takto získaný N-chráněný L-aminokyseliny se může extrakcí.
derivát D-aminokyseliny a/nebo derivát izolovat běžnými metodami, jako např.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1:
Selekce mikroorgansimů zužitkujících N-Z-L-prolin
Nejdřív se připravilo minimální medium (tabulka 1), které splňuje nároky na růst řady mikroorganismů:
I
- 18 00 000· • · 0 • 00
0 0
0 0 ·
0 0 • 0 0
00« • · «0 00 0 0 0 0
0 00 • 00 0 0
0 0
Tabulka 1: minimální medium
| Na2SO4 | 0,1 g/1 |
| Na2HPO4.2H2O | 2,5 g/1 |
| kh2po4 | 1,0 g/1 |
| NaCl | 3,0 g/1 |
| MgCl2.6H2O | 0,4 g/1 |
| CaCl2.2H20 | 14,5 mg/1 |
| FeCl3.6H2O | 0,8 mg/1 |
| roztok stopových prvků | 1,0 ml/1 |
| roztok vitaminů | 1,0 ml/1 |
pH 7,0
Jako zdroj uhlíku se přidala fruktosa (5 g/1). Aby se obohatily mikroorganismy, které jsou schopné N-Z-L-prolin selektivně hydrolyzovat, přidal se k tomuto základnímu mediu N-Z-L-prolin (5 g/1) jako jediný zdroj dusíku. Různé násady se pak inokulovaly se vzorky půdy z různých míst a tak dlouho inkubovaly (30 °C, 120 otáček/min) až byl rozeznatelný jasně viditelný růst. Alikvotní část této kultury se přeočkovala do stejně velkého objemu čerstvého media a znovu inkubovala až do zřetelného zakalení. Tento postup se třikrát opakoval. Obohacené mikroorganismy se pak oddělily na pevném mediu (stejné složení jako kapalné medium jen s přidáním 20 g/1 agar-agaru) a čistily. Takto se získalo asi 30 různých bakteriálních izolátů, které byly schopné zužitkovat N-Z-L-prolin jako jediný zdroj dusíku.
Příklad 2
Pěstování selektovaných mikroorganismů
Izoláty získané metodou popsanou v příkladu 1 se pomnožily v mediu tam popsaném. Všechny kultury, které měly dostatečnou buněčnou hustotu (ODg50 2,0), se sebraly (sklízely) centrifugováním. Sedimentující buňky se resuspendovaly v 0,85 % NaCl a promyly.
Po dalším resuspendování v roztoku NaCl se testovala u buněk v klidu schopnost hydrolyzovat N-Z-L-prolin. K tomu se inkubovalo vhodné množství buněk s N-Z-L-prolinem (5 g/1) v roztoku pufru
Φ· φ φ φ φ φ
ΦΦΦ φ • φ φφ
- 19 •v ΦΦΦΦ φ φ · φ · · φ φ φ φ φ · φ φ φφ φφ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ · ΦΦΦ φ φ · · φφ φφ φφ φφ φφ φ
(50 mM Tris-HCl, ρΗ 7,0) (30 °C). V různých okamžicích se odebraly alikvotní části a testovaly se tenkovrstevnou chromatografií na uvolnění prolinu z N-Z-prolinu. Více izolátů mělo tuto hydrolytickou aktivitu, předně oba kmeny HSZ5 a HSZ17, určené u DSM jako Arthrobacter sp. a Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans.
Příklad 3
Růst a enzymová aktivita Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328) Arthrobacter sp. HSZ5 se pěstoval s různými zdroji uhlíku (N-Z-L-prolin jako zdroj dusíku), popř. zdroji dusíku (fruktosa jako zdroj uhlíku). Zdroje uhlíku se přidaly v množství 5 g/1, zdroje dusíku v množství 2 g/1. Z důvodu indukování požadované enzymové aktivity se navíc, pokud to bylo třeba, přidal 1 g/1 N-Z-L-prolinu. Z testovaných zdrojů uhlíku se mohly zužitkovat jen fruktosa, glukosa, sacharosa a manit. Ve všech ostatních případech byl jako zdroj uhlíku použit N-Z-L-prolin. Enzymová aktivita závisela jen v malém rozsahu na použitém zdroji uhlíku. Na rozdíl od toho mohly být zužitkovány všechny testované zdroje dusíku, avšak enzymová aktivita se zmenšila, z části i výrazně (tabulka 2):
Tabulka 2:
Růst a enzymová aktivita Arthrobacter sp. HSZ5 při pěstování s různými zdroji uhlíku (A), popř. dusíku (B)
A)
| Zdroj uhlíku | hustota buněk [OD650] | relativní aktivita |
| fruktosa | 12,0 | 100 |
| glukosa | 15,0 | 150 |
| sachrosa | 12,4 | 148 |
| glycerin | 3,7 | 183 |
| manit | 11,2 | 154 |
| citrát | 2,7 | 106 |
| malát | 3,9 | 124 |
| acetát | 3,5 | 144 |
| N-Z-L-prolin | 2,8 | 109 |
• · ·
B)
Zdroj dusíku hustota buněk [OD650] relativní aktivita [%]
| amonium | 8,4 | 22 |
| nitrát | 7,6 | 6 |
| močovina | 7,8 | 12 |
| glycin | 8,0 | 17 |
| L-glutamát | 9,6 | 43 |
| L-prolin | 10,8 | 64 |
Příklad 4
Induktory N-acyl-L-prolinacylázy
Arthrobacter sp. HSZ5 se pěstoval v minimálním mediu (Příklad 1) s fruktosou (5 g/1) jako zdrojem uhlíku a L-glutamátem (2 g/1) jako zdrojem dusíku. Dodatečně se přidal N-Z-L-prolin, N-Z-DL-prolin, N-Z-D-prolin, N-Z-sarkosin, N-Z-diethylamin, N-Z-glycin, L-fenylalaninamid, benzamid, N-acetyl-L-prolin, N-acetyl-L-glycin, acetamid (pokaždé 1 g/1) nebo želatina (5 g/1). Po sebrání buněk se testovala s buňkami v klidu vždy enzymová aktivita proti N-Z-L-prolinu, popř. N-Z-D-prolinu (jak je popsáno v Příkladu 2). Analytický důkaz prolinu pomocí HPLC (vysokotlaková kapalinová chromatografie) ukázal, že N-Z-L-prolin a N-Z-DL-prolin jednotlivě indukují požadovanou enzymovou aktivitu, přičemž v obou případech byl jen N-Z-L-prolin přijat jako substrát, t.z. selektivita enzymu byla v obou případech velká.
Příklad 5
Výroba N-Z-D-prolinu
a) Arthrobacter sp. HSZ5 se pěstoval v minimálním mediu (Příklad 1) s fruktosou (5 g/1) jako zdrojem uhlíku a N-Z-L-prolinem (5 g/1) jako zdrojem dusíku. Buňky se sbíraly a promyly, jak bylo popsáno výše. Buňky v klidu (ODg50=30) se za udržování konstatního pH (pH 7,0) a za míchání inkubovaly s N-Z-DL-prolinem (50 g/1) při 30 °C. V různých okamžicích se odebraly aliktvotní části a sledovala se pomocí HPLC koncentrace N-Z-L-prolinu a N-Z-D-prolinu (viz. obr. 1). Po 60 minutách byl N-Z-L-prolin • · · 4 4 4 4 4 4 4 4 « · « 4444 4444 • 4 4 4 4 4 444 4 444 4 4
4444 44 4 4 4 · « «4 44 44 44 44
- 21 téměř úplně hydrolyzován, přičemž N-Z-D-prolin byl v roztoku nezměněný. V roztoku tedy byl N-Z-D-prolin ve velké optické čistotě (ee > 99 % ) .
b) Arthrobacter sp. HSZ5 se pěstoval ve fermentoru Chemap (pracovní objem 21) v minimálním mediu (Příklad 1) s glukosou (30 g/1) a L-prolinem (7 g/1) jako zdrojem uhlíku popř. jako zdrojem dusíku při 30 °C k hustotě buněk OD650 > 35. Pro indukování enzymové aktivity se pak přidalo malé množství N-Z-DL-prolinu (5 g/1) a nějakou dobu dále inkubovalo. Nakonec se kontinuálně přidávalo dalších 145 g N-Z-DL-prolinu po dobu 20 hod. a pak dalších pět hodin inkubovalo. Nakonec se centrifugováním buňky oddělily. Fermentační břečka se kyselinou chlorovodíkovou upravila na hodnotu pH < 3 a N-Z-prolin, který je za těchto podmínek téměř ve vodě nerozpustný, se získal extrakcí pomocí butylacetátu. Rozdělením obou fází se získal vodný roztok L-prolinu a rovněž N-Z-prolinu v organickém rozpouštědle. Organické fáze se zahustily pod vakuem a získaný N-Z-prolin se rozpustil v ethylacetátu a přidáním hexanu vykrystalizoval. Přitom se izolovalo 41,4 g N-Z-D-prolinu v krystalické formě (53,4 % teoretických), jehož identita a čistota se potvrdila pomocí 1H-MNR a určením teploty tavení (75,3 °C) a který měl vynikající optickou čistotu (ee > 99,5 % podle HPLC, [a]D24=60,0 pro c=l v kyselině octové).
1H-NMR (400 MHz v CD3OD); v ppm: 7,35 (m,5H);
5,1 (m,2H);
4,3 (m,lH);
3,6-3,4 (m,2H);
2,3-2,2 (m,lH);
2,1-1,9 (m,3H)
c) Arthrobacter sp. HSZ5 se pěstoval ve fermentoru (jmenovitý objem 20 1) v 6 1 minimálního media (srovnej Příklad 1) s glukosou (20 g/1) a L-prolinem (7 g/1) jako zdrojem uhlíku popř. jako zdrojem dusíku při 30 °C k buněčné hustotě Οϋθ50 > 30. Pro indukování enzymové aktivity se pak přidalo 112 g 50 % roztoku • · · · · · • · • · ·· · · · · · · · · · • · · · · · · · · · · • · · · · · ··· · ···· · • · · · · · · · · ·
- 22 (hmot./hmot.) N-Z-DL-prolinu a 1 hodinu dále inkubovalo. Pak se snížil objem kultury na 41 odpuštěním nepoužitého množství. K těmto 4 1 kultury s indukovanými buňkami se pak kontinuálně přidávalo dalších 709 g 50 % roztoku (hmot./hmot.)) N-Z-DL-prolinu po dobu 5,5 hod. a pak dalších 17,5 hodin inkubovalo. Během biotransformace se udržovala hodnota pH na 7,5-8,5. Po skončení přeměny vzniklo 4077 g buněčné suspenze, ze které se buňky oddělily ultrafiltrací. Alikvotní část (1000 g) vzniklé fermentační břečky se zpracovala jak je popsáno v 6a). Přitom se izolovalo 31,24 g N-Z-D-prolinu v krystalické formě (85 % teoretických), který měl vynikající hodnoty s ohledem na čistotu (titrimetrický obsah=99,6 %) a optickou čistotu (ee > 99,5 % podle HPLC, [a]D24=60,2 pro c=2 v kyselině octové).
d) Arthrobacter sp. HSZ5 se pěstoval ve 450 1 fermentoru v 250 kg minimálního media (srovnej Příklad 1) s glukosou (13 g/1) a L-prolinem (7 g/1) jako zdrojem uhlíku popř. jako zdrojem dusíku při 30 °C k požadované buněčné hustotě (ODg50 ca 25). Přidáním 4 kg 50 % roztoku (hmot./hmot.) N-Z-DL-prolinu se pak indukovala enzymová aktivita. Po inkubační době 1 hod., při které se pH pomalu zvyšovalo (pH=7,5-8,5), se při udržování konstatního pH přidalo dalších 67 kg 50 % roztoku (hmot./hmot.)
N-Z-DL-prolinu rychlostí 20 kg/hod. a pak se inkubovalo dalších 20 hod. Přičemž v důsledku rychlé přeměny (maximální rychlost ca 12 g N-Z-L-prolinu hydrolysováno/1 x hod) byla reakce již 8 hod. po indukci téměř ukončena (ee > 98 %). Z nakonec vzniklých 320 kg kultury se buňky oddělily ultracentrifugací a alikvotní část (1444 g) bezbuněóné fermentační břečky se zpracovala jak je popsáno v 6a). Přitom se izolovalo 50,0 g N-Z-D-prolinu v krystalické formě (83,2 % teoretických) o velmi dobré čistotě (titrimetrický obsah > 99 %), popř. optické čistotě (ee > 99 % podle HPLC).
• · » « • ·
- 23 Obrázek 1:
Enzymatická hydrolýza N-Z-L-prolinu pomocí buněk v klidu Arthrobacter sp. HSZ5
Příklad 6
Racemizace L-prolinu
500 mMol L-prolinu se rozpustilo v 125 ml 4 N NaOH (500 mMol). Tento roztok se pak zahřál na 160 °C v tlakové nádobě a při této teplotě se udržoval 6 hod., přičemž byl maximální tlak 0,45 MPa. Po ochlazení roztoku se na základě hodnoty otáčení ( [01 ] 545 =-l, 5 ) ukázalo, že se prolin vyskytuje téměř úplně jako racemický. Podobné výsledky bylo možné dosáhnout, když se racemizace prováděla s jen 0,15 molárními ekvivalenty NaOH. Nicméně se musela reakční doba prodloužit na 16 hod.
• tt ···· • · · · · · · · · · · • · · · · tt · tttttttt • · · · · · ··· · ···· · ···· · · · · · ·
- 24 Příklad 7
Výroba N-Z-(DL)-prolinu
100,0 g DL-prolinu se rozpustilo ve 217 ml 4 N NaOH. K tomuto roztoku se přikapal benzylester kyseliny chlormravenčí (Z-Cl) za termostatování (5-10 °C) a udržování konstatního pH (pH=ll,5-12,0). Dohromady se přitom přidalo 158,1 g Z-Cl a další 251,2 g 4 N NaOH. Navíc se přidalo 150 ml destilované vody, aby se udržela možnost míchat reakční směs. Pak se směs okyselila koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou (76 ml) na hodnotu pH =2,4 a extrahovala celkem 584 ml butylacetátu. N-Z-DL-prolin obsažený v organické fázi se krystalizoval postupem uvedeným v Příkladu 6. Takto se získalo 187,4 g N-Z-DL-prolinu (86,5 % teoretických).
Příklad 8
Výroba N-Z-(DL)-prolinu (reakce v jedné nádobě)
80,0 g L-prolinu se rozpustilo v 174 ml 4 N NaOH a tento roztok se zahřál na 160 °C v tlakové nádobě. Tato teplota se udržovala 6 hod., přičemž byl maximální tlak 0,44 MPa. Po ochlazení roztoku se na základe hodnoty otáčeni ([^)545--0,6) zjistila téměř úplná racemizace. K tomuto roztoku DL-prolinu se přikapal benzylester kyseliny chlormravenčí (Z-Cl) za termostatování (4 °C) a udržování konstatního pH (pH=ll,5-12,0). Dohromady se přitom přidalo 124,5 g Z-Cl a další 203,7 g 4 N NaOH. Navíc se přidalo 50 ml destilované vody, aby se udržela možnost míchat reakční směs. Pak se směs neutralizovala 4,7 g koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Po přidání 200 ml butylacetátu se nakonec pH vodní fáze upravilo přidáním 67,4 g koncentrované kyseliny chlorovodíkové na hodnotu 2,0. Vodná fáze se oddělila a ještě jednou extrahovala dohromady 200 ml butylacetátu. Organické fáze se spojily a N-Z-DL-prolin se krystalizoval postupem uvedeným v Příkladu 6. Takto se získalo 151,3 g N-Z-DL-prolinu (87,3 % teoretických).
• · · · ·· ·· • ·· 9 · 9 9 9
9 9 9 9 9 99
9 9999 9999 ·
- 25 Příklad 9
Charakteristika N-acyl-L-prolinacylázy z Arthrobacter sp. HSZ5
a) pH-optimum N-acyl-L-prolinacylázy
Arthrobacter sp. HSZ5 se pěstoval v mediu popsaném v tabulce 1 s fruktosou (5 g/1) a N-Z-L-prolinem (5 g/1) jako zdrojem uhlíku popř. jako zdrojem dusíku (30 °C, 120 otáček/min). Po dosažení požadované hustoty buněk se buňky sbíraly centrifugací, promyly v roztoku kuchyňské soli (0,9 %) a v něm také nakonec resuspendovaly. Enzymová aktivita v závislosti na hodnotě pH se určovala při zachováni všech ostatních parametrů (30 °C, 50 g/1 N-Z-L-prolinu, ODggQ=15-20). Jako 100 % hodnota se použil výsledek násady při pH=7,0.
Obrázek 2:
Aktivita N-acyl-L-prolinacylázy z Arthrobacter sp. HSZ5 v závislosti na hodnotě pH
• 4 49 44 44
4 4444 4449
9 4 4494 4 444
4 4 · 4 4 444 « ··· 4 4
4444 44 4 444
- 26 Přitom vznikla typická křivka optima s optimem v rozmezí pH=6,4-6,6. Při pH=5,0 a pH=8,5 nebylo již možné zjistit žádnou enzymatickou aktivitu.
b) Aktivita N-acyl-L-prolinacylázy z Arthrobacter sp. HSZ5 v závislosti na teplotě
Buňky s aktivitou N-acyl-L-prolinacylázy byly připraveny postupem podle 9a). Tentokrát se zjišťovala enzymová aktivita pří změnách teploty. Všechny ostatní parametry se udržovaly konstantní (pH 6,5, 50 g/1 N-Z-L-prolinu, OD650 ' 20-25). Jako 100 % hodnota se použil výsledek násady při 30 °C.
Obrázek 3:
Aktivita N-acyl-L-prolinacylázy z Arthrobacter sp. HSZ5 v závislosti na teplotě
•to ···· ·· ·· ·· to*
- 27 Enzymová aktivita stoupala formou mírné sigmoidální křivky. I při 50 °C je ještě zjistitelná dobrá aktivita, což ukazuje na dobrou stabilitu enzymu.
c) Stabilita N-acyl-L-prolinacylázy z Arthrobacter sp. HSZ5 v závislosti na teplotě
Buňky s aktivitou N-Z-L-prolinacylázy byly připraveny postupem podle 9a). Pro zjištění stability enzymu se pak inkubovaly alikvotní části buněčné suspenze (mícháno, pH=6,5, OD650 40-50) při různých teplotách a odebíraly se vzorky v různých okamžicích, které se testovaly při standardních podmínkách (30 °C, pH=6,5, 50 g/1 N-Z-L-prolinu, OD650 ' 15-20) na zbylou aktivitu N-acyl-L-prolinacylázy. Přitom byly zjištěny následující výsledky:
při 43 °C byla zjištěna plná aktivita pro nejméně 6 hodin při teplotě mezi 43 a 53 °C došlo nejprve dokonce ke zvýšení aktivity, pak ale k málé ztrátě aktivity, takže po pěti až šesti hodinách bylo ještě ca 80 % počáteční aktivity vyšší teploty vedly k inaktivaci enzymu (50 % zbytková aktivita po dvou hodinách při 60 °C, popř. úplná inaktivace po jedné hodině při 65 °C)
d) Vliv inhibice produktem na aktivita N-acyl-L-prolinacylázy z
Arthrobacter sp. HSZ5. Buňky s aktivitou N-acyl-L-prolinacylázy byly připraveny podle 9a). Alikvotní části buněčné suspenze se pak inkubovaly s různými koncentracemi produktů vznikajících při hydrolýze N-Z-L-prolinu (L-prolin, N-Z-D-prolin, benzylalkohol) po dobu 30 minut (30 °C, pH 6,4), než byla stanovena enzymová aktivita každé násady za standardních podmínek (30 °C, pH=6,5, 50 g/1 N-Z-L-prolinu, OD650 ' 15-20). Jako 100 % hodnota se použil výsledek násady, která se inkubovala bez přidání produktu.
9999
99 99 99
9 9999 9999
9 9999 9999
9 9 9 9 9 999 · 999 9 9
9999 99 9 999
- 28 Obrázek 4:
Aktivita N-acyl-L-prolinacylázy z Arthrobacter sp. HSZ5 v závislosti na koncentraci produktů
Přitom se ukázalo, že L-prolin ani při vysokých koncentracích nezpůsobuje žádnou inhibici aktivity. Oproti tomu však N-Z-D-prolin a benzylakohol drasticky snižovaly aktivitu enzymu s přibývající koncentrací. Zatímco se zdá, že N-Z-D-prolin působí jako kompetitivní inhibitor (lineárně rostoucí inhibice s rostoucí koncentrací), inhibuje benzylalkohol spíše nekompetitivním způsobem (účinný nad jistou mezní koncentrací).
«· ··♦· ·« ·· ·· · · • « · ···· «··· • · · ···* · · »« * · «<· ····· «··· · «··· ·· » ··· «« ·· ·♦ »· ·· ««
- 29 Příklad 10
Substrátové spektrum různých kmenů s N-acyl-L-prolinacylázou
a) Růst s různými N-chráněnými aminokyselinami jako jediným zdrojem dusíku
Arthrobacter sp. HSZ5, Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ17, Agrobacterium/Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2 Alcaligenes piechaudii K4 a Pseudomonas putida K32 se pěstovaly v mediu popsaném v tabulce 1 s fruktosou (5 g/1) jako zdrojem uhlíku (30 °C, 120 otáček/min). Jako jediný zdroj dusíku (5 g/1) se přidala pokaždé jiná N-chráněná aminokyselina. Při dosažení buněčné hustoty OD^^q > 0,5 se násada považovala za positivní.
Tabulka 3:
Růst různých kmenů s rýznými N-chráněnými aminokyselinami jako jediný zdroj dusíku
| HSZ5 | HSZ17 | HSZ30 | K2 | K4 | K32 | |
| N-Z-L-prolin | + | + | + | + | + | + |
| N-acetyl-L-prolin | + | + | + | + | ||
| N-sukcinyl-L-prolin | + | |||||
| N-fenylacetyl-L-prolin | + | + | ||||
| N-isobutoxykarbonyl-L- prolin | + | + | + | |||
| N-Z-L-pyroglutamát | + | + | + | + | + | + |
| N-Z-L-alanin | + | + | + | + | ||
| N-Z-L-serin | + | + | ||||
| N-Z-sarkosin | + |
b) Enzymatická hydrolýza různých N-chráněných aminokyselin Arthrobacter sp. HSZ5, Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ17, Agrobacterium/Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2 ·« ···· ·« ·· ** ·· »« · *·*· * * · ♦ »*« · · · · *«»« • « · * » · ♦ ·· « ··« · · ··*· · · * ··*
- 30 Alcaligenes piechaudii K4 a Pseudomonas putida K32 se pěstovaly v mediu popsaném v tabulce 1 s fruktosou (5 g/1) a N-Z-L-prolinem (5 g/1) jako jediným zdrojem uhlíku, popř. dusíku (30 °C, 120 otáček/min). Při dosažení požadované buněčné hustoty se buňky sebraly centrigugací a promyly v roztoku kuchyňské soli (0,9 %). Poté, co byly všechny kmeny testovány na požadovanou enzymovou aktivitu, se pak buňky resuspendovaly ve 100 mM pufru fosforečnanu draselného (pH 7,0). Po přidání různých N-chráněných aminokyselin (konečná koncentrace 100 mM) se násady inkubovaly při 30 °C za třepání, přičemž se odebíraly vzorky ve vhodných odstupech. U těchto vzorků se pak zjišťovala hydrolýza vnesených substrátů.
Tabulka 4:
Enzymatická hydrolýza různých N-chráněných aminokyselin pomocí celých buněk různých kmenů obsahujících N-acyl-L-prolinacylázu
| HSZ5 | HSZ17 | HSZ30 | K2 | K4 | K32 | |
| N-Z-L-prolin | + | + | + | + | + | + |
| N-BOC-L-prolin | + | + | + | + | ||
| N-acetyl-L-prolin | + | + | + | |||
| N-sukcinyl-L-prolin | + | |||||
| N-fenylacetyl-L-prolin | + | + | ||||
| N-benzoyl-L-prolin | + | + | + | + | + | + |
| N-chloracetyl-L-prolin | + | + | ||||
| N-isobutoxykarbonyl-L- prolin | + | + | + | + | + | |
| N-Z-DL-pipekolinová kys. | + | + | + | |||
| N-Z-L-alanin | + | + | + | + | ||
| N-Z-L-serin | + | + | + |
• 0
0
0
0
0
WO 97/33987
- 30 a
Applicams or asenťs filé reference numbčr LO/709 Wd/Sh • · • «
0
0
International application b
0000 •
0 • 00
0
0
000 · *
0
00 0 0 0 0 ♦ 0 00 • 00 0 0
0 0 • 0 00
PCT/EP97/01262
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED M1CROORGANISM (PCT Rule 13W.r)
A. The indications made below relate to the microorganism referred to in the description on pagc 4 , line 4
B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT
Further deposits are identifted on an additional sheet □
Name of deposiiury institution
DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH
Address of depositary institution (including poslal code and country) Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig
Dáte of deposit
14.11.95
Accession Number DSM 10328
C. ADDITIONAL INDICATIONS (leave blank ifnot applicable) This Information is continued on an additional sheet □
D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE Uf the indications are not for all designated States)
E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leave blank ifnot applicable)
The indications listed below will be submitted to the International Bureau later íspecify the generál nátuře of the indications e.g., Accession
Number of Deposit)
For receiving Office uše only
I Μ This sheet was received with the International application
For International Bureau use only [~~Ί This sheet was received by the International Bureau on:
| Authórized officer | |
| R.L.R. Pether |
Authórized officer
Fonn PCT/RO/134 (July 1992)
Applicanťs or agenis filé reference number ·· ···· ♦ · · • fc ··
WO 97/33987
30b • ♦ fc · • · · • fc • fcfc · fc fcfcfc • · fcfcfc · ··« · fc • fc · fcfcfc • fc fcfc fcfc ··
PCT/EP97/01262
J7709 Wd/Sh
International application
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule I3to)
| A. The indications made below relate to the microorganism referrcd to in thedescription | |
| on nace 4 | . line 6 |
| B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT | Further deposits are identified on an additional sheet | ] |
| Name of depositary institution DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG | VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH |
Address of depositary institution (including poslal code and coumry)
Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig
| Dáte of deposit 14.11.95 | Accession Number DSM 10329 |
| C. ADDITIONAL INDICATIONS lleave blank if not applicable) This Information is continued on an additional sheet | | |
| D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (if lbe indications are not for all destgnatcd States) | ||
| E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leave blank if not applicable) | ||
| The indications listed below will be submitted to the International Bureau láteř (specify the generál nátuře ofthe indications e.g.. Accession Number nf Deposit) | ||
| r- · . Λ , I- « 1 . | ||
| 1X1 This sheet was received with the intemational application | 11 11 rui iiitviiiauuiini ouicau wsc um v 11 □ This sheet was received by the International Bureau on: | |
| Authorized officer Pether | Authorized officer |
Form PCT/RO/134 (July 1992)
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Mikroorganismy, které jsou schopné derivát prolinu obecného vzorce I zužitkovat N-chráněný (I) ve formě racemátu nebo jeho opticky aktivního izomeru,-] kde R znamená -(CH2)2~COOH, popřípadě substituovanou každou skupinu C-^-alkoxy, aryl nebo aryloxy a R2 znamená atom vodíku nebo =0, jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku.
- 2. Mikroorganismy podle nároku 1, které jsou schopné zužitkovat N-chráněný derivát L-prolinu obecného vzorce I jako jediný zdroj dusíku, jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku.
- 3. Mikroorganismy podle nároku 1 nebo 2 rodu Arthrobacter, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Alcaligenes.
- 4. Mikroorganismy podle alespoň jednoho z nároků 1 až 3 druhu Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32 nebo Alcaligenes piechaudii K4 stejně jako jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.
- 5. N-acyl-L-prolinacyláza, která má následující vlastnosti:a) substrátová specificita:hydrolyzován je N-benzyloxykarbonyl-L-prolin, • fe ···· fefe • fe fefe fefe fefe • ♦ · · · · · · fe • » · fe · · fe fe* • · · · ··· fe ··· · · • fefe « · · ·- 32 N-benzoyl-L-prolin,N-isobutoxykarbonyl-L-prolin, N-benzyloxykarbonyl-L-pyroglutamát, N-benzyloxykarbonyl-DL-pipekolinová kyselina N-benzyloxykarbonyl-L-alanin,b) pH-optimum pH-optimum je při pH 6,5±0,2c) teplotní stabilita:při 43 °C a pH 6,5 není po 6 hodinové inkubaci zjistitelná žádná ztráta aktivityd) teplota a aktivita:při 50 °C a pH 6,5 je zjistitelná dobrá aktivitae) vliv inhibitorů:inhibičně působí benzylakohol a N-benzyloxykarbonyl-D-prolin.
- 6. Způsob výroby N-chránéného cyklického derivátu D-aminokyseliny obecného vzorce II a/nebo cyklického derivátu L-aminokyseliny obecného vzorce IIIAOH (II) (III)R3 kde A spolu s -N- a -CH znamená popřípadě substituovaný čtyř-, pěti- nebo šestičlenný nasycený heterocyklický kruh a R3 znamená -(CH2)2-COOH, každý popřípadě substituovaný alkyl, alkoxy, aryl nebo aryloxy, vyznačující se tím, že se v racemickém N-chráněném cyklickém derivátu aminokyseliny obecného vzorce IV ·· ···· ·· ·· ·· ·· • * · ···· ···* «·· ···· ·*·· • · · · · · ··· * ·♦· * · ·*·· · « · ·«·- 33 N (IV)R3 kde A spolu s -N- a -CH a R3 mají jmenovaný význam, N-chráněný cyklický derivát L-aminokyseliny převádí pomocí mikroorganismů podle nároků 1 až 4 nebo pomocí bezbuněčných enzymů podle nároku 5 na cyklický derivát L-aminokyseliny (vzorec III) a ten se popřípadě izoluje, přičemž při biotransformaci vzniká Vedle cyklického derivátu L-aminokyseliny N-chráněný cyklický derivát D-aminokyseliny (vzorec II), který se popřípadě izoluje.
- 7. Způsob výroby N-chráněného alifatického derivátu D-aminokyseliny obecného vzorce V a/nebo alifatického derivátu L-aminokyseliny obecného vzorce VIR4CH.......N—R5 (V) (ví) kde R3 má jmenovaný význam, R4 znamená atom vodíku, popřípadě substituovanou nerozvětvenou alkylovou skupinu nebo LU -hydroxyalkylovou skupinu a R5 znamená atom vodíku nebo popřípadě substituovanou nerozvětvenou alkylovou skupinu, vyznačující se tím, že se v racemickém N-chráněném alifatickém derivátu aminokyseliny obecného vzorce VIIOH (VII) =044 44 ·4 * *4 44 4 · 4 4 49 4 4 4 4 · 444 4 444« 4444 44· 4 4 4 4 •4 444»4 » ·4 4 44· 4 • 4 4 ·- 34 ο λ pr kde R , R* a R mají jmenovaný význam, N-chráněný alifatický derivát L-aminokyseliny převádí pomocí mikroorganismů podle nároků 1 až 4 nebo pomocí bezbuněčných enzymů podle nároku 5 na alifatický derivát L-aminokyseliny (vzorec VI) a ten se popřípadě izoluje, přičemž při biotransformaci vzniká vedle alifatického derivátu L-aminokyseliny N-chráněný alifatický derivát D-aminokyseliny (vzorec V), který se popřípadě izoluje.
- 8. Způsob podle nároku 6 nebo 7,vyznačující se tím, že se biotransformace provádí pomocí mikroorganismů rodu Arthrobacter, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Alcaligenes.
- 9. Způsob výroby N-chráněného cyklického derivátu D-aminokyseliny obecného vzorce IIOH (II) c—0R3 kde A spolu s -N- a -CH znamená popřípadě substituovaný čtyř-, pěti- nebo šestičlenný nasycený heterocyklický kruh a R3 znamená -(CH2)2-cooh, každý popřípadě substituovaný alkyl, alkoxy, aryl nebo aryloxy, vyznačující se tím, že se cyklický derivát L-aminokyseliny obecného vzorce III (III) ·· 94 44 444 9 4 4 4 4 4 · 4 * *4 4 4 9 4 4 4 · · 44 • · · * · · 449 4 449 9 994·· 4 9 4 444 • 4 4 44 4- 35 kde A spolu s -N- a -CH mají jmenovaný význam, racemizuje na odpovídající cyklický derivát aminokyseliny, ten se převede na N-chráněný cyklický derivát aminokyseliny obecného vzorce IV kde A spolu s -N- a -CH a R3 mají jmenovaný význam, a nakonec se N-chráněný derivát L-aminokyseliny převede pomocí mikroorganismů podle nároků 1 až 4 nebo pomocí bezbuněčných enzymů podle nároku 5 na cyklický derivát L-aminokyseliny, ten se popřípadě izoluje, přičemž při biotransformaci vzniká vedle cyklického derivátu L-aminokyseliny N-chráněný cyklický derivát D-aminokyseliny (vzorec II), který se izoluje.
- 10. Způsob výroby N-chráněného kyseliny obecného vzorce V alifatického derivátu D-amino- kde R3, R4 a R5 mají jmenovaný význam, vyznačující se tím, že se alifatický derivát L-aminokyseliny obecného vzorce VIΦΦΦΦ 4Φ Φ 4 * Φ Φ·- 36 φφ φφ φ φ φ ί φ φ ·Β Φ ΦΦΦ » Φ Φ ·* ΦΦΟΗ (VI) kde R4 má jmenovaný význam, racemizuje na odpovídající alifatický derivát aminokyseliny, ten se převede na N-chráněný alifatický derivát aminokyseliny obecného vzorce VII (VII) kde R3 , R4 a R5 mají jmenovaný význam, a nakonec se N-chráněný alifatický derivát L-aminokyseliny převádí pomocí mikroorganismů podle nároků 1 až 4 nebo pomocí bezbuněčných enzymů podle nároku 5 na alifatický derivát L-aminokyseliny, ten se popřípadě izoluje, přičemž při biotransformaci vzniká vedle alifatického derivátu L-aminokyseliny N-chráněný derivát D-aminokyseliny (vzorec V), který se izoluje.
- 11. Způsob podle nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, že se přeměna provádí ve vodné prostředí bez izolace racemického derivátu aminokyseliny.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH65696 | 1996-03-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ281198A3 true CZ281198A3 (cs) | 1998-12-16 |
Family
ID=4192092
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ982811A CZ281198A3 (cs) | 1996-03-13 | 1997-03-12 | Způsob výroby N-chráněných derivátů D-prolinu |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020037559A1 (cs) |
| EP (1) | EP0896617A1 (cs) |
| JP (1) | JP2000506728A (cs) |
| KR (1) | KR19990087341A (cs) |
| CN (1) | CN1213400A (cs) |
| AU (1) | AU2155797A (cs) |
| CA (1) | CA2245543A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ281198A3 (cs) |
| NO (1) | NO984206L (cs) |
| PL (1) | PL328795A1 (cs) |
| SK (1) | SK282099B6 (cs) |
| WO (1) | WO1997033987A1 (cs) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5757498A (en) * | 1996-12-16 | 1998-07-15 | Lonza A.G. | Method for production of d-proline derivatives |
| EP1005563A1 (de) * | 1997-08-11 | 2000-06-07 | Lonza AG | VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG ENANTIOMERENREINER CYCLISCHER alpha-AMINOSÄUREN BZW. DEREN N-GESCHÜTZTER DERIVATE MITTELS EINER D-SPEZIFISCHEN AMINOACYLASE |
| DE10050123A1 (de) * | 2000-10-11 | 2002-04-25 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren |
| RU2006119470A (ru) * | 2003-12-04 | 2007-12-20 | Пфайзер Инк. (US) | Способы получения стереоизомерно обогащенных аминов |
| WO2013147328A1 (ja) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | 味の素株式会社 | 化粧料組成物 |
| CN104592083A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-05-06 | 宁波海硕生物科技有限公司 | 一种制备n-乙酰-dl-硫代脯氨酸的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4401820A (en) * | 1981-01-23 | 1983-08-30 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Process for racemizing optically active α-amino acids or a salt thereof |
| DE3929570A1 (de) * | 1989-09-06 | 1991-03-07 | Degussa | Mikrobiologisch hergestellte n-acyl-l-prolin-acylase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung |
| US5219741A (en) * | 1989-09-06 | 1993-06-15 | Degussa Ag | Method of making L-proline using an N-acyl-L-protine acylase |
| DE4116980A1 (de) * | 1991-05-24 | 1992-11-26 | Degussa | Verfahren zur herstellung enantiomerenreiner offenkettiger n-alkyl-l oder d-aminosaeuren |
-
1997
- 1997-03-12 CZ CZ982811A patent/CZ281198A3/cs unknown
- 1997-03-12 SK SK1171-98A patent/SK282099B6/sk unknown
- 1997-03-12 JP JP9532290A patent/JP2000506728A/ja active Pending
- 1997-03-12 CA CA002245543A patent/CA2245543A1/en not_active Abandoned
- 1997-03-12 EP EP97914232A patent/EP0896617A1/de not_active Withdrawn
- 1997-03-12 KR KR1019980706750A patent/KR19990087341A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-03-12 PL PL97328795A patent/PL328795A1/xx unknown
- 1997-03-12 WO PCT/EP1997/001262 patent/WO1997033987A1/de not_active Application Discontinuation
- 1997-03-12 CN CN97192958A patent/CN1213400A/zh active Pending
- 1997-03-12 AU AU21557/97A patent/AU2155797A/en not_active Abandoned
- 1997-03-12 US US09/125,723 patent/US20020037559A1/en not_active Abandoned
-
1998
- 1998-09-11 NO NO984206A patent/NO984206L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2155797A (en) | 1997-10-01 |
| JP2000506728A (ja) | 2000-06-06 |
| NO984206D0 (no) | 1998-09-11 |
| SK117198A3 (en) | 1999-03-12 |
| US20020037559A1 (en) | 2002-03-28 |
| EP0896617A1 (de) | 1999-02-17 |
| SK282099B6 (sk) | 2001-11-06 |
| NO984206L (no) | 1998-09-11 |
| CA2245543A1 (en) | 1997-09-18 |
| WO1997033987A1 (de) | 1997-09-18 |
| PL328795A1 (en) | 1999-02-15 |
| KR19990087341A (ko) | 1999-12-27 |
| CN1213400A (zh) | 1999-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8460902B1 (en) | DNA encoding hydantoinase, DNA encoding N-carbamyl-L-amino acid hydrolase, recombinant DNA, transformed cell, method of producing protein, and method of producing optically active amino acid | |
| US7351571B2 (en) | Process for the production of β-amino acids using acylase | |
| EP0857790A1 (en) | Process for producing optically active amino compounds | |
| US7405065B2 (en) | Enzyme for the preparation of 1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyclopentene derivatives | |
| US6262295B1 (en) | Process for the preparation of a racemic or optically active 4-(hydroxymethyl)-2-cyclopentene derivative | |
| CZ281198A3 (cs) | Způsob výroby N-chráněných derivátů D-prolinu | |
| US4006057A (en) | Method of producing L-cysteine and L-cystine | |
| EP0954571B1 (en) | Biocatalysts with amine acylase activity | |
| EP0309310B1 (fr) | Nouveau système enzymatique, son procédé de préparation et son application notamment dans la préparation de la D-parahydroxyphénylglycine | |
| JPH01320991A (ja) | Ｄ−ホモフエニルアラニン類の製造方法 | |
| JP5096911B2 (ja) | ５−置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組換えｄｎａ、形質転換された細胞、および、光学活性ｎ−カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法 | |
| JP2899071B2 (ja) | Ｌ―α―アラニンの製造法 | |
| CZ3599A3 (cs) | Mikroorganismy a způsob výroby derivátů D-prolinu | |
| CZ76393A3 (en) | Micro-biological process for preparing derivatives of malonyl-7-aminocephalosporanic acid | |
| JP2001506500A (ja) | Ｄ−プロリン誘導体を調製する方法 | |
| JPH05192190A (ja) | 光学活性なカルボン酸誘導体の製造方法 | |
| CA2299324A1 (en) | Method for producing cyclic .alpha.-amino acids free from enantiomers or their n-protected derivatives by means of a d-specific aminoacylase | |
| JPH07274985A (ja) | Ｄ−γ−メチルロイシンの製造法 | |
| JPH05219987A (ja) | 光学活性乳酸の製造法 | |
| WO2001009365A1 (en) | Process for the preparation of 2-cyano-5-hydroxypyrazine | |
| JP2001120259A (ja) | 微生物によるカルボン酸アミド類の製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |